專利名稱：用于將需要的性狀迅速賦予生物的方法和系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及迅速改變生物的遺傳性狀的方法，和通過(guò)該方法得到的生物和產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
有史以來(lái)，人類一直在嘗試改變生物的遺傳性狀。在出現(xiàn)所謂的遺傳工程之前，已經(jīng)嘗試用雜交育種等來(lái)得到具有需要的性狀的生物，或者，已經(jīng)由輻射隨機(jī)地造成突變，和已經(jīng)分離出具有改變的遺傳性狀的突變生物。
新發(fā)展起來(lái)的遺傳工程更大程度地促進(jìn)了獲取具有改變的遺傳性狀的生物。遺傳工程已經(jīng)廣泛地用于生產(chǎn)遺傳地修飾的生物，其中外源基因被導(dǎo)入生物中。但是，僅僅向其中導(dǎo)入了外源基因的生物并不總能獲得需要的遺傳性狀。與自然進(jìn)化過(guò)程不同的操作可能導(dǎo)致意外的結(jié)果。因此，政府當(dāng)局對(duì)源自遺傳地修飾的生物(GMO)的食物的管理比常規(guī)食物更嚴(yán)格。
因此，本領(lǐng)域日益需要符合自然進(jìn)化地將需要的遺傳性狀賦予生物的方法和生產(chǎn)這樣的生物的方法。
迄今為止，已經(jīng)出現(xiàn)了下面的已知的誘變方法。
(1)自然突變生物在通常的環(huán)境下正常生長(zhǎng)時(shí)發(fā)生的突變稱作自然突變。認(rèn)為自然突變的主要原因是DNA復(fù)制的錯(cuò)誤和內(nèi)源誘變物(核苷酸類似物)(Maki，“Shizenheni To Shufukukiko[NaturalMutation And Repair Mechanism]”，Saibo Kogaku[CellEngineering]，Vol.13，No.8，pp.663-672，1994)。
(2)用輻射、誘變物等處理通過(guò)輻射處理，例如紫外光、X-射線等，或用人工誘變物處理，例如烷化劑等，會(huì)損害DNA。這樣的損害可能在DNA復(fù)制的過(guò)程中作為突變固定下來(lái)。
(3)使用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))在PCR中，由于DNA是進(jìn)行體外擴(kuò)增，所以PCR系統(tǒng)缺少一部分胞內(nèi)突變抑制機(jī)制。因此，可以高頻率地誘導(dǎo)突變。如果將DNA改組(shuffling)(Stemmer，Nature，Vol.370，pp.389-391，Aug.1994)與PCR結(jié)合，則可以避免有害突變的積累，且可以在基因中積累許多有益的突變。
(4)使用突變因子(或增變株)在幾乎所有的生物中，通過(guò)突變抑制機(jī)制來(lái)將自然突變的頻率維持在相當(dāng)?shù)偷乃俣取Ｍ蛔円种茩C(jī)制包括許多涉及10個(gè)或更多個(gè)基因的階段。突變?cè)谄渲衅茐牧艘粋€(gè)或多個(gè)基因的生物中高頻率地發(fā)生。這些生物稱作增變株。這些基因稱作增變基因(Maki，同上，和Horst等，Trends in Microbiology，Vol.7，No.1，pp.29-36，Jan.1999)。
使用增變株的方法是不一致的方法(Furusawa M.和Doi H.，J.Theor.Biol.157，pp.127-133，1992和Furusawa M.和Doi H.，Genetica 103，pp.333-347，1998；日本專利公開(kāi)8-163986；日本專利公開(kāi)8-163987；日本專利公開(kāi)9-23882；WO00/28015)。在該不一致的方法中，尚未闡明實(shí)際上生成的生物(更具體地，高等生物(例如，真核生物)是否能表現(xiàn)出正常的生長(zhǎng)曲線。另外，尚未證實(shí)該不一致的方法能加速自然進(jìn)化。
在模仿“高等生物”(例如，真核生物)，例如具有二倍體或更多套含有多個(gè)復(fù)制位點(diǎn)的染色體的真核生物的不平衡突變模型時(shí)，可能發(fā)生致死的突變。尚不清楚該不一致的方法是否可以用于實(shí)際的情形中。
在模仿不平衡突變模型時(shí)，將突變隨機(jī)地導(dǎo)入例如具有較低復(fù)制精確度的不連續(xù)鏈中。尚不清楚這樣的突變是否有助于進(jìn)化。
在嘗試使用具有導(dǎo)入的增變基因的大腸桿菌(E.coli)突變株的抗藥性實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)得到了抗藥的菌株。但是，仍沒(méi)有提示可以任意地改變或控制進(jìn)化速度的系統(tǒng)。
尚無(wú)實(shí)驗(yàn)?zāi)芡ㄟ^(guò)可提供進(jìn)化速度測(cè)量的基因組水平的分析，來(lái)確定是否以不均衡的方式實(shí)際上插入了突變。考慮到可以容易地實(shí)現(xiàn)測(cè)序技術(shù)本身，可以認(rèn)為還沒(méi)有報(bào)道鑒別出了突變位點(diǎn)的實(shí)例。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)解決了上述問(wèn)題，他們發(fā)現(xiàn)生物的進(jìn)化速度不是時(shí)間的函數(shù)，且可以通過(guò)調(diào)節(jié)生物的傾向于錯(cuò)誤的頻率來(lái)調(diào)節(jié)，并證實(shí)了具有改變的進(jìn)化速度的真實(shí)生物能以與自然進(jìn)化的生物基本上相同的速度增殖。根據(jù)本發(fā)明，可以證實(shí)錯(cuò)誤閾值不會(huì)顯著影響生物的進(jìn)化。
在本發(fā)明的另一方面，發(fā)明人研究了具有不同復(fù)制精確度的準(zhǔn)種(quasispecies)的錯(cuò)誤閾值。發(fā)明人證實(shí)了無(wú)錯(cuò)誤的和傾向于錯(cuò)誤的聚合酶的共存會(huì)增加錯(cuò)誤閾值，而不破壞性地遺失遺傳信息。發(fā)明人還指出復(fù)制子(replicores)(復(fù)制劑)會(huì)影響錯(cuò)誤閾值。結(jié)果，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，具有不同復(fù)制精確度的準(zhǔn)種會(huì)降低參與生成各種突變體的選擇性進(jìn)化的遺傳成本。
適當(dāng)?shù)倪M(jìn)化需要遺傳多樣性和有利突變體的穩(wěn)定繁殖?；蚪M的精確復(fù)制能保證穩(wěn)定的繁殖，盡管在復(fù)制過(guò)程中的錯(cuò)誤會(huì)生成遺傳多樣性。因此，進(jìn)化的一個(gè)關(guān)鍵是復(fù)制精確度所固有的。復(fù)制精確度依賴于核苷酸聚合酶。認(rèn)為胞內(nèi)聚合酶具有相似的復(fù)制精確度。進(jìn)化模型的大多數(shù)研究還已經(jīng)以相似的復(fù)制精確度為基礎(chǔ)。但是，已經(jīng)證實(shí)無(wú)錯(cuò)誤的和傾向于錯(cuò)誤的聚合酶在自然產(chǎn)生的生物中共存。本發(fā)明因此能與自然相容。
本發(fā)明提供了下述內(nèi)容。
1.調(diào)節(jié)細(xì)胞的遺傳性狀的轉(zhuǎn)化率的方法，包括下述步驟(a)調(diào)節(jié)細(xì)胞的基因復(fù)制的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
2.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中存在至少2種在基因復(fù)制中起作用的傾向于錯(cuò)誤的頻率的試劑。
3.根據(jù)項(xiàng)目2的方法，其中至少約30％的傾向于錯(cuò)誤的頻率的試劑具有更少的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
4.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中在基因復(fù)制中起作用的試劑具有不同的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
5.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中具有更少的傾向于錯(cuò)誤的頻率的試劑基本上是無(wú)錯(cuò)誤的。
6.根據(jù)項(xiàng)目2的方法，其中該傾向于錯(cuò)誤的頻率彼此存在至少101的不同。
7.根據(jù)項(xiàng)目2的方法，其中該傾向于錯(cuò)誤的頻率彼此存在至少102的不同。
8.根據(jù)項(xiàng)目2的方法，其中該傾向于錯(cuò)誤的頻率彼此存在至少103的不同。
9.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率的步驟包含調(diào)節(jié)至少一種選自下述的試劑的傾向于錯(cuò)誤的頻率能去除異常堿基的修復(fù)試劑和能修復(fù)錯(cuò)配的堿基對(duì)的修復(fù)試劑，該試劑存在于細(xì)胞中。
10.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率的步驟包含提供細(xì)胞中的雙鏈基因組DNA的一條鏈和另一條鏈之間的錯(cuò)誤數(shù)目的差異。
11.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率的步驟包含調(diào)節(jié)細(xì)胞的DNA聚合酶的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
12.根據(jù)項(xiàng)目11的方法，其中該DNA聚合酶具有校對(duì)功能。
13.根據(jù)項(xiàng)目11的方法，其中該DNA聚合酶包含至少一種選自下述的聚合酶真核細(xì)胞的DNA聚合酶α、DNA聚合酶β、DNA聚合酶γ、DNA聚合酶δ和DNA聚合酶ε和與其對(duì)應(yīng)的DNA聚合酶。
14.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率的步驟包含調(diào)節(jié)至少一種選自下述的聚合酶的校對(duì)活性真核細(xì)胞的DNA聚合酶δ和DNA聚合酶ε和與其對(duì)應(yīng)的DNA聚合酶。
15.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率包含調(diào)節(jié)原核細(xì)胞的DNA聚合酶δ或與其對(duì)應(yīng)的DNA聚合酶的校對(duì)活性。
16.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率包含將DNA聚合酶變體導(dǎo)入細(xì)胞中。
17.根據(jù)項(xiàng)目16的方法，其中通過(guò)選自同源重組和使用基因?qū)牖蛸|(zhì)粒的轉(zhuǎn)化的方法，將DNA聚合酶變體導(dǎo)入細(xì)胞中。
18.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率包含導(dǎo)入原核細(xì)胞的DNA聚合酶δ或與其對(duì)應(yīng)的DNA聚合酶的變體。
19.根據(jù)項(xiàng)目18的方法，其中該原核細(xì)胞的DNA聚合酶δ或與其對(duì)應(yīng)的DNA聚合酶的變體包含缺失了其校對(duì)活性的突變。
20.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率的步驟包含將傾向于錯(cuò)誤的頻率提高到高于野生型細(xì)胞的頻率。
21.根據(jù)項(xiàng)目12的方法，其中該DNA聚合酶的校對(duì)功能低于野生型DNA聚合酶。
22.根據(jù)項(xiàng)目12的方法，其中該DNA聚合酶的校對(duì)功能能在堿基序列中提供至少1個(gè)錯(cuò)配的堿基，至少1個(gè)錯(cuò)配的堿基的數(shù)目比野生型DNA聚合酶至少大1。
23.根據(jù)項(xiàng)目12的方法，其中該DNA聚合酶的校對(duì)功能能在堿基序列中提供至少1個(gè)錯(cuò)配的堿基。
24.根據(jù)項(xiàng)目12的方法，其中該DNA聚合酶的校對(duì)功能能提供至少2個(gè)錯(cuò)配的堿基。
25.根據(jù)項(xiàng)目12的方法，其中該DNA聚合酶的校對(duì)功能能在堿基序列中提供至少1個(gè)錯(cuò)配的堿基，其比率為10-6。
26.根據(jù)項(xiàng)目12的方法，其中該DNA聚合酶的校對(duì)功能能在堿基序列中提供至少1個(gè)錯(cuò)配的堿基，其比率為10-3。
27.根據(jù)項(xiàng)目12的方法，其中該DNA聚合酶的校對(duì)功能能在堿基序列中提供至少1個(gè)錯(cuò)配的堿基，其比率為10-2。
28.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中該細(xì)胞是革蘭氏陽(yáng)性的或真核的細(xì)胞。
29.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
30.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中該細(xì)胞是單細(xì)胞的或多細(xì)胞的生物。
31.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中該細(xì)胞是動(dòng)物、植物、真菌或酵母細(xì)胞。
32.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中該細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
33.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中在遺傳性狀轉(zhuǎn)化后，該細(xì)胞基本上具有與野生型細(xì)胞相同的生長(zhǎng)。
34.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中該細(xì)胞天然地具有至少2種聚合酶。
35.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中該細(xì)胞天然地具有至少2種聚合酶，這至少2種聚合酶具有不同的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
36.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中該細(xì)胞具有至少2種聚合酶，這至少2種聚合酶中的一種參與后隨鏈的傾向于錯(cuò)誤的頻率，且至少2種聚合酶中的另一種參與前導(dǎo)鏈的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
37.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中該細(xì)胞具有對(duì)環(huán)境的抗性，且轉(zhuǎn)化之前的細(xì)胞不具有該抗性。
38.根據(jù)項(xiàng)目37的方法，其中作為參數(shù)的環(huán)境包含至少一種選自下述的因素溫度，濕度，pH，鹽濃度，營(yíng)養(yǎng)物，金屬，氣體，有機(jī)溶劑，壓力，大氣壓力，粘度，流速，光強(qiáng)度，光波長(zhǎng)，電磁波，輻射，重力，張力，聲波，該細(xì)胞以外的細(xì)胞，化學(xué)試劑，抗生素，天然物質(zhì)，心理應(yīng)激和機(jī)體應(yīng)激，或其組合。
39.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中該細(xì)胞包括癌細(xì)胞。
40.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中該細(xì)胞構(gòu)成組織。
41.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中該細(xì)胞構(gòu)成生物。
42.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，還包括在轉(zhuǎn)化細(xì)胞的遺傳性狀后，使細(xì)胞分化成組織或生物。
43.根據(jù)項(xiàng)目1的方法，其中在預(yù)定條件下調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率。
44.根據(jù)項(xiàng)目43的方法，其中通過(guò)調(diào)節(jié)至少一種選自下述的因素來(lái)調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率溫度，濕度，pH，鹽濃度，營(yíng)養(yǎng)物，金屬，氣體，有機(jī)溶劑，壓力，大氣壓力，粘度，流速，光強(qiáng)度，光波長(zhǎng)，電磁波，輻射，重力，張力，聲波，該細(xì)胞以外的細(xì)胞，化學(xué)試劑，抗生素，天然物質(zhì)，心理應(yīng)激和機(jī)體應(yīng)激，或其組合。
45.生產(chǎn)具有受調(diào)節(jié)的遺傳性狀的細(xì)胞的方法，包括下述步驟(a)調(diào)節(jié)細(xì)胞的基因復(fù)制的傾向于錯(cuò)誤的頻率；和(b)繁殖得到的細(xì)胞。
46.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，還包括篩選具有需要的性狀的繁殖細(xì)胞。
47.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中存在至少2種在基因復(fù)制中起作用的傾向于錯(cuò)誤的頻率的試劑。
48.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中至少約30％的傾向于錯(cuò)誤的頻率的試劑具有更少的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
49.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中在基因復(fù)制中起作用的試劑具有不同的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
50.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中具有更低的傾向于錯(cuò)誤的頻率的試劑基本上是無(wú)錯(cuò)誤的。
51.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中該傾向于錯(cuò)誤的頻率彼此存在至少101的不同。
52.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中該傾向于錯(cuò)誤的頻率彼此存在至少102的不同。
53.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中該傾向于錯(cuò)誤的頻率彼此存在至少103的不同。
54.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率的步驟包含調(diào)節(jié)至少一種選自下述的試劑的傾向于錯(cuò)誤的頻率能去除異常堿基的修復(fù)試劑和能修復(fù)錯(cuò)配的堿基對(duì)的修復(fù)試劑，該試劑存在于細(xì)胞中。
55.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率的步驟包含提供細(xì)胞中的雙鏈基因組DNA的一條鏈和另一條鏈之間的錯(cuò)誤數(shù)目的差異。
56.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率的步驟包含調(diào)節(jié)細(xì)胞的DNA聚合酶的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
57.根據(jù)項(xiàng)目56的方法，其中該DNA聚合酶具有校對(duì)功能。
58.根據(jù)項(xiàng)目56的方法，其中該DNA聚合酶包含至少一種選自下述的聚合酶真核細(xì)胞的DNA聚合酶α、DNA聚合酶β、DNA聚合酶γ、DNA聚合酶δ和DNA聚合酶ε和與其對(duì)應(yīng)的DNA聚合酶。
59.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率的步驟包含調(diào)節(jié)至少一種選自下述的聚合酶的校對(duì)活性真核細(xì)胞的DNA聚合酶δ和DNA聚合酶ε和與其對(duì)應(yīng)的DNA聚合酶。
60.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率包含調(diào)節(jié)原核細(xì)胞的DNA聚合酶δ或與其對(duì)應(yīng)的DNA聚合酶的校對(duì)活性。
61.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率包含將DNA聚合酶變體導(dǎo)入細(xì)胞中。
62.根據(jù)項(xiàng)目61的方法，其中通過(guò)選自同源重組和使用基因?qū)牖蛸|(zhì)粒的轉(zhuǎn)化的方法，將DNA聚合酶變體導(dǎo)入細(xì)胞中。
63.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率包含導(dǎo)入原核細(xì)胞的DNA聚合酶δ或與其對(duì)應(yīng)的DNA聚合酶的變體。
64.根據(jù)項(xiàng)目63的方法，其中該原核細(xì)胞的DNA聚合酶δ或與其對(duì)應(yīng)的DNA聚合酶的變體包含僅僅缺失了其校對(duì)活性的突變。
65.根據(jù)項(xiàng)45的方法，其中調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率的步驟包含將傾向于錯(cuò)誤的頻率提高到高于野生型細(xì)胞的頻率。
66.根據(jù)項(xiàng)目57的方法，其中該DNA聚合酶的校對(duì)功能低于野生型DNA聚合酶。
67.根據(jù)項(xiàng)目57的方法，其中該DNA聚合酶的校對(duì)功能能在堿基序列中提供至少1個(gè)錯(cuò)配的堿基，至少1個(gè)錯(cuò)配的堿基的數(shù)目比野生型DNA聚合酶至少大1。
68.根據(jù)項(xiàng)57的方法，其中該DNA聚合酶的校對(duì)功能能在堿基序列中提供至少1個(gè)錯(cuò)配的堿基。
69.根據(jù)項(xiàng)目57的方法，其中該DNA聚合酶的校對(duì)功能能提供至少2個(gè)錯(cuò)配的堿基。
70.根據(jù)項(xiàng)目57的方法，其中該DNA聚合酶的校對(duì)功能能在堿基序列中提供至少1個(gè)錯(cuò)配的堿基，其比率為10-6。
71.根據(jù)項(xiàng)目57的方法，其中該DNA聚合酶的校對(duì)功能能在堿基序列中提供至少1個(gè)錯(cuò)配的堿基，其比率為10-3。
72.根據(jù)項(xiàng)目57的方法，其中該DNA聚合酶的校對(duì)功能能在堿基序列中提供至少1個(gè)錯(cuò)配的堿基，其比率為10-2。
73.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中該細(xì)胞是革蘭氏陽(yáng)性的或真核的細(xì)胞。
74.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
75.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中該細(xì)胞是單細(xì)胞的或多細(xì)胞的生物。
76.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中該細(xì)胞是動(dòng)物、植物、真菌或酵母細(xì)胞。
77.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中該細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
78.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中在遺傳性狀轉(zhuǎn)化后，該細(xì)胞基本上具有與野生型細(xì)胞相同的生長(zhǎng)。
79.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中該細(xì)胞天然地具有至少2種聚合酶。
80.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中該細(xì)胞天然地具有至少2種聚合酶，這至少2種聚合酶具有不同的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
81.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中該細(xì)胞具有至少2種聚合酶，這至少2種聚合酶中的一種參與后隨鏈的傾向于錯(cuò)誤的頻率，且至少2種聚合酶中的另一種參與前導(dǎo)鏈的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
82.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中該細(xì)胞具有對(duì)環(huán)境的抗性，且轉(zhuǎn)化之前的細(xì)胞不具有該抗性。
83.根據(jù)項(xiàng)目82的方法，其中作為參數(shù)的環(huán)境包含至少一種選自下述的因素溫度，濕度，pH，鹽濃度，營(yíng)養(yǎng)物，金屬，氣體，有機(jī)溶劑，壓力，大氣壓力，粘度，流速，光強(qiáng)度，光波長(zhǎng)，電磁波，輻射，重力，張力，聲波，該細(xì)胞以外的細(xì)胞，化學(xué)試劑，抗生素，天然物質(zhì)，心理應(yīng)激和機(jī)體應(yīng)激，或其組合。
84.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中該細(xì)胞包括癌細(xì)胞。
85.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中該細(xì)胞構(gòu)成組織。
86.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中該細(xì)胞構(gòu)成生物。
87.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，還包括在轉(zhuǎn)化細(xì)胞的遺傳性狀后，使細(xì)胞分化成組織或生物。
88.根據(jù)項(xiàng)目45的方法，其中在預(yù)定條件下調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率。
89.根據(jù)項(xiàng)目88的方法，其中通過(guò)調(diào)節(jié)至少一種選自下述的因素來(lái)調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率溫度，濕度，pH，鹽濃度，營(yíng)養(yǎng)物，金屬，氣體，有機(jī)溶劑，壓力，大氣壓力，粘度，流速，光強(qiáng)度，光波長(zhǎng)，電磁波，輻射，重力，張力，聲波，該細(xì)胞以外的細(xì)胞，化學(xué)試劑，抗生素，天然物質(zhì)，心理應(yīng)激和機(jī)體應(yīng)激，或其組合。
90.生產(chǎn)具有受調(diào)節(jié)的遺傳性狀的生物的方法，包括下述步驟(a)調(diào)節(jié)生物的基因復(fù)制的傾向于錯(cuò)誤的頻率；和(b)繁殖得到的生物。
91.通過(guò)根據(jù)項(xiàng)目90的方法生產(chǎn)的具有受調(diào)節(jié)的遺傳性狀的細(xì)胞。
92.根據(jù)項(xiàng)目91的細(xì)胞，其中該細(xì)胞基本上具有與野生型細(xì)胞相同的生長(zhǎng)。
93.通過(guò)根據(jù)項(xiàng)目90的方法生產(chǎn)的具有受調(diào)節(jié)的遺傳性狀的生物。
94.根據(jù)項(xiàng)目93的生物，其中該生物基本上具有與野生型生物相同的生長(zhǎng)。
95.生產(chǎn)能編碼具有受調(diào)節(jié)的遺傳性狀的基因的核酸分子的方法，包括下述步驟(a)改變生物的基因復(fù)制的傾向于錯(cuò)誤的頻率；(b)繁殖得到的生物；(c)鑒別生物中的突變；和(d)生產(chǎn)能編碼具有鑒別出的突變的基因的核酸分子。
96.通過(guò)根據(jù)項(xiàng)目95的方法生產(chǎn)出的核酸分子。
97.生產(chǎn)由具有受調(diào)節(jié)的遺傳性狀的基因編碼的多肽的方法，包括下述步驟(a)改變生物的基因復(fù)制的傾向于錯(cuò)誤的頻率；(b)繁殖得到的生物；(c)鑒別生物中的突變；和(d)生產(chǎn)由具有鑒別出的突變的基因編碼的多肽。
98.通過(guò)根據(jù)項(xiàng)目97的方法生產(chǎn)出的多肽。
99.生產(chǎn)具有受調(diào)節(jié)的遺傳性狀的生物的代謝物的方法，包括下述步驟(a)改變生物的基因復(fù)制的傾向于錯(cuò)誤的頻率；(b)繁殖得到的生物；(c)鑒別生物中的突變；和(d)生產(chǎn)具有鑒別出的突變的代謝物。
100.通過(guò)根據(jù)項(xiàng)目99的方法生產(chǎn)出的代謝物。
101.用于調(diào)節(jié)生物的遺傳性狀的核酸分子，包含能編碼具有受調(diào)節(jié)的傾向于錯(cuò)誤的頻率的DNA聚合酶的核酸序列。
102.根據(jù)項(xiàng)目101的核酸分子，其中該DNA聚合酶是真核生物的DNA聚合酶δ或ε，或革蘭氏陽(yáng)性的細(xì)菌的與其對(duì)應(yīng)的DNA聚合酶。
103.根據(jù)項(xiàng)目101的核酸分子，其中該DNA聚合酶是真核生物的DNA聚合酶δ或ε，或革蘭氏陽(yáng)性的細(xì)菌的與其對(duì)應(yīng)的DNA聚合酶的變體，該變體包含僅僅缺失了其校對(duì)活性的突變。
104.根據(jù)項(xiàng)目101的核酸分子，其中該DNA聚合酶是真核生物的DNA聚合酶δ，或革蘭氏陽(yáng)性的細(xì)菌的與其對(duì)應(yīng)的DNA聚合酶的變體，該變體包含僅僅缺失了其校對(duì)活性的突變。
105.載體，其包含根據(jù)項(xiàng)目101的核酸分子。
106.細(xì)胞，其包含根據(jù)項(xiàng)目101的核酸分子。
107.根據(jù)項(xiàng)目106的細(xì)胞，其中該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
108.根據(jù)項(xiàng)目107的細(xì)胞，其中該真核細(xì)胞選自植物、動(dòng)物和酵母。
109.根據(jù)項(xiàng)目106的細(xì)胞，其中該細(xì)胞是革蘭氏陽(yáng)性的細(xì)菌細(xì)胞。
110.根據(jù)項(xiàng)目106的細(xì)胞，其中該細(xì)胞用于調(diào)節(jié)遺傳性狀的轉(zhuǎn)化率。
111.生物，其包含根據(jù)項(xiàng)目101的核酸分子。
112.通過(guò)根據(jù)項(xiàng)目106的細(xì)胞或其一部分生產(chǎn)的產(chǎn)物物質(zhì)。
113.核酸分子，其包含在根據(jù)項(xiàng)目106的細(xì)胞或其一部分中。
114.根據(jù)項(xiàng)目113的核酸分子，其能編碼涉及受調(diào)節(jié)的遺傳性狀的基因。
115.測(cè)試藥物的方法，包括下述步驟使用根據(jù)項(xiàng)目106的細(xì)胞作為疾病模型，測(cè)試藥物的效果；使用野生型細(xì)胞作為對(duì)照，測(cè)試藥物的效果；和對(duì)比疾病模型和對(duì)照。
116.測(cè)試藥物的方法，包括下述步驟使用根據(jù)項(xiàng)目111的生物作為疾病模型，測(cè)試藥物的效果；使用野生型生物作為對(duì)照，測(cè)試藥物的效果；和對(duì)比疾病模型和對(duì)照。
117.用于調(diào)節(jié)生物的遺傳性狀的轉(zhuǎn)化率的至少2種聚合酶的組，其中該聚合酶具有不同的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
118.根據(jù)項(xiàng)目117的組，其中至少2種聚合酶中的一種參與后隨鏈的傾向于錯(cuò)誤的頻率，且至少2種聚合酶中的另一種參與前導(dǎo)鏈的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
119.根據(jù)項(xiàng)目117的組，其中該聚合酶的組源自相同的物種。
120.用于生產(chǎn)具有受調(diào)節(jié)的遺傳性狀的生物的至少2種聚合酶的組，其中該聚合酶具有不同的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
121.根據(jù)項(xiàng)目120的組，其中至少2種聚合酶中的一種參與后隨鏈的傾向于錯(cuò)誤的頻率，且至少2種聚合酶中的另一種參與前導(dǎo)鏈的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
122.根據(jù)項(xiàng)目121的組，其中該聚合酶的組源自相同的生物物種。
123.至少2種聚合酶在調(diào)節(jié)生物的遺傳性狀的轉(zhuǎn)化率中的用途，其中該聚合酶具有不同的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
124.至少2種聚合酶在生產(chǎn)具有受調(diào)節(jié)的遺傳性狀的生物中的用途，其中聚合酶具有不同的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
因而，本文所述的發(fā)明使得提供符合自然進(jìn)化地將需要的遺傳性狀賦予生物的方法的優(yōu)點(diǎn)成為可能。
在閱讀和理解了下面參考附圖的詳細(xì)描述后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能明白本發(fā)明的這些和其它的優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1表明，本發(fā)明實(shí)施例1的突變體和其野生型具有基本上相同的生長(zhǎng)曲線。
圖2顯示了被賦予了高溫抗性的本發(fā)明的實(shí)施例1。
圖3A顯示了被賦予了高溫抗性的本發(fā)明的實(shí)施例1的照片。從po13突變株(缺少外切核酸酶的DNA聚合酶δ)分離出了能在高溫生長(zhǎng)的突變株。標(biāo)記*指示親本株(AMY128-1)，且7個(gè)其它的菌落是高溫抗性株。
圖3B顯示了被賦予了高溫抗性的本發(fā)明的實(shí)施例1的另一張照片。從po12突變株(缺少外切核酸酶的DNA聚合酶ε)分離出了能在高溫生長(zhǎng)的突變株。標(biāo)記*指示親本株(AMY2-6)，且7個(gè)其它的菌落是高溫抗性株。
圖4A顯示了被賦予了高溫抗性的本發(fā)明的實(shí)施例1的照片。箭標(biāo)指示死亡的、且具有泡的細(xì)胞。對(duì)高溫抗性株1和2進(jìn)行單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)。在親本株中，沒(méi)有細(xì)胞能在41℃存活。通過(guò)本發(fā)明的方法得到的高溫抗性株可以在41℃存活。
圖4B顯示了被賦予了高溫抗性的本發(fā)明的實(shí)施例1的另一張照片。從啤酒糖酵母(S.cerevisiae)的po12突變株(缺少外切核酸酶活性的DNA聚合酶ε)中，分離出了能在被認(rèn)為酵母不能存活的41℃高溫生長(zhǎng)的突變株。頂部顯示了親本株(AMY2-6)，且其它的7個(gè)菌落是高溫抗性的突變株。
圖5顯示了具有類似的復(fù)制精確度和不同的復(fù)制精確度的準(zhǔn)種的實(shí)例。
圖6顯示了錯(cuò)誤的突然大變動(dòng)(catastrophe)。
圖7顯示了在各種數(shù)目的復(fù)制劑時(shí)，作為無(wú)錯(cuò)誤的聚合酶的相對(duì)濃度的函數(shù)的錯(cuò)誤閾值。
圖8顯示了基于大腸桿菌的參數(shù)的可允許的錯(cuò)誤率的實(shí)例。
圖9示意性地顯示了要導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因小鼠中的載體。
圖10顯示了用于確認(rèn)外源基因的PCR方法。從左依次是有mPGK2Tg，無(wú)mPGK2Tg，有Fthl17Tg，mPGK2Tg載體，和僅僅pBluescript(對(duì)照)(對(duì)于每個(gè)，都是轉(zhuǎn)基因小鼠#1)，和無(wú)#2小鼠Tg，有#2小鼠Tg，#2Tg載體，和pBluescript(對(duì)于每個(gè)，都是轉(zhuǎn)基因小鼠#2)。標(biāo)記顯示在右端。
圖11顯示了Cre重組酶在小鼠睪丸中的表達(dá)。a顯示了mPGK2，b顯示了Fthl17，且c顯示了對(duì)照。線條代表50μm。
圖12顯示了mPGK2啟動(dòng)子的表達(dá)區(qū)。
圖13顯示了Fthl17啟動(dòng)子的表達(dá)區(qū)。
圖14示意性地顯示了靶向載體。
圖15示意性地顯示了組織特異性的重組反應(yīng)。
圖16示意性地顯示了使用愈傷組織的篩選方法。
圖17示意性地顯示了在實(shí)施例8的ES細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中使用的載體。
圖18示意性地顯示了使用Cre重組酶的重組(靶向)載體。
(序列的描述)SEQ ID NO.1酵母DNA聚合酶δ核酸序列SEQ ID NO.2酵母DNA聚合酶δ氨基酸序列SEQ ID NO.3酵母DNA聚合酶ε核酸序列SEQ ID NO.4酵母DNA聚合酶ε氨基酸序列SEQ ID NO.5DnaQ部分序列(大腸桿菌)SEQ ID NO.6DnaQ部分序列(流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae))SEQ ID NO.7DnaQ部分序列(鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium))SEQ ID NO.8DnaQ部分序列(霍亂弧菌(Vibrio cholerae))SEQ ID NO.9DnaQ部分序列(銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa))SEQ ID NO.10DnaQ部分序列(腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitides))SEQ ID NO.11DnaQ部分序列(砂眼衣原體(Chlamydiatrachomatis))SEQ ID NO.12DnaQ部分序列(天藍(lán)色鏈霉菌(streptomycescoelicolor))SEQ ID NO.13DnaQ部分序列(弗氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)2a菌株301)SEQ ID NO.14PolC部分序列(金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus))SEQ ID NO.15PolC部分序列(枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis))SEQ ID NO.16PolC部分序列(肺枝原體(Mycoplasmapulmonis))SEQ ID NO.17PolC部分序列(生殖道枝原體(Mycoplasmagenitalium))SEQ ID NO.18PolC部分序列(肺炎枝原體(Mycoplasmapneumoniae))SEQ ID NO.19Pol III部分序列(啤酒糖酵母)SEQ ID NO.20Pol II部分序列(啤酒糖酵母)SEQ ID NO.21Polδ部分序列(小鼠)SEQ ID NO.22Polε部分序列(小鼠)SEQ ID NO.23Polδ部分序列(人)SEQ ID NO.24Polε部分序列(人)SEQ ID NO.25Polδ部分序列(稻)SEQ ID NO.26Polδ部分序列(擬南芥(Arabidopsis thaliana))SEQ ID NO.27Polε部分序列(擬南芥)SEQ ID NO.28Polδ部分序列(大鼠)SEQ ID NO.29Polδ部分序列(牛)SEQ ID NO.30Polδ部分序列(大豆)SEQ ID NO.31Polδ部分序列(果蠅)SEQ ID NO.32Polε部分序列(果蠅)SEQ ID NO.33Polδ酵母改變的核酸序列SEQ ID NO.34Polδ酵母改變的氨基酸序列SEQ ID NO.35Polε酵母改變的核酸序列SEQ ID NO.36Polε酵母改變的氨基酸序列SEQ ID NO.37Polδ正向引物
SEQ ID NO.38Polδ反向引物SEQ ID NO.39Polε正向引物SEQ ID NO.40Polε反向引物SEQ ID NO.41大腸桿菌DnaQ核酸序列SEQ ID NO.42大腸桿菌DnaQ氨基酸序列SEQ ID NO.43枯草芽孢桿菌PolC核酸序列SEQ ID NO.44枯草芽孢桿菌PolC氨基酸序列SEQ ID NO.45擬南芥Polδ氨基酸序列SEQ ID NO.46擬南芥Polε氨基酸序列SEQ ID NO.47稻Polδ核酸序列SEQ ID NO.48稻Polδ氨基酸序列SEQ ID NO.49大豆Polδ核酸序列SEQ ID NO.50大豆Polδ氨基酸序列SEQ ID NO.51人Polδ核酸序列SEQ ID NO.52人Polδ氨基酸序列SEQ ID NO.53人Polε核酸序列SEQ ID NO.54人Polε氨基酸序列SEQ ID NO.55小鼠Polδ核酸序列SEQ ID NO.56小鼠Polδ氨基酸序列SEQ ID NO.57小鼠Polε核酸序列SEQ ID NO.58小鼠Polε氨基酸序列SEQ ID NO.59大鼠Polδ核酸序列SEQ ID NO.60大鼠Polδ氨基酸序列SEQ ID NO.61牛Polδ核酸序列SEQ ID NO.62牛Polδ氨基酸序列SEQ ID NO.63果蠅Polδ核酸序列SEQ ID NO.64果蠅Polδ氨基酸序列SEQ ID NO.65果蠅Polε核酸序列SEQ ID NO.66果蠅Polε氨基酸序列SEQ ID NO.67Pold1基因的5′末端引物SpeI-5′Pold1SEQ ID NO.68Pold1基因的3′末端引物EcoRI-3′Pold1SEQ ID NO.69用于將突變導(dǎo)入Pold1基因的引物序列(實(shí)施例4)
SEQ ID NO.70Pold1基因的突變的cDNA序列(實(shí)施例4)SEQ ID NO.71mPGK2的5′mPGK2-sacII引物SEQ ID NO.72mPGK2的3′mPGK2-SpeI引物SEQ ID NO.73Fthl17的5′Fthl17-sacII引物SEQ ID NO.74Fthl17的3′Fthl17-SpeI引物SEQ ID NO.75轉(zhuǎn)基因小鼠#1的Cre-F引物SEQ ID NO.76轉(zhuǎn)基因小鼠#1的Cre-R引物SEQ ID NO.77轉(zhuǎn)基因小鼠#2的Neo-F引物SEQ ID NO.78轉(zhuǎn)基因小鼠#2的Neo-R引物SEQ ID NO.79用于在實(shí)施例4中確認(rèn)mRNA的表達(dá)的Neo-F引物SEQ ID NO.80用于在實(shí)施例4中確認(rèn)mRNA的表達(dá)的Neo--R引物SEQ ID NO.81Fthl17k游的約5.7kbp序列SEQ ID NO.82用于擴(kuò)增源自擬南芥的Polδ的Xba1-42120-FSEQ ID NO.83用于擴(kuò)增源自擬南芥的Polδ的2g42120-Sacl-RSEQ ID NO.84用于擴(kuò)增突變體polδ基因Polδ(D316A)的2g42120-D316A-FSEQ ID NO.85用于擴(kuò)增突變體polδ基因Polδ(D316A)的2g42120RSEQ ID NO.86含有源自小鼠睪丸的Kozak序列的Pold1基因(核酸序列)SEQ ID NO.87含有源自小鼠睪丸的Kozak序列的Pold1基因(氨基酸序列)SEQ ID NO.88小鼠Polδ基因突變體(D400A)的核酸序列SEQ ID NO.89小鼠Polδ基因突變體(D400A)的氨基酸序列SEQ ID NO.90Polδ(Atlg42120)的核酸序列SEQ ID NO.91Polδ(Atlg42120)的氨基酸序列SEQ ID NO.92突變體polδ基因Polδ(D316A)(核酸序列)SEQ ID NO.93突變體polδ基因Polδ(D316A)(氨基酸序列)SEQ ID NO.94455-bp mPGK2啟動(dòng)子片段SEQ ID NO.95Fthl17基因上游的5725-bp DNA片段實(shí)施本發(fā)明的最佳模式(發(fā)明詳述)在下文中，將參考附圖，以解釋性的實(shí)例描述本發(fā)明。
應(yīng)當(dāng)理解，在本說(shuō)明書(shū)中，單數(shù)形式的“一個(gè)(a)”、“一種(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)的指示物，除非上下文另有清楚的說(shuō)明。還應(yīng)當(dāng)理解，如本文所用的術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域一般使用的定義，除非另有說(shuō)明。
(術(shù)語(yǔ))在本說(shuō)明書(shū)和下面的權(quán)利要求書(shū)中，將提及許多術(shù)語(yǔ)，它們應(yīng)當(dāng)定義為具有下述的含義術(shù)語(yǔ)“生物”在這里使用其在本領(lǐng)域最廣泛的含義，指能實(shí)現(xiàn)生命過(guò)程的機(jī)體，其具有各種性質(zhì)，例如，代表性地，細(xì)胞結(jié)構(gòu)，增殖(自我繁殖)，生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)，代謝，修復(fù)能力，等。一般地，生物具有基本性質(zhì)，例如由核酸控制的遺傳和其中涉及蛋白控制的代謝的增殖。生物包括病毒，原核生物，真核生物(例如，單細(xì)胞生物(例如，酵母，等)和多細(xì)胞生物(例如，植物，動(dòng)物，等))，等。應(yīng)當(dāng)明白，本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于任何生物，包括高等生物，例如革蘭氏陽(yáng)性的細(xì)菌，真核生物，等。
術(shù)語(yǔ)“真核生物”在這里使用其普通含義，指具有帶有核膜的明顯核結(jié)構(gòu)的生物。真核生物的實(shí)例包括但不限于單細(xì)胞生物(例如，酵母，等)，植物(例如，稻，小麥，玉米，大豆，等)，動(dòng)物(例如，小鼠，大鼠，牛，馬，豬，猴，等)，昆蟲(chóng)(例如，蠅，蠶，等)，等。酵母、線蟲(chóng)、果蠅、蠶、稻、小麥、大豆、玉米、擬南芥、人、小鼠、大鼠、牛、馬、豬、蛙、魚(yú)(例如，斑馬魚(yú)，等)可以在這里用作模型，但是用途不限于此。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“原核生物”在這里使用其普通含義，指由不具有明顯的核結(jié)構(gòu)的細(xì)胞構(gòu)成的生物。原核生物的實(shí)例包括革蘭氏陰性的細(xì)菌(例如，大腸桿菌，沙門氏菌屬(Salmonella)，等)，革蘭氏陽(yáng)性的細(xì)菌(例如，枯草芽孢桿菌，放線菌，葡萄球菌屬(Staphylococcus)，等)，藍(lán)細(xì)菌，氫細(xì)菌，等。代表性地，除了大腸桿菌以外，革蘭氏陽(yáng)性的細(xì)菌可以用在這里，但是用途不限于此。
術(shù)語(yǔ)“單細(xì)胞生物”在這里使用其普通含義，指由單個(gè)細(xì)胞組成的生物。單細(xì)胞生物包括真核生物和原核生物。單細(xì)胞生物的實(shí)例包括但不限于細(xì)菌(例如，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，等)，酵母，藍(lán)細(xì)菌，等。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“多細(xì)胞生物”指由多個(gè)細(xì)胞(一般地，多個(gè)不同類型的細(xì)胞)組成的單個(gè)生物。由于多細(xì)胞生物是由不同類型的細(xì)胞組成的，所以維持該生物的生命需要高水平的與單細(xì)胞生物不同的穩(wěn)態(tài)機(jī)制。大多數(shù)真核生物是多細(xì)胞生物。多細(xì)胞生物包括動(dòng)物，植物，昆蟲(chóng)，等。應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明可以令人驚奇地應(yīng)用于多細(xì)胞生物。
術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”在這里使用其最廣泛的含義，指脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物(例如，節(jié)肢動(dòng)物)。動(dòng)物的實(shí)例包括但不限于任何哺乳綱(Mammalia)，鳥(niǎo)綱(Aves)，爬行綱(Reptilia)，兩棲綱(Amphibia)，魚(yú)綱(Pisces)，昆蟲(chóng)綱(Insecta)，蠕蟲(chóng)綱(Vermes)，等。優(yōu)選地，動(dòng)物可以是但不限于脊椎動(dòng)物(例如，盲鰻目(Myxiniformes)，七鰓鰻目(Petronyzoniformes)，軟骨魚(yú)綱(Chondrichthyes)，硬骨魚(yú)綱(Osteichthyes)，兩棲動(dòng)物，爬行動(dòng)物，鳥(niǎo)類，哺乳動(dòng)物，等)。在特定的實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是但不限于哺乳動(dòng)物(例如，單孔目(monotremata)，有袋目(marsupialia)，無(wú)齒類動(dòng)物(edentate)，皮翼目(dermoptera)，翼手目(chiroptera)，食肉動(dòng)物，食蟲(chóng)動(dòng)物，長(zhǎng)鼻目(proboscidae)，奇蹄目(perissodactyla)，偶蹄目(artiodactyla)，管齒目(tubulidentata)，鱗甲目(pholidota)，海牛目(sirenia)，鯨類動(dòng)物，靈長(zhǎng)目(primates)，嚙齒目(rodentia)，兔形目(lagomorpha)，等)。更優(yōu)選地，動(dòng)物可以是但不限于靈長(zhǎng)目(例如，黑猩猩，日本猴，人)或任何可以用作模型動(dòng)物的物種(例如，奇蹄目，偶蹄目，嚙齒目(小鼠，等)，兔形目，等)。本發(fā)明首次證實(shí)了本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于任何生物。應(yīng)當(dāng)明白，任何生物都可以用于本發(fā)明。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“植物”指屬于植物界(Plantae)的特征如下的任何生物葉綠素，硬細(xì)胞壁，存在豐富的永久的未成熟組織，和沒(méi)有移動(dòng)能力。代表性地，術(shù)語(yǔ)“植物”指能形成細(xì)胞壁和通過(guò)葉綠素進(jìn)行同化的開(kāi)花植物。術(shù)語(yǔ)“植物”指任何單子葉植物和雙子葉植物。優(yōu)選的植物包括但不限于有用的植物，例如稻科的單子葉植物(例如，小麥，玉米，稻，大麥，高粱，等)。優(yōu)選的植物的實(shí)例包括煙草，青椒，茄子，瓜，番茄，甘薯，卷心菜，韭菜，椰菜，胡蘿卜，黃瓜，柑桔，大白菜，萵苣，桃子，馬鈴薯，和蘋(píng)果。優(yōu)選的植物不限于農(nóng)作物，還包括開(kāi)花植物，樹(shù)，草坪，野草，等。除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“植物”指任意的植物體，植物器官，植物組織，植物細(xì)胞和種子。植物器官的實(shí)例包括根、葉、莖、花等。植物細(xì)胞的實(shí)例包括愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞等。本發(fā)明首次證實(shí)了本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于任何生物。應(yīng)當(dāng)明白，任何生物都可以用于本發(fā)明。
在特定的實(shí)施方案中，可以用于本發(fā)明中的植物種類的實(shí)例包括但不限于下述科的植物茄科(Solanaceae)，禾本科(Poaceae)，十字花科(Brassicaceae)，薔薇科(Rosaceae)，豆科(Leguminosae)，葫蘆科(Cucurbitaceae)，唇形科(Lamiaceae)，百合科(Liliaceae)，藜科(Chenopodiaceae)和傘形科(Umbelliferae)。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“遺傳性狀”也稱作基因型，指基因控制的生物的形態(tài)要素。遺傳性狀的實(shí)例包括但不限于對(duì)環(huán)境參數(shù)的抗性，所述參數(shù)例如，溫度，濕度，pH，鹽濃度，營(yíng)養(yǎng)物，金屬，氣體，有機(jī)溶劑，壓力，大氣壓力，粘度，流速，光強(qiáng)度，光波長(zhǎng)，電磁波，輻射，重力，張力，聲波，其它生物，化學(xué)試劑，抗生素，天然物質(zhì)，心理應(yīng)激，機(jī)體應(yīng)激，等。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“基因”指具有預(yù)定長(zhǎng)度的序列的細(xì)胞中存在的核酸?；蚩梢远x或不定義遺傳性狀。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“基因”一般指存在于基因組中的序列，且可以指染色體外的序列、線粒體中的序列等?；蛞话闩帕性谌旧w上的特定序列中。能定義蛋白的初級(jí)結(jié)構(gòu)的基因稱作結(jié)構(gòu)基因。能調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)的基因稱作調(diào)節(jié)基因(例如，啟動(dòng)子)。除非另有說(shuō)明，本文中的基因包括結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因。因此，例如，術(shù)語(yǔ)“DNA聚合酶基因”一般指DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)基因和它的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)序列(例如，啟動(dòng)子)。在本發(fā)明中，應(yīng)當(dāng)明白，轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的調(diào)節(jié)序列以及結(jié)構(gòu)基因可以用作本發(fā)明靶向的基因。如本文所使用的，“基因”可以指“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”和/或“蛋白”、“多肽”、“寡肽”和“肽”。如本文所使用的，“基因產(chǎn)物”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”和/或由基因表達(dá)的“蛋白”、“多肽”、“寡肽”和“肽”。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上下文能夠明白基因產(chǎn)物是什么。
如本文所使用的，與基因有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“復(fù)制”是指遺傳材料、DNA或RNA再生它自身的拷貝，其中親本核酸鏈(DNA或RNA)用作形成新的具有與親本核酸相同的結(jié)構(gòu)和功能的核酸分子(分別是DNA或RNA)的模板。在真核細(xì)胞中，會(huì)形成包含復(fù)制酶(DNA聚合酶α)的復(fù)制起始復(fù)合物，以在雙鏈DNA分子的許多復(fù)制起點(diǎn)處啟動(dòng)復(fù)制，且復(fù)制反應(yīng)從復(fù)制起點(diǎn)向相反的反向進(jìn)行。根據(jù)細(xì)胞周期控制復(fù)制的起始。在酵母中，將自主復(fù)制序列視作復(fù)制起點(diǎn)。在原核細(xì)胞(例如大腸桿菌等)中，復(fù)制起點(diǎn)(ori)存在于基因組的雙鏈環(huán)狀DNA分子上。復(fù)制起始復(fù)合物在ori形成，且反應(yīng)從ori向相反的反向進(jìn)行。復(fù)制起始復(fù)合物具有包含10個(gè)或更多個(gè)蛋白元件(包括復(fù)制酶(DNA聚合酶III))的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。在復(fù)制反應(yīng)中，部分地重繞雙鏈DNA的螺旋結(jié)構(gòu)；合成短的DNA引物；從引物的3′-OH基延伸新的DNA鏈；在互補(bǔ)鏈模板上合成岡崎片段；連接岡崎片段；進(jìn)行校對(duì)，以比較新復(fù)制的鏈和模板鏈；等。因而，通過(guò)許多反應(yīng)步驟進(jìn)行復(fù)制反應(yīng)。
儲(chǔ)存著生物的遺傳信息的基因組DNA的復(fù)制機(jī)制詳細(xì)地描述在例如Kornberg A.和Baker T.，“DNA Replication”，New York，F(xiàn)reeman，1992中。一般地，將能使用DNA的一條鏈作為模板合成互補(bǔ)鏈、形成雙鏈DNA的酶稱作DNA聚合酶(DNA復(fù)制酶)。DNA復(fù)制需要至少2種DNA聚合酶。這是因?yàn)?，一般地，同時(shí)合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈。從DNA上的稱作復(fù)制起點(diǎn)(ori)的預(yù)定位置處開(kāi)始DNA復(fù)制。例如，細(xì)菌在它們的環(huán)狀基因組DNA上具有至少一個(gè)雙向復(fù)制起點(diǎn)。因而，一般地，在其復(fù)制過(guò)程中，需要4種DNA聚合酶同時(shí)作用于一個(gè)基因組DNA上。在本發(fā)明中，優(yōu)選地，可以僅僅在前導(dǎo)鏈和后隨鏈中的一條上有利地調(diào)節(jié)復(fù)制錯(cuò)誤，或者，這2條鏈之間的復(fù)制錯(cuò)誤的頻率可以有利地存在差異。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“復(fù)制錯(cuò)誤”指在基因(DNA，等)復(fù)制過(guò)程中導(dǎo)入錯(cuò)誤的核苷酸。一般地，復(fù)制錯(cuò)誤的頻率低至108至1012配對(duì)中出現(xiàn)一個(gè)。復(fù)制錯(cuò)誤頻率較低的原因是，復(fù)制過(guò)程中的核苷酸添加是由模板DNA和導(dǎo)入的核苷酸之間的互補(bǔ)堿基配對(duì)決定的；酶(例如DNA聚合酶δ、ε等)的3′→5′外切核酸酶活性(校對(duì)功能)能識(shí)別和去除錯(cuò)配的與模板不互補(bǔ)的核苷酸；等。因此，在本發(fā)明中，通過(guò)破壞特定的堿基對(duì)的形成、校對(duì)功能等，可以調(diào)節(jié)復(fù)制中的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
如本文所使用的，與遺傳性狀有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化率”指在原始生物繁殖或分裂后，原始生物和其祖先之間的遺傳性狀之間發(fā)生差異的比率。這樣的轉(zhuǎn)化率可以例如由在每次分裂或每代中具有遺傳性狀變化的生物的數(shù)目代表。這樣的遺傳性狀的轉(zhuǎn)化在本文中可替換地稱作“進(jìn)化”。
如本文所使用的，與遺傳性狀的轉(zhuǎn)化率有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”是指，通過(guò)人工操作，而不是通過(guò)自然產(chǎn)生的因素，改變遺傳性狀的轉(zhuǎn)化率。因此，調(diào)節(jié)遺傳性狀的轉(zhuǎn)化率包括減慢和加速遺傳性狀的轉(zhuǎn)化率。通過(guò)減慢生物的遺傳性狀的轉(zhuǎn)化率，該生物基本上不改變遺傳性狀。換言之，通過(guò)減慢該生物的遺傳性狀的轉(zhuǎn)化率，使該生物的進(jìn)化速度變慢。相反地，通過(guò)加速生物的遺傳性狀的轉(zhuǎn)化率，該生物比正常水平更頻繁地改變遺傳性狀。換言之，通過(guò)加速生物的遺傳性狀的轉(zhuǎn)化率，使該生物的進(jìn)化速度變快。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“無(wú)錯(cuò)誤的”指在基因(DNA，等)的復(fù)制中存在較少的或基本上沒(méi)有錯(cuò)誤的性質(zhì)。校對(duì)酶(例如，DNA聚合酶δ和ε，等)的校對(duì)功能的精確度會(huì)影響無(wú)錯(cuò)誤的水平。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“傾向于錯(cuò)誤的”指在基因(DNA，等)的復(fù)制中可能發(fā)生錯(cuò)誤的性質(zhì)(即，可能發(fā)生復(fù)制錯(cuò)誤)。校對(duì)酶(例如，DNA聚合酶δ和ε，等)的校對(duì)功能的精確度會(huì)影響傾向于錯(cuò)誤的水平。
傾向于錯(cuò)誤的狀態(tài)和無(wú)錯(cuò)誤的狀態(tài)可以絕對(duì)地分開(kāi)(即，可以用傾向于錯(cuò)誤的頻率的水平等決定)，或者，可以相對(duì)地分開(kāi)(即，當(dāng)在基因復(fù)制中起作用的2個(gè)或更多個(gè)試劑是分開(kāi)的時(shí)，將具有更高的傾向于錯(cuò)誤的頻率的試劑歸類為傾向于錯(cuò)誤的基因，而將具有更低的傾向于錯(cuò)誤的頻率的試劑歸類為無(wú)錯(cuò)誤的試劑)。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“傾向于錯(cuò)誤的頻率”指傾向于錯(cuò)誤的性質(zhì)的水平。傾向于錯(cuò)誤的頻率可以由例如基因序列中的突變的絕對(duì)數(shù)目(突變本身的數(shù)目)或基因序列中的突變的相對(duì)數(shù)目(突變的數(shù)目與全長(zhǎng)的比率)來(lái)表示?；蛘撸?dāng)提及特定的生物或酶時(shí)，傾向于錯(cuò)誤的頻率可以由每次繁殖或分裂時(shí)基因序列中的突變的絕對(duì)或相對(duì)數(shù)目來(lái)表示。除非另有說(shuō)明，傾向于錯(cuò)誤的頻率是由一次復(fù)制過(guò)程中基因序列中的錯(cuò)誤數(shù)目來(lái)表示的。傾向于錯(cuò)誤的頻率在本文中可以稱作“精確度”，作為相反的量度。一致的傾向于錯(cuò)誤的頻率是指，當(dāng)提及在許多基因的復(fù)制中起作用的試劑(聚合酶，等)時(shí)，它們的傾向于錯(cuò)誤的頻率基本上彼此相等。相反地，不同的傾向于錯(cuò)誤的頻率是指，在許多基因的復(fù)制中起作用的許多試劑(聚合酶，等)中存在顯著的傾向于錯(cuò)誤的頻率的差異。
如本文所使用的，與傾向于錯(cuò)誤的頻率有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”是指，改變傾向于錯(cuò)誤的頻率。這樣調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率包括增加和減少傾向于錯(cuò)誤的頻率。調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率的方法的實(shí)例包括但不限于修飾具有校對(duì)功能的DNA聚合酶，插入能抑制或阻抑復(fù)制過(guò)程中的聚合或延伸反應(yīng)的試劑，抑制或阻抑能促進(jìn)這些反應(yīng)的因素，缺失一個(gè)或多個(gè)堿基，缺失雙鏈體DNA修復(fù)酶，修飾能去除異常堿基的修復(fù)試劑，修飾能修復(fù)錯(cuò)配的堿基對(duì)的修復(fù)試劑，降低復(fù)制本身的精確度，等。可以在雙鏈DNA的2條鏈或1條鏈上調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率。優(yōu)選地，可以有利地在1條鏈上調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率。這是因?yàn)?，?huì)減少不利的突變發(fā)生。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“DNA聚合酶”或“Po1”指能從4個(gè)脫氧核糖核苷5′-三磷酸釋放出焦磷酸、從而聚合DNA的酶。DNA聚合酶反應(yīng)需要模板DNA、引物分子、Mg2+等。將互補(bǔ)的核苷酸依次添加到引物的3′-OH末端，以延伸分子鏈。
已知大腸桿菌具有至少3種DNA聚合酶I、II和III。DNA聚合酶I參與修復(fù)受損的DNA、基因重組和DNA復(fù)制。認(rèn)為DNA聚合酶II和III具有輔助功能。這些酶的每種都具有包含幾個(gè)蛋白的亞基結(jié)構(gòu)，且根據(jù)結(jié)構(gòu)分成核心酶或全酶。核心酶由α、ε和θ亞基組成。全酶除了α、ε和θ亞基以外，包含τ、γ、δ和β組分。已知真核細(xì)胞具有許多DNA聚合酶。在高等生物中，存在許多DNA聚合酶α、β、γ、δ、ε等。在動(dòng)物中，存在已知的聚合酶DNA聚合酶α，它參與核DNA的復(fù)制，并在細(xì)胞生長(zhǎng)期的DNA復(fù)制中起作用；DNA聚合酶β，它參與核中的DNA修復(fù)，并在生長(zhǎng)期和靜止期的受損DNA的修復(fù)中起作用，等；DNA聚合酶γ，它參與復(fù)制和修復(fù)線粒體DNA，且具有外切核酸酶活性)；DNA聚合酶δ，它參與DNA延長(zhǎng)，且具有外切核酸酶活性；DNA聚合酶ε，它參與復(fù)制后隨鏈之間的缺口，且具有外切核酸酶活性；等。
在革蘭氏陽(yáng)性的細(xì)菌、革蘭氏陰性的細(xì)菌、真核生物等中具有校對(duì)功能的DNA聚合酶中，認(rèn)為具有ExoI基序的氨基酸序列在3′→5′外切核酸酶活性中心起作用，且會(huì)影響校對(duì)功能的精確度。
SEQ ID NO.5DnaQ8-QIVLDTETTGMN-19(大腸桿菌)；SEQ ID NO.6DnaQ7-QIVLDTETTGMN-18(流感嗜血菌)；SEQ ID NO.7DnaQ8-QIVLDTETTGMN-19(鼠傷寒沙門氏菌)；SEQ ID NO.8DnaQ12-IVVLDTETTGMN-23(霍亂弧菌)；SEQ ID NO.9DnaQ3-SVVLDTETTGMP-14(銅綠假單胞菌)；SEQ ID NO.10DnaQ5-QI ILDTETTGLY-16(腦膜炎奈瑟氏球菌)；SEQ ID NO.11DnaQ9-FVCLDCETTGLD-20(砂眼衣原體)；SEQ ID NO.12DnaQ9-LAAFDTETTGVD-20(天藍(lán)色鏈霉菌)；SEQ ID NO.13dnaQ11-QIVLDTETTGMN-22(弗氏志賀氏菌2a菌株301)；SEQ ID NO.14PolC420-YVVFDVETTGLS-431(金黃色葡萄球菌)SEQ ID NO.15PolC421-YVVFDVETTGLS-432(枯草芽孢桿菌)；SEQ ID NO.16PolC404-YVVYDIETTGLS-415(肺枝原體)；SEQ ID NO.17PolC416-FVIFDIETTGLH-427(生殖道枝原體)；SEQ ID NO.18PolC408-FVIFDIETTGLH-419(肺炎枝原體)；SEQ ID NO.19PolIII317-IMSFDIECAGRI-328(啤酒糖酵母)；SEQ ID NO.20PolII286-VMAFDIETTKPP-297(啤酒糖酵母)；SEQ ID NO.21Polδ310-VLSFDIECAGRK-321(小鼠)；SEQ ID NO.22Polε271-VLAFDIETTKLP-282(小鼠)；SEQ ID NO.23Polδ312-VLSFDIECAGRK-323(人)；SEQ ID NO.24Polε271-VLAFDIETTKLP-282(人)；SEQ ID NO.25Polδ316-ILSFDIECAGRK-327(稻)；SEQ ID NO.26Polδ306-VLSFDIECAGRK-317(擬南芥)；SEQ ID NO.27Polε235-VCAFDIETVKLP-246(擬南芥)；
SEQ ID NO.28Polδ308-VLSFDIECAGRK-319(大鼠)；SEQ ID NO.29Polδ311-VLSFDIECAGRK-322(牛)；SEQ ID NO.30Polδ273-ILSFDIECAGRK-284(大豆)；SEQ ID NO.31Polδ296-ILSFDIECAGRK-307(果蠅)；和SEQ ID NO.32Polε269-VLAFDIETTKLP-280(果蠅)。
顯然，具有校對(duì)功能的DNA聚合酶具有相當(dāng)保守的天冬氨酸(例如，在人DNA聚合酶δ的位置316)和谷氨酸(例如，在人DNA聚合酶δ的位置318)。含有這樣的天冬氨酸和谷氨酸的區(qū)域在本文中可以視作校對(duì)功能的活性部位。
在革蘭氏陰性細(xì)菌(例如大腸桿菌)中，存在2種DNA聚合酶蛋白，即具有外切核酸酶活性的分子和具有DNA合成活性的分子。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)外切核酸酶活性，可以調(diào)節(jié)校對(duì)功能。
但是，在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(例如，枯草芽孢桿菌，等)和真核生物(例如，酵母，動(dòng)物，植物，等)中，一種DNA聚合酶具有DNA合成活性和外切核酸酶活性。因此，需要能在調(diào)節(jié)外切核酸酶活性的同時(shí)保留正常的DNA合成活性的分子來(lái)調(diào)節(jié)校對(duì)功能。本發(fā)明提供了各種真核生物和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的DNA聚合酶，其能在調(diào)節(jié)外切核酸酶活性的同時(shí)保留正常的DNA合成活性，且其可以用于生物的進(jìn)化中。由此，得到了與大腸桿菌不同的且意外的效果。因此，可以認(rèn)為，通過(guò)發(fā)現(xiàn)上述的校對(duì)功能的活性部位在真核生物和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、特別是在真核生物中被出乎意料地確定，本發(fā)明部分地得以實(shí)現(xiàn)。而且，本發(fā)明的重大作用是獲得遺傳性狀，其在下面的實(shí)例中予以出乎意料地顯示。
已經(jīng)在細(xì)菌等以及人中發(fā)現(xiàn)了許多傾向于錯(cuò)誤的DNA聚合酶。許多復(fù)制的DNA聚合酶一般具有校對(duì)功能，即，通過(guò)3′→5′外切核酸酶活性去除錯(cuò)誤，以進(jìn)行無(wú)錯(cuò)誤的復(fù)制。但是，傾向于錯(cuò)誤的DNA聚合酶不具有校對(duì)功能，且不能繞過(guò)DNA損害，從而導(dǎo)致突變。傾向于錯(cuò)誤的DNA聚合酶的存在會(huì)參與癌癥的發(fā)作、進(jìn)化、抗體進(jìn)化等。許多DNA聚合酶具有變成傾向于錯(cuò)誤的可能性。通過(guò)破壞它們的校對(duì)功能，可以使這些DNA聚合酶傾向于錯(cuò)誤。因此，通過(guò)修飾上述的校對(duì)功能的活性部位，可以調(diào)節(jié)復(fù)制的精確度。通過(guò)使用該模型，一旦得到了新的性質(zhì)，就可以有利地?zé)o畸形地進(jìn)化。在這方面，與原始的不一致模型相比，本發(fā)明可以得到意外的不利和效果。
在準(zhǔn)種理論中，Eigen提出了一個(gè)進(jìn)化模型，其中僅僅考慮了傾向于錯(cuò)誤的復(fù)制(M.Eigen，Naturwissenschaften 58，465(1971)，等)。該準(zhǔn)種理論使用各種修飾?？梢詫?zhǔn)種定義為最適序列的穩(wěn)定的系統(tǒng)，且其突變體有選擇地分布在序列空間中的最適序列周圍。自然選擇不是發(fā)生在單一序列中，而是在整個(gè)準(zhǔn)種分布中。如下發(fā)生準(zhǔn)種的進(jìn)化具有比主序列更高的適合度的突變體出現(xiàn)在準(zhǔn)種中，該突變體有選擇地替換舊的主序列，然后新的準(zhǔn)種分布圍繞著突變體組織。
準(zhǔn)種理論認(rèn)為和總結(jié)出，存在維持遺傳信息的錯(cuò)誤閾值。因此，常規(guī)地，認(rèn)為準(zhǔn)種僅僅可以在該閾值之下進(jìn)化(M.Eigen等，Adv.Chem.Phys.75，149(1989))。這意味著，進(jìn)化速度的上限受到錯(cuò)誤閾值的上限的限制。準(zhǔn)種理論在RNA病毒的研究中似乎得到了證實(shí)，其以接近錯(cuò)誤閾值的高速度進(jìn)化。但是，認(rèn)為在突變?cè)噭┑谋硇椭芯哂性黾拥腻e(cuò)誤率的試劑在該過(guò)程中起重要作用。
盡管細(xì)菌的基因組具有單一的復(fù)制起點(diǎn)，但真核生物的基因組具有許多復(fù)制起點(diǎn)。這意味著，基因組的序列含有許多復(fù)制單元(復(fù)制劑，復(fù)制子)。因此，許多聚合酶同時(shí)參與基因組的復(fù)制。在本發(fā)明中，可以考慮許多復(fù)制劑對(duì)錯(cuò)誤閾值的影響。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)將能破壞3′→5′外切核酸酶活性的突變導(dǎo)入到能編碼DNA聚合酶的基因(DNA聚合酶基因)中，可以提供能編碼具有降低的校對(duì)功能(即，更高的傾向于錯(cuò)誤的頻率)的DNA聚合酶的核酸分子和多肽。注意到在單一的DNA聚合酶基因(PolC，POL2，CDC2，等)中，3′→5′外切核酸酶活性(校對(duì)功能)是包含在具有DNA聚合活性的分子中的(例如，真核生物，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，等)，或者是由與能編碼DNA聚合活性的基因(例如，dnaE)不同的基因(例如，dnaQ)編碼的(例如，革蘭氏陰性細(xì)菌，等)(Kornberg A.和Baker T.，“DNA Replication”，New York，F(xiàn)reeman，1992)。基于對(duì)上述性質(zhì)的理解，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明調(diào)節(jié)傾向于錯(cuò)誤的頻率。例如，在真核生物中，優(yōu)選地將能改變校對(duì)功能而基本上不改變DNA聚合活性的突變導(dǎo)入DNA聚合酶中。在該情況中，改變了2個(gè)與上述的校對(duì)功能有關(guān)的酸性氨基酸(優(yōu)選地，不保守的取代(例如，丙氨酸、纈氨酸等的取代))(Derbyshire等，EMBO J.10，pp.17-24，Jan.1991；Fijalkowska和Schaaper，“Mutants in theExo I motif of Escherichia coli dnaQDefective proofreadingand inviability due to error catastrophe”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.93，pp.2856-2861，Apr.1996)。本發(fā)明不限于此。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“校對(duì)功能”指檢測(cè)和修復(fù)細(xì)胞DNA中的損傷和/或錯(cuò)誤的功能。通過(guò)在脫嘌呤位點(diǎn)或脫嘧啶位點(diǎn)插入堿基，或者，用脫嘌呤-脫嘧啶(A-P)內(nèi)切核酸酶切割一條鏈，然后用5′→3′外切核酸酶去除該位點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)這樣的功能。在去除的部分，用DNA聚合酶合成和補(bǔ)充DNA，并通過(guò)DNA連接酶將合成的DNA與正常的DNA相連接。該反應(yīng)稱作切除修復(fù)。對(duì)于由烷化劑、異常的堿基、輻射、紫外光等的化學(xué)修飾造成的受損DNA，通過(guò)上述的反應(yīng)，在修復(fù)之前用DNA糖苷酶去除受損的部分(期外DNA合成)。具有這樣的校對(duì)功能的DNA聚合酶的實(shí)例包括但不限于真核生物等的DNA聚合酶δ、DNA聚合酶ε等。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“保真性”也可以用于代表校對(duì)功能的水平。術(shù)語(yǔ)“保真性”指DNA復(fù)制精確度。普通的DNA聚合酶一般具有高水平的保真性。由于修飾具有降低的校對(duì)功能的DNA聚合酶可能具有低水平的保真性。
DNA聚合酶的上述校對(duì)功能描述在，例如，Kunkel，T.A.J.Biol.Chem.，260，12866-12874(1985)；Kunkel，T.A.，Sabotino，R.D.& Bambara，R.A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，4865-4869(1987)；Wu，C.I.& Maeda，N.Nature，327，167-170(1987)；Roberts，J.D.& Kunkel，T.A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，7064-7068(1988)；Thomas，D.C.，F(xiàn)itzgerald，M.P.& Kunkel，T.A.Basic Life Sciences，52，287-297(1990)；Trinh，T.Q.& Siden，R.R.，Nature，352，544-547(1991)；Weston-Hafer，K.& Berg，D.E.，Genetics，127，649-655(1991)；Veaute，X.& Fuchs，R.P.P.Science，261，598-600(1993)；Roberts，J.D.，Izuta，S.，Thomas，D.C.& Kunkel，T.A.J.Biol.Chem.，269，1711-1717(1994)；Roche，W.A.，Trinh，T.Q.& Siden，R.R.，J.Bacteriol.，177，4385-4391(1995)；Kang，S.，Jaworski，A.，Ohshirna，K.& Wells，Nat.Genet.，10，213-218(1995)；Fijalkowska，I.J.，Jonczyk，P.，Maliszewska-Tkaczyk，M.，Bialoskorska，M.& Schaaper，R.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，95，10020-10025(1998)；Maliszewska-Tkaczyk，M.，Jonezyk，P.，Bialoskorska，M.，Schaaper，M.& Fijalkowska，I.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，12678-12683(2000)；Gwel，D.，Jonezyk，P.，Bialoskorska，M.，Schaaper，R.M.& Fijalkowska，I.J.Mutation Research，501，129-136(2002)；Roberts，J.D.，Thomas，D.C.& Kunkel，T.A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，3465-3469(1991)；Roberts，J.D.，Nguyen，D.&Kunkel，T.A.Biochemistry，32，4083-4089(1993)；Francino，M.P.，Chac，L.，Riley，M.A.& Ochman，H.Science，272，107-109(1996)；A.Boulet，M.Simon，G.Faye，G.A.Bauer &P.M.Burgers，EMBO J.，8，1849-1854，(1989)；Morrison A.，ArakiH.，Clark A.B.，Hamatake R.K.，& Sugino A.，Cell，62(6)，1143-1151(1990)，等。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)真核生物的“DNA聚合酶δ”指參與DNA延長(zhǎng)的酶，認(rèn)為其具有產(chǎn)生校對(duì)功能的外切核酸酶活性。代表性的DNA聚合酶δ具有如SEQ ID NO.1和2所述的序列(分別是核酸序列和氨基酸序列；PolδX61920 gi/171411/gb/M61710.1/YSCDPB2[171411])。通過(guò)修飾如SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列的位置322處的氨基酸，可以調(diào)節(jié)該DNA聚合酶δ的校對(duì)功能。DNA聚合酶δ描述在Simon，M.等，EMBO J.，10，2163-2170，1991中，其內(nèi)容在這里引作參考。DNA聚合酶δ的實(shí)例包括但不限于下述的擬南芥(SEQID NO.45)，稻(SEQ ID NO.47和48)，大豆(SEQ ID NO.49和50)，人(SEQ ID NO.51和52)，小鼠(SEQ ID NO.55和56)，大鼠(SEQ IDNO.59和60)，牛(SEQ ID NO.61和62)，果蠅(SEQ ID NO.63和64)，等。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)真核生物的“DNA聚合酶ε”指參與復(fù)制后隨鏈之間的缺口的酶，認(rèn)為其具有產(chǎn)生校對(duì)功能的外切核酸酶活性。代表性的DNA聚合酶ε具有如SEQ ID NO.3和4所述的序列(分別是核酸序列和氨基酸序列；PolεM60416gi/171408/gb/M60416.1/YSCDNA POL[171408])。通過(guò)修飾如SEQ IDNO.4所述的氨基酸序列的位置391處的氨基酸，可以調(diào)節(jié)該DNA聚合酶ε的校對(duì)功能。DNA聚合酶ε描述在，例如，Morrison，A.等，MGG.242，289-296，1994；Araki H.，等.Nucleic Acids Res.19，4857-4872，1991；和Ohya T.，等，Nucleic Acids Res.28，3846-3852，2000，其內(nèi)容在這里引作參考。DNA聚合酶ε的實(shí)例包括但不限于下述的擬南芥(SEQ ID NO.46)，人(SEQ ID NO.53和54)，小鼠(SEQID NO.57和58)，果蠅(SEQ ID NO.65和66)，等。
根據(jù)HUGO分類，將DNA聚合酶δ和ε分別稱作POLD1/POL3和POLE/POL2。在本文中可以使用兩種命名。
其它的DNA聚合酶描述在，例如，Lawrence C.W.等，J.Mol.Biol.，122，1-21，1978；Lawrence C.W.等，Genetics 92，397-408；Lawrence C.W.等，MGG，195，487-490，1984；Lawrence G.W.等，MGG.200，86-91，1985(DNA聚合酶β和DNA聚合酶ζ)；Maher V.M.等，Nature 261，593-595，1976；McGregor，W.G.等，Mol.Cell.Biol.19，147-154，1999(DNA聚合酶η)；Strand M.等，Nature 365，275-276，1993；Prolla T.A.等，Mol.Cell.Biol.15，407-415，1994；Kat A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，6424-6428；Bhattacharyya N.P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，6319-6323，1994；Faber F.A.等，Hum.Mol.Genet.3，253-256，1994；Eshleman，J.R.等，Oncogene 10，33-37，1995；Morrison A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，9473-9477，1991；Morrison A.等，EMBO J.12，1467-1473，1993；Foury F.等，EMBO J.11，2717-2726，1992(DNA聚合酶λ，DNA聚合酶μ，等)；等，其內(nèi)容在這里引作參考。
如本文所使用的，與能編碼DNA聚合酶等的基因和生物(例如，酵母，等)有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“野生型”以其最廣泛的含義指，具有自然產(chǎn)生的能編碼DNA聚合酶等的基因和生物(例如，酵母，等)所來(lái)源的物種的大多數(shù)成員的特征的類型。因此，一般地，可以認(rèn)為在某些物種中首先鑒別出的能編碼DNA聚合酶等的基因和生物(例如，酵母，等)的類型是野生型。野生型也稱作“自然的標(biāo)準(zhǔn)型”。野生型DNA聚合酶δ具有如SEQ ID NO.1和2所述的序列。野生型DNA聚合酶ε具有如SEQ ID NO.3和44所述的序列。具有如SEQ ID NO.41-66所述的序列的DNA聚合酶也是野生型。野生型生物可能具有正常的酶活性、正常的性狀、正常的行為、正常的生理學(xué)、正常的繁殖和正常的基因組。
如本文所使用的，與酶的校對(duì)功能等有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“低于野生型”是指，該酶的校對(duì)功能低于野生型酶的校對(duì)功能(即，在該酶校對(duì)加工后保留的突變的數(shù)目大于野生型酶的)。通過(guò)相對(duì)的或絕對(duì)的表達(dá)，可以進(jìn)行與野生型的對(duì)比。使用傾向于錯(cuò)誤的頻率等，可以進(jìn)行這樣的對(duì)比。
如本文所使用的，與基因有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“突變”是指改變了該基因的序列，或者指改變的該基因的核酸或氨基酸序列的狀態(tài)。例如，術(shù)語(yǔ)“突變”在本文中指會(huì)導(dǎo)致校對(duì)功能的改變的基因的序列中的改變。除非另有定義，術(shù)語(yǔ)“突變”和“變異”在本說(shuō)明書(shū)中具有相同的含義。
為了生產(chǎn)它們的有用的突變體，最常見(jiàn)地對(duì)生物進(jìn)行誘變。術(shù)語(yǔ)“突變”一般指能編碼基因的堿基序列中的變化，包含DNA序列中的變化。根據(jù)其對(duì)具有突變的個(gè)體的影響，將突變大致分成下面的3組A)中性的突變(大多數(shù)突變都?xì)w入這組中，且基本上對(duì)生物的生長(zhǎng)和代謝沒(méi)有影響)；B)有害的突變(它的頻率低于中性的突變的。這類突變會(huì)抑制生物的生長(zhǎng)和代謝。有害的突變包括會(huì)破壞對(duì)于生長(zhǎng)必須的基因的致死的突變。在微生物的情況中，有害的突變的比例一般是總突變的約1/10至1/100，盡管因物種而異)；和C)有益的突變(該突變對(duì)于生物的育種是有益的。其發(fā)生頻率明顯低于中性的突變。因此，需要大量的生物和較長(zhǎng)的時(shí)間段來(lái)得到具有有益的突變的個(gè)別生物。通過(guò)單一突變難以得到足以對(duì)生物進(jìn)行育種的效果，且經(jīng)常需要積累許多有益的突變)。
如本文所使用的，與某種生物有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)”指?jìng)€(gè)體生物的量上的增加。通過(guò)測(cè)量值(例如身體大小(身高)、體重等)的量上的增加，可以識(shí)別出生物的生長(zhǎng)。個(gè)體的量上的增加依賴于每個(gè)細(xì)胞的增大和細(xì)胞數(shù)目的增加。
如本文所使用的，與生物有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“基本上相同的生長(zhǎng)”是指，該生物的生長(zhǎng)速度與參考生物(例如，轉(zhuǎn)化前的生物)相比基本上沒(méi)有變化。認(rèn)為不是顯著改變的生長(zhǎng)速度的示例性的范圍包括但不限于一般生長(zhǎng)的統(tǒng)計(jì)分布中的1個(gè)偏差的范圍。在本發(fā)明的生物中，術(shù)語(yǔ)“基本上相同的生長(zhǎng)”是指，例如，(1)祖先的數(shù)目沒(méi)有顯著變化；(2)盡管形態(tài)學(xué)有所變化，但基本上沒(méi)有產(chǎn)生與一般的人工突變不同的紊亂。盡管有相當(dāng)高的突變率，但認(rèn)為外觀是“漂亮的”(盡管該特征與生長(zhǎng)無(wú)直接關(guān)系，但該特征是通過(guò)本發(fā)明的方法建立的突變體特有的)；和(3)一旦獲得就不會(huì)退化的性狀、基因型或表型。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“抗藥性”是指對(duì)藥物(包括生理活性物質(zhì)，例如噬菌體，細(xì)菌素，等)的耐受性或抗性。當(dāng)改變了它的藥物受體時(shí)，或者改變了許多參與藥物作用的過(guò)程中的一個(gè)或多個(gè)時(shí)，敏感的宿主就會(huì)獲得抗藥性?；蛘?，當(dāng)敏感的宿主獲得使抗生素本身失活的能力時(shí)，就可以獲得抗藥性。在抗藥的生物中，染色體DNA中的突變可能改變藥物發(fā)生作用的酶和/或核糖體蛋白，從而使得通常濃度的藥物不再有效。或者，生物可能獲得來(lái)自其它生物的抗藥的質(zhì)粒(例如，R質(zhì)粒)，從而獲得使藥物失活的酶活性?；蛘撸赡芙档退幬锏哪B透性，以得到對(duì)藥物的抗性。本發(fā)明不限于此。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“癌細(xì)胞”具有與術(shù)語(yǔ)“惡性腫瘤細(xì)胞”(包括肉瘤)相同的含義，指具有永久增殖能力的且不滅的細(xì)胞。癌細(xì)胞會(huì)獲得永久增殖能力，且以以下方式變得不滅。正常的細(xì)胞會(huì)在基因水平上發(fā)生某些不可逆的變化。結(jié)果，正常的細(xì)胞轉(zhuǎn)化成了異常的細(xì)胞，即癌細(xì)胞。
如本文所使用的，與生物有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“生產(chǎn)”是指生成了個(gè)體生物。
如本文所使用的，與生物有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“繁殖”是指，從親本個(gè)體生成了下一代的新個(gè)體。繁殖包括但不限于自然倍增，增殖，等；通過(guò)人工技術(shù)進(jìn)行的人工倍增，增殖，等，例如克隆技術(shù)(核移植，等)。繁殖技術(shù)的實(shí)例包括但不限于在植物的情況下，單個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)；插條的嫁接；插條的生根；等。繁殖的生物一般具有源自它們的親本的遺傳性狀。有性繁殖的生物一般具有源自兩性的遺傳性狀。一般地，這些遺傳性狀以基本上相等的比例源自兩性。無(wú)性繁殖的生物具有源自它們的親本的遺傳性狀。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”在本文中使用其在本領(lǐng)域最廣泛的含義，指多細(xì)胞生物的組織的結(jié)構(gòu)單元，其能自我復(fù)制，具有遺傳信息和表達(dá)它的機(jī)制，且被膜結(jié)構(gòu)圍繞，該膜結(jié)構(gòu)將活體與外界分離開(kāi)。這里使用的細(xì)胞可以是自然產(chǎn)生的細(xì)胞或人工修飾的細(xì)胞(例如，融合細(xì)胞，遺傳修飾的細(xì)胞，等)。細(xì)胞來(lái)源的實(shí)例包括但不限于正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的單細(xì)胞培養(yǎng)物、胚胎、血液或身體組織，細(xì)胞混合物，例如來(lái)自正常生長(zhǎng)的細(xì)胞系的細(xì)胞，等。
用于本發(fā)明的細(xì)胞可以源自任意的生物(例如，任意的單細(xì)胞生物(例如，細(xì)菌，酵母，等)或任意的多細(xì)胞生物(例如，動(dòng)物(例如，脊椎動(dòng)物，無(wú)脊椎動(dòng)物)，植物(例如，單子葉植物，雙子葉植物，等)，等))。例如，使用源自脊椎動(dòng)物(例如，盲鰻目，七鰓鰻目，軟骨魚(yú)綱，硬骨魚(yú)綱，兩棲動(dòng)物，爬行動(dòng)物，鳥(niǎo)類，哺乳動(dòng)物，等)的細(xì)胞。更具體地，使用源自哺乳動(dòng)物(例如，單孔目，有袋目，無(wú)齒類動(dòng)物，皮翼目，翼手目，食肉動(dòng)物，食蟲(chóng)動(dòng)物，長(zhǎng)鼻目，奇蹄目，偶蹄目，管齒目，鱗甲目，海牛目，鯨類動(dòng)物，靈長(zhǎng)目，嚙齒目，兔形目，等)的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用源自靈長(zhǎng)目(例如，黑猩猩，日本猴，人，等)，特別是人的細(xì)胞。本發(fā)明不限于此。用于本發(fā)明的細(xì)胞可以是干細(xì)胞或體細(xì)胞。上述的細(xì)胞可以用于移植目的。可以使用源自開(kāi)花植物(單子葉植物或雙子葉植物)的細(xì)胞。優(yōu)選地，使用雙子葉植物細(xì)胞。更優(yōu)選地，使用源自禾本科(Gramineae)、茄科、葫蘆科、十字花科(Cruciferae)、傘形科、薔薇科、豆科和紫草科(Boraginaceae)的細(xì)胞。優(yōu)選地，使用源自小麥、玉米、稻、大麥、高粱、煙草、青椒、茄子、瓜、番茄、草莓、甘薯、蕓苔屬(Brassica)、卷心菜、韭菜、椰菜、大豆、苜蓿、亞麻、胡蘿卜、黃瓜、柑桔、大白菜、萵苣、桃子、馬鈴薯、紫草(Lithospermumeythrohizon)、黃連根莖(Coptis Rhizom)、白楊和蘋(píng)果的細(xì)胞。植物細(xì)胞可以是一部分植物體、器官、組織、培養(yǎng)細(xì)胞等。轉(zhuǎn)化細(xì)胞、組織、器官或個(gè)體的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。這些技術(shù)詳細(xì)地描述在本文引用的文獻(xiàn)等中。可以將核酸分子短暫地或穩(wěn)定地導(dǎo)入生物細(xì)胞中。用于短暫地或穩(wěn)定地導(dǎo)入基因的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。用于分化用于本發(fā)明的細(xì)胞、從而生成轉(zhuǎn)化的植物的技術(shù)也是本領(lǐng)域眾所周知的。應(yīng)當(dāng)明白，這些技術(shù)詳細(xì)地描述在本文引用的文獻(xiàn)等中。用于從轉(zhuǎn)化的植物得到種子的技術(shù)也是本領(lǐng)域眾所周知的。這些技術(shù)描述在本文提及的文獻(xiàn)中。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”指能自我復(fù)制和具有多能性的細(xì)胞。一般地，干細(xì)胞可以再生受傷的組織。這里使用的干細(xì)胞可以是但不限于胚胎干(ES)細(xì)胞或組織干細(xì)胞(也稱作組織性干細(xì)胞，組織特異性的干細(xì)胞，或體干細(xì)胞)。干細(xì)胞可以是人工生產(chǎn)的細(xì)胞，只要它能具有上述的能力。術(shù)語(yǔ)“胚胎干細(xì)胞”指源自早期胚胎的多能干細(xì)胞。與胚胎干細(xì)胞不同，組織干細(xì)胞的分化方向受到限制。胚胎干細(xì)胞位于組織中的特定位置，且具有未分化的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。因此，組織干細(xì)胞具有低水平的多能性。在組織干細(xì)胞中，核/胞質(zhì)比率較高，且有很少的胞內(nèi)細(xì)胞器。組織干細(xì)胞一般具有多能性，細(xì)胞周期較長(zhǎng)，且可以維持超過(guò)個(gè)體壽命的增殖能力。這里使用的干細(xì)胞可以是胚胎干細(xì)胞或組織干細(xì)胞，只要它們能調(diào)節(jié)基因復(fù)制的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
可以將組織干細(xì)胞分類為細(xì)胞來(lái)源的位點(diǎn)的種類，例如皮系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、骨髓系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等。皮系統(tǒng)中的組織干細(xì)胞包括表皮干細(xì)胞，毛囊干細(xì)胞，等。消化系統(tǒng)中的組織干細(xì)胞包括胰腺(普通的)干細(xì)胞，肝干細(xì)胞，等。骨髓系統(tǒng)中的組織干細(xì)胞包括造血干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞，等。神經(jīng)系統(tǒng)中的組織干細(xì)胞包括神經(jīng)干細(xì)胞，視網(wǎng)膜干細(xì)胞，等。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“體細(xì)胞”指生殖細(xì)胞(例如卵細(xì)胞，精子等)以外的任意細(xì)胞，其不能將其DNA轉(zhuǎn)移到下一代中。一般地，體細(xì)胞具有有限的或沒(méi)有多能性。這里使用的體細(xì)胞可以是自然產(chǎn)生的或遺傳修飾的，只要它們能調(diào)節(jié)基因復(fù)制的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
將干細(xì)胞的來(lái)源分成外胚層、內(nèi)胚層或中胚層。外胚層來(lái)源的干細(xì)胞大多存在于腦中，包括神經(jīng)干細(xì)胞。內(nèi)胚層來(lái)源的干細(xì)胞大多存在于骨髓中，包括血管干細(xì)胞，造血干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞，等。中胚層來(lái)源的干細(xì)胞大多存在于器官中，包括肝干細(xì)胞，胰腺干細(xì)胞，等。如本文所使用的體細(xì)胞可以源自任意的胚層，只要它們能調(diào)節(jié)基因復(fù)制的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“分離的”表示減少了、優(yōu)選地基本上排除了至少一種一般環(huán)境中的天然伴隨物。因此，術(shù)語(yǔ)“分離的細(xì)胞”指基本上不含有一般環(huán)境中的天然伴隨物(例如，其它細(xì)胞，蛋白，核酸，等)的細(xì)胞。與核酸或多肽有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“分離的”指核酸或多肽，例如，當(dāng)通過(guò)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時(shí)，其基本上不含有細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者當(dāng)化學(xué)合成時(shí)，其基本上不含有前體化學(xué)物質(zhì)或其它化學(xué)物質(zhì)。優(yōu)選地，分離的核酸不含有天然地在生物中的核酸側(cè)翼的序列(核酸的5′或3′末端)。
如本文所使用的，與細(xì)胞有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“建立”指其中維持了細(xì)胞的特定性質(zhì)(多能性)，且該細(xì)胞在培養(yǎng)條件下會(huì)經(jīng)歷穩(wěn)定的增殖的細(xì)胞狀態(tài)。因此，建立的干細(xì)胞會(huì)維持多能性。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“分化的細(xì)胞”指具有專門功能和形式的細(xì)胞(例如，肌肉細(xì)胞，神經(jīng)元，等)。與干細(xì)胞不同，分化的細(xì)胞沒(méi)有或具有很少的多能性。分化的細(xì)胞的實(shí)例包括表皮細(xì)胞，胰腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞，胰管細(xì)胞，肝細(xì)胞，血細(xì)胞，心肌細(xì)胞，骨骼肌細(xì)胞，成骨細(xì)胞，骨骼成肌細(xì)胞，神經(jīng)元，血管內(nèi)皮細(xì)胞，色素細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，等。這里使用的細(xì)胞可以是任意的上述細(xì)胞，只要它們能調(diào)節(jié)基因復(fù)制的傾向于錯(cuò)誤的頻率。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“分化”或“細(xì)胞分化”指，在源自單個(gè)細(xì)胞分裂的子代細(xì)胞群體中發(fā)生在形態(tài)和/或功能上具有定性差異的2種或更多種細(xì)胞的現(xiàn)象。因此，“分化”包括這樣的過(guò)程，其中一群(家族樹(shù))原始地不具有特定的可檢測(cè)的特征的細(xì)胞獲得了特征，例如生成特定的蛋白，等。
如本文所使用的，與細(xì)胞、生物等有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“狀態(tài)”指細(xì)胞、生物等的參數(shù)(例如，細(xì)胞周期、對(duì)外源試劑的反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)、基因轉(zhuǎn)錄等)的狀況或模式。這樣的狀態(tài)的實(shí)例包括但不限于分化的狀態(tài)，未分化的狀態(tài)，細(xì)胞對(duì)外源試劑的反應(yīng)，細(xì)胞周期，增殖狀態(tài)，等。在這里可以使用目標(biāo)生物對(duì)下述參數(shù)(特征是生物的環(huán)境)的反應(yīng)性或抗性作為生物狀態(tài)的量度溫度，濕度(例如，絕對(duì)濕度，相對(duì)濕度，等)，pH，鹽濃度(例如，所有鹽或特定鹽的濃度)，營(yíng)養(yǎng)物(例如，碳水化合物的量，等)，金屬(例如，所有金屬或特定金屬(例如，重金屬，等)的量或濃度)，氣體(例如，所有氣體或特定氣體的量)，有機(jī)溶劑(例如，所有有機(jī)溶劑或特定有機(jī)溶劑(例如，乙醇，等)的量)，壓力(例如，局部的或總的壓力，等)，大氣壓力，粘度，流速(例如，存在生物的介質(zhì)的流速，等)，光強(qiáng)度(例如，特定波長(zhǎng)的光的量，等)，光波長(zhǎng)(例如，可見(jiàn)光，紫外光，紅外光，等)，電磁波，輻射，重力，張力，聲波，目標(biāo)生物以外的其它生物(例如，寄生物，病原性細(xì)菌，等)，化學(xué)試劑(例如，藥物，等)，抗生素，自然產(chǎn)生的物質(zhì)，心理應(yīng)激，機(jī)體應(yīng)激，等。
如本文所使用的，與實(shí)體有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“環(huán)境”(或德語(yǔ)中的“Umgebung”)指圍繞著該實(shí)體的環(huán)境。在環(huán)境中，識(shí)別出了多種組分和一定量的狀態(tài)，它們稱作環(huán)境因素。環(huán)境因素的實(shí)例包括上述的參數(shù)。環(huán)境因素一般大致分成非生物的環(huán)境因素和生物的環(huán)境因素。非生物的環(huán)境因素(無(wú)機(jī)環(huán)境因素)可以分成物理因素和化學(xué)因素，或者，氣候因素和土壤因素。各種環(huán)境因素不總是獨(dú)立地作用于生物，而是可以與另一種相關(guān)聯(lián)。因此，在這里可以逐個(gè)地或作為整體地(各種參數(shù)的整體)觀察環(huán)境因素。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“組織”指多細(xì)胞生物中的具有基本上相同的功能和/或形式的細(xì)胞的聚集體?！敖M織”一般是相同來(lái)源的細(xì)胞的聚集體，但是可以是不同來(lái)源的細(xì)胞的聚集體，只要這些細(xì)胞具有相同的功能和/或形式。因此，當(dāng)本發(fā)明的干細(xì)胞用于再生組織時(shí)，該組織可以由2種或更多種不同來(lái)源的細(xì)胞的聚集體組成。一般地，組織構(gòu)成器官的一部分。在形態(tài)的、功能的或發(fā)育的基礎(chǔ)上，可以將動(dòng)物組織分成表皮組織，結(jié)締組織，肌肉組織，神經(jīng)組織，等。根據(jù)構(gòu)成組織的細(xì)胞的發(fā)育狀態(tài)，可以將植物組織大致分成分生組織和永久組織。或者，根據(jù)構(gòu)成組織的細(xì)胞的類型，可以將組織分成單一組織和復(fù)合組織。因而，可以將組織分成各種類別。這里可以使用任意的組織，只要其中能調(diào)節(jié)基因復(fù)制的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
任意的器官或其一部分都可以用于本發(fā)明。要在本發(fā)明中注射的組織或細(xì)胞可以源自任意的器官。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“器官”指位于發(fā)揮特定功能的個(gè)體生物的特定部分中的形態(tài)上獨(dú)立的結(jié)構(gòu)。在多細(xì)胞生物(例如，動(dòng)物，植物)中，器官由空間上以特定方式排列的幾種組織組成，每種組織由許多細(xì)胞組成。這樣的器官的實(shí)例包括與血管系統(tǒng)有關(guān)的器官。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明靶向的器官包括但不限于皮膚，血管，角膜，腎，心，肝，臍帶，腸，神經(jīng)，肺，胎盤，胰腺，腦，外周肢(peripheral limb)，視網(wǎng)膜，等。任意的器官或其一部分都可以用于本發(fā)明，只要其中能調(diào)節(jié)基因復(fù)制的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)物物質(zhì)”指目標(biāo)生物或其一部分生成的物質(zhì)。這樣的產(chǎn)物物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于基因的表達(dá)產(chǎn)物、代謝物、糞便等。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)調(diào)節(jié)遺傳性狀的轉(zhuǎn)化率，可以使目標(biāo)生物改變產(chǎn)物物質(zhì)的類型和/或量。應(yīng)當(dāng)明白，本發(fā)明包括這樣改變的產(chǎn)物物質(zhì)。優(yōu)選地，產(chǎn)物物質(zhì)可以是但不限于代謝物。
如本文所使用的，與生物有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“疾病模型”指可以在其中重建對(duì)生物特異性的疾病、癥狀、紊亂、狀況等的生物模型。通過(guò)本發(fā)明的方法，可以生成這樣的疾病模型。這樣的疾病模型的實(shí)例包括但不限于癌癥的動(dòng)物模型，心臟病(例如，心肌梗塞，等)的動(dòng)物模型，心血管病(例如，動(dòng)脈硬化，等)的動(dòng)物模型，中樞神經(jīng)病(例如，癡呆，腦梗塞，等)的動(dòng)物模型，等。
(普通生物化學(xué)和分子生物學(xué))(一般技術(shù))如本文所使用的分子生物學(xué)技術(shù)、生物化學(xué)技術(shù)、微生物學(xué)技術(shù)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的和常用的，且描述在，例如，Sambrook J.等(1989)，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor和其第3版.(20D1)；Ausubel，F(xiàn).M.(1987)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associatesand Wiley-Interscience；Ausubel，F(xiàn).M.(1989)，Short Protocolsin Molecular BiologyA Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates andWiley-Interscience；Innis，M.A.(1990)，PCR ProtocolsA Guideto Methods and Applications，Academic Press；Ausubel，F(xiàn).M.(1992)，Short Protocols in Molecular BiologyA Compendiumof Methods from Current Protocols in Molecular Biology，GreenePub.Associates；Ausubel，F(xiàn).M.(1995)，Short Protocols inMolecular BiologyA Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates；Innis，M.A.等(1995)，PCR Strategies，Academic Press；Ausubel，F(xiàn).M.(1999)，Short Protocols in Molecular BiologyACompendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology，Wiley，and annual updates；Sninsky，J.J.等(1999)，PCR ApplicationsProtocols for Functional Genomics，AcademicPress；Special issue，Jikken Igaku[Experimental Medicine]“Idenshi Donyu & Hatsugen Kaiseki Jikkenho[ExperimentalMethods for Gene Introduction & Expression Analysis]”，Yodo-sha，1997，等。這些出版物中的每一篇的相關(guān)部分(或可能是整體)均在這里引作參考。
用于制備人工合成的基因的DNA合成技術(shù)和核酸化學(xué)描述在，例如，Gait，M.J.(1985)，Oligonucleotide SynthesisA PracticalApproach，IRL Press；Gait，M.J.(1990)，OligonucleotideSynthesisA Practical Approach，IRL Press；Eckstein，F(xiàn).(1991)，Oligonucleotides and AnaloguesA Practical Approac，IRL Press；Adams，R.L.等(1992)，The Biochemistry of the Nucleic Acids，Chapman & Hall；Shabarova，Z.等(1994)，Advanced OrganicChemistry of Nucleic Acids，Weinheim；Blackburn，G.M.等(1996)，Nucleic Acids in Chemistry and Biology，Oxford UniversityPress；Hermanson，G.T.(1996)，Bioconjugate Techniques，Academic Press；等，其相關(guān)部分在這里引作參考。
如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白”、“多肽”、“寡肽”和“肽”具有相同的含義，是指具有任意長(zhǎng)度的氨基酸聚合物。該聚合物可以是直鏈、分支或環(huán)狀鏈。氨基酸可以是自然產(chǎn)生的或非自然產(chǎn)生的氨基酸，或變體氨基酸。該術(shù)語(yǔ)可以包括組裝進(jìn)許多多肽鏈的復(fù)合物中的那些。該術(shù)語(yǔ)還包括自然產(chǎn)生的或人工改變的氨基酸聚合物。這樣的修飾包括，例如，二硫鍵形成，糖基化，脂化(lipidation)，乙酰化，磷酸化，或任意的其它操作或修飾(例如，與標(biāo)記部分綴合)。該定義包括例如含有至少一種氨基酸類似物(例如，非自然產(chǎn)生的氨基酸，等)的多肽、肽樣化合物(例如，類肽)和本領(lǐng)域已知的其它變體。本發(fā)明的基因產(chǎn)物一般是多肽形式。多肽形式的本發(fā)明的產(chǎn)物物質(zhì)可以用作藥物組合物等。
如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”具有相同的含義，是指具有任意長(zhǎng)度的核苷酸聚合物。該術(shù)語(yǔ)還包括“寡核苷酸衍生物”或“多核苷酸衍生物”?！肮押塑账嵫苌铩被颉岸嗪塑账嵫苌铩卑ê塑账嵫苌?，或指具有與一般連接不同的核苷酸間連接的寡核苷酸或多核苷酸，它們可互換地使用。這樣的寡核苷酸的實(shí)例具體地包括2′-O-甲基-核糖核苷酸，其中的寡核苷酸的磷酸二酯鍵被轉(zhuǎn)化成硫代磷酸酯鍵的寡核苷酸衍生物，其中的寡核苷酸的磷酸二酯鍵被轉(zhuǎn)化成N3′-P5′氨基磷酸酯鍵的寡核苷酸衍生物，其中的寡核苷酸的核糖和磷酸二酯鍵被轉(zhuǎn)化成肽-核酸鍵的寡核苷酸衍生物，其中的寡核苷酸的尿嘧啶被取代為C-5丙炔基尿嘧啶的寡核苷酸衍生物，其中的寡核苷酸的尿嘧啶被取代為C-5噻唑尿嘧啶的寡核苷酸衍生物，其中的寡核苷酸的胞嘧啶被取代為C-5丙炔基胞嘧啶的寡核苷酸衍生物，其中的寡核苷酸的胞嘧啶被取代為吩噁嗪修飾的胞嘧啶的寡核苷酸衍生物，其中的DNA的核糖被取代為2′-O-丙基核糖的寡核苷酸衍生物，和其中的寡核苷酸的核糖被取代為2′-甲氧基乙氧基核糖的寡核苷酸衍生物。除非另有說(shuō)明，特定的核酸序列還隱含地包括其保守地修飾的變體(例如簡(jiǎn)并的密碼子取代)和互補(bǔ)的序列以及明確指出的序列。具體地，通過(guò)生成其中的一個(gè)或多個(gè)選定的(或全部)密碼子的第3位取代為混合堿基和/或去氧肌苷殘基的序列，可以生成簡(jiǎn)并的密碼子取代(Batzer等，Nucleic Acid Res.195081(1991)；Ohtsuka等，J.Biel.Chem.2602605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 891-98(1994))。本發(fā)明的基因一般是多核苷酸形式。多核苷酸形式的本發(fā)明的基因或基因產(chǎn)物可以用于本發(fā)明的方法。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“核酸分子”還與術(shù)語(yǔ)“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互換地使用，包括cDNA、mRNA、基因組DNA等。如本文所使用的，核酸和核酸分子可以包含在術(shù)語(yǔ)“基因”的概念中。能編碼給定基因的序列的核酸分子包括“剪接突變體(變體)”。類似地，由核酸編碼的特定蛋白包括由該核酸的剪接變體編碼的任意蛋白。如其名字所暗示的，“剪接突變體”是基因的可變剪接的產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄后，可以剪接初始的核酸轉(zhuǎn)錄物，從而使得不同的(可變的)核酸剪接產(chǎn)物能編碼不同的多肽。生成剪接變體的機(jī)制可以有變化，但是包括外顯子的可變剪接。該定義還包括通過(guò)連讀轉(zhuǎn)錄源自相同核酸的可變多肽。該定義包括剪接反應(yīng)的任意產(chǎn)物，包括剪接產(chǎn)物的重組形式。因此，本發(fā)明的基因可以包括這里的剪接突變體。
如本文所使用的，基因(例如，核酸序列，氨基酸序列，等)的“同源性”指2個(gè)或更多個(gè)基因序列之間的同一性的比例。如本文所使用的，序列(核酸序列，氨基酸序列，等)的同一性指2個(gè)或更多個(gè)可比較的序列之間的相同序列(單個(gè)的核酸，氨基酸，等)的比例。因此，2個(gè)特定的基因之間的同源性越大，它們的序列之間的同一性或相似性越大。通過(guò)直接比較它們的序列，或者通過(guò)在嚴(yán)格條件下的雜交方法，可以確定2個(gè)基因是否具有同源性。當(dāng)將2個(gè)基因序列直接彼此對(duì)比時(shí)，如果基因的DNA序列代表性地彼此具有至少50％的同一性，優(yōu)選地至少70％的同一性，更優(yōu)選地至少80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性，則這些基因具有同源性。如本文所使用的，當(dāng)保守取代在上述的同源性中視作正的(相同的)時(shí)，基因(例如，核酸序列，氨基酸序列，等)的“相似性”指2個(gè)或更多個(gè)序列之間的同一性的比例。因此，同源性和相似性在存在保守取代時(shí)彼此不同。如果不存在保守取代，則同源性和相似性具有相同的值。
這里使用默認(rèn)參數(shù)的PSI-BLAST(序列分析工具)，對(duì)比氨基酸序列和堿基序列的相似性、同一性和同源性。另外，可以使用FASTA(使用默認(rèn)參數(shù))代替PSI-BLAST。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”可以指自然產(chǎn)生的或非自然產(chǎn)生的氨基酸，只要它能滿足本發(fā)明的目的。術(shù)語(yǔ)“氨基酸衍生物”或“氨基酸類似物”指與自然產(chǎn)生的氨基酸不同的氨基酸，且其具有與原始氨基酸類似的功能。這樣的氨基酸衍生物和氨基酸類似物是本領(lǐng)域眾所周知的。
術(shù)語(yǔ)“自然產(chǎn)生的氨基酸”指自然產(chǎn)生的氨基酸的L-異構(gòu)體。自然產(chǎn)生的氨基酸是甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，甲硫氨酸，蘇氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，半胱氨酸，脯氨酸，組氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，γ-羧基谷氨酸，精氨酸，鳥(niǎo)氨酸和賴氨酸。除非另有說(shuō)明，如本文所使用的所有氨基酸是L-異構(gòu)體，盡管使用D-氨基酸的實(shí)施方案也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“非自然產(chǎn)生的氨基酸”指通常在自然界不會(huì)發(fā)現(xiàn)的氨基酸。非自然產(chǎn)生的氨基酸的實(shí)例包括正亮氨酸，對(duì)硝基苯丙氨酸，高苯丙氨酸(homophenylalanine)，對(duì)氟苯丙氨酸，3-氨基-2-苯偶酰丙酸，D-或L-高精氨酸和D-苯丙氨酸。術(shù)語(yǔ)“氨基酸類似物”指具有與氨基酸類似的物理性質(zhì)和/或功能的非氨基酸的分子。氨基酸類似物的實(shí)例包括，例如，乙硫氨酸，刀豆氨酸，2-甲基谷氨酰胺等。氨基酸模仿物指具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)、但是以與自然產(chǎn)生的氨基酸類似的方式起作用的化合物。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“核苷酸”可以是自然產(chǎn)生的或非自然產(chǎn)生的。術(shù)語(yǔ)“核苷酸衍生物”或“核苷酸類似物”指與自然產(chǎn)生的核苷酸不同、且具有與原始核苷酸類似的功能的核苷酸。這樣的核苷酸衍生物和核苷酸類似物是本領(lǐng)域眾所周知的。這樣的核苷酸衍生物和核苷酸類似物的實(shí)例包括但不限于硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，甲基膦酸酯，手性的-甲基膦酸酯，2-O-甲基核糖核苷酸，和肽-核酸(PNA)。
在本文中可以用它們的普遍知道的三字母符號(hào)或IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)(Biochemical Nomenclature Commission)推薦的單字母符號(hào)來(lái)指示氨基酸。同樣地，可以用它們的普遍接受的單字母編碼來(lái)指示核苷酸。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“對(duì)應(yīng)的”氨基酸或核酸指特定的多肽或多核苷酸分子中的氨基酸或核苷酸，其具有或預(yù)期其具有與作為對(duì)比參考的多肽或多核苷酸中的預(yù)定的氨基酸或核苷酸類似的功能。具體地，在酶分子的情況下，該術(shù)語(yǔ)指存在于活性部位(例如，提供DNA聚合酶的校對(duì)功能的范圍)的相似位置的氨基酸，且類似地提供催化活性。例如，在反義分子的情況下，該術(shù)語(yǔ)指與反義分子的特定部分相對(duì)應(yīng)的直向同源體(ortholog)中的相似部分。使用本領(lǐng)域已知的比對(duì)技術(shù)，可以鑒別出對(duì)應(yīng)的氨基酸和核酸。這樣的比對(duì)技術(shù)描述在，例如，Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，J.Mol.Biol.48，443-453，1970中。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“對(duì)應(yīng)的”基因(例如，多肽或多核苷酸分子)指給定物種中的基因(例如，多肽或多核苷酸分子)，其具有或預(yù)期其具有與作為對(duì)比參考的物種中的預(yù)定的基因類似的功能。當(dāng)存在許多具有這樣的功能的基因時(shí)，該術(shù)語(yǔ)指具有相同的進(jìn)化起源的基因。因此，與特定的基因相對(duì)應(yīng)的基因可以是特定的基因的直向同源體。因此，可以在其它的動(dòng)物(人，大鼠，豬，牛，等)中發(fā)現(xiàn)與小鼠DNA聚合酶基因等相對(duì)應(yīng)的基因。通過(guò)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，可以鑒別出這樣對(duì)應(yīng)的基因。因此，例如，使用參考基因(例如，小鼠DNA聚合酶基因等)的序列作為查詢序列，通過(guò)搜索動(dòng)物(例如，人，大鼠)的序列數(shù)據(jù)庫(kù)，可以發(fā)現(xiàn)特定的動(dòng)物中的對(duì)應(yīng)的基因。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“核苷酸”可以是自然產(chǎn)生的或非自然產(chǎn)生的。術(shù)語(yǔ)“核苷酸衍生物”或“核苷酸類似物”指與自然產(chǎn)生的核苷酸不同、且具有與原始核苷酸相似的功能的核苷酸。這樣的核苷酸衍生物和核苷酸類似物是本領(lǐng)域眾所周知的。這樣的核苷酸衍生物和核苷酸類似物的實(shí)例包括但不限于硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，甲基膦酸酯，手性的-甲基膦酸酯，2-O-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(PNA)。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“片段”指相對(duì)于參考多肽或多核苷酸的全長(zhǎng)(長(zhǎng)度n)具有1至n-1的序列長(zhǎng)度的多肽或多核苷酸。片段的長(zhǎng)度可以根據(jù)目的相應(yīng)地改變。例如，在多肽的情況中，片段長(zhǎng)度的下限包括3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50或更多的核苷酸。這里沒(méi)有指出的整數(shù)(例如，11等)代表的長(zhǎng)度可以是適當(dāng)?shù)南孪?。例如，在多核苷酸的情況下，片段長(zhǎng)度的下限包括5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50，75，100或更多的核苷酸。這里沒(méi)有指出的整數(shù)(例如，11等)代表的長(zhǎng)度可以是適當(dāng)?shù)南孪蕖Ｈ绫疚乃褂玫?，多肽或多核苷酸的長(zhǎng)度可以分別由氨基酸或核酸的數(shù)目表示。但是，上述的數(shù)字不是絕對(duì)的。上述的作為上限或下限的數(shù)字意在包括一些更大的或更小的數(shù)字(例如，±10％)，只要能維持相同的功能即可。為了該目的，可以在數(shù)字前加上“約”。但是，應(yīng)當(dāng)明白，數(shù)字的解釋不受本說(shuō)明書(shū)中是否存在“約”的影響。根據(jù)是否維持了作為片段參考的全長(zhǎng)蛋白的功能中的至少一種功能(例如，與其它分子的特異性相互作用，等)，可以決定有用片段的長(zhǎng)度。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)能與生物試劑(例如多核苷酸、多肽等)“特異性地相互作用的試劑”指具有對(duì)生物試劑(例如多核苷酸、多肽等)的親和力的試劑，其代表性地比對(duì)其它不相關(guān)的生物試劑(例如多核苷酸、多肽等)(更具體地，具有低于30％的同一性的那些)的親和力更高或相等，優(yōu)選地顯著(例如，統(tǒng)計(jì)上顯著地)更高。使用例如雜交實(shí)驗(yàn)、結(jié)合實(shí)驗(yàn)等，可以檢測(cè)這樣的親和力。如本文所使用的，“試劑”可以是任意的物質(zhì)或其它因素(例如，能量，例如光，輻射，熱，電，等)，只要可以實(shí)現(xiàn)想要的目的即可。這樣的物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于蛋白，多肽，寡肽，肽，多核苷酸，寡核苷酸，核苷酸，核酸(例如，DNA，例如cDNA，基因組DNA，等；和RNA，例如mRNA)，多糖，寡糖，脂類，小分子量的有機(jī)分子(例如，激素，配體，信息傳遞物質(zhì)，通過(guò)組合化學(xué)合成的分子，小分子量的分子(例如，藥學(xué)上可接受的小分子量的配體等)，等)，和這些分子的組合。對(duì)多核苷酸特異性的試劑的實(shí)例包括但不限于代表性地，與具有預(yù)定的序列同源性(例如，70％或更高的序列同一性)的多核苷酸的序列具有互補(bǔ)性的多核苷酸，多肽，例如能結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄試劑，等。對(duì)多肽特異性的試劑的實(shí)例包括但不限于代表性地，特異性地針對(duì)多肽或其衍生物或類似物的抗體(例如，單鏈抗體)；當(dāng)該多肽是受體或配體時(shí)，特異性的配體或受體；當(dāng)多肽是酶時(shí)的底物等。這些試劑在這里可以用于調(diào)節(jié)生物的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“小分子量的有機(jī)分子”指具有相對(duì)較小的分子量的有機(jī)分子；通常，小分子量的有機(jī)分子指約1,000或更小的分子量，或可以指大于1,000的分子量。通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法或其組合，可以一般地合成小分子量的有機(jī)分子。生物可以生成這些小分子量的有機(jī)分子。小分子量的有機(jī)分子的實(shí)例包括但不限于激素，配體，信息傳遞物質(zhì)，通過(guò)組合化學(xué)合成的分子，藥學(xué)上可接受的小分子量的分子(例如，小分子量的配體等)，等。這些試劑在這里可以用于調(diào)節(jié)生物的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”包括多克隆抗體，單克隆抗體，人抗體，人源化的抗體，多功能抗體，嵌合抗體，和抗獨(dú)特型抗體，和其片段(例如，F(xiàn)(ab′)2和Fab片段)，和其它重組綴合物。這些抗體可以通過(guò)共價(jià)鍵或通過(guò)重組與酶(例如，堿性磷酸酶，辣根過(guò)氧化物酶，α-半乳糖酶，等)融合。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“抗原”指抗體分子可以特異性地結(jié)合的任意底物。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“免疫原”指能啟動(dòng)淋巴細(xì)胞的抗原-特異性的免疫反應(yīng)的活化的抗原。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“單鏈抗體”指通過(guò)肽交聯(lián)劑連接Fv區(qū)的重鏈片段和輕鏈片段形成的單鏈多肽。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“復(fù)合分子”指這樣的分子，其中許多分子，例如多肽、多核苷酸、脂類、糖、小分子量的分子等連接在一起。這樣的復(fù)合分子的實(shí)例包括但不限于糖脂，糖肽，等。這些分子在這里可以用作基因或其產(chǎn)物(例如，DNA聚合酶，等)或本發(fā)明的試劑，只要該分子具有與該基因或其基因產(chǎn)物(例如，DNA聚合酶，等)或本發(fā)明的試劑基本上相同的功能。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“分離的”生物試劑(例如，核酸，蛋白，等)指基本上與自然產(chǎn)生的生物的細(xì)胞中的其它生物試劑(例如，在核酸的情況下，核酸以外的試劑和具有與目標(biāo)核酸不同的核酸序列的核酸；和在蛋白的情況下，蛋白以外的試劑和具有與目標(biāo)蛋白不同的氨基酸序列的蛋白)分離或純化的生物試劑。“分離的”核酸和蛋白包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化出的核酸和蛋白。分離的核酸和蛋白還包括化學(xué)合成的核酸和蛋白。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“純化的”生物試劑(例如，核酸，蛋白，等)指從中去除了至少一部分天然伴隨的試劑的試劑。因此，通常，純化的生物試劑的純度高于正常狀態(tài)的生物試劑(即，濃縮的)。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“純化的”和“分離的”是指，存在優(yōu)選地至少75重量％、更優(yōu)選地至少85重量％、甚至更優(yōu)選地至少95重量％和最優(yōu)選地至少98重量％的相同類型的生物試劑。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)基因產(chǎn)物(例如基因，多核苷酸，多肽，等)的“表達(dá)”是指，該基因等受到預(yù)定的體內(nèi)作用的影響以改變成其它形式。優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”是指，將基因、多核苷酸等轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，基因可以轉(zhuǎn)錄成mRNA。更優(yōu)選地，這些多肽可以具有翻譯后的加工修飾。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)基因、多核苷酸、多肽等的“表達(dá)的減少”是指，在存在本發(fā)明的試劑的作用時(shí)，表達(dá)水平比沒(méi)有該試劑的作用時(shí)顯著降低。優(yōu)選地，表達(dá)的減少包括多肽(例如，DNA聚合酶等)的表達(dá)量的減少。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)基因、多核苷酸、多肽等的“表達(dá)的增加”是指，在存在本發(fā)明的試劑的作用時(shí)，表達(dá)水平比沒(méi)有該試劑的作用時(shí)顯著增加。優(yōu)選地，表達(dá)的增加包括多肽(例如，DNA聚合酶等)的表達(dá)量的增加。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)基因的“表達(dá)的誘導(dǎo)”是指，通過(guò)將特定的試劑應(yīng)用到特定的細(xì)胞，增加基因的表達(dá)量。因此，表達(dá)的誘導(dǎo)包括當(dāng)不能觀察到基因的表達(dá)時(shí)，使基因表達(dá)，和當(dāng)能觀察到基因的表達(dá)時(shí)，增加基因的表達(dá)量。這些基因或基因產(chǎn)物(多肽或多核苷酸)的增加或減少可以用于調(diào)節(jié)例如，在本發(fā)明中復(fù)制中傾向于錯(cuò)誤的頻率。
如本文所使用的，在基因的情況下的術(shù)語(yǔ)“特異性地表達(dá)”是指，基因在特定位點(diǎn)表達(dá)或表達(dá)特定的時(shí)間段，其水平與在其它位點(diǎn)或時(shí)間段的不同(優(yōu)選地更高)。術(shù)語(yǔ)“特異性地表達(dá)”是指，基因可以僅僅在給定的位點(diǎn)(特定位點(diǎn))表達(dá)或可以在其它位點(diǎn)表達(dá)。優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)“特異性地表達(dá)”是指，基因僅僅在給定的位點(diǎn)表達(dá)。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，DNA聚合酶可以特異性地或局部地在需要的部分表達(dá)。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“生物活性”是指生物內(nèi)的試劑(例如，多核苷酸，蛋白，等)所具有的活性，包括表現(xiàn)出各種功能的活性(例如，轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性)。例如，當(dāng)2種試劑彼此相互作用時(shí)(例如，DNA聚合酶結(jié)合特異性的序列)，生物活性包括DNA聚合酶和特異性的序列之間的連接，連接造成的生物變化(例如，特異性的核苷酸聚合反應(yīng)；發(fā)生復(fù)制錯(cuò)誤；去除核苷酸的能力；識(shí)別錯(cuò)配的堿基對(duì)；等)。例如，當(dāng)特定的試劑是酶時(shí)，其生物活性包括其酶促活性。在其它的實(shí)例中，當(dāng)特定的試劑是配體時(shí)，其生物活性包括該試劑與該配體的受體的結(jié)合。使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，可以測(cè)量這樣的生物活性。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“反義(活性)”是指允許特異性地阻抑或減少靶基因的表達(dá)的活性。通常，使用與靶基因(例如，DNA聚合酶等)的核酸序列互補(bǔ)的、具有至少8個(gè)鄰接核苷酸的長(zhǎng)度的核酸序列來(lái)實(shí)現(xiàn)該反義活性。這樣的核酸序列優(yōu)選地具有至少9個(gè)鄰接核苷酸的長(zhǎng)度，更優(yōu)選地至少10個(gè)鄰接核苷酸的長(zhǎng)度，且甚至更優(yōu)選地至少11個(gè)鄰接核苷酸的長(zhǎng)度，至少12個(gè)鄰接核苷酸的長(zhǎng)度，至少13個(gè)鄰接核苷酸的長(zhǎng)度，至少14個(gè)鄰接核苷酸的長(zhǎng)度，至少15個(gè)鄰接核苷酸的長(zhǎng)度，至少20個(gè)鄰接核苷酸的長(zhǎng)度，至少30個(gè)鄰接核苷酸的長(zhǎng)度，至少40個(gè)鄰接核苷酸的長(zhǎng)度，和至少50個(gè)鄰接核苷酸的長(zhǎng)度。這些核酸序列包括與其具有至少70％、更優(yōu)選地至少80％、甚至更優(yōu)選地至少90％、且再更優(yōu)選地至少95％同源性的核酸序列。反義活性優(yōu)選地與靶基因的核酸序列的5′末端序列互補(bǔ)。這樣的反義核酸序列包括具有一個(gè)或幾個(gè)、或至少一個(gè)核苷酸取代、添加和/或缺失的上述序列。具有這樣的反義活性的分子在這里可以用于調(diào)節(jié)生物的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“RNAi”是RNA干擾的縮寫(xiě)，是指下述現(xiàn)象將用于造成RNAi的試劑、例如雙鏈RNA(也稱作dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞中，并特異性地降低與其同源的mRNA，從而抑制基因產(chǎn)物的合成，和使用該現(xiàn)象的技術(shù)。如本文所使用的，RNAi可以具有與能造成RNAi的試劑相同的含義。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“能造成RNAi的試劑”指能造成RNAi的任意試劑。如本文所使用的，“能造成基因的RNA i的試劑”是指試劑能造成與該基因有關(guān)的RNAi和達(dá)到RNAi的效果(例如，抑制該基因的表達(dá)，等)。這樣的能造成RNAi試劑的實(shí)例包括但不限于與靶基因的核酸序列具有至少約70％同源性的序列或可在嚴(yán)格條件下雜交的序列，含有具有至少10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的雙鏈部分的RNA或其變體。在這里，該試劑可以優(yōu)選地是含有3′突出端的DNA，且更優(yōu)選地該3′突出端具有2個(gè)或更多個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度(例如，2-4個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度)。RNAi在這里可以用于調(diào)節(jié)生物的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
如本文所使用的，“在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸”指常用的且本領(lǐng)域眾所周知的條件。通過(guò)使用從本發(fā)明的多核苷酸中選擇出的多核苷酸，通過(guò)進(jìn)行菌落雜交、噬菌斑雜交、DNA印跡雜交等，可以得到這樣的多核苷酸。具體地，在有0.7-1.0M NaCl存在的情況下，使用在其上面固定了源自菌落或噬菌斑的DNA的濾器在65℃進(jìn)行雜交。此后，在65℃，使用0.1-2倍濃度的SSC(鹽水-檸檬酸鈉)溶液(1-倍濃度的SSC溶液由150mM氯化鈉和15mM檸檬酸鈉組成)洗滌濾器。將通過(guò)該方法鑒別出的多核苷酸稱作“在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸”。可以根據(jù)描述在下述文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行雜交，例如，Molecular Cloning第2版，Current Protocols in MolecularBiology，Supplement 1-38，DNA Cloning 1Core Techniques，APractical Approach，第2版，0xford University Press(1995)等。在這里，在嚴(yán)格條件下雜交的序列優(yōu)選地排除僅僅含有A(腺嘌呤)或T(胸腺嘧啶)的序列?！翱呻s交的多核苷酸”是指可以在上述的雜交條件下與其它多核苷酸雜交的多核苷酸。具體地，可雜交的多核苷酸至少包括與能編碼具有本文具體公開(kāi)的氨基酸序列的多肽的DNA的堿基序列具有至少60％同源性的多核苷酸，優(yōu)選具有至少80％同源性的多核苷酸，且更優(yōu)選具有至少95％同源性的多核苷酸。
術(shù)語(yǔ)“高度嚴(yán)格的條件”指用于使序列高度互補(bǔ)的DNA鏈進(jìn)行雜交、且能排除明顯錯(cuò)配的DNA的雜交的條件。雜交嚴(yán)格性主要由溫度、離子強(qiáng)度、變性劑(例如甲酰胺)的濃度決定。用于雜交和洗滌的“高度嚴(yán)格的條件”的實(shí)例是0.0015M氯化鈉，0.0015M檸檬酸鈉，在65-68℃，或0.015M氯化鈉，0.0015M檸檬酸鈉，和50％甲酰胺，在42℃。見(jiàn)Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.，1989)；Anderson等，Nucleic Acid HybridizationAPractical Approach Ch.4(IRL Press Limited)(Oxford Express)?？梢匀芜x地使用更嚴(yán)格的條件(例如更高的溫度，更低的離子強(qiáng)度，更高的甲酰胺或其它變性劑)。為了減少非特異性的和/或背景雜交的目的，在雜交和洗滌緩沖液中可以包含其它試劑。實(shí)例是0.1％牛血清清蛋白，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％焦磷酸鈉，0.1％十二烷基硫酸鈉(NaDodSO4或SDS)，F(xiàn)icoll，Denhardt氏溶液，超聲波處理的鮭精DNA(或另一種非互補(bǔ)的DNA)和葡聚糖硫酸酯，盡管還可以使用其它合適的試劑?？梢愿淖冞@些添加劑的濃度和類型，而基本上不影響雜交條件的嚴(yán)格性。雜交實(shí)驗(yàn)通常在pH6.8-7.4進(jìn)行；但是，在一般的離子強(qiáng)度條件下，雜交速度幾乎與pH無(wú)關(guān)。見(jiàn)Anderson等，Nucleic Acid HybridizationA Practical Approach Ch.4(IRLPress Limited，Oxford，英國(guó))。
能影響DNA雙鏈體的穩(wěn)定性的因素包括堿基組成、長(zhǎng)度和堿基對(duì)錯(cuò)配的程度。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以調(diào)節(jié)雜交條件，以使這些變量適應(yīng)，并使不同序列相關(guān)性的DNA形成雜交物。通過(guò)下面的方程，可以估計(jì)出較好地配對(duì)的DNA雙鏈體的解鏈溫度Tm(℃)＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(％G+C)-600/N-0.72(％甲酰胺)其中N是形成的雙鏈體的長(zhǎng)度，[Na+]是雜交或洗滌溶液中的鈉離子的摩爾濃度，％G+C是雜交物中的(鳥(niǎo)嘌呤+胞嘧啶)堿基百分比。對(duì)于較不好地配對(duì)的雜交物，每1％的錯(cuò)配，解鏈溫度會(huì)降低約1℃。
術(shù)語(yǔ)“中等嚴(yán)格的條件”指能形成具有比“高度嚴(yán)格的條件”下發(fā)生的堿基對(duì)錯(cuò)配更大的程度的DNA雙鏈體的條件。一般的“中等嚴(yán)格的條件”的實(shí)例是0.015M氯化鈉，0.0015M檸檬酸鈉，在50-65℃，或0.015M氯化鈉，0.0015M檸檬酸鈉，和20％甲酰胺，在37-50℃。作為實(shí)例，在0.015M鈉離子中、50℃的“中等嚴(yán)格的條件”允許約21％錯(cuò)配。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠明白，“高度嚴(yán)格的條件”和“中等嚴(yán)格的條件”之間沒(méi)有絕對(duì)的區(qū)別。例如，在0.015M鈉離子(無(wú)甲酰胺)時(shí)，較好地配對(duì)的長(zhǎng)DNA的解鏈溫度是約71℃。在65℃(在相同的離子強(qiáng)度)洗滌時(shí)，會(huì)允許約6％錯(cuò)配。為了捕獲相關(guān)性更差的序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以簡(jiǎn)單地降低溫度或升高離子強(qiáng)度。
通過(guò)下式可以較好地估計(jì)最高達(dá)約20個(gè)核苷酸的寡核苷酸探針在1M NaCl中的解鏈溫度Tm＝(2℃/A-T堿基對(duì))+(4℃/G-C堿基對(duì))。
應(yīng)當(dāng)注意6X鹽檸檬酸鈉(SSC)中的鈉離子濃度是1M。見(jiàn)Suggs等，Developmental Biology Using Purified Genes 683(Brown和Fox，編，1981)。
從具有PCR引物和雜交探針(其含有例如SEQ ID NO.1，3，41，43，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，等所示的核酸序列的一部分)的cDNA文庫(kù)中，容易地分離出了能編碼DNA聚合酶蛋白的自然產(chǎn)生的核酸。在基本上含有1％牛血清清蛋白(BSA)、500mM磷酸鈉(NaPO4)、1mM EDTA和7％SDS、在42℃的雜交緩沖液和基本上含有2xSSC(600mM NaCl；60mM檸檬酸鈉)和0.1％SDS、在50℃的洗滌緩沖液定義的低嚴(yán)格條件下；更優(yōu)選地在基本上含有1％牛血清清蛋白(BSA)、500mM磷酸鈉(NaPO4)、15％甲酰胺、1mM EDTA和7％SDS、在50℃的雜交緩沖液和基本上含有1xSSC(300mM NaCl；30mM檸檬酸鈉)和1％SDS、在50℃的洗滌緩沖液定義的低嚴(yán)格條件下；最優(yōu)選地在基本上含有1％牛血清清蛋白(BSA)、200mM磷酸鈉(NaPO4)、15％甲酰胺、1mM EDTA和7％SDS、在50℃的雜交緩沖液和基本上含有0.5xSSC(150mM NaCl；15mM檸檬酸鈉)和0.1％SDS、在65℃的洗滌緩沖液定義的低嚴(yán)格條件下，優(yōu)選的能編碼DNA聚合酶的核酸或其變體或片段等可與如SEQ ID NO.1，3，41，43，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，等所述序列中的全部或部分雜交。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“探針”指在生物實(shí)驗(yàn)中用于搜索的物質(zhì)，例如體外和/或體內(nèi)篩選等，包括但不限于，例如，具有特定的堿基序列的核酸分子或含有特定的氨基酸序列的肽。
作為普通探針的核酸分子的實(shí)例包括具有至少8個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度的核酸序列的、且與目標(biāo)基因的核酸序列同源或互補(bǔ)的核酸分子。這樣的核酸序列可以優(yōu)選地是具有至少9個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度、更優(yōu)選地至少10個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度、且更優(yōu)選地至少11個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度、至少12個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度、至少13個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度、至少14個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度、至少15個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度、至少20個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度、至少25個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度、至少30個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度、至少40個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度或至少50個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度的核酸序列。用作探針的核酸序列包括與上述序列具有至少70％、更優(yōu)選地至少80％、且更優(yōu)選地至少90％或至少95％同源性的核酸序列。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“搜索”是指，使用特定的核酸序列來(lái)電子地或生物地，或使用其它的方法發(fā)現(xiàn)具有特定的功能和/或性質(zhì)的其它核酸堿基序列。電子搜索的實(shí)例包括但不限于BLAST(Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990))，F(xiàn)ASTA(Pearson & Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 852444-2448(1988))，Smith和Waterman方法(Smith和Waterman，J.Mol.Biol.147195-197(1981))，和Needleman和Wunsch方法(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443-453(1970))，等。生物搜索的實(shí)例包括但不限于其中使基因組DNA附著到尼龍膜等上的微陣列，或其中在嚴(yán)格雜交、PCR和原位雜交中使基因組DNA附著到玻璃板上的微陣列(微測(cè)定)，等。這里意味著，在本發(fā)明中使用的DNA聚合酶等包括通過(guò)這樣的電子的或生物的搜索鑒定出的對(duì)應(yīng)基因。
如本文所使用的，通過(guò)在對(duì)比窗口中對(duì)比2個(gè)最佳比對(duì)的序列，可以確定“(氨基酸，核苷酸，等)序列同一性、同源性或相似性的百分比”，其中，在與用于2個(gè)序列的最佳比對(duì)的參考序列(其不包含添加或缺失(如果其它序列包含添加，則可能產(chǎn)生缺口))相比時(shí)，對(duì)比窗口中的部分多核苷酸或多肽序列可以包含添加或缺失(即缺口)。通過(guò)測(cè)定2個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目，以得到匹配位置的數(shù)目，用匹配位置的數(shù)目除以參考序列中的位置的總數(shù)(即窗口大小)，將結(jié)果乘以100，得到序列同一性的百分比，可以計(jì)算出百分比。當(dāng)在搜索中使用時(shí)，通過(guò)選自本領(lǐng)域眾所周知的各種序列對(duì)比算法和程序的合適技術(shù)，可以評(píng)價(jià)同源性。這樣的算法和程序的實(shí)例包括但不限于TBLASTN，BLASTP，F(xiàn)ASTA，TFASTA和CLUSTALW(Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(8)2444-2448，Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215(3)403-410，Thompson等，1994，Nucleic acid Res.22(2)4673-4680，Higgins等，1996，Methods Enzymol.266383-402，Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215(3)403-410，Altschul等，1993，Nature Genetics 3266-272)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域眾所周知的基礎(chǔ)的局部比對(duì)搜索工具(BasicLocal Alignment Search Tool)(BLAST)，評(píng)價(jià)了蛋白或核酸序列的同源性(例如，見(jiàn)Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872267-2268，Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215403-410，Altschul等，1993，Nature Genetics 3266-272，Altschul等，1997，Nuc.Acids Res.253389-3402)。具體地，5個(gè)特化的-BLAST程序可以用于執(zhí)行下述的任務(wù)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)比或搜索(1)使用BLASTP和BLAST3，對(duì)比氨基酸查詢序列和蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)；(2)使用BLASTN，對(duì)比核苷酸查詢序列和核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)；(3)使用BLASTX，對(duì)比概念地翻譯的產(chǎn)物(其中核苷酸查詢序列(兩條鏈)被轉(zhuǎn)變(convert)了超過(guò)6個(gè)閱讀框)和蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)；(4)使用TBLASTN，對(duì)比所有被轉(zhuǎn)變了超過(guò)6個(gè)閱讀框的蛋白查詢序列(兩條鏈)和核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)；和(5)使用TBLASTX，對(duì)比被轉(zhuǎn)變了超過(guò)6個(gè)閱讀框的核苷酸查詢序列和核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)。
通過(guò)指定氨基酸查詢序列或核酸查詢序列和優(yōu)選地從蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)或核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)得到的實(shí)驗(yàn)序列之間的稱作“高分片段對(duì)”的類似的片段，BLAST程序能鑒定出同源序列。使用本領(lǐng)域眾所周知的評(píng)分矩陣，可以優(yōu)選地鑒定(比對(duì))大量的高分片段對(duì)。優(yōu)選地，評(píng)分矩陣是BLOSUM62矩陣(Gonnet等，1992，Science 2561443-1445，Henikoff和Henikoff，1993，Proteins 1749-61)。可以使用PAM或PAM250矩陣，盡管它們不是象BLOSUM62矩陣一樣優(yōu)選的(例如，見(jiàn)，Schwartz和Dayhoff，編，1978，Matrices for DetectingDistance RelationshipsAtlas of Protein Sequence andStructure，WashingtonNational Biomedical ResearchFoundation)。BLAST程序能評(píng)價(jià)所有鑒定出的高分片段對(duì)的統(tǒng)計(jì)顯著性，并優(yōu)選地選擇能滿足使用者獨(dú)立地定義的顯著性閾值水平的片段，例如，使用者設(shè)定的同源性。優(yōu)選地，使用Karlin公式評(píng)價(jià)高分片段對(duì)的統(tǒng)計(jì)顯著性(見(jiàn)Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872267-2268)。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“引物”指能在大分子合成酶促反應(yīng)中起始要合成的大分子化合物的反應(yīng)所需的物質(zhì)。在合成核酸分子的反應(yīng)中，可以使用與要合成的大分子化合物的一部分互補(bǔ)的核酸分子(例如，DNA，RNA，等)。
經(jīng)常用作引物的核酸分子包括具有至少8個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度的核酸序列、且與目標(biāo)基因的核酸序列互補(bǔ)的核酸分子。這樣的核酸序列優(yōu)選地具有至少9個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度，更優(yōu)選地至少10個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度，甚至更優(yōu)選地至少11個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度，至少12個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度，至少13個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度，至少14個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度，至少15個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度，至少16個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度，至少17個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度，至少18個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度，至少19個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度，至少20個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度，至少25個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度，至少30個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度，至少40個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度，和至少50個(gè)鄰接的核苷酸的長(zhǎng)度。用作引物的核酸序列包括與上述序列具有至少70％、更優(yōu)選地至少80％、甚至更優(yōu)選地至少90％和最優(yōu)選地至少95％同源性的核酸序列。作為引物的合適序列可以根據(jù)要合成(擴(kuò)增)的序列的性質(zhì)而變化。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)出合適的引物。這樣的引物設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域眾所周知的，且可以手工地或使用計(jì)算機(jī)程序(例如，LASERGENE，Primer Select，DNAStar)進(jìn)行。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“表位”指其詳細(xì)結(jié)構(gòu)尚未被必要地定義的抗原決定簇，只要它能引起抗原-抗體反應(yīng)即可。因此，術(shù)語(yǔ)“表位”包括一組氨基酸殘基，其能參與特定免疫球蛋白的識(shí)別，或者在T細(xì)胞的情形中，這些殘基是T細(xì)胞受體蛋白和/或主要組織相容性復(fù)合體(MHC)受體的識(shí)別所必需的。該術(shù)語(yǔ)也與“抗原決定簇”或“抗原決定簇位點(diǎn)”可互換地使用。在免疫學(xué)領(lǐng)域，體內(nèi)地或體外地，表位是分子的特征(例如，初級(jí)、二級(jí)和三級(jí)肽結(jié)構(gòu)和電荷)，其形成能被免疫球蛋白、T細(xì)胞受體或HLA分子識(shí)別的位點(diǎn)。包括肽的表位包含3個(gè)或更多個(gè)氨基酸，其空間構(gòu)象是該表位所獨(dú)有的。通常，表位由至少5個(gè)這樣的氨基酸組成，更常見(jiàn)地，由至少6，7，8，9或10個(gè)這樣的氨基酸組成。表位的長(zhǎng)度越大，表位與原始肽的相似性越大，即，更長(zhǎng)的表位一般是優(yōu)選的。當(dāng)考慮構(gòu)象時(shí)，情況未必是這樣的。確定氨基酸的空間構(gòu)象的方法是本領(lǐng)域已知的，且包括，例如，X-射線結(jié)晶學(xué)和二維核磁共振光譜學(xué)。而且，使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，可以容易地鑒定出特定蛋白中的表位。還參見(jiàn)，Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)813998(general method forrapidly synthesizing peptides to determine the location ofimmunogenic epitopes in a given antigen)；美國(guó)專利號(hào)4,708,871(procedures for identifying and chemically synthesizingepitopes of antigens)；和Geysen等，Molecular Immunology(1986)23709(technique for identifying peptides with high affinityfor a given antibody)。在簡(jiǎn)單的免疫測(cè)定中，可以鑒別出能識(shí)別相同表位的抗體。因而，測(cè)定包含肽的表位的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。如果提供了表位的初級(jí)核酸或氨基酸序列，則使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的常見(jiàn)技術(shù)，可以測(cè)定出這樣的表位。
因此，包含肽的表位需要具有至少3個(gè)氨基酸、優(yōu)選地至少4個(gè)氨基酸、更優(yōu)選地至少5個(gè)氨基酸、至少6個(gè)氨基酸、至少7個(gè)氨基酸、至少8個(gè)氨基酸、至少9個(gè)氨基酸、至少10個(gè)氨基酸、至少15個(gè)氨基酸、至少20個(gè)氨基酸和至少25個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度的序列。表位可以是線性的或構(gòu)象的。
(基因的修飾)在特定的蛋白分子(例如，DNA聚合酶，等)中，包含在序列中的特定的氨基酸可以被蛋白結(jié)構(gòu)中的另一個(gè)氨基酸取代，例如陽(yáng)離子區(qū)或底物分子結(jié)合位點(diǎn)，而不顯著減少或損失相互作用的結(jié)合能力。蛋白的相互作用能力或其它性質(zhì)決定了蛋白的特定的生物功能。因此，可以在氨基酸序列中或在DNA編碼序列水平進(jìn)行特定氨基酸取代，以在取代后生成能維持原始性質(zhì)的蛋白。因此，可以對(duì)如本文所公開(kāi)的肽和能編碼這種肽的DNA進(jìn)行各種修飾，而不顯著損失生物有效性。或者，可以修飾能編碼DNA聚合酶的核酸序列，從而修飾DNA聚合酶的校對(duì)功能。
當(dāng)設(shè)計(jì)上述的修飾時(shí)，可以考慮氨基酸的疏水性指數(shù)。疏水氨基酸指數(shù)在為蛋白提供相互作用的生物功能中起重要作用，這是本領(lǐng)域普遍公認(rèn)的(Kyte.J和Doolittle，R.F.，J.Mol.Biol.157(1)105-132，1982)。氨基酸的疏水性質(zhì)有助于蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而調(diào)節(jié)蛋白和其它分子(例如，酶，底物，受體，DNA，抗體，抗原，等)之間的相互作用?；谄涫杷院碗姾尚再|(zhì)，為每種氨基酸指定如下的疏水性指數(shù)異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
眾所周知，如果特定的氨基酸被具有相似的疏水性指數(shù)的另一種氨基酸取代，得到的蛋白仍然可能具有與原始蛋白相似的生物功能(例如，具有等價(jià)酶活性的蛋白)。對(duì)于這樣的氨基酸取代，疏水性指數(shù)優(yōu)選地在±2內(nèi)，更優(yōu)選地在±1內(nèi)，且甚至更優(yōu)選地在±0.5內(nèi)。本領(lǐng)域認(rèn)為，這樣的基于疏水性的氨基酸取代是有效的。
在修飾本發(fā)明的基因時(shí)，可以考慮親水性指數(shù)。如美國(guó)專利號(hào)4,554,101所述，為氨基酸殘基指定下面的親水性指數(shù)精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。應(yīng)當(dāng)明白，氨基酸可以被具有相似親水性指數(shù)的另一種氨基酸取代，且仍然可以提供生物等價(jià)物。對(duì)于這樣的氨基酸取代，親水性指數(shù)優(yōu)選地在±2內(nèi)，更優(yōu)選地±1，且甚至更優(yōu)選地±0.5。
如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“保守取代”指氨基酸取代，其中被取代的氨基酸和取代氨基酸具有相似的親水性指數(shù)或/和疏水性指數(shù)。例如，在親水性或疏水性指數(shù)在±2內(nèi)、優(yōu)選地在±1內(nèi)，且更優(yōu)選地在±0.5內(nèi)的氨基酸之間進(jìn)行保守取代。保守取代的實(shí)例包括但不限于在每種下述的殘基對(duì)內(nèi)的取代精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“變體”指部分地與原始物質(zhì)不同的物質(zhì)，例如多肽、多核苷酸等。這樣的變體的實(shí)例包括取代變體、添加變體、缺失變體、截短的變體、等位基因的變體，等。這樣的變體的實(shí)例包括但不限于相對(duì)于參考核酸分子或多肽具有一個(gè)或幾個(gè)取代、添加和/或缺失的核苷酸或多肽，或具有至少一個(gè)取代、添加和/或缺失的核苷酸或多肽。變體可以具有或不具有參考分子(例如，野生型分子，等)的生物活性。根據(jù)目的，可以給變體賦予其它的生物活性，或者缺失部分生物活性。使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，可以進(jìn)行這樣的設(shè)計(jì)?；蛘撸ㄟ^(guò)從生物中分離，以生產(chǎn)變體，可以得到已知其性質(zhì)的變體，且可以擴(kuò)增該變體的核酸序列，以得到序列信息。因此，對(duì)于宿主細(xì)胞，將源自異源物種的對(duì)應(yīng)基因或其產(chǎn)物視作“變體”。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“等位基因”指位于與對(duì)應(yīng)的基因等同的基因座處的遺傳變體，這2個(gè)基因在這里彼此區(qū)別開(kāi)。因此，本文所使用的術(shù)語(yǔ)“等位基因變體”指與特定的基因具有等位基因關(guān)系的變體。這樣的等位基因變體通常具有與對(duì)應(yīng)的等位基因相同或非常相似的序列，或者通常具有幾乎相同的生物活性，盡管它很少具有不同的生物活性。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“物種同系物”或“同系物”指與特定物種的特定基因具有氨基酸或核苷酸同源性的物質(zhì)(優(yōu)選地至少60％同源性，更優(yōu)選地至少80％、至少85％、至少90％和至少95％同源性)。從本說(shuō)明書(shū)的描述中，可以清楚地明白得到這樣的物種同系物的方法。術(shù)語(yǔ)“直向同源體”(也稱作直向同源基因)指源自共同祖先的不同物種中的基因(由于物種形成)。例如，在具有多基因結(jié)構(gòu)的血紅蛋白基因家族的情況下，人和小鼠α-血紅蛋白基因是直向同源體，而人α-血紅蛋白基因和人β-血紅蛋白基因是共生同源體(paralog)(由基因復(fù)制生成的基因)。直向同源體可以用于估計(jì)分子進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)。通常，在不同物種中的直向同源體可以具有與原始物種相似的功能。因此，本發(fā)明的直向同源體可以用于本發(fā)明。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“保守的(或保守地修飾的)變體”應(yīng)用于氨基酸和核酸序列。關(guān)于特定的核酸序列，保守地修飾的變體指那些能編碼相同的或基本上相同的氨基酸序列的核酸。因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性，大量的功能上相同的核酸可以編碼任意的特定蛋白。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都能氨基酸丙氨酸。因而，在用密碼子限定丙氨酸的每個(gè)位點(diǎn)，可以將密碼子改成所述的對(duì)應(yīng)密碼予中的任一個(gè)，而不改變編碼的多肽。這樣的核酸變異是“沉默變異”，其代表著保守地修飾的變異的一個(gè)種類。能編碼多肽的每個(gè)核酸序列在這里也描述了該核酸的每個(gè)可能的沉默變異。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠認(rèn)識(shí)到，可以修飾核酸中的每個(gè)密碼子(AUG除外，它通常是甲硫氨酸的唯一密碼子；TGG除外，它通常是色氨酸的唯一密碼子)，以生成功能上相同的分子。因此，在每個(gè)所述的序列中，都暗示著能編碼多肽的核酸的每個(gè)沉默變異。優(yōu)選地，可以進(jìn)行這樣的修飾，同時(shí)避免取代半胱氨酸，后者是能極大地影響多肽的高級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸。這樣修飾堿基序列的方法的實(shí)例包括使用限制酶切割等；通過(guò)使用DNA聚合酶、克列諾(Klenow)片段、DNA連接酶等處理進(jìn)行連接等；和使用合成的寡核苷酸進(jìn)行位點(diǎn)特異性的堿基取代的方法(特異性的定位誘變；Mark Zoller和Michael Smith，Methods in Enzymology，100，468-500(1983))。使用分子生物學(xué)領(lǐng)域常用的方法，可以進(jìn)行修飾。
為了制備功能上等同的多肽，除了氨基酸取代以外，可以進(jìn)行氨基酸添加、缺失和/或修飾。氨基酸取代指將原始肽鏈的至少一個(gè)氨基酸替換為不同的氨基酸，例如用不同的氨基酸替換1-10個(gè)氨基酸，優(yōu)選地1-5個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地1-3個(gè)氨基酸。氨基酸添加指向原始肽鏈添加至少一個(gè)氨基酸，例如向原始肽鏈添加1-10個(gè)氨基酸，優(yōu)選地1-5個(gè)氨基酸，和更優(yōu)選地1-3個(gè)氨基酸。氨基酸缺失指缺失至少一個(gè)氨基酸，例如缺失1-10個(gè)氨基酸，優(yōu)選地1-5個(gè)氨基酸，和更優(yōu)選地1-3個(gè)氨基酸。氨基酸修飾包括但不限于酰胺化，羧基化，硫酸化，鹵化，烷化，糖基化，磷酸化，羥基化，酰化(例如，乙?；?，等。要取代的或添加的氨基酸可以是自然產(chǎn)生的或非自然產(chǎn)生的氨基酸或氨基酸類似物。自然產(chǎn)生的氨基酸是優(yōu)選的。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“肽類似物”或“肽衍生物”指與肽不同、但是具有至少一種與該肽等同的化學(xué)或生物功能的化合物。因此，肽類似物包括相對(duì)于原始肽具有至少一種氨基酸類似物或氨基酸衍生物添加或取代的那些。肽類似物具有上述的添加或取代，從而使其功能基本上與原始肽的功能相同(例如，相似的pKa值，相似的官能團(tuán)，相似的與其它分子的結(jié)合方式，相似的水溶性，等)。使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，可以制備出這樣的肽類似物。因此，肽類似物可以是含有氨基酸類似物的聚合物。
類似地，如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸類似物”或“核酸類似物”指與多核苷酸或核酸不同、但是具有至少一種與多核苷酸或核酸等同的化學(xué)或生物功能的化合物。因此，多核苷酸或核酸類似物包括相對(duì)于原始多核苷酸或核酸具有至少一種核苷酸類似物或核苷酸衍生物添加或取代的那些。
如本文所使用的核酸分子包括這樣的核酸分子，其中缺失了該核酸的一部分序列，或者被其它堿基取代，或者插入了其它的核酸序列，只要該核酸表達(dá)的多肽基本上具有與如上所述的自然產(chǎn)生的多肽相同的活性即可?；蛘撸梢詫⑵渌怂徇B接到該核酸的5′末端和/或3′末端。核酸分子可以包括可在嚴(yán)格的條件下與能編碼多肽的基因雜交、且能編碼具有基本上相同功能的多肽的那些。這樣的基因是本領(lǐng)域已知的，且可以用于本發(fā)明。
通過(guò)眾所周知的PCR方法(即，化學(xué)合成)，可以得到上述的核酸。該方法可以與例如定位誘變、雜交等組合。
如本文所使用的，關(guān)于多肽或多核苷酸的術(shù)語(yǔ)“取代”、“添加”或“缺失”指氨基酸或其取代基或核苷酸或其取代基分別相對(duì)于原始多肽或多核苷酸的取代、添加或缺失。這可以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，包括定位誘變技術(shù)等。多肽或多核苷酸可以具有任意數(shù)目(＞0)的取代、添加或缺失。該數(shù)目可以與具有這樣數(shù)目的取代、添加或缺失的變體一樣大，所述變體維持目的功能(例如激素和細(xì)胞因子的信息傳遞功能，等)。例如，這樣的數(shù)目可以是1個(gè)或幾個(gè)，優(yōu)選地在全長(zhǎng)的20％或10％內(nèi)，或不超過(guò)100，不超過(guò)50，不超過(guò)25，等。
(遺傳工程)通過(guò)遺傳工程技術(shù)，可以生產(chǎn)出如本文所使用的蛋白(例如DNA聚合酶和其片段和變體等)，并導(dǎo)入細(xì)胞中。
當(dāng)在本文中提及基因時(shí)，術(shù)語(yǔ)“載體”或“重組載體”指能將目標(biāo)多核苷酸序列轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中的載體。這樣的載體能自我復(fù)制或整合進(jìn)宿主細(xì)胞(例如，原核細(xì)胞，酵母，動(dòng)物細(xì)胞，植物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞，個(gè)體動(dòng)物，和個(gè)體植物，等)的染色體中，且含有位于適合轉(zhuǎn)錄本發(fā)明的多核苷酸的位點(diǎn)處的啟動(dòng)子。將適用于克隆的載體稱作“克隆載體”。這樣的克隆載體通常含有包含許多限制位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)。限制位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)是本領(lǐng)域眾所周知的，且可以根據(jù)目的適當(dāng)?shù)鼗蛉芜x地使用。該技術(shù)描述在如這里所述的文獻(xiàn)中(例如，Sambrook等(同上))。這樣的載體包括例如質(zhì)粒。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“質(zhì)粒”指存在于染色體外、且能自主復(fù)制的遺傳因子。當(dāng)特別提出時(shí)，將包含在細(xì)胞核的線粒體、葉綠體等中的DNA一般地稱作細(xì)胞器DNA，且不同于質(zhì)粒，即不包括在質(zhì)粒中。
質(zhì)粒的實(shí)例包括但不限于大腸桿菌pET(TAKARA)，pUC(TOYOBO)，pBR322(TOYOBO)，pBluescriptII(TOYOBO)；酵母pAUR(TAKARA)，pESP(TOYOBO)，pESC(TOYOBO)；枯草芽孢桿菌pHY300PLK(TAKARA)；真菌病pPRTI(TAKARA)，pAUR316(TAKARA)；動(dòng)物細(xì)胞pCMV(TOYOBO)，pBK-CMV(TOYOBO)；等。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”指包含結(jié)構(gòu)基因和用于調(diào)節(jié)其表達(dá)的啟動(dòng)予以及各種調(diào)節(jié)元件的核酸序列，所述調(diào)節(jié)元件的狀態(tài)允許它們?cè)谒拗骷?xì)胞中運(yùn)行。調(diào)節(jié)元件可以優(yōu)選地包括終止子，選擇性標(biāo)記例如抗藥性基因，和沉默予和/或增強(qiáng)子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知，生物(例如，植物)表達(dá)載體的類型和調(diào)節(jié)元件的類型可以依賴于宿主細(xì)胞而異。通過(guò)將特定的啟動(dòng)子導(dǎo)入細(xì)胞，可以在特定條件下調(diào)節(jié)細(xì)胞的傾向于錯(cuò)誤的頻率。
如本文所使用的，用于原核細(xì)胞的“重組載體”包括，例如，pcDNA3(+)，pBluescript-SK(+/-)，pGEM-T，pEF-BOS，pEGFP，pHAT，pUC18，pFT-DESTTM，42GATEWAY(Invitrogen)，等。
如本文所使用的，用于動(dòng)物細(xì)胞的“重組載體”包括，例如，pcDNAI/Amp，pcDNA I，pCDM8(都商業(yè)上購(gòu)自Funakoshi，Tokyo，日本)，pAGE107[日本
發(fā)明者古澤滿 申請(qǐng)人:古澤滿, 株式會(huì)社尼奧·摩根研究所