專利名稱：改變了分支酶活性的小麥和淀粉以及由此而獲得的淀粉產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種麥粒中直鏈淀粉含量相對較高的小麥作物。本發(fā)明也涉及一種胚乳中淀粉分支酶IIa(SBEIIa)活性減少的小麥作物，以及獲得所述作物的方法。本發(fā)明還涉及了由此而獲得的麥粒、淀粉、食物、非食物產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
在谷類食物里，淀粉大約占成熟的谷粒重量的45％～56％。
淀粉中包含有兩種分子類型直鏈淀粉和分支淀粉。直鏈淀粉本質(zhì)上是線性分子，包含鏈接在葡萄糖鏈的oc-1.4。而支鏈淀粉是高度分支的連接在線性鏈上得a-1，6葡萄糖甙鍵。
高等植物中，胚乳中淀粉的合成可以通過一系列在四個關(guān)鍵的步驟起催化作用得生化酶合成，。第一步，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶通過把G-1-P和ATP合成ADP-葡萄糖，激活淀粉單體前體。第二步，活性葡糖糖供體--ADP-葡萄糖--通過淀粉合酶被轉(zhuǎn)換成預(yù)先存在的al-4鍵的非還原性的末端。第三步，淀粉分支酶把由葡聚糖連接的oc-1，4區(qū)劈開，插入分支點。隨后，將裂開的鏈轉(zhuǎn)換為受體鏈，形成新的a-1，6鍵。淀粉分支酶是唯一一種能將a-1，6鍵插入oc-聚葡萄糖的酶，因而在支鏈淀粉的形成過程中起著非常關(guān)鍵的作用。最后一步，淀粉分支酶去掉一部份分支鏈，盡管其中得機理尚未被解決(Myers etal.，2000)。
但是，很清楚地是，高等植物的淀粉顆粒的合成過程，至少包括以上四個步驟。在突變分析(Wang et al，1998，Buleon et al.，1998)或者在通過基因改造的方法來修改基因表達水平(Abel et al.，1996，Jobling et al.，1999，Scwall etal.，2000)時，在高等作物胚乳中發(fā)現(xiàn)每一步驟中的多元同源異構(gòu)體，每個同源異構(gòu)體被認為有特定的作用。雖然如此，目前還不清楚每個同源異構(gòu)體對淀粉生物合成的確切貢獻，也不知道在不同物種之間這些貢獻是否會顯著地不同。在谷類的胚乳里，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶有兩個同源異構(gòu)體一個淀粉質(zhì)體形式，一個是細胞質(zhì)形式(Denyer et al.，1996，Thorbjornsen et al.，1996)。每個形式都包含著兩個亞組類型。在玉米中，縮小的(Sh2)和易碎的(bt2)突變分析表現(xiàn)出大和小的損害(Giroux and Hannah，1994)。玉米中縮小的變體(sh2)和易碎的變體(bt2)，分別表現(xiàn)出大亞組和小亞組的病癥(Giroux andHannan，1994)。在谷類胚乳中，發(fā)現(xiàn)有四類淀粉合成酶，一種同源異構(gòu)體排他性地位于淀粉顆粒、顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSS)中，有兩種被顆粒和可溶片段隔開(SSI，Li et al.，1999a，SSII，Li et al.，1999b)，第四種全部位于可溶片段--SSIII中(Cao et al，2000，Li et al.，1999b，Li et al，2000)。GBSS在直鏈淀粉合成過程起著很重要的作用(Shure et al.，1983)，而SSII和SSIII之間的突變改變了支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)(Gao et al，1998，Craig et al.，1998)。定義SSI活性的作用的突變還沒有記載。
在麥粒胚胎中分支酶有三種表現(xiàn)形式，分支酶I(SBEI)，分支酶IIa(SBEIIa)，分支酶IIb(SBEIIb)(Hedman and Boyer，1982，Boyer and Preiss，1978，Mizuno et al.，1992，Sun et al.，1997))。水稻(Nakamura and Yamanouchi，1992)、玉米(Baba et al.，1991；Fisher et al.，1993；Gao et al.，1997)和小麥(Repellin et al.，1997；Nair et al.，1997；Rahman et al.，1997)的基因組和cDNA序列已經(jīng)被表征。序列排列顯示，核苷酸水平與氨基酸水平有高度的序列相似性，這為分組成SBEI、SBEIIa、SBEIIb提供了可能性。SBEIIa和SBEIIb通常表現(xiàn)出80％的相同序列，特別是基因的中心區(qū)。SBEIIa和SBEIIb也可根據(jù)他們的表達形式來區(qū)分。SBEIIb通常在胚乳中特定地表現(xiàn)，而SBEIIa則在作物的各個組織中表現(xiàn)。
小麥胚乳中，發(fā)現(xiàn)SBEI(Morell et al，1997)排他地出現(xiàn)在可溶片段里，而SBEIIa和SBEIIb則出現(xiàn)在可溶片段和淀粉顆粒聯(lián)合片段中(Rahman et al.，1995)。玉米和小麥中，高直鏈淀粉顯型，即直鏈淀粉放大(ae)基因，是由SBEIIb基因損傷而導(dǎo)致的(Boyer and Preiss，1981，Mizuno et al.，1993；Nishi etal.，2001)。在SBEIIb突突變種中，谷類淀粉胚乳顯示出反常的形態(tài)，直鏈淀粉的含量顯著地提高，剩下的支鏈淀粉的分支率減少，短鏈的比例(DP17，尤其是DP8-12)下降。此外，淀粉的焦化溫度升高。另外，還存在一個相當數(shù)量的原料集中區(qū)域，被定義為直鏈淀粉和支鏈淀粉之間的“媒介體”(Boyeret al.，1980，Takeda，et al.，1993b)。相反，玉米作物的SRECa基因突變是由于增變基因(Mu)嵌插單元導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達中缺乏SBEIIa，它和野生玉米在胚乳淀粉的分支上難以被區(qū)分(Baluth et al.，2001)，盡管它們在葉片淀粉中發(fā)生了改變。同樣地，缺失SBEIIa活性的稻類作物在胚乳中的支鏈淀粉鏈屬性上沒有明顯的改變(Nankamura 2002)。在玉米和水稻中，SBEIIa和SBEIIb基因在基因組中并沒有連環(huán)遺傳。玉米中的無效突變(亦稱零突變)，基于遺傳本底的改變程度以及剩下的分支淀粉的分支率的提高(Shannon and Garwood，1984)，導(dǎo)致了淀粉含量的減少和胚乳中直鏈淀粉含量的增加。采用轉(zhuǎn)位增變基因(Mu)通過轉(zhuǎn)位標簽法識別和分離出相應(yīng)于突變的基因，該基因表現(xiàn)出對被指定的淀粉合成酶(SSII)進行編碼(Gao et al.，1998)。該被指定的SSII酶現(xiàn)在已被認知是谷類SSDI家族的成員(Li et al.，2003)。突變的胚乳中，SBEIIa活性的降低與不活潑的突變有關(guān)。在其他谷類中沒有相應(yīng)的突變被報道過。目前不知道這些發(fā)現(xiàn)是否與其他谷類作物相關(guān)，如小麥。
國際申請WO 94/09144中建議使用官能基因和反官能基因來改變淀粉合成酶(SS)和SBE的天然比率。但是，目前沒有數(shù)據(jù)證實這一被提議的分子策略，也沒有建議明確降低SBEIIa活性。
在馬鈴薯中，單獨的SBEI下行調(diào)節(jié)僅對淀粉結(jié)構(gòu)產(chǎn)生細微的影響(Filpseet al.，1996)，雖然更深入的工作確定了一些定性的改變(affor et al.，1998)。但是，馬鈴薯中SBEII和SBEI下行調(diào)節(jié)相結(jié)合所引起的直鏈淀粉含量的增長，遠大于單獨的SBEII下行調(diào)節(jié)所帶來的增長。(Schwall et al.，2000)。
基于酶作用物的特異性，高等作物中存在兩種分支酶，他們被定義為異淀粉型分支酶和普魯蘭型(pullulanase type)分支酶(Myers et al.，2000)。玉米和稻谷中的Sugary-1突變與這兩種分支酶的缺乏有關(guān)(James et al.，1995，Kubo et al.，1999)。然而，病原突變地圖與異淀粉型分支酶基因處于同一位置。表1中列出了從谷類作物中克隆的有代表性的淀粉生物合成基因。


淀粉被廣泛用于食品、紙張和化學(xué)工業(yè)中。淀粉的物理結(jié)構(gòu)，對淀粉的營養(yǎng)特性和在食品、非食用產(chǎn)品或工業(yè)產(chǎn)品中的加工特性有重大影響。某些特征是由淀粉的物理結(jié)構(gòu)造成的，如支鏈淀粉鏈長的分布、結(jié)晶的類型和程度、其他特性如膠凝溫度、粘性和膨脹體積等。結(jié)晶的改變、糊化的改變或支鏈淀粉的退化，都能帶來支鏈淀粉鏈長的改變。
淀粉組合物，特別是抗性淀粉，具有高含量的直鏈淀粉，對腸胃的健康特別是大腸，有重要的影響。因此，作為食品以促進腸胃的健康，已開發(fā)了某些谷物如玉米，使其含有較高的直鏈淀粉含量?？剐缘矸鄣臓I養(yǎng)效果，主要體現(xiàn)在它給大腸提供營養(yǎng)儲備。其中，腸微生物群發(fā)酵抗性淀粉，生成其他短鏈的脂肪酸而成為本身的能量源。這些短鏈脂肪酸給結(jié)腸粘膜細胞提供營養(yǎng)，促進大腸對營養(yǎng)的吸收，提高結(jié)腸的生理活性。通常，如果不對結(jié)腸提供抗性淀粉或其他食用纖維，結(jié)腸的代謝作用就會相對地鈍化。
同時，經(jīng)化學(xué)或其他方式改造的淀粉可以用來食用，以提供正常的、未經(jīng)改造淀粉所沒有的功能。這些加工處理，要么是修改其他價值成分，要么是去掉某些不需要的內(nèi)容。因此，更可取的是提供以未經(jīng)改造的形式存在的組分的食品源。
全球每年生產(chǎn)的小麥比其它任何一種谷類作物都要多。
相對于玉米或水稻，已知的小麥淀粉結(jié)構(gòu)的改變是有限的，部分原因在于小麥的轉(zhuǎn)變效率落后于其他谷類，面包小麥的六倍體性質(zhì)也是一個原因。小麥中的三個基因組的存在，通過掩蔽每個基因組上的突變而具有緩沖的效果。相反，雙倍體物種的突變就比較容易辨認。玉米或水稻中，SBEIIb的突變是直鏈淀粉混合劑的顯形，但小麥卻不表現(xiàn)出這一特征。目前還不知道小麥的SBEIIa或SBEIIb突變所賦予的顯形。目前已知蠟性基因突變的顯形(GBSS，Zhao和Sharp，1998)和完全缺失SGP-1蛋白質(zhì)的突變的顯形(Yamamori et al.，2000)，它們是以缺失A、B和D基因組特別形式的SGP-1(SSII)蛋白獲得的雜交種系，其中的缺失SGP-1蛋白質(zhì)可以用蛋白質(zhì)電泳法化驗。對SSII缺失的種子進行檢測，顯示該突變源于支鏈淀粉構(gòu)成的改變、淀粉顆粒的變形和直鏈淀粉相對含量提高，該含量大概占淀粉的30-37％，相對于野生的小麥，這個含量提高了約8％(Yamamori et al.，2000)。直鏈淀粉含量可以用色度測量法、電流滴定法(兩者都用碘作指示劑)和伴刀豆球蛋白A法來測定。相對于無突變的淀粉，SSII缺失突變淀粉的膠凝溫度降低了。SBII缺失的麥粒中，淀粉含量從野生麥粒的60％降低到低于50％。
WO 99/14314描述了從節(jié)節(jié)麥(Aegilops tauschii)中隔離SBEII基因，節(jié)節(jié)麥與小麥相近的雙倍體植物，但不產(chǎn)出具有改性淀粉的小麥。
WO 00/15610描述了小麥SBEIIb基因中cDNA的克隆。這些cDNA不會給小麥帶來直鏈淀粉含量的改變，也不會導(dǎo)致小麥淀粉中含有至少50％的直鏈淀粉。
WO 01/62934也描述了小麥SBEIIb基因，建議把分支酶活性的抑制劑引入到小麥作物中，但并沒有傳授小麥淀粉中含有至少50％的直鏈淀粉。
WO 01/32886中描述了小麥胚乳中對某種形式SBEI的cDNA編碼。
被編碼的多肽被發(fā)現(xiàn)優(yōu)先與A型淀粉顆粒結(jié)合，但不會抑制SBEI的活性，也不會改變淀粉顆粒的形態(tài)，也不會提高直鏈淀粉的含量。
因此，直鏈淀粉比例超過50％的小麥尚不為人知，盡管高直鏈淀粉含量的玉米變種和大麥變種都是已知的，但是與高直鏈淀粉含量的小麥相比，這些谷物還是有缺點的，因為小麥在制作諸如面包、通心粉和面條等方面是首選的谷類。
直鏈淀粉含量高的淀粉是有用而首選的，特別是當與改善淀粉合成和其他特性相結(jié)合時。例如，對收割期后的修正的減少。
這樣的的淀粉也是相對抗消化的，給健康帶來了很大的益處。
通常，本領(lǐng)域的技術(shù)人員都知道，本發(fā)明并不限于本說明書的描述，是可變更的和修改的。要知道，本發(fā)明在此描述的，包括這些變化和修改，還包括該文本所提及的和指出的單獨或共同的所有的步驟、特征、組合物和化合物，也包括任何兩個或兩個以上的步驟/特征的組合。
通過本文本，“包括”和“包含”之類的詞，要理解為包含規(guī)定的整體或步驟，但不排除其他的規(guī)定的整體或步驟，除非文中有特別說明。本發(fā)明不局限于所列舉的實施例的范圍。所列舉的實施例，僅僅為了便于說明。功能相同的產(chǎn)品、合成物和方法都落入本發(fā)明的范圍。
該文本后面，有本發(fā)明參考過的公開發(fā)行的著錄的詳細資料列表。本說明書中提及的參考資料是指這些完整的資料。這些現(xiàn)有技術(shù)中的參考資料，包括任何一種或多種現(xiàn)有技術(shù)文件，并不認為是對其的承認，或建議。這些現(xiàn)有在澳大利亞技術(shù)構(gòu)成了普通的通用知識或形成了其中的一部分。
此處，“獲得、取得、源于”之類的詞，應(yīng)被認為是表示某特定的整體來源于特定的種類，但是不要求是直接地獲取。
該文本所涉及的苷殘留物的名稱，都是IUPAC-IUB生物化學(xué)名稱委員會推薦的，其中，A表示腺嘌呤(Adenin)，C表示胞核嘧啶(Cytosine)，G表示鳥嘌呤(Guanine)，T表示腺嘧啶脫氧核苷(Thyidine)。
發(fā)明概述本發(fā)明的第一方面，提供一種從小麥作物獲得的麥粒，這種麥粒的淀粉中直鏈淀粉至少占50％。這種小麥作物具有降低了的SBEIIa基因表達或SBEIIa酶活性，或兩者都是。優(yōu)選的是SBEIIa和SBEIIb的基因表達、酶活性，或兩者都是。該麥?？梢园ɑ蛲蛔?，該基因突變要么是SBEIIa基因突變，要么是外來的核苷酸。這種SBEIIa基因突變抑制SBEIIa基因表達、酶活性，或兩者都是。
另外，該麥?？梢园嗨频腟BEI基因變種，麥粒中還包含改變蛋白質(zhì)的水平和/或ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、GBSS、SSI、SSII、SSIII、異淀粉脫麩酶、普魯蘭脫麩酶的酶活性。該麥粒還包括轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)基因編碼非官能、共抑制、核酶、雙RNA分子。該轉(zhuǎn)基因降低了mRNA編碼的SBEIIa的表達水平。該麥?？梢园⊿BEIIa基因的突變，其中的一種形式是SBEIIa基因的無效突變，在兩或三個基因組中至少有一個基因組是無效突變。
麥粒的淀粉的含量可以至少是40％、50％、55％、60％、70％或80％。該麥粒的另一種形式是，在偏振光下觀察時，該麥粒中至少50％的淀粉顆粒沒有雙折射的特性。該麥粒可以是不縮水的，平均重量是36mg或40mg。另一種形式中，當脫殼之后，該麥粒的淀粉含量(重量比)至少是25％或至少35％，而野生麥粒的淀粉含量至少是90％。所述的麥粒是所有的谷物，有殼的、碾碎的、破裂的、碾壓的、peraled、高梁或者半熟的谷物。
本發(fā)明第一方面的另一種形式，提供了一種從小麥作物中獲得的麥粒，該麥粒含有淀粉和一種基因變種。相對于野生麥粒，這種基因變種導(dǎo)致胚乳中的SBEIIa基因表現(xiàn)的水平和/或SBEIIa酶活性的降低。該基因變種包括SBEIIa基因的突變或引入用于對SBEIIa基因表現(xiàn)的抑制劑進行編碼的核酸；其中，這種麥粒的淀粉中直鏈淀粉成分的含量至少為30％。
本發(fā)明的第二方面，提供一種本發(fā)明第一方面所述的谷物碾磨所得的產(chǎn)品。這種產(chǎn)品包括但不限于由本發(fā)明的麥粒獲得的粉、全麥、粗粒小麥粉、淀粉，或者由所述的麥粒所得的食物產(chǎn)品如粉、全麥、粗粒小麥粉、淀粉、或淀粉或者碾壓的，剝落的或擠壓的產(chǎn)品。這種產(chǎn)品包括從本發(fā)明的麥粒中得到的粉、全麥、粗粒小麥粉、淀粉與從其他源的到的粉、全麥、粗粒小麥粉、淀粉混合所得產(chǎn)品。
本發(fā)明的第三方方面，提供一種從本發(fā)明第一方面所述的小麥作物中獲得的淀粉顆粒或者淀粉。第三方面的一種具體形式中，所述小麥作物的胚乳中有著低水平的SBEIIa酶活性。
本發(fā)明的第四方面，屬于根據(jù)本發(fā)明第三方面所述的淀粉和食物成分或水所得合成物。本發(fā)明第四方面包括食物和非食物合成物，包括所述淀粉與其他淀粉或者含淀粉的產(chǎn)品所得混合物。
本發(fā)明的第五方面，提供一種組合物，該組合物包含本發(fā)明第四方面中所述的淀粉顆粒和另一種食物成分或水。
本發(fā)明的第六方面，提供一種小麥作物，該小麥作物可以用來生產(chǎn)前五個方面所屬的麥粒、淀粉顆?；虻矸邸Ｔ撔←溩魑锛捌涞矸奂瓤梢允寝D(zhuǎn)基因的，也可以是非轉(zhuǎn)基因的。
本發(fā)明的第七方面，提供一種能夠生產(chǎn)麥粒的小麥作物的方法，包括以下步驟1)引入基因變種到小麥作物或者種子里。
2)識別母體小麥作物的后代小麥作物或種子。相對于野生小麥作物或種子，這種小麥作物或種子降低了胚乳中的SBEIIa基因表現(xiàn)的水平和/或SBEIIa酶活性；所述的麥粒含有淀粉，淀粉中直鏈淀粉成分的含量至少為50％。
本發(fā)明的第七方面的第二種形式，提供一種能夠生產(chǎn)麥粒的小麥作物的方法，包括1)引入基因變種到小麥作物或者種子里。其中，所述的基因變種包括SBEIIa基因的變種或引入對SBEIIa基因抑制體編碼的核酸。
2)識別母體小麥作物的后代小麥作物或種子。相對于野生小麥作物或種子，這種小麥作物或種子降低了胚乳中的SBEIIa基因表現(xiàn)的水平和/或SBEIIa酶活性；所述的麥粒含有淀粉，淀粉中直鏈淀粉成分的含量至少為30％。引入基因變種的步驟可以包括引入表現(xiàn)出SBEIIa基因表達抑制體的外來的核酸，可以包括引入母體小麥作物的突變體。
本發(fā)明的第七方面的第三種形式，提供一種能夠生產(chǎn)麥粒的小麥作物的方法，包括1)引入基因變種到小麥作物或者種子里，其中，所述的基因變種包括SBEIIa基因的變種；2)識別母體小麥作物的后代小麥作物或種子，相對于野生小麥作物或種子，這種小麥作物或種子降低了胚乳中的SBEIIa基因表現(xiàn)的水平和/或SBEIIa酶活性；3)注入基因變種到母體小麥作物或者種子里，其中，基因變種包括SEBIIb基因的突變；4)識別母體小麥作物的后代小麥作物或種子，相對于野生小麥作物或種子，這種小麥作物或種子降低了胚乳中的SBEIIb基因表現(xiàn)的水平和/或SBEIIa酶活性；5)用胚乳中含有低水平SBEIIb基因表達或/和SBEIIb酶活性作物，雜交胚乳中含有低水平SBEIIa基因表達或/和SBEIIa酶活性作物；識別含有SBEIIa和SBEIIb的低水平的基因表達或/和酶活性的后代小麥作物或者種子。
本發(fā)明的第七方面的第四種形式，提供一種生產(chǎn)小麥作物的方法，所述的小麥作物中，其麥粒的淀粉中，直鏈淀粉至少占50％，胚乳中SBEIIa酶活性降低。所述的方法包括1)識別出小麥作物或者種子。所述的小麥作物或種子在小麥的A、B或D基因組中具有降低了的SBEIIa活性表現(xiàn)；2)用第二種具有低水平SBEIIa活性的小麥作物雜交所述的小麥作物或者從上一步驟中產(chǎn)生的小麥作物；3)用具有低SBEIIb酶活性水平的小麥作物與具有低SBEIIa酶活性水平的小麥作物雜交；識別含有低水平的SBEIIa與SBEIIb酶活性的小麥作物。本發(fā)明第七方面所述的小麥作物優(yōu)選溫帶小麥(Triticum aestivum ssp.aestivum)。
本發(fā)明的第八方面，提供一種制造改造淀粉的辦法。包括用上述的方法對小麥作物進行改造和提取具有改造屬性的淀粉。
本發(fā)明的第九方面，提供一種識別小麥作物或種子以獲得SBEIIa基因突變或者SBEIIb基因突變的方法，包含的步驟是用連接在SBEIIa基因或SBEIIa基因上的分子標志篩選一部分小麥作物或者種子；以是否具有所述的分子標志來識別小麥作物或種子。
本發(fā)明第九方面的第二種形式，提供一種用來識別SBEIIa基因突變或SBEllb基因突變的小麥作物或者種子的方法。包含的步驟是分別用SBEIIb蛋白質(zhì)或SBElla蛋白質(zhì)抗體優(yōu)選一部分小麥作物或種子；根據(jù)是否含有抗體結(jié)合來識別作物或種子。
本發(fā)明的第十方面，提供一種從小麥作物獲得谷粒，包含有基因突變，其中染色體2A的長臂上沒有SBEIIa基因，或者是染色體2A長臂上的SBEIIa基因包含著基因突變，該基因突變相對于野生麥粒導(dǎo)致了胚乳中SBEIIa蛋白質(zhì)和/或SBEIIa酶活性的減少。所述的基因突變可以是SBEIIa基因的無效突變，也可以是SBEIIa基因的部分缺失。所述的麥粒進一步包括染色體2A的長臂上沒有SBEIIb基因或者染色體2A長臂上的SBEIIb基因包含著突變，該突變相對于野生麥粒導(dǎo)致胚乳中SBEIIb蛋白質(zhì)和/或SBEIIb酶活性的減少。所述的SBEIIa缺失和SBEIIb缺失，可能破壞染色體2A長臂上SBEIIa和SBEllb基因的表達。
所述的小麥作物可以是基因突變的硬質(zhì)小麥，該基因突變相對于野生麥粒導(dǎo)致染色體2B長臂上被SBEIIa基因編碼的淀粉分支酶活性的減少。更進一步的基因突變可以包括染色體長臂2B上沒有SBEIIa基因，或染色體2B長臂上的SBEIIa基因包含著相對于野生麥粒導(dǎo)致了胚乳中SBEIIa酶活性減少的基因突變。
所述的小麥作物可以是可能額外地含有基因變種的溫帶小麥(Triticumaestivum ssp aestivum)并相對于野生麥粒導(dǎo)致被染色體2B和/或染色體2D長臂上SBEIIa基因編碼的淀粉分支酶活性減少。更進一步的基因突變包括所述的染色體長臂上沒有SBEIIa基因或者所述的染色長臂上的SBEIIa基因發(fā)生突變，相對于野生麥粒，該突變導(dǎo)致了胚乳中SBEIIa酶活性的減少。
所述的小麥作物可以被引入對SBEIIa基因表達和/或SBEIIa酶活性進行編碼的核酸中。相對于野生麥粒，SBEIIa酶活性減少了至少40％，該麥粒淀粉中直鏈淀粉的含量是至少30％或至少50％。該麥?？梢允遣豢s水的，且平均重量是36mg。在偏振光下觀察，該麥粒的淀粉顆粒至少50％表現(xiàn)出不具有雙折射特性。該麥粒脫殼之后，淀粉含量至少占25％(w/w)，或淀粉含量至少是野生麥粒淀粉含量的90％。
相對于野生麥粒的支鏈淀粉，將支鏈淀粉異淀粉酶脫麩之后進行測量，本發(fā)明中任何形式的麥粒的支鏈淀粉鏈長度片段減少了4～12dp。
相對于野生麥粒，所述的小麥作物更進一步包含降低了SBEI蛋白質(zhì)、SBEI酶活性的水平，或兩者都是，而且進一步包含改變了DP-葡萄糖焦磷酸化酶、GBSS、SSI、SSII、SSIII、同工型分支酶或普魯蘭型分支酶中的部分或全部酶的水平。
本發(fā)明第十方面的各種形式是關(guān)于該麥粒、從該麥粒中提取的淀粉顆粒、該麥粒或淀粉生產(chǎn)的產(chǎn)品、比如面粉、粗面、細面等。


圖1所示是對應(yīng)于六倍體小麥(溫帶小麥)D基因組的SBEIIa基因的A.tauschii中淀粉分支酶IIa基因(wSBEII-D1)的序列[序列號No.1]。
圖2所示是溫帶小麥作物局部的SBEIIb基因序列(wbe2b基因組)[序列號No.2]。
圖3是雙RNA結(jié)構(gòu)的示意圖，其中A，所用到的基因元素的順序是官能方向上的啟動子、SBEIIa、SBEIIb基因序列(外含子1、2和3)，非官能方向上的內(nèi)含子(內(nèi)含子3)、SBEIIa或SBEIIb基因序列(外含子1、2、3和4)，和轉(zhuǎn)錄終結(jié)者/多聚腺苷酸化的序列。
B，ds-SBEIIa和ds-SBEIIb基因的轉(zhuǎn)錄形成了帶有雙鏈區(qū)的“發(fā)夾”RNA結(jié)構(gòu)。所述的雙鏈區(qū)由官能和非官能序列之間的雜交形成。與GT核苷和AG核苷交界的的內(nèi)含子序列被剪掉了。
圖4所示是通過光學(xué)顯微鏡觀察到的淀粉顆粒。其中
A)含有來自ds-SBEIIa轉(zhuǎn)基因品種83.1b的野生種類淀粉顆粒的小麥種子。
B)含有來自ds-SBEIIa轉(zhuǎn)基因改造品種50.1b的變形淀粉顆粒的小麥種子。
圖5是圖4下的兩種淀粉顆粒在偏振光下觀察到的雙折射現(xiàn)象示意圖。
圖6是部分小麥SBEIIa cDNA序列比較圖。Sbe9相應(yīng)于AF338432.1的一部分。圖中所示的序列圖分別是Y11282[序列號No.3]，sr997[序列號No.4]，sr995[序列號No.5]，sbe9[序列號No.6]。
圖7是在最前面的63個氨基酸上進行的部分小麥SBEIIa序列的堆積比較圖。圖中指出了相應(yīng)于克隆的最可能的基因組的位置。
圖8是推知的D基因組多肽(sr854)氨基酸序列[序列號No.7]與來自A或B基因組(Y1182)產(chǎn)品的序列[序列號No.8]的比較圖。斜體部分是轉(zhuǎn)序列(位置1-54)。
圖9是從各種小麥添附物(列1-11)的SBEIIb基因的內(nèi)含子3區(qū)PCR放大圖，采用的啟動子是ARA19F和ARA23R，并經(jīng)Rsa1煮解。與A、B、D相基因組對應(yīng)的群組都箭頭標識。列3(Aus17340)和列5(Aus10103)沒有D基因組的特征標記，而列8(Aus12509)和列9(Aus12565)沒有B基因組的特征標記。
圖10是來自采用SBEIIb基因內(nèi)含子3區(qū)探測的小麥的HindIII煮解DNA的DNA雜合法。各列分別對應(yīng)1)Aus12565，2)Aus12509，3)Aus10103，4)CSDT2DL-4，5)Aus12530(硬質(zhì)小麥)，6)CSDT2BL-9，7)Aus6323，8)CSDT2DS，9)Aus17340，10)Aus12745，11)CSDT2DL-4，12)節(jié)節(jié)麥。
圖11是篩選F2世代，F(xiàn)2通過Aus17340a和Aus12590雜交得來，用SBEIIb基因內(nèi)含子3區(qū)的PCR放大，采用的啟動子是AR2b19cF和AR2b23cR，接著用RsaI煮解。列8沒有B和D基因組標記，因此作物BD54對應(yīng)一個BD雙重零種系。
圖12是HindIII的DNA雜合法(列1至4)和EcoR1(列5至8)煮解的BAC克隆，采用SBEII基因的內(nèi)含子3區(qū)做探測器。各列分別對應(yīng)1)BAC 4，2)BAC 5，3)BAC 9，4)BAC 12，5)BAC 4，6)BAC 5，7)BAC9，8)BAC12。
圖13中A是把wSBEII-DA1探針和重復(fù)的DNA序列探針(pSc119.2)應(yīng)用到A.tauschii染色體(右邊的大圖和左下角的小圖)和小麥染色體(左上角的小圖)的FISH；B是小麥染色體的FISH和SBEIIb探針。
圖14是野生的中國春小麥和SGP-1零小麥作物種子生長的不同階段(開花后10、15、25天，M＝成熟)的顆粒束縛蛋白的SDS-PAGE分析圖。圖中，測量了銀跡膠體的蛋白質(zhì)譜帶強度。成熟的中國春小麥種子中GBSS的譜帶強度標準值為100，其他的酶的譜帶強度表示為與該值的百分比。a)GBSS，b)SSI，c)SBEII?？瞻妆硎緵]有SGP-1。該圖是中國春小麥和SGP-1零種系的顆粒束縛蛋白質(zhì)的凝膠電泳圖。
圖15是可溶片斷的SBEIIa和SBEIIb的相對數(shù)量。掃描了SDP-PAGE的免疫印跡，測量了蛋白質(zhì)譜帶強度。從膠體所用的SBEIIa-SBEIIb混合蛋白質(zhì)可以評估出蛋白質(zhì)的數(shù)量。
圖16中A，是小麥(cv Rosella)胚乳分支酶活性的陰離子交換色譜圖。胚乳可溶性蛋白質(zhì)和氫硫化銨被分餾，并被套色復(fù)制到Sephacry S-200柱中，優(yōu)先應(yīng)用到RESOURCE Q陰離子交換柱。
B，是小麥胚乳SBEI的WBE1抗體的免疫缺失分析圖，SBEI從不變性的PAGE中分離出來。標A和B的SBEI蛋白質(zhì)群組分別來自A和B基因組；標Di和Dii的蛋白質(zhì)群組來自D基因組。各列分別對應(yīng)1)CS，2)N7BT7A，3)N7AT7B，4)N7DT7A。
C，是純化片斷的是免疫缺失分析圖，使用WBE1抗體表現(xiàn)了陰離子交換色譜法的活性峰值。各列分別是1)胚乳天然可溶的提取液，2)對應(yīng)1、3峰值的片斷，3)對應(yīng)峰值2的片斷。
圖17是從VC3.1.11和CS7AL-15采用WEB I抗體，免疫缺失法篩選雙單倍體后代隔離SBEI同功異構(gòu)體的圖。列1至14對應(yīng)雙單倍體后代種系，列6是三倍體零SBEI突變品種，定為A113，列7是SBEI同功異構(gòu)體的正常種系，定為D28。
圖18是γ射線誘導(dǎo)突變的種子的DNA的PCR放大圖(列1至6)，這種種子是Veery 3和Gabo 1BL.1RS雜交得到的，用AR2b19cF/AR2b23cR作為啟動子。列2對應(yīng)于MLT2B8的突變種子，列7對應(yīng)于中國春小麥。
圖19是小麥品種的PCR放大圖，使用特定的A基因組啟動子ARIIaAF/ARIIaAR。列1至5分別為中國春小麥、MLT2B8、MLT2D1、Dt2AS和BD219(B和D基因組的SBEIIa和SBEIIb均為零突變的作物)。
圖20分別是小麥品種Acc144008和Acc144087的淀粉瓊脂糖(凝膠)CL 2B凝膠色譜圖，用淀粉化驗工具(Sigma)化驗.
圖21是淀粉鏈長的比較圖。這些淀粉來自轉(zhuǎn)基因小麥和非轉(zhuǎn)基因控制的小麥NB1。由非轉(zhuǎn)基因控制來的淀粉的低聚糖個體的總質(zhì)量的百分數(shù)被從轉(zhuǎn)基因種系淀粉的相應(yīng)數(shù)值中減除。所用樣品是085(◆)，025(▲)，008(○)。
發(fā)明的具體描述小麥中SBEIIa的改造本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)小麥胚乳中SBEIIa活性的減少能帶來改良的淀粉產(chǎn)物，更具體地，是富含直鏈淀粉的小麥麥粒。該發(fā)現(xiàn)一個意想不到的結(jié)果是，相反，在玉米/水稻中SBEIIa的突變不會改變其直鏈淀粉/支鏈淀粉的含量(Blauth et al.，2001，Nakamura，2002)。在進一步的實施例中，存在一個或多個附加的淀粉生物合成酶活性的改變。比如SBEIIb以及SBEIIa活性的降低。驚奇的發(fā)現(xiàn)小麥中SBEIIa與SBEIIb是緊密地連環(huán)遺傳的，這一發(fā)現(xiàn)有助于對SBEIIa與SBEIIa基因突變的活性編碼，而玉米和水稻中SBEIIa與SBEIIb則不連在一起，。我們還發(fā)現(xiàn)，SBEIIa與SBEIIb活性減少的小麥的麥粒，是不縮水的。
生產(chǎn)小麥作物的方法本發(fā)明的一方面，提供一種生產(chǎn)小麥作物的方法。所述的小麥作物，其麥粒中含有改造過的淀粉，更具體地說，淀粉中直鏈淀粉的含量至少增加到30％。通常，在六倍體小麥和硬質(zhì)小麥里，淀粉中直鏈淀粉含量是18％～30％，在某些突變(缺乏SGP-1)，直鏈淀粉的含量可以增加到35％。本發(fā)明的一個具體實施中，把一個基因突變引入到母體小麥作物或種子內(nèi)，以獲得一種小麥作物或種子，這種小麥作物或種子生產(chǎn)的麥粒，淀粉中直鏈淀粉至少占30％。在這里，淀粉中直鏈淀粉的含量被定義為重量/重量(w/w)，即，麥粒中直鏈淀粉的重量與麥粒的淀粉重量的比值。在進一步的實施例中，淀粉中直鏈淀粉的含量(w/w)至少是40％、50％、60％、65％，70％或至少75％。在本發(fā)明更一個實施例中，該方法生產(chǎn)的小麥作物的麥粒，淀粉中直鏈淀粉含量(w/w)至少占80％、至少90％。
在本發(fā)明的再一個實施例中，該方法包括改變、減少小麥中胚乳中淀粉分支酶IIa(SBEIIa)蛋白質(zhì)和/或SBEIIa酶活性。就是說，被引入到小麥作物中的基因變種，直接或間接地帶來了SBEIIa含量的改變，從而帶來了上述的淀粉的改變。在本發(fā)明的另外一個實施例中，沒有和前面的實施例互相排斥，該方法包括對小麥胚乳中SBEIIa基因表達水平的改變、減少，或者包括小麥中SBEIIa基因的突變，其中，胚乳中SBEIIa活性是被降低了的。SBEIIa基因和其他基因表達水平的降低，可以通過引入核酸來達到。例如，該核酸可以是轉(zhuǎn)基因，轉(zhuǎn)基因?qū)σ种品肿舆M行編碼，該抑制分子包括非官能、共抑制、核酸性酶或雙RNA分子。
在這里，術(shù)語“改變”、“增加”、“增加的”、“降低”、“減少的”、“抑制”等類似術(shù)語是相對的術(shù)語，即，相對于野生的或未經(jīng)改造的狀態(tài)。“蛋白質(zhì)水平”是特定蛋白質(zhì)的量。例如SBEIIa，這可以通過該領(lǐng)域內(nèi)已經(jīng)知道的任何一種方法來測量。例如，DNA印跡分析法(Western blot analysis)或其他免疫方法。“酶活性”是在酶化驗中特定的酶的量。令人感激的是，酶活性可能是在突變中改變的，而不是被蛋白質(zhì)本身的表達水平(量)改變的。相反，如果產(chǎn)出了過多或過少的活性蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的量被改變了，但是活性還是保持不變的。當然，量與活性的同時減少是可能的，例如在當給酶編碼的基因失活時。在某些實施例中，改造后的小麥作物胚乳中蛋白質(zhì)水平或活性水平比未經(jīng)改造的減少了至少40％或60％、或至少75％、或至少90％、或至少95％。蛋白質(zhì)活性或酶活性，或基因表達水平的減少，可以在麥粒生長的任何階段發(fā)生，特別是淀粉在生長的胚乳中合成時的麥粒飽滿的階段，或者在麥粒生長成熟的所有的階段。
“淀粉”被定義為多聚糖，本質(zhì)上由α-吡喃型葡萄糖個體構(gòu)成。淀粉是小麥中主要的炭水化合物，在淀粉質(zhì)粒體中合成，以顆粒狀存在和被保存。淀粉包括直鏈淀粉和支鏈淀粉。直鏈淀粉是本質(zhì)上線性的α-1，4-D-吡喃型葡萄糖聚合體；直鏈淀粉主要是支鏈α-1，4連接的α-1，4-D-吡喃型葡萄糖個體短鏈，分支點是α-1，6-糖苷鍵。野生作物的小麥淀粉中，直鏈淀粉占20％-30％，支鏈淀粉占70％-80％。直鏈淀粉和支鏈淀粉的一個明顯區(qū)別就是他們的分子量。直鏈淀粉是雙螺旋結(jié)構(gòu)，分子量為104～106；而支鏈淀粉的分子量為107～108。最近的研究發(fā)現(xiàn)，大約0.1％的糖苷分支點發(fā)生在直鏈淀粉中，因此，直鏈淀粉被描述為“本質(zhì)上線性的”。直鏈淀粉被定義為由α-1，4吡喃型葡萄糖連接的、類直鏈淀粉的長鏈分支淀粉組成的本質(zhì)上線性的分子(參考“中間產(chǎn)物”或“類直鏈淀粉的支鏈淀粉”，Takeda et al.，1993b；Fergason，1994)。直鏈淀粉的含量可以通過本領(lǐng)域內(nèi)包括分子篩高效液法(HPLC)在內(nèi)的任何已經(jīng)知道的方法來測定。例如，90％(w/v)的二甲基亞砜(DMSO)，伴刀豆球蛋白(concanavalin)A方法(Megazyme Int，Ireland)，最好是碘量法，例如實例1中所述的。HPLC法可以包括也可以不包括淀粉的脫支(Batey andCurtin，1996)。從麥粒的重量和直鏈淀粉的含量，可以計算出每單位麥粒中直鏈淀粉的量，并與基因改造的和控制種系進行比較。
在另一個實施例中，所述的方法包括用本領(lǐng)域中已知的任何的方法來測定小麥胚乳中SBEIIa的活性量。在某些實施例中，采用了蛋白質(zhì)印跡法、ELISA化驗法等免疫缺陷法測定了蛋白質(zhì)水平；或者用RNA印跡雜交法、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應(yīng)(RC-PCR)等領(lǐng)域內(nèi)已知的方法測定相應(yīng)的mRNA水平。在另一個實施例中，所述的方法包括選出一種改變了胚乳SBEIIa蛋白質(zhì)水平或SBEIIa酶活性水平的小麥作物或種子。這個選擇的步驟可以基于SBEIIa蛋白質(zhì)水平或SBEIIa酶活性水平的降低，或者基于小麥作物的麥粒的顯型，如直鏈淀粉的增加/分支淀粉的減少，或者一些可見的顯型，例如縮水的麥?；蚋脑旌蟮念w粒性質(zhì)。
令人感激的是，本發(fā)明包括用本文中所述的任何方法直接地、間接地識別改變了淀粉性質(zhì)的小麥作物的方法，例如，測定小麥作物或種子中存在基因變種。這些作物可以是小麥作物世代--如小麥繁殖--中的一株，SBE活性可以用酶化驗直接測量，例如，通過磷酸化酶刺激化驗法(Boyerand Preiss，1978)。該方法用磷酸化酶結(jié)合葡萄糖1-磷酸鹽和α-D-葡萄糖來測量SBE的刺激性。SBE活性可以通過碘印跡法測量，它所測量的是來源于葡萄糖聚合物的分支的葡萄糖-多碘聯(lián)合體的吸光率的降低。SBE活性也可以用分支鏈化驗法來化驗，該方法是測量底物上被減少了的直鏈淀粉的還原性端的產(chǎn)出，并經(jīng)異淀粉酶消化(Takeda et al.，1993a)。更適宜地，是以SBEI或SBEIIb的活性的存在來測量SBE的活性。SBE的同功異構(gòu)體顯示出不同的底物特異性。例如，SBEI在分支直鏈淀粉中顯示出更高的活性，而SBEIIa和SBEIIb在分支的直鏈淀粉底物上顯示出更高的活性。這幾個異構(gòu)體可以根據(jù)被轉(zhuǎn)換的葡聚糖鏈的長度來區(qū)分。SBE蛋白質(zhì)也可以通過使用特定的抗體來測量。SBEII活性可以在胚乳發(fā)育過程中谷粒成長的時期測量，也可以在蛋白質(zhì)還是相等而沒有被改變的成熟谷粒里通過免疫化驗方法來測量。
本發(fā)明另一個方面，提供一種改變、尤其是減少了小麥胚乳中多種淀粉合成酶活性的方法，其中一種酶是SBEIIa，這種小麥的麥粒中，直鏈淀粉至少占淀粉量的50％。在某些實施例里，SBEIIa和SBEIIb蛋白質(zhì)、或SBEIIa和SbeIIb酶活性的水平是被減少了的，或者是SBEIIa、SBEIIb、SBEI這三者的都被減少了。其他與SBEIIa結(jié)合的，可能被改變的淀粉生物合成酶是SSI、SSII或SSIII。淀粉分支酶也可以被改變，如異淀粉酶或普魯蘭酶的活性。只要SBEIIa被改變了，與上述的酶結(jié)合的任何的酶都被改變。在又一個實施例里，一個或多個淀粉生物合成酶的活性在作物胚乳之外的其他組織中被改變。如葉片中SBEI或SBEII的活性可以被增加以補償對SBEIIa抑制分子進行編碼的轉(zhuǎn)基因造成的活性損失。所述的SBEIIa抑制分子主要在胚乳中表現(xiàn)。如，所述的改造可以是量的增加或減少，或在時間表現(xiàn)上的改變?；蛘撸ㄟ^結(jié)合SBEIIa的減少和一個或多個淀粉生物合成酶的過度表達，可以進一步提高淀粉合成酶。對酶的這種基因編碼來自多個源，例如細菌或小麥外的其他來源?？梢孕拚愿淖冞@些酶的催化屬性，例如，改變酶的溫度差別(見WO94/09144)。
高直鏈淀粉顯型可以通過SBEIIa基因表達的部分或全部抑制或SBEIIa和SBEIIb基因表達的部分或全部抑制來達成。基因被抑制程度，在一定程度上決定了麥粒中形成的淀粉的特性。從改良小麥胚乳中提取的蛋白質(zhì)的凝膠電泳能夠顯示SBEIIa和/或SBEIIb活性改變的種類和程度。這些改變可以是SBEIIa和/或SBEIIb活性的減少、活性的完全消失、SBEIIb分布的改變或胚乳中其他酶的分布的改變。要做出這些檢驗，可以從該小麥胚乳中提取淀粉并分析其中的蛋白質(zhì)。Rahman et al，1995已經(jīng)描述過一個實例。該領(lǐng)域中著名的技術(shù)如SDS-PAGE和免疫法都是在可溶片段和淀粉顆粒片段上實施的，其結(jié)果用來識別被SBEIIa和/或SBEIIb酶改變的作物或麥粒。
小麥作物本發(fā)明的另一方面，提供一種能夠生產(chǎn)在麥粒的淀粉中直鏈淀粉的含量至少占30％的小麥作物。在另一個實施例中，直鏈淀粉的含量至少占40％、至少占50％、至少占55％、至少占60％、至少占65％、至少占70％、或至少占80％。在又一個實施例中，相對野生麥粒，小麥作物中麥粒的淀粉內(nèi)直鏈淀粉的含量是上述的任何一種，這種小麥作物還包括導(dǎo)致了胚乳中SBEIIa基因表達和/或SBEIIa基因活性水平的降低的基因突變。在一首選的實施例中，這種基因突變包括了SBEIIa基因的突變或引入的核酸，這種引入的核酸對SBEIIa基因表達抑制子進行編碼。這些抑制子包括非官能、共抑制、核酶或雙RNA、或抑制SBEIIa表達和/或SBEIIa活性的相似分子。
在這里，小麥作物被定義為具有小麥屬基因的物種中的任何作物。其中，這種小麥物種是能夠商業(yè)種植的，例如，包括Triticum aestivum L.ssp.aestivum(普通或面包小麥)、其他小麥的亞種、Triticum turgidum L.ssp.Durum(硬質(zhì)小麥)、Triticum monococcum L.ssp.monococcum(栽植的單粒小麥或小斯佩而特小麥)、Triticum timopheevi ssp.timopheevi，Triticum turgigum L.ssp.Dicoccon(可栽培的雙粒小麥)以及其它小麥亞種Triticum turgidum(菲爾德曼)。這種小麥可以是具有AABBDD型基因組德六倍體小麥；或者是具有AABB型基因組四倍體小麥。因為根據(jù)本發(fā)明，可以通過雜交把小麥的基因突變轉(zhuǎn)移到某些相關(guān)的物種中，如黑麥、大麥。本發(fā)明還包括由此而得的雜交物種，包括小麥與黑麥的雜交所得的黑小麥。在一個具體實施例中，小麥作物是夏季小麥的物種，確切地說，是夏季小麥的亞種。或者，由于突變或轉(zhuǎn)基因能夠容易地從夏季小麥轉(zhuǎn)移到硬質(zhì)小麥中，所以更優(yōu)選地，該小麥作物是硬質(zhì)小麥。
本發(fā)明還提供一種胚乳中SBEIIa蛋白質(zhì)和/或SBEIIa酶活性被降低的小麥作物。相對野生麥粒的淀粉，這種小麥作物能夠產(chǎn)出淀粉中直鏈淀粉的含量增高了德麥粒。SBEIIa水平的減少可以發(fā)生在麥粒成長過程中，或者貫穿整個成熟的過程。在另一個實施例中，相對于野生的麥粒，這種麥粒胚乳中SBEIIa水平被減少了至少50％、至少75％、至少90％。其中，在遺傳領(lǐng)域，“野生的”取其通常的意思，包括小麥栽培作物或基因沒有被修改的小麥。
本發(fā)明也提供一種作物或者麥粒的后代，這種后代在基因型和/或顯型方面有著母體小麥作物所期望的特性。本發(fā)明還延伸到這種小麥作物繁殖得到的、具有期望特性的產(chǎn)品，如培養(yǎng)的組織或細胞。
本發(fā)明中還包含被改變的，確切地說，是減少SBEIIb或其他淀粉生物合成酶水平、SBEIIa酶活性的小麥作物。要產(chǎn)出SBEIIa和SBEIIb活性降低的作物，可以通過將SBEIIb降低的作物與SBEIIa降低的作物進行雜交，或者通過引入對抑制SBEIIa和SBEIIb基因表達的分子進行編碼的轉(zhuǎn)基因。因為小麥中SBEIIa和SBEIIb基因緊密聯(lián)結(jié)，要生產(chǎn)SBEIIa和SBEIIb活性都降低的作物，可以通過識別缺乏被小麥中一個基因組編碼的SBEIIa和SBEIIb同工異構(gòu)體的作物，然后把這些作物雜交以生成至少被兩個基因組編碼的同工異構(gòu)體降低的作物。
本發(fā)明也包括其他本底或其他品種的基因突變或基因突變。所述的其他品種能夠和上述的小麥作物雜交。突變后的作物可以與包含更多期望基因背景的作物相交。初次雜交之后，適當數(shù)目的不期望的本底被剪除并去除。所期望的基因本底包括適當數(shù)目基因組合。所述的基因提供商業(yè)收益和其他特性，如農(nóng)學(xué)性能、非生物應(yīng)力抵抗力。所述的基因本底可以包括改變淀粉生物合成或者修正基因，例如，從其他小麥種系中來的具有縮水后的胚乳的基因，其中的病原基因并不清楚。
所說的作物可以是轉(zhuǎn)基因的，也可以是非轉(zhuǎn)基因的。
本發(fā)明還提供一種突變的小麥作物，相對于野生麥粒，該作物中染色體2A(2AL)長臂上缺失SBEIIa基因，或者染色體2A長臂上的SBEIIa基因包括著導(dǎo)致所述的麥粒胚乳中SBEIIa酶活性水平降低的突變。雖然從2400個小麥添附物中進行了廣泛的篩選，本發(fā)明并沒有找到天然生長的此類作物。這意味著2AL上SBEIIa基因功能性的保持力的選擇是自然發(fā)生的。然而，這種作物可以在突變發(fā)生后被識別和產(chǎn)出。這種作物并不是某些市場上所需要的非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。這些作物可以是面包小麥、硬質(zhì)小麥或其他小麥。在首選的實施例中，這種小麥作物包含著至少部分去除了SBEIIa基因，或延伸到染色體2AL上至少SBEIIb的部分缺失。正如該領(lǐng)域中已知的，六倍體小麥如面包小麥，包含著三個基因組，這三個基因組通常被指定為A、B和D基因組。而四倍體小麥如硬質(zhì)小麥，包含兩個基因組，這兩個基因組通常被指定為A和B基因組。每個基因組包括7對染色體，在減數(shù)分裂過程中，可以通過細胞學(xué)方法觀察到這些染色體。通常根據(jù)尺寸大小由長到短的順序來指定這些染色體，因此染色體2就是每個基因組中第二大的染色體。每個染色體都有一個著絲點，染色體2是以這個著絲點非對稱分布的。染色體2的兩條臂分別被定義為“長臂”和“短臂”。在這里，為了統(tǒng)一，“染色體2A的長臂”定義為從著絲點到長臂末梢之間的區(qū)域。同樣，“染色體2B的長臂”和“染色體2D的長臂”的定義方式與上相同，除非它們分別涉及小麥染色體2的B或D基因組。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，小麥的染色體2上，SBEIIa和SBEIIb基因是緊密相連的。在特定的實施例中，小麥作物包含至少具有SBEIIa基因突變的染色體2AL的主要部分(超過50％)。就是說，染色體2AL本質(zhì)地存在著，至少包含A基因組的SBEIIa基因的突變。2AL的存在可以用細胞學(xué)的技術(shù)測出，例如，在原位雜交技術(shù)(參見實施例9)，或采用2AL特定的分子標記。在優(yōu)選的實施例中，該小麥作物對所述突變來說是同型結(jié)合的。所述的突變可以是無效突變，也可以缺失。
在特定的實施例中，等位基因的刪減來源于MLT2B8或MLT2D1作物。由于這些作物上的SBEIIa等位基因突變發(fā)生在2AL染色體上，通過雜交，可以把這些等位基因引入到各種面包小麥、硬質(zhì)小麥中，并由此產(chǎn)出麥粒和淀粉。這些等位基因可以與其他有用的淀粉生物基因、等位基因、其他有用的基因特性結(jié)合。
明顯地，本發(fā)明延伸到生產(chǎn)、識別所述的小麥作物及其所生產(chǎn)的麥粒的方法。
麥粒本發(fā)明還提供一種相對于野生麥粒而言淀粉成分被改變的麥粒。在這里，麥粒被定義本質(zhì)上成熟的麥粒，包括出于商業(yè)目的而收割的麥粒。在一個實施例中，淀粉被至少部分的改變，是由于麥粒胚乳生長過程中SBEIIa活性的減少。在進一個實施例中，沒有與前面的實施例互相排斥，麥粒包含著提高了比例的直鏈淀粉(占總淀粉量的百分比)。這可以被確定，具有與野生的麥粒的淀粉相比降低了支鏈淀粉的含量。野生麥粒淀粉中，直鏈淀粉大約占20％～30％，支鏈淀粉大約占70％～80％。本發(fā)明中，麥粒的淀粉中直鏈淀粉至少占大約50％(w/w)。在又一個實施例中，在胚乳的生長過程中，SBEIIa和SBEIIb的活性都是降低了。在再一個實施例中，SBEI的活性也被減少了。在進一個實施例中，用該領(lǐng)域內(nèi)廣泛理解的方法來測定淀粉中直鏈淀粉的比例(w/w)，分別是至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、或至少90％?？梢酝ㄟ^光學(xué)顯微鏡觀察到的雙折射的損失，或該領(lǐng)域中其他已經(jīng)掌握的方法測定淀粉顆粒反常的形態(tài)，都顯示出直鏈淀粉含量的提高。在一特定的實施例中，測定直鏈淀粉的含量是采用碘量法，也可以采用分光光度法，例如Morrison和Laignelet使用的的方法(1983)，或者高性能液相色譜法(HPLC，例如Batey和Curtin使用的方法，1996)。
在另一個實施例中，該麥粒包含著物理特性已經(jīng)被改變的淀粉。例如，糊化溫度的降低、糊化過程中或糊化后膨脹特性的改變、粘度的改變、分支淀粉分布鏈長的改變，或者上述特性的任何組合。糊化溫度的升高或降低，可以是在糊化第一峰值或同時在第二峰值處。但該淀粉一個或多個特性如糊化焓，可以保持不變。相對于野生麥粒的淀粉的相應(yīng)數(shù)據(jù)，用差式掃描熱量法測出的該麥粒淀粉的糊化第一峰值溫度(apex)，可能會升高3到5℃，更多的情況是升高7或8℃，更可能的是至少10℃。在特定的實施例里，這個升高的范圍是3到12℃。
所述的麥?？梢允强s水的，或不縮水的，最好是不縮水顯型。在這里，“不縮水”被定義為麥粒大多數(shù)，最好是至少90％的麥粒是飽滿的，具有豐滿的或全填充的顯型。這通常是與淀粉集聚的正常或接近正常水平相關(guān)聯(lián)的。相比之下，此處的“縮水”顯形是對大多數(shù)谷粒而言，至少90％的谷粒的淀粉集聚都是降低了的。相對于野生麥粒而言，輕度縮水谷粒是指淀粉含量至少減少30％，中等縮水谷粒是指淀粉含量至少減少50％，高度縮水谷粒是指淀粉含量至少減少70％?？s水率可以通過相應(yīng)的淀粉含量來測定，淀粉含量用占麥粒重量的百分比來表示。未經(jīng)改造的野生小麥谷粒中淀粉含量大約是65％，而在縮水的麥粒中，則降低到少于50％。
在又一個實施例里，單粒麥粒平均重量至少36mg或至少40mg。平均重量的測量，是拿已知數(shù)量的麥粒的總重量除以麥粒的數(shù)量得到的。顯然，麥粒的特性如淀粉含量、平均重量、不縮水顯型，都是小麥商品生產(chǎn)中所期望的。
本發(fā)明還提供面粉、粗粉、面團和其他從所述的小麥得來的或者用所述的小麥生產(chǎn)的產(chǎn)品。包括未加工的，和已加工的，如分餾，漂白等。本發(fā)明還提供由所屬的小麥中取得的對食品生產(chǎn)有用的麥粒。此外，所述的麥粒包括用其他方式加工的，如碾磨的、碾碎的、成珠狀的、粗磨的、裂碎的、煮或蒸的。
淀粉本發(fā)明的另一方面，提供一種從上述的麥粒中獲得的淀粉。這種淀粉中，具有增加了的直鏈淀粉含量和減少了的支鏈淀粉含量。在一個首選的實施例中，從相對于野生小麥，其胚乳中SBEIIa蛋白質(zhì)和/或SBEIIb酶活性降低的麥粒中獲得淀粉。在另一個實施例里，相對于野生小麥，SBEIIa和SBEIIb活性都降低了，或者SBEIIa、SBEIIb和SBEI這三者的活性都降低了。
本發(fā)明的另外一方面，提供一種從所述的麥粒中獲得的淀粉。這種淀粉中，直鏈淀粉的含量至少是50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或90％。所述的淀粉是部分提純的，即，淀粉已經(jīng)與麥粒的其他成分分離?？梢酝ㄟ^碾磨加工如濕磨法來獲得純淀粉。所述的碾磨加工包括把淀粉與蛋白質(zhì)、油類、纖維分離。碾磨加工后的最初產(chǎn)品是淀粉顆粒的混合物。而本發(fā)明則包含這些顆粒，含有此處所描述的改性淀粉。
所述的淀粉具有提高或減少了的糊化溫度，最好是提高了糊化溫度。在具體的實施例里，相對于從野生的小麥提取的淀粉，用DSC法測量，本發(fā)明所述的淀粉第一峰值的起點溫度或第一峰值的頂點溫度至少升高了3℃、5℃、7℃或10℃。在另一具體的實施例里，這個溫度升高的范圍在3～12℃之間。特別注意的是，有可能糊化溫度第一峰點的起點溫度降低了，而第一峰點的頂點溫度卻升高了。在另一個實施例里，與前面的實施例不互相排斥地，用DSC法測定發(fā)現(xiàn)，對應(yīng)于直鏈淀粉脂的分裂，淀粉糊化溫度第一峰點的溫度改變了，但是第二峰點的溫度沒有實質(zhì)的改變。在又一個實施例里，淀粉糊化過程中，例如相對于野生小麥的淀粉，焓發(fā)生了降低，本發(fā)明的淀粉的焓至少降低了25％或至少降低了40％。
在另外一個實施例里，所述的淀粉中，抗性淀粉的含量提高了，這種結(jié)構(gòu)的改變預(yù)示著特定的物理特性，包括消化酶的物理難接近性，這可能是因為淀粉顆粒形態(tài)的改變、與脂相關(guān)聯(lián)的淀粉的存在、結(jié)晶度的改變或分支淀粉分布鏈長度的改變。較高的直鏈淀粉含量，對抗性淀粉的水平也有貢獻。
本發(fā)明還提供一種從實施例的小麥作物的麥粒中獲得的淀粉。所述的麥粒中食用纖維的含量增加了，優(yōu)選地，抗性淀粉的水平也同時升高。這些增加，至少部分導(dǎo)致了直鏈淀粉含量的提高。
本發(fā)明還明顯地延伸到生產(chǎn)上述小麥淀粉的方法。在一個實施例中，該方法包括從獲得上述的小麥麥粒中并從其中提取淀粉。所述的小麥麥?？梢酝ㄟ^種植所述的小麥作物和收割小麥獲得，也可以小麥生產(chǎn)者或進口者中獲得。
減少基因活性的方法SBEIIa和SBEIIb或者其他淀粉合成、修改基因的表達和/或活性，可以通過引入一個或多個基因變種到小麥作物中來改變。此處的“基因變種”是指小麥作物中任何可遺傳基因組的改變，在上下文中，這些改變會影響相關(guān)基因的表達或活性?；蜃兎N包括包括點突變、點插入、點置換、點復(fù)制、點遷移，優(yōu)選地，包括點的缺失、把一個或多個轉(zhuǎn)基因引入到基因組中。
“核酸分子”和“核酸序列”是核苷的聚合體，可以是單鏈或雙鏈的。它可以包括DNA，如基因組DNA或cDNA、RNA、mRNA或以上的任何組合。為將核酸分子引入到小麥細胞中，可以采用化學(xué)的方法修改核酸分子以提升傳輸性與穩(wěn)定性，或保護部分載體，如病毒基因載體。所述的核酸分子可以用克隆技術(shù)獲得，或者通過領(lǐng)域內(nèi)已知技術(shù)來合成取得。所述的核酸分子可以包括至少一個編碼鏈或非編碼鏈(非官能)，或者上述兩者的組合，例如，逆向復(fù)制結(jié)構(gòu)。對“對應(yīng)于”基因的核酸序列，術(shù)語“對應(yīng)于”是指核苷序列關(guān)系，如至少有一個與所涉及的基因相同的、或者與所象征的蛋白質(zhì)核苷序列，或者至少有一個正確地補償正常的Waston-Crick堿基配對的核苷序列，或者是一個RNA等價物如mRNA的序列，或者從基因的mRNA分離的cDNA。
此處的核苷序列出現(xiàn)在單鏈序列5’到3’的方向上，用一個標準的核苷縮寫詞?！把a償”描述了兩個單鏈核酸分子或堿基對加強的序列之間的相互關(guān)系。例如，5’-GACT-3’堿基對與其補充物，5’-AGTC-3’?！巴宓摹被颉巴吹摹?，根據(jù)上下文，指兩個或更多的核苷序列、多肽序列的相似或等同性。術(shù)語核苷序列的“等同百分比”是指兩個核苷序列之間核苷匹配的百分率。該兩個核苷序列采用標準化的運算法則，如CLUSTAL V運算法則，或在國家生物信息中心，網(wǎng)址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASHT/，上可得到的Blastn或BLAST 2等序列程序，更適宜地，要設(shè)定一個默認的程序。類似的方式，“百分比相似度”也適用于多肽序列。
這里的“基因”，包括SBEIIa、SBEIIb或其他淀粉生物合成基因，或者對非官能、共抑制、ribozyme、雙RNA之類的分子進行編碼的基因，依據(jù)其作最寬泛的背景；包括經(jīng)典的基因組基因，該基因組基因具有與調(diào)節(jié)區(qū)相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄區(qū)，如啟動子和轉(zhuǎn)錄終結(jié)者--多腺苷序列。該轉(zhuǎn)錄區(qū)包括轉(zhuǎn)錄而不轉(zhuǎn)換的序列(非轉(zhuǎn)換序列，UTR)，并選擇地包括蛋白質(zhì)編碼的區(qū)域或內(nèi)含子，該轉(zhuǎn)錄區(qū)接合出來形成一個成熟的RNA。“基因”包括從對應(yīng)于外含子的cDNA獲得的排列形式，以及在RNA基因組中發(fā)現(xiàn)的RNA基因。“基因”也用于描述合成的或聚合的分子編碼部分或全部功能產(chǎn)品。
在細胞中，特別是在小麥細胞中，“基因”指示“生物活性”分子或“基因產(chǎn)物”的“表達”，它可以是RNA或多肽。這一過程通常是通過轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生RNA和轉(zhuǎn)換以生成蛋白質(zhì)。隨后，這樣的產(chǎn)物在細胞中被修改，例如，多聚酰苷酸化、插接、遮蔽、切成21～23個核苷斷片，或由核子輸出或與蛋白質(zhì)共價或非共價交互作用。蛋白質(zhì)可以被磷酸化作用、糖基化或脂化作用而修改。所有的這些過程，都包含在“基因表達”或者類似的詞語中。
在這里用到的術(shù)語“小麥SBEIIa基因”和“小麥SBEIIb基因”以及相關(guān)詞匯指從小麥中識別出來的、分別編碼SBEIIa酶或SBEIIb酶的基因，而同源基因存在于其他小麥變種中。這些基因包括但不限于列在表格1中基因序列。可以理解，不同的小麥品種之間SBEIIa和SBEIIb基因的序列存在著天然的變種。有經(jīng)驗的技術(shù)人員能夠容易地辨認出同源基因。一般認為同源SBEIIa基因或蛋白質(zhì)之間的同一性至少是90％，同源SBEIIb基因或蛋白質(zhì)也一樣。
本發(fā)明中用到的基因可以來自于天然產(chǎn)生的SBEIIa、SBEIIb或經(jīng)標準重組技術(shù)而來的淀粉生物合成基因中取得?！爸亟M核酸分子”或類似的的術(shù)語指代非天然產(chǎn)生的序列，或者是把序列中兩個或多個獨立的片段人工合成的序列。該人工合成可以是把核酸獨立的片段化學(xué)合成，或人為操作，例如本技術(shù)領(lǐng)域中著名的基因工程技術(shù)。所述的“重組”包括獨立地被加成、取代而修改的核酸，或者部分缺失的核酸。通常，重組的核酸可以包括可操作的連接到啟動子序列的核酸序列。這樣的重組核酸可以是所采用的載體的一部分，如，用于轉(zhuǎn)換細胞。
通常，基因可能屈服于突變而產(chǎn)生一個或多個核苷替代、缺失和/或加成物，如密碼子的修改。這些基因的核苷插入衍生物包括5’和3’末端聚合，以及單個或多個核苷中的的序列內(nèi)插入。插入核苷序列的多樣性是由于一個或多個核苷被引入到核苷序列中預(yù)定的位置，盡管從結(jié)果產(chǎn)品中進行適宜地篩選的話，隨機的插入似乎也是可能的。缺失的多樣性是將一個活多個核苷從序列中移除來表征的。替代核苷的多樣性是指序列中至少一個核苷被移除和至少一個不同的核苷被插入到該位置。這種替代可以是“沉默”的，在根本上不改變由基碼所定義的氨基酸。同樣，保守替代則是指有計劃地把一個氨基酸改變成另一個相似的氨基酸。典型的替代如下保守氨基酸替代的適宜的殘留物原始的殘留物典型的替代物Ala SerArg LysAsn Gln；HisAsp GluCys SerGln AsnGlu AspGly AlaHis Asn；GlnIle Leu；ValLeu Ile；ValLys Arg；Gln；GluMet Leu；IlePhe Met；Leu；TyrSer ThrThr Ser
Trp TyrTyr Trp；PheVal Ile；Leu轉(zhuǎn)基因SBEIIa、SBEIIb或其他淀粉合成酶或修正基因的活性或/和表達可以通過引入一個或多個轉(zhuǎn)基因到小麥作物中來改變。在這里，“轉(zhuǎn)基因”是本領(lǐng)域中常用的意思，包括通過DNA或RNA重組技術(shù)生產(chǎn)的或改變的且被引入到器官或細胞的基因序列。轉(zhuǎn)基因可以包括源自器官或細胞中的基因序列，如非官能序列。典型地，轉(zhuǎn)基因包括非源自所述的器官或細胞的外生核酸?！稗D(zhuǎn)基因的”是指器官或細胞中含有轉(zhuǎn)基因?！胺寝D(zhuǎn)基因的”是指基因組中沒有任何的轉(zhuǎn)基因。為了遺傳的穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)基因通常被整合到器官或細胞的基因組中。
本領(lǐng)域中有經(jīng)驗的技術(shù)人員應(yīng)知曉，細胞中基因或互補序列的表達，要求所述的基因與啟動子序列中有可操作的位置。啟動子的選擇，根據(jù)所要求的表達的水平和/或組織、器官、品種的表達水平的不同而不同。所述的表達特別是胚乳中特定的啟動子的表達發(fā)生在組織、器官、品種中。
把核酸分子置于啟動子序列的調(diào)節(jié)控制之下，意味著啟動子序列能控制所述的核酸分子的表達。啟動子通常但不必須在上游，或者在其所控制的核酸分子的5’-端。更進一步地，包括啟動子在內(nèi)的調(diào)節(jié)單元通常位于基因轉(zhuǎn)錄的起始位點的2kb處。在異種的啟動子/結(jié)構(gòu)基因結(jié)合的結(jié)構(gòu)中，通常最好是啟動子處于遠離基因轉(zhuǎn)錄起始位點的位置，這之間的距離等于啟動子與其所控制的基因之間固有的距離(如，源至該基因的啟動子)。本領(lǐng)域已經(jīng)知的是，這個距離可以容納一些無損啟動功能的突變。同樣，最優(yōu)的，相應(yīng)于置于其控制之下的不同基因的調(diào)整序列單元的定位被定義為該單元的天然位置(如，源至該基因的啟動子)。再次說明，本領(lǐng)域的技術(shù)可知，在該距離上可能會發(fā)生某種變種。
適用在本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)中的啟動子的實例包括，源至病毒基因、酵母菌基因、霉菌基因、細菌基因、昆蟲基因、鳥類基因、哺乳動物基因和植物基因的啟動子，優(yōu)選植物細胞中的功能性基因，特別是小麥胚乳中表達的基因。啟動子根據(jù)表達發(fā)生所在的組織的不同，而本質(zhì)地或有差別地調(diào)節(jié)表達。此外，隨著表達發(fā)生的發(fā)展階段不同，或者隨著物理壓力、溫度等外部刺激的不同，該表達也會不同。
降低SbeIIa或其他淀粉生物合成基因的活性的方法，包括把轉(zhuǎn)基因引入到小麥細胞中，以及從該轉(zhuǎn)化小麥再生成一個轉(zhuǎn)基因小麥作物的過程。分支淀粉合成中包含的酶包括SBEI、SBEIIa、SBEIIb。本發(fā)明包括單獨把SBEIIa的表達降低，也包括連同SBEIIb或SBEI的表達一起降低。因此，轉(zhuǎn)基因會鈍化至少一種上述基因。此外，對SBEIIb和/或SBEI的鈍化可是直接的，其轉(zhuǎn)基因(如對雙RNA、非官能RNA或ribozyme RNA編碼的的轉(zhuǎn)基因)直接把SBEIIb或SBEI基因當成表達目標，也可以是間接地改變SBEIIb或SBEI表達的改變。例如，為了序列的同一性或者堿基配對的順序，RNA轉(zhuǎn)基因可以單獨把SBEIIa基因/RNA當目標；也可以通過改變蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性或者蛋白質(zhì)在胚乳中的分布，來降低SBEIIb或SBEI的活性。SBELLa活性的改變，與一個或多個支鏈淀粉合成酶活性的改變的組合，構(gòu)成了本發(fā)明的附加的形式。所述的分支淀粉合成酶包括SSI、SSII、SSIII和脫麩酶如異淀粉酶或普魯蘭酶。上述的酶，都可以通過引入轉(zhuǎn)基因來改變其表達水平。
目前已經(jīng)知道了小麥中分支淀粉合成基因的幾個DNA序列?？梢砸赃@幾個序列中的任何一個為基礎(chǔ)，設(shè)計出鈍化小麥基因的轉(zhuǎn)基因。這些序列包括SBEIIa(基因數(shù)據(jù)庫編號Y1182，AF338431和AF338432)和SBEII(WO00/15810，WO 01/62934)。Rahmant et al.，(1997)和Rahman et al.，(1999)已經(jīng)對小麥的SBEI基因進行了描述。SBEI的Triticum tauschii序列，能夠在公開專利文本W(wǎng)O 99/14314中找到，該序列與D小麥的SBEI基因高度同源。小麥中SBEI的cDNA序列，能夠在基因數(shù)據(jù)庫編號AF176679中找到。來自大麥或其他近親物種的、其他支鏈淀粉合成基因的同源染色體，可以用之來修改小麥的基因表達水平?？梢杂妙I(lǐng)域內(nèi)著名的方法來獲得這些基因或基因片段，包括PCR放大或經(jīng)標識的探針雜交。
此處的“嚴厲雜交條件”意味著，探針和目前序列之間，有90％甚至95％的序列等同時，雜交才發(fā)生。嚴厲雜交條件的一個例子是在50％甲酰胺、5×SSC(1×SSC＝150mM的NaCl和15mM檸檬酸化三鈉)、50mM苯酚鈉(PH＝7.6)、5×Denhardt′s溶液、10％硫酸化右旋糖苷和20up/ml變型剪平帶DNA，如在鮭魚精子DNA的溶液中通宵孵蛋，然后在大概65攝氏度的條件下，在0.1×SSC中清洗雜交支撐物。其它雜交和清洗的條件是已知的并被Sambrook et al，示證，“分子克隆法實驗室手冊第二版，Cold Spring Harbor，NY(1989)，particularly chapter 11?！蓖慈旧w中用來準備轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的區(qū)域，應(yīng)該與小麥基因具有至少85％的等同性，在適當?shù)膮^(qū)域，更可能是85％甚至95～100％的同一性。最優(yōu)的，該轉(zhuǎn)基因是具體針對小麥胚乳中的支鏈淀粉合成基因的表達的，對作物中其他部分的支鏈淀粉合成有很小的或極微弱的影響。這可以通過適當調(diào)節(jié)序列，如轉(zhuǎn)基因中的特別胚乳啟動子，來做到。
非官能基因工程近似于修改特別是降低作物中基因的活性，如小麥作物的基因活性。這些方法包括給適宜的非官能分子的表達引入基因結(jié)構(gòu)。這些非官能分子與目標基因的RNA是互補的，并能與之雜交。非官能分子被認為干擾了目標基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄處理或轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性，從而鈍化了該目標基因的表達。設(shè)計非官能序列的方法在領(lǐng)域內(nèi)是廣泛知曉的。一些相關(guān)例子可以在美國專利號5190131、歐洲專利文本0467349-A1、歐洲專利文本0223399-A1和歐洲專利文本0240208中找到。這里，參考和結(jié)合了這些的專利。作物中非官能方法的使用已被Bourque(1995)和Senior(1998)所論述。Bourque列舉了很多在作物系統(tǒng)用非官能序列鈍化基因的例子，她同時陳述，對酶活性100％抑制不是必須的，因為對酶活性的部分抑制，更可能導(dǎo)致作物系統(tǒng)的可測量的變化。Senior(1998)的陳述是，對于操作作物中基因表達的，非官能的方法是一種良好的準確的技術(shù)。
小麥SBEIIa、SBEIIb、SBEI或其他淀粉生物合成基因、淀粉修改基因的非官能分子是以小麥mRNA序列為基礎(chǔ)的，或者是從同源的DNA或mRNA序列中取得的。所述的同源的DNA或mRNA序列來自其他物種，如大麥。這些非官能序列可以對應(yīng)于這些基因的全部或部分轉(zhuǎn)錄，或者對應(yīng)于控制這些基因表達如基因拼接的序列。所述的非官能序列可以對應(yīng)于小麥SBEIIa或其他基因的目標編碼區(qū)，或者對應(yīng)于5’-非轉(zhuǎn)換區(qū)(UTR)和/或3’-UTR的目標編碼區(qū)。所述的非官能序列可以與內(nèi)含子序列的一部分互補。這些內(nèi)含子序列在轉(zhuǎn)錄時或轉(zhuǎn)錄后被拼接掉，最好是僅僅針對目標基因的外含子序列。通常，由于UTRs巨大的分歧，以這些區(qū)域為目標給基因抑制提供了巨大的特異性。在特定的實施例中，非官能序列的長度是至少19個連續(xù)的核苷，或至少50個、至少100個、至少200個、至少500個或至少1000個核苷。這些核苷與RNA序列互補，也會用到與整個基因轉(zhuǎn)錄互補的大型序列。在具體實施例中，非官能序列的長度是100～2000核苷。在另一個實施例中，非官能序列與目標轉(zhuǎn)錄的補體之間的同一性程度是至少85％，至少95％，或至少95～100％。非官能RNA分子理所當然地，可以包括不相關(guān)的序列，這些序列用以穩(wěn)定所述的RNA分子。
共抑制另一個可能會用到的分子生物學(xué)的方法就是共抑制。共抑制機制并不容易理解，但是被認為包含于轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)中，從這一點看來，與很多非官能抑制的例子相似。其包含，為了其表達，以對應(yīng)的啟動子在官能方向引入一個基因的額外復(fù)制或基因片段到作物中。官能片段的大小、相應(yīng)于目標基因區(qū)域、與目標基因的序列等同性的程度，見上面所述的非官能序列。在某種程度上，基因序列額外的復(fù)制干擾了目標作物基因的表達。為實施共抑制方法，可以參考專利文本W(wǎng)O 97/20936和歐洲專利文本0465572。
雙鏈RNA-媒介基因沉默另一個把基因突變引入到小麥作物中的方法就是雙鏈RNA-媒介基因沉默。這個方法也包括PTGS。在這個方法里，引入DNA是為了被鈍化，被引入的DNA和目標基因的同源體一起指導(dǎo)雙鏈RNA產(chǎn)物的合成，其中，該DNA包含官能和非官能序列。這些序列在被轉(zhuǎn)錄為RNA時，能夠雜交以形成雙鏈RNA區(qū)。在優(yōu)選的實施例中，官能序列和非官能序列被間隔區(qū)域隔開。所述的間隔區(qū)域包含內(nèi)含子，該內(nèi)含子在被轉(zhuǎn)錄成RNA時被拼接掉。這種安排能帶來高效率的基因沉默。所述的雙鏈區(qū)域可以包括一個或兩個RNA分子，該RNA分子由一個或兩個DNA區(qū)域轉(zhuǎn)換而來。雙鏈分子的存在引起了作物內(nèi)生系統(tǒng)的反應(yīng)。作物內(nèi)生系統(tǒng)破壞了從目標作物基因轉(zhuǎn)錄而來的雙鏈RNA和同源RNA，有效地降低或消除目標基因的活性。為實施該方法，可以參考澳大利亞專利文本99/29514-A和專利文本W(wǎng)O 99/53050。在具體的實施例中，雜交的官能和非官能序列的長度至少是19個連續(xù)的核苷，或至少30個、至少50個、至少100個、至少200個、至少500個或至少1000個核苷。對應(yīng)于整個基因轉(zhuǎn)錄的大型的序列也可能用到。在具體實施例中，該長度為100～2000個核苷之間。在一個實施例中，目標的轉(zhuǎn)錄官能和非官能序列等同程度是至少85％、90％或至少95～100％。RNA分子理所當然地，可以包括不相關(guān)用以穩(wěn)定所述的RNA分子的序列。RNA分子可以在RNA聚合酶II啟動子或者RNA聚合酶III啟動子的控制下表達。后者(啟動子III)的例子包括tRNA或snRNA啟動子。該雙鏈RNA分子還包括來自一個或多個基因的、連在一起的序列，用以確定多個基因目標。
核酶造成對小麥中基因表達進行所期望的鈍化的基因變種，可以包括對一個或多個核酶進行編碼的核酸分子。核酶是帶有酶的或帶有催化功能的RNA分子，該催化能夠在指定的位點分解RNA分子。這些位點由一個或(通常是)兩個雜交序列定義。RNA的分解，鈍化了目標基因的表達。核酶可以扮演非官能分子的角色，促成基因鈍化。核酶，特別是錘頭狀和發(fā)夾狀的核酶，包含雜交序列間的一個或多個催化域。其他可用的核酶的主旨包括RNAseP、內(nèi)含子組I或II，δ肝炎病毒類型等。參考歐洲專利文本0321201和美國專利6221661。用核酶來鈍化轉(zhuǎn)基因植物中的基因，已經(jīng)被證實了，如Wegener et al(1994)。
遺傳構(gòu)體/載體本發(fā)明還提供一種單獨的包含有RNA或DNA的核酸分子，最好是編碼基因抑制分子的DNA。在某些實施例中，核酸分子對非官能、官能(共抑制)、雙鏈RNA或核酶分子進行編碼。所述的核酶分子以SBEIIa基因序列為目標且鈍化其在小麥顆粒胚乳中的表達。本發(fā)明還提供一種包含或編碼單獨的核酸分子的基因結(jié)構(gòu)，并包含一個或多個調(diào)節(jié)單元如啟動子、強化因子和轉(zhuǎn)錄末端或多腺苷序列。這些單元在本領(lǐng)域內(nèi)是廣泛知曉的。該基因結(jié)構(gòu)還可以包括促進作物中--特別是單子葉作物如小麥--轉(zhuǎn)基因的表達的內(nèi)含子序列。這里，“內(nèi)含子”是其通用含義，指已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄的、但沒有對蛋白質(zhì)進行編碼的且在轉(zhuǎn)換之前被拼接掉的遺傳片段。如果相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因?qū)D(zhuǎn)換產(chǎn)物進行編碼，那么內(nèi)含子可以與5’-UTR或編碼區(qū)合成一體；反之，可以與任何的轉(zhuǎn)錄區(qū)合成一體。
本發(fā)明還提供了一種載體，如質(zhì)粒載體。這些載體包括有基因結(jié)構(gòu)。這里，“載體”包括表達載體和轉(zhuǎn)化載體。表達載體能夠在體外表達和體內(nèi)表達；轉(zhuǎn)化載體能構(gòu)從一個細胞或器官轉(zhuǎn)到另一個細胞或器官中。載體包括在細胞中提供復(fù)制的序列，如原核細胞中E大腸桿菌或土壤桿菌。在具體的實施例中，載體是能夠被引入到小麥細胞中的二元載體，其中包含被至少一個T-DNA邊界序列定義的T-DNA序列。本發(fā)明還提供了一種細胞，這種細胞包含了所述的載體，例如土壤桿菌或可再生的小麥細胞，如幼胚盾片上的細胞?？蛇x地，這些細胞可以轉(zhuǎn)化成含轉(zhuǎn)基因的小麥細胞。
啟動子/終止子在另一個實施例中，本發(fā)明中的轉(zhuǎn)基因或其他基因結(jié)構(gòu)包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(啟動子)。這些啟動子提供小麥胚乳中調(diào)節(jié)型和組成型的表達。這些啟動子可以是組織特異性的，在胚乳中具有表達選擇性與排他性。這些啟動子可以選自胚乳特異性(如高分子量麥谷蛋白啟動子、小麥SSI啟動子、，小麥SBEII啟動子、小麥GBSS啟動子)或非胚乳特異性(如泛素啟動子或CaMV35S或增強型35S啟動子)。這些啟動子可以被溫度、光或壓力等因素調(diào)整。通常，這些啟動子由被表達的基因序列的5’提供。這些構(gòu)體可以包括其他加強轉(zhuǎn)錄的單元，如nos 3’或ocs 3’多聚腺苷酸化區(qū)域或轉(zhuǎn)錄終端。所列舉的DNA區(qū)域可以與包含選拔標示基因序列的載體或其它單元合成一體，或與含有這些序列的載體共轉(zhuǎn)化的載體合成一體。
小麥的改造方法改造單子葉植物，如小麥的方法，是通過引入外生核酸的方式引入遺傳突變到作物中，然后從原型胚體或幼胚中再生出作物。這是本領(lǐng)域內(nèi)廣泛知曉的方法。Becker et al 1994，Cheng et al 1997，He et al 1994，Hess et al 1990，Nehra et al 1994，Vasil et al 1992，Vasil et al 1993，Weeks et al 1993，Weir et al2001，美國專利申請?zhí)?5460/94，歐洲專利申請?zhí)?09462，國際專利
發(fā)明者阿麥德·里賈納, 薩德奎·拉曼, 馬太·肯尼迪·莫維爾, 中易·李 申請人:聯(lián)邦科技產(chǎn)業(yè)研究組織, 生物胞芽公司