專利名稱：細胞培養(yǎng)微槽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種細胞培養(yǎng)微槽(micro-chamber)，更具體地，本發(fā)明涉及一種細胞培養(yǎng)微槽，通過其在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)時可以將細胞培養(yǎng)在一個細胞單位中。
背景技術：
到目前為止，對于細胞狀態(tài)變化以及細胞對某些化學制劑的反應的觀察通常是觀測基于一群細胞的某些數(shù)值的平均值，假設這群細胞來自于同一個細胞。但是實際上，一群細胞的細胞周期通常并不一致。因而各個細胞在不同周期發(fā)現(xiàn)了蛋白質。
為了解決這些問題，研發(fā)了諸如同步培養(yǎng)方法(synchronousculture process)等技術。但是，由于培養(yǎng)的細胞不是來自于一個完全相同的細胞，使得在蛋白質發(fā)現(xiàn)上的差異可能是由于在培養(yǎng)前衍生的各個細胞的基因不同所導致的。這樣，在分析對于刺激的反應時，很難判斷反應的差別到底是細胞本身反應機制的一般應答還是由于細胞存在差異(即基因信息上的差異)。
同樣地，對于細胞系也很難斷定對刺激反應的再現(xiàn)性的差異是否是由于每個細胞基因不同而造成的，因為通常其不是由一個完全相同的細胞培養(yǎng)出來的。
而且，由于對于細胞的刺激(信號)通常有兩種類型，一種是通過細胞周圍溶液中含有的信號物質、營養(yǎng)物及溶解的氣體的量給予，另一種是通過細胞間的物理接觸提供，所以也造成了難于判斷差異的情形。
另一方面，到目前為止，在生物技術領域觀察細胞時，通常是從一個大的培養(yǎng)容器中取出一部分培養(yǎng)的細胞群放在顯微鏡下觀察，或者是通過將整個顯微鏡裝入一個塑料容器中控制溫度，然后將一個小容器放入大容器中并調節(jié)二氧化碳濃度和濕度進行觀察。然后設計成在培養(yǎng)細胞時可以用新鮮培養(yǎng)液更換已經(jīng)使用的培養(yǎng)液，從而維持所述溶液條件恒定。
例如，有一種通過一種機制維持營養(yǎng)條件恒定的方法，其中一個循環(huán)泵根據(jù)基質表面，在高于基質上緣水平和低于基質下緣水平之間向上和向下操縱培養(yǎng)基的水平，由此當水平降低到較低水平時，培養(yǎng)基就被注入；當水平升高到較高水平時，培養(yǎng)基就被排出(日本專利申請公開(Kokai)Hei 10-191961)。
另外，一種維持培養(yǎng)容器營養(yǎng)條件恒定的方法是將進口管的一端插入培養(yǎng)容器以向培養(yǎng)容器中導入新鮮培養(yǎng)基，將出口管的一端插入培養(yǎng)容器以從培養(yǎng)容器中排出培養(yǎng)基和將氣體管的一端插入培養(yǎng)容器以通過泵交換培養(yǎng)容器中的氣體部分，其中進口管、出口管和氣體管在其各自管道上都安裝上過濾器以防止細菌侵入培養(yǎng)容器(日本專利申請公開(Kokai)Hei 8-172956)。
然而，這兩種方法都不能在控制要培養(yǎng)的細胞的溶液環(huán)境以及細胞間的物理接觸時培養(yǎng)所述培養(yǎng)細胞。
因此，本發(fā)明人解決了這些問題，本發(fā)明人發(fā)明了可以只選擇一個特異的新的細胞并且培養(yǎng)這個細胞形成細胞系的一種技術，其中在觀察細胞的時候可以控制細胞的溶液環(huán)境條件并維持容器中細胞濃度恒定的一種技術，以及在研究細胞間相互作用時觀察培養(yǎng)物的一種技術(日本專利申請公開(Kokai)2002-153260)。
本發(fā)明要解決的問題但是，上述專利申請(日本專利申請公開(Kokai)2002-153260)中所使用的光夾(photo pincette)技術，其捕獲能力的范圍在pN(piconewton)的程度，其足以捕獲懸浮細胞但不足以捕獲自遷移的細胞。而且，它也很難在培養(yǎng)時從培養(yǎng)區(qū)中選擇性回收遷移細胞。
因此，本發(fā)明人對上述微槽進行了很多研究，并發(fā)明了一種新的微槽，其中在培養(yǎng)時能夠在微槽中選擇性回收遷移細胞的通路可以通過可逆改變微槽的形狀來開啟或關閉。
解決問題的方法本發(fā)明的細胞培養(yǎng)微槽包括一個細胞培養(yǎng)區(qū)，至少2個連接細胞培養(yǎng)區(qū)與外界的通路，開啟或關閉通路的裝置(means)以及光學觀察細胞培養(yǎng)區(qū)及開啟或關閉通路的裝置，其中一個通路是通過它可以將可能含有細胞的培養(yǎng)液注入到細胞培養(yǎng)區(qū)內(nèi)的流體通路，而另外一個通路是通過它可以將可能含有細胞的培養(yǎng)液從細胞培養(yǎng)區(qū)排出的流體通路，所述通路的至少一部分由彈性材料包圍，且所述開啟和關閉裝置用于通過基本垂直于光學觀察裝置的觀察方向從外部擠壓或牽拉所述通路來開啟或關閉通路或改變通路的寬度。
這里用到的光學觀察裝置包括光學顯微鏡、錄影設備、照相機等等。它們可以連接個人電腦等進行圖像處理。為了觀察方便，它們也可以同時與照明裝置一起使用。
優(yōu)選在沒有操縱開啟和關閉裝置的時候通路的寬度與靶細胞的大小是相同的程度。因此，根據(jù)靶細胞大小的不同，合適的通路寬度也可以變化。當在沒有操縱開啟和關閉裝置的時候通路的寬度小于靶細胞大小時，細胞在正常狀態(tài)下不能夠通過通路，只有在通路打開時才能通過。因此，這個結構適于分離細胞。
開啟和關閉裝置可以是通過外力作用于通路來開啟或關閉通路或改變通路的寬度。其可以是任何應用機械力量的裝置或者是引起空間體積變化的裝置等。
優(yōu)選開啟和關閉裝置在鄰近通路處有一空隙，所述空隙充入氣體或液體，空隙的大小通過改變氣體或液體的壓力來改變，從而開啟或關閉通路或改變通路寬度。最常用的方法是這個空隙充入空氣，這樣形成的充入空氣的空隙可以用作空氣池(reservoir)，從而通過氣壓來控制通路的開啟或關閉。
通路可以完全用彈性材料包圍，或者也可以只用彈性材料制造其開啟和關閉裝置。優(yōu)選空隙和通路采用相同的包圍材料，這樣空隙大小的改變可以直接影響通路的寬度。
彈性材料可以是任何彈性材料。通常使用對細胞的培養(yǎng)物無有害作用的合成聚合物。具體地，優(yōu)選彈性材料是硅氧烷型樹脂。
為了光學觀察細胞培養(yǎng)區(qū)并開啟或關閉細胞培養(yǎng)微槽的通路，優(yōu)選僅用透明材料制造必需的部分。整體可以用透明彈性材料制造。
附圖簡述

圖1為本發(fā)明的基本構造一個實例的示意圖。
圖2為通路開啟或關閉方法的一個實例的示意圖。
圖3為細胞培養(yǎng)微槽制作方法的一個實例的顯微照片。
圖4為本發(fā)明細胞培養(yǎng)微槽制造方法中使用的模具和聚合物細胞培養(yǎng)微槽的一個實例的顯微照片。
圖5為細胞培養(yǎng)微槽通路開啟和關閉狀態(tài)的顯微照片。
圖6為一個細胞通過打開的細胞培養(yǎng)微槽的通路的顯微照片，圖中箭頭所指的為細胞。
圖中所示數(shù)字說明如下101，102連接空氣壓力控制區(qū)的接合處(connecting joint)103，104空氣通路(passage)105，106，202空氣池107溶液流(含有細胞的培養(yǎng)液)108，109，111，201，204通路110細胞培養(yǎng)區(qū)112，302，304玻璃基板(glass base plate)113，303聚合物(硅氧烷型樹脂)203細胞301模具305氣壓控制區(qū)連接器(connector)本發(fā)明的實施方案以下闡述本發(fā)明細胞培養(yǎng)微槽的細節(jié)。然而，本發(fā)明不以任何方式限制這種細胞培養(yǎng)微槽。
圖1顯示本發(fā)明細胞培養(yǎng)微槽的基本構造。如圖1a的水平視圖(B-B)和圖1b的縱向視圖(A-A)所示，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)微槽100包括一個在可視區(qū)光學透明的彈性聚合物上形成的細胞培養(yǎng)區(qū)110，空氣池105、106以通過膨脹或者壓縮來控制位于所述細胞培養(yǎng)區(qū)兩端的通路108、109、111的開啟或關閉狀態(tài)，空氣通路103、104用于壓縮或減壓空氣池，及與空氣控制區(qū)連接的接合處101、102，所有這些都安置在光學透明的基板112上，如載玻片等，從而溶液(含有細胞的培養(yǎng)液)可以連續(xù)流向流體107的方向。
如圖1所示，根據(jù)兩個通路108、109的開啟或關閉狀態(tài)，可以從培養(yǎng)區(qū)110中捕獲或者排出培養(yǎng)的細胞。這里，開啟或關閉通路指的是通過控制空氣池內(nèi)空氣的壓力來擴張或收縮通路周圍的聚合物壁表面而調節(jié)通路111的寬度。通路水平安置在平面上，與光學顯微鏡的光軸垂直，因此通路的寬度可以通過光學儀器測量。因此，例如在使用光學顯微鏡的時候，可以僅通過觀察來確定通路的寬度，即開啟或關閉狀態(tài)，而不需要流動樣品。因此，在這種開放狀態(tài)的目測證實下，可以控制空氣池105、106中的氣壓。而且，利用圖像處理自動測量這種開放狀態(tài)，可以對預先確定的開放狀態(tài)設置一種反饋控制。
接下來，開啟或關閉通路如圖2所示。圖2a和b分別是水平視圖和橫截面視圖，顯示了在適度關閉通路時，只有溶液可以通過通路而細胞203不能通過。往空氣池202中導入空氣加壓，關閉通路204，所以可以根據(jù)其壓力程度來控制能夠通過其的細胞大小。
另一方面，圖2c和d分別示出通路開放時的水平視圖和橫截面視圖，所以溶液和細胞都能通過通路201。將空氣池202中的空氣排出，使得通路204開放，這樣根據(jù)其減壓程度所有的細胞都能夠通過。
圖3闡述了制作細胞培養(yǎng)微槽的方法的實例。首先，利用如光刻法等精細加工技術制作模具(圖3-1)。例如，可以在玻璃片302上光固化可以光固化的、厚壁抗蝕材料SU-8以在形成模具301。然后，光學透明的彈性聚合物可以倒入并在模具中固化以將聚合物成形為模具的形狀(圖3-2)。此處可以使用在可視區(qū)域內(nèi)光學透明的彈性聚合物材料，例如硅氧烷樹脂(聚二甲基硅氧烷等)。聚合物固化后，用打孔器在其上打孔形成貫通孔以用于空氣和溶液流動，然后將聚合物從模具上剝離(圖3-2)。最后，該精細構造的聚合物被粘到玻璃基板304上，其進一步具有一個與氣壓控制區(qū)連接的連接器，以及溶液的進口和出口。如此形成的最終產(chǎn)品就可以用作細胞培養(yǎng)的微槽。
圖4為光學顯微鏡圖，顯示了一個用可光固化的樹脂SU-8根據(jù)圖3的方法制作的細胞培養(yǎng)微槽模具(圖4a)和用模具成形后聚合物精細結構(圖4b)的實例。由該光學顯微鏡圖中可以看出模具的精細結構被精確地轉移給聚合物。
圖5為一系列的顯微鏡圖，顯示了本發(fā)明細胞培養(yǎng)微槽通路的功能。圖5a顯示當通過用空氣壓縮空氣池而關閉通路的時候，細胞和溶液都不能通過。圖5b顯示，通過用負壓抽氣空氣池的時候，通路開放到一定程度使細胞不能通過。從這個顯微照片可以看出，細胞被溶液流帶向通路但是不能通過。通路開放的程度可以通過光學顯微鏡目測觀察。這樣可以僅用肉眼觀察來控制通路的開放程度，而不需要流動細胞。圖5c顯示當通路進一步打開的時候，細胞可以流出。
圖6是顯示細胞通過通路的過程的顯微照片。細胞(箭頭)從通路的左邊(圖6-1)通過通路(圖6-2)轉移到通路的右邊(圖6-3)。
本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明的細胞培養(yǎng)微槽有以下特點細胞培養(yǎng)區(qū)只通過通路與外界相連，因此，細胞不會與開啟和關閉設備等接觸，這樣不會對細胞產(chǎn)生額外負荷。
因為開啟和關閉裝置是在與觀察通路開啟或關閉的方向基本垂直的方向，所以通路的開啟或關閉不會影響觀察。而且，在觀察細胞是否通過通路的同時，通路開啟或關閉的狀態(tài)也能被觀察到。
由于以上特性，其可以從細胞培養(yǎng)液中分離出單個細胞。
因此，其可以培養(yǎng)遷移細胞等并且控制容器中細胞的數(shù)量，這到目前為止還被認為是不可能的。而且，它還可以在容器內(nèi)選擇性回收細胞。
權利要求
1.一種細胞培養(yǎng)微槽，其包括一個細胞培養(yǎng)區(qū)、至少2個將所述細胞培養(yǎng)區(qū)與外界相連的通路、開啟或關閉通路的裝置以及對細胞培養(yǎng)區(qū)及通路的開啟或關閉進行光學觀察的裝置，其中一個通路是通過它可以將可能含有細胞的培養(yǎng)液注入到細胞培養(yǎng)區(qū)內(nèi)的流體通路，而另一個通路是通過它可以將可能含有細胞的培養(yǎng)液排出細胞培養(yǎng)區(qū)的流體通路，所述通路的至少一部分由彈性材料包圍，并且開啟和關閉裝置用于通過與光學觀察裝置的觀察方向基本垂直的方向從外部擠壓或牽拉通路來控制通路的開啟或關閉或者改變通路的寬度。
2.權利要求1的細胞培養(yǎng)微槽，其中通路的寬度在沒有操縱開啟和關閉裝置的時候和靶細胞的大小相同。
3.權利要求1或2的細胞培養(yǎng)微槽，其中開啟和關閉裝置在鄰近通路處有一空隙，該空隙中充入氣體或液體且該空隙大小通過改變氣體或液體的壓力而改變，從而控制通路開啟或關閉或者改變通路的寬度。
4.權利要求1-3中任一項的細胞培養(yǎng)微槽，其中彈性材料為硅氧烷型樹脂。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在培養(yǎng)中通過可逆改變微槽的形狀來開啟或關閉能夠選擇性回收微槽中遷移細胞的通路的新的微槽。該微槽包括都放置在光學透明的基板112如載玻片上的一個在可視區(qū)域光學透明的、在彈性聚合體中形成的細胞培養(yǎng)區(qū)110，位于所述培養(yǎng)區(qū)兩端的通路108、109，通過膨脹和壓縮控制通路開啟或關閉狀態(tài)的空氣池105、106，為空氣池增壓和減壓的空氣通路103、104，以及與氣壓控制部分連接的接合處101、102，從而含有細胞的培養(yǎng)液向流體107的方向連續(xù)流動。
文檔編號C12M1/34GK1791666SQ20048001388
公開日2006年6月21日 申請日期2004年4月30日 優(yōu)先權日2003年5月19日
發(fā)明者安田賢二, 高橋一憲 申請人:獨立行政法人科學技術振興機構