專(zhuān)利名稱(chēng)：由源于虹彩組織的神經(jīng)干細(xì)胞生產(chǎn)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的方法、以及由該方法得到的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過(guò)進(jìn)行誘導(dǎo)分化從而由源于哺乳類(lèi)或鳥(niǎo)類(lèi)的虹彩組織的神經(jīng)干細(xì)胞生產(chǎn)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的方法、以及由該方法得到的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，神經(jīng)干細(xì)胞在腦、脊髓中的存在已得到了證實(shí)，而且，有報(bào)告稱(chēng)ES(Embryonic Stem)細(xì)胞能夠分化為特定的中樞神經(jīng)系細(xì)胞，因此，人們對(duì)中樞神經(jīng)系再生治療的期待日漸高漲。另外，作為神經(jīng)干細(xì)胞的分離和選擇培養(yǎng)方法，已經(jīng)確立了neurosphere法(浮游凝集塊培養(yǎng)法)。此外，還有下述神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化法，即，利用接觸培養(yǎng)法來(lái)培養(yǎng)借助于上述浮游凝集塊培養(yǎng)法形成神經(jīng)干細(xì)胞的sphere(凝集塊)，從而，將神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)系細(xì)胞。
另外，有報(bào)告稱(chēng)，將源于腦、脊髓的神經(jīng)干細(xì)胞或ES細(xì)胞移植到活體內(nèi)，由此，該所移植的細(xì)胞就適應(yīng)環(huán)境而分化為特異性的神經(jīng)細(xì)胞(參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)1Nature 414、112-117，review 2001年)。
哺乳動(dòng)物的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞一旦變性，將不能再生，并導(dǎo)致機(jī)能的降低。并且，如果因網(wǎng)膜變性疾患等而造成視細(xì)胞變性，則有可能導(dǎo)致失明?，F(xiàn)在，對(duì)這種難癥尚無(wú)有效的治療方法。如果能夠利用上述神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化來(lái)生產(chǎn)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，則將實(shí)現(xiàn)極為有效的再生治療。
作為用于上述網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化的神經(jīng)干細(xì)胞，有人提出了使用毛樣體上皮細(xì)胞和網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方案。網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和毛樣體上皮細(xì)胞均來(lái)源于神經(jīng)板。網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞由作為網(wǎng)膜的最外側(cè)的細(xì)胞層的受容器層所覆蓋，該網(wǎng)膜由多個(gè)細(xì)胞層構(gòu)成。毛樣體上皮是存在于虹彩與網(wǎng)膜的中間位置的組織。
例如，在非專(zhuān)利文獻(xiàn)2(Science 287、2032-2035頁(yè)，2000年)中公開(kāi)了下述方法，即，利用浮游凝集塊培養(yǎng)法來(lái)培養(yǎng)毛樣體上皮細(xì)胞并形成sphere(凝集塊)，然后，使用接觸培養(yǎng)法來(lái)培養(yǎng)該凝集塊，從而對(duì)分化實(shí)施誘導(dǎo)。在非專(zhuān)利文獻(xiàn)3(Biochem.And Biophys.Res.Commun.270、517-521頁(yè)，2000年)中也揭示了能夠由毛樣體上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的可能性。
此外，在非專(zhuān)利文獻(xiàn)4(Brain Res.677(2)、300-310頁(yè)，1995年)中，通過(guò)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)揭示出，雖然是胚胎期的有限的時(shí)間，哺乳動(dòng)物的網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞具有向神經(jīng)細(xì)胞分化轉(zhuǎn)換的能力。在非專(zhuān)利文獻(xiàn)5(DNA Cell Biol 12(8)、667-673頁(yè)，1993年)中也揭示了能夠由網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的可能性。
源于腦、脊髓的神經(jīng)干細(xì)胞與ES細(xì)胞在再生治療中的應(yīng)用存在下述諸多問(wèn)題，例如，因細(xì)胞移植帶來(lái)的免疫排斥問(wèn)題、倫理問(wèn)題、作為移植材料的移植細(xì)胞源的供需失衡問(wèn)題等。如果能夠?qū)⒃从谝浦矊?duì)象個(gè)體自身的細(xì)胞用作中樞神經(jīng)系再生的材料，則自身移植將成為可能，而上述問(wèn)題也能夠得以解決。
但是，在應(yīng)用于治療時(shí)，由于很難獲得患者本人的毛樣體上皮細(xì)胞，所以，要想將毛樣體上皮細(xì)胞用作中樞神經(jīng)系再生的材料并非現(xiàn)實(shí)。
此外，在非專(zhuān)利文獻(xiàn)4中，揭示出只有在各組織中存在較多相對(duì)未分化的細(xì)胞的哺乳類(lèi)的胚胎期的有限的時(shí)間內(nèi)的網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞才具有向神經(jīng)細(xì)胞分化轉(zhuǎn)換的能力。也就是說(shuō)，在哺乳動(dòng)物成體的各組織中極少存在相對(duì)未分化的細(xì)胞，網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞在成體中也已經(jīng)高度分化，所以，難以對(duì)細(xì)胞實(shí)施分離、培養(yǎng)。因此，就現(xiàn)階段而言，不能夠?qū)⒉溉閯?dòng)物成體的網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞用作中樞神經(jīng)系再生的材料。
另外，在非專(zhuān)利文獻(xiàn)6(Biochem.and Biophys.Res Commun.297，177-184頁(yè)，2002年)中揭示了由ES細(xì)胞生產(chǎn)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的方法，但是，其效率極其低下。
鑒于上述情況，眼球的虹彩色素上皮細(xì)胞就成為可望用作中樞神經(jīng)系再生的材料的細(xì)胞的一種。虹彩色素上皮細(xì)胞是構(gòu)建虹彩的細(xì)胞的一種，而該虹彩是用于根據(jù)光量來(lái)開(kāi)閉瞳孔從而對(duì)到達(dá)網(wǎng)膜的光量進(jìn)行調(diào)節(jié)的組織。關(guān)于虹彩色素上皮細(xì)胞的發(fā)生起源，與網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和毛樣體上皮細(xì)胞同樣地，其也來(lái)源于神經(jīng)板。由于能夠從患者本人身上采集其一部分的虹彩色素上皮細(xì)胞，所以，可將上述虹彩色素上皮細(xì)胞作為可自身移植的再生材料來(lái)進(jìn)行有效的利用。
另外，虹彩色素上皮細(xì)胞的組織少，其細(xì)胞數(shù)量也較少，所以，難以對(duì)該虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)。本申請(qǐng)發(fā)明人此前曾公開(kāi)了成功地分離培養(yǎng)出雞雛的虹彩色素上皮細(xì)胞的情況(參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)7(Experimental Cell Res.245，245-251頁(yè)，1998年)。在該非專(zhuān)利文獻(xiàn)7中，通過(guò)在一定培養(yǎng)條件下的實(shí)驗(yàn)，揭示出雞雛的虹彩色素上皮細(xì)胞具有向晶體分化轉(zhuǎn)換的能力。
進(jìn)而，本申請(qǐng)發(fā)明人通過(guò)改變上述非專(zhuān)利文獻(xiàn)7的方法，使得對(duì)哺乳動(dòng)物(小鼠、大鼠、人胎兒)的虹彩細(xì)胞的分離培養(yǎng)成為可能(參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)8(Nature Neuroscience 4<12>，1163頁(yè)，2001年)。
在上述非專(zhuān)利文獻(xiàn)8中，在分離成體大鼠的虹彩組織并對(duì)其實(shí)施原代培養(yǎng)(Primary Culture)后，雖然確認(rèn)了一部分細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)標(biāo)記(Neural Marker)，但是，并未檢測(cè)出特異性分化了的神經(jīng)標(biāo)記。為了得到網(wǎng)膜的視細(xì)胞，如果使所培養(yǎng)的虹彩細(xì)胞強(qiáng)制性表達(dá)用于暗示在視細(xì)胞的發(fā)育時(shí)期發(fā)揮重要作用的Crx基因，則可以確認(rèn)所培養(yǎng)的虹彩細(xì)胞產(chǎn)生了感光功能所必需的視紫紅質(zhì)(Rhodopsin)蛋白質(zhì)。
根據(jù)上述非專(zhuān)利文獻(xiàn)8，僅僅在使得強(qiáng)制性表達(dá)作為特異性基因的Crx基因的情況下，才誘導(dǎo)其向視細(xì)胞分化。但是，如果考慮到在治療中的應(yīng)用，借助于基因的強(qiáng)制性表達(dá)而實(shí)施的誘導(dǎo)分化會(huì)帶來(lái)?yè)p傷DNA等的風(fēng)險(xiǎn)，所以，并非理想的方案。
因此，就目前的現(xiàn)狀而言，由源于虹彩組織的神經(jīng)干細(xì)胞(虹彩色素上皮細(xì)胞)誘導(dǎo)分化網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，由此生產(chǎn)能夠有效地用于再生治療的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的方法尚未被確立。
如上上述，由于能夠從患者本人身上采集其一部分細(xì)胞，所以，如果能夠得到由虹彩色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，利用患者自身的細(xì)胞的再生治療就能得以實(shí)現(xiàn)。并且，可以期待將會(huì)給現(xiàn)今尚無(wú)有效治療方法的網(wǎng)膜變性疾患的治療方法的確立作出重要的貢獻(xiàn)。
本發(fā)明是鑒于上述問(wèn)題而進(jìn)行開(kāi)發(fā)的，目的是提供一種通過(guò)由具有能夠有效地用于再生治療的可能性的虹彩色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞而無(wú)需導(dǎo)入基因來(lái)生產(chǎn)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的方法、以及由該方法得到的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)的發(fā)明人對(duì)上述課題進(jìn)行潛心研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)通過(guò)共同培養(yǎng)胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞及虹彩色素上皮細(xì)胞，或者，通過(guò)在培養(yǎng)基上對(duì)虹彩色素上皮細(xì)胞實(shí)施接觸培養(yǎng)，無(wú)需導(dǎo)入基因就能誘導(dǎo)從虹彩色素上皮細(xì)胞向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的分化，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法的特征在于共同培養(yǎng)胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞和虹彩色素上皮細(xì)胞，由虹彩色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法，通過(guò)共同培養(yǎng)胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞及虹彩色素上皮細(xì)胞，無(wú)需象現(xiàn)有技術(shù)(參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)8)那樣地導(dǎo)入基因，就能進(jìn)行向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。因此，在將通過(guò)本發(fā)明的生產(chǎn)方法所得到的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞用作再生治療的材料時(shí)，不會(huì)帶來(lái)諸如損傷DNA等的危險(xiǎn)，所以，具有可有效地用于再生治療的可能性。
另外，關(guān)于上述虹彩色素上皮細(xì)胞，如上上述，可從患者本人身上采集其一部分細(xì)胞，因此，通過(guò)本發(fā)明的生產(chǎn)方法，可由源于患者的虹彩色素上皮細(xì)胞得到網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)采用了患者自身細(xì)胞的再生治療。由此，能夠克服諸如免疫排斥問(wèn)題、倫理問(wèn)題、作為移植材料的移植細(xì)胞源的供需失衡等的再生治療中的問(wèn)題，并有望對(duì)現(xiàn)在尚無(wú)有效治療方法的網(wǎng)膜變性疾患的治療方法的確立做出貢獻(xiàn)。
此外，本發(fā)明的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法的特征在于在上述的生產(chǎn)方法中，上述虹彩色素上皮細(xì)胞來(lái)源于哺乳類(lèi)。
根據(jù)上述方法，能夠生產(chǎn)在過(guò)去尚未發(fā)現(xiàn)有效的誘導(dǎo)分化方法的哺乳類(lèi)的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。本方法可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、生物技術(shù)等領(lǐng)域。
此外，本發(fā)明的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法的特征在于在上述的生產(chǎn)方法中，上述胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞來(lái)源于鳥(niǎo)類(lèi)。
根據(jù)上述方法，關(guān)于虹彩色素上皮細(xì)胞，鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞和哺乳類(lèi)細(xì)胞具有相同的與因子響應(yīng)的性質(zhì)，因此，在由哺乳類(lèi)的虹彩色素上皮細(xì)胞生產(chǎn)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞時(shí)，能夠進(jìn)行良好的誘導(dǎo)分化。另外，與哺乳類(lèi)的胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞相比，鳥(niǎo)類(lèi)的胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞易于分離，可得到較多的數(shù)量，因此，其具有便于利用的優(yōu)點(diǎn)。
此外，本發(fā)明的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法的特征在于在上述的生產(chǎn)方法中，上述虹彩色素上皮細(xì)胞是在從眼球分離后用浮游凝集塊培養(yǎng)法進(jìn)行了選擇性培養(yǎng)的虹彩色素上皮細(xì)胞。
根據(jù)上述方法，用浮游凝集塊培養(yǎng)方法對(duì)所分離的虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，可得到與形成神經(jīng)干細(xì)胞的凝集塊(sphere)非常相似的凝集塊。因此，適于通過(guò)誘導(dǎo)分化上述虹彩色素上皮細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。
另外，關(guān)于上述虹彩色素上皮細(xì)胞，如后所述，可以用現(xiàn)有公知的添加了生長(zhǎng)因子等的培養(yǎng)基對(duì)其實(shí)施培養(yǎng)，從而誘導(dǎo)向神經(jīng)細(xì)胞的分化。即，可以說(shuō)上述虹彩色素上皮細(xì)胞為相對(duì)未分化狀態(tài)。另外，上述虹彩色素上皮細(xì)胞也可以被稱(chēng)為”源于虹彩組織的神經(jīng)干細(xì)胞”。
此外，本發(fā)明的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法的特征在于在上述的生產(chǎn)方法中，通過(guò)從眼球取出虹彩組織的虹彩組織取出工序以及從所取出的上述虹彩組織分離虹彩色素上皮的虹彩色素上皮分離工序來(lái)分離上述虹彩色素上皮細(xì)胞。
根據(jù)上述方法，能夠可靠地分離虹彩色素上皮細(xì)胞，可有效地用于網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。
另外，本發(fā)明的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞是通過(guò)上述任一生產(chǎn)方法所得到的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。
上述網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞是利用可從患者本人身上采集一部分細(xì)胞的虹彩色素上皮細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)的，因此，能夠?qū)崿F(xiàn)采用患者自身的細(xì)胞的再生治療。并且，能夠克服諸如免疫排斥問(wèn)題、倫理問(wèn)題、作為移植材料的移植細(xì)胞源的供需失衡等的再生治療中的問(wèn)題。
此外，上述網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞是無(wú)需進(jìn)行基因的導(dǎo)入而誘導(dǎo)分化了的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，所以，不存在諸如損傷DNA等的危險(xiǎn)性，并可確保被用于治療時(shí)的安全性。
進(jìn)而，本發(fā)明的另一網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法是采用了接觸培養(yǎng)的生產(chǎn)方法，其特征在于，該方法由下述步驟構(gòu)成從眼球分離虹彩色素上皮細(xì)胞的步驟；以及在無(wú)血清培養(yǎng)基上對(duì)上述虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行接觸培養(yǎng)，誘導(dǎo)其向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法，通過(guò)在無(wú)血清培養(yǎng)基上對(duì)上述虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行接觸培養(yǎng)，無(wú)需象現(xiàn)有技術(shù)(參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)8)那樣地導(dǎo)入基因，就能進(jìn)行向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。因此，在將通過(guò)本發(fā)明的生產(chǎn)方法所得到的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞用作再生治療的材料時(shí)，也不會(huì)帶來(lái)諸如損傷DNA等的危險(xiǎn)，所以，具有可有效地用于再生治療的可能性。
另外，關(guān)于上述虹彩色素上皮細(xì)胞，如上上述，可從患者本人身上采集其一部分細(xì)胞，因此，通過(guò)本發(fā)明的生產(chǎn)方法，可由源于患者的虹彩色素上皮細(xì)胞得到網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)采用了患者自身細(xì)胞的再生治療。從而能夠克服諸如免疫排斥問(wèn)題、倫理問(wèn)題、作為移植材料的移植細(xì)胞源的供需失衡等的再生治療中的問(wèn)題。由此，本方法有望對(duì)現(xiàn)在尚無(wú)有效治療方法的網(wǎng)膜變性疾患的治療方法的確立做出貢獻(xiàn)。
此外，上述采用了接觸培養(yǎng)的生產(chǎn)方法的特征在于上述虹彩色素上皮細(xì)胞來(lái)源于鳥(niǎo)類(lèi)或哺乳類(lèi)。
根據(jù)上述方法，也如下述實(shí)施例所示，可得到諸如網(wǎng)膜視細(xì)胞、雙極細(xì)胞、Müller神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等的各種網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。
此外，本發(fā)明的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法的特征在于在上述采用了接觸培養(yǎng)的的生產(chǎn)方法中，在上述接觸培養(yǎng)中的培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的上述無(wú)血清培養(yǎng)基中，以1-100ng/ml的濃度含有FGF2、FGF9、CNTF中的至少一種。
根據(jù)上述方法，在上述無(wú)血清培養(yǎng)基中以1-100ng/ml的濃度含有上述因子，由此，能夠更可靠地誘導(dǎo)向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的分化，并能提高網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)效率。另外，在本發(fā)明中，可以含有多種上述各因子。在該情況下，各因子的濃度也優(yōu)選為1-100ng/ml。
此外，本發(fā)明的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法的特征在于在上述采用了接觸培養(yǎng)的的生產(chǎn)方法中，在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)上述虹彩色素上皮細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基上的細(xì)胞密度(每cm2的細(xì)胞數(shù)量)為小于或等于1×105個(gè)/cm2。
根據(jù)上述方法，在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)上述虹彩色素上皮細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基上的細(xì)胞密度為小于或等于1×105個(gè)/cm2，由此，能夠更可靠地誘導(dǎo)向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的分化，并能提高網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)效率。
進(jìn)而，本發(fā)明的另一網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法是采用了接觸培養(yǎng)的生產(chǎn)方法，其特征在于，該方法由下述步驟構(gòu)成從眼球分離虹彩色素上皮細(xì)胞的步驟；將上述虹彩色素上皮細(xì)胞植入含有FGF2和/或FGF9的培養(yǎng)基上并開(kāi)始接觸培養(yǎng)的步驟；以及在上述開(kāi)始接觸培養(yǎng)的步驟后，從上述培養(yǎng)基中除去FGF2和/或FGF9，而且，在上述培養(yǎng)基中添加CNTF，對(duì)上述虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行接觸培養(yǎng)，誘導(dǎo)其向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化的步驟。
根據(jù)上述另一采用了接觸培養(yǎng)的生產(chǎn)方法，除由上述采用了接觸培養(yǎng)的生產(chǎn)方法所得到的效果外，還能夠更快地誘導(dǎo)向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的分化。
在上述采用了接觸培養(yǎng)的另一生產(chǎn)方法中，在上述開(kāi)始接觸培養(yǎng)的步驟中上述培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基的情況下，可在上述誘導(dǎo)向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化的步驟中，進(jìn)而在上述培養(yǎng)基中添加血清。
另外，本發(fā)明的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞是根據(jù)上述采用了接觸培養(yǎng)的生產(chǎn)方法中的任意一種方法所得到的。
上述網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞是利用可從患者本人身上采集一部分細(xì)胞的虹彩色素上皮細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)的，因此，能夠?qū)崿F(xiàn)采用患者自身的細(xì)胞的再生治療。由此，能夠克服諸如免疫排斥問(wèn)題、倫理問(wèn)題、作為移植材料的移植細(xì)胞源的供需失衡等的再生治療中的問(wèn)題。
此外，上述網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞是無(wú)需進(jìn)行基因的導(dǎo)入而誘導(dǎo)分化了的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，所以，不存在諸如損傷DNA等的危險(xiǎn)性，在應(yīng)用于治療時(shí)可確保安全性。
本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)在以下的描述中會(huì)變得十分明了。此外，以下參照附圖來(lái)明確本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。


圖1是表示本發(fā)明的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法的一個(gè)實(shí)施方式的概略步驟圖。
圖2是表示在圖1所示的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法的共同培養(yǎng)步驟中使用的共同培養(yǎng)系統(tǒng)的示意圖。
圖3是表示本發(fā)明的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法的其他實(shí)施方式的概略步驟圖。
圖4(a)是表示來(lái)源于小鼠的虹彩色素上皮細(xì)胞的視紫紅質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞的示意圖。其中，箭頭所示的地方是本實(shí)施例中被抗體染色了的視紫紅質(zhì)。圖4(b)是表示來(lái)源于小鼠的虹彩色素上皮細(xì)胞的波形蛋白(Vimentin)陽(yáng)性細(xì)胞的示意圖。其中，白色區(qū)域是本實(shí)施例中被抗體染色了的波形蛋白。
圖5(a)是表示來(lái)源于雞雛的虹彩色素上皮細(xì)胞的視紫紅質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞的示意圖。其中，白色區(qū)域是本實(shí)施例中被抗體染色了的視紫紅質(zhì)。圖5(b)是表示來(lái)源于雞雛的虹彩色素上皮細(xì)胞的視紫藍(lán)質(zhì)(Iodopsin)陽(yáng)性細(xì)胞的示意圖。其中，白色區(qū)域是本實(shí)施例中被抗體染色了的視紫藍(lán)質(zhì)。圖5(c)是表示來(lái)源于雞雛的虹彩色素上皮細(xì)胞的PKC陽(yáng)性細(xì)胞的示意圖。其中，白色區(qū)域是本實(shí)施例中被抗體染色了的PKC。
圖6是表示來(lái)源于小鼠的虹彩色素上皮細(xì)胞的凝集塊(Sphere)的示意圖。
圖7(a)是表示來(lái)源于雞雛的虹彩色素上皮細(xì)胞的視紫紅質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞的示意圖。其中，白色區(qū)域是本實(shí)施例中被抗體染色了的視紫紅質(zhì)。圖7(b)是表示來(lái)源于雞雛的虹彩色素上皮細(xì)胞的視紫藍(lán)質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞的示意圖。其中，白色區(qū)域是本實(shí)施例中被抗體染色了的視紫藍(lán)質(zhì)。圖7(c)是表示來(lái)源于雞雛的虹彩色素上皮細(xì)胞的HPC-1陽(yáng)性細(xì)胞的示意圖。其中，白色區(qū)域是本實(shí)施例中被抗體染色了的HPC-1。
具體實(shí)施例方式以下，參照?qǐng)D1、圖2、圖4(a)和圖4(b)來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式1。另外，本發(fā)發(fā)明并不限于該描述。
在本實(shí)施方式1中，對(duì)下述方法進(jìn)行說(shuō)明，即，通過(guò)共同培養(yǎng)胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞和虹彩色素上皮細(xì)胞并由虹彩色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，來(lái)生產(chǎn)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的方法。
圖1表示本實(shí)施方式的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法的概略步驟。如圖1所示，本實(shí)施方式的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法大致由3個(gè)步驟構(gòu)成。第1個(gè)步驟為虹彩色素上皮細(xì)胞分離步驟，即，從動(dòng)物的眼球分離虹彩色素上皮細(xì)胞的步驟(S1)。第2個(gè)步驟為選擇培養(yǎng)步驟，即，利用浮游凝集塊培養(yǎng)方法，來(lái)選擇性地培養(yǎng)所分離的虹彩色素上皮細(xì)胞的步驟(S2)。第3個(gè)步驟為共同培養(yǎng)步驟，即，對(duì)所選擇培養(yǎng)的上述虹彩色素上皮細(xì)胞和胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng)的步驟(S3)。
換言之，根據(jù)本實(shí)施方式的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法，通過(guò)實(shí)施共同培養(yǎng)步驟(S3)，虹彩色素上皮細(xì)胞向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化，其結(jié)果，能夠得到網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，其中，在該共同培養(yǎng)步驟(S3)中，對(duì)借助于虹彩色素上皮細(xì)胞分離步驟(S1)及后續(xù)實(shí)施的虹彩色素上皮細(xì)胞的選擇培養(yǎng)步驟(S2)所得到的虹彩色素上皮細(xì)胞和胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng)。另外，通過(guò)上述選擇培養(yǎng)步驟(S2)培養(yǎng)的虹彩色素上皮細(xì)胞為相對(duì)未分化狀態(tài)，具有分化為各種神經(jīng)細(xì)胞的可能性，因此，也可以稱(chēng)之為”源于虹彩組織的神經(jīng)干細(xì)胞”。
此外，在本實(shí)施方式中，對(duì)用于網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞生產(chǎn)的虹彩色素上皮細(xì)胞，在從哺乳類(lèi)的眼球?qū)⑵浞蛛x后，如上上述，通過(guò)浮游凝集塊培養(yǎng)方法對(duì)其實(shí)施選擇性培養(yǎng)。由此，可以得到與形成源于腦或脊髓的神經(jīng)干細(xì)胞的凝集塊非常類(lèi)似的凝集塊(Sphere)，能夠有效地用于神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。
在此，對(duì)本方法所用的胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞進(jìn)行說(shuō)明。
所稱(chēng)的胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞，在參考文獻(xiàn)1(Turner DL&Cepko，Nature(1987年)328131-136頁(yè))中已經(jīng)得到證實(shí)，是在分化后成為網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的未分化的細(xì)胞。可以通過(guò)現(xiàn)有公知的方法從胚胎的網(wǎng)膜組織分離上述胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞。關(guān)于上述分離，例如，可以通過(guò)在參考文獻(xiàn)2(Akagi T.et.al.，Neurosci Lett.，2003年5月8日，341(3)213-216頁(yè))中記載的方法來(lái)實(shí)施之。
關(guān)于采集上述胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞的動(dòng)物種類(lèi)，對(duì)此并不作特別的限制。但在利用源于哺乳類(lèi)的虹彩色素上皮細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選從哺乳類(lèi)或鳥(niǎo)類(lèi)的網(wǎng)膜組織中采集并進(jìn)行分離。進(jìn)而，由于可從發(fā)育中的卵中采集，所以，分離相對(duì)容易并且廉價(jià)，還能得到相對(duì)多的數(shù)量，鑒于此點(diǎn)，優(yōu)選使用源于鳥(niǎo)類(lèi)的胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞，并且，在鳥(niǎo)類(lèi)中優(yōu)選使用源于雞的胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞。
此外，關(guān)于要采集在本實(shí)施方式的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法中所用的虹彩色素上皮細(xì)胞的動(dòng)物種類(lèi)，也并沒(méi)有特別的限制。但是，由于希望將本生產(chǎn)方法適用于過(guò)去尚未發(fā)現(xiàn)有效的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化方法的哺乳類(lèi)，所以，上述虹彩色素上皮細(xì)胞優(yōu)選來(lái)源于哺乳類(lèi)。并且，考慮到作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的利用價(jià)值，進(jìn)一步優(yōu)選小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠(Hamster)、小家鼠(Mus Musculus)等的嚙齒類(lèi)，或者，如果考慮到臨床應(yīng)用，則進(jìn)一步優(yōu)選利用來(lái)源于視覺(jué)功能更發(fā)達(dá)的動(dòng)物(雪貂、猴子)或人的虹彩色素上皮細(xì)胞。
接著，進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明分離、培養(yǎng)虹彩色素上皮細(xì)胞的方法，即，虹彩色素上皮細(xì)胞分離步驟(S1)和選擇培養(yǎng)步驟(S2)。
如圖1所示，可利用至少包括從眼球分離虹彩色素上皮細(xì)胞的虹彩色素上皮細(xì)胞分離步驟(步驟1，以下將步驟簡(jiǎn)稱(chēng)為S)和借助于浮游凝集塊培養(yǎng)方法選擇性地培養(yǎng)所分離的虹彩色素上皮細(xì)胞的選擇培養(yǎng)步驟(S2)，來(lái)實(shí)施虹彩色素上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)。根據(jù)該方法，能夠獲得與形成源于腦、脊髓的神經(jīng)干細(xì)胞的凝集塊(Sphere)非常類(lèi)似的凝集塊。
這里，分離虹彩色素上皮細(xì)胞的哺乳類(lèi)可以是從胚胎到成體的任何時(shí)期的個(gè)體。即，在本實(shí)施方式的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法中，作為其材料，不但能夠使用源于哺乳類(lèi)胚胎的虹彩色素上皮細(xì)胞，還可以使用源于哺乳類(lèi)成體的虹彩色素上皮細(xì)胞。
關(guān)于S1的虹彩色素上皮細(xì)胞分離步驟，只要能夠分離虹彩色素上皮細(xì)胞即可，并不對(duì)其具體方式進(jìn)行限制。一般而言，利用現(xiàn)有公知的方法，從哺乳類(lèi)的眼球取出虹彩組織，并從取出的虹彩組織中分離虹彩色素上皮細(xì)胞即可。作為從哺乳類(lèi)的眼球取出虹彩組織的方法，優(yōu)選采用上述非專(zhuān)利文獻(xiàn)8所記載的方法。
關(guān)于S2的選擇培養(yǎng)步驟，只要能夠僅對(duì)從哺乳類(lèi)的眼球分離的虹彩色素上皮細(xì)胞實(shí)施選擇性的培養(yǎng)即可，并不限定其具體的方式。一般而言，利用現(xiàn)有公知的方法，僅對(duì)從哺乳類(lèi)的眼球分離的虹彩色素上皮細(xì)胞實(shí)施選擇性的培養(yǎng)即可。
上述虹彩色素上皮細(xì)胞分離步驟(S1)，至少包括作為工序1(以下，將工序簡(jiǎn)稱(chēng)為P)的虹彩組織取出工序；以及作為P2的虹彩色素上皮分離工序。
此外，上述虹彩組織取出工序(P1)，如圖1所示，至少包括作為P3的僅從哺乳類(lèi)的眼球切除虹彩組織的虹彩組織切除階段；作為P4的對(duì)所切除的虹彩組織實(shí)施酶處理的酶處理階段；以及作為P5的使酶處理后的虹彩組織恢復(fù)的虹彩組織恢復(fù)階段。
另外，上述選擇培養(yǎng)步驟(S2)，至少包括作為P6的細(xì)胞解離階段，用于將在上述虹彩色素上皮細(xì)胞分離步驟(S1)中分離的虹彩色素上皮細(xì)胞從凝集狀態(tài)解離為一個(gè)一個(gè)的細(xì)胞；以及作為P7的細(xì)胞培養(yǎng)階段，僅僅對(duì)所分離的虹彩色素上皮細(xì)胞實(shí)施選擇性的培養(yǎng)。
以下，詳細(xì)地說(shuō)明上述虹彩組織取出工序(P1)中的各階段P3至P5。首先，關(guān)于P3的虹彩組織切除階段，只要從哺乳類(lèi)的眼球僅僅切除虹彩組織即可，并不特別限制其具體的方式。一般而言，利用現(xiàn)有公知的方式，從哺乳類(lèi)的眼球僅僅切除虹彩組織即可。例如，可以用市面上銷(xiāo)售的微型手術(shù)剪來(lái)實(shí)施P3的虹彩組織切除階段中的虹彩組織切除。
關(guān)于P4的酶處理階段，為了使虹彩色素上皮易于從虹彩組織分離而對(duì)虹彩組織實(shí)施酶處理，并不特別限制其具體的方式。一般而言，利用現(xiàn)有公知的方式實(shí)施即可。
例如，可以用含有在市面上銷(xiāo)售的分散酶(Dispase)的分散酶溶液使虹彩組織反應(yīng)15-40分鐘，然后，用含有在市面上銷(xiāo)售的EDTA(乙二胺四乙酸)的EDTA溶液使其反應(yīng)20-30分鐘，由此，來(lái)實(shí)施P4的酶處理階段。另外，關(guān)于在P4的酶處理階段中使用的酶和試劑，對(duì)此并不進(jìn)行特別的限定，可以使用現(xiàn)有公知的能夠?qū)绮式M織進(jìn)行處理以使得虹彩色素上皮易于從虹彩組織分離的酶和試劑。
在P5的虹彩組織恢復(fù)處理階段中，恢復(fù)因酶處理而衰弱了的虹彩組織。關(guān)于其具體的方式，在此并不進(jìn)行特別的限定，利用現(xiàn)有公知的方式實(shí)施即可。
例如，可以在酶處理階段的反應(yīng)后，使虹彩組織在含有市面上銷(xiāo)售的牛胚胎血清的培養(yǎng)液中反應(yīng)30-60分鐘，由此，來(lái)實(shí)施P5的虹彩組織恢復(fù)處理階段。另外，關(guān)于在P5的虹彩組織恢復(fù)處理階段中使用的含有血清的培養(yǎng)液和試劑，對(duì)此并不進(jìn)行特別的限定，可以使用現(xiàn)有公知的能夠恢復(fù)衰弱的虹彩組織的含有血清的培養(yǎng)液和試劑。
此外，在上述虹彩組織取出工序(P1)中，P4的酶處理階段和P5的虹彩組織恢復(fù)處理階段的反應(yīng)時(shí)間特別重要。通過(guò)調(diào)整P4的酶處理階段的虹彩組織在分散酶溶液中的反應(yīng)時(shí)間及在EDTA溶液中的反應(yīng)時(shí)間、P5的虹彩組織恢復(fù)處理階段的在含有牛胚胎血清的培養(yǎng)液中的反應(yīng)時(shí)間，不但能夠從雞的眼球分離虹彩色素上皮，而且，還能夠從諸如小鼠、大鼠、人等的哺乳類(lèi)的眼球分離虹彩色素上皮。
以下，詳細(xì)說(shuō)明對(duì)各動(dòng)物的上述各條件。
在從小鼠的眼球分離虹彩色素上皮的情況下，優(yōu)選的是，用25-37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩組織反應(yīng)15-40分鐘，在室溫下用上述EDTA溶液0.05-0.1％使其反應(yīng)16-40分鐘，用含有8-10％牛胚胎血清的培養(yǎng)液使其反應(yīng)30-120分鐘。
另外，在從出生后10天的小鼠的眼球分離虹彩色素上皮的情況下，特別優(yōu)選的是，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩組織反應(yīng)16分鐘，在室溫下用上述EDTA溶液0.05％使其反應(yīng)20分鐘，用含有8％牛胚胎血清的培養(yǎng)液使其反應(yīng)90分鐘。
此外，在從出生后12天的小鼠的眼球分離虹彩色素上皮的情況下，特別優(yōu)選的是，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩組織反應(yīng)20分鐘，在室溫下用上述EDTA溶液0.05％使其反應(yīng)25分鐘，用含有8％牛胚胎血清的培養(yǎng)液使其反應(yīng)60分鐘。
此外，在從出生后2個(gè)月的小鼠的眼球分離虹彩色素上皮的情況下，特別優(yōu)選的是，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩組織反應(yīng)30分鐘，在室溫下用上述EDTA溶液0.05％使其反應(yīng)40分鐘，用含有8％牛胚胎血清的培養(yǎng)液使其反應(yīng)30分鐘。
在從大鼠的眼球分離虹彩色素上皮的情況下，優(yōu)選的是，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩組織反應(yīng)15-40分鐘，在室溫下用上述EDTA溶液0.05％使其反應(yīng)15-60分鐘，用含有8-10％牛胚胎血清的培養(yǎng)液使其反應(yīng)30-120分鐘。
在從人胎兒的眼球分離虹彩色素上皮的情況下，優(yōu)選的是，用25-37℃的上述分散酶溶液500-1000U/ml使虹彩組織反應(yīng)15-30分鐘，在室溫下用上述EDTA溶液0.05-0.1％中使其反應(yīng)15-40分鐘，用含有8-10％牛胚胎血清的培養(yǎng)液使其反應(yīng)10-60分鐘。
另外，在從出生后19周的人胎兒的眼球分離虹彩色素上皮的情況下，特別優(yōu)選的是，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩組織反應(yīng)30分鐘，在室溫下用上述EDTA溶液0.05％使其反應(yīng)30分鐘，用含有8％牛胚胎血清的培養(yǎng)液使其反應(yīng)60分鐘。
此外，作為上述培養(yǎng)液，例如，可以使用由INVITROGEN公司生產(chǎn)的”DMEM培養(yǎng)基”，再適量添加在市面上銷(xiāo)售的牛胚胎血清即可。
在P2的虹彩色素上皮分離工序中，只要能夠從在虹彩組織取出工序(P1)取出的虹彩組織中僅僅分離虹彩色素上皮即可，并不對(duì)其具體的方式進(jìn)行限定，其中，上述虹彩組織是由虹彩基質(zhì)和虹彩色素上皮構(gòu)建的。一般而言，利用現(xiàn)有公知的方式，從虹彩組織中僅僅分離虹彩色素上皮即可。
例如，可以利用在市面上銷(xiāo)售的微型鑷子，從恢復(fù)后的虹彩組織中僅僅剝離并收集虹彩色素上皮，由此，來(lái)實(shí)施P2的虹彩色素上皮分離工序。
接著，詳細(xì)說(shuō)明上述選擇培養(yǎng)步驟(S2)的各階段P6、P7。首先，在P6的細(xì)胞解離階段中，只要能夠?qū)⑺蛛x的虹彩色素上皮的片狀的細(xì)胞解離為一個(gè)一個(gè)的細(xì)胞即可，并不對(duì)其具體的方式進(jìn)行限制。一般而言，利用現(xiàn)有公知的方式，將所分離的虹彩色素上皮的片狀的細(xì)胞解離為一個(gè)一個(gè)的細(xì)胞即可。
例如，在P6的細(xì)胞解離階段中，利用在市面上銷(xiāo)售的胰蛋白酶(Tripsin)溶液，將所分離的虹彩色素上皮的片狀的細(xì)胞解離為一個(gè)一個(gè)的細(xì)胞。另外，例如，在P6的細(xì)胞解離階段中，還可以不使用胰蛋白酶溶液，而是借助于使用了在市面上銷(xiāo)售的微型移液器(MicroPipette)的移液操作，將所分離的虹彩色素上皮的片狀的細(xì)胞解離為一個(gè)一個(gè)的細(xì)胞。
另外，關(guān)于在P6的細(xì)胞解離階段中所用的試劑和器材，在此并不對(duì)其進(jìn)行特別的限定，可以使用現(xiàn)有公知的能夠?qū)⑺蛛x的虹彩色素上皮從凝集狀態(tài)解離為一個(gè)一個(gè)的細(xì)胞的試劑和器材。
在P7的細(xì)胞培養(yǎng)階段中，只要能夠僅對(duì)所分離的虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行選擇性的培養(yǎng)即可，而并不對(duì)其具體的方式進(jìn)行限制。一般而言，利用現(xiàn)有公知的方式，僅對(duì)所分離的虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行選擇性的培養(yǎng)即可。優(yōu)選的是，使用參考文獻(xiàn)3(Science 1992225；1707-1710)所記載的Neurosphere法(浮游凝集塊培養(yǎng)法)，僅僅對(duì)從哺乳類(lèi)的眼球分離的虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行選擇性的培養(yǎng)。
例如，在P7的細(xì)胞培養(yǎng)階段中，將在市面上銷(xiāo)售的N2添加劑(Supplement)添加到在市面上銷(xiāo)售的無(wú)血清培養(yǎng)基中，并將其用作浮游凝集塊培養(yǎng)用的培養(yǎng)液。一邊用在市面上銷(xiāo)售的搖床(Shaker)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，一邊在浮游凝集塊培養(yǎng)用的培養(yǎng)液中培養(yǎng)在P6的細(xì)胞解離階段中解離的虹彩色素上皮細(xì)胞。由此，能夠得到與形成源于腦、脊髓的神經(jīng)干細(xì)胞的凝集塊(Sphere)非常類(lèi)似的凝集塊。
另外，關(guān)于在上述P7的細(xì)胞培養(yǎng)階段中所用的培養(yǎng)液和試劑，在此并不對(duì)其進(jìn)行特別的限定，可以使用現(xiàn)有公知的能夠得到與形成源于腦、脊髓的神經(jīng)干細(xì)胞的凝集塊(Sphere)非常類(lèi)似的凝集塊的培養(yǎng)液和試劑。
通過(guò)上述方法得到的源于虹彩色素上皮細(xì)胞的凝集塊被用來(lái)和胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng)。
下面，對(duì)共同培養(yǎng)步驟(S3)進(jìn)行說(shuō)明，在該共同培養(yǎng)步驟(S3)中共同培養(yǎng)上述胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞和通過(guò)上述選擇培養(yǎng)步驟(S2)選擇培養(yǎng)了的虹彩色素上皮細(xì)胞。
例如，可以根據(jù)參考文獻(xiàn)4(Semin Cell Dev Biol(1998)，9(3)，257-262，review)所記載的方法來(lái)實(shí)施上述共同培養(yǎng)步驟(S3)。即，在置入例如來(lái)源于雞等的鳥(niǎo)類(lèi)的胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞時(shí)，也一并置入通過(guò)上述方法從哺乳類(lèi)的眼球分離的虹彩色素上皮細(xì)胞(源于虹彩組織的神經(jīng)干細(xì)胞)，從而共同培養(yǎng)胚胎網(wǎng)膜細(xì)胞和虹彩色素上皮細(xì)胞。由此，可由源于哺乳類(lèi)的虹彩色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。
具體而言，例如，在從小鼠的眼球分離虹彩組織并培養(yǎng)虹彩色素上皮細(xì)胞時(shí)，按照上述步驟(即，虹彩色素上皮細(xì)胞分離步驟(S1)、選擇培養(yǎng)步驟(S2))實(shí)施該分離和培養(yǎng)即可。然后，在培養(yǎng)3-6天后，用分散酶、胰蛋白酶混合溶液來(lái)解離細(xì)胞。進(jìn)而，將所解離的虹彩色素上皮細(xì)胞與源于鳥(niǎo)類(lèi)的胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞同時(shí)投入共同培養(yǎng)系統(tǒng)(參照參考文獻(xiàn)4)，并進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，從而可以得到由虹彩色素上皮細(xì)胞分化的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。
圖2表示在本實(shí)施方式中使用的共同培養(yǎng)系統(tǒng)的示意圖。如圖2所示，本共同培養(yǎng)系統(tǒng)的主要構(gòu)成要素為培養(yǎng)皿1；以及配置在其內(nèi)部并可沿著例如箭頭A的方向旋轉(zhuǎn)的內(nèi)部容器(Inner Well)2。在上述共同培養(yǎng)步驟(S3)中，在培養(yǎng)皿1的底部置入源于鳥(niǎo)類(lèi)的網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞5，在內(nèi)部容器2的內(nèi)部注入源于鳥(niǎo)類(lèi)的胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞3和源于哺乳類(lèi)的虹彩色素上皮細(xì)胞3，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。
另外，上述旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)優(yōu)選下述實(shí)施條件，即，培養(yǎng)溫度36.5-37.5℃，培養(yǎng)天數(shù)10-30天，旋轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)50-70rpm。
在上述培養(yǎng)條件下共同培養(yǎng)的細(xì)胞是否被誘導(dǎo)向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化，并生產(chǎn)出網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，例如，可以通過(guò)下述來(lái)確認(rèn)，即利用各特異抗體對(duì)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行染色，來(lái)檢測(cè)作為特異形質(zhì)的標(biāo)記蛋白質(zhì)。
作為上述標(biāo)記蛋白質(zhì)，例如，可以列舉出用于發(fā)揮感光功能的極其特異的作為蛋白質(zhì)的視紫紅質(zhì)或視紫藍(lán)質(zhì)。視紫紅質(zhì)是網(wǎng)膜視細(xì)胞發(fā)揮感光功能所需的蛋白質(zhì)，其在形成網(wǎng)膜視細(xì)胞的視桿細(xì)胞(Rod)中進(jìn)行特異性表達(dá)，其中，該網(wǎng)膜視細(xì)胞為網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中的一種。視紫藍(lán)質(zhì)也是網(wǎng)膜視細(xì)胞發(fā)揮感光功能所需的蛋白質(zhì)，是在形成網(wǎng)膜視細(xì)胞的視錐細(xì)胞(Cone)中進(jìn)行特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)。另外，作為其他的標(biāo)記蛋白質(zhì)，還可以利用諸如檢測(cè)作為網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的一種的Müller神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(Müller Glia Cell)的波形蛋白等。
如果從上述共同培養(yǎng)的細(xì)胞中檢測(cè)出了視紫紅質(zhì)(或者視紫藍(lán)質(zhì))(參照?qǐng)D4(a))，則可以確認(rèn)該培養(yǎng)細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成了網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞(更具體地說(shuō)，為網(wǎng)膜視細(xì)胞)。此外，如果從上述共同培養(yǎng)的細(xì)胞中檢測(cè)出了波形蛋白(參照?qǐng)D4(b))，則可以確認(rèn)該培養(yǎng)細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成了網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞(更具體地說(shuō)，為Müller神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)。
根據(jù)本實(shí)施方式的方法，也如后述的實(shí)施例所示，能可靠地由哺乳類(lèi)的虹彩色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，從而生產(chǎn)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。
另外，在本實(shí)施方式中，說(shuō)明了利用源于鳥(niǎo)類(lèi)的網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞及胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞和源于哺乳類(lèi)的虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng)的示例。但是，本發(fā)明并不限于此。即，例如，還可以全部采用源于哺乳類(lèi)的細(xì)胞來(lái)實(shí)施共同培養(yǎng)，由虹彩色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。
根據(jù)上述方法，可以通過(guò)由虹彩色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。由此，本方法具有能夠用于下述極為有效的再生治療的可能性，即，采集網(wǎng)膜疾病患者自身的一部分虹彩組織，并由該虹彩組織生產(chǎn)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的再生治療。
以下，參照?qǐng)D3、圖5(a)至圖5(c)來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式2。另外，本發(fā)發(fā)明并不限于該描述。
在本實(shí)施方式2中，對(duì)包括下述步驟的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法進(jìn)行說(shuō)明，即從眼球分離虹彩色素上皮細(xì)胞的步驟；以及在無(wú)血清培養(yǎng)基上對(duì)上述虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行接觸培養(yǎng)，并誘導(dǎo)其向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化的步驟。
本實(shí)施方式的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法，如圖3所示，主要由下述步驟構(gòu)成，即虹彩色素上皮細(xì)胞分離步驟(S11)，從眼球分離虹彩色素上皮細(xì)胞；以及接觸培養(yǎng)步驟(S13)，對(duì)虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行接觸培養(yǎng)。
關(guān)于虹彩色素上皮細(xì)胞分離步驟(S11)，由于是利用與上述實(shí)施方式1所述的虹彩色素上皮細(xì)胞分離步驟(S1參照?qǐng)D1)相同的方式來(lái)實(shí)施的，所以，在本實(shí)施方式2中，省略其說(shuō)明。
并且，在本實(shí)施方式的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法中，在上述虹彩色素上皮細(xì)胞分離步驟(S11)和接觸培養(yǎng)步驟(S13)之間，包括有相當(dāng)于上述實(shí)施方式1所述的選擇培養(yǎng)步驟(S2參照?qǐng)D1)的選擇培養(yǎng)步驟(S12)。關(guān)于選擇培養(yǎng)步驟(S12)，由于是利用與實(shí)施方式1所述的選擇培養(yǎng)步驟(S2)相同的方式來(lái)實(shí)施的，所以，在本實(shí)施方式2中，也省略其說(shuō)明。
并且，在上述選擇培養(yǎng)步驟(S12)中，選擇性地培養(yǎng)源于虹彩組織的神經(jīng)干細(xì)胞(即，虹彩色素上皮細(xì)胞)，在后續(xù)進(jìn)行的接觸培養(yǎng)步驟(S13)中，所培養(yǎng)的虹彩色素上皮細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。
另外，通過(guò)上述選擇培養(yǎng)步驟(S12)培養(yǎng)的虹彩色素上皮細(xì)胞處于相對(duì)未分化狀態(tài)，具有向各種神經(jīng)細(xì)胞分化的可能性。這里所說(shuō)的上述各種神經(jīng)系細(xì)胞，包括神經(jīng)元(神經(jīng)細(xì)胞)、作為非神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。上述神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞不顯示作為神經(jīng)元的一個(gè)特征的能動(dòng)的電響應(yīng)，是對(duì)神經(jīng)元承擔(dān)各種功能的細(xì)胞，例如，支撐神經(jīng)元、或者向神經(jīng)元提供營(yíng)養(yǎng)等。就脊椎動(dòng)物而言，上述神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)其功能和特征，被分為下述四種，即，星形膠質(zhì)(星形膠質(zhì)細(xì)胞)、神經(jīng)小膠質(zhì)(神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞)、少突膠質(zhì)(少突膠質(zhì)細(xì)胞)、施萬(wàn)細(xì)胞(Schwann Cell)。
并且，本實(shí)施方式的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法為，通過(guò)上述接觸培養(yǎng)步驟(S13)，由虹彩色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化上述神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而，其中的一部分被誘導(dǎo)分化為網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。
關(guān)于采集本實(shí)施方式2的誘導(dǎo)分化所使用的虹彩色素上皮細(xì)胞的動(dòng)物種類(lèi)，在此并不作特別的限制。例如，可以列舉出雞(包括雞雛)、鵪鶉等的鳥(niǎo)類(lèi)，或者，小鼠、大鼠、人等的哺乳類(lèi)。如果利用源于鳥(niǎo)類(lèi)或哺乳類(lèi)的虹彩色素上皮細(xì)胞并按照本實(shí)施方式2的生產(chǎn)方法來(lái)生產(chǎn)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，則如后述的實(shí)施例所述，可得到諸如網(wǎng)膜視細(xì)胞、雙極細(xì)胞、Müller神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等的各種網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。
特別是就現(xiàn)狀而言，關(guān)于哺乳類(lèi)的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，由于尚未發(fā)現(xiàn)有效的誘導(dǎo)分化方法，因此，可以說(shuō)，在網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的再生治療中，能夠利用源于哺乳類(lèi)的虹彩色素上皮細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的本實(shí)施方式的方法具有較高的可利用性。
此外，在實(shí)施方式1中，采用了由上述虹彩色素上皮細(xì)胞分離步驟及選擇培養(yǎng)步驟構(gòu)成的方法來(lái)實(shí)施哺乳類(lèi)的虹彩色素上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)。也可以采用與之相同的方法來(lái)實(shí)施鳥(niǎo)類(lèi)的虹彩色素上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)。
另外，在從眼球分離虹彩色素上皮細(xì)胞時(shí)，在虹彩色素上皮細(xì)胞分離步驟(S11)中，如實(shí)施方式1所述，利用虹彩組織取出工序(P1參照?qǐng)D1)來(lái)實(shí)施酶處理和虹彩組織恢復(fù)處理。
這里，關(guān)于上述酶處理和虹彩組織恢復(fù)處理的各條件，在從鳥(niǎo)類(lèi)的眼球分離虹彩色素上皮的情況下，優(yōu)選的是，用36.5-37.5℃的分散酶溶液1000U/ml使虹彩組織反應(yīng)10-40分鐘，在室溫下用EDTA溶液0.05-0.1％使其反應(yīng)20-50分鐘。
另外，在從雞雛的眼球分離虹彩色素上皮的情況下，更為優(yōu)選的是，用36.5-37.5℃的分散酶溶液1000U/ml使虹彩組織反應(yīng)30分鐘，在室溫下用EDTA溶液0.05-0.1％使其反應(yīng)20-40分鐘，用含有5-10％牛胚胎血清的培養(yǎng)液使其反應(yīng)5-10分鐘。
接著，具體說(shuō)明對(duì)上述虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行接觸培養(yǎng)的接觸培養(yǎng)步驟(S13)。
在上述接觸培養(yǎng)步驟(S13)中，在無(wú)血清培養(yǎng)基上對(duì)虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行接觸培養(yǎng)。上述接觸培養(yǎng)可以采用現(xiàn)有公知的接觸培養(yǎng)法，例如，上述參考文獻(xiàn)3所述的接觸培養(yǎng)法。該接觸培養(yǎng)步驟(S13)所用的培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基，除此之外并不作特別的限制，可以使用能夠?qū)⒃从诤绮噬厣掀ぜ?xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)系細(xì)胞的現(xiàn)有公知的培養(yǎng)基。
作為上述接觸培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，例如，可以使用DMEM/F12培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、EMEM培養(yǎng)基(均為INVITROGEN公司生產(chǎn))等。
另外，關(guān)于在上述接觸培養(yǎng)步驟(S13)中所用的培養(yǎng)皿和所添加的因子，在此并不作特別的限制，可以使用能夠?qū)⒃从诤绮噬厣掀ぜ?xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)系細(xì)胞的現(xiàn)有公知的培養(yǎng)皿和因子。
此外，在上述接觸培養(yǎng)用的培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的無(wú)血清培養(yǎng)基中，優(yōu)選的是，以1-100ng/ml濃度含有FGF2(Fibroblast Growth Factor2成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、FGF9(Fibroblast Growth Factor 9成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)及CNTF(毛樣體神經(jīng)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)中的至少一種因子，更為優(yōu)選的是，以10-40ng/ml濃度含有FGF2、FGF9及CNTF中的至少一種因子。
并且，優(yōu)選的是，在開(kāi)始培養(yǎng)2-5天后，停止添加上述因子中的FGF2、FGF9。即，優(yōu)選的是，從培養(yǎng)開(kāi)始到最遲經(jīng)過(guò)5天為止的時(shí)間里，使用不含F(xiàn)GF2及FGF9的無(wú)血清培養(yǎng)基。關(guān)于CNTF，優(yōu)選的是，從培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)到結(jié)束時(shí)持續(xù)添加之。由此，從培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)起用約2周的時(shí)間能夠可靠地誘導(dǎo)其向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的分化。另外，優(yōu)選的是，進(jìn)而在上述無(wú)血清培養(yǎng)基中添加在市面上銷(xiāo)售的N2添加劑。
此外，作為向上述接觸培養(yǎng)步驟(S13)所用的無(wú)血清培養(yǎng)基中添加的生長(zhǎng)因子，并不限于上述，除上述之外，例如，可以列舉出FGF2、FGF9之外的FGF-family組、EGF(Epidermal Growth Factor上皮生長(zhǎng)因子)、BDNF(Brain Derived Nutritional Factor源于腦的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)、EGF(Epidermal Growth Factor上皮生長(zhǎng)因子)、NT-3(Neurotrophin-3神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素)、NT-4(Neurotrophin-4神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素)、RA(Retinoic Acid維生素A)、PDGF(PlateletDerived Growth Factor源于血小板的生長(zhǎng)因子)、T3(Triiodothyronine三碘甲狀腺氨基酸)等。
另外，作為上述接觸培養(yǎng)用的培養(yǎng)皿，優(yōu)選由層粘連蛋白(Laminin)、膠原蛋白(Collagen)等的細(xì)胞外基質(zhì)成分所包被的培養(yǎng)皿，或者優(yōu)選多聚賴(lài)氨酸(Poly-D-Lysine)包被的培養(yǎng)皿，但是，并不限于此。
此外，向上述接觸培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的上述無(wú)血清培養(yǎng)基上植入的虹彩色素上皮細(xì)胞的細(xì)胞密度(每1cm2的細(xì)胞數(shù)量)優(yōu)選的是小于或等于1×105個(gè)/cm2。由此，能夠有效地誘導(dǎo)向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的分化。并且，為了更為有效地誘導(dǎo)向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的分化，將上述虹彩色素上皮細(xì)胞的細(xì)胞密度設(shè)定為1×104-5×104個(gè)/cm2即可。
另外，關(guān)于上述接觸培養(yǎng)步驟(S13)中的上述之外的各培養(yǎng)條件，按照現(xiàn)有公知的神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)條件來(lái)實(shí)施即可。
利用現(xiàn)有公知的一般的神經(jīng)標(biāo)記來(lái)實(shí)施神經(jīng)細(xì)胞的檢測(cè)，可由此確認(rèn)在上述的培養(yǎng)條件下接觸培養(yǎng)的細(xì)胞是否被誘導(dǎo)分化為諸如神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的各種神經(jīng)細(xì)胞。另外，在神經(jīng)元的檢測(cè)時(shí)，作為標(biāo)記而使用微管蛋白(Tubulin)、神經(jīng)絲蛋白(Neurofilament)等，在星形膠質(zhì)細(xì)胞的檢測(cè)時(shí)，作為標(biāo)記而使用GFAP等，在少突膠質(zhì)細(xì)胞的檢測(cè)時(shí)，作為標(biāo)記而使用O4等。
然后，在檢測(cè)出神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞后，例如，利用各特異抗體對(duì)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行染色，從而來(lái)檢測(cè)作為特異形質(zhì)的標(biāo)記蛋白質(zhì)，由此，可確認(rèn)是否被誘導(dǎo)向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化，結(jié)果是否生產(chǎn)了網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。此外，在上述標(biāo)記蛋白質(zhì)的抗體染色之外，從細(xì)胞提取RNA，并用RT-PCR法等來(lái)確認(rèn)標(biāo)記基因的表達(dá)，由此，也能夠確認(rèn)是否生產(chǎn)了網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。
作為上述標(biāo)記蛋白質(zhì)，例如，可以列舉出實(shí)施方式所述的視紫紅質(zhì)和視紫藍(lán)質(zhì)。這些蛋白質(zhì)在作為網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的一種的網(wǎng)膜視細(xì)胞中進(jìn)行特異性表達(dá)。另外，作為網(wǎng)膜視細(xì)胞之外的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，例如，可以列舉出雙極細(xì)胞、Müller神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞(amacrine)等。關(guān)于雙極細(xì)胞，將PKC(phosphokinase)用作特異性標(biāo)記蛋白質(zhì)，關(guān)于Müller神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，將波形蛋白用作特異性標(biāo)記蛋白質(zhì)，關(guān)于無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞，將HPC-1用作特異性標(biāo)記蛋白質(zhì)。
如果從上述接觸培養(yǎng)的細(xì)胞中檢測(cè)出了視紫紅質(zhì)和視紫藍(lán)質(zhì)(參照?qǐng)D5(a)、圖5(b))，則可以確認(rèn)該培養(yǎng)細(xì)胞已被誘導(dǎo)分化為網(wǎng)膜視細(xì)胞。另外，如果從上述接觸培養(yǎng)的細(xì)胞中檢測(cè)出了PKC(phosphokinase)(參照?qǐng)D5(c))，則可以確認(rèn)該培養(yǎng)細(xì)胞已被誘導(dǎo)分化為雙極細(xì)胞；如果從上述接觸培養(yǎng)的細(xì)胞中檢測(cè)出了波形蛋白，則可以確認(rèn)該培養(yǎng)細(xì)胞已被誘導(dǎo)分化為Müller神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；如果從上述接觸培養(yǎng)的細(xì)胞中檢測(cè)出了HPC-1，則可以確認(rèn)該培養(yǎng)細(xì)胞已被誘導(dǎo)分化為無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞。
根據(jù)上述方法，可以通過(guò)由虹彩色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。由此，本方法具有能夠用于下述極為有效的再生治療的可能性，即，采集網(wǎng)膜疾病患者自身的一部分虹彩組織，并由該虹彩組織生產(chǎn)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的再生治療。
以下，說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式3。另外，本發(fā)發(fā)明并不限于該描述。
在本實(shí)施方式3中，對(duì)包括下述步驟的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法進(jìn)行說(shuō)明，即從眼球分離虹彩色素上皮細(xì)胞的步驟；在含有FGF2和/或FGF9的培養(yǎng)基上對(duì)上述虹彩色素上皮細(xì)胞開(kāi)始接觸培養(yǎng)的步驟；以及在開(kāi)始上述接觸培養(yǎng)的步驟之后，從上述培養(yǎng)基中除去FGF2和/或FGF9，而且，在上述培養(yǎng)基中添加CNTF，對(duì)上述虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行接觸培養(yǎng)，并誘導(dǎo)其向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化的步驟。
本實(shí)施方式的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法，與實(shí)施方式2同樣地，主要由下述步驟構(gòu)成，即虹彩色素上皮細(xì)胞分離步驟(S11)，從眼球分離虹彩色素上皮細(xì)胞；以及接觸培養(yǎng)步驟(S13)，對(duì)虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行接觸培養(yǎng)。另外，與實(shí)施方式2同樣地，在本實(shí)施方式3的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法中，在上述虹彩色素上皮細(xì)胞分離步驟(S11)和接觸培養(yǎng)步驟(S13)之間，包括有選擇培養(yǎng)步驟(S12)(參照?qǐng)D3)。
并且，在本實(shí)施方式3的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法中，上述接觸培養(yǎng)步驟(S13)由下述構(gòu)成，即在含有FGF2和/或FGF9的培養(yǎng)基上對(duì)上述虹彩色素上皮細(xì)胞開(kāi)始接觸培養(yǎng)；在上述接觸培養(yǎng)開(kāi)始后，從上述培養(yǎng)基中除去FGF2和/或FGF9，而且，在上述培養(yǎng)基中添加CNTF，對(duì)上述虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行接觸培養(yǎng)，并誘導(dǎo)其向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化。
另外，在本實(shí)施方式3的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法中，在接觸培養(yǎng)步驟(S13)中使用的培養(yǎng)基和向該培養(yǎng)基添加各因子的方法不同于實(shí)施方式2。因此，在本實(shí)施方式3中，關(guān)于上述接觸培養(yǎng)步驟(S13)之外的方式，由于能夠以和實(shí)施方式2相同的方式來(lái)實(shí)施，所以，在此省略其說(shuō)明。
在本實(shí)施方式3中，在開(kāi)始接觸培養(yǎng)的步驟中所用的培養(yǎng)基可以是無(wú)血清培養(yǎng)基，但是并不限于此，也可以使用含有血清的培養(yǎng)基。作為上述接觸培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，可以使用DMEM/F12培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、EMEM培養(yǎng)基(均為INVITROGEN公司生產(chǎn))等。此外，這里所使用的血清，例如，可以列舉出牛胚胎血清(FCS)。上述血清在培養(yǎng)基中的含量?jī)?yōu)選1-10％(W/V)。
另外，在上述接觸培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的培養(yǎng)基中還含有FGF2和/或FGF9。該FGF2(或FGF9)在培養(yǎng)基中的濃度優(yōu)選為10-40ng/ml。
此外，在上述接觸培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的培養(yǎng)基中所添加的生長(zhǎng)因子并不限于上述，除上述之外，例如，可以列舉出FGF2、9之外的FGF-family組、EGF、BDNF、EGF、NT-3、NT-4、RA、PDGF、T3等。
另外，作為上述接觸培養(yǎng)用的培養(yǎng)皿，優(yōu)選由層粘連蛋白(laminin)、膠原蛋白(collagen)等的細(xì)胞外基質(zhì)成分所包被的培養(yǎng)皿，或者優(yōu)選多聚賴(lài)氨酸(poly-D-lysine)包被的培養(yǎng)皿，但是，并不限于此。
此外，向上述接觸培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的上述無(wú)血清培養(yǎng)基上植入的虹彩色素上皮細(xì)胞的細(xì)胞密度(每1cm2的細(xì)胞數(shù)量)優(yōu)選的是小于或等于1×105個(gè)/cm2。由此，能夠更有效地誘導(dǎo)向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的分化。
在上述接觸培養(yǎng)開(kāi)始后，在經(jīng)過(guò)1-3天后，從上述培養(yǎng)基中除去FGF2和/或FGF9，而且，在上述培養(yǎng)基中添加CNTF作為因子。通過(guò)在該培養(yǎng)基上持續(xù)培養(yǎng)上述虹彩色素上皮細(xì)胞，可誘導(dǎo)其向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化。
另外，在上述開(kāi)始接觸培養(yǎng)的步驟中，在采用了無(wú)血清培養(yǎng)基的情況下，可以在向培養(yǎng)基中添加CNTF時(shí)，同時(shí)添加血清(例如FCS)使得其濃度達(dá)到1-10％(W/V)。
此外，關(guān)于上述接觸培養(yǎng)步驟(S13)中的上述之外的各培養(yǎng)條件，按照與實(shí)施方式2的接觸培養(yǎng)步驟(S13)中的培養(yǎng)條件相同的培養(yǎng)條件來(lái)實(shí)施即可。
與實(shí)施方式2同樣地，利用現(xiàn)有公知的一般的神經(jīng)標(biāo)記來(lái)實(shí)施神經(jīng)細(xì)胞的檢測(cè)，可由此確認(rèn)在上述的培養(yǎng)條件下接觸培養(yǎng)的細(xì)胞是否被誘導(dǎo)分化為諸如神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的各種神經(jīng)細(xì)胞。
進(jìn)而，與實(shí)施方式2同樣地，例如，利用各特異抗體對(duì)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行染色，從而來(lái)檢測(cè)作為特異形質(zhì)的標(biāo)記蛋白質(zhì)，由此，可確認(rèn)是否被誘導(dǎo)向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化，結(jié)果是否生產(chǎn)了網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。此外，在上述標(biāo)記蛋白質(zhì)的抗體染色之外，從細(xì)胞提取RNA，并用RT-PCR法等來(lái)確認(rèn)標(biāo)記基因的表達(dá)，由此，也能夠確認(rèn)是否生產(chǎn)了網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。
根據(jù)上述方法，可以通過(guò)由虹彩色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。進(jìn)而，根據(jù)本實(shí)施方式3的方法，能夠更快地誘導(dǎo)分化網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，所以，和實(shí)施方式2的方法相比較而言，能夠以更短的時(shí)間來(lái)生產(chǎn)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。
<實(shí)施例>
以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為具體的說(shuō)明。但本發(fā)明并不限于該描述。
(從哺乳類(lèi)分離虹彩色素上皮細(xì)胞的情況)從下述哺乳類(lèi)即出生后10天、出生后12天及出生后2個(gè)月的小鼠(“C57BL6”，從SLC公司或CLEA Japan公司獲取)、出生后9-12天、出生后3周及出生后2個(gè)月的大鼠(“DA大鼠”，從SLC公司獲取)、出生后19周的人胎兒(由倉(cāng)敷成人病中心院長(zhǎng)提供，并已經(jīng)得到該中心倫理委員會(huì)的認(rèn)可)取出虹彩色素上皮細(xì)胞。
使用市面上銷(xiāo)售的微型手術(shù)剪從上述哺乳類(lèi)的眼球僅切除虹彩組織。使該虹彩組織在37℃的分散酶溶液(“デイスパ一ゼ(dispase)”，合同清酒公司生產(chǎn))1000U/ml中反應(yīng)15-40分鐘，然后，在室溫下使其在0.05％EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸)溶液中反應(yīng)20-30分鐘。在反應(yīng)后，使上述虹彩組織在含有8％牛胚胎血清的培養(yǎng)液(“DMEM培養(yǎng)基”，INVITROGEN公司生產(chǎn))中反應(yīng)30-60分鐘，使上述虹彩組織恢復(fù)。之后，利用在市面上銷(xiāo)售的微型鑷子，從上述虹彩組織中僅僅剝離并收集虹彩色素上皮，從而分離虹彩基質(zhì)和虹彩色素上皮。
在為出生后10天的小鼠的情況下，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩組織反應(yīng)16分鐘，在室溫下用上述EDTA溶液0.05％使其反應(yīng)20分鐘，用含有8％牛胚胎血清的培養(yǎng)液使其反應(yīng)90分鐘。
在為出生后12天的小鼠的情況下，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩組織反應(yīng)20分鐘，在室溫下用上述EDTA溶液0.05％使其反應(yīng)25分鐘，用含有8％牛胚胎血清的培養(yǎng)液使其反應(yīng)60分鐘。
在為出生后2個(gè)月的小鼠的情況下，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩組織反應(yīng)30分鐘，在室溫下用上述EDTA溶液0.05％使其反應(yīng)40分鐘，用含有8％牛胚胎血清的培養(yǎng)液使其反應(yīng)30分鐘。
在為出生后11天的大鼠的情況下，用上述分散酶溶液1000U/ml使上述虹彩組織反應(yīng)20分鐘，用上述EDTA溶液0.05％使其反應(yīng)25分鐘，用含有8％牛胚胎血清的培養(yǎng)液使其反應(yīng)90分鐘。
在為出生后19周的人胎兒的情況下，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩組織反應(yīng)30分鐘，在室溫下用上述EDTA溶液0.05％使其反應(yīng)30分鐘，用含有8％牛胚胎血清的培養(yǎng)液使其反應(yīng)60分鐘。
(從鳥(niǎo)類(lèi)分離虹彩色素上皮細(xì)胞的情況)從下述鳥(niǎo)類(lèi)即出生后1-3天的鳥(niǎo)雛(雞雛)(從GLOBALCHICK公司(歧阜縣)獲取)取出虹彩色素上皮細(xì)胞。關(guān)于取出的基本方法，與上述哺乳類(lèi)的情形時(shí)相同。
在為出生后2天的雞雛的情況下，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使虹彩組織反應(yīng)30分鐘，用上述EDTA溶液0.05％使其反應(yīng)30分鐘，用含有8％牛胚胎血清的培養(yǎng)液使其反應(yīng)5分鐘。另外，關(guān)于利用牛胚胎血清進(jìn)行的反應(yīng)處理，也可以省略之。
(浮游凝集塊培養(yǎng)法)使用市面上銷(xiāo)售的胰蛋白酶溶液將上述分離的哺乳類(lèi)或鳥(niǎo)類(lèi)的虹彩色素上皮組織解離為細(xì)胞。然后，按照上述參考文獻(xiàn)3所述的neurosphere法(浮游凝集塊培養(yǎng)法)，對(duì)上述所解離的虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行選擇性的培養(yǎng)。浮游凝集塊培養(yǎng)的培養(yǎng)基為，在無(wú)血清培養(yǎng)基(“DMEM/F12培養(yǎng)基”，INVITROGEN公司生產(chǎn))中添加1/100量的INVITROGEN公司生產(chǎn)的N2添加劑。一邊用在市面上銷(xiāo)售的搖床進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，一邊在上述浮游凝集塊培養(yǎng)液中培養(yǎng)上述進(jìn)行了胰蛋白酶處理的虹彩色素上皮細(xì)胞，由此，能夠得到與形成源于腦或脊髓的神經(jīng)干細(xì)胞的凝集塊(Sphere)非常類(lèi)似的凝集塊(參照?qǐng)D6)。
(通過(guò)共同培養(yǎng)實(shí)施從虹彩色素上皮細(xì)胞向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化)按照參考文獻(xiàn)4所述的方法，在置入雞的胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞時(shí)，也一并置入通過(guò)上述方法從小鼠的眼球分離、解離的虹彩色素上皮細(xì)胞(源于虹彩組織的神經(jīng)干細(xì)胞)。
具體而言，按照上述步驟來(lái)實(shí)施小鼠虹彩的分離以及虹彩色素上皮細(xì)胞的培養(yǎng)。在培養(yǎng)3-6天后，用分散酶、胰蛋白酶混合溶液來(lái)解離細(xì)胞。將所解離的虹彩色素上皮細(xì)胞與雞胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞同時(shí)投入內(nèi)部容器2內(nèi)，并進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(參照?qǐng)D2)。
在經(jīng)過(guò)14天時(shí)間的培養(yǎng)后，采集培養(yǎng)細(xì)胞。
接著，通過(guò)對(duì)各網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記蛋白質(zhì)的抗體染色，來(lái)確認(rèn)上述培養(yǎng)細(xì)胞是否被誘導(dǎo)分化為網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。其結(jié)果，如圖4(a)、圖4(b)所示，從上述細(xì)胞中檢測(cè)出了用于發(fā)揮感光功能的極其特異的蛋白質(zhì)視紫紅質(zhì)(圖4(a)中箭頭所示的位置)、以及在Müller神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中特異的蛋白質(zhì)波形蛋白(圖4(b)中的白色區(qū)域)。
在上述培養(yǎng)細(xì)胞中檢測(cè)出了視紫紅質(zhì)，據(jù)此可以證實(shí)該培養(yǎng)細(xì)胞已被誘導(dǎo)分化為網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞(更具體地說(shuō)，為網(wǎng)膜視細(xì)胞)。另外，在上述培養(yǎng)細(xì)胞中檢測(cè)出了波形蛋白，據(jù)此還可以證實(shí)該培養(yǎng)細(xì)胞已被誘導(dǎo)分化為網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞(更具體地說(shuō)，為Müller神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)。
(通過(guò)接觸培養(yǎng)實(shí)施向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化的實(shí)施例1)在本實(shí)施例1中，說(shuō)明在無(wú)血清培養(yǎng)基上對(duì)虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行接觸培養(yǎng)時(shí)向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。
將按照上述方法分離、解離的雞雛的虹彩色素上皮細(xì)胞置入由層粘蛋白包被的培養(yǎng)皿。作為培養(yǎng)液，使用了在DMEM/F12培養(yǎng)基中添加N2添加劑、生長(zhǎng)因子FGF2(20ng/ml)所得到的培養(yǎng)液。另外，這里，虹彩色素上皮細(xì)胞的細(xì)胞密度為3.2×104個(gè)/cm2。此外，在本實(shí)施方式中，采用了生長(zhǎng)因子FGF2，但也可以用FGF9代替FGF2來(lái)實(shí)施之。
從培養(yǎng)開(kāi)始4-5天后，停止添加FGF2，進(jìn)而，繼續(xù)培養(yǎng)2-7天，這時(shí)，可以確認(rèn)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了變化。
在約2周時(shí)間的無(wú)血清培養(yǎng)之后，采集培養(yǎng)細(xì)胞，用一般的神經(jīng)標(biāo)記微管蛋白(或神經(jīng)絲蛋白)、GFAP、O4對(duì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。其結(jié)果，檢測(cè)出了上述各神經(jīng)標(biāo)記，據(jù)此，可以確認(rèn)上述培養(yǎng)細(xì)胞已被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞(具體而言，為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞)。
接著，通過(guò)對(duì)各網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記蛋白質(zhì)的抗體染色，來(lái)確認(rèn)上述培養(yǎng)細(xì)胞是否被誘導(dǎo)分化為網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。其結(jié)果，如圖5(a)-5(c)所示，從上述細(xì)胞中分別檢測(cè)出了視紫紅質(zhì)(圖5(a)中的白色區(qū)域)、視紫藍(lán)質(zhì)(圖5(b)中的白色區(qū)域)、PKC(圖5(c)中的白色區(qū)域)。視紫紅質(zhì)、視紫藍(lán)質(zhì)是在網(wǎng)膜視細(xì)胞中進(jìn)行特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)。另外，PKC是在雙極細(xì)胞中進(jìn)行特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)。
在上述培養(yǎng)細(xì)胞中分別檢測(cè)出了視紫紅質(zhì)、視紫藍(lán)質(zhì)和PKC，據(jù)此可以證實(shí)該培養(yǎng)細(xì)胞已被分別誘導(dǎo)分化為作為網(wǎng)膜神經(jīng)系細(xì)胞的網(wǎng)膜視細(xì)胞、雙極細(xì)胞。
另外，在本實(shí)施例中，作為用于檢測(cè)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記而使用了視紫紅質(zhì)及視紫藍(lán)質(zhì)、PKC，由此確認(rèn)了網(wǎng)膜視細(xì)胞、雙極細(xì)胞的誘導(dǎo)。但在上述培養(yǎng)細(xì)胞中還可能包含有其他的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。
(通過(guò)接觸培養(yǎng)實(shí)施向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化的實(shí)施例2)在本實(shí)施例2中，說(shuō)明在含有血清的培養(yǎng)基上對(duì)虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行接觸培養(yǎng)時(shí)向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。
將按照上述方法分離、解離的雞雛的虹彩色素上皮細(xì)胞置入由層粘蛋白包被的培養(yǎng)皿。作為培養(yǎng)液，使用了在DMEM/F12培養(yǎng)基中添加N2添加劑、生長(zhǎng)因子FGF2(20ng/ml)和牛胚胎血清(FCS)(1％(W/V))所得到的培養(yǎng)液。另外，這里，虹彩色素上皮細(xì)胞的細(xì)胞密度為3.2×104個(gè)/cm2。此外，在本實(shí)施例中，采用了生長(zhǎng)因子FGF2，但也可以用FGF9代替FGF2來(lái)實(shí)施之。
從培養(yǎng)開(kāi)始1-3天后，停止向培養(yǎng)基添加FGF2，并添加CNTF(10-30ng/ml)，進(jìn)而，繼續(xù)培養(yǎng)2-7天，這時(shí)，可以確認(rèn)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了變化。
在約1周時(shí)間的無(wú)血清培養(yǎng)之后，采集培養(yǎng)細(xì)胞，用一般的神經(jīng)標(biāo)記、即微管蛋白(或神經(jīng)絲蛋白)、GFAP、O4對(duì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。其結(jié)果，檢測(cè)出了上述各神經(jīng)標(biāo)記，據(jù)此，可以確認(rèn)上述培養(yǎng)細(xì)胞已被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞(具體而言，為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞)。
接著，通過(guò)對(duì)各網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記蛋白質(zhì)的抗體染色，來(lái)確認(rèn)上述培養(yǎng)細(xì)胞是否被誘導(dǎo)分化為網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。其結(jié)果，如圖7(a)-7(c)所示，從上述培養(yǎng)細(xì)胞中分別檢測(cè)出了視紫紅質(zhì)(圖7(a)中的白色區(qū)域)、視紫藍(lán)質(zhì)(圖7(b)中的白色區(qū)域)、HPC-1(圖7(c)中的白色區(qū)域)。視紫紅質(zhì)、視紫藍(lán)質(zhì)是在網(wǎng)膜視細(xì)胞中進(jìn)行特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)。另外，HPC-1是在無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞中進(jìn)行特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)。
在上述培養(yǎng)細(xì)胞中分別檢測(cè)出了視紫紅質(zhì)、視紫藍(lán)質(zhì)和HPC-1，據(jù)此，可以證實(shí)該培養(yǎng)細(xì)胞已被分別誘導(dǎo)分化為作為網(wǎng)膜神經(jīng)系細(xì)胞的網(wǎng)膜視細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞。
另外，在本實(shí)施例2中，也按照上述方法對(duì)幼年小鼠的虹彩色素上皮細(xì)胞實(shí)施了分離、解離，然后，與鳥(niǎo)雛的情況同樣地進(jìn)行了誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。利用各網(wǎng)膜神經(jīng)標(biāo)記(PKC、HPC-1、視紫紅質(zhì))對(duì)通過(guò)該實(shí)驗(yàn)所得到的培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)施了各種細(xì)胞的檢測(cè)。其結(jié)果如下述表1所示。
表1源于小鼠虹彩色素上皮細(xì)胞的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的檢測(cè)

如表1所示，在培養(yǎng)細(xì)胞中檢測(cè)出了PKC、HPC-1、視紫紅質(zhì)。據(jù)此，可以證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞已被分別誘導(dǎo)分化為作為網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的雙極細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、網(wǎng)膜視細(xì)胞。
另外，在用于實(shí)施本發(fā)明的最佳方式中所說(shuō)明的具體實(shí)施方式
或?qū)嵤├齼H僅是用來(lái)闡明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容的示例。本發(fā)明并不限于上述具體示例，不應(yīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行狹義的解釋?zhuān)稍诒景l(fā)明的精神和權(quán)利要求的范圍內(nèi)進(jìn)行各種變更來(lái)實(shí)施之。
工業(yè)可利用性如上上述，根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠生產(chǎn)在過(guò)去尚未發(fā)現(xiàn)有效的誘導(dǎo)分化方法的哺乳類(lèi)的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。由于在哺乳類(lèi)中存在很多以人為代表的具有較高利用價(jià)值的動(dòng)物種類(lèi)，所以，能夠生產(chǎn)哺乳類(lèi)的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的本發(fā)明的方法有望對(duì)醫(yī)療、生物技術(shù)等領(lǐng)域的發(fā)展做出貢獻(xiàn)。
本發(fā)明的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞是利用可從患者本人身上采集一部分細(xì)胞的虹彩色素上皮細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)的，因此，能夠?qū)崿F(xiàn)采用患者自身的細(xì)胞的再生治療。并且，能夠克服諸如免疫排斥問(wèn)題、倫理問(wèn)題、作為移植材料的移植細(xì)胞源的供需失衡等的再生治療中的問(wèn)題，有望對(duì)現(xiàn)在尚無(wú)有效治療方法的網(wǎng)膜變性疾患的治療方法的確立做出貢獻(xiàn)。
另外，由于無(wú)需導(dǎo)入基因就能誘導(dǎo)分化本發(fā)明的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，因此，不存在諸如DNA損傷等的危險(xiǎn)性，可確保用于治療時(shí)的安全性。
權(quán)利要求
1.一種網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其特征在于共同培養(yǎng)胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞和虹彩色素上皮細(xì)胞，由虹彩色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其特征在于所述虹彩色素上皮細(xì)胞來(lái)源于哺乳類(lèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其特征在于所述胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞來(lái)源于鳥(niǎo)類(lèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中的任意一項(xiàng)所述的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其特征在于所述虹彩色素上皮細(xì)胞是在從眼球分離后用浮游凝集塊培養(yǎng)法進(jìn)行了選擇性培養(yǎng)的虹彩色素上皮細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中的任意一項(xiàng)所述的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其特征在于通過(guò)從眼球取出虹彩組織的虹彩組織取出工序以及從所取出的所述虹彩組織分離虹彩色素上皮的虹彩色素上皮分離工序來(lái)分離所述虹彩色素上皮細(xì)胞。
6.一種網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于該網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞是根據(jù)權(quán)利要求1至5中的任意一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法所得到的。
7.一種網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其特征在于，該方法由下述步驟構(gòu)成從眼球分離虹彩色素上皮細(xì)胞的步驟；以及在無(wú)血清培養(yǎng)基上對(duì)所述虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行接觸培養(yǎng)，誘導(dǎo)其向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其特征在于所述虹彩色素上皮細(xì)胞來(lái)源于鳥(niǎo)類(lèi)或哺乳類(lèi)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其特征在于在所述接觸培養(yǎng)中的培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的所述無(wú)血清培養(yǎng)基中，以1-100ng/ml的濃度含有FGF2、FGF9、CNTF中的至少一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求7至9中的任意一項(xiàng)所述的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其特征在于在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)所述虹彩色素上皮細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基上的細(xì)胞密度為小于或等于1×105個(gè)/cm2。
11.一種網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其特征在于，該方法由下述步驟構(gòu)成從眼球分離虹彩色素上皮細(xì)胞的步驟；將所述虹彩色素上皮細(xì)胞植入含有FGF2和/或FGF9的培養(yǎng)基上并開(kāi)始接觸培養(yǎng)的步驟；以及在所述開(kāi)始接觸培養(yǎng)的步驟后，從所述培養(yǎng)基中除去FGF2和/或FGF9，而且，在所述培養(yǎng)基中添加CNTF，對(duì)所述虹彩色素上皮細(xì)胞進(jìn)行接觸培養(yǎng)，誘導(dǎo)其向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化的步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其特征在于在所述開(kāi)始接觸培養(yǎng)的步驟中所述培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基的情況下，在所述誘導(dǎo)向網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化的步驟中，進(jìn)而在所述培養(yǎng)基中添加血清。
13.一種網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，其特征在于該網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞是根據(jù)權(quán)利要求7至12中的任意一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法所得到的。
全文摘要
本發(fā)明提供一種網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法以及由該生產(chǎn)方法得到的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。本發(fā)明的網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生產(chǎn)方法為，由虹彩色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，從而來(lái)生產(chǎn)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。其第1種方法為，對(duì)源于哺乳類(lèi)的虹彩色素上皮細(xì)胞和源于鳥(niǎo)類(lèi)的胚胎網(wǎng)膜干細(xì)胞實(shí)施共同培養(yǎng)。其第2種方法為，在分離了鳥(niǎo)類(lèi)或哺乳類(lèi)等的虹彩色素上皮細(xì)胞后，對(duì)該虹彩色素上皮細(xì)胞實(shí)施接觸培養(yǎng)。根據(jù)上述方法，能夠利用從患者自身采集的虹彩色素上皮細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，所以，可實(shí)現(xiàn)非常有效的再生治療。
文檔編號(hào)C12N5/0793GK1795266SQ20048001424
公開(kāi)日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2004年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月11日
發(fā)明者小阪美津子 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)