專利名稱：：抑制蛋白激酶c－mu(pkd)用作心臟肥大和心力衰竭的療法的制作方法
背景技術(shù)：
：本發(fā)明要求2003年5月21日提交的美國(guó)臨時(shí)專利序列號(hào)60/472,298的優(yōu)先權(quán)，將其整體內(nèi)容引入本文作為參考。由于國(guó)立衛(wèi)生研究院基金編號(hào)P01HL61544的資助，美國(guó)政府擁有本發(fā)明的權(quán)利。1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總的涉及發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體說，它涉及心肌細(xì)胞中的基因調(diào)控和細(xì)胞生理學(xué)。具體地，本發(fā)明涉及采用蛋白激酶C-μ(PKD)抑制劑來(lái)阻斷組蛋白脫乙酰酶的磷酸化。也涉及用PKD抑制劑治療心臟肥大和心力衰竭。2.相關(guān)領(lǐng)域描述心臟肥大是對(duì)強(qiáng)加于心臟的工作負(fù)荷增加反應(yīng)中的一種基礎(chǔ)性適應(yīng)機(jī)制。它反映了由于神經(jīng)、內(nèi)分泌或機(jī)械刺激之一或它們的組合作用使心臟細(xì)胞大小和質(zhì)量(而不是細(xì)胞數(shù)量)增加的一種特定過程。高血壓，另一種涉及心臟肥大的因素，經(jīng)常是充血性心力衰竭的先兆。當(dāng)發(fā)生心力衰竭時(shí)，左心室通常肥大并擴(kuò)張，心臟收縮功能指數(shù)如心射血分?jǐn)?shù)降低。已清楚，心臟肥大反應(yīng)是一種復(fù)雜的綜合征，闡明導(dǎo)致心臟肥大的途徑將有益于各種刺激所致心臟病的治療。轉(zhuǎn)錄因子亞家族，肌細(xì)胞增強(qiáng)子因子-2家族(MEF2)參與了心臟肥大的發(fā)生。例如，各種刺激可提高細(xì)胞內(nèi)鈣水平，導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)或途徑，包括鈣調(diào)磷酸酶、CAM激酶、PKC和MAP激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。所有這些信號(hào)都激活MEF2，導(dǎo)致心臟肥大。然而，人們?nèi)匀粵]有完全了解各種信號(hào)系統(tǒng)是如何行使它們對(duì)MEF2的作用并調(diào)節(jié)其肥大信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的。已知某些組蛋白脫乙酰酶蛋白(HDAC)涉及調(diào)節(jié)MEF2活性。已經(jīng)克隆了脊椎生物的十一種不同的HDAC。所有HDAC的催化區(qū)域都有同源性。組蛋白乙?；负兔撘阴Ｃ冈诳刂苹虮磉_(dá)中起到重要作用。組蛋白乙?；?，通常稱為乙?；D(zhuǎn)移酶(HAT)和脫乙酰酶(HDAC)活性之間的平衡決定了組蛋白的乙?；?。因而，乙?；慕M蛋白引起染色質(zhì)松弛和基因轉(zhuǎn)錄激活，而脫乙?；娜旧|(zhì)通常無(wú)轉(zhuǎn)錄活性。在先前的報(bào)道中，本發(fā)明者的實(shí)驗(yàn)室證明了HDAC4和5與MEF2二聚化而抑制MEF2的轉(zhuǎn)錄活性，而且，該相互反應(yīng)需要存在HDAC4和5蛋白的N末端(McKinsey等，2000a，b)。近年來(lái)，已闡明和描述了HDAC與MEF2之間的聯(lián)系(McKinsey等，2002)。表明HDAC和MEF2之間的結(jié)合受磷酸化控制，和一種未鑒定的激酶介導(dǎo)此結(jié)合。缺少磷酸化位點(diǎn)的突變HDAC對(duì)心肌細(xì)胞肥大起著信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抗性阻抑劑作用，使HDAC敲除小鼠對(duì)心力衰竭和肥大超敏感(Zhang等，2002)。也已證明，某些HDAC抑制劑是抗肥大的。在其他文章中，近年的研究也突出了HDAC在癌生物學(xué)中的重要作用。實(shí)際上，測(cè)試了各種HDAC抑制劑在誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化和/或調(diào)亡的能力(Marks等，2000)。這些抑制劑包括N-辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)(Butler等，2000；Marks等，2001)、間-羧基肉桂酸雙-羥酰胺(Coffey等，2001)和焦酰胺(pyroxamide)(Butler等，2001)。所有這些發(fā)現(xiàn)證明HDAC在疾病發(fā)展中的重要作用，具體數(shù)據(jù)證明HDAC-MEF2結(jié)合是心臟病的關(guān)鍵因素。因此，負(fù)責(zé)介導(dǎo)該結(jié)合的激酶是導(dǎo)致肥大的級(jí)聯(lián)反應(yīng)的焦點(diǎn)，是潛在的治療靶。迄今，仍未鑒定到負(fù)責(zé)該結(jié)合的激酶。發(fā)明概述因此，本發(fā)明提供了一種治療病理性心臟肥大和心力衰竭的方法，該方法包括(a)鑒定患有心臟肥大或心力衰竭的病人；和(b)給予病人PKD抑制劑。給藥可包括靜脈內(nèi)、口服、透皮、緩釋、延遲釋放、控釋、栓劑、舌下給藥，或直接注入心臟組織給藥。該方法還可包括給予第二種治療方案，如β阻斷劑、變力藥物(ionotrope)、利尿劑、ACE-I、AII拮抗劑、BNP、Ca++阻斷劑或HDAC抑制劑?？梢栽诮o予PKD抑制劑的同時(shí)，或給予PKD抑制劑之前或之后給予第二治療方案。該治療可改善病理性心臟肥大或心力衰竭的一種或多種癥狀，如運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)、心排出血量增加、左心室舒張末期壓降低、肺毛細(xì)管嵌入壓降低、心臟輸出或心臟指數(shù)提高、肺動(dòng)脈壓降低、左心室收縮和舒張末期尺度降低、左右心室壁壓力降低、壁張力和壁厚度降低、生活質(zhì)量提高和疾病相關(guān)發(fā)病率和死亡率降低。在另一實(shí)施方式中，提供了一種預(yù)防病理性心臟肥大或心力衰竭的方法，該方法包括(a)鑒定處于發(fā)生病理性心臟肥大或心力衰竭危險(xiǎn)的病人；和(b)給予病人PKD抑制劑。給藥可包括靜脈內(nèi)、口服、透皮、緩釋、延遲釋放、控釋、栓劑、舌下給藥，或直接注入心臟組織。危險(xiǎn)病人可出現(xiàn)一系列危險(xiǎn)因素的一種或多種，包括長(zhǎng)時(shí)間未得到控制的高血壓、未糾正的心瓣膜疾病、慢性心絞痛或近期心肌梗塞。危險(xiǎn)病人也可能有先天性、家族性或遺傳性易患心臟病、心力衰竭或心臟肥大的體質(zhì)。心力衰竭或其癥狀可包括局部缺血、心肌病變、主動(dòng)脈狹窄、或其它心肌疾病。根據(jù)前述的實(shí)施方式，PKD抑制劑可以是任何降低PKD活性或抑制II類HDACPKD磷酸化的分子。這包括蛋白、肽、DNA分子(包括反義)、RNA分子(包括RNAi、反義和核酶)、抗體(包括單鏈抗體)、編碼抗體的表達(dá)構(gòu)建物和小分子。該小分子可包括但不限于白藜蘆醇、吲哚咔唑、Godecke6976(G6976)、星孢素、K252a、包括[d-Arg(1)、d-Trp(5，7，9)、Leu(11)]SP的物質(zhì)P(SP)類似物、PKC抑制劑109203X(GF-1)、PKC抑制劑Ro31-8220、GO7874、染料木黃酮、特異性Src抑制劑PP-1和PP-2、白屈菜季銨堿或粗糠柴毒素。HDAC抑制劑可包括但不限于，曲古抑菌素A、trapoxinB、MS275-27、間-羧基肉桂酸雙-羥酰胺、depudecin、oxamflatin、apicidin、N-辛二酰苯胺異羥肟酸、Scriptaid、焦酰胺、2-氨基-8-氧-9，10-環(huán)氧-癸酰酯、3-(4-芳?；?1H吡咯-2-基)-N-羥基-2-亞克力酰胺和FR901228。此外，下面的參考文獻(xiàn)描述了可選擇用于本發(fā)明的組蛋白脫乙酰酶抑制劑AU9,013,101；AU9,013,201；AU9,013,401；AU6,794,700；EP1,233,958；EP1,208,086；EP1,174,438；EP1,173,562；EP1,170,008；EP1,123,111；JP2001/348340；U.S.2002/103192；U.S.2002/65282；U.S.2002/61860；WO02/51842；WO02/50285；WO02/46144；WO02/46129；WO02/30879；WO02/26703；WO02/26696；WO01/70675；WO01/42437；WO01/38322；WO01/18045；WO01/14581；Furumai等(2002)；Hinnebusch等(2002)；Mai等(2002)；Vigushin等(2002)；Gottlicher等(2001)；Jung(2001)；Komatsu等(2001)；Su等(2000)。在另一實(shí)施方式中，提供了評(píng)價(jià)PKD抑制劑治療心臟肥大或心力衰竭的功效的方法，該方法包括(a)提供PKD抑制劑；(b)用PKD抑制劑處理細(xì)胞；和(c)測(cè)定一種或多種心臟肥大參數(shù)的表達(dá)，與沒有用PKD抑制劑處理的細(xì)胞中一種或多種心臟肥大參數(shù)相比，其中若有一種或多種心臟肥大參數(shù)變化將鑒定該P(yáng)KD抑制劑是心臟肥大或心力衰竭的抑制劑。所述細(xì)胞可以是肌細(xì)胞，包含在分離的完整組織中的分離肌細(xì)胞如心肌細(xì)胞，初生大鼠心室肌細(xì)胞，H9C2細(xì)胞，體內(nèi)位于完整心肌中，或轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物的心肌細(xì)胞?？梢源碳ぴ摷〖?xì)胞或完整心肌，以觸發(fā)肥大反應(yīng)的一種或多種心臟肥大參數(shù)。所述刺激可以是主動(dòng)脈結(jié)扎，快速心臟起搏，誘導(dǎo)心肌梗塞，轉(zhuǎn)基因表達(dá)，用化學(xué)品、藥劑或藥物處理?；瘜W(xué)劑或藥劑可包括但不限于血管緊張素II、異丙腎上腺素、苯腎上腺素、內(nèi)皮縮血管肽-I、血管收縮藥和抗利尿劑。治療可以在體內(nèi)或體外進(jìn)行。一種或多種心臟肥大參數(shù)可包括右心室射血分?jǐn)?shù)、左心室射血分?jǐn)?shù)、心室壁厚度、心臟重/體重比、右或左心室重/體重比或心臟重標(biāo)準(zhǔn)化度量。所述參數(shù)還可包括所述肌細(xì)胞或完整心肌中一種或多種靶基因的表達(dá)水平，其中所述一種或多種靶基因的表達(dá)水平是心臟肥大的指標(biāo)。一種或多種靶基因可選自ANF、α-MyHC、β-MyHC、α-骨架肌動(dòng)蛋白、心臟肌動(dòng)蛋白、SERCA、細(xì)胞色素氧化酶亞基VIII、小鼠T-復(fù)合體蛋白、胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白、Tau-微管結(jié)合蛋白、泛素羧基端水解酶、Thy-1細(xì)胞表面糖蛋白或MyHCI型抗原?？捎貌僮餍赃B接于靶基因啟動(dòng)子的報(bào)道蛋白編碼區(qū)，如熒光素酶，β-gal或綠色熒光蛋白來(lái)測(cè)定表達(dá)水平?？梢杂煤怂崽结樑c靶mRNA或擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物雜交來(lái)測(cè)定表達(dá)水平。一種或多種心臟肥大參數(shù)也包括細(xì)胞形態(tài)的一個(gè)或多個(gè)方面，如肌節(jié)組裝、細(xì)胞大小、細(xì)胞收縮性、總蛋白合成或細(xì)胞毒性。該細(xì)胞還可表達(dá)缺少一個(gè)或多個(gè)磷酸化位點(diǎn)的突變的II類HDAC蛋白，其中所述測(cè)定包括測(cè)定II類HDAC的磷酸化、II類HDAC的核輸出或II類HDAC與MEF-2的結(jié)合。測(cè)定還可包括測(cè)定II類HDAC與MEF-2結(jié)合的增加或MEF-2依賴性轉(zhuǎn)錄的降低。在另一實(shí)施方式中，提供了一種鑒定心臟肥大或心力衰竭抑制劑的方法，該方法包括(a)提供PKD；(b)使PKD與候選抑制劑物質(zhì)接觸；和(c)測(cè)定PKD的活性，其中PKD激酶活性的大大降低可將候選抑制劑物質(zhì)鑒定為心臟肥大或心力衰竭抑制劑。可以從完整細(xì)胞或心臟細(xì)胞中純化得到PKD，或PKD可位于完整細(xì)胞中。該細(xì)胞可以是肌細(xì)胞，如心肌細(xì)胞?？赏ㄟ^測(cè)定HDAC，更具體說是II類HDAC磷酸化的降低來(lái)測(cè)定激酶活性的降低。所述候選抑制劑物質(zhì)可包括但不限于干擾RNA、抗體制劑、單鏈抗體、RNA或DNA反義構(gòu)建物、酶、化學(xué)品、藥物或藥劑，或小分子。該候選抑制劑還可為白藜蘆醇、吲哚咔唑、Godecke6976(G6976)、星孢素、K252a、包括[d-Arg(1)、d-Trp(5，7，9)、Leu(11)]SP的物質(zhì)P(SP)類似物、PKC抑制劑109203X(GF-1)、PKC抑制劑Ro31-8220、GO7874、染料木黃酮、特異性Src抑制劑PP-1和PP-2、白屈菜季銨堿或粗糠柴毒素。測(cè)定激酶活性的降低還可通過免疫共沉淀測(cè)定PKD與II類HDAC結(jié)合的抑制，或通過測(cè)定II類HDAC磷酸化的阻斷。PKD抑制劑可增強(qiáng)II類HDAC與MEF-2或其它II類HDAC調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，提供了一種轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物，其細(xì)胞含有在真核細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子控制下的異源性PKD基因。在另一實(shí)施方式中，提供了一種轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物，其細(xì)胞含有在所述非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有活性的異源性啟動(dòng)子控制下的PKD基因。在另一實(shí)施方式中，提供了一種轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物，其細(xì)胞缺少一個(gè)或兩個(gè)天然PKD等位基因，還可通過同源重組敲除這些等位基因。該轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物可以是小鼠。該啟動(dòng)子可以是組織特異性的，也可對(duì)肌肉組織具有特異性，還可對(duì)心肌組織具有特異性。PKD基因可以是人源的。該基因還可編碼該蛋白的組成性活化形式或該蛋白的顯性失活形式。該啟動(dòng)子可以是在真核細(xì)胞中具有活性的。肌肉特異性啟動(dòng)子可選自肌球蛋白輕鏈-2啟動(dòng)子、α肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、肌鈣蛋白1啟動(dòng)子、Na+/Ca2+交換蛋白啟動(dòng)子、肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白啟動(dòng)子、肌酸激酶啟動(dòng)子、α7整合素啟動(dòng)子、腦鈉尿肽啟動(dòng)子、肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子、ANF啟動(dòng)子和αB-晶體蛋白/小熱激蛋白啟動(dòng)子。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，使患者心臟細(xì)胞的PKD活性降低，能治療心肌梗塞、預(yù)防心臟肥大和擴(kuò)張性心肌病變、抑制心臟肥大的發(fā)展、治療心力衰竭、抑制心力衰竭的發(fā)展、提高心力衰竭或心臟肥大患者的運(yùn)動(dòng)耐量、減少心力衰竭或心臟肥大患者的住院治療、改善心力衰竭或心臟肥大患者的生活質(zhì)量和降低心力衰竭或心臟肥大患者的發(fā)病率和死亡率。附圖簡(jiǎn)要說明下面的附圖構(gòu)成本說明書的一部分，包括附圖是為了進(jìn)一步展示本發(fā)明的某些方面。通過參考這些附圖中一幅或多幅，結(jié)合本文所述具體實(shí)施方式的詳述，可以更好地理解本發(fā)明。圖1A-D-HDAC5的PKC依賴性核輸出。圖1A.在六孔板中培養(yǎng)COS細(xì)胞，用GFP-HDAC5表達(dá)載體(1微克)轉(zhuǎn)染，用所示化合物刺激，如材料和方法中所述。加入化合物六十分鐘后，用熒光顯微鏡測(cè)定GFP-HDAC5的分布。PMA刺激導(dǎo)致GFP-HDAC5從核中全部重定位至胞漿，而伊屋諾霉素引發(fā)了部分反應(yīng)。圖1B.用編碼HDAC5或由丙氨酸替代絲氨酸259和498的HDAC5突變體(HDAC5S259/498A)的FLAG-標(biāo)記的表達(dá)載體(各1微克)轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。用PMA刺激細(xì)胞60分鐘，用抗FLAG第一抗體和偶聯(lián)熒光素的第二抗體作間接免疫熒光測(cè)定HDAC5分布。HDAC5259/498A能抵抗PMA的刺激。圖1C.用編碼GFPHDAC5的表達(dá)載體(1微克)轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，并用PMA刺激所示時(shí)間。圖1D.用編碼HDAC5或HDAC5S259/498A的FLAG-標(biāo)記的表達(dá)載體(各1微克)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。用PKC抑制劑雙吲哚馬來(lái)酰亞胺(BisI；10μM)預(yù)處理細(xì)胞30分鐘，用PMA刺激30分鐘，如圖所示。依次進(jìn)行免疫沉淀和免疫印跡檢測(cè)FLAG-HDAC5與內(nèi)源性14-3-3的結(jié)合。圖2A-D-PKC抑制阻斷心肌細(xì)胞中PE-介導(dǎo)的HDAC5的核輸出。圖2A.定量測(cè)定HDAC5核輸出的代表方案。在96孔板中培養(yǎng)NVRM，用編碼GFP-HDAC5的腺病毒感染。血清饑餓細(xì)胞，用激動(dòng)劑和抑制劑處理，固定并用Hoechst染料染色。用CellomicsHighContent攝像系統(tǒng)定量核中與胞漿中GFP-HDAC5的相對(duì)豐度，根據(jù)Hoechst熒光區(qū)別細(xì)胞核，根據(jù)這些核的尺寸確定周圍的胞漿。測(cè)得的值代表細(xì)胞核減去胞質(zhì)熒光強(qiáng)度差的平均數(shù)。圖2B.試驗(yàn)驗(yàn)證。用編碼GFP-HDAC5的腺病毒感染NRVM，使之接觸0.1至20μM濃度范圍內(nèi)的PE。刺激2小時(shí)后，準(zhǔn)備細(xì)胞進(jìn)行Cellomics分析。測(cè)定8孔/條件每孔至少50個(gè)細(xì)胞(總共400個(gè)細(xì)胞)的細(xì)胞核減去胞質(zhì)熒光強(qiáng)度差的平均值。將未處理細(xì)胞的值設(shè)為100％。PE引發(fā)了劑量依賴性的HDAC5核輸出。圖2C.用腺病毒GFP-HDAC5感染NRVM，用激酶抑制劑(材料和方法中所述抑制劑的濃度)預(yù)處理NRVM。用PE(20μM)刺激2小時(shí)后定量測(cè)定HDAC5的亞細(xì)胞分布。測(cè)定8孔/條件每孔至少50個(gè)細(xì)胞(總共400個(gè)細(xì)胞)的細(xì)胞核減去胞質(zhì)熒光強(qiáng)度差的平均值。較高值表明核中HDAC5豐度較高。顯示了孔與孔間的標(biāo)準(zhǔn)差。只有星孢素和PKC抑制劑BisI有效阻斷了HDAC5的核輸出。圖2D中顯示了代表性圖片。圖3A-C-通過信號(hào)抗性HDAC5抑制PKC-介導(dǎo)的心臟肥大。在6孔板中培養(yǎng)NRVM，用腺病毒(MOI＝10)轉(zhuǎn)染，該腺病毒編碼LacZ對(duì)照(Ad-LacZ)或由丙氨酸替代絲氨酸259和498的FLAG-標(biāo)記的HDAC5(Ad-HDAC5S/A)，為14-3-3介導(dǎo)的核輸出所必需。分析前，用PE(20μM)或PMA(100nM)處理細(xì)胞24小時(shí)。圖3A.固定細(xì)胞，用特異性抗α-肌動(dòng)蛋白的第一抗體和偶聯(lián)熒光素的第二抗體作間接免疫熒光使肌節(jié)顯色。圖3B.用抗ANF第一抗體作間接免疫熒光檢測(cè)ANF蛋白。圖3C.從細(xì)胞中收集總RNA，用放射標(biāo)記的所示轉(zhuǎn)錄物的特異性寡核苷酸進(jìn)行斑點(diǎn)印跡分析。用磷光攝像儀定量測(cè)定RNA水平，表示為相對(duì)于感染Ad-LacZ而未受刺激細(xì)胞所含量的變化倍數(shù)。將數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化到GAPDH對(duì)照。圖4A-F-在激動(dòng)劑-介導(dǎo)的HDAC5的核輸出中對(duì)PKC的不同要求。圖4A.在96孔板中培養(yǎng)NRVM，用腺病毒GFP-HDAC5感染，如上所述。血清饑餓細(xì)胞4小時(shí)后，用PE(20μM)、ET-1(50nM)或FBS(10％)刺激兩小時(shí)。如圖4A中所述地那樣準(zhǔn)備細(xì)胞。血清饑餓后，用BisI(10μM)預(yù)處理感染的NRVM30分鐘，用所示激動(dòng)劑刺激2小時(shí)。如上所述，用Cellomics攝像系統(tǒng)定量測(cè)定HDAC5的核輸出。較高值表明核中HDAC5豐度較高。圖4C.如圖4B所示進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了細(xì)胞在激動(dòng)劑處理前接受G6983(10μM)。圖4D.如圖4B所示進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了細(xì)胞激動(dòng)劑處理前接受增加劑量的G6976。圖4E.用配有數(shù)字相機(jī)的熒光顯微鏡拍攝各治療組的代表性圖片。圖4F.用編碼GFP-HDAC5的腺病毒感染NRVM，在10厘米平皿中培養(yǎng)。感染后二十四小時(shí)，血清饑餓細(xì)胞四小時(shí)，用BisI(10μM)或G6976(10μM)預(yù)處理一小時(shí)，然后用PE(20μM)或ET-1(50nM)刺激一小時(shí)。制備全細(xì)胞蛋白裂解物，如上所述依次進(jìn)行免疫沉淀和免疫印跡。圖5A-E-蛋白激酶D是一種HDAC5激酶。圖5A.II類HDAC的調(diào)控性磷酸化位點(diǎn)周圍的氨基酸序列。NLS核定位信號(hào)；HDAC結(jié)構(gòu)域脫乙酰酶催化域。顯示了PKD的共有序列靶位點(diǎn)。相對(duì)于磷酸化位點(diǎn)-5位置的亮氨酸是PKD-定向其它蛋白最佳磷酸化所必需的。圖5B.用編碼融合于由甘氨酸替代亮氨酸254和493的HDAC5(L254/493G)的GFP的表達(dá)載體COS轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后二十四小時(shí)，不處理細(xì)胞(對(duì)照)或用PMA刺激30分鐘。圖5C.用編碼GFP-HDAC5或GFPHDAC5S/A的表達(dá)載體(各1微克)和PKD的組成性活化(S/E)或催化失活(K/W)形式共轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)測(cè)定HDAC5的定位。圖5D.COS細(xì)胞用編碼FLAGHDAC5和野生型、組成性活化(S/E)或催化失活(K/W)的PKD的HA-標(biāo)記的表達(dá)載體(各1微克)共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后二十四小時(shí)，用PMA或空載體對(duì)照處理細(xì)胞30分鐘。如上所述，免疫沉淀全細(xì)胞蛋白裂解物中的FLAG-HDAC5，加入到體外激酶試驗(yàn)(IVK)中或通過SDS-PAGE分離作Western印跡分析，以測(cè)定結(jié)合的PKD。通過SDS-PAGE分離磷酸化的HDAC5，放射自顯影檢測(cè)。圖5E.哺乳動(dòng)物雙雜交試驗(yàn)。將編碼融合于HDAC5的GAL4DNA結(jié)合域(Gal4-HDAC5)的表達(dá)載體或所示的HDAC5丙氨酸取代的突變體，與編碼融合于VP16轉(zhuǎn)錄激活域的14-3-3(14-3-3-VP16)的質(zhì)粒、Gal4-依賴性熒光素酶報(bào)道物和編碼組成性活化PKD(S/E)的載體共轉(zhuǎn)染入COS細(xì)胞中。PKD激發(fā)HDAC5和14-3-3之間的結(jié)合，這取決于259和498位置的磷酸化受體。圖6A-B-心肌細(xì)胞中內(nèi)源性PKD與HDAC5的結(jié)合。圖6A.在10厘米平皿中培養(yǎng)NRVM，用編碼FLAG-HDAC5的腺病毒感染。轉(zhuǎn)染后二十四小時(shí)，用PMA刺激細(xì)胞30分鐘，制備全細(xì)胞蛋白裂解物。在PMA刺激之前，用BisI預(yù)處理一些細(xì)胞(pre-BisI；10μM)30分鐘。如上所述，免疫沉淀FLAG-HDAC5，將其加入到含有BisI(post-BisI；10μM)或G6976(post-G6976；10μM)的體外激酶反應(yīng)中。當(dāng)用BisI(pre-BisI)預(yù)處理細(xì)胞時(shí)，HDAC5的磷酸化被阻斷。當(dāng)直接加入激酶反應(yīng)混合物中時(shí)，G6976，而非BisI阻斷了磷酸基轉(zhuǎn)移到HDAC5上。圖6B.用編碼GFP-HDAC5的腺病毒感染NRVM，在10厘米平皿中培養(yǎng)。感染后二十四小時(shí)，血清饑餓細(xì)胞4小時(shí)，用BisI(10μM)預(yù)處理30分鐘，然后用PE(20μM)刺激一小時(shí)。免疫沉淀全細(xì)胞裂解物的HDAC5，通過免疫印跡檢測(cè)結(jié)合的總PKD或絲氨酸916(p-916)處的自磷酸化PKD。用GFP-特異性抗體再檢測(cè)印跡，以測(cè)定免疫沉淀的HDAC5總量。圖7A-D-心臟表達(dá)激活的PKD導(dǎo)致擴(kuò)張性心肌病。圖7A.如材料和方法中所述產(chǎn)生在心臟特異性α-肌球蛋白重鏈(αMHC)啟動(dòng)子控制下表達(dá)組成性活化PKD的轉(zhuǎn)基因小鼠。顯示了四周齡的野生型和aMHC-PKD轉(zhuǎn)基因(小鼠)心臟的H&E切片。也顯示4個(gè)月的aMHC-PKD轉(zhuǎn)基因心臟，出現(xiàn)擴(kuò)張性心肌病。圖7B.四周齡野生型和aMHC-PKD轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟重與體重之比。圖7C.對(duì)心臟裂解物的野生型、aMHC-PKD和aMHC-鈣調(diào)磷酸酶(CnA)作Western印跡分析。測(cè)定了總的和活化(P-916)PKD蛋白的水平。箭頭標(biāo)識(shí)出與PKD1相應(yīng)的條帶。圖7D.對(duì)4周齡野生型、CnA或PKD轉(zhuǎn)基因小鼠心臟的總RNA進(jìn)行斑點(diǎn)印跡，分析胚胎基因標(biāo)記。CnA和PKD印跡下方的數(shù)字代表標(biāo)準(zhǔn)化到GAPDH水平后相對(duì)于野生型樣品的增加倍數(shù)。圖8-調(diào)節(jié)II類HDAC的核輸出和心臟肥大的激酶-依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的模型。用α-腎上腺素能激動(dòng)劑苯腎上腺素(PE)或內(nèi)皮縮血管肽-1(ET-1)刺激心肌細(xì)胞導(dǎo)致HDAC通過激活PKD而磷酸化和核輸出。PE激活PKD是通過PKC依賴性途徑，主要是鈣非依賴性的新PKC(nPKC)途徑而發(fā)生。然而，心肌細(xì)胞ET-1中激活PKD似乎是PKC非依賴性的。隨后PKD使HDAC5磷酸化導(dǎo)致其通過與14-3-3結(jié)合和激活MEF2與肥大性遺傳程序而核輸出。示例性實(shí)施方式的詳述心力衰竭是全世界發(fā)病和致死的主要原因之一。僅在美國(guó)，估計(jì)顯示三百萬(wàn)人目前有心肌病，另外每年還診斷到400,000病例。擴(kuò)張性心肌病變(DCM)，也稱為“充血性心肌病”，是最常見的心肌病形式，估計(jì)發(fā)病率接近每100,000人中40人(Durand等，1995)。雖然引起DCM有其它原因，但是據(jù)顯示，家族性擴(kuò)張性心肌病占“特發(fā)性”DCM的約20％。大約一半的DCM病例是特發(fā)性，其余的病例與已知的疾病過程相關(guān)。例如，癌癥化療中使用的某些藥物(例如阿霉素和柔紅霉素)引起嚴(yán)重心肌損傷。此外，很多DCM病人是長(zhǎng)期酗酒者。幸運(yùn)的是，如果這些病人在病程早期減少或停止飲酒，心肌功能障礙的發(fā)展可以停止或逆轉(zhuǎn)。分娩前后心肌病是另一類型的特發(fā)性DCM，與感染性后遺癥有關(guān)?？傊―CM在內(nèi)的心肌病是重要的公眾健康問題。心臟病及其表現(xiàn)，包括冠狀動(dòng)脈疾病、心肌梗塞、充血性心力衰竭和心臟肥大，無(wú)疑是當(dāng)今美國(guó)的主要健康風(fēng)險(xiǎn)。診斷、治療和支持這些疾病患者的費(fèi)用達(dá)好幾萬(wàn)美元。心臟病中兩種尤其嚴(yán)重的表現(xiàn)是心肌梗塞和心臟肥大。就心肌梗塞而言，一般是冠狀動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化引起的急性血小板性冠狀動(dòng)脈閉塞，導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡。因?yàn)樾募〖?xì)胞，即心臟肌肉細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，通常不能細(xì)胞分裂，所以當(dāng)它們?cè)诩毙孕募」Ｈ^程中死亡時(shí)，常被疤痕組織代替。疤痕組織不具有收縮性，無(wú)助于心臟功能，但經(jīng)常由于在心臟收縮期擴(kuò)張或由于心室大小和有效半徑增大，例如變肥大而對(duì)心臟功能起到有害作用。就心臟肥大而言，一種理論認(rèn)為它類似于發(fā)育異常疾病，并由此提出了心臟中的發(fā)育信號(hào)可否促使肥大疾病發(fā)生的問題。心臟肥大是心臟對(duì)基本上所有心臟病，包括由高血壓、機(jī)械載荷、心肌梗塞、心律失常、內(nèi)分泌紊亂和心臟收縮蛋白基因中的遺傳突變引起的心臟病的適應(yīng)性反應(yīng)。雖然肥大反應(yīng)剛開始是增加心輸出的補(bǔ)償機(jī)制，但是持續(xù)性肥大可導(dǎo)致DCM、心力衰竭和猝死。在美國(guó)，每年將近五十萬(wàn)人被診斷為心力衰竭，死亡率接近50％。心臟肥大的原因和結(jié)果已有廣泛記載，但還未闡明其背后的分子機(jī)制。對(duì)這些機(jī)制的理解主要關(guān)系到預(yù)防和治療心臟病，并將成為設(shè)計(jì)特異性靶向心臟肥大和心力衰竭的藥物中的主要治療方式。因?yàn)椴±硇孕呐K肥大一般不產(chǎn)生任何癥狀，直到心臟損傷嚴(yán)重到足以產(chǎn)生心力衰竭，伴隨心力衰竭的心肌病癥狀。這些癥狀包括呼吸急促、運(yùn)動(dòng)疲勞、不變成急促呼吸就不能躺平(端坐呼吸)、陣發(fā)性夜間呼吸困難、心臟尺寸增大和/或小腿水腫。病人經(jīng)常伴有血壓升高、額外心音、心臟雜音、肺和全身血栓、胸痛、肺充血和心悸。此外，DCM引起射血分?jǐn)?shù)(即一種固有心臟收縮功能和重建的心臟收縮功能的測(cè)量方法)降低。該疾病的特征還有心室擴(kuò)張和因心肌收縮力減弱而使心臟收縮功能嚴(yán)重受損，這在很多病人中導(dǎo)致擴(kuò)張性心力衰竭。由于肌細(xì)胞/心肌功能障礙，患病的心臟也進(jìn)行細(xì)胞/腔室重建，這導(dǎo)致“DCM表型”。隨著疾病的發(fā)展，這些癥狀也不斷發(fā)展。DCM病人發(fā)生威脅生命的心律不齊，包括心室心動(dòng)過速和心室肌纖維震顫的發(fā)病率也大大增加。在這些病人中，昏厥發(fā)作(頭昏)被認(rèn)為是猝死的先兆。擴(kuò)張性心肌病的診斷一般依賴于證明心腔尺寸擴(kuò)大，尤其是心室擴(kuò)大。通?？梢栽谛夭縓光片上觀察到擴(kuò)大，但用超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)更準(zhǔn)確。DCM常難以與急性心肌炎、瓣膜性心臟病、冠狀動(dòng)脈疾病和高血壓性心臟病相區(qū)分。一旦作出擴(kuò)張性心肌病的診斷，利用各種方法鑒定和治療有可能逆轉(zhuǎn)病原，并防止進(jìn)一步心臟損傷。例如，必須排除冠狀動(dòng)脈疾病和瓣膜性心臟病。需要關(guān)注和控制貧血、異常心動(dòng)過速、營(yíng)養(yǎng)不良、酗酒、甲狀腺病和/或其它問題。如上所述，用藥物治療仍然代表了減少或消除心力衰竭表現(xiàn)的主要機(jī)制。利尿劑構(gòu)成輕度至中度心力衰竭的一線治療藥物。不幸的是，很多常用的利尿劑(如噻嗪類)具有很多副作用。例如，某些利尿劑可增加血清膽固醇和甘油三酯。而且，利尿劑對(duì)嚴(yán)重心力衰竭病人通常是無(wú)效的。如果利尿劑無(wú)效，則可用血管舒張劑；血管緊張素轉(zhuǎn)化(ACE)抑制劑(例如，依那普利和賴諾普利)不僅能使癥狀緩解，也有報(bào)道稱它們能降低死亡率(Young等，1989)。然而，ACE抑制劑也伴有副作用，導(dǎo)致它們禁忌用于某些疾病(例如，腎動(dòng)脈狹窄)的患者。類似地，變力劑藥物治療(即通過增加心肌肌肉收縮力而提高心臟輸出的藥物)伴有很多不良反應(yīng)，包括胃腸道不良反應(yīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。因此，當(dāng)前使用的藥物在特定病人群體中具有嚴(yán)重的缺點(diǎn)。取得新的安全有效的藥物無(wú)疑將使不能使用現(xiàn)有藥物治療方式或不能從這些方式獲得充分緩解的病人受益。DCM病人的預(yù)后是可變的，取決于心室功能障礙的程度，多數(shù)死亡發(fā)生在診斷后五年內(nèi)。I.本發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明者先前已經(jīng)證明，通過MAP激酶磷酸化MEF2羧基端活化結(jié)構(gòu)域中的三個(gè)保守位點(diǎn)可活化MEF2(參見，Katoh等1998)。CaMK信號(hào)也通過磷酸化II類HDAC而激活MEF2，而II類HDAC在成人心臟中高水平表達(dá)，它們可以抑制心臟的MEF2活性。一旦磷酸化，這些HDAC就與14-3-3結(jié)合，并與MEF2分離，導(dǎo)致移位到細(xì)胞核中，激活MEF2依賴性轉(zhuǎn)錄。不能被磷酸化的II類HDAC突變體不能從MEF2上解離，從而不可逆地阻斷MEF2靶基因的表達(dá)。也證明，在體外對(duì)各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑反應(yīng)中，編碼HDAC5的不可磷酸化突變體的腺病毒能夠防止心肌細(xì)胞肥大(Lu等，2000)。這些發(fā)現(xiàn)提示II類HDAC中這些保守位點(diǎn)的磷酸化是引起心臟肥大的必需步驟。發(fā)現(xiàn)還提示通過隔離和靶向負(fù)責(zé)磷酸化II類HDAC的激酶而抑制II類HDAC的磷酸化，從而阻斷肥大和后續(xù)心力衰竭的發(fā)展。本發(fā)明者在本文中描述了PKD作為負(fù)責(zé)磷酸化II類HDAC、介導(dǎo)它們與MEF-2的相互作用和部分控制II類HDAC的核或胞漿定位的激酶的特征。本發(fā)明還提出通過抑制PKD治療性干預(yù)心臟肥大和心力衰竭，以及篩選用于治療心臟肥大和心力衰竭治療藥物的方法。II.蛋白激酶激酶通過將磷酸基團(tuán)加入蛋白調(diào)節(jié)很多不同細(xì)胞的增殖、分化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。不受控制的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與各種疾病，包括炎癥、癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、牛皮癬和心臟疾病和肥大有關(guān)?？赡嫘缘鞍琢姿峄强刂普婧思?xì)胞活性的主要策略。據(jù)估計(jì)，在典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，10,000個(gè)活性蛋白中有1000個(gè)以上是磷酸化的。通常，蛋白激酶驅(qū)動(dòng)激活的高能磷酸根從三磷酸腺苷分子(ATP)轉(zhuǎn)移到某特定蛋白上，而蛋白磷酸酶從該蛋白去除高能磷酸。在對(duì)胞外信號(hào)(激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生長(zhǎng)和分化因子等)、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)、和環(huán)境或營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)生的磷酸化，大概類似于打開分子開關(guān)。當(dāng)開關(guān)打開時(shí)，合適的蛋白激酶即激活代謝酶、調(diào)節(jié)蛋白、受體、細(xì)胞骨架蛋白、離子通道或離子泵，或轉(zhuǎn)錄因子。激酶是最大的已知蛋白群體，是具有很大的不同功能和特異性的酶超家族。它們通常按它們的底物、它們調(diào)節(jié)的分子或突變表型的某些方面來(lái)命名。按照底物，可以將蛋白激酶粗略地分成兩組；磷酸化酪氨酸殘基的激酶(蛋白酪氨酸激酶，PTK)和磷酸化絲氨酸或蘇氨酸殘基的激酶(絲氨酸/蘇氨酸激酶，STK)。一些蛋白激酶具有雙重特異性，磷酸化蘇氨酸和酪氨酸殘基。幾乎所有激酶都含有類似的250-300個(gè)氨基酸的催化域。含有亞域I-IV的N-末端域通常折疊成雙葉結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能結(jié)合ATP(或GTP)供體分子，并確定其方向。含有亞域VIA-XI的較大C末端葉，能與蛋白底物結(jié)合，并將γ磷酸根從ATP轉(zhuǎn)移到絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的羥基上。亞域V跨越兩葉?？筛鶕?jù)位于激酶域任一側(cè)或插入激酶域環(huán)中的不同氨基酸序列(通常5至100個(gè)殘基)將激酶分類為家族。這些加入的氨基酸序列可以調(diào)節(jié)各激酶，因?yàn)樗R(shí)別靶蛋白并與其相互作用。激酶域的一級(jí)結(jié)構(gòu)保守，可以進(jìn)一步再分成11個(gè)亞域。這11個(gè)亞域各自含有特異性殘基和基序，或氨基酸模式，它們是該亞域的特征并高度保守(Hardie和Hanks，1995)。第二信使依賴性蛋白激酶主要介導(dǎo)第二信使如環(huán)化AMP(cAMP)、環(huán)化GMP、三磷酸肌醇、磷脂酰肌醇、3，4，5-三磷酸、環(huán)化ADP核糖、花生四烯酸、甘油二酯和鈣-鈣調(diào)蛋白的作用。環(huán)化AMP依賴性蛋白激酶(PKA)是STK家族的重要成員。在所有已經(jīng)研究的原核和動(dòng)物細(xì)胞中，環(huán)化AMP都是激素作用的胞內(nèi)介質(zhì)。這些激素誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)包括甲狀腺激素分泌、皮質(zhì)醇分泌、孕酮分泌、糖原降解、骨再吸收及心率和心肌收縮力的調(diào)節(jié)。在所有動(dòng)物細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了PKA，認(rèn)為它是環(huán)化AMP在大多數(shù)這些細(xì)胞中起作用的原因。PKA表達(dá)的改變與各種不適和疾病，包括癌癥、甲狀腺機(jī)能障礙、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病相關(guān)(Isselbacher等，1994)。鈣-鈣調(diào)蛋白(CaM)依賴性蛋白激酶也是STK家族的成員。鈣調(diào)蛋白是鈣受體，它在對(duì)鈣結(jié)合的反應(yīng)中通過結(jié)合于靶蛋白而介導(dǎo)了很多鈣調(diào)節(jié)過程。這些過程中的主要靶蛋白是CaM依賴性蛋白激酶。CaM-激酶參與平滑肌收縮(MLC激酶)、糖原降解(磷酸化酶激酶)和神經(jīng)傳遞(CaM激酶I和CaM激酶II)的調(diào)節(jié)。CaM激酶I能磷酸化各種底物，包括神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)的蛋白突觸蛋白I和II、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白、CREB和囊性纖維化傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白、CFTR(Haribabu等、1995)。CaMII激酶也在不同位點(diǎn)磷酸化突觸蛋白，并通過磷酸化和激活酪氨酸羥化酶控制腦中兒茶酚胺的合成。除了結(jié)合于CAM以外，很多CaM激酶被磷酸化激活。激酶可自身磷酸化，或被另一激酶磷酸化，作為“激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)”的一部分。另一配體活化的蛋白激酶是5’-AMP-活化的蛋白激酶(AMPK)(Gao等，1996)。哺乳動(dòng)物AMPK通過磷酸化乙酰輔酶A羧化酶和羥甲基戊二酰輔酶A還原酶調(diào)節(jié)脂肪酸和甾醇合成，并介導(dǎo)這些途徑對(duì)細(xì)胞應(yīng)激，如熱激和葡萄糖和ATP消耗的反應(yīng)。AMPK是一種異質(zhì)三聚復(fù)合物，由催化α亞基和兩個(gè)非催化性β和γ亞基構(gòu)成，這兩個(gè)非催化亞基被認(rèn)為能調(diào)節(jié)α亞基的活性。AMPK的亞基比預(yù)期的更廣泛分布于非生脂組織，如腦、心臟、脾和肺。此分布提示，它的作用可能不僅是調(diào)節(jié)脂類代謝。有絲分裂原-活化的蛋白激酶(MAP)也是STK家族的成員。MAP激酶也調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。它們通過磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)信號(hào)從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)到核中。已經(jīng)鑒定到幾個(gè)亞群，各自表現(xiàn)出不同的底物特異性和對(duì)不同胞外刺激的反應(yīng)(Egan和Weinberg，1993)。MAP激酶的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母中。激活哺乳動(dòng)物途徑的胞外刺激物包括表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、紫外光、高滲透壓培養(yǎng)基、熱激效應(yīng)、內(nèi)毒性脂多糖(LPS)和促炎癥細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子(TNF)和白介素-1(IL-1)。PRK(增殖相關(guān)激酶)是一種血清/細(xì)胞因子可誘導(dǎo)的STK，參與人巨核細(xì)胞細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)(Li等，1996)。PRK涉及STK的polo(獲自人polo基因)家族，與細(xì)胞分裂相關(guān)。PRK在肺腫瘤組織中下調(diào)，可能是在正常組織中表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致癌轉(zhuǎn)化的原癌基因。MAP激酶表達(dá)的改變與各種疾病，包括癌癥、炎癥、免疫失調(diào)和影響生長(zhǎng)和發(fā)育的疾病相關(guān)。細(xì)胞周期蛋白-依賴性蛋白激酶(CDK)是另一組STK，它們通過細(xì)胞周期控制細(xì)胞發(fā)展。細(xì)胞周期蛋白是小調(diào)節(jié)蛋白，通過結(jié)合于或激活CDK起作用，然后CDK通過磷酸化和活化參與有絲分裂過程的選擇蛋白而觸發(fā)細(xì)胞周期各期。CDK的獨(dú)特之處在于它們需要多次輸入才能被激活。除了與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合之外，CDK活化還需要特定蘇氨酸殘基的磷酸化和特定酪氨酸殘基的去磷酸化。蛋白酪氨酸激酶PTK，特異性磷酸化它們靶蛋白上的酪氨酸殘基，它們可以分為跨膜的、受體PTK和非跨膜的、非受體PTK。跨膜的蛋白-酪氨酸激酶是大多數(shù)生長(zhǎng)因子的受體。生長(zhǎng)因子與該受體的結(jié)合激活磷酸基團(tuán)從ATP轉(zhuǎn)移到該受體和其它特異性蛋白所選酪氨酸側(cè)鏈上。與受體PTK結(jié)合的生長(zhǎng)因子(GF)包括；表皮GF、血小板衍生GF、纖維母細(xì)胞GF、肝細(xì)胞GF、胰島素和胰島素樣GF、神經(jīng)GF、血管內(nèi)皮GF、和巨噬細(xì)胞集落刺激因子。非受體PTK缺少跨膜區(qū)，而能與細(xì)胞表面受體的胞內(nèi)區(qū)形成了復(fù)合物。此受體通過非受體PTK發(fā)揮作用，包括細(xì)胞因子、激素(人生長(zhǎng)激素和促乳素)受體和T和B淋巴細(xì)胞上的抗原-特異性受體。很多這些PTK都先鑒定為癌細(xì)胞突變癌基因的產(chǎn)物，在癌細(xì)胞中它們的活化不再受正常細(xì)胞的控制。實(shí)際上，大約三分之一的已知癌基因編碼PTK，細(xì)胞轉(zhuǎn)化(癌發(fā)生)經(jīng)常伴有酪氨酸磷酸化活性升高(Carbonneau和Tonks，1992)是公知的。因此，在控制一些癌癥類型中，調(diào)節(jié)PTK活性是一種重要的策略。A.蛋白激酶C家族蛋白激酶C(PKC)蛋白是STK家族的成員。蛋白激酶D(PKD)蛋白與佛波酯和甘油二酯結(jié)合，與PKC緊密相關(guān)(Valverde等，1994)。蛋白激酶C在調(diào)節(jié)多種胞外受體-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑細(xì)胞反應(yīng)中，和在調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的分化和增殖中起著關(guān)鍵作用。蛋白激酶C基因/蛋白可能在多種癌癥中起重要作用，因此可以用于藥物開發(fā)和篩檢、診斷、預(yù)防和/或治療各種癌癥。例如，已在黑色素瘤細(xì)胞系的α-型蛋白激酶C基因內(nèi)鑒定到了腫瘤特異性缺失(Linnenbach等，1988)。在某些腫瘤細(xì)胞系中觀察到PKC表達(dá)水平升高，這提示PKC在涉及生長(zhǎng)控制的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起重要作用(Johannes等，1994)。激酶蛋白，特別是蛋白激酶C亞家族成員是藥物作用和開發(fā)的主要靶。因此，對(duì)于藥物開發(fā)領(lǐng)域，鑒定并表征該激酶蛋白亞家族先前未知的成員是有價(jià)值的。本發(fā)明通過提供與蛋白激酶C亞家族成員同源并與心血管疾病相關(guān)的人激酶蛋白提高了本領(lǐng)域技術(shù)水平。在下文中引入作為參考的以下參考文獻(xiàn)都描述了可用于本發(fā)明的蛋白激酶C抑制劑美國(guó)專利6,528,294；美國(guó)專利6,441,020；美國(guó)專利6,080,784；美國(guó)專利6,043,270；美國(guó)專利5,955,501。B.蛋白激酶DPKD家族包括PKD1(小鼠PKD、人PKCμ)、PKD2和PKD3(也稱為PKC)。它們是絲氨酸/蘇氨酸激酶的AGC家族成員，但共有獨(dú)特的分子架構(gòu)，該架構(gòu)與其它AGC家族成員不同。PKD1有多個(gè)結(jié)構(gòu)域含有高頻率無(wú)極性氨基酸、主要是丙氨酸和脯氨酸的N-末端區(qū)；兩個(gè)富含半胱氨酸的鋅指區(qū)(也稱為Cla和Clb)、一個(gè)富含帶負(fù)電氨基酸的區(qū)域、一個(gè)血小板-白細(xì)胞C激酶底物-同源(PH)域和一個(gè)蛋白Ser/Thr激酶催化域(VanLint等，2002)。在PKD2和PKD3中發(fā)現(xiàn)了相似的模塊結(jié)構(gòu)。AGC家族包括各種亞類環(huán)化核苷酸-調(diào)節(jié)的蛋白激酶、PKC、PKB/Akt、G-蛋白偶聯(lián)的受體激酶(GRK)和核糖體蛋白S6激酶。可以將PKD歸類于全新AGC亞類中，因?yàn)樗磥?lái)組合了該家族不同亞類的特征，損害了它在現(xiàn)有亞類之一中的分類地位(VanLint等，2002)。例如，PKD家族的富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域與經(jīng)典和全新PKC的該結(jié)構(gòu)域類似，而PH域更類似于PKB或GRK家族，而這并未在任何PKC酶中發(fā)現(xiàn)。該催化域在結(jié)構(gòu)和功能上如幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)所判斷，都不同于PKC家族和其它AGC家族成員(Hayashi等，1999；Nishikawa等，1997；Sturany等，2001；Valverde等，1994)。首先，與所有其它已知蛋白激酶催化域相比，PKD催化域的氨基酸序列與網(wǎng)原蟲(Dictyostelium)的肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)最相似(41％)，與各PKC僅30-35％相似。第二，PKD1具有獨(dú)特的底物特異性它并不偏好含有PKC家族優(yōu)選的基本殘基的底物位點(diǎn)，而磷酸化相對(duì)于絲氨酸靶位點(diǎn)-5位置上具有亮氨酸的底物(VanLint等，2002)。第三，PKD1對(duì)PKC抑制劑GFI和Ro31-8220不敏感。第四，PKD1不具有自身抑制性假底物序列，而PKC家族的大多數(shù)成員中都可以發(fā)現(xiàn)該序列。因此，雖然歷史上將PKD分類為PKC家族成員，但單獨(dú)分類可能更加合適。有趣的是，已顯示14-3-3蛋白能夠調(diào)節(jié)PKD(VanLint等，2002)，HDAC磷酸化后結(jié)合于14-3-3蛋白。而且，在成年大鼠心臟組織中發(fā)現(xiàn)了PKD(Haworth等，2000)。最后，如上所述，已顯示PKD能夠磷酸化相對(duì)于絲氨酸-5位置上具有亮氨酸的底物(VanLint等，2002)，它正好與本發(fā)明者在II類HDAC中發(fā)現(xiàn)的磷酸化位點(diǎn)位置相對(duì)應(yīng)(未發(fā)表)?？梢栽诘卿浱?hào)NM002742處找到人PKD序列。C.激酶抑制劑如上所述，蛋白激酶是人類基因組的重要組成部分，是最基礎(chǔ)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制之一。因此，控制很多類型細(xì)胞中的激酶活性(或缺乏激酶活性)是很多疾病的主要因素，尤其是涉及增生反應(yīng)炎癥的疾病。即使有各種各樣的激酶靶(已知道大約500個(gè)激酶的序列)，但是直到最近，特別為抑制激酶設(shè)計(jì)的藥物才進(jìn)入市場(chǎng)。即使認(rèn)識(shí)到胞內(nèi)激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)非常重要已經(jīng)有很長(zhǎng)時(shí)間，但是直到最近，才積累了關(guān)于激酶活性和相應(yīng)的催化機(jī)制性質(zhì)的足夠知識(shí)，得以開發(fā)安全和選擇性的激酶抑制藥物。例如，GleevecTM(Novartis)和IressaTM(AstraZeneca)是新的和令人振奮的治療劑類型的開拓性成員，它們現(xiàn)在已經(jīng)成熟地用于臨床。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，有很多蛋白激酶C抑制劑，上述公司具有制造和篩選這些抑制劑的標(biāo)準(zhǔn)方法。因此，在下文中將這些方法和可用于這些系統(tǒng)的已知激酶或化合物引入，作為參考。D.PKD抑制劑有報(bào)道說白藜蘆醇可以抑制PKD(Haworth等，2001)，因此可用于本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中。其它可能的抑制劑包括但不限于吲哚咔唑、Godecke6976(G6976)、星孢素、K252a、包括[d-Arg(1)、d-Trp(5，7，9)、Leu(11)]SP的物質(zhì)P(SP)類似物、PKC抑制劑109203X(GF-1)、PKC抑制劑Ro31-8220、PKC抑制劑GO7874、染料木黃酮、特異性Src抑制劑PP-1和PP-2、白屈菜季銨堿、粗糠柴毒素。除了上述的之外，還有抑制基因的普通、非藥理方法，下面進(jìn)行討論。I.核酸a.反義構(gòu)建物反義方法利用了核酸傾向于與“互補(bǔ)”序列配對(duì)的優(yōu)點(diǎn)?；パa(bǔ)指那些能夠按標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick互補(bǔ)規(guī)則進(jìn)行堿基配對(duì)的那些聚核苷酸。即，較大的嘌呤將與較小的嘧啶進(jìn)行堿基配對(duì)，形成鳥嘌呤配對(duì)胞嘧啶(G:C)和在DNA情況下腺嘌啉配對(duì)胸腺嘧啶(A:T)、或在RNA情況下腺嘌啉配對(duì)尿嘧啶(A:U)的組合。雜交序列中包括的不常見堿基如次黃嘌呤核苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌啉、次黃嘌呤和其它堿基不干擾配對(duì)。用聚核苷酸靶向雙鏈(ds)DNA導(dǎo)致三螺旋形成；靶向RNA將導(dǎo)致雙螺旋形成。當(dāng)將反義聚核苷酸引入靶細(xì)胞中時(shí)，與它們的靶聚核苷酸特異性結(jié)合，并干擾轉(zhuǎn)錄、RNA加工、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯和/或穩(wěn)定性?？刹捎梅戳xRNA構(gòu)建物，或編碼反義RNA的DNA體內(nèi)外抑制宿主細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄或反義或二者，如在宿主動(dòng)物，包括人中?？梢栽O(shè)計(jì)出能與啟動(dòng)子和其它控制區(qū)域、外顯子、內(nèi)含子或甚至基因的外顯子-內(nèi)含子邊界結(jié)合的反義構(gòu)建物。考慮到大多數(shù)有效的反義構(gòu)建物將包括與內(nèi)含子/外顯子剪接點(diǎn)互補(bǔ)的區(qū)域。因此提議，優(yōu)選實(shí)施方式包括與內(nèi)含子-外顯子剪接點(diǎn)50-200堿基內(nèi)的區(qū)域互補(bǔ)的反義構(gòu)建物。觀察到可將一些外顯子序列包括在該構(gòu)建物中，而并不嚴(yán)重影響它的靶選擇性。所包括的外顯材料量將因所用具體外顯子和內(nèi)含子序列而不同。人們可以簡(jiǎn)單地通過體外測(cè)試這些構(gòu)建物，來(lái)確定正常的細(xì)胞功能是否受到影響或具有互補(bǔ)序列的相關(guān)基因的表達(dá)是否受到影響，而容易地測(cè)試是否包括了過多外顯子DNA。如上所述，“互補(bǔ)”或“反義”指基本上全長(zhǎng)互補(bǔ)和只有極少數(shù)堿基錯(cuò)配的聚核苷酸序列。例如，當(dāng)長(zhǎng)十五個(gè)堿基的序列在十三個(gè)或十四個(gè)位置上是互補(bǔ)核苷酸時(shí)，可稱為互補(bǔ)。在自然界，完全互補(bǔ)的序列是在其整個(gè)全長(zhǎng)上完全互補(bǔ)且沒有錯(cuò)配的序列。也考慮其它具有較低同源程度的序列。例如，可以設(shè)計(jì)具有有限的高度同源區(qū)，但也包含非同源區(qū)的反義構(gòu)建物(如核酶；見下)。這些分子，雖然同源性小于50％，仍能在合適的條件下與靶序列結(jié)合。將部分基因組DNA與cDNA或合成序列組合以產(chǎn)生特異性構(gòu)建物是有益的。例如，最終構(gòu)建物中需要其內(nèi)含子時(shí)，將需要采用基因組克隆。cDNA或合成的聚核苷酸可為此構(gòu)建物的剩余部分提供更方便的限制性位點(diǎn)，因此，將用于剩余序列。ii.核酶雖然傳統(tǒng)上將蛋白用于催化核酸，但發(fā)現(xiàn)了另一類可用于該用途的大分子。核酶是以位點(diǎn)特異性方式切割核酸的RNA-蛋白復(fù)合物。核酶具有特異性催化域，該域具有核酸內(nèi)切酶活性(Kim和Cook，1987；Gerlach等，1987；Forster和Symons，1987)。例如，大量核酶能以高度特異性方式加速磷酯轉(zhuǎn)移反應(yīng)，通常切割寡核苷酸底物中的幾種磷酯之一(Cook等，1981；Michel和Westhof，1990；Reinhold-Hurek和Shub，1992)。該特異性歸因于底物在化學(xué)反應(yīng)之前，需要通過堿基特異性配對(duì)相互作用與核酶的內(nèi)部指導(dǎo)序列(“IGS”)結(jié)合。起初，核酶的催化作用被視為是涉及核酸的序列-特異性切割/連接反應(yīng)的一部分(Joyce，1989；Cook等，1981)。例如，美國(guó)專利5,354,855報(bào)道，某些核酶可充當(dāng)核酸內(nèi)切酶，其序列特異性高于已知的核糖核酸酶，接近DNA限制性酶的特異性。因此，序列特異性核酶-介導(dǎo)的基因表達(dá)抑制可能尤其適合于治療應(yīng)用(Scanlon等，1991；Sarver等，1990)。最近報(bào)道，在加入核酶的某些細(xì)胞系中，核酶引起遺傳改變；被改變的基因包括癌基因H-ras、c-fos和HIV基因。這些工作的大部分涉及基于特異性核酶切割的特異性突變密碼子，所發(fā)生的靶mRNA修飾。iii.RNAiRNA干擾(也稱為“RNA-介導(dǎo)的干擾”或RNAi)是一種降低或消除基因表達(dá)的機(jī)制。據(jù)觀察，雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)此種降低，它是一個(gè)多步過程。dsRNA激活轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)監(jiān)督機(jī)制，它的功能是保護(hù)細(xì)胞免受病毒感染和轉(zhuǎn)位子活性(Fire等，1998；Grishok等，2000；Ketting等，1999；Lin和Avery等，1999；Montgomery等，1998；Sharp和Zamore，2000；Tabara等，1999)。這些機(jī)制的活化靶向成熟的dsRNA-互補(bǔ)mRNA，使其破壞。RNAi對(duì)研究基因功能提供了大量實(shí)驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)包括非常高的特異性、容易通過細(xì)胞膜和靶基因下調(diào)時(shí)間長(zhǎng)(Fire等，1998；Grishok等，2000；Ketting等，1999；Lin和Avery等，1999；Montgomery等，1998；Sharp等，1999；Sharp和Zamore，2000；Tabara等，1999)。而且，dsRNA顯示能使廣大系統(tǒng)，包括植物、原生生物、真菌、秀麗新小桿線蟲、錐蟲(Trypanasoma)、果蠅和哺乳動(dòng)物中的基因沉默(Grishok等，2000；Sharp等，1999；Sharp和Zamore，2000；Elbashir等，2001)。廣泛接受的是，RNAi在轉(zhuǎn)錄后起作用，靶向RNA轉(zhuǎn)錄物使其降解?？磥?lái)核和胞漿RNA都可能是其靶(Bosher和Labouesse，2000)。必須設(shè)計(jì)siRNA使其特異性和有效地抑制感興趣基因的表達(dá)。選擇靶序列的方法，即siRNA將降解機(jī)器導(dǎo)向感興趣基因中存在的那些序列的方法，涉及避免可能干擾siRNA導(dǎo)向功能的序列同時(shí)包括對(duì)所述基因具有特異性的序列。一般，siRNA靶序列長(zhǎng)約21至23核苷酸是最有效的。該長(zhǎng)度反映了上述長(zhǎng)得多的RNA加工產(chǎn)生的消化產(chǎn)物的長(zhǎng)度(Montgomery等，1998)。主要通過直接化學(xué)合成；通過與果蠅胚胎裂解物接觸加工較長(zhǎng)的雙鏈RNA；或通過獲自S2細(xì)胞的體外系統(tǒng)制備siRNA。細(xì)胞裂解物或體外加工的用途還可包括后來(lái)從裂解物中分離短的21-23個(gè)核苷酸siRNA，實(shí)施該過程有些麻煩和昂貴?；瘜W(xué)合成過程是制備兩種單鏈RNA-寡聚物，然后使這兩種單鏈寡聚物退火成為雙鏈RNA?；瘜W(xué)合成方法是不同的。特意引入本文作為參考的美國(guó)專利5,889,136、4,415,723和4,458,066和Wincott等(1995)中提供了非限制性例子。提出對(duì)siRNA序列進(jìn)行幾種進(jìn)一步修飾，以改變其穩(wěn)定性或提高其有效性。提出含有雙-核苷酸突出端(即19個(gè)互補(bǔ)核苷酸+3’非互補(bǔ)二聚物)的合成性互補(bǔ)21-merRNA可提供最高的抑制水平。這些方法主要采用兩個(gè)(2’-脫氧)胸腺嘧啶核苷酸的序列作為雙-核苷酸突出端。這些雙核苷酸突出端經(jīng)常寫作dTdT，以使其區(qū)別于摻入RNA中的典型核苷酸。文獻(xiàn)表明，降低化學(xué)合成RNA成本的需要從根本上推動(dòng)了dT突出端的使用。也提出dTdT突出端應(yīng)該比UU突出端更穩(wěn)定，雖然可得到的數(shù)據(jù)顯示，與含有UU突出端的siRNA相比，dTdT突出端僅有輕微提高(＜20％)。據(jù)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)化學(xué)合成的siRNA在細(xì)胞培養(yǎng)中濃度為25-100nM時(shí)，它們工作得最好，但濃度為約100nM可達(dá)到有效抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞哺乳動(dòng)物的表達(dá)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中約100nM的siRNA最為有效。然而，在幾種情況下，使用了較低濃度的化學(xué)合成siRNA(Caplen，等，2000；Elbashir等，2001)。WO99/32619和WO01/68836提出siRNA中所用的RNA可以化學(xué)或酶學(xué)合成。此二專利內(nèi)容引入本文作為參考。這些參考文獻(xiàn)中所述的酶學(xué)合成是，通過用細(xì)胞RNA聚合酶或噬菌體RNA聚合酶(例如，T3，T7，SP6)如本領(lǐng)域已知地使用和生產(chǎn)表達(dá)構(gòu)建物。例如，參見美國(guó)專利5,795,715。所考慮的構(gòu)建物提供了產(chǎn)生RNA的模板，該RNA含有與靶基因一部分相同的核苷酸序列。這些參考文獻(xiàn)提供的相同序列的長(zhǎng)度至少是25個(gè)堿基，可長(zhǎng)達(dá)400個(gè)或更多個(gè)堿基。該參考文獻(xiàn)的一個(gè)重要方面是作者考慮用體內(nèi)的內(nèi)源性核酸酶復(fù)合物將較長(zhǎng)dsRNA消化成21-25mer長(zhǎng)度，從而將長(zhǎng)的dsRNA轉(zhuǎn)變?yōu)閟iRNA。它們沒有描述或提供體外合成和使用轉(zhuǎn)錄的21-25merdsRNA的資料。在RNA干擾應(yīng)用中，化學(xué)或酶學(xué)合成制備的dsRNA所期望的性能沒有任何差別。類似地，引入本文作為參考的WO00/44914提出，可通過酶學(xué)或通過部分/全有機(jī)合成產(chǎn)生RNA單鏈。宜從DNA模板的，優(yōu)選克隆的cDNA模板的PCR產(chǎn)物酶學(xué)合成單鏈RNA，RNA產(chǎn)物是該cDNA的完整轉(zhuǎn)錄物，可包含幾百個(gè)核苷酸。引入本文作為參考的WO01/36646對(duì)siRNA合成的方式?jīng)]有設(shè)任何限制，提出RNA可在體外或體內(nèi)用手動(dòng)和/或自動(dòng)步驟合成。該參考文獻(xiàn)還提出體外合成可以是化學(xué)方法或酶學(xué)方法合成，例如用克隆的RNA聚合酶(例如，T3、T7、SP6)轉(zhuǎn)錄內(nèi)源性DNA(或cDNA)模板，或二法的混合方法。對(duì)于RNA干擾應(yīng)用來(lái)說，化學(xué)或酶學(xué)合成制備的siRNA之間在所需性能上沒有差別。美國(guó)專利5,795,715報(bào)道了在一種反應(yīng)混合物中同時(shí)轉(zhuǎn)錄兩個(gè)互補(bǔ)DNA序列鏈，該反應(yīng)中這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄物立刻發(fā)生雜交。所用模板優(yōu)選40-100堿基對(duì)，兩端都裝配有啟動(dòng)子序列。該模板能優(yōu)先附著到固體表面上。用RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄后，可用產(chǎn)生的dsRNA片段檢測(cè)和/或測(cè)定核酸靶序列。III.組蛋白脫乙酰酶和抑制劑核小體，染色質(zhì)折疊的基本支架，是動(dòng)態(tài)大分子結(jié)構(gòu)，影響染色質(zhì)溶液的構(gòu)象(Workman和Kingston，1998)。核小體核心由組蛋白、H2A、HB、H3和H4組成。組蛋白乙?；a(chǎn)生核小體和使核小體重排，表現(xiàn)為生物物理性質(zhì)的改變。組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HAT)和脫乙酰酶(HDAC)的活性之間的平衡決定組蛋白的乙?；?。乙?；慕M蛋白引起染色質(zhì)松弛和激活基因轉(zhuǎn)錄，而脫乙?；娜旧|(zhì)通常無(wú)轉(zhuǎn)錄活性。已克隆了脊椎生物的十一種不同HDAC。最先鑒定的三種人HDAC是HDAC1、HDAC2和HDAC3(稱為I類人HDAC)，HDAC8(VandenWyngaert等，2000)也加入此列。近年來(lái)，克隆并鑒定了(Grozinger等，1999；Zhou等2001；Tong等，2002)II類人HDACHDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9和HDAC10(Kao等，2000)。此外，已經(jīng)鑒定了HDAC11，但尚未將其歸為I類或II類(Gao等，2002)。所有這些HDAC的催化區(qū)都有同源性。然而，HDAC4、5、7、9和10具有獨(dú)特的氨基端延伸，這在其它HDAC中并未發(fā)現(xiàn)。該氨基端區(qū)域包含MEF2-結(jié)合域。已顯示HDAC4、5和7參與心臟基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，在具體實(shí)施方式中，抑制MEF2轉(zhuǎn)錄活性。還不完全了解II類HDAC抑制MEF2活性的確切機(jī)制。一種可能性是HDAC與MEF2的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性地或通過使天然的有轉(zhuǎn)錄活性的MEF2構(gòu)象不穩(wěn)定而抑制MEF2轉(zhuǎn)錄活性。也可能II類HDAC需要與MEF2二聚化，以將HDAC定位于或置于組蛋白附近，以進(jìn)行脫乙?；Ｒ呀?jīng)鑒定到各種組蛋白脫乙酰酶的抑制劑。建議廣泛應(yīng)用，但主要集中在癌癥治療上。Saunders等(1999)；Jung等(1997)；Jung等(1999)；Vigushin等(1999)；Kim等(1999)；Kitazomo等(2001)；Vigusin等(2001)；Hoffmann等(2001)；Kramer等(2001)；Massa等(2001)；Komatsu等(2001)；Han等(2001)。這些療法是NIH負(fù)責(zé)的I期臨床試驗(yàn)的主題，用于實(shí)體瘤和非霍金奇氏淋巴瘤。HDAC也提高轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄，因此構(gòu)成了可能的基因治療輔助方法。Yamano等(2000)；Su等(2000)?？赏ㄟ^各種不同機(jī)制-蛋白、肽和核酸(包括反義和RNAi分子)抑制HDAC。本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛知曉克隆、轉(zhuǎn)移和表達(dá)遺傳構(gòu)建物的方法，包括病毒和非病毒載體，以及脂質(zhì)體。病毒載體包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒和皰疹病毒。也考慮到了小分子抑制劑。最廣泛知曉的HDAC的小分子抑制劑也許是曲古抑菌素A，一種羥肟酸。據(jù)顯示，它誘導(dǎo)過乙?；⑹箁as轉(zhuǎn)化的細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為正常形態(tài)(Taunton等，1996)和在小鼠模型中誘導(dǎo)免疫抑制(Takahashi等，1996)。它可從BIOMOLResearchLabs，Inc.，PlymouthMeeting，PA購(gòu)得。以下引入本文作為參考的參考文獻(xiàn)都描述了可用于本發(fā)明的HDAC抑制劑AU9,013,101；AU9,013,201；AU9,013,401；AU6,794,700；EP1,233,958；EP1,208,086；EP1,174,438；EP1,173,562；EP1,170,008；EP1,123,111；JP2001/348340；美國(guó)申請(qǐng)2002/103192；美國(guó)申請(qǐng)2002/65282；美國(guó)申請(qǐng)2002/61860；WO02/51842；WO02/50285；WO02/46144；WO02/46129；WO02/30879；WO02/26703；WO02/26696；WO01/70675；WO01/42437；WO01/38322；WO01/18045；WO01/14581；Furumai等(2002)；Hinnebusch等(2002)；Mai等(2002)；Vigushin等(2002)；Gottlicher等(2001)；Jung(2001)；Komatsu等(2001)；Su等(2000)。IV.治療心臟肥大的方法A.治療方案當(dāng)前在處理心血管疾病中治療心臟肥大的醫(yī)學(xué)方法包括使用至少兩類藥物腎素-血管緊張素系統(tǒng)的抑制劑和β-腎上腺素能阻斷劑(Bristow，1999)。在處理心力衰竭中治療病理性肥大的治療劑包括血管緊張素II轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑和β-腎上腺素能受體阻斷劑(Eichhorn和Bristow，1996)。其它已公開用于治療心臟肥大的藥劑包括血管緊張素II受體拮抗劑(美國(guó)專利5,604,251)和神經(jīng)肽Y拮抗劑(WO98/33791)。盡管當(dāng)前有可用的藥學(xué)化合物，但預(yù)防和治療心臟肥大，以及隨后的心力衰竭仍然是一種治療挑戰(zhàn)。非藥物治療主要用作輔助藥物治療。非藥物治療的一種方法包括減少食物中的鈉鹽。此外，非藥物治療還需要清除某些沉淀性藥物，包括負(fù)變力劑(例如，某些鈣通道阻斷劑和抗心律失常藥如雙異丙吡胺)、心臟毒素(如安非他明)和血漿容量擴(kuò)充藥(例如，非甾體抗炎藥和糖皮質(zhì)激素)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了利用PKD抑制劑治療心臟肥大或心力衰竭的方法。對(duì)于本申請(qǐng)目的，治療包括減少心臟肥大的一種或多種癥狀，如運(yùn)動(dòng)能力降低，心射血量降低，左心室舒張末期壓增高，肺毛細(xì)管嵌入壓增高，心臟輸出、心臟指數(shù)降低，肺動(dòng)脈壓增高，左心室收縮和舒張末期尺度增大和左心室壁壓力、壁張力和壁厚度升高-同樣對(duì)于右心室。此外，PKD抑制劑可用于預(yù)防心臟肥大及其相關(guān)癥狀的發(fā)生。治療方案應(yīng)根據(jù)臨床情況而不同。然而，在大多數(shù)情況下，長(zhǎng)期維持用藥是合適的。也可能需要用PKD抑制劑間歇性治療肥大，如在疾病進(jìn)展期間短暫的治療窗。B.聯(lián)合療法在另一實(shí)施方式中，預(yù)想將PKD抑制劑與其它治療方式聯(lián)合使用。因此，除了上述療法，也可以給病人提供更“標(biāo)準(zhǔn)的”心臟藥物治療。其它療法的實(shí)例包括但不限于所謂的“β阻斷劑”、抗高血壓藥、強(qiáng)心劑、抗血栓劑、血管舒張劑、激素拮抗劑、變力藥物、利尿劑、內(nèi)皮縮血管肽拮抗劑、鈣通道阻斷劑、磷酸二酯酶抑制劑、ACE抑制劑、血管緊張素2型拮抗劑和細(xì)胞因子阻斷劑/抑制劑、和HDAC抑制劑。可通過使心臟細(xì)胞與一種組合物或包括兩種藥物的藥物制劑接觸，或通過使細(xì)胞與兩種不同組合物或制劑同時(shí)接觸實(shí)現(xiàn)聯(lián)合治療，其中一種組合物包含表達(dá)構(gòu)建物，另一組合物包含藥物?；蛘撸稍诮o予其它藥劑之前或之后數(shù)分鐘至數(shù)周間隔時(shí)，進(jìn)行PKD抑制劑治療。在其它藥物和表達(dá)構(gòu)建物分別應(yīng)用于細(xì)胞的實(shí)施方式中，通常應(yīng)保證每種藥物遞送之間有相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間間隔，以使藥物和表達(dá)構(gòu)建物仍能對(duì)細(xì)胞施加有利的聯(lián)合效應(yīng)。在這種情況下通常考慮使細(xì)胞與兩種方式的接觸彼此相隔約12-24小時(shí)，更優(yōu)選彼此相隔6-12小時(shí)，最優(yōu)選延遲時(shí)間僅為約12小時(shí)。在一些情況下，可能需要顯著延長(zhǎng)治療時(shí)間，然而，分別給藥之間的間隔也可達(dá)數(shù)天(2、3、4、5、6或7)至數(shù)周(1、2、3、4、5、6、7或8)。也可想見，將需要給予PKD抑制劑或其它藥物一次以上。在這點(diǎn)上，可采用各種組合。為了說明，PKD抑制劑是“A”，其它藥劑是“B”，下面的排列是根據(jù)總共給藥3和4次的范例A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BB/A/AA/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BB/B/B/AA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/A/B同樣考慮了其它組合。C.藥理治療劑藥理治療劑和給藥方法、劑量等是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見例如，“醫(yī)生桌面參考書(PhysiciansDeskReference)”、Klaassend的“治療的藥理學(xué)基礎(chǔ)”、“雷明頓藥物科學(xué)(Remington’sPharmaceuticalSciences)”和“莫克指數(shù)(TheMerckIndex)，第十一版”，本文引入它們的相關(guān)部分作為參考)，可根據(jù)本文公開的內(nèi)容結(jié)合本發(fā)明。必須待治療患者的情況對(duì)劑量作出某些改變。負(fù)責(zé)給藥的人必須為患者個(gè)體確定合適的劑量，確定患者個(gè)體的合適劑量是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技術(shù)能力之內(nèi)。本發(fā)明中可使用的藥物治療劑的非限制性例子包括抗高脂蛋白藥、抗動(dòng)脈硬化藥、抗血栓/溶纖維蛋白藥、血凝促進(jìn)藥、抗心律不齊藥、抗高血壓藥、血管加壓藥、充血性心力衰竭治療劑、防心絞痛藥、抗菌藥或它們的組合。此外，應(yīng)該注意，可利用以下任何一種藥物來(lái)發(fā)展新的心臟疾病治療的靶基因，如本發(fā)明實(shí)施例中所用的β-阻斷劑(見下)。雖然預(yù)計(jì)很多這些基因可能重疊，但很可能開發(fā)出新的靶基因。i.抗高脂蛋白藥在某些實(shí)施方式中，可將給予能降低一種或多種血脂和/或脂蛋白濃度的藥物，本文中稱為“抗高脂蛋白藥”與本發(fā)明的心血管治療藥物，具體是治療動(dòng)脈粥樣硬化和血管組織增厚或阻塞的藥物相結(jié)合。在某些方面，抗高脂蛋白藥可包括芳氧基鏈烷酸/纖維酸衍生物、樹脂/膽汁酸螯合劑、HMGCoA還原酶抑制劑、煙酸衍生物、甲狀腺激素或甲狀腺激素類似物、其它藥物或它們的組合。a.芳氧基鏈烷酸/纖維酸衍生物芳氧基鏈烷/纖維酸衍生物的非限制性例子包括芐氯貝特、enzafibrate、比尼貝特、環(huán)丙貝特、克利貝特、氯貝特(atromide-S)、氯貝酸、依托貝特、非諾貝特、吉非羅齊(lobid)、尼可貝特、吡貝特、氯煙貝特、雙貝特和羥乙茶堿貝特。b.樹脂/膽汁酸螯合劑樹脂/膽汁酸螯合劑的非限制性例子包括消膽胺(消膽胺、降膽敏)，降脂樹脂(考來(lái)替泊)和降膽葡胺。c.HMGCoA還原酶抑制劑HMGCoA還原酶抑制劑的非限制性例子包括洛伐他汀(mevacor)、普伐他汀(普拉固)或辛伐他汀(舒降之)。d.煙酸衍生物煙酸衍生物的非限制性例子包括煙酸呋酯、阿西莫司、戊四煙酯、尼可氯酯、煙酸環(huán)己醇酯和氧煙酸。e.甲狀腺激素和類似物甲狀腺激素及其類似物的非限制性例子包括etoroxate、甲狀丙酸和甲狀腺素。f.其它抗高脂蛋白藥其它抗高脂蛋白藥的非限制性例子包括阿昔呋喃、阿扎膽醇、苯氟雷司、β-芐叉丁酰胺、卡尼汀、硫酸軟骨素、氯雌酮甲醚、detaxtran、右旋糖酐硫酸鈉、5，8，11，14，17-二十碳五烯酸、香菇嘌啉、夫拉扎勃、美格魯托、甲亞油酰胺、雙甲雌三醇、鳥氨酸、γ-谷維素、泛硫乙胺、四乙酸季戊四醇酯、α-苯基丁酰胺、吡扎地爾、丙丁酚(普羅布考片劑)、β-谷甾醇、磺托酸-哌嗪鹽、硫癸二乙醇、三苯乙醇和聯(lián)苯丁酸。ii.抗動(dòng)脈硬化藥抗動(dòng)脈硬化藥的非限制性例子包括吡醇氨酯。iii.抗血栓/溶纖維蛋白藥在某些實(shí)施方式中，可以將給予能幫助去除或防止血液凝塊的藥物與給予調(diào)節(jié)劑相結(jié)合，尤其是治療動(dòng)脈粥樣硬化和和脈管系統(tǒng)(如動(dòng)脈)阻塞?？寡ê?或溶纖維蛋白藥的非限制性例子包括抗凝血藥、抗凝血?jiǎng)┺卓箘?、抗血小板藥、血栓溶解劑、血栓溶解劑拮抗劑或它們的組合。在某些方面，可以口服給予抗血栓藥，例如，優(yōu)選阿司匹林和華法林(丙酮香豆素鈉)。a.抗凝血藥抗凝血藥的非限制性例子包括醋硝香豆酮、安克洛酶、茴茚二酮、溴茚二酮、氯茚二酮、庫(kù)美香豆素、環(huán)香豆素、右旋糖酐硫酸鈉、雙羥香豆素、二苯茚酮、雙香豆乙酯、亞乙基雙羥香豆素、氟茚二酮、肝素、水蛭素、阿樸酸鈉、奧沙二酮、木聚硫鈉、苯茚二酮、苯丙香豆素、卵黃高磷蛋白、吡考酰胺、噻氯香豆素和華法林。b.抗血小板藥抗血小板藥的非限制性例子包括阿司匹林、右旋糖酐、雙嘧哌胺醇(潘生丁)、肝素、苯磺唑酮(anturane)和噻氯匹定(ticlid)。c.血栓溶解劑血栓溶解劑的非限制性例子包括組織纖溶酶原激活劑(激活酶)、纖溶酶、尿激酶原、尿激酶(abbokinase)、鏈激酶(鏈酶)、阿尼普酶/APSAC(依米那酶)。iv.血凝促進(jìn)藥在某些實(shí)施方式中，病人患有出血癥(hemmorage)或出血的可能性增加，可采用能促進(jìn)血液凝結(jié)的藥物。血凝促進(jìn)藥的非限制性例子包括血栓溶解劑拮抗劑和抗凝血?jiǎng)┺卓箘.抗凝血?jiǎng)┺卓箘┛鼓獎(jiǎng)┺卓箘┑姆窍拗菩岳影~精蛋白和維生素K1。b.血栓溶解劑拮抗劑和抗血栓劑血栓溶解劑拮抗劑的非限制性例子包括氨基己酸(亮氨酸)和氨甲環(huán)酸(凝血酸)?？寡▌┑姆窍拗菩岳影ò⒛歉窭住⒓忧?、cilstazol、達(dá)曲班、去纖苷、依諾肝素、速避凝、吲哚布芬、lamoparan、奧扎格雷、吡考酰胺、普拉貝脲、替地肝素、噻氯匹定和三氟柳。v.抗心律不齊藥抗心律不齊藥的非限制性例子包括I類抗心律不齊藥(鈉通道阻斷劑)，II類抗心律不齊藥(β-腎上腺素能阻斷劑)；II類抗心律不齊藥(復(fù)極化延長(zhǎng)藥物)，IV類抗心律不齊藥(鈣通道阻斷劑)和其它抗心律不齊藥。a.鈉通道阻斷劑鈉通道阻斷劑的非限制性例子包括IA類、IB類和IC類抗心律不齊藥。IA類抗心律不齊藥的非限制性例子包括雙吡嗪酰胺(雙異丙吡胺)、普魯卡因胺(百浪斯剔)和奎尼丁(硫酸奎尼丁)。IB類抗心律不齊藥的非限制性例子包括利多卡因(賽羅卡因)、妥卡胺(tonocard)和脈律定(美西律)。IC類抗心律不齊藥的非限制性例子包括恩卡胺(enkaid)和氟卡胺(tambocor)。b.β阻斷劑β阻斷劑，也稱為β-腎上腺素能阻斷劑、β-腎上腺素能拮抗劑或II類抗心律不齊藥的非限制性例子包括醋丁洛爾(醋丁酰心安)、阿普洛爾、氨磺洛爾、arotinolol、阿替洛爾、苯呋洛爾、倍他索洛爾、貝凡洛爾、比索洛爾、波吲洛爾、布庫(kù)洛爾、布非洛爾、丁呋洛爾、布尼洛爾、布拉洛爾、鹽酸布替君、丁非洛爾、卡拉洛爾、卡替洛爾、卡維地洛、塞利洛爾、塞他洛爾、氯拉洛爾、地來(lái)洛爾、依泮洛爾、艾司洛爾(brevibloc)、茚諾洛爾、拉貝洛爾、左布諾洛爾、甲吲洛爾、美替洛爾、美托洛爾、莫普洛爾、納多洛爾、萘肟洛爾、硝苯洛爾、尼普地洛、氧烯洛爾、噴布洛爾、吲哚洛爾、普拉洛爾、丙萘洛爾、丙諾洛爾(propanolol)(心得安)、索他洛爾(betapace)、硫氧洛爾、他林洛爾、特他洛爾、噻嗎洛爾、托利洛爾和xibinolol。在某些方面，β阻斷劑包括芳氧基丙醇胺衍生物。芳氧基丙醇胺衍生物的非限制性例子包括醋丁洛爾、arotinolol、阿替洛爾、倍他索洛爾、貝凡洛爾、比索洛爾、波吲洛爾、布尼洛爾、丁非洛爾、卡拉洛爾、卡替洛爾、卡維地洛、塞利洛爾、塞他洛爾、依泮洛爾、茚諾洛爾、甲吲洛爾、美替洛爾、美托洛爾、莫普洛爾、納多洛爾、尼普地洛、氧烯洛爾、噴布洛爾、吲哚洛爾、丙諾洛爾、他林洛爾、特他洛爾、噻嗎洛爾和托利洛爾。c.復(fù)極化延長(zhǎng)藥復(fù)極化延長(zhǎng)藥，也稱為III類抗心律不齊藥的非限制性例子包括胺碘酮(安律酮)和右索他洛爾(心得怡)。d.鈣通道阻斷劑/拮抗劑鈣通道阻斷劑，也稱為IV類抗心律不齊藥的非限制性例子包括芳基烷基胺(如芐丙洛、地爾硫、芬地林、戈洛帕米、普尼拉明、特羅地林、維拉帕米)、二氫吡啶衍生物(非洛地平、伊拉地平、尼卡地平、硝苯地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平)、哌嗪衍生物(例如，桂利嗪，氟桂利嗪，利多氟嗪)或其它鈣通道阻斷劑如芐環(huán)烷，依他苯酮，鎂，米貝拉地爾或米貝拉地爾。在某些實(shí)施方式中，鈣通道阻斷劑包括長(zhǎng)效二氫吡啶(硝苯吡啶型)鈣拮抗劑。e.其它抗心律不齊藥其它抗心律不齊藥的非限制性例子包括阿糖腺苷(adenocard)、地高辛(拉諾辛)、乙?？?、阿義馬林、克冠嗎啉、阿普林定、托西溴芐銨、丁萘夫汀、布托苯定、卡泊酸、西苯唑啉、雙異丙吡胺、雙氫奎尼丁、英地卡尼、溴化ipatropium、利多卡因、勞拉義明、勞卡尼、甲氧苯汀、莫雷西嗪、吡美諾、prajmaline、普羅帕酮、吡諾林、多聚半乳糖醛酸奎尼丁酯、硫酸奎尼丁酯和維喹地爾。vi.抗高血壓藥抗高血壓藥的非限制性例子包括交感神經(jīng)阻滯藥、α/β阻斷劑、α阻斷劑、抗血管緊張素II藥、β阻斷劑、鈣通道阻斷劑、血管舒張劑和其它抗高血壓藥。a.α阻斷劑α阻斷劑，也稱為α-腎上腺素能阻斷劑或α-腎上腺素能拮抗劑的非限制性例子包括氨磺洛爾、阿羅洛爾、達(dá)哌唑、多沙唑嗪、甲磺酸麥角固醇酯(ergoloidmesylates)、芬司匹利、吲哚拉明、拉貝洛爾、尼麥角林、哌唑嗪、特拉唑嗪、妥拉唑林、曲馬唑嗪和育亨賓。在某些實(shí)施方式中，α阻斷劑可包括喹唑啉衍生物。喹唑啉衍生物的非限制性例子包括阿夫唑嗪、布那唑嗪、多沙唑嗪、哌唑嗪、特拉唑嗪和曲馬唑嗪。b.α/β阻斷劑在某些實(shí)施方式中，抗高血壓藥是α和β腎上腺素能拮抗劑。α/β阻斷劑的非限制性例子包括拉貝洛爾(柳胺心定，柳胺芐心定)。c.抗血管緊張素II藥抗血管緊張素II藥的非限制性例子包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素II受體拮抗劑。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACE抑制劑)的非限制性例子包括阿拉普利、依那普利(vasotec)、卡托普利、西拉普利、地拉普利、依那普利拉、福辛普利、賴諾普利、moveltopril、培哚普利、喹那普利和雷米普利。血管緊張素II受體阻斷劑，也稱為血管緊張素II受體拮抗劑、ANG受體阻斷劑或ANG-II的1型受體阻斷劑(ARBS)的非限制性例子包括血管坎地沙坦、依普羅沙坦、厄貝沙坦、氯沙坦和纈沙坦。d.交感神經(jīng)阻滯藥交感神經(jīng)阻滯藥的非限制性例子包括作用于中樞的交感神經(jīng)阻滯藥或作用于外周的交感神經(jīng)阻滯藥。作用于中樞的交感神經(jīng)阻滯藥，也稱為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)交感神經(jīng)阻滯藥的非限制性例子包括可樂定(氯壓定)、胍那芐(氯壓胍)、胍法辛(鹽酸胍法辛)和甲基多巴(愛道美)。作用于外周的交感神經(jīng)阻滯藥的非限制性例子包括神經(jīng)節(jié)阻斷劑、腎上腺素能能神經(jīng)元阻斷劑、β-腎上腺素能阻斷劑或αl-腎上腺素能阻斷劑。神經(jīng)節(jié)阻斷劑的非限制性例子包括美卡拉明(美加明)和三甲噻方(阿方那特)。腎上腺素能能神經(jīng)元阻斷劑的非限制性例子包括胍乙啶(依斯米林)和利舍平(色巴息)。β-腎上腺素能阻斷劑的非限制性例子包括acenitolol(醋丁酰心安)、阿替洛爾(氨酰心安)、倍他洛爾(卡爾侖)、卡替洛爾(鹽酸卡替洛爾)、拉貝洛爾(柳胺心定、柳胺羥胺)、美托洛爾(美多洛爾)、萘丁樂(康加爾多)、噴布洛爾(levatol)、吲哚洛爾(心得靜)、普萘洛爾(萘心安)和噻嗎洛爾(噻嗎心安)。αl-腎上腺素能阻斷劑的非限制性例子包括哌唑嗪(鹽酸哌唑嗪)、多沙唑嗪(doxazocin)(甲磺酸多沙唑嗪)和特拉唑嗪(高特靈)。e.血管舒張劑在某些實(shí)施方式中，心血管治療劑可包括血管舒張劑(例如，腦血管舒張劑，冠狀血管舒張劑或外周血管舒張劑)。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，血管舒張劑是冠狀血管舒張劑。冠狀血管舒張劑的非限制性例子包括胺氧三苯、阿苯達(dá)唑、琥珀苯呋地爾、苯碘達(dá)隆、氯吩嗪、卡波羅孟、氯芐呋醇、氯硝甘油、克冠二氮卓、雙嘧達(dá)莫、氫普拉明、乙氧黃酮、四硝酸赤癬醇酯、依他苯酮、芬地林、夫洛地爾、更利芬、herestrol雙(β-二乙氧基乙基醚)、海索苯定、硝乙醇胺、凱林、利多氟嗪、六硝酸己烷醇酯、美地巴嗪、煙酰甘油(nicorglycerin)、四硝酸季戊四醇酯、戊硝醇、哌克昔林、匹美茶堿、曲匹地爾、甲色酮、曲美他嗪、磷酸三硝乙醇胺和維司那定。在某些方面，血管舒張劑可包括慢性療法血管舒張劑或緊急高血壓血管舒張劑。慢性療法血管舒張劑的非限制性例子包括雙肼屈嗪(肼苯噠嗪)和米諾地爾(降壓定)。緊急高血壓血管舒張劑的非限制性例子包括硝普鈉(亞硝基鐵氰化鈉)、二氮嗪(降壓嗪IV)、雙肼屈嗪(肼苯噠嗪)、米諾地爾(降壓定)和維拉帕米。f.其它抗高血壓藥其它抗高血壓藥的非限制性例子包括阿義馬林、γ-氨基丁酸、丁苯碘胺、西氯他寧、環(huán)西多明、丹寧酸綠藜安酯、非諾多泮、氟司喹南、酮色林、美布氨酯、美卡拉明、甲基多巴、甲基4-吡啶基酮縮氨基硫脲、莫唑胺、帕吉林、潘必啶、吡那地爾、哌羅克生、普立哌隆、原藜蘆堿、蘿巴新、瑞西美托、利美尼定、沙拉新、sodiumnitrorusside、替尼酸、右旋樟腦磺酸三甲噻方酯、酪氨酸酶和烏拉地爾。在某些方面，抗高血壓藥可包括芳基乙醇胺衍生物、苯丙噻二嗪衍生物、N-羧基烷基(肽/內(nèi)酰胺)衍生物、二氫吡啶衍生物、胍衍生物、肼/酞嗪、咪唑衍生物、季銨化合物、利血平衍生物或磺胺類衍生物。芳基乙醇胺衍生物。芳基乙醇胺衍生物的非限制性例子包括氨磺洛爾、丁呋洛爾、地來(lái)洛爾、拉貝洛爾、丙萘洛爾、索他洛爾和硫氧洛爾。苯丙噻二嗪衍生物。苯丙噻二嗪衍生物的非限制性例子包括阿爾噻嗪、芐氟噻嗪、芐噻嗪、芐基氫氯噻嗪、布噻嗪、氯噻嗪、氯噻酮、環(huán)戊噻嗪、環(huán)噻嗪、二氮嗪、依匹噻嗪、乙噻嗪、芬喹唑、氫氯噻嗪、氫氟噻嗪、甲氯噻嗪、美替克侖、美托拉宗、對(duì)氟噻嗪、聚噻嗪、四氯噻嗪和三氯噻嗪。N-羧基烷基(肽/內(nèi)酰胺)衍生物。N-羧基烷基(肽/內(nèi)酰胺)衍生物的非限制性例子包括阿拉普利、卡托普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、賴諾普利、莫維普利、培哚普利、喹那普利和雷米普利。二氫吡啶衍生物。二氫吡啶衍生物的非限制性例子包括氨氯地平、非洛地平、伊拉地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼索地平和尼群地平。胍衍生物。胍衍生物的非限制性例子包括芐二甲胍、異喹胍、胍那芐、胍那克林、胍那決爾、胍那佐定、胍乙啶、胍法辛、胍氯、胍諾沙芐和胍生。肼/酞嗪。肼/酞嗪的非限制性例子包括布屈嗪、卡屈嗪、雙肼屈嗪、恩屈嗪、肼卡巴嗪、肼屈嗪、苯異丙肼、匹爾屈嗪和托屈嗪。咪唑衍生物。咪唑衍生物的非限制性例子包括吡可樂定、右洛非西定、酚妥拉明、噻甲尼定和托洛尼定。季銨化合物。季銨化合物的非限制性例子包括阿扎溴銨、松達(dá)氯銨、六甲溴銨、噴他雙甲硫銨、噴他溴銨、酒石酸噴托銨、芬托氯銨和甲硫曲美替定。利血平衍生物。利血平衍生物的非限制性例子包括比他舍平、地舍平、瑞西那明、利舍平和昔洛舍平。磺胺類衍生物。磺胺類衍生物的非限制性例子包括氨丁磺酰胺、氯哌胺、利尿磺胺、茚磺苯酰胺、喹噻酮、曲帕胺和氯磺水楊胺。g。血管加壓藥血管加壓藥通常用于在外科手術(shù)休克期間提高血壓。血管加壓藥，也稱為抗低血壓藥的非限制性例子包括甲硫阿美銨、血管緊張素酰胺、二甲福林、多巴胺、雙苯次甲丁胺、依替福林、氨苯福林、間羥胺、甲氧胺福林、去甲腎上腺素、福勒德林和脫氧腎上腺素。vii.充血性心力衰竭的治療藥充血性心力衰竭的治療藥的非限制性例子包括抗血管緊張素II藥、后載-預(yù)載降低治療、利尿劑和變力藥物。a.后載-預(yù)載降低在某些實(shí)施方式中，可以用聯(lián)合療法治療不能耐受血管緊張素拮抗劑的患病動(dòng)物。該療法可聯(lián)合給予肼屈嗪(肼苯噠嗪)和二硝酸異山梨醇酯(硝異梨醇，消心痛)。b.利尿劑利尿劑的非限制性例子包括噻嗪類或苯丙噻二嗪衍生物(如阿爾噻嗪、苯氟噻嗪、芐噻嗪、芐基氫氯噻嗪、異丁噻嗪、氯噻嗪、氯噻嗪、氯噻酮、環(huán)戊噻嗪、依匹噻嗪、乙噻嗪、乙噻嗪、芬喹唑、氫氯噻嗪、氫氟噻嗪、甲氯噻嗪、美替克侖、美托拉宗、對(duì)氟噻嗪、聚噻嗪、四氯噻嗪、三氯噻嗪)、有機(jī)汞制劑(如氯汞君、美拉魯利、mercamphamide、硫汞林鈉、mercumallylicacid、汞香豆林鈉、氯化亞汞、汞撒利)、蝶啶(如呋氨蝶啶、氨苯蝶啶)、嘌呤(如茶堿、7-嗎啉代甲基茶堿、pamobrom、丙可可堿、可可堿)、包括醛固酮拮抗劑的類固醇(如坎利酮、夾竹桃苷、螺內(nèi)酯)、磺胺類衍生物(如乙酰唑胺、氨丁磺酰胺、阿佐寒米、布美他尼、布他唑胺、氯米非那胺、雙氯非那胺、氯哌胺、氯索隆、二苯基甲烷-4，4’-二磺胺、二磺法胺、依索唑胺、利尿磺胺、茚磺苯酰胺、美夫西特、醋甲唑胺、吡咯他尼、喹噻酮、托拉塞米、曲帕胺、氯磺水楊胺)、尿嘧啶(如氨美啶、阿米美啶)、鉀輕微(sparing)拮抗劑(如阿米洛利、氨苯蝶啶)或其它利尿劑，如aminozine、熊果苷、氯拉扎尼、依他尼酸、依托唑啉、肼卡巴嗪、異山梨醇、甘露醇、美托查酮、莫唑胺、哌克昔林、ticrnafen和脲。c.變力藥物正變力劑，也稱為強(qiáng)心劑的非限制性例子包括茶堿、乙?；蟮攸S毒苷、2-氨基-4-甲基吡啶、氨利酮、半琥珀酸琥珀呋酯、布拉地辛、黃花夾竹桃次苷B(cerberosine)、樟吡他胺、鈴蘭毒苷、磁麻苷、地諾帕明、去乙酰毛花苷、洋地黃苷、洋地黃、洋地黃毒苷、地高辛、多巴酚丁胺、多巴胺、多培沙明、依諾昔酮、格木堿、非那可明、吉他林、羥基洋地黃毒苷、胍基乙酸、辛胺醇、白毛莨分堿、異波帕胺、毛花苷、甲氧酚酰胺(metamivamn)、米力農(nóng)、黃夾次苷乙、夾竹桃苷、毒毛花苷G、奧昔非君、普瑞特羅、次海蔥苷、殘余蟾蜍配基、海蔥苷、海蔥苷寧、毒毛旋花苷(strophanthin)、硫馬唑、可可堿和扎莫特羅。在具體方面，變力藥物是強(qiáng)心苷、β-腎上腺素能激動(dòng)劑或磷酸二酯酶抑制劑。強(qiáng)心苷的非限制性例子包括地高辛(拉諾辛)和洋地黃毒苷(crystodigin)。β-腎上腺素能激動(dòng)劑的非限制性例子包括沙丁胺醇，班布特羅，比托特羅，卡布特羅，克侖特羅，氯丙那林，地諾帕明，雙羥乙麻黃堿，多巴酚丁胺(杜丁胺)，多巴胺(intropin)，多培沙明，麻黃堿，乙非君，乙基去甲腎上腺素，非諾特羅，福莫特羅，海索那林，異波帕胺，新異丙腎上腺素，異丙腎上腺素，馬布特羅，奧西那林，甲氧那明，奧昔非君，吡布特羅，丙卡特羅，普羅托醇，瑞普特羅，利米特羅，利托君，索特瑞醇，特布他林，曲托喹酚，妥洛特羅和扎莫特羅。磷酸二酯酶抑制劑的非限制性例子包括氨利酮(強(qiáng)心隆)。d.防心絞痛藥防心絞痛藥可包括有機(jī)硝酸鹽、鈣通道阻斷劑、β阻斷劑及它們的組合。有機(jī)硝酸鹽，也稱為硝基血管舒張劑的非限制性例子包括硝酸甘油(貼保寧，三硝酸甘油)，二硝酸異山梨醇酯(硝異梨醇，消心痛)和硝酸戊酯(aspirol，亞硝酸異戊酯)。D.外科治療在某些方面，第二種治療可包括一些類型的外科治療，其包括，例如，預(yù)防、診斷或進(jìn)程、治愈性和姑息性外科治療。外科手術(shù)，具體說是治愈性外科手術(shù)，可與其它療法，如本發(fā)明和一種或多種其它藥物聯(lián)合使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于血管和心血管疾病和失調(diào)的外科治療方法、這些治療方法包括但不限于、對(duì)生物體進(jìn)行外科手術(shù)、提供心血管機(jī)械修復(fù)假體、血管重建術(shù)、冠狀動(dòng)脈再灌注、導(dǎo)管摘除術(shù)、為患者提供可植入的心臟電復(fù)律器除顫器、機(jī)械性循環(huán)支持或它們的組合?？捎糜诒景l(fā)明的機(jī)械性循環(huán)支持的非限制性例子包括主動(dòng)脈內(nèi)氣囊對(duì)抗搏動(dòng)法、左心室輔助裝置或它們的組合。E.藥物制劑和向病人給藥的途徑考慮到臨床應(yīng)用，將藥物組合物制備成適合于應(yīng)用的形式。通常，這需要制備基本無(wú)熱原質(zhì)和其它對(duì)人或動(dòng)物可能有害的雜質(zhì)的組合物。通常，需要采用合適的鹽和緩沖液來(lái)產(chǎn)生穩(wěn)定的和可以被靶細(xì)胞攝取的遞送載體。當(dāng)將重組細(xì)胞引入病人時(shí)，也使用緩沖液。本發(fā)明的水相組合物包含有效量的溶解或分散于藥學(xué)上可接受運(yùn)載體或水相介質(zhì)中的載體或細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上或藥理上可接受的”指當(dāng)給予動(dòng)物或人時(shí)，不產(chǎn)生不良的、過敏或其它不利反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。本文所用的“藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體”包括可用于配制藥物，如適于給予人的藥物的溶劑、緩沖液、溶液、分散介質(zhì)、包衣劑、抗菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。用于藥學(xué)活性物質(zhì)的這些介質(zhì)和制劑的用途是本領(lǐng)域公知的。除了迄今已知與本發(fā)明活性成分不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或制劑外，也考慮用于治療組合物中。也可將補(bǔ)充的活性成分摻入該組合物中，只要它們不使組合物的載體或細(xì)胞失活。本發(fā)明的活性組合物可包括經(jīng)典的藥學(xué)制劑。可通過任何常規(guī)途徑給予本發(fā)明的這些組合物，只要通過該途徑可到達(dá)靶組織。這包括口服、鼻腔或含服?；蛘撸梢云?nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，或直接注射入心臟組織給藥。如上所述，通常以藥學(xué)上可接受的組合物給予這些組合物。也可經(jīng)胃腸道外或腹腔內(nèi)給予該活性化合物。為了說明，可用適當(dāng)混有表面活性劑，如羥丙基纖維素的水制備該活性化合物的游離堿或藥理上可接受的鹽溶液。也可用甘油、液體聚乙二醇和它們的混合物以及用油制備分散液。在普通的儲(chǔ)存和使用條件下，這些制劑通常含有防腐劑，以防止微生物生長(zhǎng)。適合注射用的藥物形式包括，例如，無(wú)菌水溶液或分散液和可用于即時(shí)制備的無(wú)菌可注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末。通常，這些制劑應(yīng)無(wú)菌，其流動(dòng)性易于注射。在制造和儲(chǔ)存的條件下，制劑應(yīng)穩(wěn)定，應(yīng)能抵抗微生物，如細(xì)菌和真菌的污染作用。合適的溶劑或分散介質(zhì)可包括，例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)，它們的合適混合物和植物油?？赏ㄟ^，例如使用包衣劑，如卵磷脂維持合適的流動(dòng)性，對(duì)于分散液可用表面活性劑維持所需粒度?？赏ㄟ^各種抗菌劑和抗真菌劑，如對(duì)羥基苯甲酸脂類、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等防止微生物的作用。在很多情況下，將優(yōu)選包括等滲劑，如糖或氯化鈉。通過與延遲吸收劑，如單硬脂酸鋁和明膠組合，可以實(shí)現(xiàn)可注射組合物的延長(zhǎng)吸收?？赏ㄟ^將合適量的活性化合物與任何其它所需成分(例如，上述所列)一起摻入溶劑中，然后過濾除菌來(lái)制備無(wú)菌注射液。通常，通過將各種無(wú)菌活性成分摻入含有基本分散介質(zhì)和所需其它成分(如上述所列)的無(wú)菌載體來(lái)制備分散液。在用于制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉末時(shí)，優(yōu)選的方法包括真空干燥和凍干技術(shù)，以此從之前過濾除菌的溶液中產(chǎn)生活性成分加任意附加所需成分的粉末。對(duì)于口服給藥來(lái)說，通常可將本發(fā)明多肽與賦形劑摻和，以不可消化的漱口水和潔齒劑的形式使用?？赏ㄟ^將所需量的活性成分摻入合適的溶劑，如硼酸鈉溶液(Dobell’s溶液)中制備漱口水。另外，可將活性成分摻入含有硼酸鈉、甘油和碳酸氫鉀的消毒水中。也可將活性成分分散到潔齒劑，包括凝膠、膏、粉和漿中?？梢詫⒅委熡行Я康幕钚猿煞旨尤胙栏嘀?，牙膏可包括水、粘合劑、研磨劑、調(diào)味劑、發(fā)泡劑和濕潤(rùn)劑。通?？蓪⒈景l(fā)明組合物制成中性或鹽形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括，例如，獲自無(wú)機(jī)酸(如鹽酸或磷酸)或有機(jī)酸(如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)的酸加成鹽(與蛋白的游離氨基形成)。與蛋白的游離羧基形成的鹽也可獲自無(wú)機(jī)堿(如氫氧化鈉、鉀、銨、鈣或鐵)或有機(jī)堿(如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等。關(guān)于劑型，優(yōu)選以劑型相容形式和治療有效量給予溶液。該劑型可以容易地以各種劑型，如注射液、藥物釋放膠囊等給予。對(duì)于水溶液的胃腸道外給藥來(lái)說，例如，通常合適地緩沖該溶液，先使用，例如足夠的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲?？梢詫⑦@些水溶液用于，例如，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹腔內(nèi)給藥。優(yōu)選地，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，尤其是依照本發(fā)明公開的內(nèi)容來(lái)使用無(wú)菌水相介質(zhì)。為了說明，可將單劑溶解在1毫升等滲NaCl溶液中，然后加入到1000毫升皮下灌注液體中或在計(jì)劃的注入位點(diǎn)注射，(參見例如，“雷明頓藥物科學(xué)”第15版，第1035-1038和1570-1580頁(yè))。有必要根據(jù)受試者的情況對(duì)劑量作出某些改變。負(fù)責(zé)給藥的人一定要為個(gè)體受試者確定合適的劑量。而且，對(duì)于人的給藥，制劑的無(wú)菌性、致熱性、總的安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該滿足FDA生物制品標(biāo)準(zhǔn)辦公室的要求。V.篩選方法本發(fā)明還包括鑒定用于預(yù)防或治療或逆轉(zhuǎn)心臟肥大或心力衰竭的PKD抑制劑的方法。這些測(cè)定可包括隨機(jī)篩選候選物質(zhì)的大文庫(kù)；另外，該測(cè)定可用于集中在通過結(jié)構(gòu)屬性選擇的具體類別的化合物上，據(jù)信該結(jié)構(gòu)屬性使它們更可能抑制PKD功能。為鑒定PKD抑制劑，人們通常將確定在存在和不存在候選物質(zhì)的情況下PKD的功能。例如，方法通常包括(a)提供候選調(diào)節(jié)劑；(b)將候選調(diào)節(jié)劑與PKD混合；(c)測(cè)量PKD激酶活性；和(d)比較步驟(c)中的活性和不存在候選調(diào)節(jié)劑的情況下的活性，其中測(cè)量到的活性差異說明候選調(diào)節(jié)劑實(shí)際上是該化合物、細(xì)胞或動(dòng)物的調(diào)節(jié)劑。也可在分離的細(xì)胞、器官或在活生物中進(jìn)行測(cè)定。一般地，通過提供未磷酸化的II類HDAC和測(cè)量由PKD加入的標(biāo)記量來(lái)測(cè)量PKD的激酶活性。當(dāng)然應(yīng)該理解，盡管可能沒有找到有效的候選物，但本發(fā)明的所有篩選方法本身是有用的。本發(fā)明提供了篩選這些候選物的方法，而不僅是找到它們的方法。A.調(diào)節(jié)劑本文使用的術(shù)語(yǔ)“候選物質(zhì)”指可能抑制PKD的激酶活性或細(xì)胞功能的任何分子。候選物質(zhì)可以是蛋白或其片段、小分子，或甚至是核酸?？梢宰C明，藥理上最有效的化合物是與已知PKC抑制劑結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物，在本申請(qǐng)中的其它位置列出。用先導(dǎo)化合物幫助開發(fā)改進(jìn)的化合物被稱為“理性藥物設(shè)計(jì)”，不僅包括與已知抑制劑和激活物比較，還包括靶分子結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。理性藥物設(shè)計(jì)的目標(biāo)是產(chǎn)生生物活性多肽或靶化合物的結(jié)構(gòu)類似物。通過建立這些類似物，就可能形成比天然分子活性更高或更穩(wěn)定的藥物，它對(duì)變化具有不同的易感性，或可能影響各種其它分子的功能。在一個(gè)方法中，人們將生成靶分子或其片段的三維結(jié)構(gòu)。這可通過X射線晶體學(xué)、計(jì)算機(jī)建?；蛲ㄟ^兩種方法的組合來(lái)完成。也可能用抗體確證靶化合物、激活物或抑制劑的結(jié)構(gòu)。原則上，該方法產(chǎn)生一個(gè)藥核心，后續(xù)的藥物設(shè)計(jì)可以此為基礎(chǔ)進(jìn)行?？赡芡ㄟ^生成功能、藥理活性抗體的抗-獨(dú)特型抗體而完全回避蛋白晶體學(xué)。作為鏡像的鏡像，預(yù)計(jì)抗獨(dú)特型抗體的結(jié)合位點(diǎn)是原始抗原的類似物。然后，抗-獨(dú)特型抗體可用于從化學(xué)或生物學(xué)生產(chǎn)的肽庫(kù)中鑒定和分離肽。然后，選擇的肽將用作藥核心?？捎帽疚闹忻枋龅纳a(chǎn)抗體的方法，將抗體用作抗原，生成抗-獨(dú)特型抗體。另一方面，人們可以簡(jiǎn)單地從各種商業(yè)資源中購(gòu)得據(jù)信滿足有用藥物基本標(biāo)準(zhǔn)的小分子文庫(kù)，以“強(qiáng)力進(jìn)行”有用化合物的鑒定。篩選這些文庫(kù)，包括組合產(chǎn)生的文庫(kù)(例如，肽文庫(kù))，是快速有效地篩選大量相關(guān)(和不相關(guān))化合物活性的方法。組合方法也通過建立第二、第三和第四代化合物幫助其自身快速發(fā)展出潛在藥物，這些化合物模擬(modeled)具有活性、卻不需要的化合物。候選化合物可包括天然存在的化合物的片段或部分，或也可能是沒有活性的已知化合物的活性組合。建議可將分離自天然來(lái)源，如動(dòng)物、細(xì)菌、真菌、包括樹葉和樹皮的植物來(lái)源和海洋樣品的化合物作為候選物測(cè)定可能有用藥劑的存在。應(yīng)理解，待篩選藥劑也可獲自或合成自化學(xué)組合物或人造化合物。因此，應(yīng)理解本發(fā)明鑒定的候選物質(zhì)可能是從已知抑制劑或刺激物通過理性藥物設(shè)計(jì)的肽、多肽、聚核苷酸、小分子抑制劑或任何其他化合物。其它合適的調(diào)節(jié)劑包括反義分子、核酶和抗體(包括單鏈抗體)，各自對(duì)靶分子具有特異性。在本文中的其它地方更詳細(xì)地描述了這些化合物。例如，結(jié)合到翻譯或轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、或剪接接頭的反義分子是理想的候選抑制劑。除了最初鑒定的調(diào)節(jié)化合物，本發(fā)明者也考慮到可能設(shè)計(jì)其它空間排列類似的化合物，以模仿調(diào)節(jié)劑結(jié)構(gòu)核心部分?？砂恼{(diào)節(jié)劑的肽模擬物的這些化合物可以相同方式用作起始調(diào)節(jié)劑。B.體外測(cè)定進(jìn)行的快速、廉價(jià)和容易的測(cè)定是體外測(cè)定。這些測(cè)定通常使用分離的分子，可以迅速和大量地完成，從而提高在短時(shí)間內(nèi)可獲得的信息量。各種器皿均可用于進(jìn)行這些測(cè)定，包括試管、板、皿和其它表面如標(biāo)尺或珠子。WO84/03564中描述了高通量篩選化合物的技術(shù)。在固體底材，如塑料桿或其它表面上合成大量小肽測(cè)試化合物。可以根據(jù)它們結(jié)合和抑制PKD的能力快速篩選這些肽。C.細(xì)胞內(nèi)測(cè)定本發(fā)明也考慮到根據(jù)化合物在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)PKD的能力篩選化合物。各種細(xì)胞系均可用于這些篩選測(cè)定，包括專門為此目的設(shè)計(jì)的細(xì)胞。D.體內(nèi)測(cè)定體內(nèi)測(cè)定包括使用各種心臟病動(dòng)物模型，包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，它們被設(shè)計(jì)具體特定的缺陷，或載有可用于測(cè)量候選化合物在生物體內(nèi)到達(dá)和影響不同細(xì)胞的能力的標(biāo)記。由于它們的大小、容易操作和它們生理和遺傳構(gòu)成信息，小鼠是優(yōu)選的實(shí)施方式，尤其適于轉(zhuǎn)基因。然而，其它動(dòng)物也是合適的，包括大鼠、家兔、倉(cāng)鼠、豚鼠、沙鼠、土撥鼠、貓、狗、綿羊、山羊、豬、牛、馬和猴(包括黑猩猩、長(zhǎng)臂猿和狒狒)?？梢允褂毛@自這些種的任一動(dòng)物模型進(jìn)行抑制劑的測(cè)定。用測(cè)試化合物處理動(dòng)物將包括以合適形式將化合物給予動(dòng)物。將通過可用于臨床目的的任一途徑給藥。確定化合物在體內(nèi)的有效性可包括各種不同標(biāo)準(zhǔn)，包括但不限于。也可以通過比體外或細(xì)胞內(nèi)測(cè)定更有意義的方式在動(dòng)物中進(jìn)行毒性和劑量反應(yīng)的測(cè)定。VI.純化蛋白需要純化PKD。蛋白純化技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這些技術(shù)在一個(gè)水平上包括，將細(xì)胞整體粗分成多肽和非-多肽部分。將多肽與其它蛋白分離后，可用層析或電泳技術(shù)將感興趣的多肽進(jìn)一步純化，以達(dá)到部分或完全純化(或純化至同質(zhì))。尤其適用于純肽制備的分析方法是離子交換層析，排阻層析；聚丙烯酰胺凝膠電泳；等電點(diǎn)聚焦。尤其有效的純化肽的方法是快速蛋白液相層析或甚至HPLC。本發(fā)明某些方面涉及編碼蛋白或肽的純化，在具體實(shí)施方式中，是基本純化。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“純化的蛋白或肽”意指可分離自其它組分的組合物，其中該蛋白或肽相對(duì)于其天然可獲得狀態(tài)純化至任意程度。因此，純化蛋白或肽也指從其天然存在的環(huán)境中游離出的蛋白或肽。通常，“純化的”將指已進(jìn)行分級(jí)以去除各種其它組分的蛋白或肽組合物，組合物基本保持其表達(dá)的生物活性。其中使用術(shù)語(yǔ)“基本純化”，該術(shù)語(yǔ)指一種組合物，其中蛋白或肽形成該組合物的主要組分，如占組合物中蛋白的約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％或更多。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開，將知曉定量蛋白或肽純化程度的各種方法。這些方法包括，例如，確定活性部分的特異活性，或通過SDS/PAGE分析在某部分內(nèi)評(píng)價(jià)多肽量。評(píng)價(jià)某部分純度的優(yōu)選方法是計(jì)算該部分的特異活性，將其與最初抽提物的特異活性比較，從而計(jì)算純度，本文評(píng)價(jià)為“純化倍數(shù)”。當(dāng)然，用于代表活性量的實(shí)際單位將取決于根據(jù)純化和是否表達(dá)的蛋白或肽表現(xiàn)出可檢測(cè)的活性而選擇的具體測(cè)定技術(shù)。各種適用于蛋白純化的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些技術(shù)包括，例如，用硫酸銨、PEG、抗體等或通過加熱變性而沉淀，然后離心；層析步驟如離子交換、凝膠過濾、反向、羥磷灰石和親核層析；等電點(diǎn)聚焦；凝膠電泳；和這些和其它技術(shù)的組合。如本領(lǐng)域所公知的，相信進(jìn)行各種純化步驟的順序可以改變，或某些步驟可以省略，仍然產(chǎn)生用于制備基本純化的蛋白或肽的合適方法。并沒有總的要求總是以最純化狀態(tài)提供蛋白或肽。實(shí)際上，考慮了在某些實(shí)施方式中可使用基本純化的更少產(chǎn)物?？梢酝ㄟ^在組合中使用更少的純化步驟，或通過使用相同總純化方案的不同形式來(lái)完成部分純化。例如，應(yīng)理解用HPLC設(shè)備進(jìn)行的陽(yáng)離子交換柱層析通常將導(dǎo)致比用低壓層析系統(tǒng)的相同技術(shù)的純化“倍數(shù)”更高。具有較低相關(guān)純化程度的方法在總的蛋白產(chǎn)物回收方面，或在維持表達(dá)蛋白的活性方面會(huì)具有優(yōu)勢(shì)。已知在不同的SDS/PAGE條件下多肽的遷移可改變，有時(shí)還很明顯(Capaldi等，1977)。因此應(yīng)理解，在不同電泳條件下，顯示出的純化或部分純化表達(dá)產(chǎn)物的分子量可能改變。高效液相色譜(HPLC)以快速分離并具有出色的峰分辨率為特征。這通過使用非常精細(xì)的顆粒和高壓，以維持足夠流速來(lái)實(shí)現(xiàn)。大約幾分鐘、或最多一小時(shí)內(nèi)就可完成分離。而且，僅需要很小體積的樣品，因?yàn)樵擃w粒是很小且緊密封裝的，使空隙體積占柱床體積的很小部分。樣品濃度也不需要很高，因?yàn)槠錀l帶很窄，樣品幾乎沒有稀釋。凝膠層析或分子篩層析是基于分子量的特殊分配層析類型。凝膠層析背后的理論是，用含有小孔的惰性物質(zhì)的微小顆粒制備的柱子，在分子通過或傳送到小孔時(shí)，根據(jù)它們的大小從較小分子中分離較大分子。只要制成顆粒的材料不吸收該分子，那么確定流速的唯一因素是大小。因此，只要其形狀是相對(duì)不變的，分子就以大小降低的方式從柱中洗脫出來(lái)。對(duì)于分離不同大小的分子，凝膠層析是非常卓越的，因?yàn)榉蛛x不依賴于所有其它因素，如pH、離子強(qiáng)度、溫度等。實(shí)質(zhì)上也沒有吸收，更小的區(qū)域擴(kuò)展和洗脫體積簡(jiǎn)單地與分子量相關(guān)。親和層析是依賴待分離物質(zhì)和它可特異性結(jié)合的分子之間特異性親和力的層析過程。這是受體-配體類型的相互作用。通過將結(jié)合對(duì)的一方共價(jià)偶聯(lián)到不溶性基質(zhì)上合成該柱材料。然后，該柱材料能夠從溶液中特異性吸收該物質(zhì)。通過將條件改變?yōu)椴粫?huì)發(fā)生結(jié)合的條件(改變pH、離子強(qiáng)度、溫度等)進(jìn)行洗脫。用于純化含有碳水化合物的親和層析具體類型是凝集素親和層析。凝集素是一類與各種多糖和糖蛋白結(jié)合的物質(zhì)。凝集素通常通過溴化氰與瓊脂糖偶聯(lián)。與瓊脂糖偶聯(lián)的伴刀豆球蛋白(Conconavalin)A是第一個(gè)使用的這類材料，已經(jīng)廣泛用于分離多糖和糖蛋白。其它凝集素包括小扁豆凝集素、已用于純化N-乙酰基葡糖胺殘基的小麥胚芽凝集素和勃艮第蝸牛(Helixpomatia)凝集素。用使用碳水化合物配體的親和層析純化凝集素本身。用半乳糖從蓖麻子和花生中純化凝集素；麥芽糖用于從小扁豆和刀豆中抽提凝集素；N-乙?；?D葡糖胺用于從黃豆中純化凝集素；N-乙酰葡糖胺基與來(lái)自小麥胚芽的凝集素結(jié)合；D-葡糖胺用于從蛤中獲得凝集素，L-海藻糖將結(jié)合蓮中的凝集素?；|(zhì)應(yīng)該是本身不以任何明顯程度吸收分子的物質(zhì)，并且具有較寬的化學(xué)、物理和熱穩(wěn)定性范圍。配體應(yīng)該以不影響其結(jié)合性質(zhì)的方式偶聯(lián)。配體也應(yīng)提供相對(duì)緊密的結(jié)合。應(yīng)可能在不破壞樣品或配體的情況下洗脫物質(zhì)。最常見的親和層析形式之一是免疫親和層析。下面描述適用于本發(fā)明的抗體的產(chǎn)生。VII.克隆載體、基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)在某些實(shí)施方式中，用表達(dá)載體表達(dá)PKD多肽產(chǎn)物，然后純化該產(chǎn)物。在其它實(shí)施方式中，該表達(dá)載體可用于基因治療。表達(dá)需要載體中提供合適的信號(hào)，包括各種調(diào)節(jié)元件，如來(lái)自病毒和哺乳動(dòng)物來(lái)源的在宿主細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)感興趣基因表達(dá)的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子。也定義了設(shè)計(jì)用于使信使RNA穩(wěn)定性和在宿主細(xì)胞中的可翻譯性最優(yōu)化的元件，使信使RNA穩(wěn)定性最優(yōu)化，也確定在宿主細(xì)胞中的可翻譯性。也提供了為建立表達(dá)該產(chǎn)物的永久、穩(wěn)定的細(xì)胞克隆，使用很多顯性藥物選擇標(biāo)記的條件，或者說是將藥物選擇標(biāo)記的表達(dá)與多肽表達(dá)相聯(lián)系的元件。A.調(diào)節(jié)元件該申請(qǐng)全文中的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)構(gòu)建物”意于包括含有編碼基因產(chǎn)物的核酸的任意類型遺傳構(gòu)建物，其中編碼序列的部分或全部核酸能夠被轉(zhuǎn)錄。可將轉(zhuǎn)錄物翻譯成蛋白，但不必如此。在某些實(shí)施方式中，表達(dá)包括基因轉(zhuǎn)錄和mRNA翻譯成基因產(chǎn)物。在其它實(shí)施方式中，表達(dá)僅包括轉(zhuǎn)錄編碼感興趣基因的核酸。在某些實(shí)施方式中，編碼基因產(chǎn)物的核酸在啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下。“啟動(dòng)子”指細(xì)胞合成機(jī)器或引入的合成機(jī)器識(shí)別的DNA序列，需要它起始特異的基因轉(zhuǎn)錄。術(shù)語(yǔ)“在轉(zhuǎn)錄控制下”指相對(duì)于該核酸，啟動(dòng)子在正確位置和方向上，以控制RNA聚合酶起始和表達(dá)該基因。這里用術(shù)語(yǔ)啟動(dòng)子指簇集在RNA聚合酶II起始位點(diǎn)周圍的轉(zhuǎn)錄控制模塊群。關(guān)于啟動(dòng)子如何組織的很多想法得自對(duì)幾個(gè)病毒啟動(dòng)子的分析，包括對(duì)HSV胸腺嘧啶激酶(tk)和SV40早期轉(zhuǎn)錄單位的分析。這些研究，加上最近的很多工作，顯示出啟動(dòng)子由不連續(xù)的功能模塊構(gòu)成，這些功能模塊各自由約7-20bp的DNA組成，并含有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄激活或抑制蛋白的識(shí)別位點(diǎn)。各啟動(dòng)子中至少一個(gè)模塊的功能是為RNA合成定位起始位點(diǎn)。最為熟知的實(shí)例是TATA框，但是在一些缺少TATA框的啟動(dòng)子中，如哺乳動(dòng)物末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶基因的啟動(dòng)子和SV40后期基因的啟動(dòng)子，位于起始位點(diǎn)本身上的不連續(xù)元件幫助固定起始的位置。附加啟動(dòng)子元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率。一般地，這些元件定位于起始位點(diǎn)上游30-110bp的區(qū)域，雖然最近很多啟動(dòng)子顯示出在起始位點(diǎn)下游也含有功能元件。啟動(dòng)子元件之間的間隔經(jīng)常是可變的，以致在元件被反轉(zhuǎn)或互相移動(dòng)時(shí)保持啟動(dòng)子功能。在tk啟動(dòng)子中，活性開始下降前，啟動(dòng)子元件之間的間隔可增加到50bp遠(yuǎn)。根據(jù)啟動(dòng)子來(lái)看，似乎單個(gè)元件可合作地或獨(dú)立地用作激活轉(zhuǎn)錄。在某些實(shí)施方式中，將使用天然PKD啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)相應(yīng)的PKD基因、異源PKD基因、可篩選或可選擇性的標(biāo)記基因、或任何其它感興趣基因的表達(dá)。在其它實(shí)施方式中，可使用人巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期基因啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)、大鼠胰島素啟動(dòng)子和甘油醛-3-磷酸脫氫酶以獲得感興趣編碼序列的高水平表達(dá)。也考慮了使用本領(lǐng)域公知的其它病毒或哺乳動(dòng)物細(xì)胞或噬菌體啟動(dòng)子來(lái)完成感興趣編碼序列的表達(dá)，只要表達(dá)水平足夠給定目的之需。通過使用具有公知性質(zhì)的啟動(dòng)子，可使轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化后感興趣蛋白的表達(dá)水平和模式最優(yōu)化。而且，選擇響應(yīng)于具體生理信號(hào)而進(jìn)行調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，可允許基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)表達(dá)。在本
發(fā)明內(nèi)容中，表1和2列出了幾個(gè)可以使用的調(diào)節(jié)元件，以調(diào)節(jié)感興趣基因的表達(dá)。該列表并未詳盡地列舉涉及啟動(dòng)基因表達(dá)的所有可能元件，而僅是它們的范例。增強(qiáng)子是從位于相同DNA分子上較遠(yuǎn)位置的啟動(dòng)子增加轉(zhuǎn)錄的遺傳元件。增強(qiáng)子的組織方式和啟動(dòng)子很相似。即，它們由很多單個(gè)元件組成，各自與一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄蛋白結(jié)合。增強(qiáng)子和啟動(dòng)子之間的基本差別是操作上的。增強(qiáng)子區(qū)，作為一個(gè)整體必須能夠在遠(yuǎn)處促進(jìn)轉(zhuǎn)錄；對(duì)于啟動(dòng)子區(qū)或其組成元件則不需如此。另一方面，啟動(dòng)子必須有一個(gè)或多個(gè)元件，將RNA合成的起始導(dǎo)向具體位點(diǎn)和具體方向，然而增強(qiáng)子缺少這些特性。啟動(dòng)子和增強(qiáng)子經(jīng)常是重疊和鄰接的，它們經(jīng)?？瓷先ゾ哂蟹浅ｎ愃频哪K組織結(jié)構(gòu)。下面是病毒啟動(dòng)子、細(xì)胞啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和誘導(dǎo)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的列表，可將它們與表達(dá)構(gòu)建物中編碼感興趣基因的核酸結(jié)合使用(表1和表2)。此外，也可使用任何啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合(按照真核啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù)EPDB)來(lái)驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。如果提供合適的細(xì)菌聚合酶，真核細(xì)胞可以支持從某些細(xì)菌啟動(dòng)子進(jìn)行胞漿轉(zhuǎn)錄，作為部分輸送復(fù)合物或作為附加遺傳表達(dá)構(gòu)建物。具體感興趣的是肌肉特異性啟動(dòng)子，更具體說是心臟特異性啟動(dòng)子。這些包括肌球蛋白輕鏈-2啟動(dòng)子(Franz等，1994；Kelly等，1995)、α肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(Moss等，1996)、肌鈣蛋白1啟動(dòng)子(Bhavsar等，1996)；Na+/Ca2+交換子啟動(dòng)子(Barnes等，1997)、抗肌萎縮蛋白啟動(dòng)子(Kimura等，1997)、α7整合素啟動(dòng)子(Ziober和Kramer，1996)、腦促尿鈉排泄肽啟動(dòng)子(LaPointe等，1996)和αB-晶體蛋白/小熱激蛋白啟動(dòng)子(Gopal-Srivastava，1995)、α肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子(Yamauchi-Takihara等，1989)和ANF啟動(dòng)子(LaPointe等，1988)。在使用cDNA插入物的地方，一般會(huì)需要包括聚腺苷酸化信號(hào)，以影響基因轉(zhuǎn)錄物的合適聚腺苷酸化。相信對(duì)本發(fā)明實(shí)踐來(lái)說，聚腺苷酸化信號(hào)的性質(zhì)并不重要，可以使用任何這些序列，如人生長(zhǎng)激素和和SV40聚腺苷酸化信號(hào)。也認(rèn)為終止子是表達(dá)盒的元件。這些元件可用于增加信息水平并使從盒到其它序列的連讀最小化。B.可選擇性標(biāo)記在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，細(xì)胞含有本發(fā)明的核酸構(gòu)建物，可通過在表達(dá)構(gòu)建物中包括標(biāo)記以在體外或體內(nèi)鑒定細(xì)胞。這些標(biāo)記會(huì)賦予細(xì)胞可鑒定的改變，以允許容易地鑒定含有表達(dá)構(gòu)建物的細(xì)胞。通常，包含藥物選擇標(biāo)記有助于克隆和選擇轉(zhuǎn)化子，例如，賦予耐新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、零霉素和組氨醇的基因是有用的可選擇性標(biāo)記。另外，可使用酶，如單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)或氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT)。也可使用免疫標(biāo)記。相信所用可選擇性標(biāo)記并不重要，只要它能夠與編碼基因產(chǎn)物的核酸同時(shí)表達(dá)?？蛇x擇性標(biāo)記的其它實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。C.多基因構(gòu)建物和IRES在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，用內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)元件建立多基因、或多順反子信息。IRES元件能夠繞過5’甲基化帽依賴性翻譯的核糖體掃描模型，并在內(nèi)部位點(diǎn)開始翻譯(Pelletier和Sonenberg，1988)。已描述了來(lái)自picano病毒科中兩個(gè)成員(脊髓灰質(zhì)炎和腦心肌炎病毒)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及來(lái)自哺乳動(dòng)物信息的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可以與異源開放閱讀框連接。多開放閱讀框可一起轉(zhuǎn)錄，各自被IRES分開，建立多順反子信息。依靠IRES元件，核糖體可到達(dá)各開放閱讀框，以有效翻譯?？梢杂脝蝹€(gè)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子有效表達(dá)多個(gè)基因，轉(zhuǎn)錄成單條信息?？蓪⑷魏萎愒撮_放閱讀框與IRES元件連接。這包括分泌蛋白，多亞基蛋白、獨(dú)立基因編碼的、胞內(nèi)或膜結(jié)合蛋白和可選擇性標(biāo)記的基因。以這種方式，可用單個(gè)構(gòu)建物和單個(gè)可選擇性標(biāo)記將幾種蛋白的表達(dá)同時(shí)工程改造到一個(gè)細(xì)胞中。D.表達(dá)載體的遞送有多種方式可將表達(dá)載體引入細(xì)胞。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，表達(dá)構(gòu)建物包含病毒或獲自病毒基因組的工程改造構(gòu)建物。某些病毒通過受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，以摻入宿主細(xì)胞基因組并穩(wěn)定和有效地表達(dá)病毒基因的能力使它們成為將外源基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的誘人的候選物(Ridgeway，1988；Nicolas和Rubenstein，1988；Baichwal和Sugden，1986；Temin，1986)。首先用作基因載體的病毒是DNA病毒，包括乳頭狀多瘤空泡病毒(猿病毒40，牛乳頭瘤病毒和多瘤病毒)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986)和腺病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986)。這些病毒對(duì)外源性DNA序列的容量較低，具有受限的宿主譜。而且，它們?cè)诟惺軕B(tài)細(xì)胞中的致癌可能性和引起細(xì)胞病變的效果引起了人們對(duì)安全性的關(guān)注。它們僅可容納長(zhǎng)至8kB的外源性遺傳物質(zhì)，但可容易地引入各種細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986)。用于體內(nèi)遞送的優(yōu)選方法之一包括使用腺病毒表達(dá)載體。“腺病毒表達(dá)載體”意于包括含有足夠(a)支持構(gòu)建物包裝和(b)表達(dá)其中克隆的反義聚核苷酸的腺病毒序列的構(gòu)建物。在本文中，表達(dá)不需要合成基因產(chǎn)物。表達(dá)載體包含腺病毒的遺傳工程改造形式。所知的腺病毒的遺傳結(jié)構(gòu)是36kB、線性、雙鏈DNA病毒，這允許用長(zhǎng)達(dá)7kB的外源性序列取代大段的腺病毒DNA(Grunhaus和Horwitz，1992)。與逆轉(zhuǎn)錄病毒相反，腺病毒感染宿主細(xì)胞并不產(chǎn)生染色體整合，因?yàn)橄俨《綝NA可以游離基因(episomal)的方式復(fù)制，而沒有潛在的基因毒性。腺病毒也是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的，在大量擴(kuò)增后，并沒有檢測(cè)到基因組重排。腺病毒實(shí)質(zhì)上可感染所有上皮細(xì)胞，不管其處于哪個(gè)細(xì)胞周期階段。迄今，腺病毒感染似乎僅與輕微的疾病有關(guān)，如人類的急性呼吸道疾病。腺病毒因?yàn)槠渲械却笮〉幕蚪M、容易操縱、高滴度、靶細(xì)胞范圍寬和高感染活性，尤其適于用作基因轉(zhuǎn)移載體。病毒基因組的兩端都包含100-200個(gè)堿基對(duì)的反向重復(fù)序列(ITR)，它是病毒DNA復(fù)制和包裝必需的順式元件?；蚪M的早期(E)和后期(L)區(qū)含有不同的轉(zhuǎn)錄單元，它們被病毒DNA復(fù)制的開始處分開。E1區(qū)(E1A和E1B)編碼負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)病毒基因組和幾個(gè)細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄的蛋白。E2區(qū)(E2A和E2B)的表達(dá)導(dǎo)致病毒DNA復(fù)制蛋白的合成。這些蛋白涉及DNA復(fù)制、后期基因表達(dá)和宿主細(xì)胞中斷(shut-off)(Renan，1990)。包括大部分病毒衣殼蛋白的后期基因的產(chǎn)物僅在單個(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)錄物明顯加工之后表達(dá)，初級(jí)轉(zhuǎn)錄物由主要后期啟動(dòng)子(MLP)產(chǎn)生。MLP(位于16.8m.u.)在感染后期尤其有效，所有該啟動(dòng)子產(chǎn)生的mRNA都具有5’-三分先導(dǎo)(TPL)序列，這使它們成為進(jìn)行翻譯的優(yōu)選mRNA。在當(dāng)前系統(tǒng)中，由穿梭載體和前病毒載體之間的同源重組產(chǎn)生重組腺病毒。由于兩種前病毒載體之間可能重組，可通過該方法產(chǎn)生野生型腺病毒。因此，從單獨(dú)的噬菌斑中分離單個(gè)病毒克隆并檢查其基因組結(jié)構(gòu)是重要的。產(chǎn)生和增殖現(xiàn)有的復(fù)制缺陷的腺病毒載體，取決于獨(dú)特的協(xié)助細(xì)胞系，稱為293，它由Ad5DNA片段轉(zhuǎn)化人胚腎細(xì)胞而得，連續(xù)表達(dá)E1蛋白(Graham等，1977)。因?yàn)镋3區(qū)是腺病毒基因組中非必需的(Jones和Shenk，1978)，所以現(xiàn)有的腺病毒載體，在293細(xì)胞的協(xié)助下，在E1、D3或這兩個(gè)區(qū)域中攜帶外源性DNA(Graham和Prevec，1991)。實(shí)際上，腺病毒可包裝約105％的野生型基因組(Ghosh-Choudhury等，1987)，提供的DNA容量約多2kb。與E1和E3區(qū)中約5.5kb的可替代DNA結(jié)合時(shí)，現(xiàn)有腺病毒載體的最大容量低于7.5kb，或約占載體總長(zhǎng)的15％。多于80％的腺病毒病毒基因組保留在載體骨架上，這是載體-產(chǎn)生的細(xì)胞毒性的來(lái)源。E1-缺失病毒的復(fù)制缺陷也是不完全的。協(xié)助細(xì)胞系可獲自人細(xì)胞，如人胚腎細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、造血細(xì)胞或其它人胚間葉細(xì)胞或上皮細(xì)胞。另外，協(xié)助細(xì)胞可獲自可感受人腺病毒的其它哺乳動(dòng)物種的細(xì)胞。這些細(xì)胞包括，例如，Vero細(xì)胞或其它猴胚間葉細(xì)胞或上皮細(xì)胞。如上所述，優(yōu)選的協(xié)助細(xì)胞系是293。Racher等(1995)公開了培養(yǎng)293細(xì)胞和增殖腺病毒的改進(jìn)方法。在一種形式中，通過將單個(gè)細(xì)胞接種到含有100-200毫升培養(yǎng)基的1升硅化旋轉(zhuǎn)燒瓶中生長(zhǎng)獲得天然細(xì)胞集合(Techne，Cambridge，UK)。以40rpm攪拌后，用臺(tái)盼藍(lán)估計(jì)細(xì)胞活力。在另一種形式中，如下所述地使用Fibra-Cel微運(yùn)載體(BibbySterlin，Stone，UK)(5克/升)。將重懸于5毫升培養(yǎng)基中的細(xì)胞接種體加入到250毫升錐形燒瓶中的運(yùn)載體(50毫升)中并靜置，偶爾攪拌，1至4小時(shí)。然后用50毫升新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，開始振蕩。對(duì)于病毒生產(chǎn)來(lái)說，允許細(xì)胞長(zhǎng)至約80％匯合，然后更換培養(yǎng)基(至最終體積的25％)，以MOIO.05加入腺病毒。將培養(yǎng)物靜置過夜，然后將體積增加到100％，開始再次振蕩72小時(shí)。不同于要求腺病毒載體是復(fù)制缺陷的，或至少是條件缺陷的，相信腺病毒載體的性質(zhì)對(duì)本發(fā)明的成功實(shí)踐并不重要。腺病毒可以是42個(gè)不同的已知血清型或A-F亞組中任意一種。亞組C的5型腺病毒是優(yōu)選的起始材料，以獲得用于本發(fā)明的條件復(fù)制缺陷型腺病毒載體。這是因?yàn)?型腺病毒是人腺病毒，大量關(guān)于它的生化和遺傳信息是已知的，它在歷史上已用于腺病毒用作載體的大部分構(gòu)建物。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的典型載體是復(fù)制缺陷型，不會(huì)有腺病毒E1區(qū)。因此，從去除了E1-編碼序列的位置上引入編碼感興趣基因的聚核苷酸將是最方便的。然而，腺病毒序列內(nèi)插入構(gòu)建物的位置對(duì)于本發(fā)明來(lái)說并不重要。也可將編碼感興趣基因的聚核苷酸插入E3替代載體中缺失E3區(qū)的地方，如Karlsson等(1986)所述，或插入?yún)f(xié)助細(xì)胞系或協(xié)助病毒補(bǔ)足E4缺失的E4區(qū)中。在體外和體內(nèi)，腺病毒容易培養(yǎng)和操縱，并顯示出寬宿主范圍?？梢愿叩味?，例如，每毫升109-1012噬斑形成單位獲得該群病毒，它們具有高感染性。腺病毒的生命周期不需要摻入宿主細(xì)胞基因組中。腺病毒載體遞送的基因是游離的，因此對(duì)宿主細(xì)胞的基因毒性低。用野生型腺病毒接種疫苗的研究中未報(bào)道副作用(Couch等，1963；Top等，1971)，證明其作為體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移載體的安全性和治療潛力。腺病毒載體已用于真核基因表達(dá)(Levrero等，1991；Gomez-Foix等，1992)和疫苗開發(fā)(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1991)。最近，動(dòng)物研究提示重組腺病毒可用于基因治療(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991；Stratford-Perricaudet等，1990；Rich等，1993)。將重組腺病毒給予不同組織的研究包括氣管滴注(Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1992)、肌肉注射(Ragot等，1993)、外周靜脈內(nèi)注射(Herz和Gerard，1993)和定向接種到腦中(LeGalLaSalle等，1993)。逆轉(zhuǎn)錄病毒是一組單鏈RNA病毒，其特征為在感染細(xì)胞中能夠通過逆轉(zhuǎn)錄過程將它們的RNA轉(zhuǎn)化成雙鏈(Coffin，1990)。然后，產(chǎn)生的DNA作為前病毒穩(wěn)定地?fù)饺爰?xì)胞染色體，指導(dǎo)病毒蛋白的合成。整合導(dǎo)致病毒基因序列保留在受體細(xì)胞和它的后代中。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有三個(gè)基因，gag、pol和env，它們分別編碼衣殼蛋白、聚合酶和包膜組件。在gag基因上游發(fā)現(xiàn)的序列包含將基因組包裝到病毒粒子中的信號(hào)。在病毒基因組的5’和3’末端存在兩個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)序列。它們包含強(qiáng)力啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列，也是摻入宿主細(xì)胞基因組所必需的(Coffin，1990)。為了構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將編碼感興趣基因的核酸插入病毒基因組中，代替某些病毒序列，產(chǎn)生復(fù)制缺陷型病毒。為了產(chǎn)生病毒粒子，構(gòu)建含有g(shù)ag、pol和env基因但不含LTR的包裝細(xì)胞系和包裝組件(Mann等，1983)。當(dāng)將含有cDNA與逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR和包裝序列的重組質(zhì)粒引入該細(xì)胞系時(shí)(例如通過磷酸鈣沉淀)，包裝序列允許將重組質(zhì)粒的RNA轉(zhuǎn)錄物包裝到病毒顆粒中，然后病毒顆粒被分泌到培養(yǎng)基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。然后收集含有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，任選地濃縮，并用于基因轉(zhuǎn)移。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠感染很多種細(xì)胞類型。然而，整合和穩(wěn)定表達(dá)需要宿主細(xì)胞進(jìn)行分裂(Paskind等，1975)。最近，根據(jù)通過將乳糖殘基化學(xué)加成到病毒包膜上而化學(xué)修飾逆轉(zhuǎn)錄病毒，開發(fā)了設(shè)計(jì)用于特異性靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的全新方法。該修飾可允許通過唾液酸糖蛋白受體特異性感染肝細(xì)胞。設(shè)計(jì)了一個(gè)不同的靶向重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法，該方法中使用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白和抗特異性細(xì)胞受體的生物素化抗體。通過生物素組件用抗生物素蛋白鏈菌素偶聯(lián)這些抗體(Roux等，1989)。用抗主要組織相容性復(fù)合體I類和II類抗原的抗體，他們證明了親嗜性病毒體外感染各種帶有那些表面抗原的人細(xì)胞(Roux等，1989)。在本發(fā)明的所有方面，對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的用途有某些限制。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通常整合入細(xì)胞基因組中的隨機(jī)位點(diǎn)。這可導(dǎo)致通過中斷宿主基因或通過插入可干擾側(cè)翼基因功能的病毒調(diào)節(jié)序列進(jìn)行插入誘變(Varmus等，1981)。使用缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中另一引人關(guān)注的問題是在包裝細(xì)胞中可能出現(xiàn)野生型復(fù)制競(jìng)爭(zhēng)型病毒。這可能是由重組事件引起，該事件中將來(lái)自重組病毒的完整序列插入到摻入宿主細(xì)胞基因組的gag、pol、env序列上游。然而，現(xiàn)在可用新包裝細(xì)胞系，它應(yīng)該能夠大大降低重組的可能(Markowitz等，1988；Hersdorffer等，1990)。其它病毒載體可在本發(fā)明中用作表達(dá)構(gòu)建物?？墒褂毛@自病毒，如牛痘病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)腺相關(guān)病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Hermonat和Muzycska，1984)和皰疹病毒的載體。它們具有適用于各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的幾種誘人特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。通過識(shí)別缺陷型乙肝病毒，我們對(duì)不同病毒序列的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系有了新的認(rèn)識(shí)。體外研究顯示，盡管病毒缺失了多達(dá)80％的基因組，它仍可保留依賴協(xié)助的包裝和逆轉(zhuǎn)錄能力(Horwich等，1990)。這提示可用外源性遺傳物質(zhì)替換大部分基因組。對(duì)于肝臟-導(dǎo)向的基因轉(zhuǎn)移來(lái)說，嗜肝性和持續(xù)性(整合)是尤其吸引人的特性。Chang等將氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因引入鴨乙肝病毒基因組代替聚合酶、表面和前表面編碼序列。將該病毒與野生型病毒共轉(zhuǎn)染到禽肝細(xì)胞系中。含有高滴度重組病毒的培養(yǎng)基用于感染初級(jí)小鴨肝細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后至少24天，檢測(cè)到穩(wěn)定的CAT基因表達(dá)(Chang等，1991)。為了實(shí)現(xiàn)正義或反義基因構(gòu)建物的表達(dá)，必須將表達(dá)構(gòu)建物遞送到細(xì)胞中?？审w外如在轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)室程序中，或體內(nèi)或離體如在某些病癥的治療中完成遞送。一種遞送機(jī)制是通過病毒感染，其中將表達(dá)構(gòu)建物包裹在感染性病毒顆粒中。本發(fā)明也考慮了幾種將構(gòu)建物轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的非病毒方法。這些方法包括磷酸鈣沉淀(Graham和VanDerEb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)DEAE-葡聚糖(Gopal，1985)、電穿孔(Tur-Kaspa等，1986；Potter等，1984)、直接顯微注射(Harland和Weintraub，1985)、載有DNA的脂質(zhì)體(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979)和lipofectamine-DNA復(fù)合物、細(xì)胞超聲波降解法(Fechheimer等，1987)、用高速微粒進(jìn)行基因轟擊(Yang等，1990)和受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)。這些技術(shù)中的一部分可成功用于體內(nèi)或離體用途。一旦將表達(dá)構(gòu)建物遞送到細(xì)胞中，編碼感興趣基因的核酸在該細(xì)胞中可能位于和表達(dá)于不同位點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，可以將編碼該基因的核酸穩(wěn)定地整合入細(xì)胞基因組中。該摻入可能通過同源重組發(fā)生在關(guān)聯(lián)位置和方向上(基因替換)或可能摻入隨機(jī)、非特異性位置(基因增加)。在另一實(shí)施方式中，核酸可在細(xì)胞中穩(wěn)定地維持為單獨(dú)、游離節(jié)段的DNA。這些核酸節(jié)段或“游離基因”編碼足夠獨(dú)立于或同步于宿主細(xì)胞周期進(jìn)行維持和復(fù)制的序列。怎樣將表達(dá)構(gòu)建物遞送到細(xì)胞中和核酸保留在細(xì)胞何處取決于所用表達(dá)構(gòu)建物的類型。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，表達(dá)構(gòu)建物可簡(jiǎn)單地由裸重組DNA或質(zhì)粒構(gòu)成?？赏ㄟ^任何上述方法進(jìn)行構(gòu)建物的轉(zhuǎn)移，該方法可以物理或化學(xué)地使細(xì)胞膜通透。這尤其可用于體外轉(zhuǎn)移，但它也可應(yīng)用于體內(nèi)用途。Dubensky等(1984)成功地以磷酸鈣沉淀的形式將多瘤病毒DNA注射到成年和新生小鼠的肝臟和脾臟中，證明了活性病毒復(fù)制和急性感染。Benvenisty和Neshif(1986)也證明直接腹腔內(nèi)注射磷酸鈣沉淀的質(zhì)粒導(dǎo)致轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)?？梢韵胂?，也可將編碼感興趣基因的DNA以類似的方式向體內(nèi)轉(zhuǎn)移，并表達(dá)基因產(chǎn)物。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，將裸DNA表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中可包括顆粒轟擊。該方法依賴于將包裹DNA的微粒加速到允許它們刺穿細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞而不會(huì)殺死細(xì)胞的高速(Klein等，1987)。已經(jīng)開發(fā)了幾種加速小顆粒的裝置。該設(shè)備依賴于高壓放電以產(chǎn)生電流，它反過來(lái)提供原動(dòng)力(Yang等，1990)。所用微粒由生物學(xué)惰性物質(zhì)，如鎢或金珠組成。體內(nèi)轟擊選擇器官，包括大鼠和小鼠的肝臟、皮膚和肌肉組織(Yang等，1990；Zelenin等，1991)。這可能需要對(duì)組織或細(xì)胞進(jìn)行外科處理，以消除槍和靶組織之間的任何介入組織，即離體處理。編碼具體基因的DNA也可通過該方法遞送，并仍通過本發(fā)明整合。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，可將表達(dá)構(gòu)建物包裹到脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體是泡囊狀結(jié)構(gòu)，其特征為磷脂雙層膜和內(nèi)部水相介質(zhì)。多層脂質(zhì)體具有被水相介質(zhì)分開的多個(gè)脂質(zhì)層。當(dāng)磷脂懸浮在過量水溶液中時(shí)，它們自發(fā)形成。在形成閉合結(jié)構(gòu)之前，脂質(zhì)組分進(jìn)行自重排，將水和溶解的溶質(zhì)包裹在脂質(zhì)雙層之間(Ghosh和Bachhawat，1991)。也考慮到lipofectamine-DNA復(fù)合物。脂質(zhì)體介導(dǎo)的核酸遞送和外源性DNA的體外表達(dá)已經(jīng)是非常成功的。Wong等，(1980)證明了脂質(zhì)體介導(dǎo)的遞送和在培養(yǎng)的雞胚、HeLa和肝細(xì)胞中表達(dá)外源性DNA的可行性。Nicolau等，(1987)在大鼠中完成了靜脈注射后成功的脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，可將脂質(zhì)體與紅細(xì)胞凝集病毒(HVJ)復(fù)合。結(jié)果顯示它有助于與細(xì)胞膜的融合并促進(jìn)脂質(zhì)體-包裹的DNA進(jìn)入細(xì)胞(Kaneda等，1989)。在其它實(shí)施方式中，脂質(zhì)體可與核非組蛋白染色體蛋白(HMG-1)復(fù)合或與其聯(lián)合使用(Kato等，1991)。在另外的實(shí)施方式中，該脂質(zhì)體可與HVJ和HMG-1復(fù)合或與其聯(lián)合使用。由于這些表達(dá)構(gòu)建物已成功用于在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)移和表達(dá)核酸，所以它們適用于本發(fā)明。如果將細(xì)菌啟動(dòng)子用于DNA構(gòu)建物，那么也將需要在脂質(zhì)體中包括合適的細(xì)菌聚合酶。其它可用于將編碼具體基因的核酸遞送到細(xì)胞中的表達(dá)構(gòu)建物是受體介導(dǎo)的遞送載體。這些載體利用了在幾乎所有真核細(xì)胞中通過受體介導(dǎo)的胞吞作用對(duì)大分子的選擇性攝取。因?yàn)楦鞣N受體的細(xì)胞類型特異性分布，所以遞送可以是高度特異性的(Wu和Wu，1993)。受體介導(dǎo)的基因靶向載體通常由兩個(gè)組件構(gòu)成細(xì)胞受體特異性配體和DNA結(jié)合劑。幾種配體已用于受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。最廣泛表征的配體是脫唾液酸血清類粘蛋白(ASOR)(Wu和Wu，1987)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(Wagner等，1990)。最近，已將與ASOR識(shí)別相同受體的合成新糖蛋白用作基因遞送載體(Ferkol等，1993；Perales等，1994)，也已將表皮生長(zhǎng)因子(EGF)用于將基因遞送到鱗狀癌細(xì)胞中(Myers，EP00273085)。在其它實(shí)施方式中，遞送載體可包括配體和脂質(zhì)體。例如，Nicolau等，(1987)用乳糖基-神經(jīng)酰胺，一種末端為半乳糖的脫唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂，摻入脂質(zhì)體中，觀察到肝細(xì)胞對(duì)胰島素基因的攝取增加。因此，通過任意數(shù)量受體-配體系統(tǒng)用或不用脂質(zhì)體將編碼具體基因的核酸特異性遞送到細(xì)胞類型中是可行的。例如，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)可用作將核酸介導(dǎo)遞送到細(xì)胞中的受體，該類細(xì)胞顯示出EGF受體上調(diào)?？蓪⒏事短怯糜诎邢蚋渭?xì)胞上的甘露糖受體?？笴D5(CLL)、CD22(淋巴瘤)、CD25(T-細(xì)胞白血病)和MAA(黑色素瘤)的抗體也可類似地用作靶向部分。在某些實(shí)施方式中，在離體條件下可能更容易進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。離體基因治療指從動(dòng)物分離細(xì)胞，將核酸體外遞送到細(xì)胞中，然后將修飾的細(xì)胞送回動(dòng)物體內(nèi)。這可包括從動(dòng)物或細(xì)胞和組織的原代培養(yǎng)物中手術(shù)去除組織/器官。VIII.制造轉(zhuǎn)基因小鼠的方法本發(fā)明的具體實(shí)施方式提供了在啟動(dòng)子的控制下表達(dá)異源PKD基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子的控制下表達(dá)PKD編碼核酸的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，獲自該動(dòng)物的重組細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因胚胎可用于確定PKD在心肌細(xì)胞的發(fā)育和分化以及病理性心臟肥大和心力衰竭發(fā)展中起到的確切作用。而且，這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可提供對(duì)心臟發(fā)育的認(rèn)識(shí)。使用組成型表達(dá)的PKD編碼核酸提供過表達(dá)或表達(dá)下調(diào)的模型。也考慮到“敲除”PKD的一個(gè)或兩個(gè)等位基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在一個(gè)總的方面，通過給定轉(zhuǎn)基因以允許轉(zhuǎn)基因表達(dá)的方式整合入基因組中生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。Wagner和Hoppe(美國(guó)專利4,873,191；引入本文作為參考)以及以整體引入本文作為參考的Brinster等，1985總地描述了生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。通常，通過顯微注射把側(cè)翼連有基因組序列的基因轉(zhuǎn)移到受精卵中。將該顯微注射的卵移植到雌性宿主動(dòng)物體內(nèi)，篩選其后代中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)?？捎稍S多動(dòng)物，包括但不限于爬蟲、兩棲動(dòng)物、鳥類、哺乳動(dòng)物和魚類的受精卵生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物?？赏ㄟ^任何本領(lǐng)域已知手段制備用于顯微注射的DNA克隆。例如，可用適用于去除細(xì)菌質(zhì)粒序列的酶切割用于顯微注射的DNA克隆，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在TBE緩沖液中在1％瓊脂糖凝膠上電泳DNA片段。用溴化乙錠染色使DNA條帶顯色，切下含有表達(dá)序列的條帶。然后將切下的條帶置于含有0.3M乙酸鈉、pH7.0的滲析袋中。將DNA電洗脫到透析袋中，用1∶1的苯酚∶氯仿溶液抽提DNA，并用兩倍體積的乙醇沉淀。將DNA再溶解于1毫升低鹽緩沖液(0.2MNaCl、20mMTris、pH7.4和1mMEDTA)中，在Elutip-DTM柱上純化。首先用3毫升高鹽緩沖液(1MNaCl、20mMTris、pH7.4和1mMEDTA)灌柱，然后用5毫升低鹽緩沖液洗滌。將DNA溶液過柱三次，以使DNA結(jié)合到柱基質(zhì)上。用3毫升低鹽緩沖液洗滌一次后，用0.4毫升高鹽緩沖液洗脫DNA，用兩倍體積的乙醇沉淀。通過紫外分光光度計(jì)中260納米處的吸光度測(cè)量DNA濃度。對(duì)于顯微注射，在5mMTris、pH7.4和0.1mMEDTA中將DNA濃度調(diào)整到3微克/毫升。Palmiter等(1982)和Sambrook等(2001)中描述了用于顯微注射的其他DNA純化方法。在示例性顯微注射步驟中，通過注射5IU的懷孕馬血清促性腺激素(PMSG；Sigma)(0.1毫升，腹腔內(nèi))，48小時(shí)后再注射5IU的人絨毛膜促性腺激素(hCG；Sigma)(0.1毫升，腹腔內(nèi))來(lái)誘導(dǎo)六周齡的雌性小鼠排卵過度。hCG注射后立即將雌性小鼠與雄性放在一起。注射后二十一小時(shí)，用CO2窒息或斷頸法處死交配過的雌性，從切下的輸卵管中回收胚胎，置于含有0.5％牛血清白蛋白(BSA；Sigma)的Dulbecco氏磷酸鹽緩沖液中。用透明質(zhì)酸酶(1毫克/毫升)去除周圍的堆積細(xì)胞。然后洗滌前核胚胎，并置于含有0.5％BSA的Earle氏平衡鹽溶液(EBSS)中，在37.5℃的培養(yǎng)箱中，5％CO2、95％空氣的潮濕環(huán)境下培養(yǎng)，直到注射?？梢栽诙?xì)胞期移植胚胎。將成年雌性小鼠的生理周期隨機(jī)化后，與切除輸精管的雄性配對(duì)?？蓪57BL/6或Swiss小鼠或其他相當(dāng)品系用于此目的。受體雌性與供體雌性同時(shí)交配。在轉(zhuǎn)移胚胎的同時(shí)，通過每克體重腹腔內(nèi)注射0.015毫升2.5％阿佛丁麻醉受體雌性。通過背中線單切開暴露輸卵管。然后在正好位于輸卵管之上的體壁上作切口。然后用鐘表(warchmaker)鉗將卵巢囊撕碎。將待轉(zhuǎn)染胚胎置于DPBS(Dulbecco氏磷酸鹽緩沖液)中，并在移液管的頂端(約10至12個(gè)胚胎)。將移液管頂端插入輸卵管漏斗，轉(zhuǎn)移胚胎。轉(zhuǎn)移后，縫合兩針封閉切口。IX.對(duì)PKD具有活性的抗體在另一方面，本發(fā)明考慮了對(duì)本發(fā)明的PKD分子具有免疫活性的抗體，或其部分?？贵w可以是多克隆或單克隆抗體。在優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體是單克隆抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知制備和表征抗體的方法(參見，例如，Harlow和Lane，1988)。簡(jiǎn)要說，通過用含有本發(fā)明多肽的免疫原免疫動(dòng)物，并從免疫的動(dòng)物中收集抗血清來(lái)制備多克隆抗體。很多動(dòng)物種都可用于生產(chǎn)抗血清。一般地，用于生產(chǎn)抗血清的動(dòng)物是非人動(dòng)物，包括家兔、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豬或馬。因?yàn)榧彝玫难后w積相對(duì)較大，所以家兔是生產(chǎn)多克隆抗體的優(yōu)選選擇。可用常規(guī)免疫技術(shù)制備特異性抗抗原同種型的多克隆和單克隆抗體，如本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所知。含本發(fā)明化合物的抗原表位的組合物可用于免疫一種或多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如家兔或小鼠，然后進(jìn)行抗本發(fā)明化合物的特異性抗體的生產(chǎn)。在經(jīng)過產(chǎn)生抗體的時(shí)間后，簡(jiǎn)單地通過給動(dòng)物放血和從全血中制備血清樣品就可獲得多克隆抗血清。據(jù)推斷，將發(fā)現(xiàn)本發(fā)明單克隆抗體可應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)免疫化學(xué)方法，如ELISA和Western印跡法，和用于免疫組化方法，如組織染色，以及其他可能利用特異性抗PKD相關(guān)抗原表位的抗體的方法?？偟膩?lái)說，抗PKD的多克隆、單克隆和單鏈抗體都可用于各種實(shí)施方式。這些抗體的具體有用應(yīng)用是在純化天然或重組PKD中，例如，用抗體親和柱。根據(jù)本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解所有接受的免疫學(xué)技術(shù)的操作。制備和表征抗體的方法是本領(lǐng)域中公知的(參見，例如，Harlow和Lane，1988；引入本文作為參考)。下面的實(shí)施例中給出了制備單克隆抗體的更具體的實(shí)例。正如本領(lǐng)域中所公知的，給定組合物的免疫原性可以改變。因此，經(jīng)常有必要強(qiáng)化宿主免疫系統(tǒng)，如通過將肽或多肽免疫原偶聯(lián)到運(yùn)載體上所達(dá)到的那樣。示例性和優(yōu)選的運(yùn)載體是鑰孔血藍(lán)素(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其他白蛋白，如卵清蛋白，小鼠血清白蛋白或家兔血清白蛋白也可用作運(yùn)載體。將多肽共軛到運(yùn)載體蛋白上的方法是本領(lǐng)域中公知的，該方法包括戊二醛，間馬來(lái)酰亞胺基苯甲?；?m-maleimidobencoyl)-N-羥基琥珀酰亞胺酯，碳二亞胺和雙二氮化(bis-biazotized)聯(lián)苯胺。也如本領(lǐng)域中所公知的那樣，可以通過使用稱為佐劑的免疫反應(yīng)非特異性刺激物，增強(qiáng)具體免疫原組合物的免疫原性。示例性和優(yōu)選的佐劑包括完全弗氏佐劑(含殺死的結(jié)核分支桿菌的免疫反應(yīng)非特異性刺激物)、不完全弗氏佐劑和氫氧化鋁佐劑。用于生產(chǎn)多克隆抗體的免疫原組合物的量因免疫原性質(zhì)以及用于免疫的動(dòng)物而改變。各種途徑(皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)和腹腔內(nèi))均可用于給予免疫原。可通過在免疫后不同時(shí)間點(diǎn)采集免疫動(dòng)物的血樣來(lái)監(jiān)測(cè)多克隆抗體的生產(chǎn)。也可給予第二次加強(qiáng)注射。重復(fù)進(jìn)行加強(qiáng)和測(cè)定滴度的過程，直到獲得合適的滴度。當(dāng)獲得所需水平的免疫原性時(shí)，將免疫動(dòng)物放血，分離血清并儲(chǔ)存，和/或動(dòng)物可用于產(chǎn)生mAb?？梢酝ㄟ^使用本領(lǐng)域公知技術(shù)，如引入本文作為參考的美國(guó)專利4,196,265中示例的技術(shù)容易地制備MAb。通常，該技術(shù)包括用選擇的免疫原組合物，如純化或部分純化的PKD蛋白、多肽或肽或表達(dá)高水平PKD的細(xì)胞來(lái)免疫合適的動(dòng)物。以有效刺激抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方式給予該免疫組合物。嚙齒類如小鼠和大鼠是優(yōu)選的動(dòng)物，然而，使用家兔、綿羊、蛙細(xì)胞也是可能的。使用大鼠可提供某些優(yōu)點(diǎn)(Goding，1986)，但優(yōu)選小鼠，最優(yōu)選BALB/c小鼠，因?yàn)檫@是最常規(guī)使用的動(dòng)物，通常產(chǎn)生更高百分?jǐn)?shù)的穩(wěn)定融合。免疫后，選擇具有產(chǎn)生抗體的潛能的體細(xì)胞，具體是B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)用于mAb產(chǎn)生方法。這些細(xì)胞可獲自活組織檢查的脾臟、扁桃體或淋巴結(jié)，或獲自外周血樣。優(yōu)選脾細(xì)胞和外周血細(xì)胞，前者是因?yàn)樗鼈兪歉缓幱诜至殉蓾{細(xì)胞階段的抗體產(chǎn)生細(xì)胞的來(lái)源，后者是因?yàn)榭扇菀椎氐玫酵庵苎?。?jīng)常是免疫一系列動(dòng)物，摘除抗體滴度最高的動(dòng)物脾，通過用注射器勻漿脾臟獲得脾淋巴細(xì)胞。一般地，來(lái)自免疫小鼠的脾臟含有大約5×107至2×108個(gè)淋巴細(xì)胞。然后將來(lái)自免疫動(dòng)物的產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞與永生化的骨髓瘤細(xì)胞，通常是與免疫動(dòng)物種相同的骨髓瘤細(xì)胞融合。適用于生產(chǎn)雜交瘤的融合方法的骨髓瘤細(xì)胞系優(yōu)選不生產(chǎn)抗體，具有高融合效率和酶缺陷，酶缺陷使其后來(lái)不能在某些選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，選擇性培養(yǎng)基僅支持所需融合細(xì)胞(雜交瘤)生長(zhǎng)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，可用許多種骨髓瘤細(xì)胞中的任意一種(Goding，1986；Campbell，1984)。例如，免疫動(dòng)物是小鼠時(shí)，人們可使用P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653，NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XXOBul；對(duì)于大鼠來(lái)說，人們可使用R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和4B210；U-266、6M1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和729-6都可用于細(xì)胞融合。產(chǎn)生抗體生產(chǎn)脾臟或淋巴結(jié)細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的雜合子的方法通常包括，在一種或幾種促進(jìn)細(xì)胞膜融合藥劑(化學(xué)或電學(xué))的存在下，按2∶1的比例將體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞混合，但該比例可分別在約20∶1至約1∶1中變化。已經(jīng)描述了使用仙臺(tái)病毒的融合方法(Kohler和Milstein，1975；1976)，Gefter等，(1977)也描述了使用聚乙二醇(PEG)，如37％(v/v)PEG的方法。使用電誘導(dǎo)的融合方法也是合適的(Goding，1986)。融合方法通常以低頻率，大約1×10-6至1×10-8產(chǎn)生存活雜交子。然而，這并不造成問題，因?yàn)榇婊畹娜诤想s交子是通過在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從母代、未融合細(xì)胞(尤其是正常情況下會(huì)繼續(xù)無(wú)限分裂的未融合骨髓瘤細(xì)胞)分化而來(lái)的。該選擇性培養(yǎng)基通常在組織培養(yǎng)基中含有阻斷核苷酸從頭合成的藥劑。示例性和優(yōu)選的藥劑是氨基蝶呤、氨甲蝶呤和重氮絲氨酸。氨基蝶呤和氨甲蝶呤阻斷嘌呤和嘧啶的從頭合成，而重氮絲氨酸僅阻斷嘌呤合成。如果使用了氨基蝶呤或氨甲蝶呤，該培養(yǎng)基需補(bǔ)充有次黃嘌呤和胸腺嘧啶作為核苷酸來(lái)源(HAT培養(yǎng)基)。如果使用重氮絲氨酸，該培養(yǎng)基則需補(bǔ)充有次黃嘌呤。優(yōu)選的選擇性培養(yǎng)基是HAT。只有能進(jìn)行核苷酸補(bǔ)救途徑的細(xì)胞才能夠在HAT培養(yǎng)基中存活。骨髓瘤細(xì)胞缺少補(bǔ)救途徑的關(guān)鍵酶，如次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)，因此它們不能存活。B細(xì)胞可進(jìn)行該途徑，但它們?cè)谂囵B(yǎng)條件中壽命有限，通常在約兩星期內(nèi)死亡。因此，在選擇性培養(yǎng)基中可以存活的細(xì)胞只有骨髓瘤和B-細(xì)胞形成的雜合子。該培養(yǎng)提供了一群雜交瘤，從中選擇特異性雜交瘤。一般地，通過在微量滴定板上稀釋單個(gè)克隆以培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行雜交瘤的選擇，然后測(cè)試單個(gè)克隆上清液(約兩至三星期后)中所需的反應(yīng)性。該測(cè)定應(yīng)該是靈敏、簡(jiǎn)單和快速的，如放射性免疫測(cè)定、酶免疫測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、噬菌斑測(cè)定，斑點(diǎn)免疫結(jié)合測(cè)定等。然后將選擇的雜交瘤連續(xù)稀釋，并克隆到單個(gè)抗體生產(chǎn)細(xì)胞系中，然后這些克隆可無(wú)限傳代以提供mAb，可以兩種基本途徑使該細(xì)胞系進(jìn)行mAb生產(chǎn)。可將雜交瘤的樣品注射(經(jīng)常是腹腔內(nèi))到動(dòng)物內(nèi)，該動(dòng)物與用于為最初融合提供體細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的動(dòng)物類型組織相容。注射的動(dòng)物發(fā)生腫瘤，該腫瘤分泌由融合細(xì)胞雜合子生產(chǎn)的特異性單克隆抗體。然后可放出該動(dòng)物的體液，如血清或腹水，以提供高濃度mAb。也可在體外培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞系，mAb被自然地分泌到培養(yǎng)基中，可容易地從培養(yǎng)基中獲得高濃度抗體。如果需要，兩種方法生產(chǎn)的mAb均可進(jìn)一步用過濾、離心和各種層析方法如HPLC或親和層析來(lái)純化。X.定義本文使用的術(shù)語(yǔ)“心力衰竭”廣泛用于指降低心臟泵血能力的任何病癥。結(jié)果是組織內(nèi)發(fā)生充血和水腫。最經(jīng)常的情況是，心力衰竭由冠狀血流減少產(chǎn)生的心肌收縮力降低引起；然而，很多其它因素可導(dǎo)致心力衰竭，包括心臟瓣膜的損傷、維生素缺乏和原發(fā)性心肌疾病。雖然我們還不完全了解心力衰竭的精確生理機(jī)制，但相信心力衰竭通常涉及幾種心臟自律神經(jīng)作用的紊亂，包括交感神經(jīng)、副交感神經(jīng)和壓力感受器反應(yīng)。將術(shù)語(yǔ)“心力衰竭表現(xiàn)”廣泛用于包括所有與心力衰竭相關(guān)的后遺癥，如呼吸急促、壓痕性水腫、擴(kuò)大的觸痛肝、過飽的頸靜脈、肺音等，包括有關(guān)心力衰竭的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)“治療”或語(yǔ)法同等成分包括改善和/或逆轉(zhuǎn)心力衰竭的癥狀(即心臟的泵血能力)。可用本文中描述的任意測(cè)量方法評(píng)價(jià)對(duì)心臟“生理功能的改善”(例如，測(cè)量射血分?jǐn)?shù)、縮短分?jǐn)?shù)、左心室內(nèi)部尺寸、心率等)，以及對(duì)動(dòng)物存活的任何影響。在動(dòng)物模型的使用中，用本文中描述的任一測(cè)定比較治療的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和未治療的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的反應(yīng)(此外，可以包括治療和未治療的非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為對(duì)照)。因此，可將引起本發(fā)明篩選方法中使用的任何心力衰竭相關(guān)參數(shù)的改善的化合物鑒定為治療化合物。術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)張型心肌病”指一種心力衰竭的類型，其特征為出現(xiàn)對(duì)稱性擴(kuò)張的左心室，其心臟收縮功能差，此外，經(jīng)常包括右心室。術(shù)語(yǔ)“化合物”指可用于治療或預(yù)防身體功能的疾病或不適的任何化學(xué)實(shí)體、藥劑、藥物等?；衔锇ㄒ阎涂赡艿闹委熁衔??？赏ㄟ^用本發(fā)明的篩選方法篩選來(lái)確定化合物。“已知治療化合物”指在這些治療中已經(jīng)顯示有效(例如，通過動(dòng)物試驗(yàn)或先前有給予人的經(jīng)驗(yàn))的治療化合物。換句話說，已知治療化合物并不限于在治療心力衰竭中有效的化合物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”指模擬“天然”或“自然”化合物作用的分子或化合物。激動(dòng)劑可以與這些天然化合物在構(gòu)象、電荷或其它特征上同源。因此，激動(dòng)劑可被細(xì)胞表面表達(dá)的受體識(shí)別。該識(shí)別可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的生理和/或生化改變，使細(xì)胞以相同方式與存在的激動(dòng)劑發(fā)生反應(yīng)，就像天然化合物存在一樣。激動(dòng)劑可包括與感興趣分子、受體和/或通路相互作用的蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物或任何其它分子。本文使用的術(shù)語(yǔ)“心臟肥大”指成熟的心肌細(xì)胞通過肥大生長(zhǎng)對(duì)應(yīng)激作出反應(yīng)的過程。這種生長(zhǎng)的特征為，細(xì)胞大小增加而不進(jìn)行細(xì)胞分裂，在細(xì)胞內(nèi)組裝附加肌節(jié)使產(chǎn)生的力最大化和激活胎心基因程序。心臟肥大經(jīng)常與發(fā)病率和死亡率的風(fēng)險(xiǎn)升高相關(guān)，因此針對(duì)理解心臟肥大分子機(jī)制的研究可對(duì)人類健康具有重大影響。本文使用的術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”和“抑制劑”指抑制可能涉及心臟肥大的細(xì)胞因子作用的分子、化合物或核酸。拮抗劑與這些天然化合物在構(gòu)象、電荷或其它特征上可以或可以不同源。因此，拮抗劑可被激動(dòng)劑識(shí)別的相同或不同受體識(shí)別。拮抗劑可具有變構(gòu)效應(yīng)，它防止激動(dòng)劑的作用。另外，拮抗劑可防止激動(dòng)劑的功能。與激動(dòng)劑不同的是，拮抗化合物不導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的病理性和/或生化改變，從而使細(xì)胞以與細(xì)胞因子存在時(shí)相同的方式與存在的拮抗劑發(fā)生反應(yīng)。拮抗劑和抑制劑可包括與感興趣受體、分子和/或通路相互作用的蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物或任何其它分子。本文使用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”指生物活性的改變或變化。調(diào)節(jié)可以是蛋白活性的升高或降低、激酶活性的改變、結(jié)合性質(zhì)的改變或與感興趣蛋白或其它結(jié)構(gòu)相關(guān)的生物學(xué)、功能或免疫性質(zhì)的任何其它改變。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)劑”指能夠改變或變化上述生物學(xué)活性的分子或化合物。術(shù)語(yǔ)“β-腎上腺素能受體拮抗劑”指能夠部分或完全阻斷β型腎上腺素能受體(即響應(yīng)于兒茶酚胺，尤其是去甲腎上腺素的腎上腺素能反應(yīng)系統(tǒng)的受體)的化學(xué)化合物或?qū)嶓w。一些β-腎上腺素能受體拮抗劑對(duì)一個(gè)受體亞型(通常是β1)顯示出一定程度的特異性；此類拮抗劑稱為“β1-特異性腎上腺素能受體拮抗劑”和“β2-特異性腎上腺素能受體拮抗劑”。術(shù)語(yǔ)“β-腎上腺素能受體拮抗劑”指選擇性和非選擇性拮抗劑化學(xué)化合物。β-腎上腺素能受體拮抗劑的實(shí)例包括但不限于醋丁洛爾、阿替洛爾、布他沙明、卡替洛爾、艾司洛爾、拉貝洛爾、美托洛爾、納多洛爾、噴布洛爾、丙諾洛爾和噻嗎洛爾。本發(fā)明方法包括使用已知β-腎上腺素能受體拮抗劑的衍生物。實(shí)際上，本發(fā)明方法包括任何功能上相當(dāng)于β-腎上腺素能受體拮抗劑的化合物。術(shù)語(yǔ)“血管緊張肽-轉(zhuǎn)化酶抑制劑”或“ACE抑制劑”指能夠部分或完全抑制涉及在凝乳酶-血管緊張肽系統(tǒng)中將相對(duì)失活的血管緊張肽I轉(zhuǎn)化為活性血管緊張肽II的酶的化學(xué)化合物或?qū)嶓w。此外，ACE抑制劑也伴隨地抑制緩激肽的降解，這很可能顯著增強(qiáng)ACE抑制劑的抗高血壓效果。ACE抑制劑的實(shí)例包括但不限于貝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、賴諾普利、quiapril和雷米普利。本發(fā)明方法包括使用已知ACE抑制劑的衍生物。實(shí)際上，本發(fā)明方法包括任何功能上相當(dāng)于ACE抑制劑的化合物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“基因型”指生物體的實(shí)際遺傳構(gòu)成，而“表型”指?jìng)€(gè)體顯示的物理特性。此外，“表型”是基因組選擇表達(dá)的結(jié)果(即它是細(xì)胞歷史和它對(duì)胞外環(huán)境反應(yīng)的表達(dá))。實(shí)際上，人類基因組估計(jì)含有30,000-35,000個(gè)基因。在各細(xì)胞類型中，只表達(dá)了這些基因的一小部分(即10-15％)。XI.實(shí)施例包括了下面的實(shí)施例，以進(jìn)一步說明本發(fā)明的各個(gè)方面。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，下面的實(shí)施例中公開的技術(shù)代表本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的在實(shí)踐本發(fā)明中發(fā)揮良好作用的技術(shù)和/或組合物，因此可以認(rèn)為這些技術(shù)構(gòu)成其實(shí)踐的優(yōu)選模式。然而根據(jù)本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解，可對(duì)公開的具體實(shí)施方式作出很多改變并仍然獲得同樣或類似的結(jié)果，而不背離本發(fā)明精神和范圍。實(shí)施例1材料和方法化學(xué)試劑和質(zhì)粒。豆蔻酰12-佛波醇13-乙酯(PMA)、8-Br-cAMP、pCPT-cGMP、和茴香霉素購(gòu)自SigmaChemical(St.Louis，MO)。下面的激酶抑制劑購(gòu)自所示公司馬來(lái)酰亞胺I和G6976(A.G.Scientific，SanDiego，CA)，KN93、SB216763和渥曼青霉素(BIOMOL，PlymouthMeeting，PA)，G6983、星孢素、PD98059、渥曼青霉素、U1026、Y-27632、雷帕霉素和DAG激酶抑制劑II(Calbiochem)。以ImM使用KN93、渥曼青霉素和星孢素。以10mM使用U1026、HA1077、Y-27632、DAG激酶抑制劑II、SB216763和BisI。以30納克/毫升使用雷帕霉素。苯腎上腺素和內(nèi)皮縮血管肽-1購(gòu)自Sigma。AlexToker善意地提供編碼PKD同種型的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，其它地方有該載體的描述(Storz和Toker，2003)。細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染測(cè)定。在含有FBS(10％)、L-谷胺酰胺(2mM)和青霉素-鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)COS細(xì)胞。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書用Fugene6(RocheMolecularBiochemicals)進(jìn)行COS細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。對(duì)于HDAC定位實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染后用PMA(100nM)、伊屋諾霉素(1mM)、8-Br-cAMP(1mM)、pCPT-GMP(1mM)或茴香霉素(1mM)處理細(xì)胞16-24小時(shí)。注意，在加入任何化學(xué)刺激30分鐘前，加入特異性蛋白激酶抑制劑。用標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微技術(shù)使GFP-HDAC5顯色。對(duì)于FLAG-HDAC5的間接免疫熒光來(lái)說，將COS細(xì)胞接種在蓋玻片上，轉(zhuǎn)染，然后如上地處理。在特異性處理后，用福爾馬林緩沖液(10％)固定細(xì)胞，在含有BSA(3％)和NonidetP-40(0.1％)的PBS中染色。以1∶200的濃度使用FlagM2抗體(Sigma)。也以1∶200的濃度使用第二熒光素共軛抗體(VectorLaboratories)。通過上述間接免疫熒光檢測(cè)，分別用抗肌節(jié)α-輔肌動(dòng)蛋白(Sigma)和ANF(PeninsulaLaboratories)的抗體對(duì)心肌細(xì)胞中的肌節(jié)和心鈉素(ANF)進(jìn)行染色。心肌細(xì)胞培養(yǎng)和腺病毒感染。如之前所述地從1-2天齡的SpragueDawley大鼠中分離新生大鼠心肌細(xì)胞(NRVM)(Antos等，2003)。對(duì)于腺病毒生產(chǎn)，將編碼LacZ或FLAG-標(biāo)記的HDAC5(S259/498A)的cDNA亞克隆化到pACCMV載體中，和pJM17共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中。將初級(jí)裂解物用于再感染293細(xì)胞，用瓊脂覆蓋法獲得病毒噬菌斑。將全長(zhǎng)人HDAC5(編碼1122個(gè)氨基酸)的互補(bǔ)DNA與編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP；Clontech)的序列在pcDNA3.1+(Invitrogen)內(nèi)融合。產(chǎn)生的構(gòu)建物編碼框架內(nèi)融合到HDAC5氨基末端的GFP。以相同方式產(chǎn)生編碼GFP的構(gòu)建物，該GFP融合到用丙氨酸代替絲氨酸259和498的HDAC5中。將GFP-HDAC5cDNA亞克隆化到pACCMV中，以進(jìn)行腺病毒生產(chǎn)。擴(kuò)增腺病毒的克隆群體并測(cè)定其滴度。免疫共沉淀測(cè)定。將Flag-HDAC5表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到如上述處理的COS細(xì)胞中。將處理細(xì)胞收集到Tris(50mM，pH7.4)、NaCl(150mM)、EDTA(1mM)和TritonX-100(1％)中。使細(xì)胞通過22號(hào)針頭，以進(jìn)一步瓦解細(xì)胞，通過離心去除細(xì)胞碎片。用M2-瓊脂糖結(jié)合體(conjugate)(Sigma)免疫沉淀Flag-HDAC5，徹底洗滌。用SDS-PAGE解析結(jié)合蛋白，用FlagM2(Sigma)或14-3-3抗體(SantaCruzBiotechnology)進(jìn)行Western印跡分析。對(duì)于用NRVM研究來(lái)說，用含有蛋白酶抑制劑混合物(完全；Roche)、PMSF(1mM)和磷酸酶抑制劑[焦磷酸鈉(1mM)、氟化鈉(2mM)、b-磷酸甘油(10mM)、鉬酸鈉(1mM)、原釩酸鈉(1mM)]的相同緩沖液從表達(dá)GFP-HDAC5的細(xì)胞中制備全細(xì)胞蛋白抽提物。短時(shí)超聲處理裂解物，離心以澄清。在免疫沉淀中，將蛋白裂解物與HDAC5特異性抗血清(19)和蛋白G瓊脂糖珠子(AmershamBiosciences)接觸。用裂解緩沖液洗滌免疫沉淀物5次，SDS-PAGE解析和用特異性抗GFP(BDBiosciences；1∶2,500稀釋)或14-3-3(SantaCruz[H-8]；1∶1000稀釋)的小鼠單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡。通過免疫印跡檢測(cè)結(jié)合的PKD，所用抗體是抗PKD-1、絲氨酸744和748磷酸化的PKD-1或絲氨酸916磷酸化的PKD-1的兔多克隆抗體(CellSignalingTechnologies)，1∶1000稀釋。體外激酶測(cè)定。用抗-FlagM2抗體免疫沉淀Flag-HDAC5，如上所述。用激酶緩沖液(Tris(25mM，pH7.4)、MgCl2(10mM)、DTT(1mM))洗滌和平衡結(jié)合的Flag-HDAC5。平衡后，加入激酶反應(yīng)混合物(激酶緩沖液加ATP(0.1mM)和50mCi[g-32P]-ATP)。在30℃進(jìn)行激酶反應(yīng)30分鐘，通過加入等體積的2xSDS-PAGE上樣緩沖液終止反應(yīng)。用SDS-PAGE解析磷酸化蛋白，通過放射自顯影顯色。GFP-HDAC5定位研究。為了在NRVM中分析GFP-HDAC5，在腺病毒存在下(感染復(fù)數(shù)＝～50-100)將細(xì)胞鋪板在明膠包被的96孔板(Costar；1×104細(xì)胞/孔)上，含有胎牛血清(FBS)(10％)、L-谷氨酰胺(2mM)和青霉素-鏈霉素的DMEM中。培養(yǎng)過夜后，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，在含有Neutridoma-SP(0.1％；RocheAppliedScience)的DMEM(100毫升)中培養(yǎng)，Neutridoma-SP含有白蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和其他明確的有機(jī)和無(wú)機(jī)化合物。在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)(3小時(shí))后，將細(xì)胞與激酶抑制劑接觸(30分鐘)，然后用激動(dòng)劑刺激2.5小時(shí)。用PBS洗滌細(xì)胞，并用含有Hoechst染料33342(H-3570，MolecularProbes)的10％福爾馬林PBS溶液固定。用配有數(shù)碼相機(jī)(PhotometricsCoolSNAPHQ)的熒光顯微鏡(NikonEclipseTS100)40X放大和MetaMorph成像軟件捕獲圖像。用HighContentImagingSystem(Cellomics，Inc.，Pittsburgh，PA)定量GFP-HDAC5在核中與胞漿中的相對(duì)豐度，該系統(tǒng)根據(jù)Hoechst熒光劃分核界限，根據(jù)這些核尺度定義胞漿環(huán)。HDAC5定位值代表來(lái)自每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下最少200個(gè)細(xì)胞的平均值。RNA分析。將NRVM鋪于明膠包被的10厘米培養(yǎng)皿上(2×106細(xì)胞/皿)。按照指示的處理方法，用Trizol試劑(Gibco/BRL)從心肌細(xì)胞中分離RNA。用96-孔型斑點(diǎn)印跡儀(Bio-Rad)將總RNA(2微克)真空印跡到硝酸纖維素膜(Bio-Rad)上。在含SDS(1％)、5xDenhardt氏試劑、焦磷酸鈉(0.05％)和100微克/毫升超聲處理的鮭魚精子DNA的4xSSC中封閉膜(500℃4小時(shí))，用32P-末端標(biāo)記的寡核苷酸探針孵育(1×106cpm/毫升；500℃14小時(shí))。寡核苷酸的序列如下ANF，5’-aatgtgaccaagctgcgtgacacaccacaagggcttaggatcttttgcgatctgctcaag-3’；BNP，5’-tgaactatgtgccatcttggaatttcgaagtctctcct-3’；α-SK-肌動(dòng)蛋白5’-tggagcaaaacagaatggctggctttaatgcttcaagttttccatttcctttccacaggg-3’；GAPDH5’-ggaacatgtagaccatgtagttgaggtcaatgaag-3’。用含0.1％SDS的0.5xSSC洗滌印跡(500℃10分鐘)兩次，通過放射自顯影分析。哺乳動(dòng)物雙雜交分析。在pM1表達(dá)載體(Sadowski)中產(chǎn)生編碼融合到人HDAC5氨基端(氨基酸2-664)的GAL4DNA結(jié)合域的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。以類似方式構(gòu)建由丙氨酸代替絲氨酸259和/或498的GAL4-HDAC5融合蛋白。用pVP16(Clontech)產(chǎn)生編碼融合到14-3-3σ的氨基末端的皰疹病毒VP16轉(zhuǎn)錄激活域的構(gòu)建物。在存在或不存在組成性活化的PKD-1的構(gòu)建物的情況下，在五個(gè)拷貝的GAL4DNA結(jié)合位點(diǎn)(5xUAS熒光素酶)的控制下，用GAL4-HDAC5、VP16-14-3-3和熒光素酶報(bào)道基因的載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。轉(zhuǎn)染四十八小時(shí)后，收集細(xì)胞，用熒光素酶測(cè)定試劑盒(Promega)定量熒光素酶的水平。轉(zhuǎn)基因小鼠的生產(chǎn)。將編碼PKD組成性活化形式的cDNA克隆到心臟特異性α-肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子的下游。將該載體注射到B6C3F1小鼠卵母細(xì)胞中，并植入代用的雌性ICR小鼠。通過用轉(zhuǎn)基因特異性引物進(jìn)行PCR來(lái)鑒定轉(zhuǎn)基因后代。結(jié)果顯示在圖7A-D中。實(shí)施例2結(jié)果PKC依賴途徑刺激HDAC5的核輸出。為了進(jìn)一步確定導(dǎo)致II類HDAC磷酸化和核輸出的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，本發(fā)明者測(cè)試了各種蛋白激酶途徑激活物在COS細(xì)胞中刺激HDAC5核輸出的能力。HDAC5主要位于允許用方便系統(tǒng)評(píng)價(jià)核輸出的COS細(xì)胞核中。測(cè)試了PKA(8-Br-cAMP)、PKG(pCPT-GMP)、PKC(PMA)、CaMK(伊屋諾霉素)和Jun-N-末端激酶(茴香霉素)的激活物激活與GFP融合的HDAC5的核輸出能力。在這些化合物中，只有伊屋諾霉素和PMA刺激GFP-HDAC5的核輸出(圖1A)。在測(cè)試濃度下，PMA是比伊屋諾霉素更強(qiáng)效的輸出刺激物。HDAC5和其他II類HDAC響應(yīng)于CaMK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的核輸出需要位于HDAC蛋白的N-末端區(qū)的兩個(gè)絲氨酸(Grozinger和Schreiber，2000；McKinsey等，2000)。由丙氨酸取代這些絲氨酸殘基(殘基249和498)的HDAC5突變體(HDAC5-S/A)不能響應(yīng)于PMA處理而輸出(圖1B)，驗(yàn)證了在對(duì)PKC激活的反應(yīng)中這些位點(diǎn)的必需角色。加入PMA后15分鐘內(nèi)起始HDAC5的核輸出，30分鐘內(nèi)完成(圖1C)。HDAC5中絲氨酸249和498的磷酸化為14-3-3蛋白建立了?？课稽c(diǎn)，14-3-3蛋白護(hù)送HDAC5到胞漿中(Grozinger和Schreiber，2000；McKinsey等，2000)。為進(jìn)一步確證PMA促進(jìn)這些位點(diǎn)的磷酸化，本發(fā)明者在免疫共沉淀測(cè)定中分析了HDAC5與14-3-3的相互作用。如圖1D所示，在PMA存在下，14-3-3與HDAC5的結(jié)合增強(qiáng)。相反，HDAC5-S/A突變體不能響應(yīng)于PMA，不與14-3-3結(jié)合。因此，本發(fā)明者得出結(jié)論，PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致HDAC5絲氨酸249和498的磷酸化和隨后通過14-3-3-依賴機(jī)制的核輸出。心肌細(xì)胞中HDAC5的PKC依賴性核輸出。為了開始研究PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在心臟肥大過程中控制HDAC5運(yùn)輸?shù)淖饔?，本發(fā)明人開發(fā)了定量測(cè)定，用于在原代心肌細(xì)胞中測(cè)量激動(dòng)劑依賴性HDAC5核輸出。該測(cè)定使用CellomicsHighContentImagingSystem，它快速定量核和胞漿的GFP熒光強(qiáng)度，并提供兩個(gè)亞細(xì)胞室之間強(qiáng)度差異的讀數(shù)(圖2A)。為確認(rèn)該測(cè)定，用表達(dá)GFP-HDAC5(Ad-GFP-HDAC5)的腺病毒感染新生大鼠心室心肌細(xì)胞(NRVM)，并用遞增劑量的α-1-腎上腺素能能激動(dòng)劑苯腎上腺素(PE)(一種促進(jìn)HDAC5核輸出的肥大激動(dòng)劑)刺激(Bush等，2004)。如圖2B所示，PE以濃度依賴方式引發(fā)HDAC5的核輸出。通過視覺檢查這些細(xì)胞確證了這些結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。確立定量核輸出測(cè)定的有效性后，本發(fā)明人下一步測(cè)試一系列酶的抑制劑阻斷PE-誘導(dǎo)的HDAC5易位出核的能力。普通的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶抑制劑星孢素和PKC抑制劑馬來(lái)酰亞胺I(BisI)有效阻斷HDAC5的PE-依賴性輸出(圖2C和2D)。相反，CaMK(KN93)、MEK1(U1026)、ROCK(Y-27632)、甘油二酯激酶(DAGK抑制劑II)、PI3-激酶(渥曼青霉素)、S6激酶(雷帕霉素)、GSK(SB216763)的抑制劑或PKG、MLCK和PKA的抑制劑(HA1077)并不顯著影響PE-誘導(dǎo)的HDAC5核輸出。PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過HDAC磷酸化誘導(dǎo)心臟肥大。已顯示的激活足夠引起心肌細(xì)胞肥大，在某些情況下，PKC激活對(duì)心肌細(xì)胞肥大是必要的(參見Antos，2003；Dunnmon等，1990)。上述結(jié)果使PKC-依賴性HDAC5核輸出或其它II類HDAC牽連于心肌細(xì)胞肥大發(fā)展中。為證實(shí)該可能性，本發(fā)明人檢測(cè)響應(yīng)于PKC激活的肥大是否需要II類HDAC的磷酸化和核輸出。用編碼信號(hào)-抗性HDAC5-S/A突變蛋白的腺病毒感染NRVM，或用編碼LacZ的腺病毒轉(zhuǎn)染作為對(duì)照。如圖3A所示，在原代心肌細(xì)胞中表達(dá)HDAC5-S/A突變體防止響應(yīng)于PE或PMA的肌節(jié)裝配和細(xì)胞增大。心臟肥大與病理性“胎”基因程序的再活化相關(guān)，該基因程序包括編碼心鈉素(ANF)、腦鈉尿肽(BNP)和α-骨架肌動(dòng)蛋白的基因。也可通過用ANF特異性抗體免疫染色心肌細(xì)胞來(lái)檢測(cè)ANF表達(dá)的激動(dòng)劑依賴性升高。如圖3B所示，在用PE或PMA處理的NRVM中觀察到明顯的核周ANF蛋白表達(dá)。ANF表達(dá)的激動(dòng)劑依賴性誘導(dǎo)不受LacZ異位表達(dá)的影響，但在信號(hào)抗性HDAC5的存在下顯著降低。此外，不可磷酸化的HDAC5阻斷PE-和PMA-介導(dǎo)的ANF轉(zhuǎn)錄物誘導(dǎo)，以及BNP和α-骨架肌動(dòng)蛋白的轉(zhuǎn)錄物誘導(dǎo)?？傊?，這些結(jié)果說明PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)部分地通過刺激II類HDAC的核輸出而引發(fā)心臟肥大。HDAC5核輸出對(duì)PKC抑制的差別敏感性。本發(fā)明者下一步檢查響應(yīng)于其它肥大信號(hào)的HDAC5核輸出是否也依賴于PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。刺激肥大的內(nèi)皮縮血管肽-1(ET-1)和胎牛血清(FBS)也有效促進(jìn)HDAC5核輸出(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。然而，與其對(duì)PE依賴性HDAC5核輸出的抑制效果相反，BisI對(duì)響應(yīng)于ET-1或FBS的HDAC5核輸出沒有影響(圖4A)。這些發(fā)現(xiàn)提示，PE引發(fā)不同于ET-1和FBS的激酶途徑，以促進(jìn)HDAC5的核輸出。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)上述肥大激動(dòng)劑的蛋白激酶效應(yīng)子的性質(zhì)，本發(fā)明者測(cè)試了附加PKC抑制劑對(duì)HDAC5核輸出的可能影響。G6983，另一普通PKC抑制劑的活性，與BisI的活性類似，抑制響應(yīng)于PE而非ET-1或FBS的HDAC5核輸出(圖4B和4D)。相反，G6976，鈣依賴性PKCa和b同功酶的特異性抑制劑，則有效阻斷PE、ET-1或FBS引發(fā)的HDAC5核輸出(圖4C和D)。上述抑制劑對(duì)HDAC5核輸出的不同影響與它們對(duì)14-3-3與HDAC5結(jié)合(HDAC5磷酸化的指示)的影響類似。G6976而非BisI阻斷響應(yīng)于PE和ET-1的HDAC5和14-3-3的結(jié)合(圖4E)。G6976而非BisI或G6983阻斷響應(yīng)于多個(gè)激動(dòng)劑的HDAC5核輸出的能力似乎是荒謬的，因?yàn)楹笳呋衔锱cG6976同樣有效地阻斷PKCa和b。然而，該抑制劑性質(zhì)與其他人用來(lái)區(qū)分PKCa或b和PKD/PKCm的作用的擬制劑類似(Zugaza等，1996)，即對(duì)G6976而不是對(duì)BisI或G6983敏感(Gschwendt等，1996)。蛋白激酶D刺激HDAC5的核輸出。根據(jù)上述提示PKD可能參與激動(dòng)劑依賴性HDAC5核輸出的結(jié)果，本發(fā)明者檢測(cè)了HDAC5中信號(hào)反應(yīng)性絲氨酸周圍氨基酸序列的潛在PKD共有磷酸化位點(diǎn)。PKD在相對(duì)于磷酸化絲氨酸-5位置上強(qiáng)烈優(yōu)選亮氨酸殘基(Nishikawa等，1997)。HDAC5在相對(duì)于兩個(gè)信號(hào)反應(yīng)性絲氨酸殘基的這個(gè)位置上含有亮氨酸(圖5A)。有趣的是，II類HDAC4、7和9也在此位置上含有亮氨酸。為評(píng)價(jià)-5位置上亮氨酸的重要性，本發(fā)明者將HDAC5中的亮氨酸254和493突變成甘氨酸，未改變實(shí)際磷酸化位點(diǎn)。該HDAC5突變體(L254/493G)構(gòu)成定位于核，完全不受PMA的控制(圖5B)。轉(zhuǎn)染測(cè)定進(jìn)一步支持PKD參與HDAC5核輸出，在該測(cè)定中PKD的激活形式(PKDS/E)，而非催化失活的突變體(PKDK/W)，有效刺激HDAC5的核輸出(圖5C)。信號(hào)反應(yīng)性絲氨酸殘基或HDAC5的254和493位亮氨酸的突變消除了響應(yīng)于PKD的核輸出(圖5C)。為了進(jìn)一步探索PKD作為HDAC5核輸出激酶的可能作用，本發(fā)明者進(jìn)行了免疫共沉淀和體外激酶測(cè)定。免疫共沉淀HDAC5和PKD后，體外激酶測(cè)定確證了PKD直接磷酸化HDAC5。如圖5D所示，PKD的共轉(zhuǎn)染幾乎不導(dǎo)致HDAC5的磷酸化。用PMA處理細(xì)胞使與PKD結(jié)合同時(shí)發(fā)生的HDAC5磷酸化程度增加。雖然PMA處理增加HDAC5的磷酸化，但激活的PKDS/E結(jié)合和磷酸化HDAC5并不需要PMA，也許這是由于在免疫復(fù)合物中存在內(nèi)源性PKD。用催化失活的突變PKDK/W沒有觀察到HDAC5的磷酸化。然而有趣的是，甚至在不存在PMA的情況下，PKDK/W也與HDAC5結(jié)合。PKD也增加HDAC5和14-3-3之間的相互作用，如哺乳動(dòng)物雙雜交測(cè)定所評(píng)價(jià)，該測(cè)定中將HDAC5與GAL4DNA結(jié)合域融合，并將14-3-3與VP16轉(zhuǎn)錄激活域融合(圖5E)。HDAC5中任一信號(hào)反應(yīng)性絲氨酸的突變使HDAC5和14-3-3之間的相互作用顯著降低，同時(shí)突變兩個(gè)信號(hào)反應(yīng)性絲氨酸完全解除了HDAC5與14-3-3的結(jié)合。PKD是心臟HDAC5激酶。本發(fā)明者下一步檢查了在心肌細(xì)胞中PKD是否可以用作HDAC激酶。用編碼Flag-HDAC5的腺病毒感染細(xì)胞，用PMA處理細(xì)胞。用從PMA處理的細(xì)胞中免疫沉淀的FLAG-HDAC5進(jìn)行體外激酶測(cè)定，在該測(cè)定中觀察到HDAC5磷酸化增加(圖6A)。加入PMA前，用BisI孵育細(xì)胞阻斷HDAC5的磷酸化。然而當(dāng)G6976阻斷HDAC5的磷酸化時(shí)，將BisI直接加入激酶反應(yīng)沒有效果。這些結(jié)果說明，在心肌細(xì)胞中PKD能夠結(jié)合HDAC5，和BisI阻斷PMA誘導(dǎo)的激酶激活，而G6976能夠直接抑制與HDAC5結(jié)合的PKD。通過連續(xù)的免疫沉淀和免疫印跡進(jìn)一步證明心肌細(xì)胞中PKD與HDAC5相互作用的能力。用編碼GFP-HDAC5的腺病毒感染NRVM，在不存在或存在Bis.I的情況下用PE處理NRVM。如圖6A所示，內(nèi)源性PKD有效地與HDAC5免疫共沉淀。在不存在激動(dòng)劑的情況下，PKD與HDAC5結(jié)合，PE處理后以PKC依賴方式活化。該結(jié)果進(jìn)一步說明PKD是心臟II類HDAC激酶，并支持圖8中提出的模型。根據(jù)本公開，不需過多的實(shí)驗(yàn)就可制成和實(shí)施本文中公開和要求權(quán)利的所有組合物和方法。雖然按照優(yōu)選實(shí)施方式描述了本發(fā)明的組合物和方法，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，可以對(duì)這些組合物和方法，以及本文所述方法的步驟或步驟順序加以改變，而不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更具體說，應(yīng)明白，用某些化學(xué)和生理學(xué)相關(guān)試劑替代本文中描述的試劑也會(huì)獲得相同或相似的結(jié)果。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說明顯的所有這些類似替代物和修改都被認(rèn)為是在如所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。XII.參考文獻(xiàn)下面的參考文獻(xiàn)，它們提供示例性程序和補(bǔ)充本文所述內(nèi)容的其它細(xì)節(jié)，特別引入本文作為參考。美國(guó)申請(qǐng)2002/103192美國(guó)申請(qǐng)2002/65282美國(guó)申請(qǐng)2002/61860美國(guó)專利4,196,265美國(guó)專利4,415,723美國(guó)專利4,458,066美國(guó)專利4,873,191美國(guó)專利5,354,855美國(guó)專利5,604,251美國(guó)專利5,795,715美國(guó)專利5,889,136美國(guó)專利5,955,501美國(guó)專利6,043,270美國(guó)專利6,080,784美國(guó)專利6,441,020美國(guó)專利6,528,294Angel等，Mol.Cell.Biol.，72256，1987。Angel等，Mol.Cell.Biol.，72256，1987a。Angel等，Cell，49729，1987b。Antos，等，2003.J.Biol.Chem.，27828930-28937，2003。Atchison和Perry，Cell，46253，1986。Atchison和Perry，Cell，48121，1987。AU6,794,700AU9,013,101AU9,013,201AU9,013,401Baichwal和Sugden，基因轉(zhuǎn)移(GeneTransfer)，Kucherlapati(編)，NY，PlenumPress，117-148，1986。Banerji等，Cell，27(2Pt1)299-308，1981。Banerji等，Cell，33(3)729-740，1983。Barnes等，J.Biol.Chem.，272(17)11510-7，1997。Benvenisty和Neshif，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，839551-9555，1986。Berkhout等，Cell，59273-282，1989。Bhavsar等，Genomics，35(1)11-23，1996。Blanar等，EMBOJ.，81139，1989。Bodine和Ley，EMBOJ.，62997，1987。Boshart等，Cell，41521，1985。Bosher和Labouesse，Nat.Cell.Biol.，2E31-E36，2000。Bosze等，EMBOJ.，5(7)1615-1623，1986。Braddock等，Cell，58269，1989。Brinster等，Proc.Natl.AcadSci.USA，82(13)4438-4442，1985。Bristow，Cardiology，923-6，1999。Bulla和Siddiqui，J.Virol.，621437，1986。Bush等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1012870-2875，2004。Butler等，CancerRes.，605165-5170，2000。Butler等，Clin.CancerRes.，7962-970，2001。Campbell和Villarreal，Mol.Cell.Biol.，81993，1988。Campbell等，J.Mol.Biol.，1801-19，1984。Campere和Tilghman，Genes和Dev.，3537，1989。Campo等，Nature，30377，1983。Capaldi等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，76425-433，1977。Caplen等，Gene，252(1-2)95-105，2000。Carbonneau和Tonks，Annu.Rev.Cell.Biol.，8463-93，1992。Celander和Haseltine，J.Virology，61269，1987。Celander等，J.Virology，621314，1988。Chandler等，Cell，33489，1983。Chang等，Hepatology，14124A，1991。Chang等，Mol.Cell.Biol.，92153，1989。Chatterjee等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，869114，1989。Chen和Okayama，Mol.CellBiol.，72745-2752，1987。Choi等，Cell，53519，1988。Coffey等，CancerRes.，613591-3594，2001。Coffin，病毒學(xué)(Virology)，F(xiàn)ields等(編)，RavenPress，NY，1437-1500，1990。Cohen等，J.Cell.Pliysiol.，575，1987。Cook等，Cell，27487-496，1981。Costa等，Mol.Cell.Biol.，881，1988。Couch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(gè)或多個(gè)方面包括肌節(jié)組裝、細(xì)胞大小或細(xì)胞收縮性。42.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述一種或多種心臟肥大參數(shù)包括總蛋白合成。43.如權(quán)利要求19所述的方法，還包括測(cè)量細(xì)胞毒性。44.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞表達(dá)缺少一個(gè)或多個(gè)磷酸化位點(diǎn)的突變的II類HDAC蛋白。45.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述測(cè)定包括測(cè)定選自心鈉素基因、β-肌球蛋白重鏈基因、心臟肌動(dòng)蛋白基因和α-骨架肌動(dòng)蛋白基因的基因的活性或表達(dá)。46.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述測(cè)定包括測(cè)定II類HDAC的磷酸化。47.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述測(cè)定包括測(cè)定II類HDAC的核輸出。48.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述測(cè)定包括測(cè)定II類HDAC和Mef-2的結(jié)合。49.如權(quán)利要求48所述的方法，所述測(cè)定還包括測(cè)定II類HDAC與MEF-2結(jié)合的增強(qiáng)。50.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，通過Mef-2依賴性轉(zhuǎn)錄的增加測(cè)定所述增強(qiáng)。51.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述處理在體外進(jìn)行。52.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述處理在體內(nèi)進(jìn)行。53.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物的部分。54.一種鑒定心臟肥大或心力衰竭抑制劑的方法，該方法包括(a)提供PKD；(b)使PKD與候選抑制劑物質(zhì)接觸；和(c)測(cè)定所述PKD的激酶活性，其中，PKD激酶活性的降低鑒定所述候選抑制劑物質(zhì)為心臟肥大或心力衰竭的抑制劑。55.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述PKD是從全細(xì)胞中純化得到的。56.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是心臟細(xì)胞。57.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述PKD位于完整細(xì)胞中。58.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述完整細(xì)胞是肌細(xì)胞。59.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述肌細(xì)胞是心肌細(xì)胞。60.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，通過HDAC的磷酸化降低測(cè)定激酶活性的降低。61.如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于，所述HDAC是II類HDAC。62.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述候選抑制劑物質(zhì)是干擾RNA。63.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述候選抑制劑物質(zhì)是抗體制劑。64.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，所述抗體制劑包括單鏈抗體。65.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述候選抑制劑物質(zhì)是反義構(gòu)建物。66.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述抑制劑是酶、化學(xué)品、藥品或小分子化合物。67.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述PKD抑制劑選自白藜蘆醇、吲哚咔唑、Godecke6976(Go6976)、星孢素、K252a、包括[d-Arg(1)、d-Trp(5，7，9)、Leu(11)]SP的物質(zhì)P(SP)類似物、PKC抑制劑109203X(GF-1)、PKC抑制劑Ro31-8220、GO7874、染料木黃酮、特異性Src抑制劑PP-1和PP-2、白屈菜季銨堿或粗糠柴毒素。68.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述抑制劑阻斷PKD與II類HDAC的結(jié)合。69.如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，通過免疫共沉淀來(lái)測(cè)定所述阻斷結(jié)合的方法。70.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述抑制劑阻斷PKD磷酸化II類HDAC。71.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述抑制劑增強(qiáng)HDAC與Mef-2或其它II類HDAC調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。72.一種轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物，它的細(xì)胞包含在真核細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子控制下的異源PKD基因。73.如權(quán)利要求72所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物是小鼠。74.如權(quán)利要求72所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其特征在于，所述異源性PKD基因是人源的。75.如權(quán)利要求72所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其特征在于，所述啟動(dòng)子是組織特異性啟動(dòng)子。76.如權(quán)利要求75所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其特征在于，所述組織特異性啟動(dòng)子是肌肉特異性啟動(dòng)子。77.如權(quán)利要求75所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其特征在于，所述組織特異性啟動(dòng)子是心肌特異性啟動(dòng)子。78.如權(quán)利要求75所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其特征在于，所述肌肉特異性啟動(dòng)子選自肌球蛋白輕鏈-2啟動(dòng)子、α肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、肌鈣蛋白1啟動(dòng)子、Na+/Ca2+交換子啟動(dòng)子、抗肌萎縮蛋白啟動(dòng)子、肌酸激酶啟動(dòng)子、α7整合素啟動(dòng)子、腦鈉尿肽啟動(dòng)子、肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子、ANF啟動(dòng)子和αB-晶體蛋白/小熱激蛋白啟動(dòng)子。79.如權(quán)利要求72所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其特征在于，所述激酶是組成性活化的。80.如權(quán)利要求72所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其特征在于，所述激酶是顯性失活的。81.一種轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物，它的細(xì)胞包含在所述非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有活性的異源性啟動(dòng)子控制下的PKD基因。82.如權(quán)利要求81所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物是小鼠。83.如權(quán)利要求81所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其特征在于，所述PKD基因是人源的。84.如權(quán)利要求83所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其特征在于，所述啟動(dòng)子在真核細(xì)胞中具有活性。85.如權(quán)利要求84所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其特征在于，所述啟動(dòng)子是組織特異性啟動(dòng)子。86.如權(quán)利要求85所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其特征在于，所述組織特異性啟動(dòng)子是肌肉特異性啟動(dòng)子。87.如權(quán)利要求85所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其特征在于，所述組織特異性啟動(dòng)子是心肌特異性啟動(dòng)子。88.一種轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物，它的細(xì)胞缺少一個(gè)或兩個(gè)天然PKD等位基因。89.如權(quán)利要求88所述的哺乳動(dòng)物，其特征在于，通過同源重組敲除了一個(gè)或多個(gè)基因。90.一種治療心肌梗塞的方法，該方法包括在對(duì)象心臟細(xì)胞中降低PKD的活性。91.一種預(yù)防心臟肥大和擴(kuò)張性心肌癥的方法，該方法包括在對(duì)象心臟細(xì)胞中降低PKD的活性。92.一種抑制心臟肥大發(fā)展的方法，該方法包括在對(duì)象心臟細(xì)胞中降低PKD的活性。93.一種治療心力衰竭的方法，該方法包括在對(duì)象心臟細(xì)胞中降低PKD的活性。94.一種抑制心力衰竭發(fā)展的方法，該方法包括在對(duì)象心臟細(xì)胞中降低PKD的活性。95.一種提高心力衰竭或心臟肥大患者運(yùn)動(dòng)耐量的方法，該方法包括在對(duì)象心臟細(xì)胞中降低PKD的活性。96.一種減少心力衰竭或心臟肥大對(duì)象住院的方法，該方法包括在對(duì)象心臟細(xì)胞中降低PKD的活性。97.一種改善心力衰竭或心臟肥大患者生活質(zhì)量的方法，該方法包括在對(duì)象心臟細(xì)胞中降低PKD的活性。98.一種降低心力衰竭或心臟肥大對(duì)象發(fā)病率的方法，該方法包括在對(duì)象心臟細(xì)胞中降低PKD的活性。99.一種降低心力衰竭或心臟肥大對(duì)象死亡率的方法，該方法包括在對(duì)象心臟細(xì)胞中降低PKD的活性。全文摘要本發(fā)明提供了治療和預(yù)防心臟肥大和心力衰竭的方法。MEF－2和II類HDAC顯示出在心臟肥大和心力衰竭中起到重要作用，抑制II類HDAC顯示出有益的、抗肥大效應(yīng)。本發(fā)明提供MEF－2和II類HDAC，稱作PKD的激酶之間的聯(lián)系。本發(fā)明還證明PKD的抑制劑通過部分抑制胎兒心臟基因表達(dá)和在MEF－2依賴性轉(zhuǎn)錄被抑制時(shí)發(fā)生的細(xì)胞改組來(lái)抑制心臟肥大和心力衰竭。文檔編號(hào)C12Q1/48GK1812776SQ200480013998公開日2006年8月2日申請(qǐng)日期2004年5月19日優(yōu)先權(quán)日2003年5月21日發(fā)明者T·A·麥克金西,E·奧爾森,R·B·維加申請(qǐng)人:得克薩斯州大學(xué)系統(tǒng)董事會(huì),莫埃根股份有限公司