專利名稱：用于增加植物對脅迫條件耐受性的方法和手段的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及聚ADP核糖糖基水解酶在植物中的用途，用于增加植物對不利的生長條件包括干旱、高光照強度、高溫、營養(yǎng)限制等的耐受性。提供了方法和手段來產(chǎn)生對非生物脅迫條件耐受的植物。
背景技術：
通常非生物脅迫條件將直接或間接地導致暴露于不利條件的植物細胞的DNA損傷。如果基因組損傷任其不修復，可導致細胞死亡。植物表現(xiàn)的對脅迫條件的耐受性是暴露于不利條件的植物細胞能減少和/或修復損傷并存活的能力的結(jié)果。
像其它真核細胞一樣，植物細胞已經(jīng)進化產(chǎn)生精細的DNA修復系統(tǒng)。由DNA鏈的斷裂激活聚ADP-核糖聚合酶(PARP)常常是對DNA損傷的第一細胞反應之一。PARP通過連續(xù)地加入由煙酰胺二核苷酸(NAD)轉(zhuǎn)化得到的ADP-核糖分子來催化蛋白質(zhì)的翻譯后修飾以形成包含多達200個ADP-核糖殘基(植物中約40個殘基)的多支鏈聚合物。聚ADP-核糖合成對DNA鏈斷裂的依賴，以及進一步包含DNA修復、復制和轉(zhuǎn)錄反應的關鍵效應物的多蛋白復合物中PARP的存在，強烈地暗示這種翻譯后修飾參與核酸的代謝及DNA修復。也有跡象表明聚ADP-核糖合成參與細胞周期和細胞死亡的調(diào)控。
蛋白的聚ADP-核糖基化在活細胞中是暫時的。聚ADP-核糖聚合物快速的周轉(zhuǎn)，通過聚ADP-核糖糖基水解酶(PARGEC 321143)的外切糖苷酶和內(nèi)切糖苷酶活性轉(zhuǎn)化為游離的ADP-核糖。ADP-核糖在蛋白受體上最接近的部分通過另一種酶(ADP-核糖基蛋白裂解酶)的作用水解。
除了PARP在細胞存活上的這種正(DNA-修復相關的)效應，PARP也存在負效應。當DNA損傷時，激活PARP的過程與NAD+水平迅速降低相關，因為PARP每轉(zhuǎn)移一個ADP-核糖單位就消耗一分子NAD+。NAD+的消耗接下來導致ATP的消耗，因為NAD+再合成需要至少(取決于生物合成途徑)三分子的ATP每分子NAD+。而且，NAD+消耗阻礙甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性，在糖酵解過程中需要該酶來再合成ATP。最后，NAD+是通過電子轉(zhuǎn)移和氧化磷酸化產(chǎn)生ATP所需的關鍵電子載體。
NAD+和ATP消耗的生理學后果已經(jīng)確定與DNA-損傷誘導的細胞死亡相關。已經(jīng)表明，程序性細胞死亡的完成絕對依賴于ATP的存在，并且缺少該核苷酸時，細胞死亡的類型由程序性細胞死亡轉(zhuǎn)變?yōu)閴乃?。由于與壞死相關的細胞溶解對鄰近細胞產(chǎn)生進一步損傷，所以多細胞生物體更優(yōu)先傾向于細胞程序性細胞死亡而不是壞死。
因而考慮聚ADP核糖基化對在DNA損傷下細胞存活潛能的正作用和負作用之間的微妙平衡是非常重要的。
WO 00/04173描述了一種在真核細胞和生物體中，特別是植物細胞和植物體中，通過導入“PCD調(diào)控嵌合基因”影響內(nèi)源的聚ADP-核糖聚合酶(PARP)基因的表達和/或表觀活性來調(diào)節(jié)程序化細胞死亡(PCD)的方法。可以抑制或激活程序化細胞死亡。本發(fā)明特別涉及編碼具有PARP活性的蛋白的核苷酸序列的用途，用于調(diào)控PCD、提高生長速率或產(chǎn)生脅迫耐受性細胞和生物體。
PARG編碼基因在一些動物如大鼠(Rattus norvegicus)(基因登錄號NM_031339、NW_043030、AB019366)、小鼠(Mus musculus)(基因登錄號NT_039598、NM_003631、AF079557)、現(xiàn)代智人(Homo sapiens)(基因登錄號NT_017696、NM_003631、AF079557)、牛(Bos taurus)(基因登錄號NM_031339、NW_043030、AB019366)、果蠅(Drosophilamelanogaster)(基因登錄號AF079556)中得以鑒定。
在植物中，聚ADP-核糖糖基水解酶通過野生型基因的圖位克隆得以鑒定，其中所述基因在突變體中受到擬南芥的生物鐘控制的基因轉(zhuǎn)錄和光周期依賴的從營養(yǎng)生長至開花的轉(zhuǎn)換影響而失活(tej)?；虻暮塑账嵝蛄锌梢詮暮塑账釘?shù)據(jù)庫基因登錄號AF394690(Panda等，2002 Dev.Cell.第3期，51-61頁)獲得。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種方法來產(chǎn)生對脅迫條件耐受的植物，其中所述方法包括的步驟是給植物細胞提供嵌合基因以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中該嵌合基因包含下面的有效連接的DNA片段可在植物表達的啟動子；當轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生ParG抑制性RNA分子的DNA區(qū)；以及參與轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化的3’末端區(qū)。由轉(zhuǎn)基因植物細胞再生轉(zhuǎn)基因植物品系群體；并在轉(zhuǎn)基因植物品系群體中鑒定脅迫條件耐受植物品系。ParG抑制性RNA分子可以包含這樣的至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述的至少20個連續(xù)核苷酸來自存在于植物細胞的ParG基因(內(nèi)源ParG基因)的核苷酸序列。ParG抑制性RNA分子也可以包含這樣的至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述的連續(xù)核苷酸來自存在于植物細胞的ParG基因(內(nèi)源ParG基因)的核苷酸序列的互補序列。另外在另一實施方案中，ParG抑制性RNA可以包含這樣的有義區(qū)及反義區(qū)，所述有義區(qū)包含至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述的連續(xù)核苷酸來自存在于植物細胞的ParG基因的核苷酸序列，所述反義區(qū)包含至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述的連續(xù)核苷酸來自存在于植物細胞的ParG基因的核苷酸序列的互補序列，其中有義區(qū)和反義區(qū)能形成包含上述至少20個連續(xù)核苷酸的雙鏈RNA區(qū)。嵌合基因可進一步包含在所述編碼parG抑制性RNA分子的DNA區(qū)和3’末端區(qū)之間編碼自剪接核酶的DNA區(qū)。脅迫條件可選自熱、干旱、營養(yǎng)耗竭、氧化脅迫或強光照條件。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了一種方法以產(chǎn)生對脅迫條件耐受的植物，其中所述方法包括的步驟是分離至少100bp的包含目的植物部分parG編碼基因的DNA片段；通過有效地將可在植物表達的啟動子區(qū)以與啟動子相同的方向連接經(jīng)分離的包含植物部分parG編碼基因的DNA片段；以及以與啟動子區(qū)相反的方向連接經(jīng)分離的包含所述植物部分parG編碼基因的DNA片段，和參與轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化的3’末端區(qū)來產(chǎn)生嵌合基因。然后將這些嵌合基因提供給植物細胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細胞。由轉(zhuǎn)基因植物細胞再生轉(zhuǎn)基因植物品系群體；并在轉(zhuǎn)基因植物品系群體中鑒定脅迫耐受植物品系。本發(fā)明也涉及通過此方法獲得的脅迫耐受植物細胞和脅迫耐受植物。
又在本發(fā)明另一實施方案中，也提供了一種方法來產(chǎn)生對脅迫條件耐受的植物，其中所述的方法包括的步驟是給植物細胞提供嵌合基因以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細胞，該嵌合基因包含轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生ParG抑制性RNA分子的DNA區(qū)，其中該DNA區(qū)包含編碼下述蛋白質(zhì)的核苷酸序列中的至少21-100個核苷酸的核苷酸序列，其中所述的蛋白質(zhì)包含氨基酸序列SEQ IDNo 1、2或16，或包含SEQ ID 3、4、15或23的核苷酸序列的至少21-100個核苷酸，這些DNA區(qū)有效地連接至可在植物表達的啟動子及參與轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化的3’末端區(qū)上；從所述轉(zhuǎn)基因細胞再生轉(zhuǎn)基因植物品系群體；并在轉(zhuǎn)基因植物品系群體中鑒定脅迫耐受性植物。
本發(fā)明也提供了這樣的DNA分子，該DNA分子包含可在植物表達的啟動子，該啟動子有效地連接至轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生ParG抑制性RNA分子的DNA區(qū)，并連接有參與轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化的3’末端區(qū)上。ParG抑制性RNA分子可以包含這樣的至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述的連續(xù)核苷酸來自存在于植物細胞的ParG基因(內(nèi)源ParG基因)的核苷酸序列。ParG抑制性RNA分子也可以包含這樣的至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述的連續(xù)核苷酸來自存在于植物細胞的ParG基因(內(nèi)源ParG基因)的核苷酸序列的互補序列。又在另一實施方案中，ParG抑制性RNA可以包含這樣的有義區(qū)和反義區(qū)，所述有義區(qū)包含至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述的連續(xù)核苷酸來自存在于植物細胞的ParG基因的核苷酸序列，所述反義區(qū)包含至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述的連續(xù)核苷酸來自存在于植物細胞的ParG基因的核苷酸序列的互補序列，其中該有義和反義區(qū)能形成包含上述至少20連續(xù)核苷酸的雙鏈RNA區(qū)。嵌合基因可進一步包含在所述編碼parG抑制性RNA分子的DNA區(qū)和3’末端區(qū)之間編碼自剪接核酶的DNA區(qū)。嵌合基因也可以包含編碼下述蛋白質(zhì)的核苷酸序列中的至少21-100個核苷酸的核苷酸序列，其中所述的蛋白質(zhì)包含SEQ ID No 1、2或16的氨基酸序列，或嵌合基因包含SEQ ID 3、4、15或23的核苷酸序列的至少21-100個核苷酸。
又在另一實施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明DNA分子的植物細胞和基本由這些植物細胞組成的植物，也涉及產(chǎn)生脅迫耐受植物的方法，該方法包括進一步將這種植物與另一植物雜交的步驟。也提供這種包含本發(fā)明嵌合基因的植物的種子和繁殖材料。
本發(fā)明也涉及用于獲得脅迫耐受植物的方法，該方法包括的步驟是讓植物細胞系或植物或植物品系接受誘變；鑒定具有內(nèi)源ParG基因突變的那些植物細胞或植物；讓已鑒定的植物細胞或植物受到脅迫條件作用并鑒定耐受所述脅迫條件優(yōu)于對照植物的植物細胞或植物。備選地，可以通過對ParG抑制劑的抗性選擇植物細胞或植物并進一步如該段中描述的那樣處理植物細胞或植物。
本發(fā)明進一步涉及具有內(nèi)源ParG基因突變的脅迫耐受植物細胞或植物。
附圖簡述

圖1真核細胞中通過PARP/PARG作用的聚-ADP核糖聚合作用/解聚作用循環(huán)的圖示。
圖2在高光照強度脅迫下擬南芥品系的NAD+和ATP含量的圖表。黑框代表相對于在低光照強度下測定的NAD含量值以百分比表示的在高光照強度下的NAD含量。白框代表用相對于低光照強度下測定的ATP含量值以百分比表示的在高光照強度下的ATP含量。
圖3在氮耗竭脅迫下玉米品系的NAD+和ATP含量的圖表。黑框代表NAD含量而白框代表ATP含量。
優(yōu)選的實施方案詳述一方面，本發(fā)明基于闡述來自脅迫耐受植物品系的包含減少PARP基因表達的嵌合基因的細胞，其在不利條件下較來自未轉(zhuǎn)化植物品系的細胞表現(xiàn)出更高的NAD/ATP含量。另一方面，已經(jīng)觀察到使用基于衛(wèi)星病毒的瞬時沉默RNA載體在煙草中沉默PARG編碼基因的表達得到與使用同樣的沉默體系沉默PARP編碼基因觀察到的相似的表型。而且，在植物如擬南芥和煙草中沉默PARG編碼基因的表達得到對脅迫條件如施加高光照強度的條件更具耐受性的植物。
雖然不想將本發(fā)明限定為特定的作用模式，因為以下原因預計沉默PARG基因表達與沉默PARP基因表達得到相似的表型。如從圖1可看到的，通過PARP催化ADP核糖的聚合反應，消耗NAD，然后由PARG催化的聚ADP核糖的解聚作用。PARP蛋白自身的聚ADP核糖基化導致PARP蛋白的失活。植物細胞中導致NAD消耗并因而消耗ATP的ADP核糖聚合作用/解聚作用的循環(huán)速度可以通過降低PARP基因表達或降低PARP的酶活性來減緩或停止。因此，植物細胞以及包含這種細胞的植物對不利條件有更好的耐受性。這里提供的數(shù)據(jù)顯示通過降低PARG基因表達或減少PARG的酶活性來減緩或停止循環(huán)可獲得相似的效果。
本發(fā)明涉及通過在植物中改變ParG基因的表達水平，或通過改變PARG蛋白的活性或表觀活性來降低由于不利環(huán)境條件引起的植物細胞死亡，并因而涉及增強脅迫耐受性。便利地，ParG基因的表達水平可以通過導入嵌合基因來改變ParG基因的表達，或通過改變內(nèi)源PARG編碼基因包括通過改變表達信號而得以從基因上控制。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供一種方法用于產(chǎn)生對脅迫條件或不利生長條件耐受的植物，其中所述方法包括的步驟是-給植物細胞提供嵌合基因以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中所述嵌合基因包含以下有效連接的DNA片段可在植物中表達的啟動子，
DNA區(qū)，它在轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生ParG抑制性RNA分子；參與轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化的3’末端區(qū)；-從所述轉(zhuǎn)基因植物細胞再生轉(zhuǎn)基因植物品系群體；并且-在所述的轉(zhuǎn)基因植物品系群體中鑒定脅迫耐受性植物。
這里使用的“脅迫耐受植物”或“對脅迫條件或不利的生長條件耐受的植物”是一種這樣的植物(特別是根據(jù)本發(fā)明方法獲得的植物)，該植物當受不利生長條件影響一段時間時，例如但不限于受干旱、高溫、營養(yǎng)(特別是氮)供應是受限的、高光照強度影響時，比沒有根據(jù)本發(fā)明方法處理的對照植物生長的更好。這可以通過植物的總體外表顯而易見并可以測量，例如通過增加的生物量產(chǎn)量、在不利條件下持續(xù)的營養(yǎng)生長或更高的種子產(chǎn)量而測量。脅迫耐受性植物具有更廣的生長譜，即它們能經(jīng)受更廣范圍的氣候和其它非生物變化而沒有產(chǎn)量的損失。生化上，脅迫耐受性可以從脅迫條件下脅迫耐受植物比對照植物更高的NAD+-NADH/ATP含量和更低的活性氧類的生成顯而易見。脅迫耐受性也可以從在脅迫條件下的脅迫耐受植物與在相同條件下的對照植物相比較更高的葉綠素含量、更高的光合作用和更低的葉綠素熒光而顯而易見。
顯然，也不要求植物因為脅迫耐受性而在不利條件下持續(xù)生長是顯而易見的。通常，即便在生長過程中只遭遇相對較短周期的不利條件，根據(jù)本發(fā)明的植物或植物細胞與對照植物或植物細胞之間的脅迫耐受性差異也將是明顯的。
如這里使用的，“ParG抑制性RNA分子”是能優(yōu)選地通過轉(zhuǎn)錄后沉默減少植物細胞的內(nèi)源PARG編碼基因表達的RNA分子。顯然即便在ParG抑制性RNA分子通過轉(zhuǎn)錄后沉默減少PARG編碼基因表達時，這種RNA分子也可在細胞中起到其它作用，如指導內(nèi)源ParG基因的甲基化，最后又一次導致減少PARG編碼基因的表達。植物細胞的內(nèi)源PARG編碼基因的表達也可以通過轉(zhuǎn)錄沉默得以減少，如通過使用靶向內(nèi)源ParG基因的啟動子區(qū)的RNAi或dsRNA。
如這里使用的，“PARG編碼基因”或“ParG基因”是能編碼PARG(聚ADP核糖糖基水解酶)蛋白的基因，其中PARG蛋白通過內(nèi)切糖苷作用或外切糖苷作用釋放游離ADP核糖單位來催化聚ADP核糖的解聚。
PARG編碼基因可以包含編碼含有SEQ ID No 1(擬南芥(Arabidopsisthaliana))或SEQ ID No 2(馬鈴薯(Solanum tuberosum))或SEQ ID No 16(稻(Oryza sativa))或它們的一部分氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，例如包含SEQ ID No.3或SEQ ID 4或SEQ ID No 15或SEQ ID 23(玉米(Zea mays))的核苷酸序列的DNA片段。
然而，顯然技術人員能通過用源于上述植物的PARG編碼基因的探針，或甚至用源于上述PARG編碼基因的探針雜交從其它植物物種或甚至從動物物種中分離出變體DNA序列。為此目的，探針優(yōu)選地具有包含至少40個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述的連續(xù)核苷酸來自那些提到的PARG編碼基因序列的編碼區(qū)，優(yōu)選來自SEQ ID No 3或SEQ ID No 4的編碼區(qū)。然而探針可以包含更長的源于ParG基因的核苷酸序列區(qū)，如來自任意提到的ParG基因的約50、60、75、100、200或500個連續(xù)核苷酸。優(yōu)選地，探針包含編碼催化結(jié)構域的其中一個高度保守區(qū)的核苷酸序列，該序列通過比對來自動物的不同PARG蛋白而得以鑒定。這些區(qū)域也存在于來自擬南芥的經(jīng)鑒定PARG蛋白中，并且包含氨基酸序列LXVDFANXXXGGG(對應于SEQ ID No 1從位置252的氨基酸到位置264的氨基酸；X可以是任意氨基酸)LXVDFANXXXGGGXXXXGXVQEEIRF(對應于SEQ ID No 1從位置252的氨基酸到位置277的氨基酸)或LXVDFANXXXGGGXXXXGXVQEEIRFXXXPE(對應于SEQ ID No 1從位置252的氨基酸到位置282的氨基酸)、TGXWGCGXFXGD(對應于SEQ ID No 1從位置449的氨基酸到位置460的氨基酸)或TGXWGCGAFXGDXXLKXXXQ(對應于SEQ ID No 1從位置449的氨基酸到位置468的氨基酸)。其它保守區(qū)具有氨基酸序列DXXXRXXXXAIDA(對應于SEQ ID No 1從位置335的氨基酸到位置344的氨基酸)或REXXKAXXGF(對應于SEQ ID No 1從位置360的氨基酸到位置369的氨基酸)或GXXXXSXYTGY(對應于SEQ ID No 1從位置303的氨基酸到位置313的氨基酸)。優(yōu)選地在嚴格條件下進行雜交。
如這里使用的“嚴格雜交條件”指如果在探針與靶標序列之間有至少95％并優(yōu)選至少97％的序列同一性時，雜交一般會發(fā)生。嚴格的雜交條件的實例是在包含50％甲酰胺、5xSSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉鹽)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5x Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml經(jīng)變性的剪切的載體DNA如鮭魚精DNA的溶液中過夜孵育，隨后于大約65℃在0.1x SSC中洗滌雜交支持物如約10分鐘(兩次)。其它雜交和洗滌條件是熟知的并在Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，第二版，冷泉港，紐約(1989年)，特別是第11章中作為例子給出。
備選地，ParG編碼基因或其部分也可以通過基于PCR的技術，使用包含來自所述PARG編碼基因的核苷酸序列或它的互補序列的至少20個連續(xù)核苷酸的寡核苷酸作為引物得以分離。如上面提到的，這種引物可以包含編碼保守區(qū)的核苷酸序列，或與這種核苷酸序列互補?？捎糜诖四康牡墓押塑账峥砂琒EQ ID No.5、SEQ ID No 6、SEQ ID No.7或SEQ IDNo.8的核苷酸序列?？墒褂玫墓押塑账嵋部墒呛啿⒌模鏢EQ ID No 17、SEQ ID No 18、SEQ ID No 19；SEQ ID No 20、SEQ ID No 21或SEQ IDNo 22的寡核苷酸引物。
來自ParG基因的特定PCR片段可以例如通過使用具有SEQ ID No.5和SEQ ID No 6的核苷酸序列的寡核苷酸組合物，用例如擬南芥的基因組DNA或cDNA作為模板DNA，或通過使用具有SEQ ID No.7和SEQ IDNo 8的核苷酸序列的寡核苷酸組合物，用例如馬鈴薯的基因組DNA或cDNA作為模板DNA，在嚴格退火條件下獲得。
分離的序列可以編碼功能性PARG蛋白或其部分。優(yōu)選地，分離的序列包含編碼來自如所述PARG蛋白催化結(jié)構域的一個或多個高度保守區(qū)的核苷酸序列。
然而，為本發(fā)明目的不要求分離的序列編碼功能性PARG蛋白，也不要求分離全長編碼區(qū)。當然，本發(fā)明必需的是可以基于植物內(nèi)源ParG基因經(jīng)鑒定的或經(jīng)分離的序列而設計或產(chǎn)生的嵌合基因，該嵌合基因能產(chǎn)生ParG抑制性RNA?？商峁讉€備選的方法來產(chǎn)生這種ParG抑制性RNA分子。
在一個實施方案中，編碼ParG抑制性RNA分子的嵌合基因是基于所謂的反義技術。換而言之，嵌合基因的編碼區(qū)包含至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述的連續(xù)核苷酸來自植物細胞或植物內(nèi)源ParG基因的核苷酸序列的互補序列，目的在于降低內(nèi)源ParG基因的表達。此種嵌合基因可通過將來自經(jīng)分離或鑒定的ParG基因或此基因的部分的包含至少20個核苷酸的DNA片段以反向有效連接至可在植物表達的啟動子并與參與轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化的3’端形成區(qū)連接而常規(guī)構建。由此可見無需了解來自經(jīng)分離ParG基因的所述DNA片段的準確核苷酸序列或完整的核苷酸序列。
在另一實施方案中編碼ParG抑制性RNA分子的嵌合基因基于所謂的共抑制技術。換而言之，嵌合基因的編碼區(qū)包含至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述的連續(xù)核苷酸來自植物細胞或植物內(nèi)源ParG基因的核苷酸序列，目的在于降低內(nèi)源ParG基因的表達。這種嵌合基因可以通過有效地將包含至少20個核苷酸的DNA片段，其中所述的核苷酸來自經(jīng)分離的或鑒定的ParG基因或這種基因的一部分，以相同的方向，連接至可在植物表達的啟動子及參與轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化的3’末端區(qū)。再一次，不要求知道使用的DNA片段的確切核苷酸序列，其中所述的DNA片段來自經(jīng)分離的ParG基因。
上述嵌合基因降低內(nèi)源ParG基因表達的效率可以通過包含這樣的DNA元件而進一步增強，該DNA元件導致異常的、未多聚腺苷酸化的ParG抑制性RNA分子的表達。適合于此目的的一個這類DNA元件是編碼自剪接核酶的DNA區(qū)，如在WO 00/01133中描述的。
上述嵌合基因降低植物細胞內(nèi)源ParG基因表達的效率也可以通過同時將如此處描述的編碼反義ParG抑制性RNA分子的嵌合基因和如此處描述的編碼有義ParG抑制性RNA分子的嵌合基因包括至植物細胞中而得以進一步增強，其中所述的反義和有義ParG抑制性RNA分子能通過上述的至少20個連續(xù)核苷酸之間的堿基配對形成雙鏈RNA區(qū)，如WO 99/53050中描述。
如WO 99/53050中進一步描述的，能形成雙鏈RNA區(qū)的有義和反義ParG抑制性RNA區(qū)可以存在于一個RNA分子內(nèi)，優(yōu)選通過間隔區(qū)分開。該間隔區(qū)可包含內(nèi)含子序列。此種嵌合基因可以通過將來自經(jīng)分離的或鑒定的內(nèi)源ParG基因的包含至少20個核苷酸的DNA片段(目的在于降低內(nèi)源ParG基因表達)以反向重復有效地連接至可在植物表達的啟動子及參與轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化的3’末端形成區(qū)而常規(guī)構建。為了獲得這種嵌合基因的構建，可使用如WO 02/059294中描述的載體。
本發(fā)明的實施方案因而涉及用于獲得脅迫耐受植物品系的方法，其包括的步驟是-給植物細胞提供嵌合基因以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中所述嵌合基因包含以下有效連接的DNA片段可在植物表達的啟動子，DNA區(qū)，當轉(zhuǎn)錄時該DNA區(qū)產(chǎn)生包含至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列的ParG抑制性RNA分子，其中所述的連續(xù)核苷酸來自存在于所述植物細胞中的ParG基因的核苷酸序列；或DNA區(qū)，當轉(zhuǎn)錄時該DNA區(qū)產(chǎn)生包含至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列的ParG抑制性RNA分子，其中所述的連續(xù)核苷酸來自存在于所述植物細胞中的ParG基因核苷酸序列的互補序列；或DNA區(qū)，當轉(zhuǎn)錄時該區(qū)產(chǎn)生ParG抑制性RNA分子，其中所述的RNA分子包含這樣的有義區(qū)和反義區(qū)，其中所述有義區(qū)包含來自存在于所述植物細胞的ParG基因核苷酸序列的至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，所述反義區(qū)包含至少20個這樣的連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，所述連續(xù)核苷酸來自存在于所述植物細胞的ParG基因的核苷酸序列的互補序列，其中所述的有義和反義區(qū)能形成包含所述至少20個連續(xù)核苷酸的雙鏈RNA區(qū)。
-參與轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化的3’末端區(qū)；-從所述轉(zhuǎn)基因植物細胞再生轉(zhuǎn)基因植物品系群體；并且在所述的轉(zhuǎn)基因植物品系群體中鑒定脅迫耐受植物品系。
如此處所用“包含”應該理解為是指存在所談及的特征、整數(shù)、步驟或組分，但不排除存在或添加一個或多個特征、整數(shù)、步驟或組分或它們的組。因而，例如包含核苷酸序列或氨基酸序列的核酸或蛋白可以包含比實際上引用的核苷酸或氨基酸更多的核苷酸或氨基酸，即這些引用的核苷酸或氨基酸嵌入更大的核酸或蛋白中。包含在功能上或結(jié)構上定義了的DNA區(qū)的嵌合基因可以包含額外的DNA區(qū)等。
因而顯然，ParG編碼區(qū)的約20nt的反義或有義RNA區(qū)的最小核苷酸序列可以包含于更大的RNA分子中，大小變化從20nt大小到等于靶標基因的大小。
上述的反義或有義核苷酸區(qū)因而可以是從約21nt至約5000nt長，如21nt、40nt、50nt、100nt、200nt、300nt、500nt、1000nt、2000nt或甚至約5000nt或更大長度。
而且，為了本發(fā)明的目的不需要所使用的抑制性ParG RNA分子的核苷酸序列或嵌合基因的編碼區(qū)與目的在于降低其在細胞中表達的內(nèi)源ParG基因完全相同或互補。序列越長，對全部序列的同一性要求就越不嚴格。因而，有義或反義區(qū)可以與內(nèi)源ParG基因的核苷酸序列或它的互補序列具有約40％或50％或60％或70％或80％或90％或100％的全部序列同一性。然而，如提到的反義或有義區(qū)應該包含具有這樣的20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述的20個連續(xù)核苷酸與內(nèi)源ParG基因的核苷酸序列具有約100％的序列同一性。優(yōu)選地，約100％序列同一性的一段序列為約50、75或100nt。
為本發(fā)明目的，以百分率表示的兩個相關的核苷酸序列的“序列同一性”指在兩個進行最優(yōu)化比對的序列中具有相同殘基的位置數(shù)目(X100)除以比對的位置數(shù)目。缺口，即比對中殘基存在于一個序列但不存在于另一個序列的位置，可認為是具有非相同殘基的位置。通過Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)進行兩個序列的比對。使用標準軟件程序如GAP可以便利地實施計算機輔助序列比對，其中所述的GAP是Wisconsin程序包10.1版(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin大學，美國)的一部分，使用GAP時采用具有缺口創(chuàng)建罰分為50和缺口延伸罰分為3的默認計分矩陣。
顯然，無論何時通過提及相應的DNA分子的核苷酸序列描述RNA分子的核苷酸序列時，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)應該用尿嘧啶(U)代替。從本申請的內(nèi)容來看是在談及RNA或是在談及DNA分子是顯然的。
也顯然，能在特定植物品種或植物物種中產(chǎn)生用于特定ParG基因的抑制性ParG基因的嵌合基因也能用于抑制其它植物品種或植物物種中的ParG基因的表達。當然，當ParG抑制性RNA區(qū)和ParG基因之間存在足夠的同源性，或當ParG基因共有同樣的19個核苷酸的一段序列時，那些其它基因的表達也將得以下調(diào)。
鑒于核酸代謝中ParG的潛在作用，ParG抑制性RNA不完全抑制內(nèi)源ParG基因的表達是有利的。通過導入編碼ParG抑制性RNA的嵌合基因進行基因沉默來下調(diào)特定基因的表達將產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)基因品系群體，該品系群體表現(xiàn)出ParG基因的不同程度的沉默。因此該群體將包含獨立的轉(zhuǎn)基因植物品系，其中內(nèi)源ParG基因得以沉默至需要的沉默程度。本領域技術人員能輕易地鑒別這種植物品系，例如通過將植物品系接受特定的不利條件如高光照強度、氧化脅迫、干旱、熱等影響并選擇那些表現(xiàn)得令人滿意并在該處理下存活得很好的植物。
如此處所用，術語“啟動子”表示任何在轉(zhuǎn)錄起始期間被DNA-依賴的RNA聚合酶識別并結(jié)合(直接或間接地)的DNA。啟動子包括轉(zhuǎn)錄起始位點以及轉(zhuǎn)錄起始因子和RNA聚合酶的結(jié)合位點，并可包含多個其它位點(如增強子)，在這些位點可以結(jié)合基因表達調(diào)控蛋白。
如此處所用的術語“調(diào)控區(qū)”是指任何涉及驅(qū)動轉(zhuǎn)錄并控制特定DNA序列如編碼蛋白或多肽的DNA轉(zhuǎn)錄的時間和水平的DNA。例如，5’調(diào)控區(qū)(或“啟動子區(qū)”)是位于編碼序列上游(即5′)并包含啟動子和5’-非翻譯前導序列的DNA。3’調(diào)控區(qū)是位于編碼序列下游(即3’)并包含合適的轉(zhuǎn)錄終止(和/或調(diào)控)信號，該信號包括一個或多個多聚腺苷酸化信號的DNA序列。
在本發(fā)明的一個實施方案中，啟動子是組成型啟動子。在本發(fā)明另一實施方案中，啟動子活性可通過外部或內(nèi)部刺激如但不限于激素、化學化合物、機械刺激、非生物或生物脅迫條件來增強(誘導型啟動子)。也可以以時間或空間的方式調(diào)節(jié)啟動子的活性(組織特異性啟動子；發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動子)。
為本發(fā)明目的，啟動子是可在植物表達的啟動子。如此處所用，術語“可在植物表達”表示能在植物細胞中控制(啟動)轉(zhuǎn)錄的DNA序列。這包括植物源的任何啟動子，但也包括任何能在植物細胞中指導轉(zhuǎn)錄的非植物源啟動子，即某些病毒或細菌源啟動子如CaMV35S(Hapster等，1988年)、地下三葉草病毒啟動子No 4或No 7(WO9606932)或T-DNA基因啟動子，也包括組織特異性或器官特異性啟動子，其包括但不限于種子特異性啟動子(如，WO89/03887)、器官特異性啟動子(An等，1996年)、莖特異性啟動子(Keller等，1988年)、葉特異性啟動子(Hudspeth等，1989年)、葉肉特異性啟動子(如光可誘導的Rubisco啟動子)、根特異性啟動子(Keller等，1989年)、塊莖特異性啟動子(Keil等1989年)、維管組織特異性啟動子(Peleman等1989年)、雄蕊選擇性啟動子(WO 89/10396，WO 92/13956)、開裂區(qū)特異性啟動子(WO 97/13865)等。
用于將嵌合基因?qū)胫参镏械姆椒楸绢I域熟知并包括農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化、粒子槍遞送、微注射、完整細胞的電穿孔、聚乙二醇介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體的電穿孔、脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)化、硅須(silicon-whisker)介導的轉(zhuǎn)化等。以這種方式獲得的經(jīng)轉(zhuǎn)化細胞隨后可以再生為成熟可繁殖的植物。
根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細胞和細胞系可進一步包含如WO 00/04173中描述的能減少PARP基因表達的嵌合基因。這些其它的嵌合基因可以如通過將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物品系與包含降低PARP基因表達的嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物雜交而導入。轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物品系也可以通過將本發(fā)明的嵌合基因?qū)牖蜣D(zhuǎn)化至包含降低PARP基因表達的嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物細胞內(nèi)獲得，或反之亦然。備選地，PARP和PARG抑制性RNA區(qū)可以由一個嵌合基因編碼并作為一個RNA分子轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明的嵌合基因(或與之對應的抑制性RNA分子)也可以以瞬時的方式例如使用病毒載體如像在WO 00/63397或WO 02/13964中描述的病毒RNA載體導入植物細胞中。
如果已經(jīng)讀過該說明書，熟練的技術人員應該立即清楚，可使用PARG活性被降低的突變植物細胞和細胞品系以達到與這里描述的轉(zhuǎn)基因植物細胞和植物品系相同的效果。植物細胞或植物中的ParG基因中的突變可以通過使用本領域已知的篩選方法輕易地鑒定，為此，化學誘變?nèi)鏓MS誘變可與靈敏的檢測方法(如變性HPLC)結(jié)合。該技術的一個實例是所謂的“定向誘導基因組局部突變”方法，該方法在McCallum等、PlantPhysiology 123 439-442或WO 01/75167中有描述。然而，其它在特定的基因區(qū)或等位基因中檢測突變的方法也是可用的，并且包括篩選已經(jīng)存在或新產(chǎn)生的插入突變植物品系的文庫，為此將這些突變植物品系的基因組DNA庫進行PCR擴增，擴增使用對插入的DNA片段特異的引物或?qū)ζ渲蓄A計有插入的基因組區(qū)或等位基因特異的引物(見如Maes等，1999年，Trends in Plant Science，4，pp 90-96)。
植物細胞系和植物品系也可通過選擇對ParG抑制劑如沒食子鞣質(zhì)的抗性而進行誘變(Ying等，(2001).Proc.Natl.Acad.Sci.美國98(21)，12227-12232；Ying，W.，Swanson，R.A.(2000).NeuroReport 11(7)，1385-1388。
因此，本領域用于鑒定包含ParG基因突變的植物細胞或植物品系的方法是可用的。這些突變細胞或突變植物品系群體隨后能置于不同的非生物脅迫條件之下，并且能很容易地測定它們的表型或存活。而且，能測定受脅迫細胞的NAD和/或ATP含量并且與不受脅迫細胞的這種測定結(jié)果相比較。在脅迫耐受細胞中，NAD含量在脅迫條件下的減少量與非脅迫細胞相比較時比相應對照細胞的減少量低。
提供包含本發(fā)明嵌合基因或RNA分子的植物細胞和植物也是本發(fā)明的目的。通過傳統(tǒng)的繁殖方法產(chǎn)生的包含本發(fā)明嵌合基因的植物的配子、種子、胚、合子或體細胞、后代或雜種也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。
通過這里描述的方法獲得的植物可以進一步通過傳統(tǒng)的繁殖技術將其與其它植物雜交而獲得包含本發(fā)明嵌合基因的脅迫耐受子代植物。
認為這里描述的方法和手段適于所有的植物細胞和植物，即雙子葉植物和單子葉植物細胞及雙子葉植物和單子葉植物，包括但不限于棉花、蕓苔類蔬菜、油菜、小麥、谷物或玉米、大麥、紫花苜蓿、花生、向日葵、稻、燕麥、甘蔗、大豆、草坪草、大麥、黑麥、高粱、甘蔗、蔬菜(包括菊苣、萵苣、馬鈴薯、南瓜、柿子椒、茄子、黃瓜、甜瓜、洋蔥、韭蔥)、煙草、馬鈴薯、甜菜、木瓜、菠蘿、芒果、擬南芥，還包括用于園藝、花藝或林業(yè)(白楊、冷杉、桉樹等)的植物。
下面非限定性實施例描述了增加植物協(xié)迫耐受性的本發(fā)明方法和手段。
除非在實施例中另外聲明，所有的重組DNA技術根據(jù)如Sambrook等(1989)分子克隆A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，紐約，和Ausubel等的第1和2卷(1994)CurrentProtocols in Molecular Biology(Current Protocols，美國)中描述的標準方法實施。用于植物分子研究的標準材料和方法描述于R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993年)，由BIOS ScientificPublications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK共同出版。標準分子生物技術的其它參考書包括Sambrook和Russell(2001)Molecular CloningA Laboratory Manual，第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press，紐約，Brown(1998年)Molecular Biology LabFax，第二版，第1和2卷，Academic Press(UK)。用于聚合酶鏈反應的標準材料和方法能在Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer實驗室手冊，冷泉港出版社，及在McPherson等，(2000)PCR-BasicsFrom Background to Bench，第一版(Springer Verlag，德國)中找到。
在整個說明書和實施例中，提及下列序列SEQ ID N°1來自擬南芥的ParG蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID N°2來自馬鈴薯部分ParG蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID N°3來自擬南芥的編碼ParG蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID N°4來自馬鈴薯的編碼部分ParG蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID N°5寡核苷酸引物的核苷酸序列，該序列適用于編碼部分ParG蛋白的DNA片段的PCR擴增。
SEQ ID N°6寡核苷酸引物的核苷酸序列，該序列適用于編碼部分ParG蛋白的DNA片段的PCR擴增。
SEQ ID N°7寡核苷酸引物的核苷酸序列，該序列適用于編碼部分ParG蛋白的DNA片段的PCR擴增。
SEQ ID N°8寡核苷酸引物的核苷酸序列，該序列適用于編碼部分ParG蛋白的DNA片段的PCR擴增。
SEQ ID N°9 T-DNA載體的核苷酸序列，該序列包含基于擬南芥ParG基因序列的降低ParG表達的嵌合基因。
SEQ ID N°10PARG蛋白的保守序列1的氨基酸序列。
SEQ ID N°11 PARG蛋白的保守序列2的氨基酸序列。
SEQ ID N°12PARG蛋白的保守序列3的氨基酸序列。
SEQ ID N°13PARG蛋白的保守序列4的氨基酸序列。
SEQ ID N°14PARG蛋白的保守序列5的氨基酸序列。
SEQ ID N°15來自稻的ParG蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID N°16來自稻的ParG蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID N°17寡核苷酸引物PG1的核苷酸序列，該序列適用于編碼部分ParG蛋白的DNA片段的PCR擴增。
SEQ ID N°18寡核苷酸引物PG2的核苷酸序列，該序列適用于編碼部分ParG蛋白的DNA片段的PCR擴增。
SEQ ID N°19寡核苷酸引物PG3的核苷酸序列，該序列適用于編碼部分ParG蛋白的DNA片段的PCR擴增。
SEQ ID N°20寡核苷酸引物PG4的核苷酸序列，該序列適用于編碼部分ParG蛋白的DNA片段的PCR擴增。
SEQ ID N°21寡核苷酸引物PG5的核苷酸序列，該序列適用于編碼部分ParG蛋白的DNA片段的PCR擴增。
SEQ ID N°22寡核苷酸引物PG6的核苷酸序列，該序列適用于編碼部分ParG蛋白的DNA片段的PCR擴增。
SEQ ID N°23來自玉米的編碼ParG蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID N°24T-DNA載體的核苷酸序列，該序列包含能夠降低PARG表達的嵌合基因。
SEQ ID N°25T-DNA載體的核苷酸序列，該序列包含能夠降低PARG表達的嵌合基因。
實施例實施例1.脅迫對包含降低PARP基因表達的嵌合基因的轉(zhuǎn)基因脅迫耐受植物品系的能量產(chǎn)生效率的影響分析。
如WO 00/04173中描述，將包含降低PARP基因表達的嵌合基因的轉(zhuǎn)基因歐洲油菜(Brassica napus)植物的下胚軸在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天。隨后將外植體轉(zhuǎn)移至包含30mg/L阿司匹林或乙酰水楊酸(產(chǎn)生氧化脅迫條件)的液體培養(yǎng)基中一天。在對照實驗中，將非轉(zhuǎn)基因歐洲油菜植物N90-740的下胚軸在同樣的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)并且隨后在包含30mg/L阿司匹林的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天。而且，將轉(zhuǎn)基因品系和對照品系的下胚軸都放在同樣的沒有阿司匹林的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
培養(yǎng)期后，每個實驗測定125個外植體的ATP含量。而且，測定125個外植體3小時內(nèi)的耗氧量。結(jié)果總結(jié)于表1中。平均值的標準誤差少于6％。然而，對照植物中ATP摩爾數(shù)與毫克耗氧量的比率在施用氧化脅迫時于對照植物中降低，而在脅迫耐受的轉(zhuǎn)基因植物品系中這一比率在施用氧化脅迫時升高，并且相當多地高于對照植物中的比率(約高24％)。因而脅迫耐受性植物品系保持不變的能量產(chǎn)生效率，而對照品系表現(xiàn)出降低的能量產(chǎn)生效率。而且，超氧化物的產(chǎn)生量，其以在沒有受到氧化脅迫的對照植物中產(chǎn)生的超氧化物的百分比表示，在受到脅迫條件作用的脅迫耐受植物中沒有增加。
表1.脅迫對培養(yǎng)了5天的歐洲油菜下胚軸外植體的能量生產(chǎn)效率的影響。
在另一個實驗中，4種不同的轉(zhuǎn)基因擬南芥品系的NAD+和ATP含量在高光照強度或低光強度下得以測定，該4種不同的轉(zhuǎn)基因擬南芥品系包含如WO 00/04173中描述的降低PARP基因表達的嵌合基因，并且與在相同條件下從非轉(zhuǎn)化對照品系中獲得的值相比較。這4種不同的品系表現(xiàn)出不同的脅迫耐受程度，由例如通過它們抵抗熱和/或干旱條件的能力表現(xiàn)。在高光照強度脅迫下獲得的NAD和ATP含量值以相對低光照強度條件下NAD和ATP含量值的百分比表示，并在圖2中以圖表畫出。
結(jié)果顯示高光照強度脅迫在對照植物細胞和在脅迫耐受性最小的轉(zhuǎn)基因植物品系中引起顯著的NAD減少。轉(zhuǎn)基因植物品系的脅迫耐受性越強，在高光照強度脅迫條件下NAD的減少越不明顯。
在另一個實驗中，分離型群體的NAD+和ATP含量在營養(yǎng)(氮)耗竭條件下得以測定，該分離型群體通過將包含如WO 00/04173中描述的降低PARP基因表達的嵌合基因的轉(zhuǎn)基因玉米品系與非轉(zhuǎn)基因玉米品系雜交得到，并且將該含量與相同條件下從非轉(zhuǎn)化對照品系獲得的值相比較。圖3是獲得的結(jié)果的圖形表示。半合子品系和單性合子(azygous)品系通過對選擇性標記基因的存在加以確認而區(qū)分。在半合子脅迫耐受植物中的NAD和ATP含量明顯地比在非轉(zhuǎn)化對照植物或單性合子植物中的含量高。
實施例2.降低ParG基因表達的嵌合基因的構建。
為了降低PARG基因如在擬南芥和其相關植物中的表達，構建能表達包含可形成雙鏈RNA的有義區(qū)和反義區(qū)的dsRNA的嵌合基因。這種dsRNA通過轉(zhuǎn)錄后沉默對降低與其具有序列同源性的基因的表達很有效。嵌合基因包含以下DNA片段來自花椰菜花葉病毒的啟動子區(qū)(CaMV 35S)；相同方向的包含來自擬南芥ParG基因的163bp DNA片段(Genbank登錄號AF394690的核苷酸位置973到1135)；編碼來自黃花菊(Flaveria)pdk基因內(nèi)含子2的DNA片段；相反方向的包含來自擬南芥ParG基因的163bp DNA片段(Genbank登錄號AF394690的核苷酸位置973到1135)；來自根癌農(nóng)桿菌的章魚堿合成酶的3’非翻譯端的片段。
將這種嵌合基因與能提供除草劑膦絲菌素抗性的選擇性標記基因在T-DNA的左邊界序列和右邊界序列之間一同導入T-DNA載體。
為了減少PARG基因在如馬鈴薯及相關植物中的表達，構建能表達包含來自馬鈴薯cDNA序列的有義區(qū)和反義區(qū)的dsRNA的嵌合基因，該嵌合基因能編碼與擬南芥PARG蛋白的N-端部分有高度序列同一性的蛋白。嵌合基因包含以下DNA片段
來自花椰菜花葉病毒的啟動子區(qū)(CaMV 35S)；相同方向的包含來自馬鈴薯(Genbank登錄號BE340510)ParG同源物的至少100bp序列的DNA片段；編碼來自黃花菊的pdk基因內(nèi)含子2的DNA片段；相反方向的包含來自馬鈴薯(Genbank登錄號BE340510)ParG同源物的至少100bp序列的DNA片段；來自根癌農(nóng)桿菌的章魚堿合成酶基因的3’非翻譯端的片段。
將這種嵌合基因與能提供除草劑膦絲菌素抗性的選擇性標記基因在T-DNA的左邊界序列和右邊界序列之間一同導入T-DNA載體。
實施例3.分析包含降低ParG基因表達的嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物品系。
通過農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化，將實施例2的嵌合基因分別導入擬南芥或馬鈴薯中。
將獲得的轉(zhuǎn)基因品系群體與對照植物一起接受如下脅迫條件的影響-升溫幾天(溫室)或幾小時(體外(in vitro))-干旱幾天-幾天的高光照強度-營養(yǎng)耗竭選擇在以上所提到的脅迫條件下存活得很好的獨立的植物品系。
測定在對照和脅迫條件下上述植物的NAD含量和ATP含量。
實施例4.植物細胞中NAD、ATP和超氧化物自由基的定量測定。
基本上如Rawyler等(1999)，Plant Physiol.120，293-300描述實施植物組織中ATP的定量。該檢測法用于測定在A2S3培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-5天的下胚軸外植體或體外培養(yǎng)2周大的擬南芥植物的ATP含量。所有的操作都在碎冰塊上進行，除非有另外的說明。
ATP的提取-用液氮冷凍植物材料
100個下胚軸外植體±700mg擬南芥植物(根+芽)(大約32-37個18天大C24植物)-將冷凍的下胚軸置于研缽中并且加入6ml 6％的高氯酸。
-在室溫下使用杵提取。提取后，迅速地將樣品置于冰上。
-在4℃下24,000g(Sorvall、SS34轉(zhuǎn)頭，于14,000轉(zhuǎn)/分鐘)離心10分鐘。
-用5M K2CO3中和上清液(加入350μl的5M K2CO3至3ml的上清液)。
-如上所述通過離心將KClO4移除。
ATP的定量生物發(fā)光測定-使用購自Sigma的ATP生物發(fā)光檢測試劑盒(FL-AA)。
-稀釋提取液6000x(從大約6mL提取液中取出100μl，將其稀釋1000倍)，用ATP生物發(fā)光檢測試劑盒的‘ATP檢測混合稀釋緩沖液(FL-AAB)’進行所述稀釋。
-使用Turner Designs(Sunnyvale，美國)的TD-20/20發(fā)光計測量所產(chǎn)生的發(fā)光量。
-標準曲線在10ml水中溶解試劑盒的標準品ATP(FL-AAS)(2×10-6摩爾)。
對植物組織中NAD+和NADH的定量基本上如Karp等(1983)或Filipovic等(1999)的描述在以下植物材料中進行歐洲油菜150個培養(yǎng)了5天的下胚軸外植體/樣本擬南芥1000mg體外生長了18天大的植物(芽+根)/樣本(對應于±60 C24植物)檢測液(A)用于測量NADH25mM磷酸鉀緩沖液pH70.1mM DTT
3μM FMN(Fluka，83810)30μM正癸醛(Sigma，D-7384)(B)用于測量NAD++NADH如僅用于測量NADH，則同上+2μg/mL醇脫氫酶(Roche，102717)提取-用液氮冷凍-將冷凍的植物材料放入冷卻的研缽中(在-20℃冷卻)并加入5mL提取緩沖液-用杵碾碎材料-4℃下24,000g(Sorvall公司，SS34轉(zhuǎn)子，14,000轉(zhuǎn)/分鐘)離心15分鐘-取出1mL上清液用于分析檢測法NADH390μL檢測液A+10μL提取液+2μL NAD(P)H:FMN氧化還原酶+100μL熒光素酶溶液NAD++NADH390μL檢測液B+10μL提取液室溫下2分鐘+2μL NAD(P)H:FMN氧化還原酶+100μL熒光素酶溶液使用Turner Designs(Sunnyvale，美國)的TD-20/20發(fā)光計測量所產(chǎn)生的發(fā)光量。
NADH-標準品
NADH貯液1mM(7.1mg/10mL水)NADH二鈉鹽，Roche公司，107 73510mM磷酸鉀緩沖液pH7中系列稀釋(10-2)；5×10-3；2×10-3；10-3；5×10-4將10μL稀釋液加至390μL檢測液A中并進行反應，繪制標準曲線如De Block和De Brouwer(2002)Plant Physiol，Biochem，40，845-852中描述通過定量XTT的還原來測量超氧化物自由基的產(chǎn)生量。
歐洲油菜培養(yǎng)基和反應緩沖液播種培養(yǎng)基(培養(yǎng)基201)半濃縮的Murashige和Skoog鹽2％蔗糖pH5.80.6％瓊脂(Difco Bacto Agar)250mg/l triacillin愈傷組織誘導培養(yǎng)基A2S3MS培養(yǎng)基，0.5g/l Mes(pH 5.8)，3％蔗糖，40mg/l腺嘌呤-SO4，0.5％瓊脂糖，1mg/l 2，4-D，0.25mg/l NAA，1mg/l BAP，250mg/l triacillin孵育培養(yǎng)基25mM的pH5.8的磷酸鉀緩沖液2％蔗糖每25ml培養(yǎng)基1滴Tween20反應緩沖液50mM的pH7.4的磷酸K緩沖液1mM鈉，3’-{1-[苯基氨基-羰基]-3，4-四唑}-雙(4-甲氧基-6-硝基)＝XTT(bts，德國，目錄號2525)
每25ml緩沖液1滴Tween20滅菌種子-種子預萌發(fā)-幼苗生長。將種子浸于70％的乙醇中2分鐘，隨后在包含0.1％Tween20的次氯酸鈉溶液(含約6％活性氯)中表面滅菌15分鐘。最后，用1升滅菌自來水將種子漂洗。將種子在滅菌自來水中培育至少1小時(以便讓可能抑制萌芽的成分從種子擴散)。將種子置于裝有50ml滅菌自來水(+250mg/l triacillin)的250ml錐形瓶中。搖動約20小時。將長出胚根的種子置于購自Duchefa的裝有約125ml播種培養(yǎng)基的Vitro Vent容器中(10顆種子/容器，不要太多以減少由污染引起的種子損失)。種子在±24℃及10-30Einstein/s-1m-2且晝長為16小時萌發(fā)。
下胚軸外植體的預培養(yǎng)和脅迫誘導-播種后12-14天，將下胚軸剪為約7-10mm的節(jié)段。
-將下胚軸外植體(25個下胚軸/Optilux Petridish，F(xiàn)alcon S1005，丹麥)于25℃下在培養(yǎng)基A2S3上培養(yǎng)5天(在10-30Einstein/s-1m-2下)XTT-檢測-將150個下胚軸外植體轉(zhuǎn)移至50ml Falcon管中。
-用反應緩沖液(無XTT)洗滌。
-加入20mL反應緩沖液+XTT。(需浸沒外植體，但不用真空浸潤)-于26℃下在黑暗中培養(yǎng)約3小時-于470nm處測定反應培養(yǎng)基的吸光度擬南芥培養(yǎng)基和反應緩沖液植物培養(yǎng)基半濃縮的Murashige和Skoog鹽B5維生素1.5％蔗糖pH5.80.7％的Difco瓊脂孵育培養(yǎng)基
10mM pH5.8的磷酸鉀緩沖液2％蔗糖每25ml培養(yǎng)基1滴Tween20反應緩沖液50mM pH7.4的磷酸鉀緩沖液1mM鈉，3’-{1-[苯基氨基-羰基]-3，4-四唑}-雙(4-甲氧基-6-硝基)＝XTT(bts，德國，目錄號2525)每25ml緩沖液1滴Tween20擬南芥植物-擬南芥品系對照品系用于試驗品系-擬南芥種子滅菌70％乙醇2分鐘10分鐘漂白(6％活性氯)+每20ml溶液1滴Tween 20用無菌自來水洗滌5次-種子預萌發(fā)裝有12ml無菌自來水的9cm Optilux Petridishes(Falcon)。
低光照過夜24小時。
-擬南芥植物的生長將種子在Falcon公司的Intergrid組織培養(yǎng)盤中播種(nr，3025)裝有±125ml植物培養(yǎng)基1粒種子/格。
植物在24℃，30μEinstein s-1m-2，16小時光照-8小時黑暗生長約3周(結(jié)實之前)XTT-檢測對照條件(無脅迫)從瓊脂平板收獲芽(包括根)并直接將它們置于裝有反應緩沖液(無XTT)的50ml Falcon管中受脅迫的芽將芽轉(zhuǎn)移至裝有反應緩沖液(無XTT)的50ml Falcon管中用含有XTT的緩沖液(40mL/管)替換反應緩沖液需要將芽浸沒，但是不用真空浸潤黑暗中26℃下培養(yǎng)約3小時測量470nm處反應培養(yǎng)基的吸光度如下通過使用克拉克極譜電極(Cark polarographic electrode)測量耗氧量來定量呼吸作用植物材料歐洲油菜150-200*下胚軸外植體25℃培養(yǎng)5天(參考活力檢測法)*150個外植體誤差＜10％；200個外植體誤差＜6％擬南芥為獲得C24±1000mg*in vitro植物(芽+根)(對應于約50個18天大的植物)播種之前將種子預萌發(fā)24℃生長18天(參考體外生長擬南芥方法)*誤差＜8％孵育培養(yǎng)基歐洲油菜25mM pH5.8磷酸鉀緩沖液2％蔗糖Tween20(1滴/25ml)擬南芥10mM pH5.8磷酸鉀緩沖液
2％蔗糖Tween20(1滴/25ml)使用之前，通過攪拌至少幾小時而充分使培養(yǎng)基充氣(充滿氧氣)。
檢測將外植體置于裝滿孵育培養(yǎng)基的100ml玻璃瓶(Schott公司，德國)中。在每個瓶中放入同樣重量的芽(±700mg)裝瓶至溢出并蓋緊(避免大的氣泡)同樣將一個瓶裝滿不包含外植體的孵育培養(yǎng)基(對照)于24℃低光強度孵育3-4小時(歐洲油菜)3小時(擬南芥)在孵育過程中輕微搖晃(避免外植體周圍培養(yǎng)基的氧氣消耗)使用手持溶氧測量儀(Cyberscan DO 310；Eutech Instruments，新加坡)來測量孵育培養(yǎng)基的氧濃度(mg/l)。
mg/l耗氧量＝[氧]對照-[氧]樣本。
實施例5.分析包含降低ParG基因表達的嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物品系通過農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化將實施例2中的嵌合基因?qū)霐M南芥和一種煙草(Nicotiana tabacum c.v.Petit Havana SR1)中。
讓轉(zhuǎn)基因種子在含有MS鹽/2；B5維生素；1.5％蔗糖；pH5.8和0.7％Difco瓊脂的培養(yǎng)基中萌發(fā)。將萌發(fā)的種子接受低光照強度(約30μmol m-1s-1的光合作用光子通量下14到18天，隨后光照強度提高6倍(約190μmol m-1s-1的光合作用光子通量))。1天后，用循環(huán)酶法(enzymaticcycling method)(Karp等(1983年)Anal，Biochem，128，pp 175-180)測定NAD和NADH含量。將一部分幼苗在高光照條件下進一步培養(yǎng)大約3天到數(shù)天，之后評價損傷。損傷由嫩葉和芽尖變暗、較老的葉子的褪色以及生長受阻而看出來。擬南芥的結(jié)果總結(jié)于表1而煙草的結(jié)果總結(jié)于表2。
表1.擬南芥(Columbia)的分析。±R表示觀察到一些暗色素沉淀。ND未測定
表2.煙草(Nicotiana tabacum c.v.Petit Havana SR1)的分析?！繰/S表示對耐受顯型不是很清楚。
轉(zhuǎn)基因植物對高光照強度脅迫的耐受性和細胞中NAD+NADH含量之間存在正相關。在TTC還原能力和高光照強度耐受性之間存在負相關。
實施例6.構建適用于谷類植物的降低ParG基因表達的嵌合基因的為了減少例如在谷類植物如稻或玉米及相關植物中PARG基因的表達，構建了能表達包含來自稻核苷酸序列的有義區(qū)和反義區(qū)的dsRNA的嵌合基因，該嵌合基因能編碼與PARG蛋白有高度序列同一性的蛋白。嵌合基因包含以下DNA片段來自花椰菜花葉病毒的啟動子區(qū)(CaMV 35S)；相同方向的包含來自稻(SEQ ID No 15)ParG同源物的至少100bp序列的DNA片段；編碼來自黃花菊pdk基因內(nèi)含子2的DNA片段；相反方向的包含來自稻(SEQ ID No 15)ParG同源物的至少100bp序列的DNA片段；來自根癌農(nóng)桿菌的章魚堿合成酶基因3’非翻譯端的片段。
將這種嵌合基因與能提供抗性如除草劑膦絲菌素抗性的選擇性標記基因在T-DNA的左邊界序列和右邊界序列之間一同導入T-DNA載體。
為了減少如在谷類植物如稻或玉米及相關植物中PARG基因的表達，構建了能表達包含來自稻核苷酸序列的有義區(qū)和反義區(qū)的dsRNA的嵌合基因，該嵌合基因能編碼與PARG蛋白編碼列有高度序列同一性的蛋白。嵌合基因包含以下DNA片段來自花椰菜花葉病毒的啟動子區(qū)(CaMV 35S)；相同方向的包含來自玉米(SEQ ID No 23)ParG同源物的至少100bp序列的DNA片段；編碼來自黃花菊pdk基因內(nèi)含子2的DNA片段；相反方向的包含來自玉米(SEQ ID No 23)ParG同源物的至少100bp序列的DNA片段；來自根癌農(nóng)桿菌的章魚堿合成酶基因3’非翻譯端的片段。
將這種嵌合基因與能提供抗性如除草劑膦絲菌素抗性的選擇性標記基因在T-DNA的左邊界序列和右邊界序列之間一同導入T-DNA載體。這類T-DNA載體的兩個實例的核苷酸序列在SEQ ID Nos 24和25中描述，其中這類載體包含如前面段落描述的兩種不同嵌合基因。
實施例7.分析包含降低ParG基因表達的嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物品系通過農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化將實施例6的嵌合基因分別導入稻或玉米中。
所獲得的轉(zhuǎn)基因品系群體與對照植物一起受如下脅迫條件的影響-升溫幾天(溫室中)或幾小時(體外)-干旱幾天-幾天的高光照強度-營養(yǎng)耗竭選擇在上述脅迫條件下存活得很好的獨立植物品系。
在對照和脅迫條件下測定上述植物的NAD含量和ATP含量。
序列表<110>拜爾生物科學公司<120>用于增加植物對脅迫條件耐受性的方法和手段<130>BCS 03 2002 WO1<150>EP03076044.1<151>2003-04-09<150>US 60/496,688<151>2003-08-21<160>25<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>548<212>PRT<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1
Met Glu Asn Arg Glu Asp Leu Asn Ser Ile Leu Pro Tyr Leu Pro Leu1 5 10 15Val Ile Arg Ser Ser Ser Leu Tyr Trp Pro Pro Arg Val Val Glu Ala20 25 30Leu Lys Ala Met Ser Glu Gly Pro Ser His Ser Gln Val Asp Ser Gly35 40 45Glu Val Leu Arg Gln Ala Ile Phe Asp Met Arg Arg Ser Leu Ser Phe50 55 60Ser Thr Leu Glu Pro Ser Ala Ser Asn Gly Tyr Ala Phe Leu Phe Asp65 70 75 80Glu Leu Ile Asp Glu Lys Glu Ser Lys Arg Trp Phe Asp Glu Ile Ile85 90 95Pro Ala Leu Ala Ser Leu Leu Leu Gln Phe Pro Ser Leu Leu Glu Val100 105 110His Phe Gln Asn Ala Asp Asn Ile Val Ser Gly Ile Lys Thr Gly Leu115 120 125Arg Leu Leu Asn Ser Gln Gln Ala Gly Ile Val Phe Leu Ser Gln Glu130 135 140Leu Ile Gly Ala Leu Leu Ala Cys Ser Phe Phe Cys Leu Phe Pro Asp145 150 155 160Asp Asn Arg Gly Ala Lys His Leu Pro Val Ile Asn Phe Asp His Leu165 170 175
Phe Ala Ser Leu Tyr Ile Ser Tyr Ser Gln Ser Gln Glu Ser Lys Ile180 185 190Arg Cys Ile Met His Tyr Phe Glu Arg Phe Cys Ser Cys Val Pro Ile195 200 205Gly Ile Val Ser Phe Glu Arg Lys Ile Thr Ala Ala Pro Asp Ala Asp210 215 220Phe Trp Ser Lys Ser Asp Val Ser Leu Cys Ala Phe Lys Val His Ser225 230 235 240Phe Gly Leu Ile Glu Asp Gln Pro Asp Asn Ala Leu Glu Val Asp Phe245 250 255Ala Asn Lys Tyr Leu Gly Gly Gly Ser Leu Ser Arg Gly Cys Val Gln260 265 270Glu Glu Ile Arg Phe Met Ile Asn Pro Glu Leu Ile Ala Gly Met Leu275 280 285Phe Leu Pro Arg Met Asp Asp Asn Glu Ala Ile Glu Ile Val Gly Ala290 295 300Glu Arg Phe Ser Cys Tyr Thr Gly Tyr Ala Ser Ser Phe Arg Phe Ala305 310 315 320Gly Glu Tyr Ile Asp Lys Lys Ala Met Asp Pro Phe Lys Arg Arg Arg325 330 335Thr Arg Ile Val Ala Ile Asp Ala Leu Cys Thr Pro Lys Met Arg His340 345 350
Phe Lys Asp Ile Cys Leu Leu Arg Glu Ile Asn Lys Ala Leu Cys Gly355 360 365Phe Leu Asn Cys Ser Lys Ala Trp Glu His Gln Asn Ile Phe Met Asp370 375 380Glu Gly Asp Asn Glu Ile Gln Leu Val Arg Asn Gly Arg Asp Ser Gly385 390 395 400Leu Leu Arg Thr Glu Thr Thr Ala Ser His Arg Thr Pro Leu Asn Asp405 4l0 415Val Glu Met Asn Arg Glu Lys Pro Ala Asn Asn Leu Ile Arg Asp Phe420 425 430Tyr Val Glu Gly Val Asp Asn Glu Asp His Glu Asp Asp Gly Val Ala435 440 445Thr Gly Asn Trp Gly Cys Gly Val Phe Gly Gly Asp Pro Glu Leu Lys450 455 460Ala Thr Ile Gln Trp Leu Ala Ala Ser Gln Thr Arg Arg Pro Phe Ile465 470 475 480Ser Tyr Tyr Thr Phe Gly Val Glu Ala Leu Arg Asn Leu Asp Gln Val485 490 495Thr Lys Trp Ile Leu Ser His Lys Trp Thr Val Gly Asp Leu Trp Asn500 505 5l0Met Met Leu Glu Tyr Ser Ala Gln Arg Leu Tyr Lys Gln Thr Ser Val515 520 525
Gly Phe Phe Ser Trp Leu Leu Pro Ser Leu Ala Thr Thr Asn Lys Ala530 535 540Ile Gln Pro Pro545<210>2<211>169<212>PRT<213>馬鈴薯(Solanum tuberosum)<400>2Met Glu Asn Arg Glu Asp Val Lys Ser Ile Leu Pro Phe Leu Pro Val1 5 10 15Cys Leu Arg Ser Ser Ser Leu Phe Trp Pro Pro Leu Val Val Glu Ala20 25 30Leu Lys Ala Leu Ser Glu Gly Pro His Tyr Ser Asn Val Asn Ser Gly35 40 45Gln Val Leu Phe Leu Ala Ile Ser Asp Ile Arg Asn Ser Leu Ser Leu50 55 60Pro Asp Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ala Ser Asp Gly Phe Ser Leu Leu65 70 75 80Phe Asp Asp Leu Ile Pro Arg Asp Glu Ala Val Lys Trp Phe Lys Glu85 90 95
Val Val Pro Lys Met Ala Asp Leu Leu Leu Arg Leu Pro Ser Leu Leu100 105 110Glu Ala His Tyr Glu Lys Ala Asp Gly Gly Ile Val Lys Gly Val Asn115 120 125Thr Gly Leu Arg Leu Leu Glu Ser Gln Gln Pro Gly Ile Val Phe Leu130 135 140Ser Gln Glu Leu Val Gly Ala Leu Leu Ala Cys Ser Phe Phe Cys Tyr145 150 155 160Ser Leu Pro Met Ile Glu Val Ser Val165<210>3<211>1647<212>DNA<213>擬南芥<400>3atggagaatc gcgaagatct taactcaatt cttccgtacc ttccacttgt aattcgttcg 60tcgtcgctgt attggccgcc gcgtgtggtg gaggcgttaa aggcaatgtc tgaaggacca120tctcacagcc aagttgactc aggagaggtt ctacggcaag ctattttcga tatgagacga180tccttatctt tctctactct cgagccatct gcttctaatg gctacgcatt tctctttgac240gaattgattg atgagaaaga atcaaagaga tggttcgatg agattatccc agcattggcg300agcttacttc tacagtttcc atctctgtta gaagtgcatt tccaaaatgc tgataatatt360
gttagtggaa tcaaaaccgg tcttcgtttg ttaaattccc aacaagctgg cattgttttc420ctcagccagg agttgattgg agctcttctt gcatgctctt tcttttgttt gtttccggat480gataatagag gtgcaaaaca ccttccagtc atcaactttg atcatttgtt tgcaagcctt540tatataagtt atagtcaaag tcaagaaagc aagataagat gtattatgca ttactttgaa600aggttttgct cctgcgtgcc tattggtatt gtttcatttg aacgcaagat taccgctgct660cctgatgctg atttctggag caagtctgac gtttctcttt gtgcatttaa ggttcactct720tttgggttaa ttgaagatca acctgacaat gctctcgaag tggactttgc aaacaagtat780ctcggaggtg gttccctaag tagagggtgc gtgcaggaag agatacgctt catgattaac840cctgaattaa tcgctggcat gcttttcttg cctcggatgg atgacaatga agctatagaa900atagttggtg cggaaagatt ttcatgttac acagggtatg catcttcgtt tcggtttgct960ggtgagtaca ttgacaaaaa ggcaatggat cctttcaaaa ggcgaagaac cagaattgtt 1020gcaattgatg cattatgtac accgaagatg agacacttta aagatatatg tcttttaagg 1080gaaattaata aggcactatg tggcttttta aattgtagca aggcttggga gcaccagaat 1140atattcatgg atgaaggaga taatgaaatt cagcttgtcc gaaacggcag agattctggt 1200cttctgcgta cagaaactac tgcgtcacac cgaactccac taaatgatgt tgagatgaat 1260agagaaaagc ctgctaacaa tcttatcaga gatttttatg tggaaggagt tgataacgag 1320gatcatgaag atgatggtgt cgcgacaggg aattggggat gtggtgtttt tggaggagac 1380ccagagctaa aggctacgat acaatggctt gctgcttccc agactcgaag accatttata 1440tcatattaca cctttggagt agaggcactc cgaaacctag atcaggtgac gaagtggatt 1500ctttcccata aatggactgt tggagatctg tggaacatga tgttagaata ttctgctcaa 1560aggctctaca agcaaaccag tgttggcttc ttttcttggc tacttccatc tctagctacc 1620accaacaaag ctatccagcc gccttga 1647
<210>4<211>598<212>DNA<213>馬鈴薯<400>4gcaatggaga atagagaaga cgtgaagtca atccttccct ttttgccggt gtgtctccga 60tcatcttctc ttttctggcc gccgctagtt gttgaagcac tgaaagccct ctctgaaggc120cctcattaca gcaatgttaa ctccggccaa gtcctcttcc tcgcaatctc cgacattcgg180aattcccttt cactacctga ttcttcaatt tcctcttctg cttcagacgg attttctctc240ttatttgatg atttaattcc tagggatgaa gctgttaaat ggttcaaaga agtggtgccg300aaaatggcgg atttgctatt gcggttgcct tccttattgg aggctcacta tgagaaggct360gatggtggaa ttgttaaagg agtcaacact ggtcttcgct tattggaatc acaacagcct420ggcattgttt tcctcagtca ggaattagtc ggtgctcttc ttgcatgttc cttcttttgc480tattccctac caatgataga ggtatctgta tgatcagtat gacgagaaat ttgaaaataa540attgaagtgc attcttcact attttgagag gattggctca ttgatacctg cgggctac 598<210>5<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ParGAtl<400>5ggatcccctg caggacaaaa aggcaatgga tcctttc 37<210>6<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ParGAt2<400>6gcacgaattc gcggccgcgg tgctcccaag ccttgctac39<210>7<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ParGStl<400>7ggatcccctg caggctcact atgagaaggc tgatggtgg39<210>8
<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ParGSt2<400>8gcacgaattc gcggccgcgt catactgatc atacagatac ctc 43<210>9<211>13466<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pTVE428的核苷酸序列<220>
<221>misc_feature<222>(198)..(222)<223>右T-DNA邊界<220>
<221>misc_feature
<222>(983)..(273)<223>3’ocs(章魚堿合成酶基因的3’非翻譯端)<220>
<221>misc_feature<222>(995)..(1155)<223>聚ADP核糖糖基水解酶的一部分<220>
<221>misc_feature<222>(1929)..(1188)<223>來自黃花菊(Flaveria)pdk基因的內(nèi)含子2<220>
<221>misc_feature<222>(2122)..(1962)<223>聚ADP核糖糖基水解酶的一部分<220>
<221>misc_feature<222>(3476)..(2131)<223>來自花椰菜花葉病毒的35S啟動子區(qū)
<220>
<221>misc_feature<222>(3948)..(3737)<223>根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)基因7的3’非翻譯末端<220>
<221>misc_feature<222>(4521)..(3970)<223>bar編碼區(qū)<220>
<221>misc_feature<222>(6247)..(4522)<223>PSSuAra啟動子區(qū)<220>
<221>misc_feature<222>(6415)..(6439)<223>根癌農(nóng)桿菌的T-DNA左邊界區(qū)<400>9agattcgaag ctcggtcccg tgggtgttct gtcgtctcgt tgtacaacga aatccattcc 60
cattccgcgc tcaagatggc ttcccctcgg cagttcatca gggctaaatc aatctagccg120acttgtccgg tgaaatgggc tgcactccaa cagaaacaat caaacaaaca tacacagcga180cttattcaca cgcgacaaat tacaacggta tatatcctgc cagtactcgg ccgtcgaccg240cggtaccccg gaattaagct tgcatgcctg caggtcctgc tgagcctcga catgttgtcg300caaaattcgc cctggacccg cccaacgatt tgtcgtcact gtcaaggttt gacctgcact360tcatttgggg cccacataca ccaaaaaaat gctgcataat tctcggggca gcaagtcggt420tacccggccg ccgtgctgga ccgggttgaa tggtgcccgt aactttcggt agagcggacg480gccaatactc aacttcaagg aatctcaccc atgcgcgccg gcggggaacc ggagttccct540tcagtgaacg ttattagttc gccgctcggt gtgtcgtaga tactagcccc tggggccttt600tgaaatttga ataagattta tgtaatcagt cttttaggtt tgaccggttc tgccgctttt660tttaaaattg gatttgtaat aataaaacgc aattgtttgt tattgtggcg ctctatcata720gatgtcgcta taaacctatt cagcacaata tattgttttc attttaatat tgtacatata780agtagtaggg tacaatcagt aaattgaacg gagaatatta ttcataaaaa tacgatagta840acgggtgata tattcattag aatgaaccga aaccggcggt aaggatctga gctacacatg900ctcaggtttt ttacaacgtg cacaacagaa ttgaaagcaa atatcatgcg atcataggcg960tctcgcatat ctcattaaag caggactcta gagacaaaaa ggcaatggat cctttcaaaa 1020ggcgaagaac cagaattgtt gcaattgatg cattatgtac accgaagatg agacacttta 1080aagatatatg tcttttaagg gaaattaata aggcactatg tggcttttta aattgtagca 1140aggcttggga gcaccatcga tttcgaaccc agcttcccaa ctgtaatcaa tccaaatgta 1200agatcaatga taacacaatg acatgatcta tcatgttacc ttgtttattc atgttcgact 1260aattcattta attaatagtc aatccattta gaagttaata aaactacaag tattatttag 1320aaattaataa gaatgttgat tgaaaataat actatataaa atgatagatc ttgcgctttg 1380
ttatattagc attagattat gttttgttac attagattac tgtttctatt agtttgatat1440tatttgttac tttagcttgt tatttaatat tttgtttatt gataaattac aagcagattg1500gaatttctaa caaaatattt attaactttt aaactaaaat atttagtaat ggtatagata1560tttaattata taataaacta ttaatcataa aaaaatatta ttttaattta tttattctta1620tttttactat agtattttat cattgatatt taattcatca aaccagctag aattactatt1680atgattaaaa caaatattaa tgctagtata tcatcttaca tgttcgatca aattcattaa1740aaataatata cttactctca acttttatct tcttcgtctt acacatcact tgtcatattt1800ttttacatta ctatgttgtt tatgtaaaca atatatttat aaattatttt ttcacaatta1860taacaactat attattataa tcatactaat taacatcact taactatttt atactaaaag1920gaaaaaagaa aataattatt tccttaccaa gctggggtac cggtgctccc aagccttgct1980acaatttaaa aagccacata gtgccttatt aatttccctt aaaagacata tatctttaaa2040gtgtctcatc ttcggtgtac ataatgcatc aattgcaaca attctggttc ttcgcctttt2100gaaaggatcc attgcctttt tgtcctcgag cgtgtcctct ccaaatgaaa tgaacttcct2160tatatagagg aagggtcttg cgaaggatag tgggattgtg cgtcatccct tacgtcagtg2220gagatgtcac atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg2280atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt cggcagagag atcttgaatg2340atagcctttc ctttatcgca atgatggcat ttgtaggagc caccttcctt ttctactgtc2400ctttcgatga agtgacagat agctgggcaa tggaatccga ggaggtttcc cgaaattatc2460ctttgttgaa aagtctcaat agccctttgg tcttctgaga ctgtatcttt gacatttttg2520gagtagacca gagtgtcgtg ctccaccatg ttgacgaaga ttttcttctt gtcattgagt2580cgtaaaagac tctgtatgaa ctgttcgcca gtcttcacgg cgagttctgt tagatcctcg2640atttgaatct tagactccat gcatggcctt agattcagta ggaactacct ttttagagac2700
tccaatctct attacttgcc ttggtttatg aagcaagcct tgaatcgtcc atactggaat2760agtacttctg atcttgagaa atatgtcttt ctctgtgttc ttgatgcaat tagtcctgaa2820tcttttgact gcatctttaa ccttcttggg aaggtatttg atctcctgga gattgttact2880cgggtagatc gtcttgatga gacctgctgc gtaggcctct ctaaccatct gtgggtcagc2940attctttctg aaattgaaga ggctaacctt ctcattatca gtggtgaaca tagtgtcgtc3000accttcacct tcgaacttcc ttcctagatc gtaaagatag aggaaatcgt ccattgtaat3060ctccggggca aaggagatct cttttggggc tggatcactg ctgggccttt tggttcctag3120cgtgagccag tgggcttttt gctttggtgg gcttgttagg gccttagcaa agctcttggg3180cttgagttga gcttctcctt tggggatgaa gttcaacctg tctgtttgct gacttgttgt3240gtacgcgtca gctgctgctc ttgcctctgt aatagtggca aatttcttgt gtgcaactcc3300gggaacgccg tttgttgccg cctttgtaca accccagtca tcgtatatac cggcatgtgg3360accgttatac acaacgtagt agttgatatg agggtgttga atacccgatt ctgctctgag3420aggagcaact gtgctgttaa gctcagattt ttgtgggatt ggaattaatt cgtcgagcgg3480ccgctcgacg agcgcgccga tatcgcgatc gcccgggccg gccatttaaa tgaattcgag3540ctcggtaccc aaacgcggcc gcaagctata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta3600ttcgactcta gaggatccca attcccatgc atggagtcaa agattcaaat agaggacact3660tctcgaactc ggccgtcgaa ctcggccgtc gagtacatgg tcgataagaa aaggcaattt3720gtagatgtta attcccatct tgaaagaaat atagtttaaa tatttattga taaaataaca3780agtcaggtat tatagtccaa gcaaaaacat aaatttattg atgcaagttt aaattcagaa3840atatttcaat aactgattat atcagctggt acattgccgt agatgaaaga ctgagtgcga3900tattatgtgt aatacataaa ttgatgatat agctagctta gctcatcggg ggatcctaga3960cgcgtgagat cagatctcgg tgacgggcag gaccggacgg ggcggtaccg gcaggctgaa4020
gtccagctgc cagaaaccca cgtcatgcca gttcccgtgc ttgaagccgg ccgcccgcag4080catgccgcgg ggggcatatc cgagcgcctc gtgcatgcgc acgctcgggt cgttgggcag4140cccgatgaca gcgaccacgc tcttgaagcc ctgtgcctcc agggacttca gcaggtgggt4200gtagagcgtg gagcccagtc ccgtccgctg gtggcggggg gagacgtaca cggtcgactc4260ggccgtccag tcgtaggcgt tgcgtgcctt ccaggggccc gcgtaggcga tgccggcgac4320ctcgccgtcc acctcggcga cgagccaggg atagcgctcc cgcagacgga cgaggtcgtc4380cgtccactcc tgcggttcct gcggctcggt acggaagttg accgtgcttg tctcgatgta4440gtggttgacg atggtgcaga ccgccggcat gtccgcctcg gtggcacggc ggatgtcggc4500cgggcgtcgt tctgggtcca ttgttcttct ttactctttg tgtgactgag gtttggtcta4560gtgctttggt catctatata taatgataac aacaatgaga acaagctttg gagtgatcgg4620agggtctagg atacatgaga ttcaagtgga ctaggatcta caccgttgga ttttgagtgt4680ggatatgtgt gaggttaatt ttacttggta acggccacaa aggcctaagg agaggtgttg4740agacccttat cggcttgaac cgctggaata atgccacgtg gaagataatt ccatgaatct4800tatcgttatc tatgagtgaa attgtgtgat ggtggagtgg tgcttgctca ttttacttgc4860ctggtggact tggccctttc cttatgggga atttatattt tacttactat agagctttca4920tacctttttt ttaccttgga tttagttaat atataatggt atgattcatg aataaaaatg4980ggaaattttt gaatttgtac tgctaaatgc ataagattag gtgaaactgt ggaatatata5040tttttttcat ttaaaagcaa aatttgcctt ttactagaat tataaatata gaaaaatata5100taacattcaa ataaaaatga aaataagaac tttcaaaaaa cagaactatg tttaatgtgt5160aaagattagt cgcacatcaa gtcatctgtt acaatatgtt acaacaagtc ataagcccaa5220caaagttagc acgtctaaat aaactaaaga gtccacgaaa atattacaaa tcataagccc5280aacaaagtta ttgatcaaaa aaaaaaaacg cccaacaaag ctaaacaaag tccaaaaaaa5340
acttctcaag tctccatctt cctttatgaa cattgaaaac tatacacaaa acaagtcaga5400taaatctctt tctgggcctg tcttcccaac ctcctacatc acttccctat cggattgaat5460gttttacttg taccttttcc gttgcaatga tattgatagt atgtttgtga aaactaatag5520ggttaacaat cgaagtcatg gaatatggat ttggtccaag attttccgag agctttctag5580tagaaagccc atcaccagaa atttactagt aaaataaatc accaattagg tttcttatta5640tgtgccaaat tcaatataat tatagaggat atttcaaatg aaaacgtatg aatgttatta5700gtaaatggtc aggtaagaca ttaaaaaaat cctacgtcag atattcaact ttaaaaattc5760gatcagtgtg gaattgtaca aaaatttggg atctactata tatatataat gctttacaac5820acttggattt ttttttggag gctggaattt ttaatctaca tatttgtttt ggccatgcac5880caactcattg tttagtgtaa tactttgatt ttgtcaaata tatgtgttcg tgtatatttg5940tataagaatt tctttgacca tatacacaca cacatatata tatatatata tatattatat6000atcatgcact tttaattgaa aaaataatat atatatatat agtgcatttt ttctaacaac6060catatatgtt gcgattgatc tgcaaaaata ctgctagagt aatgaaaaat ataatctatt6120gctgaaatta tctcagatgt taagattttc ttaaagtaaa ttctttcaaa ttttagctaa6180aagtcttgta ataactaaag aataatacac aatctcgacc acggaaaaaa aacacataat6240aaatttgaat ttcgaccgcg gtacccggaa ttgggttata attacctcag gtcgaggaat6300taattcggta cgtacctaat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atatggatct6360cgaggcatta cggcattacg gcactcgcga gggtcccaat tcgagcatgg agccatttac6420aattgaatat atcctgccgc cgctgccgct ttgcacccgg tggagcttgc atgttggttt6480ctacgcagaa ctgagccggt taggcagata atttccattg agaactgagc catgtgcacc6540ttccccccaa cacggtgagc gacggggcaa cggagtgatc cacatgggac ttttaaacat6600catccgtcgg atggcgttgc gagagaagca gtcgatccgt gagatcagcc gacgcaccgg6660
gcaggcgcgc aacacgatcg caaagtattt gaacgcaggt acaatcgagc cgacgttcac6720ggtaccggaa cgaccaagca agctagctta gtaaagccct cgctagattt taatgcggat6780gttgcgatta cttcgccaac tattgcgata acaagaaaaa gccagccttt catgatatat6840ctcccaattt gtgtagggct tattatgcac gcttaaaaat aataaaagca gacttgacct6900gatagtttgg ctgtgagcaa ttatgtgctt agtgcatcta acgcttgagt taagccgcgc6960cgcgaagcgg cgtcggcttg aacgaattgt tagacattat ttgccgacta ccttggtgat7020ctcgcctttc acgtagtgga caaattcttc caactgatct gcgcgcgagg ccaagcgatc7080ttcttcttgt ccaagataag cctgtctagc ttcaagtatg acgggctgat actgggccgg7140caggcgctcc attgcccagt cggcagcgac atccttcggc gcgattttgc cggttactgc7200gctgtaccaa atgcgggaca acgtaagcac tacatttcgc tcatcgccag cccagtcggg7260cggcgagttc catagcgtta aggtttcatt tagcgcctca aatagatcct gttcaggaac7320cggatcaaag agttcctccg ccgctggacc taccaaggca acgctatgtt ctcttgcttt7380tgtcagcaag atagccagat caatgtcgat cgtggctggc tcgaagatac ctgcaagaat7440gtcattgcgc tgccattctc caaattgcag ttcgcgctta gctggataac gccacggaat7500gatgtcgtcg tgcacaacaa tggtgacttc tacagcgcgg agaatctcgc tctctccagg7560ggaagccgaa gtttccaaaa ggtcgttgat caaagctcgc cgcgttgttt catcaagcct7620tacggtcacc gtaaccagca aatcaatatc actgtgtggc ttcaggccgc catccactgc7680ggagccgtac aaatgtacgg ccagcaacgt cggttcgaga tggcgctcga tgacgccaac7740tacctctgat agttgagtcg atacttcggc gatcaccgct tccctcatga tgtttaactt7800tgttttaggg cgactgccct gctgcgtaac atcgttgctg ctccataaca tcaaacatcg7860acccacggcg taacgcgctt gctgcttgga tgcccgaggc atagactgta ccccaaaaaa7920acagtcataa caagccatga aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc gttcggtcaa7980
ggttctggac cagttgcgtg agcgcatacg ctacttgcat tacagcttac gaaccgaaca8040ggcttatgtc cactgggttc gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc acccggcaac8100cttgggcagc agcgaagtcg aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc gcaaggtttc8160ggtctccacg catcgtcagg cattggcggc cttgctgttc ttctacggca agtgctgtgc8220acggatctgc cctggcttca ggagatcgga agacctcggc cgtccgggcg cttgccggtg8280gtgctgaccc cggatgaagt ctctagagct ctagagggtt cgcatcctcg gttttctgga8340aggcgagcat cgtttgttcg cccagcttct gtatggaacg ggcatgcgga tcagtgaggg8400tttgcaactg cgggtcaagg atctggattt cgatcacggc acgatcatcg tgcgggaggg8460caagggctcc aaggatcggg ccttgatgtt acccgagagc ttggcaccca gcctgcgcga8520gcagggatcg atccaacccc tccgctgcta tagtgcagtc ggcttctgac gttcagtgca8580gccgtcttct gaaaacgaca tgtcgcacaa gtcctaagtt acgcgacagg ctgccgccct8640gcccttttcc tggcgttttc ttgtcgcgtg ttttagtcgc ataaagtaga atacttgcga8700ctagaaccgg agacattacg ccatgaacaa gagcgccgcc gctggcctgc tgggctatgc8760ccgcgtcagc accgacgacc aggacttgac caaccaacgg gccgaactgc acgcggccgg8820ctgcaccaag ctgttttccg agaagatcac cggcaccagg cgcgaccgcc cggagctggc8880caggatgctt gaccacctac gccctggcga cgttgtgaca gtgaccaggc tagaccgcct8940ggcccgcagc acccgcgacc tactggacat tgccgagcgc atccaggagg ccggcgcggg9000cctgcgtagc ctggcagagc cgtgggccga caccaccacg ccggccggcc gcatggtgtt9060gaccgtgttc gccggcattg ccgagttcga gcgttcccta atcatcgacc gcacccggag9120cgggcgcgag gccgccaagg cccgaggcgt gaagtttggc ccccgcccta ccctcacccc9180ggcacagatc gcgcacgccc gcgagctgat cgaccaggaa ggccgcaccg tgaaagaggc9240ggctgcactg cttggcgtgc atcgctcgac cctgtaccgc gcacttgagc gcagcgagga9300
agtgacgccc accgaggcca ggcggcgcgg tgccttccgt gaggacgcat tgaccgaggc9360cgacgccctg gcggccgccg agaatgaacg ccaagaggaa caagcatgaa accgcaccag9420gacggccagg acgaaccgtt tttcattacc gaagagatcg aggcggagat gatcgcggcc9480gggtacgtgt tcgagccgcc cgcgcacgtc tcaaccgtgc ggctgcatga aatcctggcc9540ggtttgtctg atgccaagct ggcggcctgg ccggccagct tggccgctga agaaaccgag9600cgccgccgtc taaaaaggtg atgtgtattt gagtaaaaca gcttgcgtca tgcggtcgct9660gcgtatatga tgcgatgagt aaataaacaa atacgcaagg ggaacgcatg aaggttatcg9720ctgtacttaa ccagaaaggc gggtcaggca agacgaccat cgcaacccat ctagcccgcg9780ccctgcaact cgccggggcc gatgttctgt tagtcgattc cgatccccag ggcagtgccc9840gcgattgggc ggccgtgcgg gaagatcaac cgctaaccgt tgtcggcatc gaccgcccga9900cgattgaccg cgacgtgaag gccatcggcc ggcgcgactt cgtagtgatc gacggagcgc9960cccaggcggc ggacttggct gtgtccgcga tcaaggcagc cgacttcgtg ctgattccgg 10020tgcagccaag cccttacgac atatgggcca ccgccgacct ggtggagctg gttaagcagc 10080gcattgaggt cacggatgga aggctacaag cggcctttgt cgtgtcgcgg gcgatcaaag 10140gcacgcgcat cggcggtgag gttgccgagg cgctggccgg gtacgagctg cccattcttg 10200agtcccgtat cacgcagcgc gtgagctacc caggcactgc cgccgccggc acaaccgttc 10260ttgaatcaga acccgagggc gacgctgccc gcgaggtcca ggcgctggcc gctgaaatta 10320aatcaaaact catttgagtt aatgaggtaa agagaaaatg agcaaaagca caaacacgct 10380aagtgccggc cgtccgagcg cacgcagcag caaggctgca acgttggcca gcctggcaga 10440cacgccagcc atgaagcggg tcaactttca gttgccggcg gaggatcaca ccaagctgaa 10500gatgtacgcg gtacgccaag gcaagaccat taccgagctg ctatctgaat acatcgcgca 10560gctaccagag taaatgagca aatgaataaa tgagtagatg aattttagcg gctaaaggag 10620
gcggcatgga aaatcaagaa caaccaggca ccgacgccgt ggaatgcccc atgtgtggag 10680gaacgggcgg ttggccaggc gtaagcggct gggttgtctg ccggccctgc aatggcactg 10740gaacccccaa gcccgaggaa tcggcgtgac ggtcgcaaac catccggccc ggtacaaatc 10800ggcgcggcgc tgggtgatga cctggtggag aagttgaagg ccgcgcaggc cgcccagcgg 10860caacgcatcg aggcagaagc acgccccggt gaatcgtggc aagcggccgc tgatcgaatc 10920cgcaaagaat cccggcaacc gccggcagcc ggtgcgccgt cgattaggaa gccgcccaag 10980ggcgacgagc aaccagattt tttcgttccg atgctctatg acgtgggcac ccgcgatagt 11040cgcagcatca tggacgtggc cgttttccgt ctgtcgaagc gtgaccgacg agctggcgag 11100gtgatccgct acgagcttcc agacgggcac gtagaggttt ccgcagggcc ggccggcatg 11160gccagtgtgt gggattacga cctggtactg atggcggttt cccatctaac cgaatccatg 11220aaccgatacc gggaagggaa gggagacaag cccggccgcg tgttccgtcc acacgttgcg 11280gacgtactca agttctgccg gcgagccgat ggcggaaagc agaaagacga cctggtagaa 11340acctgcattc ggttaaacac cacgcacgtt gccatgcagc gtacgaagaa ggccaagaac 11400ggccgcctgg tgacggtatc cgagggtgaa gccttgatta gccgctacaa gatcgtaaag 11460agcgaaaccg ggcggccgga gtacatcgag atcgagctag ctgattggat gtaccgcgag 11520atcacagaag gcaagaaccc ggacgtgctg acggttcacc ccgattactt tttgatcgat 11580cccggcatcg gccgttttct ctaccgcctg gcacgccgcg ccgcaggcaa ggcagaagcc 11640agatggttgt tcaagacgat ctacgaacgc agtggcagcg ccggagagtt caagaagttc 11700tgtttcaccg tgcgcaagct gatcgggtca aatgacctgc cggagtacga tttgaaggag 11760gaggcggggc aggctggccc gatcctagtc atgcgctacc gcaacctgat cgagggcgaa 11820gcatccgccg gttcctaatg tacggagcag atgctagggc aaattgccct agcaggggaa 11880aaaggtcgaa aaggtctctt tcctgtggat agcacgtaca ttgggaaccc aaagccgtac 11940
attgggaacc ggaacccgta cattgggaac ccaaagccgt acattgggaa ccggtcacac 12000atgtaagtga ctgatataaa agagaaaaaa ggcgattttt ccgcctaaaa ctctttaaaa 12060cttattaaaa ctcttaaaac ccgcctggcc tgtgcataac tgtctggcca gcgcacagcc 12120gaagagctgc aaaaagcgcc tacccttcgg tcgctgcgct ccctacgccc cgccgcttcg 12180cgtcggccta tcgcggccgc tggccgctca aaaatggctg gcctacggcc aggcaatcta 12240ccagggcgcg gacaagccgc gccgtcgcca ctcgaccgcc ggcgcccaca tcaaggcacc 12300ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac 12360ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc 12420gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta 12480tactggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt 12540gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg 12600ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag 12660gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa 12720ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc 12780cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca 12840ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 12900accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 12960catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 13020gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 13080tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc 13140agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac 13200actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 13260
gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc 13320aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atccggaaaa cgcaagcgca 13380aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat agctagactg ggcggtttta 13440tggacagcaa gcgaaccgga attgcc 13466<210>10<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>PARG蛋白的共有序列1<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>X代表任意氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(8)..(10)<223>X代表任意氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(17)<223>X代表任意氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>X代表任意氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(27)..(29)<223>X代表任意氨基酸<400>10Leu Xaa Val Asp Phe Ala Asn Xaa Xaa Xaa Gly Gly Gly Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Gly Xaa Val Gln Glu Glu Ile Arg Phe Xaa Xaa Xaa Pro Glu20 25 30<210>11<211>20
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>PARG蛋白的共有序列2<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>X代表任意氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>X代表任意氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(13)..(14)<223>X代表任意氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(19)<223>X代表任意氨基酸<400>11Thr Gly Xaa Trp Gly Cys Gly Ala Phe Xaa Gly Asp Xaa Xaa Leu Lys1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Gln20<210>12<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>PARG蛋白的共有序列3<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(4)<223>X代表任意氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(9)<223>X代表任意氨基酸<400>12Asp Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Asp Ala1 5 10<210>13<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>PARG蛋白的共有序列4<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(4)<223>X代表任意氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(8)<223>X代表任意氨基酸
<400>13Arg Glu Xaa Xaa Lys Ala Xaa Xaa Gly Phe1 5 10<210>14<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>保守的PARG區(qū)<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(5)<223>X代表任意氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>X代表任意氨基酸<400>14
Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Tyr Thr Gly Tyr1 5 10<210>15<211>1530<212>DNA<213>0ryza sativa<220>
<221>CDS<222>(1)..(1530)<223>
<400>15atg gag gcg cgc ggc gac ctg cgc tcg atc ctg ccc tac ctc ccc gtc 48Met Glu Ala Arg Gly Asp Leu Arg Ser Ile Leu Pro Tyr Leu Pro Val1 5 10 15gtg ctc cgc ggc ggc gcg ctc ttc tgg ccg ccg gcg gcg cag gag gcg 96Val Leu Arg Gly Gly Ala Leu Phe Trp Pro Pro Ala Ala Gln Glu Ala20 25 30ctc aag gcg ctg gcg ctg ggc ccc gac gtg agc cgc gtc tcc tcc ggc144Leu Lys Ala Leu Ala Leu Gly Pro Asp Val Ser Arg Val Ser Ser Gly35 40 45gac gtc ctc gcc gac gcc ctc acc gac ctc cgc ctc gcg ctc aac ctc192Asp Val Leu Ala Asp Ala Leu Thr Asp Leu Arg Leu Ala Leu Asn Leu50 55 60gac cca ctc ccg cgc cgc gcc gcc gag ggc ttc gcg ctc ttc ttc gac 240Asp Pro Leu Pro Arg Arg Ala Ala Glu Gly Phe Ala Leu Phe Phe Asp65 70 75 80
gac ctc ctg tcg cgg gcg cag gcg cgg gac tgg ttc gac cac gtc gcc288Asp Leu Leu Ser Arg Ala Gln Ala Arg Asp Trp Phe Asp His Val Ala85 90 95ccc tcc ctc gcc cgc ctc ctc ctc cgc ctc ccc acg ctg ctc gag ggc336Pro Ser Leu Ala Arg Leu Leu Leu Arg Leu Pro Thr Leu Leu Glu Gly100 105 110cac tac cgc gcc gcc ggc gac gag gct cgc ggg ctc cgc atc ctg agc384His Tyr Arg Ala Ala Gly Asp Glu Ala Arg Gly Leu Arg Ile Leu Ser115 120 125tcg cag gat gcc ggg ctc gtg ctc ctc agc cag gag ctc gcc gcc gcg432Ser Gln Asp Ala Gly Leu Val Leu Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ala Ala130 135 140ctg ctc gcc tgc gcg ctc ttc tgc ctg ttc ccc acc gcc gat agg gcc480Leu Leu Ala Cys Ala Leu Phe Cys Leu Phe Pro Thr Ala Asp Arg Ala145 150 155 160gag gcg tgc ctc ccg gcg atc aat ttc gat agc cta ttt gcg gca ctg528Glu Ala Cys Leu Pro Ala Ile Asn Phe Asp Ser Leu Phe Ala Ala Leu165 170 175tgt tat aat tcg agg caa agc cag gag cag aag gtg agg tgc ctt gtt576Cys Tyr Asn Ser Arg Gln Ser Gln Glu Gln Lys Val Arg Cys Leu Val180 185 190cac tat ttt gac agg gtg acc gct tct aca cct act ggt tcc gtt tcg624His Tyr Phe Asp Arg Val Thr Ala Ser Thr Pro Thr Gly Ser Val Ser195 200 205ttt gag cgt aag gtt ctt cct cgc cgt cct gaa tct gat ggc att acg672Phe Glu Arg Lys Val Leu Pro Arg Arg Pro Glu Ser Asp Gly Ile Thr210 215 220tac cct gac atg gat act tgg atg aaa tct ggt gtt ccc ctt tgc aca720Tyr Pro Asp Met Asp Thr Trp Met Lys Ser Gly Val Pro Leu Cys Thr225230 235 240ttc cgg gta ttt tcc tca ggc ttg ata gaa gat gag gaa caa gaa gcc768Phe Arg Val Phe Ser Ser Gly Leu Ile Glu Asp Glu Glu Gln Glu Ala245 250 255
ctt gaa gtt gac ttt gca aat aga tat ttg gga ggt ggc gca ctt tcc 816Leu Glu Val Asp Phe Ala Asn Arg Tyr Leu Gly Gly Gly Ala Leu Ser260 265 270aga ggc tgc gtg cag gaa gaa atc cgg ttc atg ata aac cca gaa ttg 864Arg Gly Cys Val Gln Glu Glu Ile Arg Phe Met Ile Asn Pro Glu Leu275 280 285atc gtg ggc atg ctc ttc atg gtt tca atg gaa gat aat gaa gct ata 912Ile Val Gly Met Leu Phe Met Val Ser Met Glu Asp Asn Glu Ala Ile290 295 300gaa att gtt ggt gca gaa agg ttc tca cag tac atg ggg tat ggt tcc 960Glu Ile Val Gly Ala Glu Arg Phe Ser Gln Tyr Met Gly Tyr Gly Ser305 310 315 320tca ttc cgt ttt act ggt gac tac tta gat agc aaa ccc ttt gat gcg1008Ser Phe Arg Phe Thr Gly Asp Tyr Leu Asp Ser Lys Pro Phe Asp Ala325 330 335atg ggt aga cgg aaa act agg ata gtg gca att gat gct ttg gac tgt1056Met Gly Arg Arg Lys Thr Arg Ile Val Ala Ile Asp Ala Leu Asp Cys340 345 350cca act agg tta cag ttt gaa tct agt ggt ctt cta agg gaa gtg aac1104Pro Thr Arg Leu Gln Phe Glu Ser Ser Gly Leu Leu Arg Glu Val Asn355 360 365aag gct ttt tgt gga ttt ttg gat caa tca aat cat cag ctc tgt gca1152Lys Ala Phe Cys Gly Phe Leu Asp Gln Ser Asn His Gln Leu Cys Ala370 375 380aag ctt gtc cag gat tta aat aca aag gat aac tgt cca agt gtc att1200Lys Leu Val Gln Asp Leu Asn Thr Lys Asp Asn Cys Pro Ser Val Ile385 390 395 400cct gat gaa tgc ata gga gtt tca act gga aac tgg ggt tgc ggg gct1248Pro Asp Glu Cys Ile Gly Val Ser Thr Gly Asn Trp Gly Cys Gly Ala405 410 415ttt ggt gga aac cct gaa atc aag agc atg att caa tgg att gct gca1296Phe Gly Gly Asn Pro Glu Ile Lys Ser Met Ile Gln Trp Ile Ala Ala420 425 430
tca cag gca ctc cga tct ttt att aac tac tac act ttt gag tcc gaa1344Ser Gln Ala Leu Arg Ser Phe Ile Asn Tyr Tyr Thr Phe Glu Ser Glu435 440 445tca ctg aaa aga tta gaa gag gtg acc cag tgg ata ttg cgc cat agg1392Ser Leu Lys Arg Leu Glu Glu Val Thr Gln Trp Ile Leu Arg His Arg450 455 460tgg acg gtt ggc gag ttg tgg gac atg ctt gtg gag tat tca tcc cag1440Trp Thr Val Gly Glu Leu Trp Asp Met Leu Val Glu Tyr Ser Ser Gln465 470 475 480agg cta aga gga gac acc aat gag ggc ttt tta aca tgg cta ctt ccc1488Arg Leu Arg Gly Asp Thr Asn Glu Gly Phe Leu Thr Trp Leu Leu Pro485 490 495aag gac atc ccc aat ggt gat gta gat tac atg tgt gaa tag1530Lys Asp Ile Pro Asn Gly Asp Val Asp Tyr Met Cys Glu500 505<210>16<211>509<212>PRT<213>0ryza saiva<400>16Met Glu Ala Arg Gly Asp Leu Arg Ser Ile Leu Pro Tyr Leu Pro Val1 5 10 15Val Leu Arg Gly Gly Ala Leu Phe Trp Pro Pro Ala Ala Gln Glu Ala20 25 30Leu Lys Ala Leu Ala Leu Gly Pro Asp Val Ser Arg Val Ser Ser Gly35 40 45
Asp Val Leu Ala Asp Ala Leu Thr Asp Leu Arg Leu Ala Leu Asn Leu50 55 60Asp Pro Leu Pro Arg Arg Ala Ala Glu Gly Phe Ala Leu Phe Phe Asp65 70 75 80Asp Leu Leu Ser Arg Ala Gln Ala Arg Asp Trp Phe Asp His Val Ala85 90 95Pro Ser Leu Ala Arg Leu Leu Leu Arg Leu Pro Thr Leu Leu Glu Gly100 105 110His Tyr Arg Ala Ala Gly Asp Glu Ala Arg Gly Leu Arg Ile Leu Ser115 120125Ser Gln Asp Ala Gly Leu Val Leu Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ala Ala130 135 140Leu Leu Ala Cys Ala Leu Phe Cys Leu Phe Pro Thr Ala Asp Arg Ala145 150 155 160Glu Ala Cys Leu Pro Ala Ile Asn Phe Asp Ser Leu Phe Ala Ala Leu165 170 175Cys Tyr Asn Ser Arg Gln Ser Gln Glu Gln Lys Val Arg Cys Leu Val180 185 190His Tyr Phe Asp Arg Val Thr Ala Ser Thr Pro Thr Gly Ser Val Ser195 200 205Phe Glu Arg Lys Val Leu Pro Arg Arg Pro Glu Ser Asp Gly Ile Thr210 215 220
Tyr Pro Asp Met Asp Thr Trp Met Lys Ser Gly Val Pro Leu Cys Thr225 230235 240Phe Arg Val Phe Ser Ser Gly Leu Ile Glu Asp Glu Glu Gln Glu Ala245 250 255Leu Glu Val Asp Phe Ala Asn Arg Tyr Leu Gly Gly Gly Ala Leu Ser260 265 270Arg Gly Cys Val Gln Glu Glu Ile Arg Phe Met Ile Asn Pro Glu Leu275 280 285Ile Val Gly Met Leu Phe Met Val Ser Met Glu Asp Asn Glu Ala Ile290 295 300Glu Ile Val Gly Ala Glu Arg Phe Ser Gln Tyr Met Gly Tyr Gly Ser305 310 315 320Ser Phe Arg Phe Thr Gly Asp Tyr Leu Asp Ser Lys Pro Phe Asp Ala325 330 335Met Gly Arg Arg Lys Thr Arg Ile Val Ala Ile Asp Ala Leu Asp Cys340 345 350Pro Thr Arg Leu Gln Phe Glu Ser Ser Gly Leu Leu Arg Glu Val Asn355 360 365Lys Ala Phe Cys Gly Phe Leu Asp Gln Ser Asn His Gln Leu Cys Ala370 375 380Lys Leu Val Gln Asp Leu Asn Thr Lys Asp Asn Cys Pro Ser Val Ile385 390 395 400
Pro Asp Glu Cys Ile Gly Val Ser Thr Gly Asn Trp Gly Cys Gly Ala405 410 415Phe Gly Gly Asn Pro Glu Ile Lys Ser Met Ile Gln Trp Ile Ala Ala420 425 430Ser Gln Ala Leu Arg Ser Phe Ile Asn Tyr Tyr Thr Phe Glu Ser Glu435 440 445Ser Leu Lys Arg Leu Glu Glu Val Thr Gln Trp Ile Leu Arg His Arg450 455 460Trp Thr Val Gly Glu Leu Trp Asp Met Leu Val Glu Tyr Ser Ser Gln465 470 475 480Arg Leu Arg Gly Asp Thr Asn Glu Gly Phe Leu Thr Trp Leu Leu Pro485 490 495Lys Asp Ile Pro Asn Gly Asp Val Asp Tyr Met Cys Glu500 505<210>17<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>簡并寡核苷酸引物PG1
<400>17atgtbccaca rmtckccrac mgtcc25<210>18<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>簡并寡核苷酸引物PG2<400>18gggtytccwc caaaarcmcc rcawcccc 28<210>19<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>簡并寡核苷酸引物PG3<400>19gctatagaaa twgtyggtgy rgaaag 26<210>20<211>26
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>簡并寡核苷酸引物PG4<400>20agrggstgyg trcaggarga ratmcg 26<210>21<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>簡并寡核苷酸引物PG5<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>n＝任意核苷酸<400>21atggargaya aygargcnat hga 23<210>22
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>簡并寡核苷酸引物PG6<400>22ccaytgdagc atrctyttda gytc24<210>23<211>603<212>DNA<213>玉米(zea mays)<400>23tagggctgtg tgcaggagga aatccgcttc atgataaacc ccgaattgat tgtgggtatg 60ctattcttgt cttgtatgga agataacgag gctatagaaa tctttggtgc agaacggttc120tcacagtata tgggttatgg ttcctccttt cgctttgttg gtgactattt agataccaaa180ccctttgatt cgatgggcag acggagaact aggattgtgg ctatcgatgc tttggactgt240ccagctaggt tacactatga atctggctgt ctcctaaggg aagtgaacaa ggcattttgt300ggatttttcg atcaatcgaa acaccatctc tatgcgaagc ttttccagga tttgcacaac360aaggatgact tttcaagcat caattccagt gagtacgtag gagtttcaac aggaaactgg420ggttgtggtg cttttggtgg aaaccctgaa atcaagagca tgattcagtg gattgctgca480tcacaggctc ttcgcccttt tgttaattac tacacttttg agaacgtgtc tctgcaaaga540
ttagaggagg tgatccagtg gatacggctt catggctgga ctgtcggcga gctgtggaac600ata 603<210>24<211>12987<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>包含降低ParG表達的嵌合基因的T-DNA載體<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(25)<223>左T-DNA邊界的互補序列<220>
<221>misc_feature<222>(58)..(318)<223>3’nos的互補序列<220>
<221>misc_feature<222>(337)..(888)
<223>bar編碼區(qū)<220>
<221>misc_feature<222>(889)..(1721)<223>35S啟動子<220>
<221>misc_feature<222>(1728)..(3123)<223>35S啟動子<220>
<221>misc_feature<222>(3133)..(3311)<223>玉米的ParG同源物的一部分<220>
<221>misc_feature<222>(3344)..(4085)<223>Pdk內(nèi)含子<220>
<221>misc_feature<222>(4119)..(4297)<223>玉米的ParG同源物的一部分(反向)<220>
<221>misc_feature<222>(4310)..(5020)<223>3’0CS<220>
<221>mis_feature<222>(5066)..(5042)<223>右T-DNA邊界<400>24cggcaggata tattcaattg taaatggctc catggcgatc gctctagagg atcttcccga 60tctagtaaca tagatgacac cgcgcgcgat aatttatcct agtttgcgcg ctatattttg120ttttctatcg cgtattaaat gtataattgc gggactctaa tcataaaaac ccatctcata180aataacgtca tgcattacat gttaattatt acatgcttaa cgtaattcaa cagaaattat240atgataatca tcgcaagacc ggcaacagga ttcaatctta agaaacttta ttgccaaatg300tttgaacgat ctgcttcgga tcctagacgc gtgagatcag atctcggtga cgggcaggac360cggacggggc ggtaccggca ggctgaagtc cagctgccag aaacccacgt catgccagtt420
cccgtgcttg aagccggccg cccgcagcat gccgcggggg gcatatccga gcgcctcgtg480catgcgcacg ctcgggtcgt tgggcagccc gatgacagcg accacgctct tgaagccctg540tgcctccagg gacttcagca ggtgggtgta gagcgtggag cccagtcccg tccgctggtg600gcggggggag acgtacacgg tcgactcggc cgtccagtcg taggcgttgc gtgccttcca660ggggcccgcg taggcgatgc cggcgacctc gccgtccacc tcggcgacga gccagggata720gcgctcccgc agacggacga ggtcgtccgt ccactcctgc ggttcctgcg gctcggtacg780gaagttgacc gtgcttgtct cgatgtagtg gttgacgatg gtgcagaccg ccggcatgtc840cgcctcggtg gcacggcgga tgtcggccgg gcgtcgttct gggtccatgg ttatagagag900agagatagat ttatagagag agactggtga tttcagcgtg tcctctccaa atgaaatgaa960cttccttata tagaggaagg gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc atcccttacg 1020tcagtggaga tgtcacatca atccacttgc tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt 1080tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc agaggcatct 1140tgaatgatag cctttccttt atcgcaatga tggcatttgt aggagccacc ttccttttct 1200actgtccttt cgatgaagtg acagatagct gggcaatgga atccgaggag gtttcccgaa 1260attatccttt gttgaaaagt ctcaatagcc ctttggtctt ctgagactgt atctttgaca 1320tttttggagt agaccagagt gtcgtgctcc accatgttga cgaagatttt cttcttgtca 1380ttgagtcgta aaagactctg tatgaactgt tcgccagtct tcacggcgag ttctgttaga 1440tcctcgattt gaatcttaga ctccatgcat ggccttagat tcagtaggaa ctaccttttt 1500agagactcca atctctatta cttgccttgg tttatgaagc aagccttgaa tcgtccatac 1560tggaatagta cttctgatct tgagaaatat gtctttctct gtgttcttga tgcaattagt 1620cctgaatctt ttgactgcat ctttaacctt cttgggaagg tatttgatct cctggagatt 1680gttactcggg tagatcgtct tgatgagacc tgctgcgtag gaacgcggcc gcgtatacgt 1740
atcgatatct tcgaattcga gctcgtcgag cggccgctcg acgaattaat tccaatccca1800caaaaatctg agcttaacag cacagttgct cctctcagag cagaatcggg tattcaacac1860cctcatatca actactacgt tgtgtataac ggtccacatg ccggtatata cgatgactgg1920ggttgtacaa aggcggcaac aaacggcgtt cccggagttg cacacaagaa atttgccact1980attacagagg caagagcagc agctgacgcg tacacaacaa gtcagcaaac agacaggttg2040aacttcatcc ccaaaggaga agctcaactc aagcccaaga gctttgctaa ggccctaaca2100agcccaccaa agcaaaaagc ccactggctc acgctaggaa ccaaaaggcc cagcagtgat2160ccagccccaa aagagatctc ctttgccccg gagattacaa tggacgattt cctctatctt2220tacgatctag gaaggaagtt cgaaggtgaa ggtgacgaca ctatgttcac cactgataat2280gagaaggtta gcctcttcaa tttcagaaag aatgctgacc cacagatggt tagagaggcc2340tacgcagcag gtctcatcaa gacgatctac ccgagtaaca atctccagga gatcaaatac2400cttcccaaga aggttaaaga tgcagtcaaa agattcagga ctaattgcat caagaacaca2460gagaaagaca tatttctcaa gatcagaagt actattccag tatggacgat tcaaggcttg2520cttcataaac caaggcaagt aatagagatt ggagtctcta aaaaggtagt tcctactgaa2580tctaaggcca tgcatggagt ctaagattca aatcgaggat ctaacagaac tcgccgtgaa2640gactggcgaa cagttcatac agagtctttt acgactcaat gacaagaaga aaatcttcgt2700caacatggtg gagcacgaca ctctggtcta ctccaaaaat gtcaaagata cagtctcaga2760agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca aaggataatt tcgggaaacc tcctcggatt2820ccattgccca gctatctgtc acttcatcga aaggacagta gaaaaggaag gtggctccta2880caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcattcaa gatctctctg ccgacagtgg2940tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac3000gtcttcaaag caagtggatt gatgtgacat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc3060
ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac3120acgctcgagc ccgaattgat tgtgggtatg ctattcttgt cttgtatgga agataacgag3180gctatagaaa tctttggtgc agaacggttc tcacagtata tgggttatgg ttcctccttt3240cgctttgttg gtgactattt agataccaaa ccctttgatt cgatgggcag acggagaact3300aggattgtgg cggtacccca gcttggtaag gaaataatta ttttcttttt tccttttagt3360ataaaatagt taagtgatgt taattagtat gattataata atatagttgt tataattgtg3420aaaaaataat ttataaatat attgtttaca taaacaacat agtaatgtaa aaaaatatga3480caagtgatgt gtaagacgaa gaagataaaa gttgagagta agtatattat ttttaatgaa3540tttgatcgaa catgtaagat gatatactag cattaatatt tgttttaatc ataatagtaa3600ttctagctgg tttgatgaat taaatatcaa tgataaaata ctatagtaaa aataagaata3660aataaattaa aataatattt ttttatgatt aatagtttat tatataatta aatatctata3720ccattactaa atattttagt ttaaaagtta ataaatattt tgttagaaat tccaatctgc3780ttgtaattta tcaataaaca aaatattaaa taacaagcta aagtaacaaa taatatcaaa3840ctaatagaaa cagtaatcta atgtaacaaa acataatcta atgctaatat aacaaagcgc3900aagatctatc attttatata gtattatttt caatcaacat tcttattaat ttctaaataa3960tacttgtagt tttattaact tctaaatgga ttgactatta attaaatgaa ttagtcgaac4020atgaataaac aaggtaacat gatagatcat gtcattgtgt tatcattgat cttacatttg4080gattgattac agttgggaag ctgggttcga aatcgatagc cacaatccta gttctccgtc4140tgcccatcga atcaaagggt ttggtatcta aatagtcacc aacaaagcga aaggaggaac4200cataacccat atactgtgag aaccgttctg caccaaagat ttctatagcc tcgttatctt4260ccatacaaga caagaatagc atacccacaa tcaattcggg tctagagtcc tgctttaatg4320agatatgcga gacgcctatg atcgcatgat atttgctttc aattctgttg tgcacgttgt4380
aaaaaacctg agcatgtgta gctcagatcc ttaccgccgg tttcggttca ttctaatgaa4440tatatcaccc gttactatcg tatttttatg aataatattc tccgttcaat ttactgattg4500taccctacta cttatatgta caatattaaa atgaaaacaa tatattgtgc tgaataggtt4560tatagcgaca tctatgatag agcgccacaa taacaaacaa ttgcgtttta ttattacaaa4620tccaatttta aaaaaagcgg cagaaccggt caaacctaaa agactgatta cataaatctt4680attcaaattt caaaaggccc caggggctag tatctacgac acaccgagcg gcgaactaat4740aacgttcact gaagggaact ccggttcccc gccggcgcgc atgggtgaga ttccttgaag4800ttgagtattg gccgtccgct ctaccgaaag ttacgggcac cattcaaccc ggtccagcac4860ggcggccggg taaccgactt gctgccccga gaattatgca gcattttttt ggtgtatgtg4920ggccccaaat gaagtgcagg tcaaaccttg acagtgacga caaatcgttg ggcgggtcca4980gggcgaattt tgcgacaaca tgtcgaggct cagcaggacc tgcaggtcga cggccgagta5040ctggcaggat atataccgtt gtaatttgtc gcgtgtgaat aagtcgctgt gtatgtttgt5100ttgattgttt ctgttggagt gcagcccatt tcaccggaca agtcggctag attgatttag5160ccctgatgaa ctgccgaggg gaagccatct tgagcgcgga atgggaatgg atttcgttgt5220acaacgagac gacagaacac ccacgggacc gagcttcgat cgagcatcaa atgaaactgc5280aatttattca tatcaggatt atcaatacca tatttttgaa aaagccgttt ctgtaatgaa5340ggagaaaact caccgaggca gttccatagg atggcaagat cctggtatcg gtctgcgatt5400ccgactcgtc caacatcaat acaacctatt aatttcccct cgtcaaaaat aaggttatca5460agtgagaaat caccatgagt gacgactgaa tccggtgaga atggcaaaag tttatgcatt5520tctttccaga cttgttcaac aggccagcca ttacgctcgt catcaaaatc actcgcatca5580accaaaccgt tattcattcg tgattgcgcc tgagcgagac gaaatacgcc gctgttaaaa5640ggacaattac aaacaggaat cgaatgcaac cggcgcagga acactgccag cgcatcaaca5700
atattttcac ctgaatcagg atattcttct aatacctgga atgctgtttt tccggggatc5760gcagtggtga gtaaccatgc atcatcagga gtacggataa aatgcttgat ggtcggaaga5820ggcataaatt ccgtcagcca gtttagtctg accatctcat ctgtaacatc attggcaacg5880ctacctttgc catgtttcag aaacaactct ggcgcatcgg gcttcccata caatcgatag5940attgtcgcac ctgattgccc gacattatcc gaatctggca attccggttc gcttgctgtc6000cataaaaccg cccagtctag ctatcgccat gtaagcccac tgcaagctac ctgctttctc6060tttgcgcttg cgttttccgg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc6120ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca6180actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta6240gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct6300ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg6360gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc6420acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta6480tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg6540gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt6600cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg6660cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg6720ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc6780gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg6840agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt6900tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag6960tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac7020
ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga7080ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc7140agggtgcctt gatgtgggcg ccggcggtcg agtggcgacg gcgcggcttg tccgcgccct7200ggtagattgc ctggccgtag gccagccatt tttgagcggc cagcggccgc gataggccga7260cgcgaagcgg cggggcgtag ggagcgcagc gaccgaaggg taggcgcttt ttgcagctct7320tcggctgtgc gctggccaga cagttatgca caggccaggc gggttttaag agttttaata7380agttttaaag agttttaggc ggaaaaatcg ccttttttct cttttatatc agtcacttac7440atgtgtgacc ggttcccaat gtacggcttt gggttcccaa tgtacgggtt ccggttccca7500atgtacggct ttgggttccc aatgtacgtg ctatccacag gaaagagacc ttttcgacct7560ttttcccctg ctagggcaat ttgccctagc atctgctccg tacattagga accggcggat7620gcttcgccct cgatcaggtt gcggtagcgc atgactagga tcgggccagc ctgccccgcc7680tcctccttca aatcgtactc cggcaggtca tttgacccga tcagcttgcg cacggtgaaa7740cagaacttct tgaactctcc ggcgctgcca ctgcgttcgt agatcgtctt gaacaaccat7800ctggcttctg ccttgcctgc ggcgcggcgt gccaggcggt agagaaaacg gccgatgccg7860ggatcgatca aaaagtaatc ggggtgaacc gtcagcacgt ccgggttctt gccttctgtg7920atctcgcggt acatccaatc agctagctcg atctcgatgt actccggccg cccggtttcg7980ctctttacga tcttgtagcg gctaatcaag gcttcaccct cggataccgt caccaggcgg8040ccgttcttgg ccttcttcgt acgctgcatg gcaacgtgcg tggtgtttaa ccgaatgcag8100gtttctacca ggtcgtcttt ctgctttccg ccatcggctc gccggcagaa cttgagtacg8160tccgcaacgt gtggacggaa cacgcggccg ggcttgtctc ccttcccttc ccggtatcgg8220ttcatggatt cggttagatg ggaaaccgcc atcagtacca ggtcgtaatc ccacacactg8280gccatgccgg ccggccctgc ggaaacctct acgtgcccgt ctggaagctc gtagcggatc8340
acctcgccag ctcgtcggtc acgcttcgac agacggaaaa cggccacgtc catgatgctg8400cgactatcgc gggtgcccac gtcatagagc atcggaacga aaaaatctgg ttgctcgtcg8460cccttgggcg gcttcctaat cgacggcgca ccggctgccg gcggttgccg ggattctttg8520cggattcgat cagcggccgc ttgccacgat tcaccggggc gtgcttctgc ctcgatgcgt8580tgccgctggg cggcctgcgc ggccttcaac ttctccacca ggtcatcacc cagcgccgcg8640ccgatttgta ccgggccgga tggtttgcga ccgtcacgcc gattcctcgg gcttgggggt8700tccagtgcca ttgcagggcc ggcagacaac ccagccgctt acgcctggcc aaccgcccgt8760tcctccacac atggggcatt ccacggcgtc ggtgcctggt tgttcttgat tttccatgcc8820gcctccttta gccgctaaaa ttcatctact catttattca tttgctcatt tactctggta8880gctgcgcgat gtattcagat agcagctcgg taatggtctt gccttggcgt accgcgtaca8940tcttcagctt ggtgtgatcc tccgccggca actgaaagtt gacccgcttc atggctggcg9000tgtctgccag gctggccaac gttgcagcct tgctgctgcg tgcgctcgga cggccggcac9060ttagcgtgtt tgtgcttttg ctcattttct ctttacctca ttaactcaaa tgagttttga9120tttaatttca gcggccagcg cctggacctc gcgggcagcg tcgccctcgg gttctgattc9180aagaacggtt gtgccggcgg cggcagtgcc tgggtagctc acgcgctgcg tgatacggga9240ctcaagaatg ggcagctcgt acccggccag cgcctcggca acctcaccgc cgatgcgcgt9300gcctttgatc gcccgcgaca cgacaaaggc cgcttgtagc cttccatccg tgacctcaat9360gcgctgctta accagctcca ccaggtcggc ggtggcccat atgtcgtaag ggcttggctg9420caccggaatc agcacgaagt cggctgcctt gatcgcggac acagccaagt ccgccgcctg9480gggcgctccg tcgatcacta cgaagtcgcg ccggccgatg gccttcacgt cgcggtcaat9540cgtcgggcgg tcgatgccga caacggttag cggttgatct tcccgcacgg ccgcccaatc9600gcgggcactg ccctggggat cggaatcgac taacagaaca tcggccccgg cgagttgcag9660
ggcgcgggct agatgggttg cgatggtcgt cttgcctgac ccgcctttct ggttaagtac9720agcgataacc ttcatgcgtt ccccttgcgt atttgtttat ttactcatcg catcatatac9780gcagcgaccg catgacgcaa gctgttttac tcaaatacac atcacctttt tagacggcgg9840cgctcggttt cttcagcggc caagctggcc ggccaggccg ccagcttggc atcagacaaa9900ccggccagga tttcatgcag ccgcacggtt gagacgtgcg cgggcggctc gaacacgtac9960ccggccgcga tcatctccgc ctcgatctct tcggtaatga aaaacggttc gtcctggccg 10020tcctggtgcg gtttcatgct tgttcctctt ggcgttcatt ctcggcggcc gccagggcgt 10080cggcctcggt caatgcgtcc tcacggaagg caccgcgccg cctggcctcg gtgggcgtca 10140cttcctcgct gcgctcaagt gcgcggtaca gggtcgagcg atgcacgcca agcagtgcag 10200ccgcctcttt cacggtgcgg ccttcctggt cgatcagctc gcgggcgtgc gcgatctgtg 10260ccggggtgag ggtagggcgg gggccaaact tcacgcctcg ggccttggcg gcctcgcgcc 10320cgctccgggt gcggtcgatg attagggaac gctcgaactc ggcaatgccg gcgaacacgg 10380tcaacaccat gcggccggcc ggcgtggtgg tgtcggccca cggctctgcc aggctacgca 10440ggcccgcgcc ggcctcctgg atgcgctcgg caatgtccag taggtcgcgg gtgctgcggg 10500ccaggcggtc tagcctggtc actgtcacaa cgtcgccagg gcgtaggtgg tcaagcatcc 10560tggccagctc cgggcggtcg cgcctggtgc cggtgatctt ctcggaaaac agcttggtgc 10620agccggccgc gtgcagttcg gcccgttggt tggtcaagtc ctggtcgtcg gtgctgacgc 10680gggcatagcc cagcaggcca gcggcggcgc tcttgttcat ggcgtaatgt ctccggttct 10740agtcgcaagt attctacttt atgcgactaa aacacgcgac aagaaaacgc caggaaaagg 10800gcagggcggc agcctgtcgc gtaacttagg acttgtgcga catgtcgttt tcagaagacg 10860gctgcactga acgtcagaag ccgactgcac tatagcagcg gaggggttgg atcgatccct 10920gctcgcgcag gctgggtgcc aagctctcgg gtaacatcaa ggcccgatcc ttggagccct 10980
tgccctcccg cacgatgatc gtgccgtgat cgaaatccag atccttgacc cgcagttgca 11040aaccctcact gatccgcatg cccgttccat acagaagctg ggcgaacaaa cgatgctcgc 11100cttccagaaa accgaggatg cgaaccactt catccggggt cagcaccacc ggcaagcgcc 11160cggacggccg aggtcttccg atctcctgaa gccagggcag atccgtgcac agcacttgcc 11220gtagaagaac agcaaggccg ccaatgcctg acgatgcgtg gagaccgaaa ccttgcgctc 11280gttcgccagc caggacagaa atgcctcgac ttcgctgctg cccaaggttg ccgggtgacg 11340cacaccgtgg aaacggatga aggcacgaac ccagtggaca taagcctgtt cggttcgtaa 11400gctgtaatgc aagtagcgta tgcgctcacg caactggtcc agaaccttga ccgaacgcag 11460cggtggtaac ggcgcagtgg cggttttcat ggcttgttat gactgttttt ttggggtaca 11520gtctatgcct cgggcatcca agcagcaagc gcgttacgcc gtgggtcgat gtttgatgtt 11580atggagcagc aacgatgtta cgcagcaggg cagtcgccct aaaacaaagt taaacatcat 11640gagggaagcg gtgatcgccg aagtatcgac tcaactatca gaggtagttg gcgtcatcga 11700gcgccatctc gaaccgacgt tgctggccgt acatttgtac ggctccgcag tggatggcgg 11760cctgaagcca cacagtgata ttgatttgct ggttacggtg accgtaaggc ttgatgaaac 11820aacgcggcga gctttgatca acgacctttt ggaaacttcg gcttcccctg gagagagcga 11880gattctccgc gctgtagaag tcaccattgt tgtgcacgac gacatcattc cgtggcgtta 11940tccagctaag cgcgaactgc aatttggaga atggcagcgc aatgacattc ttgcaggtat 12000cttcgagcca gccacgatcg acattgatct ggctatcttg ctgacaaaag caagagaaca 12060tagcgttgcc ttggtaggtc cagcggcgga ggaactcttt gatccggttc ctgaacagga 12120tctatttgag gcgctaaatg aaaccttaac gctatggaac tcgccgcccg actgggctgg 12180cgatgagcga aatgtagtgc ttacgttgtc ccgcatttgg tacagcgcag taaccggcaa 12240aatcgcgccg aaggatgtcg ctgccgactg ggcaatggag cgcctgccgg cccagtatca 12300
gcccgtcata cttgaagcta gacaggctta tcttggacaa gaagaagatc gcttggcctc 12360gcgcgcagat cagttggaag aatttgtcca ctacgtgaaa ggcgagatca ccaaggtagt 12420cggcaaataa tgtctaacaa ttcgttcaag ccgacgccgc ttcgcggcgc ggcttaactc 12480aagcgttaga tgcactaagc acataattgc tcacagccaa actatcaggt caagtctgct 12540tttattattt ttaagcgtgc ataataagcc ctacacaaat tgggagatat atcatgaaag 12600gctggctttt tcttgttatc gcaatagttg gcgaagtaat cgcaacatcc gcattaaaat 12660ctagcgaggg ctttactaag ctagcttgct tggtcgttcc ggtaccgtga acgtcggctc 12720gattgtacct gcgttcaaat actttgcgat cgtgttgcgc gcctgcccgg tgcgtcggct 12780gatctcacgg atcgactgct tctctcgcaa cgccatccga cggatgatgt ttaaaagtcc 12840catgtggatc actccgttgc cccgtcgctc accgtgttgg ggggaaggtg cacatggctc 12900agttctcaat ggaaattatc tgcctaaccg gctcagttct gcgtagaaac caacatgcaa 12960gctccaccgg gtgcaaagcg gcagcgg 12987<210>25<211>13226<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>包含降低ParG表達的嵌合基因的T-DNA載體<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(25)
<223>左T-DNA邊界(C)<220>
<221>misc_feature<222>(58)..(318)<223>3’nos(C)<220>
<221>misc_feature<222>(337)..(888)<223>bar編碼區(qū)(C)<220>
<221>misc_feature<222>(889)..(1721)<223>35S3啟動子區(qū)(C)<220>
<221>misc_feature<222>(1778)..(3123)<223>35S啟動子區(qū)
<220>
<221>misc_feature<222>(3130)..(3431)<223>玉米的ParG同源物的一部分<220>
<221>misc_feature<222>(3464)..(4205)<223>Pdk-內(nèi)含子<220>
<221>misc_feature<222>(4238)..(4536)<223>玉米的ParG同源物的一部分(C)<220>
<221>misc_feature<222>(4549)..(5259)<223>3’ocs<220>
<221>misc_feature
<222>(5281)..(5305)<223>右T-dNA邊界(C)<400>25cggcaggata tattcaattg taaatggctc catggcgatc gctctagagg atcttcccga 60tctagtaaca tagatgacac cgcgcgcgat aatttatcct agtttgcgcg ctatattttg120ttttctatcg cgtattaaat gtataattgc gggactctaa tcataaaaac ccatctcata180aataacgtca tgcattacat gttaattatt acatgcttaa cgtaattcaa cagaaattat240atgataatca tcgcaagacc ggcaacagga ttcaatctta agaaacttta ttgccaaatg300tttgaacgat ctgcttcgga tcctagacgc gtgagatcag atctcggtga cgggcaggac360cggacggggc ggtaccggca ggctgaagtc cagctgccag aaacccacgt catgccagtt420cccgtgcttg aagccggccg cccgcagcat gccgcggggg gcatatccga gcgcctcgtg480catgcgcacg ctcgggtcgt tgggcagccc gatgacagcg accacgctct tgaagccctg540tgcctccagg gacttcagca ggtgggtgta gagcgtggag cccagtcccg tccgctggtg600gcggggggag acgtacacgg tcgactcggc cgtccagtcg taggcgttgc gtgccttcca660ggggcccgcg taggcgatgc cggcgacctc gccgtccacc tcggcgacga gccagggata720gcgctcccgc agacggacga ggtcgtccgt ccactcctgc ggttcctgcg gctcggtacg780gaagttgacc gtgcttgtct cgatgtagtg gttgacgatg gtgcagaccg ccggcatgtc840cgcctcggtg gcacggcgga tgtcggccgg gcgtcgttct gggtccatgg ttatagagag900agagatagat ttatagagag agactggtga tttcagcgtg tcctctccaa atgaaatgaa960cttccttata tagaggaagg gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc atcccttacg 1020tcagtggaga tgtcacatca atccacttgc tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt 1080
tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc agaggcatct1140tgaatgatag cctttccttt atcgcaatga tggcatttgt aggagccacc ttccttttct1200actgtccttt cgatgaagtg acagatagct gggcaatgga atccgaggag gtttcccgaa1260attatccttt gttgaaaagt ctcaatagcc ctttggtctt ctgagactgt atctttgaca1320tttttggagt agaccagagt gtcgtgctcc accatgttga cgaagatttt cttcttgtca1380ttgagtcgta aaagactctg tatgaactgt tcgccagtct tcacggcgag ttctgttaga1440tcctcgattt gaatcttaga ctccatgcat ggccttagat tcagtaggaa ctaccttttt1500agagactcca atctctatta cttgccttgg tttatgaagc aagccttgaa tcgtccatac1560tggaatagta cttctgatct tgagaaatat gtctttctct gtgttcttga tgcaattagt1620cctgaatctt ttgactgcat ctttaacctt cttgggaagg tatttgatct cctggagatt1680gttactcggg tagatcgtct tgatgagacc tgctgcgtag gaacgcggcc gcgtatacgt1740atcgatatct tcgaattcga gctcgtcgag cggccgctcg acgaattaat tccaatccca1800caaaaatctg agcttaacag cacagttgct cctctcagag cagaatcggg tattcaacac1860cctcatatca actactacgt tgtgtataac ggtccacatg ccggtatata cgatgactgg1920ggttgtacaa aggcggcaac aaacggcgtt cccggagttg cacacaagaa atttgccact1980attacagagg caagagcagc agctgacgcg tacacaacaa gtcagcaaac agacaggttg2040aacttcatcc ccaaaggaga agctcaactc aagcccaaga gctttgctaa ggccctaaca2100agcccaccaa agcaaaaagc ccactggctc acgctaggaa ccaaaaggcc cagcagtgat2160ccagccccaa aagagatctc ctttgccccg gagattacaa tggacgattt cctctatctt2220tacgatctag gaaggaagtt cgaaggtgaa ggtgacgaca ctatgttcac cactgataat2280gagaaggtta gcctcttcaa tttcagaaag aatgctgacc cacagatggt tagagaggcc2340tacgcagcag gtctcatcaa gacgatctac ccgagtaaca atctccagga gatcaaatac2400
cttcccaaga aggttaaaga tgcagtcaaa agattcagga ctaattgcat caagaacaca2460gagaaagaca tatttctcaa gatcagaagt actattccag tatggacgat tcaaggcttg2520cttcataaac caaggcaagt aatagagatt ggagtctcta aaaaggtagt tcctactgaa2580tctaaggcca tgcatggagt ctaagattca aatcgaggat ctaacagaac tcgccgtgaa2640gactggcgaa cagttcatac agagtctttt acgactcaat gacaagaaga aaatcttcgt2700caacatggtg gagcacgaca ctctggtcta ctccaaaaat gtcaaagata cagtctcaga2760agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca aaggataatt tcgggaaacc tcctcggatt2820ccattgccca gctatctgtc acttcatcga aaggacagta gaaaaggaag gtggctccta2880caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcattcaa gatctctctg ccgacagtgg2940tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac3000gtcttcaaag caagtggatt gatgtgacat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc3060ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac3120acgctcgagg aatctggctg tctcctaagg gaagtgaaca aggcattttg tggatttttc3180gatcaatcga aacaccatct ctatgcgaag cttttccagg atttgcacaa caaggatgac3240ttttcaagca tcaattccag tgagtacgta ggagtttcaa caggaaactg gggttgtggt3300gcttttggtg gaaaccctga aatcaagagc atgattcagt ggattgctgc atcacaggct3360cttcgccctt ttgttaatta ctacactttt gagaacgtgt ctctgcaaag attagaggag3420gtgatccagt gggtacccca gcttggtaag gaaataatta ttttcttttt tccttttagt3480ataaaatagt taagtgatgt taattagtat gattataata atatagttgt tataattgtg3540aaaaaataat ttataaatat attgtttaca taaacaacat agtaatgtaa aaaaatatga3600caagtgatgt gtaagacgaa gaagataaaa gttgagagta agtatattat ttttaatgaa3660tttgatcgaa catgtaagat gatatactag cattaatatt tgttttaatc ataatagtaa3720
ttctagctgg tttgatgaat taaatatcaa tgataaaata ctatagtaaa aataagaata3780aataaattaa aataatattt ttttatgatt aatagtttat tatataatta aatatctata3840ccattactaa atattttagt ttaaaagtta ataaatattt tgttagaaat tccaatctgc3900ttgtaattta tcaataaaca aaatattaaa taacaagcta aagtaacaaa taatatcaaa3960ctaatagaaa cagtaatcta atgtaacaaa acataatcta atgctaatat aacaaagcgc4020aagatctatc attttatata gtattatttt caatcaacat tcttattaat ttctaaataa4080tacttgtagt tttattaact tctaaatgga ttgactatta attaaatgaa ttagtcgaac4140atgaataaac aaggtaacat gatagatcat gtcattgtgt tatcattgat cttacatttg4200gattgattac agttgggaag ctgggttcga aatcgatcac tggatcacct cctctaatct4260ttgcagagac acgttctcaa aagtgtagta attaacaaaa gggcgaagag cctgtgatgc4320agcaatccac tgaatcatgc tcttgatttc agggtttcca ccaaaagcac cacaacccca4380gtttcctgtt gaaactccta cgtactcact ggaattgatg cttgaaaagt catccttgtt4440gtgcaaatcc tggaaaagct tcgcatagag atggtgtttc gattgatcga aaaatccaca4500aaatgccttg ttcacttccc ttaggagaca gccagattct ctagagtcct gctttaatga4560gatatgcgag acgcctatga tcgcatgata tttgctttca attctgttgt gcacgttgta4620aaaaacctga gcatgtgtag ctcagatcct taccgccggt ttcggttcat tctaatgaat4680atatcacccg ttactatcgt atttttatga ataatattct ccgttcaatt tactgattgt4740accctactac ttatatgtac aatattaaaa tgaaaacaat atattgtgct gaataggttt4800atagcgacat ctatgataga gcgccacaat aacaaacaat tgcgttttat tattacaaat4860ccaattttaa aaaaagcggc agaaccggtc aaacctaaaa gactgattac ataaatctta4920ttcaaatttc aaaaggcccc aggggctagt atctacgaca caccgagcgg cgaactaata4980acgttcactg aagggaactc cggttccccg ccggcgcgca tgggtgagat tccttgaagt5040
tgagtattgg ccgtccgctc taccgaaagt tacgggcacc attcaacccg gtccagcacg5100gcggccgggt aaccgacttg ctgccccgag aattatgcag catttttttg gtgtatgtgg5160gccccaaatg aagtgcaggt caaaccttga cagtgacgac aaatcgttgg gcgggtccag5220ggcgaatttt gcgacaacat gtcgaggctc agcaggacct gcaggtcgac ggccgagtac5280tggcaggata tataccgttg taatttgtcg cgtgtgaata agtcgctgtg tatgtttgtt5340tgattgtttc tgttggagtg cagcccattt caccggacaa gtcggctaga ttgatttagc5400cctgatgaac tgccgagggg aagccatctt gagcgcggaa tgggaatgga tttcgttgta5460caacgagacg acagaacacc cacgggaccg agcttcgatc gagcatcaaa tgaaactgca5520atttattcat atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc tgtaatgaag5580gagaaaactc accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg tctgcgattc5640cgactcgtcc aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata aggttatcaa5700gtgagaaatc accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagt ttatgcattt5760ctttccagac ttgttcaaca ggccagccat tacgctcgtc atcaaaatca ctcgcatcaa5820ccaaaccgtt attcattcgt gattgcgcct gagcgagacg aaatacgccg ctgttaaaag5880gacaattaca aacaggaatc gaatgcaacc ggcgcaggaa cactgccagc gcatcaacaa5940tattttcacc tgaatcagga tattcttcta atacctggaa tgctgttttt ccggggatcg6000cagtggtgag taaccatgca tcatcaggag tacggataaa atgcttgatg gtcggaagag6060gcataaattc cgtcagccag tttagtctga ccatctcatc tgtaacatca ttggcaacgc6120tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg gcgcatcggg cttcccatac aatcgataga6180ttgtcgcacc tgattgcccg acattatccg aatctggcaa ttccggttcg cttgctgtcc6240ataaaaccgc ccagtctagc tatcgccatg taagcccact gcaagctacc tgctttctct6300ttgcgcttgc gttttccgga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct6360
tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa6420ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag6480tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc6540tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg6600actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca6660cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat6720gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg6780tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc6840ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc6900ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc6960cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg7020cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga7080gcgaggaagc ggaagagcgc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt7140cacaccgcat atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagt7200atacactccg ctatcgctac gtgactgggt catggctgcg ccccgacacc cgccaacacc7260cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac7320cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgaggca7380gggtgccttg atgtgggcgc cggcggtcga gtggcgacgg cgcggcttgt ccgcgccctg7440gtagattgcc tggccgtagg ccagccattt ttgagcggcc agcggccgcg ataggccgac7500gcgaagcggc ggggcgtagg gagcgcagcg accgaagggt aggcgctttt tgcagctctt7560cggctgtgcg ctggccagac agttatgcac aggccaggcg ggttttaaga gttttaataa7620gttttaaaga gttttaggcg gaaaaatcgc cttttttctc ttttatatca gtcacttaca7680
tgtgtgaccg gttcccaatg tacggctttg ggttcccaat gtacgggttc cggttcccaa7740tgtacggctt tgggttccca atgtacgtgc tatccacagg aaagagacct tttcgacctt7800tttcccctgc tagggcaatt tgccctagca tctgctccgt acattaggaa ccggcggatg7860cttcgccctc gatcaggttg cggtagcgca tgactaggat cgggccagcc tgccccgcct7920cctccttcaa atcgtactcc ggcaggtcat ttgacccgat cagcttgcgc acggtgaaac7980agaacttctt gaactctccg gcgctgccac tgcgttcgta gatcgtcttg aacaaccatc8040tggcttctgc cttgcctgcg gcgcggcgtg ccaggcggta gagaaaacgg ccgatgccgg8100gatcgatcaa aaagtaatcg gggtgaaccg tcagcacgtc cgggttcttg ccttctgtga8160tctcgcggta catccaatca gctagctcga tctcgatgta ctccggccgc ccggtttcgc8220tctttacgat cttgtagcgg ctaatcaagg cttcaccctc ggataccgtc accaggcggc8280cgttcttggc cttcttcgta cgctgcatgg caacgtgcgt ggtgtttaac cgaatgcagg8340tttctaccag gtcgtctttc tgctttccgc catcggctcg ccggcagaac ttgagtacgt8400ccgcaacgtg tggacggaac acgcggccgg gcttgtctcc cttcccttcc cggtatcggt8460tcatggattc ggttagatgg gaaaccgcca tcagtaccag gtcgtaatcc cacacactgg8520ccatgccggc cggccctgcg gaaacctcta cgtgcccgtc tggaagctcg tagcggatca8580cctcgccagc tcgtcggtca cgcttcgaca gacggaaaac ggccacgtcc atgatgctgc8640gactatcgcg ggtgcccacg tcatagagca tcggaacgaa aaaatctggt tgctcgtcgc8700ccttgggcgg cttcctaatc gacggcgcac cggctgccgg cggttgccgg gattctttgc8760ggattcgatc agcggccgct tgccacgatt caccggggcg tgcttctgcc tcgatgcgtt8820gccgctgggc ggcctgcgcg gccttcaact tctccaccag gtcatcaccc agcgccgcgc8880cgatttgtac cgggccggat ggtttgcgac cgtcacgccg attcctcggg cttgggggtt8940ccagtgccat tgcagggccg gcagacaacc cagccgctta cgcctggcca accgcccgtt9000
cctccacaca tggggcattc cacggcgtcg gtgcctggtt gttcttgatt ttccatgccg9060cctcctttag ccgctaaaat tcatctactc atttattcat ttgctcattt actctggtag9120ctgcgcgatg tattcagata gcagctcggt aatggtcttg ccttggcgta ccgcgtacat9180cttcagcttg gtgtgatcct ccgccggcaa ctgaaagttg acccgcttca tggctggcgt9240gtctgccagg ctggccaacg ttgcagcctt gctgctgcgt gcgctcggac ggccggcact9300tagcgtgttt gtgcttttgc tcattttctc tttacctcat taactcaaat gagttttgat9360ttaatttcag cggccagcgc ctggacctcg cgggcagcgt cgccctcggg ttctgattca9420agaacggttg tgccggcggc ggcagtgcct gggtagctca cgcgctgcgt gatacgggac9480tcaagaatgg gcagctcgta cccggccagc gcctcggcaa cctcaccgcc gatgcgcgtg9540cctttgatcg cccgcgacac gacaaaggcc gcttgtagcc ttccatccgt gacctcaatg9600cgctgcttaa ccagctccac caggtcggcg gtggcccata tgtcgtaagg gcttggctgc9660accggaatca gcacgaagtc ggctgccttg atcgcggaca cagccaagtc cgccgcctgg9720ggcgctccgt cgatcactac gaagtcgcgc cggccgatgg ccttcacgtc gcggtcaatc9780gtcgggcggt cgatgccgac aacggttagc ggttgatctt cccgcacggc cgcccaatcg9840cgggcactgc cctggggatc ggaatcgact aacagaacat cggccccggc gagttgcagg9900gcgcgggcta gatgggttgc gatggtcgtc ttgcctgacc cgcctttctg gttaagtaca9960gcgataacct tcatgcgttc cccttgcgta tttgtttatt tactcatcgc atcatatacg 10020cagcgaccgc atgacgcaag ctgttttact caaatacaca tcaccttttt agacggcggc 10080gctcggtttc ttcagcggcc aagctggccg gccaggccgc cagcttggca tcagacaaac 10140cggccaggat ttcatgcagc cgcacggttg agacgtgcgc gggcggctcg aacacgtacc 10200cggccgcgat catctccgcc tcgatctctt cggtaatgaa aaacggttcg tcctggccgt 10260cctggtgcgg tttcatgctt gttcctcttg gcgttcattc tcggcggccg ccagggcgtc 10320
ggcctcggtc aatgcgtcct cacggaaggc accgcgccgc ctggcctcgg tgggcgtcac 10380ttcctcgctg cgctcaagtg cgcggtacag ggtcgagcga tgcacgccaa gcagtgcagc 10440cgcctctttc acggtgcggc cttcctggtc gatcagctcg cgggcgtgcg cgatctgtgc 10500cggggtgagg gtagggcggg ggccaaactt cacgcctcgg gccttggcgg cctcgcgccc 10560gctccgggtg cggtcgatga ttagggaacg ctcgaactcg gcaatgccgg cgaacacggt 10620caacaccatg cggccggccg gcgtggtggt gtcggcccac ggctctgcca ggctacgcag 10680gcccgcgccg gcctcctgga tgcgctcggc aatgtccagt aggtcgcggg tgctgcgggc 10740caggcggtct agcctggtca ctgtcacaac gtcgccaggg cgtaggtggt caagcatcct 10800ggccagctcc gggcggtcgc gcctggtgcc ggtgatcttc tcggaaaaca gcttggtgca 10860gccggccgcg tgcagttcgg cccgttggtt ggtcaagtcc tggtcgtcgg tgctgacgcg 10920ggcatagccc agcaggccag cggcggcgct cttgttcatg gcgtaatgtc tccggttcta 10980gtcgcaagta ttctacttta tgcgactaaa acacgcgaca agaaaacgcc aggaaaaggg 11040cagggcggca gcctgtcgcg taacttagga cttgtgcgac atgtcgtttt cagaagacgg 11100ctgcactgaa cgtcagaagc cgactgcact atagcagcgg aggggttgga tcgatccctg 11160ctcgcgcagg ctgggtgcca agctctcggg taacatcaag gcccgatcct tggagccctt 11220gccctcccgc acgatgatcg tgccgtgatc gaaatccaga tccttgaccc gcagttgcaa 11280accctcactg atccgcatgc ccgttccata cagaagctgg gcgaacaaac gatgctcgcc 11340ttccagaaaa ccgaggatgc gaaccacttc atccggggtc agcaccaccg gcaagcgccc 11400ggacggccga ggtcttccga tctcctgaag ccagggcaga tccgtgcaca gcacttgccg 11460tagaagaaca gcaaggccgc caatgcctga cgatgcgtgg agaccgaaac cttgcgctcg 11520ttcgccagcc aggacagaaa tgcctcgact tcgctgctgc ccaaggttgc cgggtgacgc 11580acaccgtgga aacggatgaa ggcacgaacc cagtggacat aagcctgttc ggttcgtaag 11640
ctgtaatgca agtagcgtat gcgctcacgc aactggtcca gaaccttgac cgaacgcagc 11700ggtggtaacg gcgcagtggc ggttttcatg gcttgttatg actgtttttt tggggtacag 11760tctatgcctc gggcatccaa gcagcaagcg cgttacgccg tgggtcgatg tttgatgtta 11820tggagcagca acgatgttac gcagcagggc agtcgcccta aaacaaagtt aaacatcatg 11880agggaagcgg tgatcgccga agtatcgact caactatcag aggtagttgg cgtcatcgag 11940cgccatctcg aaccgacgtt gctggccgta catttgtacg gctccgcagt ggatggcggc 12000ctgaagccac acagtgatat tgatttgctg gttacggtga ccgtaaggct tgatgaaaca 12060acgcggcgag ctttgatcaa cgaccttttg gaaacttcgg cttcccctgg agagagcgag 12120attctccgcg ctgtagaagt caccattgtt gtgcacgacg acatcattcc gtggcgttat 12180ccagctaagc gcgaactgca atttggagaa tggcagcgca atgacattct tgcaggtatc 12240ttcgagccag ccacgatcga cattgatctg gctatcttgc tgacaaaagc aagagaacat 12300agcgttgcct tggtaggtcc agcggcggag gaactctttg atccggttcc tgaacaggat 12360ctatttgagg cgctaaatga aaccttaacg ctatggaact cgccgcccga ctgggctggc 12420gatgagcgaa atgtagtgct tacgttgtcc cgcatttggt acagcgcagt aaccggcaaa 12480atcgcgccga aggatgtcgc tgccgactgg gcaatggagc gcctgccggc ccagtatcag 12540cccgtcatac ttgaagctag acaggcttat cttggacaag aagaagatcg cttggcctcg 12600cgcgcagatc agttggaaga atttgtccac tacgtgaaag gcgagatcac caaggtagtc 12660ggcaaataat gtctaacaat tcgttcaagc cgacgccgct tcgcggcgcg gcttaactca 12720agcgttagat gcactaagca cataattgct cacagccaaa ctatcaggtc aagtctgctt 12780ttattatttt taagcgtgca taataagccc tacacaaatt gggagatata tcatgaaagg 12840ctggcttttt cttgttatcg caatagttgg cgaagtaatc gcaacatccg cattaaaatc 12900tagcgagggc tttactaagc tagcttgctt ggtcgttccg gtaccgtgaa cgtcggctcg 12960
attgtacctg cgttcaaata ctttgcgatc gtgttgcgcg cctgcccggt gcgtcggctg 13020atctcacgga tcgactgctt ctctcgcaac gccatccgac ggatgatgtt taaaagtccc 13080atgtggatca ctccgttgcc ccgtcgctca ccgtgttggg gggaaggtgc acatggctca 13140gttctcaatg gaaattatct gcctaaccgg ctcagttctg cgtagaaacc aacatgcaag 13200ctccaccggg tgcaaagcgg cagcgg 1322權利要求
1.產(chǎn)生對脅迫條件耐受的植物的方法，所述方法包括以下步驟(a)給植物細胞提供嵌合基因以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細胞，所述嵌合基因包含以下有效連接的DNA片段(i)可在植物表達的啟動子，(ii)DNA區(qū)，它在轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生ParG抑制性RNA分子；(iii)參與轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化的3’末端區(qū)；(b)從所述轉(zhuǎn)基因植物細胞再生轉(zhuǎn)基因植物品系群體；以及(c)在所述的轉(zhuǎn)基因植物品系群體中鑒定脅迫耐受的植物品系。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述parG抑制性RNA分子包含含有存在于所述植物細胞中的ParG基因核苷酸序列的至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的parG抑制性RNA分子包含含有這樣的至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述至少20個連續(xù)的核苷酸是來自存在于所述植物細胞中的ParG基因的核苷酸序列的互補序列。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的方法，其中所述的嵌合基因進一步包含在編碼所述parG抑制性RNA分子的所述DNA區(qū)和所述3’末端區(qū)之間編碼自剪接核酶的DNA區(qū)。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的parG抑制性RNA包含這樣的有義區(qū)和反義區(qū)，其中所述有義區(qū)包含這樣的至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，該至少20個連續(xù)的核苷酸來自存在于所述植物細胞的ParG基因的核苷酸序列，所述反義區(qū)包含這樣的至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，該至少20個連續(xù)的核苷酸來自存在于所述植物細胞的ParG基因的核苷酸序列的互補序列，其中所述有義區(qū)和反義區(qū)能形成包含所述至少20個連續(xù)核苷酸的雙鏈RNA區(qū)。
6.根據(jù)權利要求1到5中任意一項所述的方法，其中所述的脅迫條件選自熱、干旱、營養(yǎng)耗竭、氧化脅迫或高光照條件。
7.根據(jù)權利要求1到6中任意一項所述的方法，所述方法包括進一步將所述的轉(zhuǎn)基因植物品系與另一植物品系雜交來獲得脅迫耐受的子代植物。
8.產(chǎn)生對脅迫條件耐受的植物的方法，其中所述方法包括下述步驟(a)分離包含所述植物的部分parG編碼基因的至少100bp DNA片段；(b)通過有效地連接下列DNA片段產(chǎn)生嵌合基因；(i)可在植物中表達的啟動子區(qū)；(ii)與啟動子區(qū)相同方向的所述經(jīng)分離DNA片段，其中所述經(jīng)分離DNA片段包含所述植物的部分parG編碼基因；(iii)與啟動子區(qū)相反方向的所述經(jīng)分離DNA片段，其中所述經(jīng)分離DNA片段包含所述植物的部分parG編碼基因；(iv)參與轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化的3’末端區(qū)；(c)給植物細胞提供所述的嵌合基因以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細胞，(d)從所述轉(zhuǎn)基因植物細胞再生轉(zhuǎn)基因植物品系群體；以及(e)在所述的轉(zhuǎn)基因植物品系群體中鑒定脅迫耐受的植物。
9.DNA分子，所述DNA分子包含(i)可在植物中表達的啟動子；(ii)DNA區(qū)，所述DNA區(qū)當轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生ParG抑制性RNA分子；(iii)參與轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化的3’末端區(qū)。
10.根據(jù)權利要求9所述的DNA分子，其中所述的DNA區(qū)包含這樣的至少21到100個核苷酸的核苷酸序列，其中所述至少21到100個核苷酸來自編碼包含SEQ ID No 1、2或16的氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，或所述至少21到100個核苷酸來自SEQ ID 3、4、15或23的核苷酸序列。
11.包含權利要求9或10所述的DNA分子的植物細胞。
12.基本由權利要求11所述的植物細胞組成的植物。
13.用于產(chǎn)生脅迫耐受的植物的方法，所述方法包括進一步將權利要求12所述的植物與另一植物雜交的步驟。
14.根據(jù)權利要求12所述植物的種子和繁殖材料，所述的種子和繁殖材料包含權利要求9或10所述的嵌合基因。
15.通過權利要求8所述的方法可獲得的或獲得的植物。
16.產(chǎn)生對脅迫條件耐受的植物的方法，所述方法包括下述步驟(a)給植物細胞提供嵌合基因以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中所述嵌合基因包含以下有效連接的DNA片段(i)可在植物中表達的啟動子(ii)DNA區(qū)，所述DNA區(qū)當轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生ParG抑制性RNA分子，所述DNA區(qū)包含這樣的至少21-100個核苷酸的核苷酸序列，其中所述至少21-100個核苷酸來自編碼包含SEQ ID No 1、2或16的氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，或所述至少21到100個核苷酸來自SEQ ID 3，4，15或23的核苷酸序列；(iii)參與轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化的3’末端區(qū)；(b)從所述轉(zhuǎn)基因植物細胞再生轉(zhuǎn)基因植物品系群體；以及(c)在所述的轉(zhuǎn)基因植物品系群體中鑒定脅迫耐受的植物品系。
17.生產(chǎn)對脅迫條件耐受的植物的方法，所述方法包括以下步驟(a)將植物細胞系或植物或植物品系進行誘變；(b)鑒定那些在內(nèi)源ParG基因中具有突變的植物細胞或植物；(c)將經(jīng)鑒定的植物細胞或植物置于脅迫條件下；(d)鑒定耐受所述脅迫條件優(yōu)于對照植物的植物細胞或植物。
18.產(chǎn)生對脅迫條件耐受的植物的方法，所述方法包括下述步驟(a)選擇對ParG抑制劑耐受的植物細胞系或植物或植物品系；(b)鑒定那些在內(nèi)源ParG基因中具有突變的植物細胞或植物；(c)將經(jīng)鑒定的植物細胞或植物置于脅迫條件下；(d)鑒定耐受所述脅迫條件優(yōu)于對照植物的植物細胞或植物。
19.在內(nèi)源ParG基因中包含突變的脅迫耐受性植物細胞或植物。
全文摘要
提供了通過降低植物中內(nèi)源PARG蛋白的活性來提高植物對非生物脅迫或不利生長條件的耐受性的方法和手段，所述的非生物脅迫或不利生長條件包括干旱、高光照強度、高溫、營養(yǎng)限制等。
文檔編號C12N9/24GK1784495SQ200480012651
公開日2006年6月7日 申請日期2004年4月9日 優(yōu)先權日2003年4月9日
發(fā)明者M·德布洛克 申請人:拜爾生物科學公司