專利名稱：葡萄糖脫氫酶的生產(chǎn)過程的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)可大量表達(dá)洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burknorderia cepacia)葡萄糖脫氫酶復(fù)合物的埃希氏菌(Escherichia)的方法及一種生產(chǎn)該酶復(fù)合物的方法。葡萄糖脫氫酶應(yīng)用在使用酶電極之類的葡萄糖感應(yīng)器中。
背景技術(shù)：
已知由屬于伯克霍爾德氏菌屬(Burkhorderia)的微生物洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1菌株產(chǎn)生的一種酶為葡萄糖脫氫酶(GDH)。該酶是一種酶復(fù)合物，由作為催化亞基的α-亞基，作為細(xì)胞色素c的β-亞基以及γ-亞基組成，由于具有高熱穩(wěn)定性的超級特性，因此由該酶催化的反應(yīng)幾乎不被溶解氧等物質(zhì)影響。已分離到編碼該酶α-亞基和γ-亞基的DNA，而且也分離到編碼β-亞基的部分DNA。而且該酶已在大腸桿菌中得到成功表達(dá)(參考國際專利公布WO02/36779)。然而，所表達(dá)的GDH并不含β-亞基。
同時，通過大腸桿菌的細(xì)胞色素成熟系統(tǒng)了解到ccm系統(tǒng)(細(xì)胞色素c成熟系統(tǒng))。而且已知ccm系統(tǒng)在大腸桿菌中在厭氧及特定的條件下表達(dá)(J.Bacteriol.177.4321-4326(1995))。編碼ccm系統(tǒng)操縱子(ccmABCDEFGH)的DNA序列已得到闡明(Nature，409(6819)，529-533(2001)；GeneBank登錄號U0008(1993))。另外，已報道通過使用可表達(dá)ccm系統(tǒng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在厭氧條件下可表達(dá)并生產(chǎn)來源于不同于大腸桿菌的生物體中共價鍵類型的多亞鐵血紅素細(xì)胞色素(Biochem.Biophys.Res.Commun.，251，744-7(1998)；Bioehem.Biophys.Acta，1411，114-20(1999)；Biochem.Biophys.Acta，1481，18-24(2000)；Protein Sci.9，2074-84(2000))。
另外，已知含ccm操縱子的質(zhì)粒pEC86是通過將操縱子插入到pACYC184上而獲得的(Biochem.Biophys.Res.Commun.，251，744-7(1998))。
發(fā)明描述本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)上述葡萄糖脫氫酶的α-亞基和β-亞基同時在大腸桿菌中表達(dá)時比單獨(dú)表達(dá)α-亞基的表達(dá)效率更低。因此本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供一種在埃希氏菌中大量表達(dá)含α-亞基和β-亞基的酶復(fù)合物的方法。
為了完成上述目標(biāo)，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了刻苦的研究。結(jié)果他們發(fā)現(xiàn)通過增強(qiáng)埃希氏菌中ccm系統(tǒng)的表達(dá)，可提高編碼洋蔥伯克霍爾德氏菌葡萄糖脫氫酶復(fù)合物的DNA的表達(dá)，從而完成了本發(fā)明。
因此本發(fā)明提供下列各項。
(1)一種埃希氏菌，該菌導(dǎo)入了以可表達(dá)形式存在的編碼洋蔥伯克霍爾德氏菌葡萄糖脫氫酶α-亞基和β-亞基的DNA，而且其ccm系統(tǒng)的表達(dá)是增強(qiáng)的。
(2)根據(jù)(1)中的埃希氏菌，其中編碼α-亞基的DNA位于編碼β-亞基的DNA的上游，而且它們的表達(dá)由同一個啟動子調(diào)控。
(3)根據(jù)(1)中的埃希氏菌，該菌進(jìn)一步引入以可表達(dá)形式存在的編碼葡萄糖脫氫酶γ-亞基的DNA。
(4)根據(jù)(3)中的埃希氏菌，其中編碼γ-亞基的DNA位于編碼α-亞基的DNA的上游。
(5)根據(jù)(1)到(4)任何一項中的埃希氏菌，其中埃希氏菌是大腸桿菌。
(6)一種生產(chǎn)葡萄糖脫氫酶復(fù)合物的方法，包括培養(yǎng)(1)到(5)任何一項中的埃希氏菌，使編碼α-亞基和β-亞基的DNA得到表達(dá)從而生產(chǎn)葡萄糖脫氫酶復(fù)合物，并收集該復(fù)合物。
附圖的簡要描述

圖1所示的是從洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1菌株和大腸桿菌JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccm中純化的GDH復(fù)合物的SDS-PAGE結(jié)果(照片)。
泳道1分子量標(biāo)準(zhǔn)泳道2從KS1菌株純化的GDH泳道3從JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccm純化的GDH實現(xiàn)本發(fā)明的最佳實施方式以下對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
本發(fā)明的埃希氏菌是一種引入以可表達(dá)形式存在的編碼洋蔥伯克霍爾德氏菌葡萄糖脫氫酶(以下也簡稱為“GDH”)α-亞基和β-亞基(以下也分別稱為“α-亞基基因”和“β-亞基基因”)DNA的埃希氏菌，而且其中ccm系統(tǒng)得到增強(qiáng)。
上述埃希氏菌的實施例包括大腸桿菌。
而且，上述洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkhorderia cepacia)的實施例包括KS1菌株，JCM2800菌株，JCM2801菌株，J2315菌株等。KS1菌株保藏在國際專利生物保藏機(jī)構(gòu)，國立產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，保藏號是FERM BP-7306。JCM2800菌株和JCM2801菌株從日本微生物保藏中心(JCM)，理化學(xué)研究所生物資源中心獲得。另外，J2315菌株保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，ATCC號為BAA-245，以及比利時微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCCMTM)，保藏號是LNG 16656，并可從這些保藏中心獲得。
包含KS1菌株GDHα-亞基和部分β-亞基的染色體DNA片段的核酸序列如SEQ ID NO1(參考WO02/36779)所示。在該核酸序列中存在3個開放閱讀框(ORFs)。從5’端開始的第二和第三個ORFs分別編碼α-亞基(SEQ ID NO3)和β-亞基(SEQ ID NO4)。另外，估計第一個ORF編碼γ-亞基(SEQ ID NO2)。包含全長β-亞基基因的核酸序列如SEQ ID NO9所示。另外，β-亞基的氨基酸序列如SEQ ID NO10所示。估計SEQ ID NO10中1到22位的氨基酸是一個信號肽。雖然在SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示的第一個氨基酸殘基是Val，但它更可能是Met，在翻譯后被除去了。
本發(fā)明所用的α-亞基基因并不限于編碼氨基酸序列為SEQ IDNO3的基因，并可以是編碼具有在SEQ ID NO3所示的氨基酸序列基礎(chǔ)上通過包括替代，缺失，插入或添加一個或幾個氨基酸殘基所得的氨基酸序列的蛋白的基因，只要編碼的多肽具有GDH活性即可。雖然由核酸序列SEQ ID NO1編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示，但N-末端的甲硫氨酸殘基可在翻譯后被除去。上面表述的“一個或幾個”優(yōu)選地是1到10，更優(yōu)選地是1到5，特別優(yōu)選地是1到3。
另外，β-亞基基因可以編碼具有在SEQ ID NO10所示的氨基酸序列的第23到425位氨基酸序列的基礎(chǔ)上包括替代，缺失，插入或添加一個或幾個氨基酸殘基所得的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，只要其具有GDH β-亞基的功能即可。上面表述的“一個或幾個”優(yōu)選地是1到20，更優(yōu)選地是1到10，特別優(yōu)選地是1到5。表述“具有GDH β-亞基的功能”是指具有細(xì)胞色素c的功能，而且不破壞GDH的酶活性。
α-亞基基因的特定實施例包括由SEQ ID NO1中第764到2380位核苷酸的核酸序列所組成的DNA。另外，α-亞基基因可以是能夠與由SEQ ID NO1中第764到2380位核苷酸的核酸序列所組成的DNA、或從該序列制備的探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、并編碼具有GDH活性的蛋白的DNA。
進(jìn)一步，β-亞基基因的特定實施例包括由SEQ ID NO9中第187到1398位核苷酸的核酸序列所組成的DNA。另外，β-亞基基因可以是能夠與由SEQ ID NO9中第187到1398位核苷酸的核酸序列所組成的DNA、或從該序列制備的探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行雜交、并編碼具有β-亞基功能的蛋白的DNA。
上述嚴(yán)謹(jǐn)條件包括在該條件下，同源性為70％或更高，優(yōu)選地為80％或更高，更優(yōu)選地為90％或更高的DNA才能互相雜交。特別地，在1×SSC，0.1％SDS，60℃的條件下進(jìn)行雜交。
α-亞基基因和β-亞基基因可通過，例如，使用洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1菌株染色體DNA為模板的PCR來獲得。PCR的引物可根據(jù)上述核酸序列通過化學(xué)合成來制備。另外，也可以用基于上述序列而制備的寡核苷酸為探針通過雜交從洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1菌株的染色體DNA中獲得這些基因。另外，它們的變異體也可以通過同樣的方式從其它洋蔥伯克霍爾德氏菌菌株中獲得。
在本發(fā)明中，α-亞基基因位于β-亞基基因的上游并且優(yōu)選它們的表達(dá)由同一個啟動子進(jìn)行調(diào)控。另外，優(yōu)選編碼γ-亞基的DNA(γ-亞基基因)與α-亞基基因和β-亞基基因一起以可表達(dá)的形式引入到埃希氏菌中。在這種情況下，優(yōu)選γ-亞基基因位于α-亞基基因的上游并且這些亞基基因的表達(dá)均由同一個啟動子進(jìn)行調(diào)控。
以這種順序排列的編碼γ-亞基、α-亞基和β-亞基的多順反子DNA片段可通過，例如，以洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1菌株的染色體DNA為模板，核酸序列為SEQ ID NO12和13的寡核苷酸為引物的PCR來獲得(參見下述實施例)。
為了將含有α-亞基基因和β-亞基基因(如果需要，還有γ-亞基基因)的DNA(以下用“GDHαβ基因”指代)以可表達(dá)形式引入到埃希氏菌中，可以將GDHαβ基因插入到可在埃希氏菌中起作用的載體中，然后用獲得的重組載體轉(zhuǎn)化埃希氏菌。在這種情況下，在GDHαβ基因上游提供一個可在埃希氏菌中起作用的啟動子，則GDHαβ基因可在該啟動子調(diào)控下進(jìn)行表達(dá)。
在埃希氏菌中起作用的載體的實施例包括pBR322，pUC18，pUB118，pUC19，pUB119，pACYC184，pBBR122等。另外，上述啟動子的實施例包括lac，trp，tac，trc，PL，tet，PhoA等。另外，通過將GDHαβ基因插入到含啟動子的表達(dá)載體中的合適位置，可在同一步驟中進(jìn)行基因插入載體及啟動子的連接。這種表達(dá)載體的實施例包括pTrc99A，pBluescript，pKK223-3等。
另外，GDHαβ基因可以可表達(dá)形式整合到埃希氏菌的染色體DNA上。
為了將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到埃希氏菌中，可使用例如鈣處理，電穿孔或其它類似方法制備感受態(tài)細(xì)胞。
本發(fā)明中的埃希氏菌是引入上述GDHαβ基因的埃希氏菌，而且其中ccm系統(tǒng)的表達(dá)得到增強(qiáng)。
ccm系統(tǒng)由ccm操縱子(ccmABCDEFGH)編碼。ccm操縱子可通過，例如，使用大腸桿菌的染色體DNA為模板的PCR來獲得。PCR引物可根據(jù)報道的核酸序列(DDBJ/EMBL/GeneBank序列號AE005452)通過合成而制備。另外，可使用基于上述序列制備的寡核苷酸作為探針通過雜交從大腸桿菌的染色體DNA中獲得這些基因。另外，也可以通過相同方式從其它埃希氏菌中獲得這些基因的變異體。
ccm操縱子除了可以是具有上述報道核酸序列的DNA，還可以是能夠與含有這些序列的DNA、或者與由這些序列制備的探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行雜交、并編碼一組具有ccm系統(tǒng)功能的酶的DNA。
已知ccm系統(tǒng)在厭氧及特定條件下表達(dá)(非專利文獻(xiàn)1)。在本發(fā)明中，表述“ccm系統(tǒng)的表達(dá)是增強(qiáng)的”是指同野生的或未修飾的埃希氏菌相比表達(dá)增強(qiáng)了，或進(jìn)行的修飾可使該系統(tǒng)在非厭氧及特定條件下也進(jìn)行表達(dá)。非厭氧及特定條件的實施例包括需氧條件。
為了增強(qiáng)ccm系統(tǒng)的表達(dá)，將ccm操縱子基因連接到組成型表達(dá)的啟動子或可調(diào)控表達(dá)的啟動子上，并將獲得的重組基因引入到埃希氏菌中。優(yōu)選的啟動子和載體、及將ccm操縱子引入到埃希氏菌中的方法與操作GDHαβ基因的描述相似。
含有ccm操縱子的質(zhì)粒的實施例包括將操縱子插入到pACYC184中而獲得的pEC86。該操縱子在tet啟動子的調(diào)控下進(jìn)行組成型表達(dá)。另外，也可以制備插入了從埃希氏菌染色體DNA中通過PCR等方式克隆的ccm操縱子的質(zhì)粒，從而使其由合適的啟動子進(jìn)行調(diào)控。
另外，也可以通過用合適的啟動子替換埃希氏菌染色體DNA上的ccm操縱子中的啟動子來增強(qiáng)該操縱子的表達(dá)。
可通過培養(yǎng)本發(fā)明中的埃希氏菌，使其表達(dá)α-亞基基因和β-亞基基因，產(chǎn)生作為這些基因表達(dá)產(chǎn)物的GDH酶復(fù)合物，并收集這些復(fù)合物來有效生產(chǎn)GDH復(fù)合物。此處所用的術(shù)語“GDH復(fù)合物”優(yōu)選地是指由亞基的聯(lián)合而形成的多價蛋白，但是也包括自由形式的亞基混合物。
對于培養(yǎng)埃希氏菌的方法，培養(yǎng)條件可考慮宿主的營養(yǎng)和生理特性。在多數(shù)情況下，以液體培養(yǎng)的方式進(jìn)行培養(yǎng)。工業(yè)培養(yǎng)可以在通風(fēng)和攪拌的條件下方便地進(jìn)行。
作為培養(yǎng)基的養(yǎng)份，可廣泛使用那些培養(yǎng)埃希氏菌的物質(zhì)。作為碳源，可使用那些可吸收的碳化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、半乳糖、糖蜜、丙酮酸等。作為氮源，可使用氮化合物，例如蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、大豆堿提取物等。另外，如果需要，可以使用磷酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、鎂鹽、鈣、鉀、鐵、錳、鋅等，特定的氨基酸、特定的維生素等。
培養(yǎng)溫度可在埃希氏菌生長和產(chǎn)生GDH復(fù)合物的范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，優(yōu)選地為約20至42℃。雖然培養(yǎng)時間根據(jù)條件有輕微調(diào)整，但通過估計達(dá)到GDH復(fù)合物產(chǎn)量最大的時間可終止培養(yǎng)，培養(yǎng)時間通常是12至72小時。培養(yǎng)基的pH可在細(xì)菌細(xì)胞生長和產(chǎn)生GDH復(fù)合物的范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，優(yōu)選地范圍在pH約6.0到9.0。
可以收集和使用培養(yǎng)液作為GDH復(fù)合物。然而，當(dāng)GDH復(fù)合物存在于培養(yǎng)液中時，通常通過過濾、離心或類似的常規(guī)方式將埃希氏菌細(xì)胞分離后，用作含GDH復(fù)合物的溶液。而當(dāng)GDH復(fù)合物存在于細(xì)胞中時，則從獲得的培養(yǎng)物中通過過濾、離心或類似的方式收集細(xì)胞，然后通過物理方法或者通過例如使用溶菌酶或其它類似酶法破碎細(xì)胞，如果需要，可加入例如EDTA及表面活性劑這樣的鰲合劑溶解亞基，以水相溶液的形式分離并收集GDH復(fù)合物。
GDH復(fù)合物可從上述獲得的溶液中通過，例如，真空濃縮、膜濃縮、使用硫酸銨、硫酸鈉或其它類似物的鹽析，或通過親水性有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇或丙酮進(jìn)行分級沉淀而沉淀出來。另外，熱處理和等電點沉淀也是有效的純化方式。然后可通過使用吸附劑、凝膠過濾試劑或其它類似試劑的凝膠過濾、吸附層析、離子交換層析、親和層析等方式的適當(dāng)組合進(jìn)行純化，從而獲得純化的GDH復(fù)合物?？赏ㄟ^柱層析進(jìn)行分離和純化而得到純化的酶制品。
GDH的α-亞基可單獨(dú)表現(xiàn)出酶活性。因此可從本發(fā)明的埃希氏菌或GDH復(fù)合物中單獨(dú)分離純化出α-亞基，并進(jìn)行使用。
實施例本發(fā)明將參考以下實施例進(jìn)行更為詳盡的說明。
實施例1分離編碼洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1菌株GDH β-亞基的基因<1>洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1菌株GDH β-亞基的查找通過使用Sanger中心(http//www.sanger.ac.uk/)的洋蔥伯克霍爾德氏菌J2315菌株基因組數(shù)據(jù)庫查找來源于KS1菌株的GDH β-亞基基因。參照已闡明的KS1菌株GDH β-亞基的N-末端序列(SEQ IDNO5)，設(shè)計了一個氨基酸序列(SEQ ID NO6)，它與來源于下述酶的細(xì)胞色素c亞基具有同源性，所述的酶指醋桿菌(Acetobactersp.)和葡糖桿菌(Gluconobacter sp.)的乙醇脫氫酶(Tamaki T.等，Biochem.Biophys.Acta，1088(2)292-300(1991)；Matsushita K.等，Biosci.Biotech.Biochem.，56，304-310(1992)；Takemura H.等，J.Bacteriol.，175，6857-66(1993)；Kondo K.等，Appl.Environ.Microbiol.，63，1131-8(1997))、來源于歐文氏菌(Erwinia sp.)和假單胞菌(Pseudomonas sp.)的葡糖酸脫氫酶(Yum D.Y.等，J.Bacteriol.，179，6566-72(1997)；Matsushita等，J.Biochem.，85，1173-81(1979))、來源于葡糖桿菌(Gluconobacter sp.)的山梨醇脫氫酶(Choi E.S.等，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.，125，45-50(1995))及來源于歐文氏菌及泛菌(Pantoeasp.)的2-酮葡糖酸脫氫酶(Pujol C.J.等，J.Bacteriol.，182，2230-7(2000))。
以上述氨基酸序列作為索引，通過BLAST在上述洋蔥伯克霍爾德氏菌J2315菌株數(shù)據(jù)庫中查找所編碼的氨基酸序列具有高同源性的基因序列。然后檢查5個所得的序列與KS1菌株GDHα-亞基C-末端序列的同源性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從兩個基因片段翻譯的氨基酸序列具有高同源性(＞90％)。由于每個基因片段都比較短，約200至500bp，因此通過BLAST在洋蔥伯克霍爾德氏菌J2315菌株數(shù)據(jù)庫中查找與這些序列具有高同源性的序列，并將這些片段連接起來。從而獲得一個3110bp的片段。在獲得的核酸序列中，存在一個表現(xiàn)為GDH C-末端的ORF以及一個1275bp長度的表現(xiàn)為細(xì)胞色素c結(jié)構(gòu)基因的ORF。對所獲得的J2315菌株的核酸序列與已克隆的KS1菌株α-亞基的核酸序列進(jìn)行比較。結(jié)果表明，與編碼J2315菌株細(xì)胞色素c信號肽的核酸序列具有高同源性的核酸序列包含在α-亞基的下游。
根據(jù)上述結(jié)果，估計已克隆的洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1菌株GDH基因(SEQ ID NO1，參考WO 02/36779)中的第三個ORF(在SEQID NO1中2386位核苷酸與其后續(xù)序列)編碼β-亞基。而且由于純化的β-亞基的N-末端氨基酸序列與SEQ ID NO1中2452位至2466位核苷酸組成的核酸序列所翻譯的氨基酸序列有5個氨基酸殘基是匹配的，因此認(rèn)為上述ORF編碼β-亞基。
<2>通過反向PCR擴(kuò)增β-亞基結(jié)構(gòu)基因(1)細(xì)胞培養(yǎng)和基因組提取KS1菌株在37℃，5ml完全培養(yǎng)基(0.5％聚胨，0.3％酵母提取物，0.5％NaCl)中振蕩培養(yǎng)過夜。用GennomicPrepTM細(xì)胞及組織DNA提取試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)從獲得的細(xì)胞中提取基因組。根據(jù)附帶的操作手冊進(jìn)行操作。將獲得的基因組進(jìn)行酚/氯仿處理及乙醇沉淀，然后溶解在純水中。
(2)基因組片段的環(huán)化從KS1菌株提取的基因組用BamHI，EcoRI，HindIII，SmaI，SacI和XhoI進(jìn)行消化，得到的基因組片段通過乙醇沉淀進(jìn)行收集。用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo)對1μg限制性內(nèi)切酶消化的基因組進(jìn)行連接，于16℃連接過夜。
(3)PCR將根據(jù)編碼KS1菌株GDH β-亞基N-末端信號序列的核酸序列而設(shè)計的50pmol正向引物(EF1，SEQ ID NO7)和50pmol反向引物(ER1，SEQ ID NO8)(兩個引物均由Invitrogen合成)、0.5ml LATaq(Takara Bio Inc.)、8μldNTP溶液和5μl 10×PCR緩沖液加到純水中，使終體積為50μl，使用Program Temp Control System PC-801(ASTEC)進(jìn)行PCR。PCR在以下條件下進(jìn)行。94℃5分鐘，然后98℃20秒，62℃30秒重復(fù)30次，之后在72℃反應(yīng)6分鐘，72℃反應(yīng)10分鐘。
當(dāng)以限制性內(nèi)切酶SmaI消化的基因組為模板時，通過瓊脂糖電泳可確定片段大小約為2.1kbp。
<3>PCR擴(kuò)增片段測序(1)TA克隆對上述反向PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后切下條帶并用Gene Clean II試劑盒(Bio101 Inc)進(jìn)行純化。使用pGEMR-T與pGEMR-T easy載體系統(tǒng)(Promega)將該片段連接到pGEM-T載體上。用連接載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并在含50μg/ml氨芐青霉素，40μg/ml X-Gal和0.1μM IPTG的L瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。在出現(xiàn)的菌落中挑選白斑，并在含50μg/ml氨芐青霉素的L培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，通過堿法從細(xì)胞中提取質(zhì)粒。
(2)測序樣品的制備對獲得的質(zhì)粒進(jìn)行RNase處理，在1體積質(zhì)粒中加入0.6倍的20％PEG6000/2.5M NaCl，置于冰上1小時。然后在4℃將混合物15000rpm離心15分鐘，獲得沉淀。用70％乙醇洗滌沉淀，真空干燥后，溶解在純水中。
(3)DNA核酸序列的分析通過ABI PRISMTM310Genetic Analyzer(PERKIN-ELMERApplied Biosystems)對(2)中獲得的插入到質(zhì)粒中的片段進(jìn)行核酸序列分析。插入載體多克隆位點的插入片段的部分序列通過M13引物進(jìn)行測定。從而確定了包括已闡明的β-亞基N-末端序列的核酸序列。隨后根據(jù)該序列制備引物，對插入片段的核酸序列進(jìn)行測定。結(jié)果如SEQID NO9所示。另外，由該核酸序列中的ORF所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO10所示。
β-亞基共包含425個氨基酸殘基。根據(jù)與已有的氨基酸序列的N-末端比較，其中22個殘基被認(rèn)為是信號肽。根據(jù)氨基酸序列計算的分子量為45,276Da，除去信號肽的分子量為42,731Da，這與通過SDS-PAGE獲得的KS1菌株GDH β-亞基的分子量43kDa相當(dāng)。確定在β-亞基的氨基酸序列中細(xì)胞色素c上有3個位點是亞鐵血紅素結(jié)合元件(SEQ ID NO11)。該ORF緊鄰α-亞基結(jié)構(gòu)基因ORF的下游，而且在起始密碼子上游存在一個表現(xiàn)為SD序列的序列。
通過BLAST對該氨基酸序列進(jìn)行同源性搜索，發(fā)現(xiàn)在氨基酸水平上的同源性整體上都很高，例如，與來源于茄科羅爾斯通氏菌(Ralstoniasolanacearum)的氧化還原酶脫氫酶的細(xì)胞色素c亞基同源性為65％，與來源于氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)的山梨醇脫氫酶的細(xì)胞色素c亞基同源性為48％，與來源于毛芍蘭根歐文氏菌(Eriwiniacypripedii)的葡糖酸脫氫酶的細(xì)胞色素c亞基同源性為44％，與來源于檸檬泛菌(Pantoea citrea)的2-酮葡糖酸脫氫酶的細(xì)胞色素c亞基同源性為46.4％。另外，亞鐵血紅素結(jié)合元件序列(SEQ ID NO11)在這些細(xì)胞色素c的氨基酸序列中是保守的。
KS1菌株的GDH β-亞基結(jié)構(gòu)基因與J2315菌株的GDH β-亞基結(jié)構(gòu)基因在核酸序列水平和氨基酸水平上的同源性分別是92.0％和92.2％。
實施例2將GDHαβ基因?qū)氪竽c桿菌及ccm系統(tǒng)的增強(qiáng)<1>制備洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1菌株的染色體DNA通過常規(guī)方法制備洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1菌株的染色體基因。即，細(xì)菌菌株在TL液體培養(yǎng)基(1升中含10g聚胨，1g酵母提取物，5g NaCl，2g KH2PO4，5g葡萄糖，pH值為7.2)中，于34℃振蕩培養(yǎng)過夜。通過離心收集增殖細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在含10mM NaCl，20mMTris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，0.5％SDS和100μg/ml蛋白酶K的溶液中，于50℃處理6小時。向該懸浮液中加入等體積酚/氯仿，室溫振蕩10分鐘，離心獲得上清。向上清中加入醋酸鈉至終濃度0.3M，再加入2倍上清體積的乙醇來沉淀中間層的染色體DNA。將DNA用玻璃棒挑出，用70％乙醇洗滌，并溶解到合適體積的TE緩沖液中，從而獲得染色體DNA溶液。
<2>GDHαβ基因的制備通過PCR，以上述染色體DNA為模板，以具有下面序列的寡核苷酸為引物擴(kuò)增編碼GDHγ-亞基、α-亞基及β-亞基的DNA片段。
<正向引物cF1>
5’-CATGCCATGGCACACAACGACAACAC-3’(SEQ ID NO12)<反向引物GDHbU1>
5’-GTCGACGATCTTCTTCCAGCCGAACATCAC-3’(SEQ IDNO13)擴(kuò)增片段的C-末端是平端化的，然后N-末端用NcoI消化，然后將片段連接到相似處理的pTrc99A(Pharmacia)上。用獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上選取出現(xiàn)的菌落。所獲得的轉(zhuǎn)化子在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。分析插入DNA片段，確認(rèn)其大小約為3.8kb。該質(zhì)粒命名為pTrc99Aγαβ。該質(zhì)粒上的GDHαβ基因由trc啟動子調(diào)控。pTrc99Aγαβ包含氨芐青霉素抗性基因。
<3>ccm系統(tǒng)質(zhì)粒的制備用EcoT22I消化pTrc99Aγαβ，然后末端進(jìn)行平端化。然后用NotI消化片段并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分離和收集短的DNA片段。將該DNA片段插入到ScaI和NotI消化的pBBR122(MoBiTec)上，從而制備pBBGDHγαβ。
通過常規(guī)方法制備大腸桿菌JM109的染色體基因。即，該菌株在LB培養(yǎng)基(1升中含10g聚胨，5g酵母提取物，10g NaCl，pH值為7.0)中，于37℃振蕩培養(yǎng)過夜。通過離心收集增殖細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在含10mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，0.5％SDS和100μg/ml蛋白酶K的溶液中，于50℃處理6小時。向該懸浮液中加入等體積酚/氯仿，室溫振蕩10分鐘，離心獲得上清。向上清中加入醋酸鈉至終濃度0.3M，再加入2倍上清體積的乙醇來沉淀中間層的染色體DNA。將DNA用玻璃棒挑出，用70％乙醇洗滌，并溶解到合適體積的TE緩沖液中，從而得到JM109染色體DNA溶液。
通過PCR，以JM109染色體DNA為模板，以具有下面序列的寡核苷酸為引物擴(kuò)增編碼ccm系統(tǒng)基因的DNA片段。
<正向引物ECccmD1>
5’-TGGCCATGGTTGAAGCCAGAGAGTTACTTT-3’(SEQ IDNO14)<反向引物ECccmU1>
5’-TTATTTACTCTCCTGCGGCGACAAATGTTG-3’(SEQ IDNO15)擴(kuò)增片段的末端是平端化的，然后N-末端用NcoI消化。該片段用ACCI消化，平端化，然后連接到NcoI消化的pBBGDHγαβ上，從而得到pBBJMccm。GDHαβ基因通過AccI消化、平端化和隨后的NcoI消化pBBGDHγαβ而除去。
<4>將GDHαβ基因和ccm系統(tǒng)導(dǎo)入大腸桿菌用pTrc99Aγαβ和pBBJMccm轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，得到JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccm。
另外，用pTrc99Aγαβ轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，得到JM109/pTrc99Aγαβ作為對照。
這些轉(zhuǎn)化子在10ml含有50μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素(JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccm)，或含有50μg/ml氨芐青霉素(JM109/pTrc99Aγαβ)的2×YT培養(yǎng)基中，于34℃振蕩培養(yǎng)過夜。另外，洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1菌株在10ml完全培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜。通過離心從每個培養(yǎng)液的一部分中收集細(xì)胞，離心前加入含1％膽酸鈉的10mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)，再通過超聲破碎細(xì)胞。然后通過離心破碎的懸浮液測定所獲得的上清液中GDH活性。
GDH活性通過以下步驟進(jìn)行測定。預(yù)先將47mM磷酸緩沖液(pH6.0)、20mM葡萄糖、2mM吩嗪硫酸甲脂和0.1mM 2，6-二氯酚-吲哚酚的混合物加熱到37℃，然后加入樣品進(jìn)行反應(yīng)。當(dāng)混合物維持在37℃時，測定600nm處的吸收值變化可測定GDH活性。通過2，6-二氯酚-吲哚酚的分子消光系數(shù)(4.76mM/cm)測定GDH的活性。一個單位(U)的酶活性定義為每分鐘1μmol 2，6-二氯酚-吲哚酚的氧化量。
結(jié)果表明，JM109/pTrc99Aγαβ、洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1和JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccm的GDH活性分別為0.3、1.4和32U/ml。這表明JM109/pTrc99Aγαβ很難表現(xiàn)出GDH活性，野生菌株洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1表現(xiàn)出較弱的GDH活性，而JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccm表現(xiàn)出非常高的GDH活性。另外，從JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccm中純化出GDH復(fù)合物，并進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果確認(rèn)了該GDH復(fù)合物與從KS1菌株中純化的GDH復(fù)合物表現(xiàn)出相同的電泳模式(圖1)。
工業(yè)應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明，含有洋蔥伯克霍爾德氏菌葡萄糖脫氫酶α-亞基和β-亞基的酶復(fù)合物可在埃希氏菌中大量表達(dá)。
序列表<110>Arkray，Inc.
<120>葡萄糖脫氫酶的生產(chǎn)方法<130>G843-OPC4051<150>JP 2003-82739<151>2003-03-25<160>15<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2467<212>DNA<213>洋蔥伯克霍爾德氏菌<220>
<221>CDS<222>(258)..(761)<220>
<221>CDS<222>(764)..(2380)<220>
<221>CDS<222>(2386)..(2466)<400>1aagctttctg tttgattgca cgcgattcta accgagcgtc tgtgaggcgg aacgcgacat 60gcttcgtgtc gcacacgtgt cgcgccgacg acacaaaaat gcagcgaaat ggctgatcgt 120tacgaatggc tgacacattg aatggactat aaaaccattg tccgttccgg aatgtgcgcg 180tacatttcag gtccgcgccg atttttgaga aatatcaagc gtggttttcc cgaatccggt 240gttcgagaga aggaaac atg cac aac gac aac act ccc cac tcg cgt cgc290Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg1 5 10cac ggc gac gca gcc gca tca ggc atc acg cgg cgt caa tgg ttg caa 338His Gly Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln15 20 25ggc gcg ctg gcg ctg acc gca gcg ggc ctc acg ggt tcg ctg aca ttg 386
Gly Ala Leu Ala Leu Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu30 35 40cgg gcg ctt gca gac aac ccc ggc act gcg ccg ctc gat acg ttc atg434Arg Ala Leu Ala Asp Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met45 50 55acg ctt tcc gaa tcg ctg acc ggc aag aaa ggg ctc agc cgc gtg atc482Thr Leu Ser Glu Ser Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile60 65 70 75ggc gag cgc ctg ctg cag gcg ctg cag aag ggc tcg ttc aag acg gcc530Gly Glu Arg Leu Leu Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala80 85 90gac agc ctg ccg cag ctc gcc ggc gcg ctc gcg tcc ggt tcg ctg acg578Asp Ser Leu Pro Gln Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr95 100 105cct gaa cag gaa tcg ctc gca ctg acg atc ctc gag gcc tgg tat ctc626Pro Glu Gln Glu Ser Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu110 115 120ggc atc gtc gac aac gtc gtg att acg tac gag gaa gca tta atg ttc674Gly Ile Val Asp Asn Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe125 130 135ggc gtc gtg tcc gat acg ctc gtg atc cgt tcg tat tgc ccc aac aaa722Gly Val Val Ser Asp Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys140 145 150 155ccc ggc ttc tgg gcc gac aaa ccg atc gag agg caa gcc tg atg gcc769Pro Gly Phe Trp Ala Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala Met Ala160 165 170gat acc gat acg caa aag gcc gac gtc gtc gtc gtt gga tcg ggt gtc817Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser Gly Val175 180 185gcg ggc gcg atc gtc gcg cat cag ctc gcg atg gcg ggc aag gcg gtg865Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys Ala Val190 195 200atc ctg ctc gaa gcg ggc ccg cgc atg ccg cgc tgg gaa atc gtc gag913Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile Val Glu205 210 215cgc ttc cgc aat cag ccc gac aag atg gac ttc atg gcg ccg tac ccg961Arg Phe Arg Asn Gln Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro Tyr Pro220 225 230tcg agc ccc tgg gcg ccg cat ccc gag tac ggc ccg ccg aac gac tac1009Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn Asp Tyr235 240 245 250ctg atc ctg aag ggc gag cac aag ttc aac tcg cag tac atc cgc gcg1057Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gln Tyr Ile Arg Ala255 260 265
gtg ggc ggc acg acg tgg cac tgg gcc gcg tcg gcg tgg cgc ttc att1105Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg Phe Ile270 275 280ccg aac gac ttc aag atg aag agc gtg tac ggc gtc ggc cgc gac tgg1153Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg Asp Trp285 290 295ccg atc cag tac gac gat ctc gag ccg tac tat cag cgc gcg gag gaa1201Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala Glu Glu300 305 310gag ctc ggc gtg tgg ggc ccg ggc ccc gag gaa gat ctg tac tcg ccg1249Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr Ser Pro315 320 325 330cgc aag cag ccg tat ccg atg ccg ccg ctg ccg ttg tcg ttc aac gag1297Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe Asn Glu335 340 345cag acc atc aag acg gcg ctg aac aac tac gat ccg aag ttc cat gtc1345Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe His Val350 355 360gtg acc gag ccg gtc gcg cgc aac agc cgc ccg tac gac ggc cgc ccg1393Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly Arg Pro365 370 375act tgt tgc ggc aac aac aac tgc atg ccg atc tgc ccg atc ggc gcg1441Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile Gly Ala380 385 390atg tac aac ggc atc gtg cac gtc gag aag gcc gaa cgc gcc ggc gcg1489Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala Gly Ala395 400 405 410aag ctg atc gag aac gcg gtc gtc tac aag ctc gag acg ggc ccg gac1537Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly Pro Asp415 420 425aag cgc atc gtc gcg gcg ctc tac aag gac aag acg ggc gcc gag cat1585Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala Glu His430 435 440cgc gtc gaa ggc aag tat ttc gtg ctc gcc gcg aac ggc atc gag acg1633Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ile Glu Thr445 450 455ccg aag atc ctg ctg atg tcc gcg aac cgc gat ttc ccg aac ggt gtc1681Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn Gly Val460 465 470gcg aac agc tcg gac atg gtc ggc cgc aac ctg atg gac cat ccg ggc1729Ala Asn Ser Ser Asp Met Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His Pro Gly475 480 485 490acc ggc gtg tcg ttc tat gcg agc gag aag ctg tgg ccg ggc cgc ggc1777Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly Arg Gly
495 500 505ccg cag gag atg acg tcg ctg atc ggt ttc cgc gac ggt ccg ttc cgc1825Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro Phe Arg510 515 520gcg acc gaa gcg gcg aag aag atc cac ctg tcg aac ctg tcg cgc atc1873Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser Arg Ile525 530 535gac cag gag acg cag aag atc ttc aag gcc ggc aag ctg atg aag ccc1921Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met Lys Pro540 545 550gac gag ctc gac gcg cag atc cgc gac cgt tcc gca cgc tac gtg cag1969Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr Val Gln555 560 565 570ttc gac tgc ttc cac gaa atc ctg ccg caa ccc gag aac cgc atc gtg2017Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg Ile Val575 580 585ccg agc aag acg gcg acc gat gcg atc ggc att ccg cgc ccc gag atc2065Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro Glu Ile590 595 600acg tat gcg atc gac gac tac gtg aag cgc ggc gcc gcg cat acg cgc2113Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His Thr Arg605 610 615gag gtc tac gcg acc gcc gcg aag gtg ctc ggc ggc acg gac gtc gtg2161Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp Val Val620 625 630ttc aac gac gaa ttc gcg ccg aac aat cac atc acg ggc tcg acg atc2209Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser Thr Ile635 640 645 650atg ggc gcc gat gcg cgc gac tcc gtc gtc gac aag gac tgc cgc acg2257Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys Arg Thr655 660 665ttc gac cat ccg aac ctg ttc att tcg agc agc gcg acg atg ccg acc2305Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met Pro Thr670 675 680gtc ggt acc gta aac gtg acg ctg acg atc gcc gcg ctc gcg ctg cgg2353Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala Leu Arg685 690 695atg tcg gac acg ctg aag aag gaa gtc tgacc gtg cgg aaa tct act ctc 2403Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val Val Arg Lys Ser Thr Leu700 705 710act ttc ctc atc gcc ggc tgc ctc gcg ttg ccg ggc ttc gcg cgc gcg2451Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu Pro Gly Phe Ala Arg Ala715 720 725gcc gat gcg gcc gat c 2467
Ala Asp Ala Ala Asp730<210>2<211>168<212>PRT<213>洋蔥伯克霍爾德氏菌<400>2Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg His Gly Asp Ala Ala1 5 10 15Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln Gly Ala Leu Ala Leu20 25 30Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu Arg Ala Leu Ala Asp35 40 45Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met Thr Leu Ser Glu Ser50 55 60Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile Gly Glu Arg Leu Leu65 70 75 80Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala Asp Ser Leu Pro Gln85 90 95Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr Pro Glu Gln Glu Ser100 105 110Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu Gly Ile Val Asp Asn115 120 125Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe Gly Val Val Ser Asp130 135 140Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys Pro Gly Phe Trp Ala145 150 155 160Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala165<210>3<211>539<212>PRT<213>洋蔥伯克霍爾德氏菌<400>3Met Ala Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser1 5 10 15Gly Val Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys20 25 30Ala Val Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile35 40 45Val Glu Arg Phe Arg Asn Gln Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro
50 55 60Tyr Pro Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn65 70 75 80Asp Tyr Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gln Tyr Ile85 90 95Arg Ala Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg100 105 110Phe Ile Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg115 120 125Asp Trp Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala130 135 140Glu Glu Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr145 150 155 160Ser Pro Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe165 170 175Asn Glu Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe180 185 190His Val Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly195 200 205Arg Pro Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile210 215 220Gly Ala Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala225 230 235 240Gly Ala Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly245 250 255Pro Asp Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala260 265 270Glu His Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ile275 280 285Glu Thr Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn290 295 300Gly Val Ala Asn Ser Ser Asp Met Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His305 310 315 320Pro Gly Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly325 330 335Arg Gly Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro340 345 350Phe Arg Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser355 360 365Arg Ile Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met370 375 380Lys Pro Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr385 390 395 400Val Gln Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg
405 410 415Ile Val Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro420 425 430Glu Ile Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His435 440 445Thr Arg Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp450 455 460Val Val Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser465 470 475 480Thr Ile Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys485 490 495Arg Thr Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met500 505 510Pro Thr Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala515 520 525Leu Arg Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val530 535<210>4<211>27<212>PRT<213>洋蔥伯克霍爾德氏菌<400>4Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu1 5 10 15Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp20 25<210>5<211>16<212>PRT<213>洋蔥伯克霍爾德氏菌<400>5Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala1 5 10 15<210>6<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述共有序列<220>
<221>UNSURE<222>(6，17，18，19，22)<223>Xaa＝未知<400>6Ala Asp Ala Ala Asp Xaa Ala Leu Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Asp Cys Xaa Ala Cys His20 25<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>7tgcaccgtgc ggaaatctac tctcact 27<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>8acttccttct tcagcgtgtc cgacatc 27<210>9<211>1441<212>DNA<213>洋蔥伯克霍爾德氏菌<220>
<221>CDS<222>(121)..(1398)
<400>9tccgaacctg ttcatttcga gcagcgcgac gatgccgacc gtcggtaccg taaacgtgac 60gctgacgatc gccgcgctcg cgctgcggat gtcggacacg ctgaagaagg aagtctgacc 120gtg cgg aaa tct act ctc act ttc ctc atc gcc ggc tgc ctc gcg ttg168Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu1 5 10 15ccg ggc ttc gcg cgc gcg gcc gat gcg gcc gat ccg gcg ctg gtc aag216Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys20 25 30cgc ggc gaa tac ctc gcg acc gcc atg ccg gta ccg atg ctc ggc aag264Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys35 40 45atc tac acg agc aac atc acg ccc gat ccc gat acg ggc gac tgc atg312Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met50 55 60gcc tgc cac acc gtg aag ggc ggc aag ccg tac gcg ggc ggc ctt ggc360Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly65 70 75 80ggc atc ggc aaa tgg acg ttc gag gac ttc gag cgc gcg gtg cgg cac408Gly Ile Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His85 90 95ggc gtg tcg aag aac ggc gac aac ctg tat ccg gcg atg ccg tac gtg456Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val100 105 110tcg tac gcg aag atc aag gac gac gac gta cgc gcg ctg tac gcc tac504Ser Tyr Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr115 120 125ttc atg cac ggc gtc gag ccg gtc aag cag gcg ccg ccg aag aac gag552Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu130 135 140atc cca gcg ctg cta agc atg cgc tgg ccg ctg aag atc tgg aac tgg600Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp145 150 155 160ctg ttc ctg aag gac ggc ccg tac cag ccg aag ccg tcg cag agc gcc648Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala165 170 175gaa tgg aat cgc ggc gcg tat ctg gtg cag ggt ctc gcg cac tgc agc696Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser180 185 190acg tgc cac acg ccg cgc ggc atc gcg atg cag gag aag tcg ctc gac744Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp195 200 205gaa acc ggc ggc agc ttc ctc gcg ggg tcg gtg ctc gcc ggc tgg gac792Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp
210 215 220ggc tac aac atc acg tcg gac ccg aat gcg ggg atc ggc agc tgg acg840Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr225 230 235 240cag cag cag ctc gtg cag tat ttg cgc acc ggc agc gtg ccg ggc gtc888Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val245 250 255gcg cag gcg gcc ggg ccg atg gcc gag gcg gtc gag cac agc ttc tcg936Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser260 265 270aag atg acc gaa gcg gac atc ggt gcg atc gcc acg tac gtc cgc acg984Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr275 280 285gtg ccg gcc gtt gcc gac agc aac gcg aag cag ccg cgg tcg tcg tgg1032Val Pro Ala Val Ala Asp Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp290 295 300ggc aag ccg gcc gag gac ggg ctg aag ctg cgc ggt gtc gcg ctc gcg1080Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala305 310 315 320tcg tcg ggc atc gat ccg gcg cgg ctg tat ctc ggc aac tgc gcg acg1128Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr325 330 335tgc cac cag atg cag ggc aag ggc acg ccg gac ggc tat tac ccg tcg1176Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser340 345 350ctg ttc cac aac tcc acc gtc ggc gcg tcg aat ccg tcg aac ctc gtg1224Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val355 360 365cag gtg atc ctg aac ggc gtg cag cgc aag atc ggc agc gag gat atc1272Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ile Gly Ser Glu Asp Ile370 375 380ggg atg ccc gct ttc cgc tac gat ctg aac gac gcg cag atc gcc gcg1320Gly Met Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ala385 390 395 400ctg acg aac tac gtg acc gcg cag ttc ggc aat ccg gcg gcg aag gtg1368Leu Thr Asn Tyr Val Thr Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val405 410 415acg gag cag gac gtc gcg aag ctg cgc tga catagtcggg cgcgccgaca 1418Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg420 425cggcgcaacc gataggacag gag 1441<210>10<211>425
<212>PRT<213>洋蔥伯克霍爾德氏菌<400>10Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu1 5 10 15Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys20 25 30Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys35 40 45Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met50 55 60Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly65 70 75 80Gly lle Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His85 90 95Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val100 105 110Ser Tyr Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr115 120 125Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu130 135 140Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp145 150 155 160Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala165 170 175Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser180 185 190Thr Cys His Thr Pro Arg Gly lle Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp195 200 205Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp210 215 220Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr225 230 235 240Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val245 250 255Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser260 265 270Lys Met Thr Glu Ala Asp lle Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr275 280 285Val Pro Ala Val Ala Asp Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp290 295 300Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala305 310 315 320
Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr325 330 335Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser340 345 350Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val355 360 365Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ile Gly Ser Glu Asp Ile370 375 380Gly Met Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ala385 390 395 400Leu Thr Asn Tyr Val Thr Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val405 410 415Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg420 425<210>11<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述血紅素結(jié)合元件<220>
<221>UNSURE<222>(2，3)<223>Xaa＝未知<400>11Cys Xaa Xaa Cys His1 5<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>12catgccatgg cacacaacga caacac26<210>13
<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>13gtcgacgatc ttcttccagc cgaacatcac30<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>14tggccatggt tgaagccaga gagttacttt30<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>15ttatttactc tcctgcggcg acaaatgttg30
權(quán)利要求
1.一種埃希氏菌(Escherichia)，該菌導(dǎo)入了以可表達(dá)形式存在的編碼洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkhorderia cepacia)葡萄糖脫氫酶α-亞基和β-亞基的DNA，而且其ccm系統(tǒng)的表達(dá)是增強(qiáng)的。
2.權(quán)利要求1中的埃希氏菌，其中編碼α-亞基的DNA位于編碼β-亞基的DNA的上游，而且它們的表達(dá)由同一個啟動子調(diào)控。
3.權(quán)利要求1中的埃希氏菌，該菌進(jìn)一步引入以可表達(dá)形式存在的編碼葡萄糖脫氫酶γ-亞基的DNA。
4.權(quán)利要求3中的埃希氏菌，其中編碼γ-亞基的DNA位于編碼α-亞基的DNA的上游。
5.權(quán)利要求1到4任何一項中的埃希氏菌，其中埃希氏菌是大腸桿菌。
6.一種生產(chǎn)葡萄糖脫氫酶復(fù)合物的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求1到5任何一項中的埃希氏菌，使編碼α-亞基和β-亞基的DNA得到表達(dá)從而生產(chǎn)葡萄糖脫氫酶復(fù)合物，并收集該復(fù)合物。
全文摘要
通過培養(yǎng)埃希氏菌，該菌導(dǎo)入以可表達(dá)形式存在的編碼洋蔥伯克霍爾德氏菌葡萄糖脫氫酶α－亞基和β－亞基的DNA，而且其ccm系統(tǒng)(細(xì)胞色素c成熟系統(tǒng))的表達(dá)是增強(qiáng)的，表達(dá)上述DNA并產(chǎn)生葡萄糖脫氫酶復(fù)合物，以及收集該復(fù)合物的過程從而生產(chǎn)葡萄糖脫氫酶復(fù)合物。
文檔編號C12N9/04GK1795264SQ200480014358
公開日2006年6月28日 申請日期2004年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月25日
發(fā)明者山岡秀亮, 星島光博, 川瀨至道, 黑坂啟介 申請人:愛科來株式會社