專利名稱：保存溶液中目標的檢測的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于在醇保存溶液(preservative solution)中檢測目標物質和用于識別用于與這些目標結合的傳感器(sensor)的方法、物品和組合物。
背景技術：
醫(yī)學診斷測試方法是病理狀態(tài)早期檢測的關鍵篩選工具。早期檢測能夠在更可能進行成功治療的階段確定這些病癥。通常早期治療也涉及較小破壞性或較小侵襲性的治療方法，降低對患者的影響。除了常規(guī)篩選之外，診斷測試也有許多其他應用，包括生物活組織檢查分析和監(jiān)測進行中的醫(yī)學治療的結果。
分析樣品如醫(yī)學樣品中存在的特定成分的典型方法可以包括多步處理步驟如固定、染色、透化、原位雜交以及其他酶學和/或化學處理，這取決于進行的具體測定法。
對可從樣品獲得的診斷信息量的限制因素包括可獲得和易于操作的樣品的數(shù)量、進行多重檢測所需的處理時間、樣品在不失去信號的情況下對多重處理步驟的耐受性以及進行多重分析方法的費用。
醫(yī)學樣品經常使用本領域已知的多種技術染色。許多染色液含有固定劑如醇，不過很多方法也需要固定步驟。通常希望獲得關于各種存在于或可能存在于樣品中的物質(species)的其它信息和/或獲得關于較小成分如病毒或其它細胞成分或其它可能存在于樣品中但通過染色方法不能充分檢測的物質的信息。
使用更精確的分子技術如原位雜交可以從樣品中提供比染色技術甚至更為詳細的信息。但是，原位雜交需要對樣品進行多重繁瑣的操作，包括固定、轉移至載玻片上、通過溶液梯度逐步操作、加蓋玻片、過長的雜交步驟、洗滌、干燥和其它處理步驟。這些方法耗費時間，對多重步驟需要嚴格的注意。
本領域需要改進的樣品分析方法以及改進的用于這些方法的組合物和物品的制備方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及用于在醇保存溶液中檢測目標物質和用于識別用于與這些目標結合的傳感器的方法、物品和組合物。該方法使得樣品的充分固定和可檢測的傳感器與樣品中感興趣的目標的結合同時進行。一方面，本發(fā)明提供一種方法，其包括使懷疑含有目標的樣品與已知與這種目標結合的可檢測的傳感器分子在醇保存溶液中接觸。該方法可以以多重的形式(multiplex form)進行以同時分析多種目標。本發(fā)明還提供識別在醇保存溶液中能夠與期望的目標結合的傳感器的方法。本發(fā)明還提供含有一種或多種這種可檢測的傳感器的醇保存溶液。本發(fā)明還提供含有由這種方法提供的結合傳感器的樣品。本發(fā)明還提供用于這些方法的試劑盒。
附圖簡述

圖1表示用50×油浸鏡頭和Omega FITC/Texas Red對偶濾波器觀察到的與對金黃色葡萄球菌(S.aureus)rRNA特異的異硫氰酸熒光素(FITC)標記的PNA探針雜交的金黃色葡萄球菌陰性表皮葡萄球菌(S.epidermitis)標本在PreservCyt溶液中雜交90分鐘后的影像。
圖2表示用50×油浸鏡頭和Omega FITC/Texas Red對偶濾波器觀察到的與對金黃色葡萄球菌rRNA特異的FITC標記的PNA探針雜交的金黃色葡萄球菌陽性標本在PreservCyt溶液中雜交90分鐘后的影像。
圖3表示用50×油浸鏡頭和Omega對偶濾波器觀察到的與對白色念珠菌(C.albicans)rRNA特異的FITC標記的PNA探針雜交的酵母陰性ThinPrep制備樣品的影像。
圖4表示用50×油浸鏡頭和Omega FITC/Texas Red對偶濾波器觀察到的與對白色念珠菌rRNA特異的FITC標記的PNA探針雜交的酵母陽性ThinPrep制備樣品的影像。該ThinPrep標本于1999年收集，在PreservCyt中儲存四年后雜交。
具體實施例方式
本發(fā)明的發(fā)明人有利地發(fā)現(xiàn)將傳感器分子引入含醇保存溶液中允許多重細胞學操作在同一溶液中進行，從而減少處理樣品所需的步驟數(shù)目和時間量并增加在給定時間內對于給定樣品可以進行的測定法的數(shù)目。
例如，繁瑣且需要多重步驟和操作的FISH方法如果在醇保存溶液例如含有傳感器如檢測核酸目標的PNA探針的PreservCyt中進行就可以被簡化。這有利地消除對費時且不必要的固定步驟的需要，因為PreservCyt中的甲醇也能充當固定劑。
我們進行了研究，顯示了通過FISH(熒光原位雜交)利用PNA探針對PreservCyt中的金黃色葡萄球菌和白色念珠菌進行微生物檢測。我們證明了使用PNA探針FISH可以在PreservCyt的溶液基質中有效地進行。在常規(guī)方法中，雜交事件在由血液培養(yǎng)物標本制備的載玻片上進行，為達到最佳效果血液培養(yǎng)物標本需要是新鮮的。由于PreservCyt具有保存性質因而很好地保持PNA目標(rRNA序列)的穩(wěn)定性。我們的研究表明，在PreservCyt中rRNA的完整性至少保持四年且可被PNA FISH檢測到。我們還確定了在室溫下PreservCyt中的雜交事件至少在23日內保持穩(wěn)定。這有利地提供了對以前采集的樣品進行回顧分析的方法。因此，還提供了用于在醇保存溶液中對長期儲存后的目標的檢測方法。檢測目標的方法可以在1、2或3周后，或者1、2、3、4、6或9個月后，或者1、2、3、4或更多年后進行。
雖然使用PNA FISH檢測白色念珠菌和金黃色葡萄球菌作為模型系統(tǒng)來舉例說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于檢測這些微生物的方法。該方法可以用于檢測其它感染或致病性物質(agent)(包括病毒)以及遺傳分析如點突變或其它染色體異常的識別(即檢測非整倍性的著絲粒探針)。
該方法還用于在醇保存溶液中進行分子測定，例如擴增反應如PCR，其包括使用一種或多種PNA探針阻斷不期望的目標的擴增，例如檢測特定選擇的人乳頭瘤病毒(HPV)的菌株如致病性菌株，而同時避免檢測到其它未選擇的菌株如非致病性菌株。該方法可以以多重的形式使用。該方法還可以用于測試候選傳感器與期望的目標的結合能力，這種測試可以以多重的形式進行，例如使用化合物庫如小分子、有機分子和/或無機分子或測試寡核苷酸的混合物來從混合物中識別具有希望的結合特征(profile)的適體(aptamer)。
癌癥的病理診斷通常需要單細胞或組織活檢物的顯微鏡檢查以識別指示惡性的形態(tài)異常。輔助的實驗室檢查可以有助于形態(tài)學檢查。這些檢查包括以下檢測染色體異常(如擴增、缺失或易位)、表達異常的酶、蛋白質或脂質或碳水化合物。盡管為證實異常的細胞成分可以使用不同的分析方法，但它們的共同點是分析在與最初的形態(tài)學檢查中所使用的細胞不同的組織切片、懸浮液或顯微鏡載玻片上的一組細胞中進行。這可能給診斷過程帶來挑戰(zhàn)。
本文所述的方法可以用于通過使用中心體特異的傳感器分析樣品中存在的中心體。目前中心體計數(shù)還沒有在實際中用于對惡性腫瘤或其前體的輔助診斷。在一個實施方案中，本發(fā)明提供同時進行細胞形態(tài)學評價和中心體數(shù)目計數(shù)的方法，這樣通過將兩種因素的信息結合就可以更準確地確定正?；虍惓５姆诸悺＠缈梢杂帽４娴募毎苽銽hinPrep載玻片，進行巴氏染色操作。可以使細胞在染色操作之前或之后與可檢測的對中心體目標特異的傳感器接觸。通過特定的光波長檢查載玻片以測定形態(tài)學特征和中心體特異的傳感器的特異性結合。可以使用自動成像系統(tǒng)如ThinPrep成像系統(tǒng)根據(jù)可檢測的傳感器的結合而定量中心體的數(shù)目。
在保存溶液中接觸傳感器之后，可以對樣品進行檢測以確定傳感器是否已經與目標結合。檢測可以在含有于溶液中的樣品的容器中進行，或者可以在將部分或全部樣品轉移至另一容器中或基材如濾紙、載玻片或蓋玻片上之后再進行?？梢杂靡环N或多種特定的光波長測定樣品的形態(tài)學特征和目標的特異性結合和傳感器的存在來檢測樣品。
樣品可以通過手動和/或通過合適的裝置如自動成像系統(tǒng)來進行分析。自動成像系統(tǒng)的實例包括Cytyc Corporation的ThinPrepImaging System、TriPath FocalPointTMProfiler、ChromaVision AcisSystem、CompuCyt iCyte Imaging System、Applied ImagingCytoVisionTMSystem和Veracel Verasys Imaging System。諸如上述這些的裝置可以經過改造引入一種或多種檢測系統(tǒng)以檢測引入含醇保存染色溶液中的傳感器上使用的附加標記。例如可以使裝置適用于檢測和/或分析由加入保存溶液中的傳感器(和/或它們的標記)所提供的一種或多種特定的波長。當目標是中心體時，可使用自動成像系統(tǒng)通過檢測與樣品結合的中心體特異的傳感器的量或數(shù)目來定量中心體數(shù)目。
在進一步詳細描述本發(fā)明之前，應理解本發(fā)明不限于所描述的具體方法、溶液或裝置，因為這些方法、溶液或裝置當然可以改變。還應理解本文使用的術語僅僅是為了描述具體的實施方案，而無意于限制本發(fā)明的范圍。
若非另外明確指出，使用單數(shù)形式“一”、“這”或“那”包括復數(shù)的意思。因此，例如所指的“一個樣品”包括多個樣品，所指的“一個傳感器”包括多個這種傳感器，所指的“一個目標”包括多個目標等等。此外，若非另外明確指出，使用明確的復數(shù)形式如“兩”、“三”等，以同主題中較大的數(shù)字為準。
若非另外明確指出，術語如“連接的(connected)”、“連接的(attached)”和“連接的(linked)”在本文中可互換地使用，并且包括直接以及間接的連接或綴合。當描述數(shù)值范圍時，應理解任何介于該范圍的所述上限和下限之間的整數(shù)值及其分數(shù)，以及在這些值之間的任何子范圍也均被具體公開。任何范圍的上限和下限可以獨立地包含在該范圍之內或排除于該范圍之外，而且任何其中兩個限值之一、兩個限值都不包括或兩個限值都包含的范圍也包含在本發(fā)明的范圍之內。當所討論的值具有內在的限度時，例如當組分以0-100％的濃度存在時，或當水溶液的pH范圍為1至14時，這些內在的限度被具體公開。當明確描述一個值時，應理解與所述值大約相同的量以及基于其的范圍也在本發(fā)明的范圍內。當公開一個組合時，該組合的元素的每個亞組合也被具體地公開且在本發(fā)明的范圍內。相反，當公開不同元素或多組元素時，它們的組合也被公開。當公開一個發(fā)明的任何元素具有多種選擇時，則其中各自的選擇被單獨排除或與其它選擇的任意組合被排除的該發(fā)明的實例也在本文公開；一個發(fā)明中一種以上的元素可以具有這種排除，具有這種排除的元素的所有組合也在本文公開。
若非另外定義或上下文另外明確指出，本文使用的所有科技術語都具有本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的含意。雖然與本文所述相似或等價的方法和材料也可以用于本發(fā)明的實踐或測試中，但現(xiàn)在描述的方法和材料是優(yōu)選的。
本文使用的術語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”可互換地使用，都指任何長度的多聚形式的核苷酸，而且可以包括核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、它們的類似物或它們的混合物。這些術語僅僅指該分子的一級結構。因此，該術語包括三鏈、雙鏈和單鏈脫氧核糖核酸(“DNA”)以及三鏈、雙鏈和單鏈核糖核酸(“RNA”)。它還包括例如通過烷基化和/或通過加帽的修飾和非修飾的多核苷酸形式。
本領域技術人員能夠確定對于給定測定形式的合適雜交條件；可調節(jié)的非限制性參數(shù)包括測定成分的濃度、pH、使用的鹽及它們的濃度、離子強度、溫度等。
更具體地，術語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”包括多脫氧核糖核苷酸(含2-脫氧-D-核糖)、包括剪接或未剪接的tRNA、rRNA、hRNA和mRNA在內的多核糖核苷酸(含D-核糖)、任何其它類型的為嘌呤堿基或嘧啶堿基的N-或C-糖苷的多核苷酸和包括肽核酸(PNA)在內的含有其它骨架的其它聚合物以及其它合成的序列特異性核酸聚合物，條件是該聚合物含有使得如DNA和RNA中存在的那樣的堿基配對和堿基堆積的構象的核堿基。術語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”之間不存在有意的長度區(qū)別，這些術語在本文中可以互換使用。這些術語僅僅指該分子的一級結構。因此，這些術語包括例如3′-脫氧-2′，5′-DNA、寡脫氧核糖核苷酸N3′P5′磷酰胺、2′-O-烷基-取代RNA、雙鏈和單鏈DNA以及雙鏈和單鏈RNA和它們的雜交體包括例如DNA和/或RNA和/或PNA和/或其它形式之間的雜交體，也包括多核苷酸或寡核苷酸的已知類型的修飾形式例如標記，烷基化，“帽”，用類似物取代一個或多個核苷酸，核苷酸間修飾例如具有負電荷連接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些、含有側基(pendant moiety)如蛋白質(包括酶(例如核酸酶)、毒素、抗體、信號肽、聚左旋賴氨酸等)的那些、含有嵌入劑(如吖啶、補骨酯素等)的那些、含有螯合物(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等的螯合物)的那些、含有烷化劑的那些、具有修飾連接(如α異頭核酸等)的那些，以及非修飾形式。
應理解，如本文所用，術語“核苷”和“核苷酸”包括那些不僅含有已知嘌呤和嘧啶堿基還含有其它已修飾的雜環(huán)堿基的基團。這些修飾包括甲基化的嘌呤或嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶或其它雜環(huán)。修飾的核苷或核苷酸還可以包括糖基上的修飾，例如其中一個或多個羥基被鹵素、脂族基替代或官能化為醚、胺等。術語“核苷酸單元”意于包括核酸和核苷酸。
此外，對核苷酸單元的修飾包括重排、添加(appending)、取代或改變嘌呤或嘧啶堿基上的與各自互補的嘧啶或嘌呤形成氫鍵的官能基。所得的修飾核苷酸單元任選可以與其它這樣修飾的核苷酸單元形成堿基對，但是不與A、T、C、G或U形成堿基對?？梢砸氩环恋K多核苷酸功能的無堿基位點；優(yōu)選多核苷酸不含無堿基位點。多核苷酸中的一部分殘基或全部殘基可以以一種或多種方式任選被修飾。
修飾核苷酸單元的實例包括吖丙啶基胞嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿苷、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(β-D-mannosylqueosine)、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸、2，6-二氨基嘌呤和“鎖定”核酸單元(LNA)及其類似物。Koshkin等，Tetrahedron Letters 1998 394381-4384；PCT Publ.No.WO99/14226。
在使得胸苷的N3-H和C4-氧基分別與腺苷的N1和C6-NH2之間以及胞苷的C2-氧基、N3和C4-NH2分別與鳥苷的C2-NH2、N′-H和C6-氧基之間形成氫鍵的條件下形成標準A-T和G-C堿基對。因此，例如鳥苷(2-氨基-6-氧基-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)可以修飾成為異鳥苷(2-氧基-6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)。這種修飾導致將不再有效地與胞嘧啶形成標準堿基對的核酸堿基。但是，將胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氧基-4-氨基-嘧啶)修飾成為異胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氨基-4-氧基-嘧啶)導致將不能有效地與鳥苷形成堿基對但將與異鳥苷形成堿基對的修飾核苷酸。異胞嘧啶可以從Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)獲得；異胞苷可以通過Switzer等，(1993)Biochemistry 3210489-10496及其中引用的參考文獻中描述的方法制備；2′-脫氧-5-甲基-異胞苷可以通過Tor等，(1993)J.Am.Chem.Soc.1154461-4467及其中引用的參考文獻中描述的方法制備；以及異鳥嘌呤核苷酸可以通過Switzer等，(1993)同上和Mantsch等，(1993)Biochem.145593-5601中描述的方法或通過Collins等的美國專利5,780,610中描述的方法來制備。其它非天然堿基對可以通過Piccirilli等，(1990)Nature 34333-37中描述的關于合成2，6-二氨基嘧啶及其互補體(1-甲基吡唑并-[4，3]嘧啶-5，7-(4H，6H)-二酮)的方法來合成。其它這樣形成獨特堿基對的修飾核苷酸單元是已知的，如Leach等，(1992)J.Am.Chem.Soc.1143675-3683和Switzer等，同上中所描述的那些。
“互補的”或“基本互補的”是指核苷酸或核酸之間例如傳感器肽核酸與目標多核苷酸之間雜交或形成堿基對的能力。互補核苷酸通常是A與T(或A與U)或C與G。對于兩條單鏈多核苷酸或PNA的堿基，當以最佳方式排列和比較而且具有適當?shù)牟迦牖蛉笔r，一條鏈的堿基與另一條鏈的堿基至少約80％，通常至少約90％-95％，更優(yōu)選約98％-100％配對時，則說這兩條鏈是基本互補的。
或者，當多核苷酸或PNA在選擇性雜交條件下與其互補體雜交時，則基本互補性存在。通常在至少14-25個堿基的長度內至少具有約65％、優(yōu)選至少約75％、更優(yōu)選至少約90％的互補時，會發(fā)生選擇性雜交。參見M.Kanehisa Nucleic Acids Res.12203(1984)。
“優(yōu)先結合”或“優(yōu)先雜交”是指與樣品中非互補的聚合物相比一個多核苷酸或PNA與樣品中它的互補體增加的結合傾向性。
雜交條件通常包括鹽濃度小于約1M，更通常小于約500mM，優(yōu)選小于約200mM。在肽核酸或其它類似核酸與多核苷酸之間雜交的情況下，雜交可在幾乎不含或不含鹽的溶液中進行。雜交溫度可以低至5℃，但通常高于22℃，更通常高于約30℃，優(yōu)選高于約37℃。較長的片段對于特異性雜交可能需要較高的雜交溫度。其它因素可能影響雜交的嚴謹性，其包括堿基組成和互補鏈的長度、有機溶劑的存在和堿基錯配的程度，而所用的參數(shù)的組合比任一單獨的參數(shù)的絕對值都重要。其它可以控制的雜交條件包括緩沖劑類型和濃度、溶液pH、降低背景結合的封閉試劑如重復序列或封閉蛋白溶液的存在和濃度、洗滌劑類型和濃度、增加多核苷酸相對濃度的分子如聚合物、金屬離子及它們的濃度、螯合劑及它們的濃度以及本領域已知的其它條件。
本文使用的術語“適體”(或“核酸抗體”)是指通過其形狀識別期望的目標分子并與之結合的單鏈或雙鏈多核苷酸。參見例如PCT公開WO 92/14843、WO 91/19813和WO 92/05285。
“多肽”和“蛋白質”在本文中可以互換使用，包括通過肽鍵連接的氨基酸分子鏈。該術語不指產物的具體長度。因此，“肽”、“寡肽”和“蛋白質”均包括在多肽的定義之內。該術語包括多肽的含有翻譯后修飾例如糖基化、乙酰化、磷酸化和硫酸化的多肽。此外，蛋白質片段、類似物(包括非遺傳密碼編碼的氨基酸如高半胱氨酸、鳥氨酸、D-氨基酸和肌酸)、天然或人工突變體或變異體或它們的組合，融合蛋白、衍生殘基(氨基烷基化、羧基乙?；蝓セ?等都包括在多肽的含意之內。
如本文所用，術語“結合對”是指以高于與樣品中其它成分的親和力彼此特異性結合的第一個和第二個分子。在結合對成員之間的結合通常是非共價結合。結合對的實例包括免疫學結合對(如任何半抗原或抗原復合物與相應的抗體或其結合部分或片段的組合，例如地高辛配基與抗地高辛配基、熒光素與抗熒光素、二硝基苯酚與抗二硝基苯酚、溴脫氧尿苷與抗溴脫氧尿苷、小鼠免疫球蛋白與羊抗小鼠免疫球蛋白)和非免疫學結合對(如生物素-抗生物素蛋白、生物素-鏈霉抗生物素、激素(如甲狀腺素和可的松)-激素結合蛋白、受體-受體激動劑或拮抗劑(如乙酰膽堿受體-乙酰膽堿或其類似物)、IgG-蛋白A、凝集素-碳水化合物、酶-輔酶、酶-酶抑制劑和能夠形成核酸二倍體的互補多核苷酸對)等。結合對兩成員之一可以或兩者都可以與其它分子綴合。
如本文所用，術語“抗體”包括從多克隆和單克隆制備物獲得的抗體以及雜交(嵌合)抗體分子(參見例如Winter等，(1991)Nature 349293-299和美國專利4,816,567)；F(ab′)2和F(ab)片段；Fv分子(非共價異二聚體，參見例如Inbar等，(1972)Proc Natl Acad Sci USA 692659-2662和Ehrlich等，(1980)Biochem 194091-4096)；單鏈Fv分子(sFv)(參見例如Huston等，(1988)Proc Natl Acad Sci USA 855879-5883)；二聚和三聚抗體片段構建體；微型抗體(minibody)(參見例如Pack等，(1992)Biochem 311579-1584、Cumber等、(1992)JImmunology 149B120-126)；人源化抗體分子(參見例如Riechmann等，(1988)Nature 332323-327、Verhoeyan等，(1988)Science 2391534-1536和1994年9月21日公開的英國專利GB 2,276,169)；以及從這些分子中獲得的任何功能性片段，其中這種片段保留了母抗體分子的特異性結合性質。
如本文所用，術語“單克隆抗體”是指具有同種抗體群體的抗體組合物。該術語不限制抗體的種類或來源，也無意被其制備方式所限制。因此，該術語包括從鼠雜交瘤獲得的抗體以及用人雜交瘤獲得的或從小鼠表達的人免疫球蛋白鏈基因或其部分制備的鼠雜交瘤獲得的人單克隆抗體。參見例如Cote等，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，1985，p.77。
本文的“多重的”是指其中多種分析物可同時被測定的測定法或其它分析方法。
“任選的”或“任選地”是指其后描述的事件或情況可以發(fā)生或不發(fā)生，而且該描述包括該事件或情況發(fā)生的情況和該事件或情況不發(fā)生的情況。
樣品要分析的樣品部分可以是可直接或間接從活生物體獲得的任何來源的生物材料，包括細胞、組織或液體。樣品的非限制性實例包括血液、尿、精液、乳汁、痰、粘液、胸腔液(plueral fluid)、盆腔液、滑膜液(sinovial fluid)、腹水、體腔灌洗液、眼刷物(eye brushing)、皮膚刮下物(skin scraping)、口腔拭物、陰道拭物、巴氏涂片物(papsmear)、直腸拭物、吸出物、穿刺活組織檢查物(needle biospy)、例如通過手術或尸檢獲得的組織切片、血漿、血清、脊髓液、淋巴液、皮膚、呼吸道、腸道和泌尿生殖道的外分泌物、淚液、唾液、腫瘤、器官、微生物培養(yǎng)物、病毒和體外細胞培養(yǎng)物成分的樣品。
樣品可以是已知含有目標的對照樣品。也可以使用陰性對照樣品以用于確定是否一套給定的條件產生假陽性。
樣品可以在如下所述的溶液中或基材上提供?？梢栽跇悠放c傳感器分子在保存溶液中接觸之前或之后將樣品轉移至基材上。
基材基材可以包含廣范的材料，生物材料、非生物材料、有機材料、無機材料或這些材料的任意組合。例如基材可以是聚合的L-B膜、功能性玻璃、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、改性硅或多種凝膠或聚合物如(聚)四氟乙烯、(聚)亞乙烯基二氟、聚苯乙烯、交聯(lián)聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(丙交酯共乙交酯)、聚酐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙烯共乙酸乙烯酯)、聚硅氧烷、聚二氧化硅、膠乳、葡聚糖聚合物、環(huán)氧樹脂、聚碳酸酯中的任一種或它們的組合。
基材可以是平面結晶基材如二氧化硅基基材(如玻璃、石英等)或例如半導體和微處理器工業(yè)中使用的結晶基材如硅、砷化鎵等。
硅補強劑也可以用作基材，它可以通過本領域已知的方法制備。氣凝膠基材可以用作獨立的基材或作為另一種基材的表面涂層。
基材可以是任何形狀，通常是板、載玻片、蓋玻片、珠、小丸、圓盤、粒子、鏈、沉淀物、薄片、任選多孔的凝膠、大片、管、球、容器、毛細管、墊、片、膜、芯片、多孔板或盤、光纖等。雖然基材一般是無活性的(inanimate)形式，但是對于一些應用基材可以是硬質或半硬質的任何形式。
基材表面可以由與基材相同的材料組成或者可以由不同材料制成，可以通過化學或物理手段與基材偶聯(lián)。這種偶聯(lián)的表面可以由多種材料例如聚合物、塑料、樹脂、多糖、二氧化硅或二氧化硅基材料、碳、金屬、無機玻璃、膜或上面列出的基材中的任一種組成。在一種實施方案中，表面是光學透明的而且具有表面Si-OH官能團，如在二氧化硅表面上存在的那些。
目標目標可以是期望視覺可見的樣品中的任何成分。目標的非限制性實例包括可以針對其獲得傳感器的多核苷酸、蛋白質、多糖、粘多糖、蛋白聚糖、脂質、細胞、細胞類型(cell type)、生物體、病毒、結構或分子。該目標可以是亞細胞結構例如中心體或中心體成分或者是細胞外產物或成分。
當目標是細胞或細胞成分或產物時，該細胞可以是任何來源的，包括原核細胞、真核細胞或古細胞(archea)。該細胞可以是活的或死的。若來自于多細胞生物體，則該細胞可以是任何細胞類型。該細胞可以是培養(yǎng)的細胞系或原分離物，該細胞可以是哺乳動物細胞、兩棲動物細胞、爬行動物細胞、植物細胞、酵母細胞、細菌細胞、螺旋體細胞或原生動物細胞。該細胞可以是人細胞、鼠細胞、大鼠細胞、倉鼠細胞、雞細胞、鶉細胞或狗細胞。該細胞可以是正常細胞、突變細胞、遺傳操作細胞、腫瘤細胞等。
來自多細胞生物體的細胞類型的實例包括嗜酸細胞、腺泡細胞、松果體細胞、脂肪細胞、成釉細胞、星形膠質細胞、基(干)細胞、嗜堿細胞、肝細胞、神經元、表面凸出細胞(bulging surface cell)、C細胞、心肌細胞、泡心細胞、主細胞、軟骨細胞、克拉拉細胞、柱狀上皮細胞、黃體細胞、蛻膜細胞、樹突、內分泌細胞、內皮細胞、腸內分泌細胞、嗜酸細胞、紅細胞、球外系膜細胞、胎兒成纖維細胞、胎兒紅細胞、成纖維細胞、卵泡細胞、神經節(jié)細胞、巨大貝茲細胞、杯狀細胞、毛細胞、內毛細胞、I型毛細胞、肝細胞、內皮細胞、萊迪希氏細胞、脂肪細胞、肝實質細胞、淋巴細胞、溶菌酶分泌細胞、巨嗜細胞、肥大細胞、巨核細胞、黑色素細胞、系膜細胞、單核細胞、肌上皮細胞、肌樣細胞、頸粘液細胞、神經細胞、中性粒細胞、少突膠質細胞、卵母細胞、成骨細胞、破軟骨細胞、破骨細胞、骨細胞、柱細胞、sulcal細胞、甲狀旁腺細胞、壁細胞、胃蛋白酶分泌細胞、周細胞、松果體細胞、垂體細胞、漿細胞、血小板、足細胞、精母細胞、浦肯野細胞、錐體細胞、紅細胞、網織紅細胞、施萬細胞、支持細胞、柱狀細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、促生長素抑制素細胞、腸內分泌細胞、精子細胞、精原細胞、精子、星形細胞、支持戴特斯細胞、支持漢森細胞、表面細胞、表面上皮細胞、表面粘液細胞、汗腺細胞、T淋巴細胞、膜黃體細胞、胸腺細胞、胸腺上皮細胞、甲狀腺細胞、過渡上皮細胞、I型肺泡細胞和II型肺泡細胞。
腫瘤細胞的實例包括腺瘤、癌、腺癌、纖維腺瘤、成釉細胞瘤、星形細胞瘤、間皮瘤、膽管細胞癌、膽管纖維瘤、膽管瘤、軟骨瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、絨毛膜癌、顱咽管瘤、囊腺癌、囊腺瘤、無性細胞瘤、室管膜瘤、上皮瘤、紅細胞性白血病、纖維腺瘤、纖維瘤、纖維肉瘤、神經節(jié)神經膠質瘤、神經節(jié)瘤、成神經節(jié)細胞瘤、神經膠質瘤、粒細胞性白血病、血管瘤、血管外皮細胞瘤、血管肉瘤、冬眠瘤、組織細胞瘤、角化棘皮瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、脂肪瘤、脂肉瘤、黃體瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴瘤、成神經管細胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、間皮瘤、骨髓脂肪瘤、腎母細胞瘤、神經母細胞瘤、肌神經母細胞瘤、牙瘤、少突神經膠質瘤、骨軟骨瘤、骨瘤、骨肉瘤、乳頭狀瘤、副神經節(jié)瘤、嗜鉻細胞瘤、松果體瘤、垂體細胞瘤、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、神經鞘瘤、精原細胞瘤、畸胎瘤、泡膜細胞瘤和胸腺瘤。
細菌的實例包括金黃色葡萄球菌、嗜肺菌團菌(Legionellapneuynophila)、大腸桿菌(Escherichia coli)、結核分枝桿菌(M.tuberculosis)、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、霍亂弧菌(Vibriocholera)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfrtazgens)、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、巴氏梭菌(Clostridium baratii)、艱難梭菌(Clostridium difficile)、麻風分枝桿菌(M.leprae)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、B型流感嗜血桿菌(Hemophilus influenzae type b)、白喉桿菌(Corynebacteriurndiphtheriae)、微小棒狀桿菌(Corynebacterium minutissimum)、百日咳桿菌(Bordetella pertussis)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitides)、痢疾致賀氏菌(Shigella dysenteriae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)、產黑素普雷沃氏菌(Prevotella melaninogenica)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、單核細胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、杜氏嗜血桿菌(Hemophilus ducreyi)、土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisellatularensis)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)、漢氏巴爾通氏體(Bartonella henselae)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)、變形菌屬(Proteus)和致賀氏菌屬(Shigella)。
螺旋體的實例包括蒼白密螺旋體(Treponemapallidum)、極細密螺旋體(Tpertenue)、斑點病密螺旋體(Tcarateum)、回歸熱疏螺旋體(Borrelia recurrentis)、奮森氏疏螺旋體(B.vincentii)、布氏疏螺旋體(B.burgdorferi)和出血黃疸鉤端螺旋體(Leptospira icterohaemorrhagiae)。
真菌的實例包括牛型放線菌(Actinomyces bovis)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、白色念珠菌、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、新型隱球菌(Cryptococcusenoformans)、莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)、申克氏孢子絲菌(Sporotrichum schenckii)、衣氏放線菌(Actinomyces israelii)、牛型放線菌、煙曲霉、皮炎芽生菌、白色念珠菌、粗球孢子菌、新型隱球菌、莢膜組織胞漿菌、星狀諾卡氏菌(Nocardia asteroides)、卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、申克氏孢子絲菌(Sporothrix schenckii)、巴斯德畢赤氏酵母(Pichiapastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
可以編碼的原生動物和寄生蟲的實例包括惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、痢疾內阿米巴(Entamoeba histolytica)、錐蟲(trypansomes)、利什曼原蟲(Leishmania)、剛地弓形蟲(Toxpolasmagondii)、賈第鞭毛蟲(Giardiala lamblia)和沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)。
當目標是多核苷酸時，該目標多核苷酸可以是單鏈、雙鏈或更高級的，并可以是任何拓撲結構例如線性、環(huán)狀、分支。單鏈目標多核苷酸的實例包括mRNA、DNA、tRNA、hnRNA、ssRNA或ssDNA病毒基因組，不過這些多核苷酸可以含有內部互補序列和顯著的二級結構。雙鏈目標多核苷酸的實例包括基因組DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA、dsRNA或dsDNA病毒基因組、質粒、噬菌體和類病毒。
傳感器傳感器可以是穩(wěn)定、可溶且能在含醇保存溶液中與它的目標特異性結合的任何物質。傳感器的非限制性實例包括小的有機化學物質、無機分子、上述的多核苷酸包括肽核酸和適體。也可以使用不同傳感器的組合，其允許對樣品中的多種目標進行檢測和分析。傳感器可以是一種被選擇的與細胞成分如中心體或其子成分特異性結合的傳感器?？梢詼y試多種候選傳感器分子例如化學物質庫與期望的目標的結合，該測試可以在醇保存溶液中完成。
傳感器必須是可以檢測的，可以是自然可檢測的或者可以是通過與標記偶聯(lián)而使之成為可檢測的。可以使用任何有效的檢測方法，包括光學法、分光鏡法、電法、壓電法、磁法、拉曼散射法、表面等離子體共振法、放射顯影法、比色法、量熱法等。優(yōu)選傳感器對人和/或檢測裝置是光學可檢測的或者可以使其變?yōu)楣鈱W可檢測的。在一個實施方案中，通過使用發(fā)光二極管(LED)進行檢測。
在一個實施方案中，傳感器可以是與懷疑存在于樣品中的目標多核苷酸特異性結合的PNA。PNA是一種合成核酸類似物，具有肽衍生結構。它具有由重復N-2-氨乙基甘氨酸單元組成的骨架，這些單元通過酰胺鍵而不是DNA中存在的糖-磷酸基連接(1)。PNA通常被稱為“擬DNA”(DNA mimic)，因為它與互補的核酸目標雜交遵守沃森-克里克堿基配對法則(2)。但是由于它們具有肽骨架，PNA帶中性電荷而且具有優(yōu)于DNA的獨特性質，包括熱穩(wěn)定性增加、雜交動力學速率快(為DNADNA雜交速率的50000倍)(3)和對蛋白酶和核酸酶的降解作用具有耐受性。另外，由于其疏水性(4)PNA可以容易地穿過生物體的細胞壁并找到它的核酸目標。這些特征使得PNA成為體外診斷特別是原位雜交的優(yōu)異工具。
在另一個實施方案中，傳感器可以是一種適體。與期望的目標結合的寡核苷酸的制備在Blackwell，T.K.等，Science(1990)2501104-1110；Blackwell，T.K.等，Science(1990)2501149-1152；Tuerk，C.和Gold，L.，Science(1990)249505-510；Joyce，G.F.，Gene(1989)8283-87；1993年12月14日授予Gold等的美國專利5,270,163中描述。這種寡核苷酸被稱為“適體”。Tuerk和Gold描述了名為“systematicevolution ofligands by exponential enrichment”的方法的應用。在該方法中，通過固定于硝酸纖維素濾膜上的期望的核酸結合蛋白來對特定部位上完全隨機的一組RNA進行結合選擇。然后回收結合的RNA并擴增為能進行后續(xù)體外轉錄的雙鏈DNA。然后將新轉錄的RNA通過這一方法循環(huán)以富集具有共有序列的寡核苷酸以與關連蛋白結合。然后可以對這樣獲得的寡核苷酸進行測序以用于進一步研究。Tuerk和Gold將該方法用于識別通過T4DNA聚合酶的RNA結合域結合的RNA寡核苷酸。
可以在醇保存溶液如PreservCyt中測試含有適體的傳感器的結合，或者可以通過使用這種溶液的測定法進行。傳感器適體可以通過已知的任何方法包括合成、重組和純化方法制備，且可以單獨使用或與其它對同一目標特異的適體組合使用。適體可以標記到和/或綴合于其它物質上。術語“適體”特別包括含有衍生自將兩種或多種已知適體與給定目標相比較的共有序列的“二級適體”。適體的制備在1996年12月10日授予Toole等的美國專利5,582,981中有廣泛的討論。用作確定適體傳感器的特異性結合序列的原料的寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA。原料寡核苷酸將含有隨機序列部分，通常包括約10-400個核苷酸，更優(yōu)選20-100個核苷酸。隨機序列被引物序列側翼，這允許將聚合酶鏈反應應用到從復合物中獲得的寡核苷酸?？梢詫l(fā)現(xiàn)與目標結合的適體分離、測序然后再合成為常規(guī)DNA或RNA部分，或者可能是上述的“修飾的”多核苷酸。例如，通常存在的任一羥基可以被磷酸酯基、磷酸基替代、被標準保護基保護或被活化以準備與另外核苷酸的另外連接，或者可以與固體載體綴合。通常5′末端的OH是游離的但可以被磷酸化，3′末端的OH取代基也可以被磷酸化。羥基還可以衍生為標準保護基。一個或多個磷酸二酯鍵可以被另外的連接基替代。這些另外的連接基包括但不限于下述實施方案其中P(O)O被P(O)S、P(O)NR2、P(O)R、P(O)OR′、CO或CNR2替代，其中R是H或烷基(1-20C)，而R′是烷基(1-20C)；此外，該基團可以通過O或S與相鄰的核苷酸相連。連接并不需要都相同?？梢源_定對于任何期望目標例如中心體成分的適體。小分子如2002年4月9日授予Kong的美國專利6,368,818中描述結晶劑也可以用于與細胞器包括中心體、微管和/或細胞骨架結合。
細胞分裂過程涉及一系列受控、互相依賴的生化反應，首先產生染色體拷貝，之后是細胞分裂。稱為有絲分裂的該過程開始時包括亞細胞器的形成，亞細胞器提供了細胞分裂所必需的結構骨架。一個重要的細胞器是中心體，其與相關成分一起起定位點的作用，微管蛋白網絡可以從這個定位點將母細胞DNA與子細胞的分開。正常的靜止細胞通常具有一個中心體，但在細胞分裂之前有中心體復制，因此形成兩個定位點。癌細胞或導致癌癥的前體細胞可能具有異常的中心體數(shù)目。因此中心體計數(shù)可以用來識別異常細胞。
在一種實施方案中，提供通過使樣品與引入醇保存溶液中的中心體特異的傳感器接觸，之后將從該混合物中取出的樣品進行定量成像而進行中心體計數(shù)的方法。因此，可以使用優(yōu)先與中心體或中心體外周物質結合的傳感器以允許通過視覺檢查或通過計算機成像來進行中心體計數(shù)。中心體目標分子的實例包括劍蛋白、劍蛋白亞基(參見2002年8月6日授予Vale等的美國專利6,429,304)、eg5(參見2002年10月29日授予Uhlmann等的美國專利6,472,521)、Nlkl(參見美國專利6,476,193)、HSP90(參見2002年1月1日授予Gonzalez等的美國專利6,335,157)、trinectin、中心粒周蛋白(pericentrin)、cpl40、中心體蛋白、γ-微管蛋白、α-微管蛋白、β-微管蛋白(參見1999年10月26日授予Doxsey的美國專利5,972,626)、CENP-F(參見1997年2月4日授予Yen等的美國專利5,599,919)、aurora蛋白(參見美國專利6,207,401、5,972,676和5,962,312)和BTAK(參見美國專利6,352,858)。本文使用的術語“中心體”和“中心體的”等是指中心體外周區(qū)域以及中心體區(qū)域，因此例如術語“中心體目標”包括中心體外周目標以及中心體目標。傳感器還可以包括可檢測的中心體酶的底物，該底物在結合時可以是可檢測的和/或在被中心體酶作用時可以產生可檢測的反應產物。
標記本文描述的用于本發(fā)明的標記包括與樣品中存在的目標締合的當傳感器與目標結合時可以直接或間接被檢測的任何物質。標記的實例包括發(fā)色團、發(fā)光團、熒光團、色原體、半抗原、抗原、放射性同位素、磁性顆粒、金屬納米顆粒如金或銀納米顆粒、酶、抗體或其結合部分或同等物、適體和結合對中的一員。
熒光團可以是吸收一種波長的光而發(fā)射另一種波長的光的任何物質。典型的熒光團包括熒光染料、半導體納米晶體、鑭系元素螯合物和綠色熒光蛋白。
熒光染料的實例包括熒光素6-FAM、羅丹明、德克薩斯紅、四甲基羅丹明、羧基羅丹明、羧基羅丹明6G、arboxyrhodol、羧基羅丹明110、Cascade Blue、Cascade Yellow、香豆素、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy-Chrome、藻紅蛋白、PerCP(多甲藻黃素葉綠素-a蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4，5-二氯-2′，7′-二甲氧基熒光素)、NED、ROX(5-(和-6)-羧基-X-羅丹明)、HEX、熒光黃、Marina Blue、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Alexa Fluor350、Alexa Fluor430、AlexaFluor488、Alexa Fluor532、AlexaFluor546、Alexa Fluor568、AlexaFluor594、Alexa Fluor633、Alexa Fluor647、Alexa Fluor660、Alexa Fluor680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、BODIPYFL、BODIPYFL-Br2、BODIPY530/550、BODIPY558/568、BODIPY564/570、BODIPY576/589、BODIPY581/591、BODIPY630/650、BODIPY650/665、BODIPYR6G、BODIPYTMR、BODIPYTR、它們的綴合物和組合。鑭系元素螯合物的實例有銪螯合物、鋱螯合物和釤螯合物。
本領域已知多種熒光半導體納米晶體(SCNC)，半導體納米晶體的制備和使用方法在1999年5月27日公開的發(fā)明人為Bawendi等的PCT公開WO 99/26299、1999年11月23日授予Weiss等的美國專利5,990,479和Bruchez等，Science 2812013，1998中有描述?？梢垣@得具有峰發(fā)射波長明確的(well-defined)極窄發(fā)射帶的半導體納米晶體，這允許許多不同的SCNC在同一測定中作為信號發(fā)色團，任選與其它非SCNC型信號發(fā)色團組合使用。
術語“綠色熒光蛋白”既指天然水母綠色熒光蛋白也指已經確定的表現(xiàn)改變的熒光特征的突變型，改變的熒光特征包括改變的激發(fā)和發(fā)射最大波長以及不同的激發(fā)和發(fā)射光譜形狀(Delagrave，S.等，(1995)Bio/Technology 13151-154；Heim，R.等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9112501-12504；Heim，R.等，(1995)Nature 373663-664)。Delgrave等分離了克隆Aequorea victoria GFP的激發(fā)光譜發(fā)生紅移的突變型(Bio/Teclinology 13151-154(1995)。Heim，R.等報道了具有藍色熒光的突變型(Tyr66至His)(Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)USA 9112501-12504)。
酶的實例包括在含醇保存溶液中穩(wěn)定的酶。在這些條件下可以測試它們穩(wěn)定性的酶包括堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、細菌熒光素酶、昆蟲熒光素酶和海腎(sea pansy)熒光素酶(Renilla koellikeri)，它們在本領域已知的合適的底物的存在下和測定條件下可以產生可檢測的信號。
半抗原和/或結合對成員的實例包括抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素、地高辛配基、生物素以及上述的那些。
保存溶液保存溶液適用于在室溫下保存細胞和組織。該溶液含有醇且優(yōu)選含有緩沖劑，并可以用于生物活組織檢查之后和染色或其它分析形式之前在室溫下體外保存哺乳動物細胞。該溶液可以是如1993年10月26日授予Hurley等的美國專利5,256,571中描述的溶液。在一個實施方案中，該保存溶液提供用于相對長期的室溫保存的介質。在另一個實施方案中，該保存溶液提供用于轉運和除去樣品溶液中不期望的成分例如蛋白質的介質。
更特別地，該保存溶液含有可與水混溶的醇且優(yōu)選含有抗聚集劑和緩沖劑。醇組分以足以固定樣品細胞或組織同時仍使得傳感器與它的目標有可接受的結合的量存在。醇通常是低級烷基(C1-6)醇，可以是C1-4醇，可以選自甲醇、乙醇和異丙醇。在優(yōu)選實施方案中，該醇是甲醇。
在本發(fā)明的一個實施方案中，醇以足以固定和保存感興趣的樣品成分的水平存在，可以以高于約40％且低于約60％的量存在，可以為約45％或以上，可以為約55％或以下。含約60％或以上醇的溶液傾向于表現(xiàn)聚集或凝結，這干擾了后續(xù)的將樣品細胞有效染色的能力。相反，如果在該實施方案中醇濃度為40％或以下，那么細胞就不能充分固定以進行相對長期的保存，而是隨時間引起細胞降解。在該實施方案中，該溶液含有占溶液的約50％的甲醇。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，醇以占溶液的至少20％的量存在。盡管如上所述，這一濃度的醇不能夠實現(xiàn)長期保存(即多于兩日)，但它在該時間內充分地固定細胞以進行后續(xù)分析?；蛘?，可以將細胞從該20％的實施方案溶液轉移至較高濃度例如50％的醇溶液中以進行后續(xù)的于分析之前的長期保存。
抗聚集劑可以以足以防止細胞在溶液中聚集的量存在?？梢允褂迷诖急４嫒芤褐杏行У娜魏魏线m的抗聚集劑，可以是例如螯合劑，該螯合劑選自例如乙二胺四乙酸(EDTA)及其鹽如二鈉鹽、三鉀鹽和四鈉鹽。認為可用作抗聚集劑的其它活性劑包括cuminin、肝素、鏈激酶以及存在于溶解或抗凝劑組合物中的活性劑。
可以使用能在使用期間將保存溶液維持在所期望的pH的任何緩沖劑。緩沖劑的實例包括PBS、Tris、乙酸鈉和枸櫞酸。EDTA及其鹽也可以用作緩沖劑。優(yōu)選在保存期間將溶液pH維持在約4至約7之間的緩沖劑。因此，優(yōu)選的緩沖劑是乙酸鹽緩沖劑如乙酸鈉、乙酸鎂、乙酸鈣和它們的組合。雖然在本發(fā)明的溶液中也可以使用其它緩沖劑如磷酸鹽或Tris緩沖劑，但是認為這些緩沖劑對在期望的pH處的有效緩沖范圍不如乙酸鹽廣泛。
所使用的緩沖劑特別是長期儲存所使用的緩沖劑優(yōu)選具有大的緩沖范圍以調節(jié)因懸浮于溶液中的樣品細胞的自溶副產物所導致的任何pH變化。例如，頸細胞老化時它們釋放改變懸浮溶液的pH平衡的自溶副產物。此外，保存不同的細胞類型可能需要不同酸度和不同pH范圍的溶液。因此，具有寬的緩沖范圍的溶液可以用于多種細胞類型。
在一個實施方案中，該保存溶液含有甲醇、作為酸的EDTA和乙酸鈉。在該實施方案中，該溶液含有占約45-55％的甲醇、占約2-4％的EDTA和占約6-8％的乙酸鈉緩沖劑。
在另一個實施方案中，該保存溶液含有甲醇、EDTA鈉鹽和鉀鹽的組合和乙酸鹽緩沖劑。在另一個實施方案中，該溶液含有甲醇、乙酸鎂、乙酸鈣、氯化鉀和氯化鈉，其中醇占溶液的約20％，氯化鈉占約0.1％，氯化鉀為10mM，乙酸鈣為2mM且乙酸鎂為1mM。
該保存溶液適用于在約4℃至約8℃的環(huán)境溫度下保存懸浮的細胞至少約三周。在這期間，細胞保留足以染色的結構而沒有完整性的顯著丟失。該溶液可以增強細胞的核結構的維持，因為它能維持細胞膜使之足以進行后續(xù)的細胞學染色。該溶液還可以破壞樣品中的微生物病原體和抑制逆轉錄病毒的活性。該溶液可以除去樣品中不期望的成分如蛋白質。
該持續(xù)期間可以被該溶液在環(huán)境細胞懸浮之前的儲存時間、細胞取樣與細胞懸浮之間的時間和含醇量所改變。例如，如果該溶液已儲存了相當長的一段時間，無論是冷藏狀態(tài)還是室溫狀態(tài)，那么該溶液剩下的保存細胞生存力都可能是有限的。
除了保存細胞之外，該溶液還可以殺死選擇的病原體。例如，該溶液有效地殺死測試樣品中的下列微生物白色念珠菌、黑曲霉(Aspergillus niger)、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。
在溶液中可以使用洗滌劑。該洗滌劑可以是非離子的、陽離子的、陰離子的或兩性離子的。也可以使用洗滌劑的混合物。洗滌劑種類的實例包括醇醚硫酸鹽、醇硫酸鹽、烷醇酰胺、烷基磺酸鹽、胺氧化物、兩性洗滌劑、陰離子洗滌劑、甜菜堿衍生物、陽離子洗滌劑、二磺酸鹽、十二烷基苯磺酸、乙氧基化醇、乙氧基化烷基苯酚、乙氧基化脂肪酸、甘油酯助水溶物、月桂基硫酸鹽、單酸甘油酯和甘油二酯、非離子洗滌劑、磷酸酯、季銨鹽洗滌劑和脫水山梨糖醇衍生物。
試劑盒本發(fā)明還提供可含有用于實施本發(fā)明方法的試劑的試劑盒。在一個實施方案中，試劑盒含有醇保存溶液和存在于溶液中時適于與樣品中的中心體目標結合的可檢測的傳感器。該傳感器可以與標記綴合，標記可以是包括熒光團在內的發(fā)色團。
試劑盒的組分可通過包裝物(housing)來保存。使用試劑盒實施本發(fā)明方法的說明書也可以與試劑盒一同提供，它可以以任何固定媒介形式提供。該說明書可以在包裝物之內或之外，可以印刷于使該說明書清楚易讀的形成該包裝物的任一表面的內面或外面上。該試劑盒可以是多重的形式，含有多種可以與樣品中的相應的不同目標結合的一種或多種不同傳感器。
實施例闡述以下的實施例是為了向本領域普通技術人員提供如何制備和使用本發(fā)明的完整實施方式，而無意限制本發(fā)明的范圍。雖然努力確保所使用數(shù)字的準確性(例如量、溫度等)，但是應考慮存在一些實驗誤差和偏差。若非另外說明，部分是以重量計部分，溫度是攝氏度，壓力是或者接近于大氣壓，所有的材料均可商購獲得。
實施例1將50μl體積的PNA混合入含有一定體積的細胞PreservCyt(Cytyc Corp.)的ThinPrep小瓶(Cytyc Corp.)或微離心管中，雜交事件在溶液中使用55℃的水浴進行?；蛘?，雜交事件在室溫下進行過夜。雜交后，將標本以12000rpm離心5分鐘，使細胞沉淀然后重懸于一定體積的洗滌緩沖液中。通過將樣品置于55℃水浴中30分鐘來洗滌細胞。洗滌后，將樣品再次以如上所述的方法離心，再次重懸于一定體積的新洗滌緩沖液中，然后轉移至載玻片上。將載玻片風干，蓋上蓋玻片并觀察是否陽性(多個視野中存在一簇一簇的綠色熒光生物體)?；蛘?，也可以通過在T2處理器上處理標本來洗滌標本，制備載玻片(T2操作的細胞收集處理期間除去未結合的探針)。這里制備的載玻片被T2處理器釋放至含有1×洗滌緩沖液(AdvanDx)的收集小瓶中，然后在55℃的緩沖液中溫育30分鐘。
實施例2建立了通過FISH(熒光原位雜交)使用PNA技術檢測PreservCyt溶液中的微生物的方法。
這些研究中使用的PNA探針來自于AdvanDx，Inc。AdvanDx，Inc.經Boston Probes，Inc.許可生產檢測金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的PNA試劑盒。期望用途是檢測從血液培養(yǎng)物制備的涂片中的白色念珠菌和黃色葡萄球菌(僅供研究使用)。
在PreservCyt中的溶液內雜交步驟1.將50μl PNA探針加入500μl PreservCyt標本*中，渦旋混合。置于55℃水浴中(90min或過夜)雜交。
2.在T2處理器上處理標本以將細胞轉移至ThinPrep載玻片上。制備好細胞點后，儀器會把載玻片釋放入含有1×洗滌緩沖液(AdvanDx)的收集小瓶中。
3.將載玻片(浸沒在1×洗滌緩沖液中)在55℃水浴中溫育30分鐘。
4.取出載玻片，風干。固定，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。通過多個視野中存在一簇一簇的綠色熒光生物體來確定陽性。
*該方法主要是使用加入了白色念珠菌或金黃色葡萄球菌的細胞PreservCyt來實施。但是，使用長達四年的白色念珠菌陽性ThinPrep標本(載玻片基)也已經證實了該測定法的性能。
常規(guī)方法(AdvanDx試劑盒插入頁中所描述)1.將一滴固定溶液(AdvanDx)置于顯微鏡載玻片(AdvanDx)上，然后加一滴血液培養(yǎng)物標本并混合。
2.通過將涂片在55-80℃下加熱20分鐘以固定。
3.將載玻片浸入80％或96％乙醇中5-10分鐘，風干。
4.將一滴PNA探針加至固定的涂片上，蓋上蓋玻片，在55℃下溫育90分鐘雜交。
5.將載玻片置于55℃下預熱的1×洗滌溶液中，移去蓋玻片。在55℃的洗滌溶液中溫育30分鐘。
取出載玻片，風干。固定，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。通過多個視野中存在一簇一簇的綠色熒光生物體來確定陽性。
結論在PreservCyt中進行溶液內雜交證實了用ThinPrep小瓶進行輔助分子測試的技術。這表明含有PNA探針的ThinPrep標本可以在FISH后在ThinPrep 2000處理器上進行處理，而不損害目標進行PNA雜交事件。細胞和目標生物體都被轉移至載玻片上，形成比常規(guī)涂片法更容易解析的單層細胞。另外，ThinPrep處理器使從樣品中除去未結合的PNA容易，使得制備的載玻片具有較低的背景噪音。在ThinPrep小瓶中進行雜交和在ThinPrep處理器上制備載玻片在使輔助分子測試的過程流線化的同時通過減少步驟而使FISH方法簡化。
權利要求
1.一種測定方法，其包括提供懷疑含有中心體目標的樣品；提供可以在醇保存溶液中與所述中心體目標結合的可檢測的傳感器；如果目標存在的話，使所述樣品在所述傳感器能夠與所述目標結合的條件下在醇保存溶液中與所述傳感器接觸；檢測所述傳感器是否與所述目標結合。
2.權利要求1的方法，其中所述樣品選自血液；尿；精液；乳汁；痰；粘液；胸腔液；盆腔液；滑膜液；腹水；體腔灌洗液；眼刷物；皮膚刮下物；口腔拭物；陰道拭物；巴氏涂片物；直腸拭物；吸出物；穿刺活組織檢查物；組織切片；血漿；血清；脊髓液；淋巴液；皮膚、呼吸道、腸道或泌尿生殖道的外分泌物；淚液；唾液；腫瘤；器官；和體外細胞培養(yǎng)物成分。
3.權利要求1的方法，其中所述傳感器包括適體。
4.權利要求1的方法，其中所述傳感器包括多核苷酸。
5.權利要求1的方法，其中所述傳感器包括肽核酸。
6.權利要求1的方法，其中所述傳感器包括鎖定核酸。
7.權利要求1的方法，其中所述傳感器與發(fā)色團綴合。
8.權利要求7的方法，其中所述發(fā)色團是熒光團。
9.權利要求8的方法，其中所述熒光團選自半導體納米晶體、熒光染料和鑭系元素螯合物。
10.權利要求9的方法，其中所述熒光團是半導體納米晶體。
11.權利要求9的方法，其中所述熒光團是熒光染料。
12.權利要求11的方法，其中所述熒光染料是熒光素。
13.權利要求9的方法，其中所述熒光團是鑭系元素螯合物。
14.權利要求1的方法，其中所述樣品是細胞部分。
15.權利要求1的方法，其中所述樣品被轉移至基材上。
16.權利要求1的方法，其中所述基材是載玻片。
17.權利要求1的方法，其中所述基材是蓋玻片。
18.權利要求1的方法，其中所述樣品是活組織檢查樣品。
19.權利要求1的方法，其中所述樣品是巴氏涂片物。
20.權利要求1的方法，其中所述樣品進一步進行染色步驟。
21.權利要求1的方法，其中所述染色步驟是巴氏染色步驟。
22.權利要求1的方法，其進一步包括將從所述檢測步驟得到的結果與從對照樣品得到的結果相比較。
23.權利要求22的方法，其中所述對照樣品是陽性對照。
24.權利要求22的方法，其中所述對照樣品是陰性對照。
25.權利要求1的方法，其進一步包括在所述檢測步驟之前洗滌所述樣品。
26.權利要求1的方法，其中所述傳感器與可檢測的部分綴合。
27.權利要求1的方法，其中所述傳感器本身是可檢測的。
28.權利要求1的方法，其中所述方法為自動化的。
29.權利要求1的方法，其中所述方法手動完成。
30.權利要求28的方法，其中所述自動化方法通過自動化成像系統(tǒng)完成。
31.權利要求31的方法，其中所述自動化成像系統(tǒng)定量一部分樣品中存在的中心體的數(shù)目。
32.權利要求1的方法，其中所述中心體目標選自劍蛋白、劍蛋白亞基、eg5、Nlkl、HSP90、trinectin、中心粒周蛋白、cpl40、中心體蛋白、γ-微管蛋白、α-微管蛋白、β-微管蛋白、CENP-F、aurora蛋白和BTAK。
33.一種識別與中心體目標特異性結合的傳感器的方法，其包括使含有中心體的樣品與可檢測的傳感器接觸，其中所述接觸在保存溶液中進行，所述保存溶液含有一定量的一種或多種有效地防止這種溶液被至少一種污染物污染的水溶性醇；和檢測所述傳感器是否已經與中心體目標結合。
34.權利要求33的方法，其中所述方法對多種候選傳感器進行。
35.一種保存?zhèn)鞲腥芤海浒跇悠反嬖谙掠行П３秩芤簩χ辽僖环N污染物的無菌性的量的水溶性醇；緩沖溶液；抗聚集劑；和能夠與該含醇溶液中的中心體目標特異性結合的可檢測的傳感器。
36.權利要求35的溶液，其中所述醇選自乙醇、異丙醇和甲醇。
37.權利要求35的溶液，其中所述醇是甲醇。
38.權利要求35的溶液，其中所述抗聚集劑是選自乙二胺四乙酸及其鹽的螯合劑。
39.權利要求35的溶液，其中所述緩沖劑選自磷酸鹽緩沖鹽水、Tris緩沖劑、乙酸鈉、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸鹽、枸櫞酸和枸櫞酸鹽。
40.權利要求35的溶液，其中所述緩沖劑是乙酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在醇保存溶液(preservativesolution)中檢測目標物質和用于識別用于與這些目標結合的傳感器(sensor)的方法、物品和組合物。該方法使得樣品的充分固定和可檢測的傳感器與樣品中感興趣的目標的結合同時進行。一方面，本發(fā)明提供一種方法，其包括使懷疑含有目標的樣品與已知與這種目標結合的可檢測的傳感器分子在醇保存溶液中接觸。該方法可以以多重的形式(multiplexform)進行以同時分析多種目標。本發(fā)明還提供識別在醇保存溶液中能夠與期望的目標結合的傳感器的方法。本發(fā)明還提供含有一種或多種這種可檢測的傳感器的醇保存溶液。本發(fā)明還提供含有由這種方法提供的結合傳感器的樣品。本發(fā)明還提供用于這些方法的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1816634SQ200480018678
公開日2006年8月9日 申請日期2004年7月9日 優(yōu)先權日2003年7月11日
發(fā)明者詹姆斯·林德, 邁克爾·科恩福特, 埃林·科夫曼, 布萊恩·B·蘭特里奇亞 申請人:Cytyc公司