專利名稱：篩選過氧化物酶體增殖物的dna芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩選過氧化物酶體增殖物的DNA芯片，更具體而言，涉及一種DNA芯片，其包括一種探針，該探針可與個(gè)體服藥過氧化物酶體增殖物后表達(dá)的基因特異性雜交，并涉及包括DNA芯片的用于篩選過氧化物酶體增殖物的試劑盒，制備該試劑盒地方法，和使用該試劑盒篩選過氧化物酶體增殖物的方法。
現(xiàn)有技術(shù)的描述
眾所周知，過氧化物酶體增殖物在體內(nèi)產(chǎn)生過量的自由基以誘發(fā)異常的細(xì)胞反應(yīng)和活化促進(jìn)體內(nèi)甘油三酯分解的PPARs(過氧化物酶體增殖物激活的受體)。當(dāng)動(dòng)物服藥過氧化物酶體增殖物，體內(nèi)產(chǎn)生過量的自由基，因此過氧化物酶體在細(xì)胞中異常增殖并除去過量產(chǎn)生的自由基。異常增殖的過氧化物酶體吸收并除去存在于細(xì)胞的大多數(shù)自由基，而允許少量自由基保留在細(xì)胞中。因此，所述剩余的自由基，即使它們是在數(shù)量上是小的，能夠?qū)е录?xì)胞異常的氧化。在這方面，考慮到安全問題，驗(yàn)證一種待給藥到動(dòng)物的化學(xué)品是否可以作為過氧化物酶體增殖物是非常重要的。
直到現(xiàn)在，為驗(yàn)證一種待給藥到動(dòng)物體的化學(xué)品是否可以作為過氧化物酶體增殖物，篩選具有過氧化物酶體增殖活性的化學(xué)品的下列方法已經(jīng)在本領(lǐng)域中使用，其包含步驟對動(dòng)物給藥化學(xué)品；從動(dòng)物切除肝以獲得用于光學(xué)顯微鏡檢查的組織樣品；和用光學(xué)顯微鏡檢查該組織并將其大小與原樣樣品比較，以驗(yàn)證異常增殖的過氧化物酶體的存在。
然而，常規(guī)方法已經(jīng)顯示對于低的過氧化物酶體增殖活性的化學(xué)品具有時(shí)間消耗長和分辨率低的缺點(diǎn)。也就是說，從化學(xué)品服藥的動(dòng)物獲得組織樣品需要超過一天。此外，對于低過氧化物酶體增殖活性的化學(xué)品它不是相關(guān)的，產(chǎn)生可能不導(dǎo)致過度的過氧化物酶體增殖的相對小量的自由基，因此增殖的過氧化物酶體的大小與原樣相比差別不明顯。為了克服所述問題，本領(lǐng)域已經(jīng)嘗試了多種方法，然而還沒有得到可以替換的方法。
在這種條件下，開發(fā)篩選具有過氧化物酶體增殖活性的化學(xué)品有著強(qiáng)烈的理由。
發(fā)明概述
本發(fā)明人致力于建立篩選具有過氧化物酶體增殖活性的方法，并發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖物的篩選可以使用包含特異性與個(gè)體服藥過氧化物酶體增殖物時(shí)表達(dá)的基因雜交的探針的DNA芯片，和使用包含熒光標(biāo)記的核苷酸以標(biāo)記從分離自樣品的RNA合成的cDNA的用于篩選過氧化物酶體增殖物的試劑盒。
因此本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供篩選過氧化物酶體增殖物的DNA芯片，包含可以特異性與個(gè)體服藥過氧化物酶體增殖物時(shí)表達(dá)的基因雜交的探針。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供制備該DNA芯片的方法。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供篩選過氧化物酶體增殖物的試劑盒，其包含DNA芯片。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供使用篩選試劑盒篩選過氧化物酶體增殖物的方法。
發(fā)明詳述
本發(fā)明篩選過氧化物酶體增殖物的DNA芯片包括由121bp到587bp核苷酸組成的探針，該探針特異性結(jié)合到被過氧化物酶體增殖物誘導(dǎo)表達(dá)的基因；由寡聚(dT)15，(CH2)6-和胺基以相繼次序組成的接頭，寡聚(dT)15的3′末端可以結(jié)合到探針的5′末端；和表面包被與接頭的胺基通過Schiff堿作用連接的醛基的固體基材。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，探針，不限于此，選自以下SEQ ID Nos1到12的ESTs。
AA8189105′-ACAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAACACTTTTATTTTCCACAAGGAAGAGCAATAGGAAAAGTCAAATCATTTCCCACATGGTTTTCTTAAAACAGAGCCTACAAGGACATATTCAGCACCAAATAAAAGATTACAACAGCCATAGAATATAATCTATAAAGCAAACATTTAATATTGCACTTTGTTTCGCAAACATTTTGGATTTTACTTTTCCTAAATGAAAAATTAGGAATTCAAGATAGCTTGAATACTAGAGCGCAACTGTGACCCTCAGATGTTATGTCAGGAATTGACCAATATTTAGAATAGTGTAATGCCTCAAAAGAGTAAAGAAATACTTAATGGGAAAAATAAAACTTTACTTCACCAACTCTTAAAATAATTTTGTCACCAATGCCAATTATCAGAATATTGGTCATTCTTGCTTAATAAAGTATTTTGTAGAACATGGTAGTGAGCGCCCCGAGGCCATGCACACCAACAATTGTTCCCTAGTCAGACATAACACAGAGTCAGGTGTTTTTACACAATCCCTCCCAACAAAAACAAATCCACCAAATGCCCTTTATGCCAAATATCCCATCAGCT-3′(SEQ ID No1)
AI0458275′-TTTATTGTGGGGCCACATGAAAAGGGCTGGGGTAGGGGATGTGGGGCCAGCCCCCGAGGCCTGGGGATGAGGAAAAAGTTAATACACAGTACATATAGAAGGCACAAGTGGGGAATTGGAG-3′(SEQ ID No2)
AI0458145′-CATCTCAGTTCTAAGATAGACCAATGCTCAAAGTTTTATTAATTTTCCTGAAGTGTATCTGGGACGCATGCTCCTCTAAAGAGGAGGCACTTTATTTGTTTACCCCAGAGTCCACTGTTGGCAAACAGATACTTTTTTTTCTGCACCTACCAATTTTAAATGTTCTAAATAAAACAGAAAATGTAGAAATTCTATTAACACAAGTAATGTATAATAGGAGCTAGGATCAGCATTATTATCAGTGAATGTGCTATGAGGTCTGAGGAAGCATTTGATGCCCAGTCCCCT-3′(SEQ ID No3)
AA8194085′-TGCACTATCACTCCCCAACCTACAGCCATCTGATACGCCGTGTACTGTTGCCTAGACTACAGTGAAAGGAAATGGAACTTTGTTACTTGGCTGTAGAGGACCTGATGGAAACCCTCTGTAAATGCTGGTGTTCTGAGAGAGTGCTTGTTCTGTCAAAGACCACAACCCAGAGCATTGCAGCAGTGCTGGGGAGACCAGTGAAGGCACTAGGGTAGAGAGCATTGGCATGGGTCACTGGCCCAGTAGACTTAATTCCCCTCGTGCCG-3′(SEQ ID No4)
AA8194265′-GAGGTGCGAAGGACCACATCTCCAGTCGGAACACGTTCCGTTAGTTAATTAAAAAAAAAAAAAAAGACTTGGGTTTTTGAAAACCCAAACCAGCTTTCTTCAAAGATGTCACCCTCATTTGTACCCCTGGGCTTAGCAGCGTTAAGAGGGCTCTTGGCTCATGGATGTTCCTCTCTGGACTGACTGGTGAGCAGGTCCAGGCAGGGCGGCCTCCGGGCAGGCTCCTCCCTAGCTCCATCCAGCAGCGACGCTCCCAGCAGGCTCCAGATGGCGCTCCTCCCAGAAGGAGTGGCACTGGGGGCAGCAGGTGAACTGAGGATCCTCGCCCCACAGACCGCGGCCGTTTTTTATTACACACAGGTAAAACCACA-3′(SEQ ID No5)
AA9255455′-TGGCCAGGTGGCAAGGTCACCGGTGGCCCGGTCACCGATACAGGTAGTCAGCCTGGATGTTGGCCGCGATCTCGGCCTCCCACTTGTCACCATTGTTGAGTAGCTTCTCCTTGTTGTACAGCAACTCCTCATGCGTCTCGGTGGAGAACTCAAAGTTGGGGCCCTCCACGATAGCGTCAACAGGGCAGGCTTCCTGGCAGAAACCACAGTAGATACACTTGGTCATGTCAATGTCATAGCGTGTAGTCCGGCGGCTGCCATCTGCTCTTGGCTCAGCCTCAATGGTGATGGCCTGTGCAGGACAGATGGCCTCACAGAGCTTGCAGGCGATGCAACGCTCCTCCCCAGACGGGTAGCGGCGCAGTGCATGCTCCCCACGGAAGCGCGGACTCA-3′(SEQ ID No6)
AA8595865′-AGGGTGTGGGGAGAGCTAGGCTCCTGATGTCTCCTCGGCACTGGACTGTGGGCCTGGTCAGTACACACGGGCTTGTAGAGAAAGTCAGTATCTCATTAAAAAAAGAAGCGGCGGCGGCGGCAGCATCCCGGCTGTGCAGACCGCAGCAGTGCATGTGCCTAAGACAGGCCGTACCGTCCTCTGGACCAGCACGCTCTGGACAGCCTGAGCCAGGGCAGGGTGCTGCAAAGAGGGGGCTGGGCAGGCTTAGGAGACCACAGGGAACCATACCTCAATAGGCTTCTGGCCTTGCCCAGGGTCTGGACCAAAGGGACCCCAGGCCCTGCCTCTGGGTGAACCCGTCATACGTCCATAAAGTCATCGTCCTCGTCTGTCTCACTCTCCAATGAGGACTCCTGGCTGGATGTCTCCAGAACCTCCAGGGCTGGCTGGCACAGGCTCTCCTTCCTCACATTGGCGGCA-3′(SEQ ID No7)
AA8754965′-GTGAATCAATAAAACAAAAGCTAAGGACAATGAGCTCAAGTTATCGATTCTTAAGTTTCAAAATAGAACAGTAGGAAAGCTATGAAAGTGGGGGGGTGGACTTTGGGGTGTATGAGCAATAGGAATCTAAAGCATCAAAACACAGGCTAAGAAAGTCTAGGACACAAGGAAGACTCCAGCAGCTCCCTCAGATGTCTAATTCCGGTCATTTACTTTTCACTCTAAAAAGTATCTTAAATTTTTAATATTTATTAGTTTTTTGTTTTTTCAAGACAGGGTCTCACATATAGCTCTGCCTACCCCAGAACTCACAATGAAGTCCAGGCTGACCTTGAACTCACAGAGACCCTCTAGCCTCTGCCTCTGTCGTGCTGGAATTAAAGGCACATGCACCACTATGCCCAGCATAA ATATTTA-3′(SEQ ID No8)
AI0293855′-CACTTACTAAACTAACATTATATGTTTTACAATTTTGAACAACTTTACAAGTTACTGTTATTTTCAATTCTGAGTAGAAAGGTAAACTCCAAGCAAGACAAAGCCAATAGAGGCTTAAGTTCATCACCAACAAGTTTCAACAATTTACCCCAAATTTACTGTTAAACAGTACCTGGTTGAAGACACAAGCTGCGCCTTAAATAAGCTGGAGCGACTCTGGGATGTTATGAACTTAACCTTGAAAGGAAGAAGGTATAGGAACTTCTATTTGGTTTGGATTGTAAGAACAGACAAATTACTTACAGAAACTGAATTACTTCAATACACATGTGAAGAC-3′(SEQ IDNo9)
AI0307485′-TATAGTAAATACGTGTGTTTTCCAGGATGCCACAGAATTTCATTGGAAAACAATGAAACTAGATTAACCTGAGACCCCCCCCTTCCCCTTAGAAAATAAGGACTATAGGATTAGACCACAAGCAGACTAGTAAAGGGGATGGGGTTGTGGTACACCTGATTTTAGCCAGACTTTCCCAAGCTAAATCCAGATAAAACTGCTTCTGTATTAGTAAGTTGGGTGAGTGTGTAAAATCTATCATTCAAAAAGT-3′(SEQ IDNo10)
AA8193995′-AGAGCATAGATGTGGCAGGGTCTCAGTCCCTGCACAGAAATGAGAGATGAACAAAAACGAGACACTTCCACCTGGCCAGAGTCTGGGAGGGCAGGGAGGAACACAGACCTGGACATTCGTAAGAAAAATAAAACCTAAATCAAACATTCAATCTTGTACCCAATAAAGGTTTGAACAGGGAACTCAGTCACCACCAGTTCCCACCCTCCCCTGCCAGCACTGAAGAAAAACAAAAGTTCAACACACACTAAGGGCTTAGGAGGAAGGGGCATTCTCCTGCCTTCCCCCAACCCCCAAGAATGGGCTGGGGAAAAAACGGCTATATTTCCCCACCCCTTACAGTGTCAACCCTACACGAGTTCTGAATGTGATCCGTAAGAATCAGCAGCTCAA-3′(SEQ ID No11)
AA9251285′-TGTGTTCTTAGAAAGCAAACTTAATGGCTTTCAAACCAAATCCTTAGAGCCAGTACATCAAAGGCATTGCGGTCCACGTATGCAAGGGTGTGCATGTAGAGGCCAGAGGGCAACTTTAGGAGTCAGTATTCTCCTTCCACCCTCGGCTCCAGAGTCGAATTCAGGCCTCATGAGCAACAAGCATGTTCACCTCTTGGGCCATTCACCAGTCCCAGGATCAAGACTTCTTTGATGCTTCTATTTCTTCCCACAATGCAGCTTCAATTTTTGAAGTGTCATATTCTCTCATCATATCAAACTCAAGCCATGGCTTGCTCCACTTCTGGGCTTCTTTCATTTGCTCTTCAGTTAAAGCAAGATCAAATCTGATCCCTTTAATGTTGAAGTTCGGACGTT-3′(SEQ ID No12)
制備篩選過氧化物酶體增殖物的DNA芯片的方法包括如下步驟合成由121bp到587bp核苷酸組成的探針，該探針特異性結(jié)合到被過氧化物酶體增殖物誘導(dǎo)表達(dá)的基因；合成由寡聚(dT)15，(CH2)6-和胺基以相繼次序組成的接頭；將合成的探針的5’末端結(jié)合到合成的接頭的寡聚(dT)15的3’末端；將結(jié)合到探針的接頭與表面通過Schiff堿作用涂布有醛基的固體基材連接；和還原未反應(yīng)的醛基。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，玻璃，但不限于此，被用作固體基材，而醛的還原，不限于此，通過還原劑例如NaBH4進(jìn)行。
另一方面，本發(fā)明篩選氧化物酶體增殖物的試劑盒可以通過使用篩選過氧化物酶體增殖物的所述DNA芯片而制備即篩選過氧化物酶體增殖物的試劑盒，包括用于篩選過氧化物酶體增殖物的DNA芯片和用于標(biāo)記從樣品中分離的RNA合成的cDNA的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸是得克薩斯紅dATP，花青3dCTP，花青5dGTP或熒光素-12dUTP，但不限于此。
此外，過氧化物酶體增殖物可以使用篩選過氧化物酶體增殖物的試劑盒來篩選。即過氧化物酶體增殖物可以通過驗(yàn)證服藥的化學(xué)品的過氧化物酶體增殖活性而篩選，采用如下步驟對動(dòng)物給藥過氧化物酶體增殖物候選化學(xué)品；從動(dòng)物分離RNA；從分離的RNA使用試劑盒中熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸合成熒光標(biāo)記的cDNA；將合成的cDNA用于在試劑盒中篩選過氧化物酶體增殖物的DNA芯片，以允許雜交；和洗滌雜交的DNA芯片，并使用掃描器檢查DNA芯片中雜交的探針。
根據(jù)本發(fā)明，誘導(dǎo)體內(nèi)異常細(xì)胞反應(yīng)的過氧化物酶體增殖物可以通過使用篩選過氧化物酶體增殖物的試劑盒容易地篩選，其使得不同化學(xué)品安全測試領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用成為可能。
本發(fā)明進(jìn)一步通過以下實(shí)施例來闡述，其不應(yīng)當(dāng)視為對本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例1與通過給藥過氧化物酶體增殖物而表達(dá)的基因特異性雜交的EST(表達(dá)序列標(biāo)簽)的選擇
如下制備實(shí)驗(yàn)組1-3，而無化學(xué)品處理的大鼠制備為對照組，從實(shí)驗(yàn)組和對照組切除肝臟。
實(shí)驗(yàn)組16-周齡大鼠(Sprague-Dawley VAF+白化體)每天通過腹部注射0.2mg/kg具有過氧化物酶體增殖活性的氯貝特(clofibrate)處理2周；
實(shí)驗(yàn)組26-周齡大鼠(Sprague-Dawley VAF+白化體)每天通過腹部注射0.2mg/kg具有過氧化物酶體增殖活性的吉非諾齊(gemfibrozil)處理2周；和
實(shí)驗(yàn)組36-周齡大鼠(Sprague-Dawley VAF+白化體)每天通過腹部注射0.2mg/kg沒有過氧化物酶體增殖活性的苯妥英(phenytoin)處理2周。
從大鼠收集的各肝臟，使用RNA抽提試劑盒(Micro-to-Midi總RNA純化系統(tǒng)，Life Technologies，Inc.，USA)分離mRNA，并通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Platinum Biochip Reagent Kit，Genocheck，Korea)和花青5dGTP自mRNA合成熒光標(biāo)記的cDNA。
另一方面，從帶有不同ESTs的Clone-LibraryTM(Research Genetics，USA)提取質(zhì)粒，ESTs通過PCR技術(shù)擴(kuò)增，并點(diǎn)樣到玻璃基材上以制備含有EST作為探針的DNA芯片。
從各實(shí)驗(yàn)組合成的cDNAs被用于DNA芯片并與DNA芯片的探針雜交12小時(shí)。然后，通過掃描器(GenePix Scanner 4000A，Axon Inc.，Union CA)進(jìn)行DNA芯片的掃描，以測量從DNA芯片的各探針發(fā)射的熒光水平。結(jié)果使用圖像分析系統(tǒng)(GenePix Pro 4.0，Axon instrumentInc.，USA)進(jìn)行分析以從探針候選物中選擇12種ESTs。
選擇的ESTs和它們的SEQ ID Nos.以及所述ESTs與各實(shí)驗(yàn)組的cDNAs雜交發(fā)射的熒光相對強(qiáng)度顯示于下面的表1。考慮到相對熒光強(qiáng)度與特異性雜交的水平成比例，相對熒光強(qiáng)度基于參考值1.00而計(jì)算，其是在對照組cDNA與DNA芯片雜交時(shí)從花青5dGTP發(fā)射的熒光水平。
表1可以與通過給藥各化學(xué)品*而特異性表達(dá)的基因雜交的ESTs和從雜交產(chǎn)生的相對熒光強(qiáng)度
*實(shí)驗(yàn)1，實(shí)驗(yàn)2，實(shí)驗(yàn)3分別代表用氯貝特處理的實(shí)驗(yàn)組1，用吉非諾齊處理的實(shí)驗(yàn)組2和用苯妥英處理的實(shí)驗(yàn)組3。
如表1所示，來自實(shí)驗(yàn)組1的cDNA和SEQ ID Nos 1到11的ESTs之間的雜交產(chǎn)生相對熒光強(qiáng)度的高值，來自實(shí)驗(yàn)組2的cDNA和SEQID Nos 12的ESTs之間的雜交也產(chǎn)生相對熒光強(qiáng)度的高值，但是來自實(shí)驗(yàn)組3的cDNA和SEQ ID Nos 1到12的ESTs之間的雜交產(chǎn)生相對熒光強(qiáng)度的低值。
考慮到用于實(shí)驗(yàn)組1和2的化學(xué)品已知具有過氧化物酶體增殖活性而用于實(shí)驗(yàn)組3的化學(xué)品沒有活性，可以推斷具有過氧化物酶體增殖活性的化學(xué)品可以使用所述12種ESTs來篩選。
實(shí)施例2DNA芯片的制備
作為用于DNA芯片的探針，實(shí)施例1選擇的12種ESTs分別被化學(xué)合成，并制備由寡聚(dT)15，-(CH2)6-和胺基以相繼次序組成的每個(gè)接頭，然后接頭的胸腺嘧啶殘基被結(jié)合到合成的ESTs的5′末端。
然后，結(jié)合到接頭的探針溶解在濃度50μM的緩沖液(350mM碳酸氫鈉，pH9.0)中并通過點(diǎn)陣器(arrayer)(MicroGrid II，BioRobotics，USA
150μm的大小和400μm的間距點(diǎn)樣在涂有醛基的載玻片(甲硅烷基化的載玻片，CSS-100，CEL，Houston，TX，USA)表面上，并進(jìn)行Schiff堿作用。然后，所述載玻片用0.2％(w/v)SDS溶液和蒸餾水順序洗滌，并浸泡到NaBH4溶液(0.1g NaBH4，30ml PBS，10ml乙醇)中15分鐘。然后，還原沒有與胺起反應(yīng)的醛基，用蒸餾水洗滌并干燥以制備DNA芯片。
實(shí)施例3使用DNA芯片篩選過氧化物酶體增殖物
檢驗(yàn)顯示過氧化物酶體增殖活性的化學(xué)品是否可以通過使用實(shí)施例2制備的DNA芯片而篩選熒光標(biāo)記的cDNAs以與實(shí)施例1類似方式合成，不同之處在于使用如下不同的化學(xué)品，并合成各實(shí)驗(yàn)組的熒光標(biāo)記的cDNAs。
實(shí)驗(yàn)組46-周齡大鼠(Sprague-Dawley VAF+白化體)每天用0.05mg/kg具有過氧化物酶體增殖活性的1-甲基-4-哌啶基-雙(p-氯苯氧基)乙酸酯通過腹部注射處理2周；
實(shí)驗(yàn)組56-周齡大鼠(Sprague-Dawley VAF+白化體)每天用0.05mg/kg Wy-14，643(一種具有過氧化物酶體增殖活性的致癌劑)通過腹部注射處理2周；
實(shí)驗(yàn)組66-周齡大鼠(Sprague-Dawley VAF+白化體)每天用0.05mg/kg二-(2-乙基己基)苯二甲酸酯(一種具有過氧化物酶體增殖活性的內(nèi)分泌擾亂劑)通過腹部注射處理2周；和，
實(shí)驗(yàn)組76-周齡大鼠(Sprague-Dawley VAF+白化體)每天用0.05mg/kg 2-羥基-3-丙基-4-[(6-四唑-5-基)己氧基]-苯乙酮(一種顯示過氧化物酶體增殖活性的肝臟脂肪酸氧化抑制劑)通過腹部注射處理2周。
熒光標(biāo)記的cDNAs被用于實(shí)施例2制備的DNA芯片，并雜交12小時(shí)。然后，掃描DNA芯片并分別測量發(fā)射自每一個(gè)實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度(參見，表2)。
表2DNA芯片與通過各化學(xué)品特異性表達(dá)的基因雜交的相對熒光強(qiáng)度結(jié)果
*實(shí)驗(yàn)4，實(shí)驗(yàn)5，實(shí)驗(yàn)6和實(shí)驗(yàn)7分別代表用1-甲基-4-哌啶基-雙(p-氯苯氧基)處理的實(shí)驗(yàn)組4，用Wy-14，643處理的實(shí)驗(yàn)組5，用二-(2-乙基己基)苯二甲酸酯處理的實(shí)驗(yàn)組6和用2-羥基-3-丙基-4-[(6-四唑-5-基)己氧基]處理的實(shí)驗(yàn)組7。
如表2所示，來自實(shí)驗(yàn)組4到7的cDNA顯示與DNA芯片中的各ESTs比較高的雜交程度，表明該結(jié)果與實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)組1和2的結(jié)果相同。
因此，很清楚表明具有過氧化物酶體增殖活性的化學(xué)品可以通過使用本發(fā)明的DNA芯片以迅速和準(zhǔn)確的方式篩選。
如上述清晰的圖解和說明，本發(fā)明提供DNA芯片，其包括一種探針，該探針可與個(gè)體服藥過氧化物酶體增殖物時(shí)表達(dá)的基因特異性雜交，并涉及包括DNA芯片的篩選過氧化物酶體增殖物的試劑盒，制備該試劑盒的方法，和使用該試劑盒篩選過氧化物酶體增殖物的方法。根據(jù)本發(fā)明，過氧化物酶體增殖物誘導(dǎo)體內(nèi)異常細(xì)胞反應(yīng)可以通過使用篩選過氧化物酶體增殖物的試劑盒容易地篩選，這使得在各種化學(xué)品的安全試驗(yàn)方面廣泛的應(yīng)用變成可能。
雖然本發(fā)明已經(jīng)公開用于作例證目的的優(yōu)選的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到多種修飾，添加和取代是可能的，而不偏離權(quán)利要求書中公開的本發(fā)明的范圍和精神。
序列表
<110>株式會(huì)社 格諾切克(GENOCHECK CO.，LTD.)等
<120>篩選過氧化物酶體增殖物的DNA芯片
(DNA CHIP FOR SCREENING OF PEROXISOME PROLIFERATOR)
<130>SCT054826-47
<160>12
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>587
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>1
acaaaaaaaa gaaaaaaaaa aaacactttt attttccaca aggaagagca ataggaaaag 60
tcaaatcatt tcccacatgg ttttcttaaa acagagccta caaggacata ttcagcacca 120
aataaaagat tacaacagcc atagaatata atctataaag caaacattta atattgcact 180
ttgtttcgca aacattttgg attttacttt tcctaaatga aaaattagga attcaagata 240
gcttgaatac tagagcgcaa ctgtgaccct cagatgttat gtcaggaatt gaccaatatt 300
tagaatagtg taatgcctca aaagagtaaa gaaatactta atgggaaaaa taaaacttta 360
cttcaccaac tcttaaaata attttgtcac caatgccaat tatcagaata ttggtcattc 420
ttgcttaata aagtattttg tagaacatgg tagtgagcgc cccgaggcca tgcacaccaa 480
caattgttcc ctagtcagac ataacacaga gtcaggtgtt tttacacaat ccctcccaac 540
aaaaacaaat ccaccaaatg ccctttatgc caaatatccc atcagct 587
<210>2
<211>121
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>2
tttattgtgg ggccacatga aaagggctgg ggtaggggat gtggggccag cccccgaggc 60
ctggggatga ggaaaaagtt aatacacagt acatatagaa ggcacaagtg gggaattgga120
g121
<210>3
<211>288
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>3
catctcagtt ctaagataga ccaatgctca aagttttatt aattttcctg aagtgtatct 60
gggacgcatg ctcctctaaa gaggaggcac tttatttgtt taccccagag tccactgttg120
gcaaacagat actttttttt ctgcacctac caattttaaa tgttctaaat aaaacagaaa180
atgtagaaat tctattaaca caagtaatgt ataataggag ctaggatcag cattattatc240
agtgaatgtg ctatgaggtc tgaggaagca tttgatgccc agtcccct 288
<210>4
<211>266
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>4
tgcactatca ctccccaacc tacagccatc tgatacgccg tgtactgttg cctagactac 60
agtgaaagga aatggaactt tgttacttgg ctgtagagga cctgatggaa accctctgta120
aatgctggtg ttctgagaga gtgcttgttc tgtcaaagac cacaacccag agcattgcag180
cagtgctggg gagaccagtg aaggcactag ggtagagagc attggcatgg gtcactggcc240
cagtagactt aattcccctc gtgccg 266
<210>5
<211>371
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>5
gaggtgcgaa ggaccacatc tccagtcgga acacgttccg ttagttaatt aaaaaaaaaa 60
aaaaagactt gggtttttga aaacccaaac cagctttctt caaagatgtc accctcattt120
gtacccctgg gcttagcagc gttaagaggg ctcttggctc atggatgttc ctctctggac180
tgactggtga gcaggtccag gcagggcggc ctccgggcag gctcctccct agctccatcc240
agcagcgacg ctcccagcag gctccagatg gcgctcctcc cagaaggagt ggcactgggg300
gcagcaggtg aactgaggat cctcgcccca cagaccgcgg ccgtttttta ttacacacag360
gtaaaaccac a 371
<210>6
<211>393
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>6
tggccaggtg gcaaggtcac cggtggcccg gtcaccgata caggtagtca gcctggatgt 60
tggccgcgat ctcggcctcc cacttgtcac cattgttgag tagcttctcc ttgttgtaca 120
gcaactcctc atgcgtctcg gtggagaact caaagttggg gccctccacg atagcgtcaa 180
cagggcaggc ttcctggcag aaaccacagt agatacactt ggtcatgtca atgtcatagc 240
gtgtagtccg gcggctgcca tctgctcttg gctcagcctc aatggtgatg gcctgtgcag 300
gacagatggc ctcacagagc ttgcaggcga tgcaacgctc ctccccagac gggtagcggc 360
gcagtgcatg ctccccacgg aagcgcggac tca 393
<210>7
<211>462
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>7
agggtgtggg gagagctagg ctcctgatgt ctcctcggca ctggactgtg ggcctggtca 60
gtacacacgg gcttgtagag aaagtcagta tctcattaaa aaaagaagcg gcggcggcgg 120
cagcatcccg gctgtgcaga ccgcagcagt gcatgtgcct aagacaggcc gtaccgtcct 180
ctggaccagc acgctctgga cagcctgagc cagggcaggg tgctgcaaag agggggctgg 240
gcaggcttag gagaccacag ggaaccatac ctcaataggc ttctggcctt gcccagggtc 300
tggaccaaag ggaccccagg ccctgcctct gggtgaaccc gtcatacgtc cataaagtca 360
tcgtcctcgt ctgtctcact ctccaatgag gactcctggc tggatgtctc cagaacctcc 420
agggctggct ggcacaggct ctccttcctc acattggcgg ca462
<210>8
<211>417
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>8
gtgaatcaat aaaacaaaag ctaaggacaa tgagctcaag ttatcgattc ttaagtttca 60
aaatagaaca gtaggaaagc tatgaaagtg ggggggtgga ctttggggtg tatgagcaat 120
aggaatctaa agcatcaaaa cacaggctaa gaaagtctag gacacaagga agactccagc 180
agctccctca gatgtctaat tccggtcatt tacttttcac tctaaaaagt atcttaaatt 240
tttaatattt attagttttt tgttttttca agacagggtc tcacatatag ctctgcctac 300
cccagaactc acaatgaagt ccaggctgac cttgaactca cagagaccct ctagcctctg 360
cctctgtcgt gctggaatta aaggcacatg caccactatg cccagcataa atattta417
<210>9
<211>337
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>9
cacttactaa actaacatta tatgttttac aattttgaac aactttacaa gttactgtta 60
ttttcaattc tgagtagaaa ggtaaactcc aagcaagaca aagccaatag aggcttaagt 120
tcatcaccaa caagtttcaa caatttaccc caaatttact gttaaacagt acctggttga 180
agacacaagc tgcgccttaa ataagctgga gcgactctgg gatgttatga acttaacctt240
gaaaggaaga aggtatagga acttctattt ggtttggatt gtaagaacag acaaattact300
tacagaaact gaattacttc aatacacatg tgaagac 337
<210>10
<211>250
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>10
tatagtaaat acgtgtgttt tccaggatgc cacagaattt cattggaaaa caatgaaact 60
agattaacct gagacccccc ccttcccctt agaaaataag gactatagga ttagaccaca120
agcagactag taaaggggat ggggttgtgg tacacctgat tttagccaga ctttcccaag180
ctaaatccag ataaaactgc ttctgtatta gtaagttggg tgagtgtgta aaatctatca240
ttcaaaaagt 250
<210>11
<211>393
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>11
agagcataga tgtggcaggg tctcagtccc tgcacagaaa tgagagatga acaaaaacga 60
gacacttcca cctggccaga gtctgggagg gcagggagga acacagacct ggacattcgt120
aagaaaaata aaacctaaat caaacattca atcttgtacc caataaaggt ttgaacaggg180
aactcagtca ccaccagttc ccaccctccc ctgccagcac tgaagaaaaa caaaagttca 240
acacacacta agggcttagg aggaaggggc attctcctgc cttcccccaa cccccaagaa 300
tgggctgggg aaaaaacggc tatatttccc caccccttac agtgtcaacc ctacacgagt 360
tctgaatgtg atccgtaaga atcagcagct caa 393
<210>12
<211>396
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>12
tgtgttctta gaaagcaaac ttaatggctt tcaaaccaaa tccttagagc cagtacatca 60
aaggcattgc ggtccacgta tgcaagggtg tgcatgtaga ggccagaggg caactttagg120
agtcagtatt ctccttccac cctcggctcc agagtcgaat tcaggcctca tgagcaacaa180
gcatgttcac ctcttgggcc attcaccagt cccaggatca agacttcttt gatgcttcta240
tttcttccca caatgcagct tcaatttttg aagtgtcata ttctctcatc atatcaaact300
caagccatgg cttgctccac ttctgggctt ctttcatttg ctcttcagtt aaagcaagat360
caaatctgat ccctttaatg ttgaagttcg gacgtt 39權(quán)利要求
1.篩選過氧化物酶體增殖物的DNA芯片，其包括
(i)由121bp到587bp核苷酸組成的探針，其特異性結(jié)合到被過氧化物酶體增殖物誘導(dǎo)表達(dá)的基因；
(ii)由寡聚(dT)15，-(CH2)6-和胺基以相繼次序組成的接頭，寡聚(dT)15的3′末端可以結(jié)合到探針的5′末端；和
(iii)表面包被有與接頭的胺基通過Schiff堿作用連接的醛基的固體基材。
2.權(quán)利要求1的篩選過氧化物酶體增殖物的DNA芯片，其中探針是選自SEQ ID Nos1到12的一種以上基因。
3.制備用于篩選過氧化物酶體增殖物的DNA芯片的方法，其包括如下步驟
(i)合成由121bp到587bp核苷酸組成的探針，該探針特異性結(jié)合到被過氧化物酶體增殖物誘導(dǎo)表達(dá)的基因；
(ii)合成由寡聚(dT)15，-(CH2)6-和胺基以相繼次序組成的接頭；
(iii)將合成探針的5’末端結(jié)合到合成接頭的寡聚(dT)15的3’末端；
(iv)將結(jié)合到探針的接頭與表面通過Schiff堿反應(yīng)包被有醛基的固體基材連接；和
(v)還原未反應(yīng)的醛基。
4.權(quán)利要求3的制備用于篩選過氧化物酶體增殖物的DNA芯片的方法，其中探針是選自SEQ ID Nos1到12的一種以上基因。
5.篩選過氧化物酶體增殖物的試劑盒，包括權(quán)利要求1的DNA芯片和用于標(biāo)記從樣品中分離的RNA合成的cDNA的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸。
6.權(quán)利要求5的篩選過氧化物酶體增殖物的試劑盒，其中熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸是得克薩斯dATP，花青3dCTP，花青5dGTP或熒光素-12dUTP。
7.使用權(quán)利要求5的試劑盒篩選過氧化物酶體增殖物的方法，其包括如下步驟
(i)對動(dòng)物給藥過氧化物酶體增殖物候選化學(xué)品；
(ii)從動(dòng)物分離RNA；
(iii)從分離的RNA使用權(quán)利要求5的試劑盒中熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸合成熒光標(biāo)記的cDNA；
(iv)將合成的cDNA用于在試劑盒中篩選過氧化物酶體增殖物的DNA芯片，以允許雜交；和
(v)洗滌雜交的DNA芯片，并使用掃描器檢查DNA芯片中雜交的探針。
8.權(quán)利要求7的使用權(quán)利要求5的試劑盒篩選過氧化物酶體增殖物的方法，其中熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸是得克薩斯紅dATP，花青3dCTP，花青5dGTP或熒光素-12dUTP。
全文摘要
本發(fā)明涉及DNA芯片，其包括一種探針，該探針可與個(gè)體服藥過氧化物酶體增殖物后表達(dá)的基因特異性雜交，并涉及篩選包括DNA芯片的過氧化物酶體增殖物的試劑盒，制備該試劑盒的方法，和使用該試劑盒篩選過氧化物酶體增殖物的方法。本發(fā)明篩選過氧化物酶體增殖物的DNA芯片包括由121bp到587bp核苷酸組成的探針，其特異性結(jié)合到被過氧化物酶體增殖物誘導(dǎo)表達(dá)的基因；由寡聚(dT)15r(CH2) 6－和胺基以相繼次序組成的接頭，寡聚(dT)15的3′末端可以結(jié)合到探針的5′末端；和表面包被與接頭的胺基通過Schiff堿作用連接的醛基的固體基材。根據(jù)本發(fā)明，過氧化物酶體增殖物誘導(dǎo)體內(nèi)異常細(xì)胞反應(yīng)可以通過使用篩選過氧化物酶體增殖物的試劑盒容易地篩選，這使得在各種化學(xué)品的安全試驗(yàn)方面廣泛的應(yīng)用變成可能。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1798852SQ200480015069
公開日2006年7月5日 申請日期2004年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月31日
發(fā)明者黃丞鏞, 鄭真旭, 吳文珠, 金升俊, 延鐘泌, 金俊燮, 金容賢, 李昌弦, 尹賢圭, 廉惠晶, 康景宣, 李榮純, 樸埈奭, 黃載雄, 金良石, 李婉先, 金起善, 嚴(yán)贊輝, 姜宗秀, 李炅宰, 宋福洙, 金錦珍, 呂燦東 申請人:株式會(huì)社格諾切克, 財(cái)團(tuán)法人Seoul大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力財(cái)團(tuán), 株式會(huì)社艾斯泰克, 株式會(huì)社新元科學(xué)