專利名稱：選擇性產(chǎn)生雄性或雌性不育植物的方法
作物中的雜種優(yōu)勢可具有顯著的提高產(chǎn)量的效應(yīng)。通常，與非雜交品種相比，雜種表現(xiàn)出增加的產(chǎn)量。雜種通常給生長因素例如水和肥料以更高的回報單位。雜種通常提供更優(yōu)的逆境耐受性、在產(chǎn)量和成熟上的一致性，并且也提供簡單的將以其它方法可能難以組合的特征或性狀給合起來的育種機會。植物中的雜種優(yōu)勢通常大到足以保證商業(yè)利用。商用雜種被廣泛地應(yīng)用于許多作物中，包括玉米、高梁、甜菜、向日葵和油菜(canola)。然而，主要由于缺乏經(jīng)濟的雜交種子生產(chǎn)方法，小麥、大麥和水稻仍然主要以近親交配繁育。
常規(guī)上，雜交種子的生產(chǎn)包括分區(qū)種植雌性和雄性親本系并且只從雌性親本收獲種子。為確保該種子是雜種，必需通過使雌性系產(chǎn)生雄性不育從而將雌性親本的自體受粉減少到最小。用于使雌性親本系雄性不育的方法包括機械的、化學(xué)的和遺傳的方法。在雌雄異體的植物例如玉米中，可很容易地通過除去雄性花序機械地獲得雄性不育。然而絕大部分作物是雌雄同株并且在同一朵花中具有雄性和雌性器官，這使得這種物理去雄不具實用性。因此有時使用遺傳方法。
發(fā)生的遺傳雄性不育性狀通常是由核基因控制的，其中相對于對應(yīng)的與能育性相關(guān)的等位基因，與雄性不育表型相關(guān)的等位基因通常是隱性表達的。在遺傳雄性不育發(fā)生時，其通常與單個隱性基因相關(guān)，所述穩(wěn)性基因必需是純合的，這樣雄性不育才得以表達。為了在實踐中應(yīng)用這種遺傳雄性不育性狀，育種家通常培育表型一致的雌性系，所述雌性系分離成雄性不育和雄性可育植物。需要除去雄性可育植物(一旦鑒定)，這是項費力的工作。因為雄性可育植物對保持群體是必需的，所以不能從群體中將其清除，從而使得保持親本系一直成問題。除了依賴天然存在的雄性不育等位基因外，也可能使用分子生物學(xué)方法。可通過基因工程改造植物，使其表達例如反義或核酶基因，所述基因可降低或消除可育花粉形成所必需的關(guān)鍵基因的表達。這種轉(zhuǎn)基因植物系是雄性不育的，并且通過與來自雄性可育植物的花粉雜交可用來生產(chǎn)雜交種子。這些系的主要問題是通過與等基因可育系雜交，其只能在后代中以雜合狀態(tài)保持。當(dāng)產(chǎn)量非常重要時，這在雜交種子生產(chǎn)中可能是個問題。盡管例如通常將除草劑抗性與雄性不育連鎖起來，就可能選擇性地除去雄性可育植物，但這要確保所述植物一開始要以相當(dāng)高的密度種植。
使用細胞質(zhì)雄性不育用于商業(yè)雜種生產(chǎn)要求有穩(wěn)定的雄性不育細胞質(zhì)和花粉來源。雄性不育細胞質(zhì)遺傳系統(tǒng)要求用于雜種生產(chǎn)的三種類型的系存在，A系(細胞質(zhì)雄性不育系)、B系(雄性可育保持系)和R系(具有恢復(fù)基因的雄性可育系)。用該系統(tǒng)產(chǎn)生的三系雜交涉及4系的保持和生產(chǎn)，近親交配的A和B系和另外兩系的雄性可育近親交配。對單一雄性不育細胞質(zhì)來源的依賴性可使育種的靈活性降到最低并且導(dǎo)致后代大規(guī)模地對特定疾病的易感性。
也可通過抑制有活力的花粉形成的化學(xué)物質(zhì)生產(chǎn)雜交種子。這些化學(xué)物質(zhì)(稱為殺配子劑)用于提供瞬時雄性不育。但是殺配子劑的費用、注冊和可靠性已限制其使用。
常規(guī)的雜種種子生產(chǎn)系統(tǒng)的缺點是需要分行或分區(qū)種植雄性和雌性親本系。在釋放少量不能隨風(fēng)傳播較遠的花粉的作物例如小麥中，低效率的授粉是尤其迫切的問題。在這些作物中多達三分之二的雜種生產(chǎn)田地需要供給雄性花粉供體植物，從而使得雜交種子生產(chǎn)變得很不經(jīng)濟。
為了在小麥或其它作物中獲得更經(jīng)濟的雜交種子生產(chǎn)，需要將雄性和雌性植物移得更近以更有效地傳授花粉；最有效地是在同一行中將雄性和雌性在數(shù)厘米內(nèi)間作。在這種系統(tǒng)中只收獲來自(雄性不育)雌性親本的種子是不現(xiàn)實的。通過在種植混合物中使用盡可能低的這種雄性親本植株和/或通過使用雌性不育的雄性植株可最大限度地減少來自雄性親本的非雜交種子的污染。用于構(gòu)建顯性雌性不育系的方法已在(EP412,006A1(1990)；Goldman等人，(1994)EMBO.J.，13，2976-2984)中描述，但對于雄性不育系，其必須以雜合子保持。
因此，存在著對用于生產(chǎn)雜交種子的簡單經(jīng)濟的方法的需要。特別是為了有效地生產(chǎn)雜交種子，存在著對提供雄性不育雌性親本系和雌性不育雄性親本系的需要，它們可容易地以純的純合系保持和用于有效地生產(chǎn)雜交種子。在本領(lǐng)域中描述的用于實現(xiàn)該目的的方法包括從雄性和雌性親本系生產(chǎn)雜交種子的方法，在所述雄性和雌性親體系中至少有一個包含優(yōu)選地在花組織中表達的異源嵌合基因，所述嵌合基因使得株系條件性地不育，所述不育依賴于外源非毒害植物的物質(zhì)的施用，所述非毒害植物的物質(zhì)可通過由所述異源嵌合基因編碼和優(yōu)選地在雄性或雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達的酶特異性和局部地轉(zhuǎn)化成毒植物素。所述非毒害植物的物質(zhì)可以是前除草劑(pro-herbicide)。具有這種條件性不育親本系的有利方面是允許其以不育性狀的純合體保持。能育性只是在施用外源非植物毒性物質(zhì)時被破壞。在一個這樣的條件性雄性不育系統(tǒng)的例子中，編碼脫乙?；傅幕騼?yōu)選地在雄花組織的絨氈層細胞中表達，在所述細胞中其將外源施用的前除草劑N-乙酰L膦絲菌素轉(zhuǎn)化成毒植物素L膦絲菌素，從而阻止了有活力的花粉形成。在進一步類似的例子中(i)絨氈層優(yōu)選地表達的細菌細胞色素P450催化前除草劑R7402轉(zhuǎn)化成阻止有活力的花粉形成的磺脲毒植物素；和(ii)絨氈層優(yōu)選地表達的膦酸單酯水解酶催化甘油草甘膦將前除草劑轉(zhuǎn)化成阻止有活力的花粉形成的毒植物素草甘膦。WO98/03838描述了條件性雌性不育系統(tǒng)的例子，其中能夠?qū)⑺銮俺輨┺D(zhuǎn)化成植物毒素的酶優(yōu)選地在雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達。
盡管存在這些用于生產(chǎn)條件性不育的雄性和雌性親本系的方法，雜交種子的產(chǎn)量仍然遠不能滿足在作物例如小麥的常規(guī)應(yīng)用。本發(fā)明特別涉及到在本領(lǐng)域內(nèi)提高條件性雄性不育的雌性親本系和條件性雌性不育的雄性親本系的生產(chǎn)。
本發(fā)明涉及改進用于生產(chǎn)作物雜交種子的方法。特別是本發(fā)明涉及從雄性和雌性親本系中生產(chǎn)雜交種子的方法，所述雄性和雌性親本系中至少有一種是條件性雌性或雄性不育的，所述不育依賴于外源施用對作物為非植物毒性的和包括前除草劑的物質(zhì)。本發(fā)明進一步涉及在使條件性不育親本系中自體受精被減少到最低或被阻止的時間和足夠量施用所述非植物毒性物質(zhì)的方法。本發(fā)明也涉及通過用一個或多個嵌合基因轉(zhuǎn)化植物材料以生成條件性雄性或雌性不育植物的方法，其中所述嵌合基因單個地或一起編碼一個或多個能夠與非毒害植物的物質(zhì)(優(yōu)選地以前除草劑的形式存在)反應(yīng)產(chǎn)生毒害植物的物質(zhì)的酶。在一個或多個啟動子有效地控制下表達酶，所述啟動子在條件性雄性不育植物的情況下使所述酶優(yōu)先地在雄性生殖結(jié)構(gòu)中表達或在條件性雌性不育植物的情況下使所述酶優(yōu)先地在雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達。所述植物材料再生成形態(tài)學(xué)正常的能育植物(條件性雄性或雌性不育的植物)。本發(fā)明也包括使用條件性雄性不育植物與條件性雌性不育植物更有效地產(chǎn)生雜交種子，使用某些前除草劑作為非毒害植物的物質(zhì)和使用嵌合基因以更有效地生產(chǎn)雜交種子，本發(fā)明也包括用于本發(fā)明的嵌合基因和酶。本發(fā)明也提供條件性雄性不育、條件性雌性不育植物、這些植物的種子和通過所述方法產(chǎn)生的雜交種子。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，用于所述制備雜交種子的方法的作物是玉米、水稻、高梁、小麥、粟、燕麥、油菜和大麥。
根據(jù)本發(fā)明，提供了生產(chǎn)雄性或雌性不育植物的方法，所述方法包括步驟用編碼至少一種與非毒害植物的物質(zhì)反應(yīng)生成毒害植物的物質(zhì)的酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物材料，并且將所得的轉(zhuǎn)化材料再生成植物，其中將所述非毒害植物的物質(zhì)施用于所述植物直至雄性或雌性配子形成和/或成熟的時候，這樣所述非毒害植物的物質(zhì)提供了選擇性地阻止所述配子形成或使所述配子無功能的毒害植物的物質(zhì)的產(chǎn)生，其中所述酶優(yōu)先地在雄性或雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達，其特征在于(i)所述非毒害植物的物質(zhì)選自D-α氨基酸、非蛋白D-α氨基酸的肽衍生物和(ii)所述酶是在對應(yīng)于野生型纖細紅酵母(Rhodotorula gracilis)D-氨基酸氧化酶的第58位苯丙氨酸的位點上具有賴氨酸的D-氨基酸氧化酶的突變體形式。
由于最大化雜交種子的產(chǎn)量并因此而使對任何作物的損害降到最低是想要的目的，因此在優(yōu)選的實施方案中，所述非毒害植物的物質(zhì)是選自對作物相對為非毒害植物的物質(zhì)的前除草劑。為了能夠影響花組織，前除草劑在‘非綠色’組織中是有效的毒植物素的前體也是想要的。因此，在優(yōu)選的本發(fā)明的實施方案中，前除草劑選自毒植物素的前體，所述毒植物素直接對非綠色組織具有毒害植物的作用而不是選自主要作用位點是光合作用或產(chǎn)生光合色素的那些。使雜交種子生產(chǎn)的成本降到最低也是想要的目的。因此，在優(yōu)選的實施方案中，前除草劑選自化學(xué)物質(zhì)，所述化學(xué)物質(zhì)已獲得合適的管理機構(gòu)批準用于作物或正在審批的化學(xué)物質(zhì)。
術(shù)語定義此處所用的‘基因’是指任何包含幾個有效地連接的DNA片段例如啟動子和5’調(diào)節(jié)區(qū)域、編碼序列以及包含聚腺苷酸化位點的非翻譯3’區(qū)域的DNA序列。
當(dāng)涉及基因或DNA序列時，‘嵌合的’用于表示在自然界中，所述編碼序列與啟動子或與基因中的至少一個其它DNA調(diào)節(jié)區(qū)域不相關(guān)的事實。
如此處所用的，‘嵌合基因’是指一種基因，其中在自然界中基因的編碼序列與啟動子或與至少一個其它DNA調(diào)節(jié)區(qū)域不相關(guān)。
此處所用的‘表達盒’是指包含嵌合基因的可翻譯的DNA區(qū)域，所述嵌合基因的側(cè)翼連接著一個或多個限制性或其它位點，所述位點有利于從一個DNA座位的精確切割和插入另一個座位。
‘非毒害植物的物質(zhì)’在本發(fā)明中是指對用于本發(fā)明方法的植物、任何特定的作物的細胞或組織相對無植物毒害的物質(zhì)。非毒害植物的物質(zhì)不必在所有植物的所有組織中是非毒害植物的。非毒害植物的物質(zhì)包括前除草劑，所述前除草劑是對植物組織沒有可察覺的直接毒害作用但卻是活性毒植物素的前體的物質(zhì)。在易感的植物物種中，這種前除草劑通過內(nèi)源性酶的作用間接地起著除草劑的作用，所述內(nèi)源性酶可在植物體內(nèi)將其轉(zhuǎn)化成毒植物素。
‘毒植物素’在本發(fā)明中是指對在本發(fā)明方法中使用的植物、植物組織和特定作物的植物細胞具有毒害的物質(zhì)。這種毒植物素不必在來自所有植物種類的所有植物細胞中都毒害植物。
‘雌性生殖結(jié)構(gòu)’是指雌性配子和專門負責(zé)雌性配子產(chǎn)生、成熟和生存力的植物部分。通常其包含植物的這些部分，所述部分包含心皮或雌蕊(“花柱”)。植物的心皮包括但不限于柱頭、花柱、子房和由柱頭、花柱和子房包含的細胞或組織。
‘雄性生殖結(jié)構(gòu)’是指雄性配子和專門負責(zé)雄性配子產(chǎn)生、成熟和生存力的植物部分。其包括植物的這些部分，所述部分包括例如小孢子、雄蕊、絨氈層、花藥和花粉。
此處所用的‘雌性不育植物’是在用有功能或有活力的花粉授粉后不能支持有活力的種子形成的植物。這種雌性不育可以是育種選擇或轉(zhuǎn)基因存在造成的?！畻l件性雌性不育植物’是指在正常生長條件下是雌性可育的而在特定的條件下可變成雌性不育的植物。在本發(fā)明中所述條件包括外源施用前除草劑或其它非毒害植物的物質(zhì)。在本發(fā)明中這種‘雌性不育植物’或‘條件性雌性不育植物’保持雄性可育并能產(chǎn)生有活力的花粉。
此處所用的‘雄性不育植物’是不能支持有活力的花粉形成的植物。這種雄性不育可能是育種選擇或轉(zhuǎn)基因的存在造成的。‘條件性雄性不育植物’是指在正常條件下是雄性可育的而在特定條件下可變成雄性不育的植物。例如，所述條件可以包括物理去雄或施用特定的化學(xué)殺配子劑。在本發(fā)明中所述條件特別包括前除草劑或其它非毒害植物的物質(zhì)的外源施用。在本發(fā)明中這種‘雄性不育植物’或‘條件性雄性不育植物’保持雌性可育并能在用有功能或有活力的花粉授粉后產(chǎn)生有活力的種子。
此處所用的‘啟動子區(qū)域’是DNA區(qū)域，所述DNA區(qū)域至少包含功能性啟動子和任選地一些或所有與其相關(guān)的上游調(diào)節(jié)序列(包括增強子序列)和/或相關(guān)的下游序列(包括一些或所有相對于啟動子為內(nèi)源的基因的5’非翻譯區(qū)域)。
此處所用的‘間作’是指在田間種植種子或植物的方法，所述方法確保由雄性可育植物充分地給雄性不育或條件性雄性不育植物異花傳粉。通過在種植植物之前以不同的混合比例(80/20；90/10；等)隨機地混合雌性和和雄性親本種子或通過以特定的田間模式(其中不同種子交替播種)種植來實現(xiàn)該方法。當(dāng)要求從不同植物中分開收獲時，以交替區(qū)或行種植植物是優(yōu)選的。
在本發(fā)明的方法中，所述非毒害植物的物質(zhì)可以和至少一種其它的物質(zhì)混合使用，所述其它物質(zhì)可選自氨基酸、安全劑、殺配子劑、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)劑、細胞色素P450誘導(dǎo)劑、肥料、除草劑、殺線蟲劑、增效劑、殺蟲劑、殺真菌劑、激素、植物生長調(diào)節(jié)劑和細胞色素P450抑制劑。在特定的實施方案中所述非毒害植物的物質(zhì)可與其前體是所述非毒害植物的物質(zhì)的毒害植物的物質(zhì)混合使用。
所述酶是D-氨基酸氧化酶的突變體形式，所述突變體在對應(yīng)于來自纖細紅酵母的野生型D-氨基酸氧化酶的第58位殘基的序列位置上具有賴氨酸，而在所述野生型序列中該殘基是苯丙氨酸(即所述突變體是F58K突變體)，非毒害植物的物質(zhì)可以是D-氨基酸和特別地其可以是膦絲菌素的D對映異構(gòu)體、雙丙氨膦的D對映異構(gòu)體或選自D-天冬氨酸和D-谷氨酸。
突變D-氨基酸氧化酶(DAMOX)可以來源于例如由紅冬孢屬物種(紅酵母屬物種)、三角酵母屬物種、豬、鐮孢屬物種、假絲酵母屬物種、裂殖糖酵母屬物種和輪枝孢屬物種產(chǎn)生的酶和也可以例如選自具有對應(yīng)于Swissprot檢索號P80324、Q99042、P00371、P24552或SPTREMBL號Q9HGY3和Q9Y7N4的序列的蛋白的F58K等同突變體。編碼野生型D-氨基酸氧化酶的起始DNA序列可選自例如包含于EMBL登錄號A56901、RGU60066、Z50019、SSDA04、D00809、AB042032、RCDAAOX、A81420和SPCC1450的序列。
特別優(yōu)選的D-氨基酸氧化酶是來自纖細紅酵母的酶的突變體形式。這種突變體總是在第58位上具有賴氨酸(即其是野生型序列的F58K突變體)和可以在其它的位點發(fā)生突變，以及特別地可在位點213、223和238(與野生型序列比較時)上進一步包含單、雙或三氨基酸替代。優(yōu)選地213位點的野生型甲硫氨酸被His、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代和/或223位點的野生型酪氨酸被His、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代和/或238位點的野生型酪氨酸被His、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代。在特別優(yōu)選的實施方案中213位點上的甲硫氨酸被絲氨酸取代。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中位點213的甲硫氨酸被蘇氨酸取代。
當(dāng)非毒害植物的物質(zhì)是D-氨基酸而不是D-膦絲菌素或D-雙丙氨膦時，那么所述D-氨基酸優(yōu)選地不是內(nèi)源植物代謝物并且被選擇作為在韌皮部內(nèi)流動的、在植物中代謝穩(wěn)定(優(yōu)選地在植物中具有大于約1周的t1/2)并且為D-氨基酸氧化酶的有效底物的物質(zhì)。通過酶進行的D-氨基酸氧化伴隨著氧還原為毒害植物的過氧化物陰離子。
在優(yōu)選的實施方案中所述氧化酶被靶向至除了過氧化物酶體以外的亞細胞位置。例如，通過修飾基因例如刪除或修飾三個C-末端氨基酸(例如在來源于纖細紅酵母的D-氨基酸氧化酶的情況下是SKL)和/或通過向序列的N末端加上葉綠體或線粒體轉(zhuǎn)運肽序列可實現(xiàn)該目的。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和通過本公開內(nèi)容改進的突變和選擇方法優(yōu)選地可從真菌來源獲得其它合適的D-氨基酸氧化酶。
通過在合適的宿主細胞例如大腸桿菌(E.coli)或酵母(合適宿主株系缺少針對D-膦絲菌素的內(nèi)源性氧化酶或脫氫酶活性)中表達候選突變體D-氨基酸氧化酶文庫獲得適合用于本發(fā)明的進-步的突變體D-氨基酸氧化酶和DNA編碼序列，所述宿主細胞經(jīng)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生具有增強的對基本培養(yǎng)基中的D-膦絲菌素產(chǎn)生的生長抑制作用敏感的表型。該方法依賴于經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌克隆通過其內(nèi)源L轉(zhuǎn)氨酶活性和異源表達的氧化酶相結(jié)合的作用從D-PPT產(chǎn)生L-PPT的能力?？蛇x擇地，在就想要的氧化D-膦絲菌素的活力在體外測定所表達的酶的基礎(chǔ)上選擇合適的和改進的基因。存在許多用于直接測定D-氨基酸氧化酶活性的方法，例如基于通過使用氧電極除去氧來進行過氧化物(EnzymeMicrob.Technol.，(2000)，27(8)，605-611)檢測或基于氨或酮酸產(chǎn)物的直接檢測的方法。
在本發(fā)明的實施方案中，將來源于真菌的DAMOX基因克隆入穿梭載體，處于能夠在宿主生物體中表達的啟動子(例如GAL啟動子)有效控制下，所述宿主生物體是要在其中進行選擇的生物體(優(yōu)選地是酵母)。然后將該基因接受誘變，例如通過經(jīng)Mn2+中毒的PCR；在DNA復(fù)制/編輯過程中有缺陷的株系例如大腸桿菌株系XL1 red中復(fù)制質(zhì)粒DNA；或通過在使用例如X射線、UV光、加入化學(xué)誘變劑進行誘變的宿主株系中復(fù)制質(zhì)粒DNA并轉(zhuǎn)化入宿主生物體(優(yōu)選地是酵母)中。通過例如下列選擇方式，選擇想要的編碼DAMOX(具有想要的增強的氧化D-PPT的能力的特性)的DNA(在任選的基于存在于所述穿梭載體上的選擇標記的初步選擇步驟之后，所述標記允許例如通過原養(yǎng)型的恢復(fù)或在潮霉素存在的情況下生長等進行篩選)，例如a)具有利用化學(xué)上與D-膦絲菌素相似的氨基酸作為唯一氮源的能力的轉(zhuǎn)化細胞的選擇。例如，選擇能夠在作為唯一N源的D-PPT(和其酯)的類似物上生長的轉(zhuǎn)化酵母菌落，在所述D-PPT類似物中次膦酸部分被羧酸(即D-谷氨酸)、磺酸、膦酸、砜或亞砜部分(或其酯)取代。例如
b)能夠利用D-PPT自身作為唯一N源的轉(zhuǎn)化細胞的選擇。為進行該選擇，也用能夠消除L-膦絲菌素對谷氨酰胺合成酶的抑制作用的基因轉(zhuǎn)化宿主細胞。例如所述穿梭載體也包含編碼酶例如使L-PPT失活的PAT的基因。
重復(fù)突變和選擇周期。可進一步克隆、表達、部分純化和動力學(xué)表征D-氨基酸氧化酶以鑒定具有最合適特性的(例如酶穩(wěn)定性、針對D-PPT氧化的高kcat/Km值、對任何內(nèi)源性植物底物的最低氧化、最優(yōu)pH等)基因和DAMOXs。
當(dāng)非毒害植物的物質(zhì)是D-膦絲菌素(PPT)時其可從D和L PPT混合物中獲得。例如，當(dāng)大腸桿菌經(jīng)轉(zhuǎn)化以高水平(例如，在加入IPTG后誘導(dǎo)地)表達PAT基因(編碼將乙?；鶊F從乙酰CoA轉(zhuǎn)移至L-PPT的酶)時可向大腸桿菌細胞(任選地使N-乙酰PPT脫乙?；富钚缘谋尘八浇档阶畹偷腶rgE突變體)的培養(yǎng)基(優(yōu)選地基本培養(yǎng)基)中加入DL PPT。優(yōu)選地，所述大腸桿菌也通過基因工程改造以表達乙酰CoA合成酶。在經(jīng)歷允許膦絲菌素的L組分基本上全部被N-乙?；?例如通過使用31-P NMR監(jiān)控判斷)的合適時間后，通過使用例如在高和低pH下溶劑提取，陰離子和陽離子交換層析，用手性陽離子例如chinchocine進行選擇性結(jié)晶或其它本領(lǐng)域已知的方法(例如用兩種非混溶的水相作為相系統(tǒng)(USP5,153,355中的方法)進行液體/液體抽提)的連續(xù)步驟從無細胞培養(yǎng)基中回收和純化D-PPT。通常后面的步驟是對以銨鹽回收的D-PPT進行陽離子交換層析。
可選擇地，通過酶促方法可獲得D-PPT，其中通過(I)L-氨基轉(zhuǎn)移酶(例如來自大腸桿菌)和(II)谷氨酸脫羧酶的結(jié)合作用將DLPPT+2-酮戊二酸主要轉(zhuǎn)化成D-PPT、2-氧代PPT(和其脫羧產(chǎn)物)和GABA的混合物。使用本領(lǐng)域已知的和上面所述的方法從所述反應(yīng)混合物中將想要的純D-PPT解析出來。
D-PPT也可通過使用酶促方法獲得，其中通過(I)L-氨基轉(zhuǎn)移酶和(II)谷氨酸脫氫酶的結(jié)合作用將DL PPT+2-酮戊二酸+NAD主要轉(zhuǎn)化成D-PPT、2-氧代PPT(和其脫羧產(chǎn)物)NADH和氨的混合物。從反應(yīng)混合物純化所需的D-PPT。
在制備D-PPT的進一步方法中，用L氨基酸氧化酶處理DL PPT以使剩余的氨基酸僅僅是想要的D型。然后從所述反應(yīng)混合物中純化該D-PPT。
進一步的方法包括(I)將DL PPT轉(zhuǎn)化成N-乙酰DL PPT(使用乙酸酐或其它乙?；噭┖捅绢I(lǐng)域已知的方法)和(II)用D?；被崴饷柑幚鞱-乙酰DL PPT以使只有N-乙酰-D-PPT脫乙?；?。從所述反應(yīng)混合物中純化所得的D-PPT。例如，通過結(jié)合Dowex陰離子交換樹脂和用40mM甲酸洗脫將D-PPT從N-乙酰-L-PPT中解析出來。在合適的上樣條件下，該酸洗脫D-PPT同時保留與柱子結(jié)合的N-乙酰L-PPT。
進一步的方法包括用L?；被崴饷负头撬匀軇┲械孽；噭┨幚鞤L PPT，這樣只有想要的D-PPT以非乙酰化形式保留下來。
進一步制備純D-PPT的方法包括通過使用手性堿例如chinchocine和加入手性堿和純D-PPT的種子晶體從DL PPT中對映選擇性結(jié)晶。
通過使用手性堿性柱直接進行手性層析從DL-PPT制備純D-PPT的方法。
在一個下列的實施例中給出了詳細的生產(chǎn)純D-PPT的方法。
任選地可進一步突變和選擇編碼用于本發(fā)明的酶的DNA序列以產(chǎn)生進一步有用的具有提高的效力的酶。于是許多酶的特性得到了提高，所述特性包括對想要的底物的催化活性(kcat/Km)、溫度穩(wěn)定性和pH的最適合值。用于產(chǎn)生、篩選和選擇這些改進了的變體的方法是熟知的。例如，通過誘變(例如通過將DNA通過DNA復(fù)制易于出錯的細菌或醇母株系例如大腸桿菌XL1 red傳遞、通過UV、化學(xué)或被靶向的寡核苷酸PCR誘變)的方法產(chǎn)生合適的變體DNA序列。特別地通過許多可選擇的DNA重排或‘有性PCR’方法(如，WO 00/61740中從28至41頁中所概述的，此處引用作為參考)中的任一種產(chǎn)生這類基因。許多方法適合用于篩選這些改進了的基因。在合適的宿主細胞例如大腸桿菌或酵母中可合適地表達基因并且可通過使用合適的測定法例如此處所描述的測定法選擇改進了的基因。
編碼用于本發(fā)明的酶的嵌合基因可各自包含編碼其中一個所述酶的DNA序列，所述DNA序列有效地連接優(yōu)選地指導(dǎo)其在雄性或雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達的5’啟動子區(qū)域，所述酶能夠單獨地或與其它酶一起將非毒害植物的物質(zhì)轉(zhuǎn)化成毒害植物的物質(zhì)。這種表達的特異性確保了所表達的酶的效果只在有活力的種子或有活力的花粉形成所必需的組織和細胞位點內(nèi)發(fā)揮作用，并且在合適的非毒害植物的物質(zhì)(可能是前除草劑)存在時除了其對能育性的影響外對所述植物無害。除了啟動子區(qū)域外，本發(fā)明的嵌合基因還包含3’轉(zhuǎn)錄終止子序列。其負責(zé)轉(zhuǎn)錄的終止和使mRNA正確聚腺苷酸化。許多這樣的3’終止子序列在本領(lǐng)域是已知的并且適合用于本發(fā)明的嵌合基因。在特定的實施方案中所述3’轉(zhuǎn)錄終止子序列選自CMV35S終止子、tm1終止子、胭脂堿合酶(nos)終止子和豌豆rbcS E0終止子。
適合用于所述嵌合基因的某些實施方案的5’啟動子區(qū)域包含基因的5’區(qū)域，其優(yōu)選地在雌花組織中表達。在某些實施方案中5’啟動子區(qū)域選自煙草的stig 1啟動子(Goldman等人，(1994)EMBO J.，13，2976-2984)、經(jīng)修飾的S13啟動子(Dzelkalns等人(1993)PlantCell，5，8555)、AGL5啟動子(Savidge等人(1995)Plant Cell，7，721-733)和玉米心皮特異性ZAG2基因(Thiessen等人(1995)Gene，156，155-166)5’的啟動子區(qū)域。任選地，從基因組DNA的編碼序列的上游區(qū)域獲得進一步合適的啟動子區(qū)域，所述基因組DNA的編碼序列對應(yīng)于本領(lǐng)域已知的優(yōu)先地在雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達的cDNA序列。在某些實施方案中這類探針cDNAs選自擬南芥Fbp7和Fbp11基因(Angenent等人.，(1995)Plant Cell，7，1569-1582)和蘭花特異性cDNAs 040、0108、039、0126和0141(Nadeau等人，(1996)Plant Cell，8，213-239)。在特定的實施方案中包含基因組DNA的5’啟動子區(qū)域選自包含于由基因組DNA克隆pSH64(具有登錄號NRRLB-21920)、與cDNA P26-A4(具有登錄號NRRL B-21655)雜交的pCIB10302基因組克隆和與cDNA克隆P19-QA(具有登錄號NRRLB-21919)雜交的基因組DNA克隆X2-1構(gòu)成的群體的DNA區(qū)域，所述5’啟動子區(qū)域包含優(yōu)先地在雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達的基因組DNA。在特定的實施方案中，這些啟動子區(qū)域包含WO 98/39462中的SEQ ID No.11的核苷酸1至1390、SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的核苷酸1至1093。在進一步的實施方案中，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法分離和克隆適合用于本發(fā)明的嵌合基因的5’啟動子區(qū)域。例如，通過從組織例如玉米穗絲或小麥雌蕊中分離RNA，接著使用技術(shù)例如差示顯示、PCR選擇性cDNA扣除和扣除cDNA文庫構(gòu)建進行差示篩選來鑒定在雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達的新轉(zhuǎn)錄物。分離優(yōu)先地在雌性組織而不在其它植物部分表達的cDNA克隆。任選地通過Northern印跡雜交進一步確定表達的組織特異性。將所述cDNA克隆用作基因組文庫篩選的探針。從基因組DNA克隆中獲得與組織特異性表達相關(guān)的5’啟動子區(qū)域和任選地3’非翻譯DNA區(qū)域，并用于構(gòu)建用于優(yōu)先地在雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達的嵌合基因。
適合用于所述嵌合基因的某些實施方案的5’啟動子區(qū)域包括基因的5’區(qū)域，所述基因優(yōu)選地在雄花組織中表達。這些包括在花粉、絨氈層或花藥的其它結(jié)構(gòu)中表達的啟動子區(qū)域。在某些實施方案中，這些5’啟動子區(qū)域選自LAT52啟動子(Twell等人.，(1989)Dev.，109，705-713)、番茄A127啟動子(Dotson等人，(1996)Plant J.，10，383-392)、玉米Zmg啟動子(Hamilton等人，(1989)Sex.PlantReprod.2，208-212)、玉米CDPK啟動子(Guerro等人.，(1990)Mol.Gen.Genet.，224，161-168)和USP 5477002中公開的花藥特異性ant32和ant43D啟動子，此處引用其全文作為參考。在某些實施方案中，所述5’啟動子區(qū)域選自來自玉米的絨氈層特異性啟動子CA55(WO92/13956中描述的“Pca55”)、來自水稻的絨氈層特異性啟動子E1(USP5639948中所描述的)、來自水稻的絨氈層特異性啟動子T72(USP5639948中所描述的)、來自水稻的RA8花藥特異性啟動子(EMBL/Genbank檢索號AF042275；Jeon等人，(1999)PMB，39，35-44；WO 00/26389)、花藥特異性Tap1啟動子(Spena等人(1992)TheorAppl Genet 84，520-527)和來自玉米的ZmC5-花粉特異性啟動子(EMBL/Genbank檢索號Y13285；Wakeley等人，(1998)PMB，37，187-192)。任選地，從基因組DNA的編碼序列的上游區(qū)域獲得合適的啟動子區(qū)域，所述基因組DNA的編碼序列對應(yīng)于本領(lǐng)域已知的優(yōu)先地在雄性生殖結(jié)構(gòu)中表達的cDNA。在某些實施方案中這種探針cDNAs選自由蘭花花粉管特異性細胞色素P450基因(Nadeau等人.，(1996)Plant Cell，8，213-239)、擬南芥Bcp1基因(Xu等人(1995)P.N.A.S.，92，2106-2110)和玉米的雄花特異性MFS14基因(Wright等人.，(1993)Plant J，3，41-49)構(gòu)成的組。在進一步的實施方案中，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法分離和克隆適合用于本發(fā)明的嵌合基因的5’啟動子區(qū)域。例如，通過從組織例如穗、花粉管、花藥或絨氈層中分離RNA，接著通過使用技術(shù)例如差示顯示、PCR選擇性cDNA扣除和扣除cDNA文庫構(gòu)建進行差示篩選來鑒定在雄性生殖結(jié)構(gòu)中表達的新轉(zhuǎn)錄物。分離優(yōu)先地在雄性組織而不在其它植物部分例如葉、根和柱頭表達的cDNA克隆。任選地通過Northern印跡雜交進一步確定表達的組織特異性。將所述cDNA克隆用作基因組文庫篩選的探針。從基因組DNA克隆中獲得與組織優(yōu)先表達相關(guān)的5’啟動子區(qū)域和任選地3’非翻譯DNA區(qū)域，并將其用于構(gòu)建用于優(yōu)先地在雄性生殖結(jié)構(gòu)中表達的嵌合基因。
進一步用于本發(fā)明的嵌合基因的啟動子區(qū)域包括水稻的Osmads13基因、水稻花藥的OSG基因和水稻的YY2基因的上游區(qū)域。通常，在雄性或雌性生殖結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生高水平的、早期的、持續(xù)的和優(yōu)先的表達的啟動子區(qū)域被選作最合適的啟動子。啟動子區(qū)域也可進一步包含相互之間組合和與增強子區(qū)域組合的嵌合體。
嵌合基因可任選地包含緊接在編碼參與將非毒害植物的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為毒植物素的酶的DNA序列前面的區(qū)域，所述區(qū)域編碼能夠?qū)⑺雒赴邢騺喖毎骼缛~綠體、過氧化物酶體(除了當(dāng)所述毒植物素是過氧化物或過氧化物陰離子時)或線粒體的肽序列，并且所述靶向蛋白可以具有(i)葉綠體轉(zhuǎn)運肽或(ii)葉綠體蛋白-葉綠體轉(zhuǎn)運肽的葉綠體轉(zhuǎn)運肽的N端部分的序列。特別地，為了靶向線粒體，所述緊接在酶編碼DNA序列之前的DNA區(qū)域編碼線粒體轉(zhuǎn)運肽序列。在某些實施方案中，轉(zhuǎn)運肽序列可選自Nicotinia plumbaginifolia線粒體ATP合酶的β亞單位、線粒體特異性NADP依賴性異檸檬酸脫氫酶、呼吸鏈復(fù)合物I的NADPH結(jié)合亞單位和酵母線粒體色氨酰-tRNA-合成酶的內(nèi)源轉(zhuǎn)運肽序列。
用于本發(fā)明方法的多核苷酸可包含一個或多個編碼酶的嵌合基因，所述酶催化參與從非毒害植物的物質(zhì)產(chǎn)生毒植物素的反應(yīng)。任選地這些多核苷酸還包含進一步的基因和嵌合基因，例如嵌合標記基因。此處使用的嵌合標記基因包含在植物細胞中具有活性的啟動子控制之下表達的標記DNA。所述標記DNA編碼RNA、蛋白質(zhì)或多肽，當(dāng)所述物質(zhì)在植物，植物組織或植物細胞中表達時，可使這種植物材料與不表達所述標記DNA的植物材料區(qū)分開來。標記基因的例子有為細胞提供特異性顏色的基因例如A1基因(Meyer等人(1987)Nature 330，667)或使植物細胞抵抗使用抗生素(例如，編碼對艮他霉素抗性的aac(6’)基因，WO 94/01560或提供對潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)或除草劑例如草甘膦(例如USP 5510471或WO 00/66748中的EPSPS基因)、甜菜寧(例如USP5347047；USP 5543306中的pmph基因)、溴苯腈(bromoxynyl)(例如USP 4810648中描述的基因)、磺酰脲(例如EP 0360750中描述的基因)、茅草枯(WO 99/48023中描述的基因)、氨腈(WO98/48023；WO 98/56238中描述的基因)進行致死選擇的基因和編碼對谷氨酰胺合成酶抑制劑例如L-膦絲菌素抗性的基因(例如，EP 0242246、EP 0242246和EP 0257542中描述的N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)。在本發(fā)明的多核苷酸(包含作為標記基因的除草劑抗性基因)的優(yōu)選的實施方案中，所述除草劑是用于作物中控制雜草的除草劑，此外，充分表達除草劑抗性基因以提供對田間比率的所述除草劑充沛的耐受性。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述除草劑是草甘膦并且所述除草劑抗性基因是EPSP合酶。而所述標記基因可以是提供正選擇的基因，其中所述標記基因編碼在特定的介質(zhì)中給轉(zhuǎn)化的植物細胞提供正代射作用有利方面的酶。USP 5767378描述了許多合適的正選擇系統(tǒng)和基因。
當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸包含除草劑抗性基因時，對以充分密度間作的作物植株外源地施用所述除草劑，所述充分密度間作用以消除來源于非轉(zhuǎn)基因的自體受精親本植株的非雜交種子的產(chǎn)生。在優(yōu)選的實施方案中所述除草劑是草甘膦或其農(nóng)學(xué)上有用的鹽，而所述除草劑抗性標記基因選自WO 00/66748中描述的草苷膦抗性提供基因。
當(dāng)標記基因存在時，也可提供用于除去所述標記基因的方法。例如在決定組合性狀時，這是想要的。此外，除去除草劑抗性標記基因也是想要的，當(dāng)所述基因可干擾本發(fā)明的前除草劑抗性依賴性條件性生育力機制的作用時。例如，從也包含嵌合基因的多核苷酸中除去膦絲菌素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)除草劑抗性標記基因可以是想要的，所述嵌合基因用于依賴于外源施用D-膦絲菌素前除草劑的條件性雄性或雌性不育。PAT基因的存在可通過失活L-膦絲菌素毒植物素潛在地干擾成功的條件性不育。因此，包含標記基因的多核苷酸可任選地包含特異性重組酶的特異性識別位點，所述位點位于所述標記基因側(cè)翼并允許所述序列被“剔除”的位置上。將攜帶這種經(jīng)側(cè)翼連接的標記基因的植物與攜帶編碼相應(yīng)的特異性重組酶的基因的植物雜交導(dǎo)致所述標記從其中被特異性切除的后代植物。合適的這類位點特異性同源重組系統(tǒng)的例子是flp/frt系統(tǒng)(Lyznik等人，(1996)，NucleicAcids Res.24，3784-3789)和Cre/Lox系統(tǒng)(Bayley，C.C.等人，(1992)PMB，18，353-361)。
用于本發(fā)明方法的多核苷酸可任選地包含一個或多個位于編碼蛋白的序列的5’非翻譯區(qū)域內(nèi)的翻譯增強子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道這類合適的翻譯增強子，例如來源于TMV的Omega和Omega引物序列以及來自煙草蝕紋病毒的翻譯增強子，也知道怎樣可將這些翻譯增強子導(dǎo)入所述多核苷酸以提供想要的增加的蛋白表達結(jié)果。進一步的例子包括來源于玉米褪綠斑駁病毒和苜蓿花葉病毒(Gallie等人，(1987)Nucl.Acids Res.，15，8693-8711；Skuzeski等人，(1990)PMB.，15，65-79)的翻譯增強子。為進一步最優(yōu)化來自嵌合基因和嵌合標記基因的蛋白的表達，所述多核苷酸也可進一步包含元件例如增強子、支架或基質(zhì)附著區(qū)域(SARS或MARS)和內(nèi)含子。已顯示當(dāng)基因的5’非翻譯區(qū)域包含各種內(nèi)含子序列和任選地當(dāng)各種內(nèi)含子序列用于本發(fā)明的嵌合基因中時，各種內(nèi)含子例如玉米adh1內(nèi)含子1增強表達。
根據(jù)本發(fā)明已轉(zhuǎn)化以表現(xiàn)想要的雄性/雌性不育特征的植物也可用多核苷酸轉(zhuǎn)化，所述多核苷酸酸包含編碼能夠為包含其的植物材料提供至少一種下列農(nóng)藝學(xué)性狀的區(qū)域，所述性狀是對昆蟲、真菌、細菌、線蟲、逆境、dessication和除草劑的抗性。
除草劑抗性提供基因可以例如選自編碼下列蛋白的群體草苷膦氧化酶(GOX)、EPSP合酶、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)、羥苯基丙酮酸二氧化酶(HPPD)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、細胞色素P450、乙酰-CoA羧化酶(ACCase)、乙酰乳酸合酶(ALS)、原卟啉原氧化酶(PPO)、二氫蝶酸合酶、多胺轉(zhuǎn)運蛋白、超氧化物岐化酶(SOD)、溴苯腈腈水解酶，八氫番茄紅素去飽和酶(PDS)、獲自真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes eutrophus)的tfdA基因的產(chǎn)物和已知的所述蛋白的誘變產(chǎn)生的或其它修飾的變體。仔細地考慮其用于轉(zhuǎn)化非毒植物素物質(zhì)的酶的性質(zhì)后，本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到需要包括這些基因和驅(qū)動其表達的啟動子。在所述多核苷酸提供多種除草劑抗性的情況下，這些除草劑可選自二硝基苯胺除草劑，三唑并嘧啶、尿嘧啶、苯基脲、三酮、異唑、N-乙酰苯胺、二唑、triazinone、N-磺酰苯胺、酰胺、N-酰苯胺、isoxaflutole、flurochloridone、噠草伏和三唑啉酮(triazolinone)類型除草劑，并且萌后(post-emergence)除草劑選自草甘膦和其鹽、草銨膦、磺草靈、滅草松、雙丙氨膦、除草定、稀禾定或其它的環(huán)己二酮、麥草畏、蔓草磷、胺草唑、苯氧基丙酸、喹禾靈或其它芳氧基苯氧基丙酸、毒莠定、fluormetron、butafenacil、莠去津或其它三嗪、嗪草酮、氯嘧黃隆、綠黃隆、flumetsulam、halosulfuron、sulfometron、滅草喹、咪草煙、isoxaben、imazamox、metosulam、pyrithrobac、rimsulfuron、芐嘧黃隆、煙嘧黃隆、氟磺胺草醚、乙羧氟草醚、KIH9201、ET751、carfentrazone、mesotrione、sulcotrione、百草枯、敵草快、溴苯腈和唑禾草靈。
在所述多核苷酸包含編碼殺蟲劑蛋白的序列的情況下，這些蛋白可選自來源于Bt的晶體毒素(包括分泌的Bt毒素例如稱作“VIP”的毒素)、蛋白酶抑制劑、凝集素和Xenhorabdus/光狀桿菌屬毒素。提供真菌抗性的基因可選自編碼已知的AFPs、防衛(wèi)素、殼多糖酶、葡聚糖酶和Avr-Cf9的基因。特別優(yōu)選的殺昆蟲蛋白是cryIAc、cryIAb、cry3A、Vip 1A、Vip 1B、Vip3A、Vip3B、半胱氨酸蛋白酶抑制劑和雪花蓮凝集素。在所述多核苷酸包含提供細菌抗性的基因的情況下，這些基因可選自編碼殺菌肽和techyplesin和其類似物的基因。病毒抗性提供基因可選自編碼病毒衣殼蛋白、運動蛋白、病毒復(fù)制酶的基因和反義和核酶序列，已知所述核酶序列提供對病毒的抗性；而提供逆境、鹽和干旱抗性的基因可選自編碼谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和過氧化物酶的基因、構(gòu)成已知的CBF1調(diào)節(jié)序列的序列和已知提供海藻糖積累的基因。
可“修飾”用于本發(fā)明的多核苷酸以增強由其包含的蛋白編碼序列的表達，例如可除去mRNA不穩(wěn)定性基序和/或偶然的拼接區(qū)或可使用作物優(yōu)選的密碼子以使所得的多核苷酸在植物中表達產(chǎn)生基本相似的蛋白，所述蛋白具有與生物體中未經(jīng)修飾的多核苷酸的蛋白編碼區(qū)域表達獲得的蛋白基本相似的活性/功能，在所述生物體中這些未經(jīng)修飾的多核苷酸區(qū)域是內(nèi)源多核苷酸。經(jīng)修飾的多核苷酸和內(nèi)源地包含于所述植物并編碼基本相同蛋白的多核苷酸之間的同一性程度可以使得防止經(jīng)修飾的和內(nèi)源序列之間的共抑制。在這種情況下，序列之間的同一性程度應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地低于大約70％。此外可以修飾翻譯起始位點周圍的序列以使其是“Kozack優(yōu)選的”。其代表的意義對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。
本發(fā)明進一步包括形態(tài)學(xué)正常的條件性可育的完整植物，所述完整植物由使用本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)化的從而提供這種性狀的材料再生的植物雜交產(chǎn)生。本發(fā)明也包括所得植物的后代、其種子和部分。
本發(fā)明的植物可選自田間作物、水果和蔬菜例如油菜、向日葵、煙草、甜菜、棉花、玉米、小麥、大麥、水稻、高梁、mangel worzels、蕃茄、芒果、桃、蘋果、梨、草莓、香蕉、瓜、馬鈴薯、胡蘿卜、萵苣、卷心菜、洋蔥、大豆屬物種、甘蔗、豌豆、field beans、白楊、葡萄、柑橘、紫花苜蓿、黑麥、燕麥、草皮和草料草、亞麻和油料種子油菜、和產(chǎn)生堅果的植物(只要其沒有在前面被特別地提到)、其后代、種子和部分。
特別優(yōu)選的這類植物包括小麥、大麥、燕麥、水稻、玉米、粟和高梁。
產(chǎn)生雜交小麥種子的優(yōu)選的方法包括步驟(i)用包含提供雄性不育的基因的多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化植物材料，所述雄性不育條件性依賴于外源施用前除草劑或其它非毒害植物的物質(zhì)；(ii)選擇所得的轉(zhuǎn)化材料；和(iii)將所選擇的材料再生成形態(tài)學(xué)正常的條件性雄性不育的完整植物。
(iv)培育純合的條件性雄性不育雌性親本系(v)用包含提供雌性不育的基因的多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化植物材料，所述雌性不育條件性依賴于外源施用與(i)中相同的前除草劑或非毒害植物的物質(zhì)；(vi)選擇所得的轉(zhuǎn)化植物；和(vii)將所選擇的材料再生成形態(tài)學(xué)正常的條件性雌性不育的完整植物(viii)培育純合的條件性雌性不育雄性親本系
(ix)以確保有效授粉的比例間作所述條件性不育的雄性和雌性親本系(x)以使自體受精減少到最少的劑量和發(fā)育階段對所述間作的親本系施用所述前除草劑或其它非毒害植物的物質(zhì)(xi)從間作親本植物中收獲雜交小麥種子。
本發(fā)明也提供了上述方法的變體，其中通過任何方法使雄性親本雌性不育，通過任何方法使雌性親本雄性不育，雄性和雌性親本系是依賴于施用不同前除草劑(同時施用兩者)的條件性不育，并且所述作物不是小麥。
本發(fā)明也包括包含用于檢測蛋白或編碼其的DNA序列的手段的診斷試劑盒，所述蛋白或DNA序列存在于根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的植物中，因此適合用于鑒定包含其的組織或樣品。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的PCR擴增可檢測所述DNA序列，所述PCR擴增基于引物，所述引物是可容易地從本申請公開或提到的編碼酶的序列推導(dǎo)得出的引物。所述酶自身可通過例如使用針對其而產(chǎn)生的抗體進行檢測，所述抗體用于診斷性區(qū)分其包含的抗原性區(qū)域。
可通過方法產(chǎn)生對映異構(gòu)體純的D-膦絲菌素(D-PPT)，所述方法包括步驟(a)提供包含能夠選擇性N-?；疨PT的酶的細胞；(b)將所述細胞培養(yǎng)在包含D-L PTT以產(chǎn)生條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中；(c)將細胞從(b)中的條件培養(yǎng)基中分離出來；(d)任選地在各種pHs下用非水、非混溶的溶劑提取所述條件培養(yǎng)基，以使包含PPT的級分從包含比PPT更溶于水的分子的級分分離開；(e)任選地將條件培養(yǎng)基或步驟(d)中的包含PPT的經(jīng)提取的培養(yǎng)基與以質(zhì)子化形式存在的陽離子交換樹脂(以從培養(yǎng)基中充分吸收除了PPT以外的絕大部分陽離子的量和pH下)混合；(f)將條件培養(yǎng)基、提取的培養(yǎng)基或來自步驟(e)中的培養(yǎng)基與以質(zhì)子化形式存在的陽離子交換樹脂(以充分結(jié)合培養(yǎng)基中大量的PPT的量和pH下)混合；(g)收集步驟(f)中結(jié)合有PPT的陽離子交換樹脂并用洗脫介質(zhì)從其中選擇性地洗脫PPT，所述洗脫介質(zhì)具有足夠的pH和離子強度，前提是所述洗脫介質(zhì)的pH不能低至使所得的洗脫的PPT外消旋化。
關(guān)于植物材料的轉(zhuǎn)化，本領(lǐng)域技術(shù)人員承認盡管靶材料的類型(例如，胚發(fā)生細胞懸浮培養(yǎng)物或去分化未成熟胚)和轉(zhuǎn)化的特定方法(例如，使用農(nóng)桿菌或微粒轟擊)在下列的實施例中明確公開，但本發(fā)明并不限于這些特定的實施方案并且這些靶材料和方法可交換使用。此外，整個本發(fā)明說明書中所用的術(shù)語“植物細胞”是指分離的細胞，包括懸浮培養(yǎng)物，和完整或部分完整的組織中的細胞，所述組織是例如胚、小盾片、小孢子、來源于小孢子的胚或來自植物器官的體細胞。類似地，盡管特定的實施方案限定于玉米和小麥，本發(fā)明同樣應(yīng)用于廣泛的可使用合適的植物細胞轉(zhuǎn)化方法進行轉(zhuǎn)化的農(nóng)作物中。
本發(fā)明提供了D-氨基酸氧化酶的突變體形式和編碼其的基因，其中在對應(yīng)于野生型纖細紅酵母D-氨基酸氧化酶的位點58苯丙氨酸的位點上存在賴氨酸。在優(yōu)選的實施方案中本發(fā)明提供了在位點58上具有賴氨酸(F58K)和在位點213上具有絲氨酸(M213S)的纖細紅酵母D-氨基酸氧化酶的雙突變體形式。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了在位點58上具有賴氨酸(F58K)和在位點213上具有蘇氨酸(M213T)的纖細紅酵母D-氨基酸氧化酶的雙突變體形式。這些酶能夠有效地氧化D-膦絲菌素和其它類似的帶負電荷的D-氨基酸例如天冬氨酸和谷氨酸。
在本發(fā)明的進一步實施方案中，這些酶和編碼其的基因用于除了產(chǎn)生雜交作物外的進一步應(yīng)用中，例如，1)所述酶可應(yīng)用于用于D-氨基酸例如D-膦絲菌素的檢測設(shè)備中(例如作為檢測殺蟲劑殘留物的手段)。例如氧氣的還原和過氧化物離子的產(chǎn)生可與許多化學(xué)或電化學(xué)的檢測方法結(jié)合并用于傳感器設(shè)備。
2)所述酶可應(yīng)用于用于酸性氨基酸的DL混合物的對映異構(gòu)體解析的生物催化方法。例如，盡管只有L型膦絲菌素是有活性的除草劑，但除草劑膦絲菌素通常以DL外消旋物形式進行生產(chǎn)。將所有的D型轉(zhuǎn)化成L型以獲得更純的和每化學(xué)重量兩倍活性的除草劑制劑是想要的。本發(fā)明的基因和酶提供了獲得其的方法。例如，將外消旋DL膦絲菌素加入經(jīng)轉(zhuǎn)化的表達F58K、M213S或F58K、M213T纖細紅酵母D-氨基酸氧化酶的宿主細胞(例如大腸桿菌或酵母等)的生長培養(yǎng)基中。任選地，也將所述宿主細胞進行基因工程改造以表達高水平的L-谷氨酸氨基酸轉(zhuǎn)移酶。所述生長培養(yǎng)基優(yōu)選地包含谷氨酰胺來源，從而使所述細胞仍能生長，盡管谷氨酰胺合成酶被膦絲菌素的L組分抑制。在合適的時間后，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中的外消旋的膦絲菌素基本上都轉(zhuǎn)化成L型。然后收集所述培養(yǎng)基以提供基本純的L-膦絲菌素。除了細胞培養(yǎng)方法外，類似的對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的方法可任選地使用分離的酶并且任選地可利用層析從殘留的L-膦絲菌素中分離2-酮酸產(chǎn)物。這些方法可同樣地應(yīng)用于許多酸性氨基酸的對映異構(gòu)體解析中。
從下面的與相關(guān)序列表和附圖結(jié)合的非限定性實施例中可進一步闡明本發(fā)明。
SEQ ID NO1和2描述了用于獲得TA29啟動子區(qū)域的PCR引物。
SEQ ID NO3描述了分離自纖細紅酵母的DNA序列，所述DNA序列編碼具有D-氨基酸氧化酶活性的酶。
SEQ ID NO4和5描述了用于提供變異的D-氨基酸氧化酶的簡并寡核苷酸。
SEQ ID NO6和7描述了基序，為了提供變異的D-氨基酸氧化酶可替代所述基序中的可選擇的氨基酸。


圖1是用于煙草轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體的示意圖，其中所述構(gòu)建體具有在stig1啟動子區(qū)域有效控制下的紅酵母D-氨基酸氧化酶。標明的組分是LB(左邊界序列)、AOPR1(AoPR1啟動子)、PSTIG1(EMBL目錄號X77823)、RGDAO(OPT)(SEQ ID NO7)、PC PROMOTER(EMBL目錄號X16082)、PAT(EMBL目錄號A02774)、NOS(獲自EMBL目錄號ATU237588的終止子)和RB(右邊界序列)。
圖2是用于煙草轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體的示意圖，其中紅酵母D-氨基酸氧化酶編碼序列在3’端截去3個密碼子并在5’端(RGDAO(OPT)-SKL)融合至編碼最優(yōu)化的轉(zhuǎn)運肽(FR2673643)的區(qū)域。
根據(jù)已建立好的方法進行一般的分子生物學(xué)方法。
對于絕大部分下列實施例，各包含本發(fā)明的多個范例。此處所用術(shù)語‘基因的啟動子區(qū)域’表示DNA序列，所述DNA序列包含啟動子、所述啟動子的上游序列和任選地也包含全部或部分編碼mRNA 5’非翻譯前導(dǎo)區(qū)域的DNA序列。
實施例1.依賴于外源施用D-膦絲菌素或D-天冬氨酸或D-谷氨酸的條件性雌性不育的煙草植物通過RT-PCR從類酵母紅冬孢(Rhodosporidium toruloides)(纖細紅酵母)的mRNA中獲得編碼在EMBL序列A56901內(nèi)的D-氨基酸氧化酶蛋白序列P80324(Swissprot)的DNA序列或通過合成(使其更容易控制內(nèi)部限制性內(nèi)切酶位點和建立有助于克隆的側(cè)翼連接位點)獲得相似的DNA序列例如SEQ ID NO3，所述SEQ ID NO3設(shè)計時考慮了植物(在該情況下是小麥)密碼子的利用和使?jié)撛诘夭焕诒磉_的DNA特性減小到最低程度。通過PCR誘變改變DNA序列以使其編碼在位點58上具有賴氨酸(F58K)而不是苯丙氨酸和任選地在位點213上具有絲氨酸或蘇氨酸而不是甲硫氨酸(M213S或M213T)的D-氨基酸氧化酶的突變體形式。設(shè)計PCR引物和合成的DNA序列側(cè)翼以放置有用的單一限制性位點以便進行亞克隆。優(yōu)選地和在當(dāng)氧化酶編碼序列不含有易混的內(nèi)部位點的情況下，將Ncol或Ndel置于5’末端以促進符合讀碼框的融合體的克隆，所述融合體是與在ORF的5’加入的序列例如葉綠體轉(zhuǎn)運肽編碼序列的融合體。在一些例子的變體中以這樣的方式克隆D-氨基酸氧化酶截去末端3個氨基酸從而使編碼的酶不再被靶向過氧化物酶體。在所述方法的另外的系列變體中，通過PCR對基因進行基因工程以編碼在位點213、223和238上具有替換氨基酸的纖細紅酵母D-氨基酸氧化酶，特別是在位點213，野生型的甲硫氨酸被His、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代，和/或在223位點野生型酪氨酸被His、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代和/或在238位點野生型酪氨酸被His、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代。將天然的蛋白序列基序RCTMDSS中‘213’位點上的甲硫氨酸標記為M。將天然蛋白序列基序GGTYGVG內(nèi)位點238上的酪氨酸標記為‘Y’。
任選地，將限制性位點置于ATG翻譯起始位點間插序列的上游以符合植物翻譯一致序列(例如根據(jù)Kozack)。
‘ΔS13啟動子’是用于在雌花部分獲得優(yōu)先表達的啟動子區(qū)域。其包含與CMV35S核心啟動子(Dzelkalns等人(1993)Plant Cell，5，833-863)-46至+8融合的來自SLG13啟動子區(qū)域的-339至-79區(qū)域。將該S13啟動子區(qū)域克隆入bluescript sk中，然后將所述質(zhì)粒進一步限制性酶切割并用包含nos3’轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)域和一個或其它的氨基酸氧化酶編碼序列連接以在bluescript sk質(zhì)粒中產(chǎn)生‘ΔS13-D-氨基酸氧化酶-Nos終止子’表達盒。然后將其合適地以例如EcoR 1片段限制性切出并原樣將其連接入載體例如pBIN19(Bevan(1984)Nucleic Acids Res.)或pCIB200或pCIB2001(WO98/39462)的合適位點上以用于使用農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。如WO 98/39462中所描述的，pCIB200包含下列單一的多接頭限制性位點EcoR1、Sst1、Kpn1，BglII、Xba1和SalI。PCIB2001在多接頭中包含插入片段，所述插入片段加入進一步的單一限制性位點，包括MluI、BclI、AvrII、ApaI、HpaT和StuI。PCIB200和pCIB2001也提供了用于在卡那霉素上篩選植物和細菌的選擇標記基因、左和右T-DNA邊界、來源于RK2的在大腸桿菌和其它宿主細胞之間轉(zhuǎn)移的trfA功能以及來自RK2的oriT和oriV?？蛇x擇地使用了包含來自具有廣泛宿主范圍的質(zhì)粒pRK252(Rothstein等人(1987)Gene53，153-161)的序列的二元載體pCIB10或使用了一個其衍生物，所述衍生物包含卡那霉素抗性基因和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，例如pCIB715(Gritz等人(1983)Gene25，179-188)。
可選擇地使用了大約1.6kb的Stig 1啟動子區(qū)域(來源于EMBL登錄號X77823)。例如通過使用合適的限制性酶，用編碼P80324或Q99042編碼序列的DNA序列取代Goldman等人(1994)在EMBOJ.13，2976-2984中描述的stig1-GUS構(gòu)建體中的GUS基因編碼區(qū)，并將所得的stig1-D-氨基酸氧化酶表達構(gòu)建體在鄰近合適的標記基因的3’終止子序列的上游位點和在T-DNA的邊界序列之間克隆入合適的載體例如pCIB200中。
在進一步特定實施例中，根據(jù)圖1構(gòu)建二元載體內(nèi)的T-DNA插入物。將包含合成DNA序列(SEQ ID NO3)(在stig1啟動子區(qū)域的有效控制之下)和編碼L-膦絲菌素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)的DNA序列(在豌豆質(zhì)體藍素啟動子區(qū)域的有效控制下)的構(gòu)建體克隆入二元載體的LB/nptII基因和T-DNA的RB之間的位點，所述合成DNA序列編碼纖細紅酵母D-氨基酸氧化酶，且已通過PCR誘變使其編碼D-氨基酸氧化酶的突變體形式，所述突變體在位點58上具有賴氨酸而不是苯丙氨酸(F58K)和，在位點213上具有絲氨酸或蘇氨酸而不是甲硫氨酸(M213S或M213T)。簡而言之，將編碼雙(F58K，M213S or F58K，M213T)突變體的經(jīng)改變的SEQ ID NO3在Stig 1啟動子之后和在nos終止子區(qū)域(包含于EMBLATU237588)之前以NcoI/PstI片段克隆入質(zhì)粒pFse4-Stiglnos(描述于WO 99/42598)中。通過PCR從豌豆基因組DNA中獲得豌豆質(zhì)體藍素啟動子區(qū)域(來源于EMBL登錄號X16082)并將其克隆在PAT基因/nos終止子之前。將所得的PC-PAT-nos盒以Not I片段克隆在Stig1-RGDAMOX-nos之后并且將這完整的二個基因構(gòu)建體以FseI片段轉(zhuǎn)移至二元載體(pVB6，Bin19衍生物)中。
在進一步的方法變體中，按照圖2中的示意圖構(gòu)建所用的構(gòu)建體。紅酵母D-氨基酸氧化酶編碼序列SEQ ID NO3經(jīng)定向突變以編碼所述酶的F58K，M213S或F58K，M213T雙突變體形式，然后在突變體3’端截去3個密碼子并將其克隆，使其5’端正好位于編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的區(qū)域的下游，從而編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽/D-氨基酸氧化酶融合蛋白。所述葉綠體轉(zhuǎn)運肽編碼序列來源于編碼EPSP合酶小亞基(Klee，等人1987，Mol.Gen.Genet.，210，437)的擬南芥基因。任選地對其進行修飾以在CTP加工位點包含Sph1位點從而在該位點用Cys-Met取代Glu-Lys(WO 92/044490的圖9中的SEQ)。相應(yīng)地，可在D-氨基酸氧化酶編碼序列的N末端通過基因工程引入SPh 1位點(將緊隨甲硫氨酸后的氨基酸轉(zhuǎn)化成亮氨酸)。可選擇地，所述葉綠體轉(zhuǎn)運肽編碼序列來源于編碼EPSP合酶(WO 92/044490中的圖11)的Petunia基因?？蛇x擇地葉綠體基因編碼序列是大量可能序列中的任何一個，所述可能序列包括來源于編碼Rubisco小亞基的基因的那些和包括所謂的‘最優(yōu)化的’嵌合轉(zhuǎn)運肽序列(FR2673643)的那些。在所有情況下，不依賴于亞克隆，可簡單地通過合成獲得整個想要的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽/雙突變紅酵母D-氨基酸氧化酶融合多肽的DNA序列。將該序列克隆入合適的載體內(nèi)的stig 1啟動子區(qū)域下游和終止子(例如nos)序列的上游位點(例如在Goldman等人(1994)在EMBO J.，13，2976-2984中描述的包含stig 1→GUS構(gòu)建體的載體中取代GUS編碼序列)。然后將整個基因表達構(gòu)建體克隆入PVB6載體的T-DNA的右和左邊界之間的合適位點上。
使用類似于Horsch等人(1985)Science，227，1229-1231中描述的方法用重組二元載體轉(zhuǎn)化煙草葉片?？墒褂迷S多該方法的變體。使用冷凍解凍的轉(zhuǎn)化方法可將二元載體轉(zhuǎn)化入例如根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)株系LBA4404中。按照Draper等人(Plant Genetic Transformation，Blackwell Sci.Pub.1989)描述的實驗方法使用Nicotiana tabacum var.Samsun進行煙草轉(zhuǎn)化和完整的植物再生。在含有卡那霉素或其它合適的抗生素的MS培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化事件。通過PCR確定整合的轉(zhuǎn)基因的存在。再生植物并使其長到成熟并自交產(chǎn)生種子。使用Northern和/或Western分析來確定D-氨基酸氧化酶基因的組織特異性表達。所選擇的植物是自花能稔的但具有條件性雌性不育的條件。將T1代的種子播種到地里。當(dāng)植物長到足夠大時通過PCR就轉(zhuǎn)基因的存在對其進行檢測。將PCR陽性植物轉(zhuǎn)移至溫室中。在沒有外源施用前除草劑的情況下這些植物是完全能育的。以各種量和在各生長階段用D-膦絲菌素或D-天冬氨酸或D-谷氨酸處理這些(假定的)條件性不育植物亞組。對D-氨基酸氧化酶基因被確定為PCR陽性的T1植物進行這些處理，或等同地，直接對T0代(無性繁殖所述植物以使可留出各事件的未處理克隆用于種子生產(chǎn))植物進行這些處理。然后以觀察到的能育性作為選擇合適的表現(xiàn)最明顯的條件性不育表型的植物系的基礎(chǔ)。例如這些氨基酸是純D對映異構(gòu)體或可選擇地是DL外消旋物。例如，其可以在花形成的早期階段之前或期間以通常0.25-20kg/ha通過葉片噴霧的方式施用。通過進一步的噴霧方式施用水可使氨基酸(所述氨基酸在葉片施用后可從葉上的溶液中結(jié)晶出來)重新溶解和重新流動以便葉片吸收。例如，也可以根部浸潤的方式施用氨基酸和任選地以大約50μl 10-200mM的溶液直接灌入冒出花芽的花蕾中施用。收集來自經(jīng)處理的植物的花粉并檢驗生存力。獲取在用D-膦絲菌素或D-天冬氨酸或D-谷氨酸處理后產(chǎn)生相對少的或無種子但在相同的處理條件下卻產(chǎn)生接近正常水平的有生活力的花粉的植物。對照包括轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物并且生長在同一條件下和同一物理處理方案(除了處理溶液是水或等濃度的純L氨基酸)下。
在一個方法的變體中，所施用的氨基酸是外消旋DL膦絲菌素。在這種情況下，用于轉(zhuǎn)化的DNA構(gòu)建體除了包含在組織特異性雌花啟動子區(qū)域例如‘stig 1’有效的表達控制下的編碼D-氨基酸氧化酶的DNA序列，還包括在啟動子區(qū)域例如Pisum sativum質(zhì)體藍素基因(EMBL登錄號X16082)的質(zhì)體藍素基因的翻譯起始5’區(qū)域的有效的控制下的‘PAT’基因的DNA序列(EMBLA02774)。例如，所述構(gòu)建體與圖1中描述的相同。
質(zhì)體藍素啟動子區(qū)域提供了在植物綠色組織中優(yōu)先的表達。意外地發(fā)現(xiàn)，與例如35S啟動子區(qū)域不同，所述質(zhì)體藍素啟動子基本上只在某些植物的組織中表達并且最顯著地在綠色組織中表達，當(dāng)與PAT基因一起使用時提供了對除草劑DL PPT(甚至在超過2kg/ha時)的基本上完全的生殖耐受性。此外，當(dāng)缺少在花組織中共表達的異源D-氨基酸氧化酶的情況下，盡管PAT表達(當(dāng)在該啟動子區(qū)域的控制之下表達時)水平在許多至關(guān)重要的花組織中非常低或不存在，但質(zhì)體藍素/PAT基因組合提供了基本完全的生殖耐受性而無顯著的產(chǎn)量損失。因此，在實施例的這個變體中，以其最低成本和最容易獲得的形式如商業(yè)除草劑DL膦絲菌素外消旋物施用非毒害植物的物質(zhì)D-膦絲菌素。在合適的噴霧時間和以250g/ha至5kg/ha DL膦絲菌素處理的植物沒有受到顯著的損害但在保持正?；蚪咏５男坌阅苡耐瑫r造成條件性雌性不育。
實施例2.依賴于外源施用D-膦絲菌素或D-天冬氨酸或D-谷氨酸的條件性雄性不育的煙草植物突變體D-氨基酸氧化酶蛋白序列和編碼其的DNA序列與前面實施例1中的一樣。
通過使用引物進行PCR從煙草基因組DNA中克隆TA29啟動子區(qū)域(Kriete等人(1996)Plant J.，9，808-818)，所述引物是5′-AACTGCAGCTTTTTGGTTAGCGAATGC-3′(SEQ ID NO1)和5′-CAGACTAGTTTTAGCTAATTTCTTTAAGTAAAAAC-3′(SEQ ID NO2)。通過一系列的限制性酶切割和亞克隆步驟將所獲得的PCR片段置于D-氨基酸氧化酶編碼序列的上游并將nos轉(zhuǎn)錄終止子加入到所述編碼區(qū)域的3’。然后以合適的限制性片段克隆并獲得所得TA29-D-氨基酸氧化酶-nos終止子表達盒，并將其克隆入實施例1中的二元載體中。
可選擇地，以合適的限制性片段(例如BamH1，Bgl/II，其中設(shè)計合成的編碼序列的變體以除去內(nèi)部的限制性位點)克隆任何一個上述D-氨基酸氧化酶編碼序列區(qū)域并通過以有義構(gòu)型插入(例如)二元載體pROK1(Baulcombe等人(1986)Nature，321，446-449)的BamH1位點將其與CaMV35S啟動子和胭脂堿合酶終止子區(qū)域融合。然后切割攜帶35S啟動子的EcoR1-BamH1片段并用來自攜帶TA29s啟動子區(qū)域片段(-810至+54)的pAP30(Kriete等人(1996)The Plant Journal9，809-818)的EcoR1-BamH1片段取代。根據(jù)編碼的蛋白質(zhì)序列，所得載體可稱為pGKTA29_Q99042、pGKTA29_P80324、pGKTA29_Q9HGY3和pGKTA29_P24552等。
通過農(nóng)桿菌用載體轉(zhuǎn)化煙草植物材料并以前面實施例中描述的類似方式再生轉(zhuǎn)基因植物。所產(chǎn)生的植物是自花能稔的但也是條件性雄性不育的。將T1代的種子播種在土壤中。當(dāng)幼苗長到充分大時通過PCR就轉(zhuǎn)基因的存在對其進行檢測。將PCR陽性的植物移入溫室。這些植物在沒有外源施用前除草劑的情況下是完全能育的。以不同的量和在不同的生長階段用D-膦絲菌素或D-天冬氨酸或D-谷氨酸處理這些假定的條件性不育T1植物亞組或可選擇地處理T0‘事件’的幼苗(直接從轉(zhuǎn)化體中再生的)。在處理T0植物時對其進行無性繁殖以留出所述事件的未處理娣妹成員用于種子生產(chǎn)。然后以觀察到的能育性作為選擇合適的表現(xiàn)最顯著的條件性不育表型的植物的基礎(chǔ)。例如這些氨基酸是純D型對映異構(gòu)體或可選擇地是DL外消旋物。例如，其可在花形成的早期階段之前或期間以通常0.25和20kg/ha之間的比率通過葉片噴霧的方式進行施用。通過進一步的噴霧方式施用水可使氨基酸(在葉片施用后從葉上的溶液中結(jié)晶出來的氨基酸)重新溶解和重新流動以便葉片吸收。也以例如根部浸潤的方式施用氨基酸，進一步地以10-200mM溶液直接施入冒出小花的花蕾中。
收集來自經(jīng)處理的植物的花粉并檢驗其存活力。獲取沒有散發(fā)花粉或散發(fā)很少花粉和/或無存活力的花粉的植物。對從一些經(jīng)處理的植物中收集的花粉進行檢驗并發(fā)現(xiàn)其是畸形和無存活力的。然而，這種雄性不育植物保持雌性能育，并且當(dāng)用收集自其它未處理的非轉(zhuǎn)基因或條件性雌性不育煙草植物的花粉授粉時產(chǎn)生(雜交)種子。對照包括轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物并且生長在同一條件下和同一物理處理方案(除了處理溶液是水或等濃度的純L氨基酸外)下。
在另一可選擇的實施方案中，所使用的啟動子區(qū)域是來自金魚草的tap 1基因(Spena等人(1992)，Theor.Appl.Genet.，84，520-527)上游的2.2kb區(qū)域(EMBO號X57295)。
類似于實施例1，在該實施例的一個變體中，施用的氨基酸是外消旋DL膦絲菌素。在這種情況下用于轉(zhuǎn)化的DNA構(gòu)建體除了包含在組織特異性雄花啟動子區(qū)域例如‘TAP1’或‘TA29’有效的表達控制之下的編碼D-氨基酸氧化酶的DNA序列，還包含在啟動子區(qū)域例如來自質(zhì)體藍素基因(在這種情況下所述區(qū)域來自Pisum sativum質(zhì)體藍素基因)的啟動子區(qū)域的有效的表達控制之下的編碼膦絲菌素N-乙?；D(zhuǎn)移酶基因例如‘PAT’基因的DNA序列。在合適的噴霧時間和以250g/ha至5kg/ha DL膦絲菌素的比例處理的植物沒有受到明顯的傷害但在保持正?；蚪咏５拇菩阅苡缘耐瑫r導(dǎo)致條件性雄性不育。
實施例3.能夠優(yōu)先地在小麥的雄性生殖結(jié)構(gòu)中表達和編碼能夠氧化D-膦絲菌素、D-谷氨酸或D-天冬氨酸的酶的嵌合基因。
突變體D-氨基酸氧化酶蛋白序列和編碼其的DNA序列與實施例1中的相同。質(zhì)粒pGK73攜帶從-810到+54的TA29s啟動子區(qū)域EcoR1-BamH1片段(Kriete等人(1996)，9，809-818)。優(yōu)選地以符合讀碼框的融合方式在編碼例如雙突變體(F58K、M213S或F58K、M213T)纖細紅酵母D-氨基酸氧化酶的DNA序列的上游位點上將該限制性片段或相似的合適的PCR-產(chǎn)生的片段克隆入bluescript sk。使用合適的一系列限制性酶切割、連接和亞克隆步驟將nos轉(zhuǎn)錄終止子加到編碼區(qū)域的3’以根據(jù)編碼序列在Bluescript sk質(zhì)粒中產(chǎn)生可選擇的類型TA29-羧酸酯酶-nos表達盒，如pBLTA_RGF58KM213T、pBLTA_RGF58KM213S等。
在進一步的例子中，使用了USP 5470359的花藥特異性SGB6啟動子區(qū)域SEQ ID NO1。例如，將包含來自pSGB6g1(USP 5470359)的3kb基因組EcoR1-Nhe1亞克隆片段的pSGBNE1進一步亞克隆以將平端1558bp ApaII/Xba1片段克隆入bluescript sk，置于Sma1位點。如前面所述，通過進一步限制性酶切割和克隆步驟將該片段以符合讀碼框的形式融合到突變體D-氨基酸氧化酶DNA編碼序列的上游。再在所述編碼區(qū)域的3’加入nos終止子以建立可選擇的包含可選擇的SGB6-DAMOX-nos表達盒的Bluescript sk質(zhì)粒，pBLB6_RGF58K等。
在相似的一組實施例中，類似地也將來自水稻的RA8花藥特異性啟動子區(qū)域(EMBL/genbank目錄號AF042275；Jeon等人(1999)PMB，39，35-44；WO 00/26389)以符合讀碼框的融合方式融合到一個或其它編碼F58K突變體D-氨基酸氧化酶的DNA序列的上游并在編碼序列的3’融合nos終止子，從而產(chǎn)生系列包含可選擇的RA8-DAMOX-nos表達盒的bluescript sk載體，pBLRA8_RGF58K、M213S等。
實施例4.能夠優(yōu)先地在小麥的雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達和編碼能夠氧化D-膦絲菌素和/或D-谷氨酸和/或D-天冬氨酸的酶的嵌合基因。
如實施例1中所描述的，獲取編碼D-氨基酸氧化酶蛋白序列的DNA序列。
按照布達佩斯條約于1998年2月27日在NRRL保藏了基因組克隆pSH64，保藏號為NRRL B-21920。據(jù)檢測其為能與穗絲特異性cDNA克隆B200i4-2(WO98/39462)雜交的基因組克隆。如下構(gòu)建優(yōu)先地在雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達的嵌合基因。如WO 98/39462所描述的，構(gòu)建類似于具有‘空’表達盒的pSH70的bluescript ks來源的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒從5’至3’包含由WO98/39462的SEQ ID No 11的核苷酸1-3790構(gòu)成的B200i 5′啟動子區(qū)域、BamH1位點和包含WO 98/39462中的SEQ ID No.11的核苷酸4427-6397的B200i 3′非翻譯終止區(qū)域。使用部分BamH1降解，或可選擇地通過進一步亞克隆，PCR和連接步驟，將可選擇的D-氨基酸氧化酶編碼序列連接入BamH1位點或其附近的位點以使其正好在B200i啟動子的3’和B200i終止子區(qū)域的5’。由此，建立編碼可選擇的突變體D-氨基酸氧化酶-B200i表達盒的bluescript載體pBLB200_RGF58K、pBLB200_RGF58KM213T、pBLB200_RGF58KM213S等。
可選擇地，如WO 98/39462中所描述的，將P19基因5’啟動子區(qū)域的Pst I/Nco I片段從基因組克隆X2-1中切割出來，所述基因組克隆X2-1是按照布達佩斯條約于1998年2月27在NRRL保藏的，保藏號為B-21919。WO 98/39462中的SEQ ID No 14的核苷酸1088位的Nco I對應(yīng)于P19基因的ATG轉(zhuǎn)錄起始位點。通過使用合適的亞克隆、限制性酶切割、連接和PCR步驟將該片段連接以和一個或其它編碼D-氨基酸氧化酶的DNA序列形成符合讀碼框的融合體并在所述編碼序列的3’加上nos終止子序列。由此，建立了編碼可選擇的P19-D-氨基酸氧化酶-nos表達盒的一系列bluescript載體pBLP19_RGF58KM213S、pBLP19_RGF58KM213T等。可選擇地，使用相似的標準方法，獲得具有代替P19啟動子區(qū)域的P26基因的5’啟動子區(qū)域(包含一些或所有WO 98/39462中的SEQ ID No.2的核苷酸1-3987)的類似質(zhì)粒。如WO 98/39462中所描述的，亞克隆基因組P26-A4克隆pCIB10302，所述基因組克隆按照布達佩斯條約于1997年1月21日在the Agricultural Research Service patent culturecollection保藏，(NRRL)保藏號為NRRL B-21655。由此，建立了編碼可選擇的P19-D-氨基酸氧化酶-nos表達盒的一系列bluescript載體pBLP26_RGF58KM213T、pBLP26_RGF58KM213S等。
實施例5.用于提供(a)雌性近親交配親本系和(b)互補雄性近親交配親本系的方法的成對互補構(gòu)建體，所述雌性近親交配親本系是依賴于DL膦絲菌素施用的條件性雄性不育，所述互補雄性近親交配親本系是依賴于DL膦絲菌素施用的條件性雌性不育。
適合提供雌性近親交配親本谷物或水稻植物系的第一DNA構(gòu)建體包含三個基因A)、B)和C)，所述雌性近親交配親本谷物或水稻植物系是依賴于DL膦絲菌素施用的條件性雄性不育。A)由在來自大麥質(zhì)體藍素基因(EMBLZ28347)的大約1kb啟動子區(qū)域有效控制之下的編碼能夠N乙?；疞-膦絲菌素的PAT酶的DNA序列和合適的終止子區(qū)域例如來自nos或35S基因的終止區(qū)域組成，B)由編碼類似于第一但此時在組織特異性雌花啟動子區(qū)域(例如上面描述的P19或P26)有效控制之下的PAT編碼序列和合適的終止子組成，C)由描述于實施例1、10和11中的在組織特異性雄花啟動子區(qū)域(例如上面描述的SGB6或RA8)有效控制之下編碼例如纖細紅酵母D-氨基酸氧化酶的F58K突變體形式的雙、三突變體的合適的DAMOX編碼序列和合適的終止子區(qū)域組成，所述突變體在位點213、223和238上具有改變，并且特別地在位點213上，野生型甲硫氨酸被His、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代，和/或在位點223上野生型酪氨酸被His、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代和/或在位點238上野生型酪氨酸被His、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代。在優(yōu)選的實施方案中，被編碼的纖細紅酵母DAMOX酶是雙重突變F58K、M213S或F58K、M213T突變體形式。使用本領(lǐng)域標準的方法和前面實施例提供的信息裝配該構(gòu)建體。
適合提供雄性近親交配親本谷物或水稻植物系的第二DNA構(gòu)建體包含3個基因A)、D)和F)，所述雄性近親交配親本谷物或水稻植物系是依賴于DL膦絲菌素施用的條件性雌性不育。A)由在來自大麥質(zhì)體藍素基因的啟動子區(qū)域有效控制之下的編碼能夠N乙?；疞-膦絲菌素的PAT酶的DNA序列和合適的終止子區(qū)域例如來自nos或35S基因的終止子區(qū)域組成，D)由與第一相似的但此時在與構(gòu)建體1中所用的相同的組織特異性雄花啟動子區(qū)域(例如SGB6或RA8)有效控制之下的PAT序列和合適的終止子組成，F(xiàn))由例如用于構(gòu)建體1和在與用于構(gòu)建體1中的相同的組織特異性雌花啟動子區(qū)域(例如P19或P26)控制之下的合適的DAMOX基因和合適的終止子區(qū)域組成。使用本領(lǐng)域標準的方法和前面實施例提供的信息組裝該構(gòu)建體。
本實施例的成對DNA構(gòu)建體包括例如下列元件構(gòu)建體1A＝大麥質(zhì)體藍素啟動子區(qū)域→PAT編碼序列，Nos終止子；B＝P26啟動子區(qū)域→PAT編碼序列，35S終止子；C＝RA8啟動子區(qū)域→紅酵母D-氨基酸氧化酶(F58K，M213T突變體)編碼序列，Nos終止子；
構(gòu)建體2A＝大麥質(zhì)體藍素啟動子區(qū)域→PAT編碼序列，Nos終止子；D＝RA8啟動子區(qū)域→PAT編碼序列，35S終止子；E＝P26啟動子區(qū)域→紅酵母D-氨基酸氧化酶(F58K，M213T突變體)編碼序列，Nos終止子實施例6.用于小麥轉(zhuǎn)化的多核苷酸載體實施例3、4和5描述了通常被克隆入bluescript sk中的表達盒中的各種嵌合基因構(gòu)建體。任選地大量制備這些載體以用于直接的DNA轉(zhuǎn)化，所述載體與共轟擊的選擇標記例如WO 98/39462中所描述的pSOG35(DHFR/氨甲蝶呤)或pUbi-Hyg(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶/潮霉素)一起用于直接的DNA轉(zhuǎn)化。優(yōu)選地，在大量制備后，使用合適的限制性酶線性化所述載體以除去bluescript的氨芐青霉素抗性基因。
任選地，除了使用共轟擊外，通過標準方法進一步對所述bluescript載體進行遺傳工程改造以使其進一步包含植物選擇性標記基因例如卡那霉素抗性、潮霉素抗性、氨甲蝶呤抗性或草甘膦抗性基因，并直接進行使用。在一些上述的示例中，將PAT基因整合入設(shè)計的載體中，并且在這些情況下，任選地在轉(zhuǎn)化后的一些階段可用DL膦絲菌素進行選擇。
可選擇地，在合適的限制性片段內(nèi)切割表達盒并將其克隆入pIGPD9來源的載體(描述于WO 00/66748的圖12)中。使用這種載體進行轉(zhuǎn)化避免了將抗生素標記基因轉(zhuǎn)移到植物中，因為其在細胞中的保持依賴于營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌突變體的互補作用。所述載體包含表達IGPD(HisB產(chǎn)物)的基因并經(jīng)進一步的基因工程改造以包含植物選擇性標記基因例如克隆入例如WOO0/66748的pZEN16i和pZEN18i的Xma I位點的EPSPS基因?？蛇x擇地使用了在甘露糖或木糖上提供陽性選擇的標記基因(USP 5767378)。
在使用pIGPD9載體的特定的實施方案中，構(gòu)建用于小麥轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒。說明性示例是pZEN18_BLB200_Q99042和pZEN18_BLRA8_Q01470。這些是包含pZEN18 EPSPS基因(WO 00/66748)的pIGPD9來源的載體，并且在這種情況下，分別是B200i-)D-氨基酸氧化酶-B200i或RA8-D-氨基酸氧化酶-nos表達盒。
通過使用廠商提供的實驗方案使用Maxi-prep procedure(Qiagen)獲得用于植物轉(zhuǎn)化的大規(guī)模DNA制劑。
實施例7.用多核苷酸轉(zhuǎn)化/再生小麥，所述多核苷酸包含優(yōu)先地在雄性或雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達的和編碼能夠氧化D-膦絲菌素和/或D-天冬氨酸和/或D-谷氨酸的嵌合基因在一個實施例中，將基因型UC703的未成熟胚(長度為0.75-1.0mm)置于含有3mg/l 2，4-D和3％蔗糖的MS培養(yǎng)基上。大約4小時后，將胚置于含有15％麥芽糖、3％蔗糖和3mg/l 2，4-D的MS培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基上覆蓋有濾紙支持的含有相同組分的瓊脂板。在轟擊前使胚進行質(zhì)壁分離2-3小時。
使用標準方法將如實施例6和前面的實施例中所描述的制備的DNA沉淀在微米尺寸的金顆粒上。使用DuPont Biolistics氦氣設(shè)備用1100psi的爆破壓轟擊4個靶板(每個靶含16個胚)各二次。在載體臺和靶之間放置80目的阻擋屏，對板進行轟擊。轟擊后，在將載有胚的板放置到含有3％蔗糖和3mg/l 2，4-D的MS培養(yǎng)基的板上之前，將靶在25℃下于暗處放置24小時。再經(jīng)過48小時后，將單個胚從板上取出并直接放在相同組分的新鮮培養(yǎng)基上。在基因遞送大約6周后，將所述組織放置在含有3mg/l 2，4-D、3％蔗糖和0.2mg/l氨甲喋呤的MS培養(yǎng)基上進行3周。然后將組織置于包含含有1mg/l玉米素核苷和1mg/l氨甲喋呤的MS培養(yǎng)基的再生培養(yǎng)基中。2周后，將再生小苗置于裝有含有2％蔗糖、1mg/l萘乙酸和4mg/l氨甲喋呤的半強度MS培養(yǎng)基的滅菌容器中。
在特定的實施例變體中，包含優(yōu)先地在雄性生殖結(jié)構(gòu)中表達的嵌合基因的載體與可選擇的選擇性標記基因一起用于共轟擊。因此，例如，制備質(zhì)粒DNA并與pUbiHyg(編碼在玉米聚泛素啟動子有效控制之下的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的質(zhì)粒)一起被包被在金微粒上。在這種情況下，除了在轟擊后再生培養(yǎng)基含有在2和20mg/l之間不斷增加的潮霉素濃度外，如上所述進行轉(zhuǎn)化和再生。
在進一步的實施例中，用pZEN18_BLB200_RGF58KM213S(D-氨基酸氧化酶)轉(zhuǎn)化小麥，使用草甘膦進行選擇和如WO 00/66748的實施例15中所描述的進行再生。
從來源于轉(zhuǎn)化體的植物的葉組織中提取DNA和進行PCR以檢驗選擇性標記基因和編碼D-氨基酸氧化酶的基因的存在。繁殖PCR陽性植物。在開花期間，收集雌蕊和花藥并制備RNA。通過Northern分析確定DNA表達。此外，使用pET載體在大腸桿菌中表達D-氨基酸氧化酶基因并部分純化。從SDS凝膠上切下所表達的蛋白的蛋白帶并用于產(chǎn)生多克隆抗體。通過Western分析將這些抗體用于檢測在花組織或其它組織中的表達。
實施例8.有效地產(chǎn)生雜交谷類作物的方法，其中DL膦絲菌素用于雜草控制和同時用作化學(xué)雜交劑，其中由所產(chǎn)生的雜交種子產(chǎn)生的F1代雜交植物在營養(yǎng)和生殖上基本上都對DL膦絲菌素的施用具有耐受性。
化學(xué)雜交劑(chemical hydridising agent)很昂貴。使用相對便宜的物質(zhì)例如商業(yè)除草劑如化學(xué)雜交劑是想要的。這也會達到更好的效果，因為可將雜草控制與化學(xué)雜交相結(jié)合。然而為了實現(xiàn)這個建議有許多問題需要克服。首先，需要建立對所述的除草劑具有耐受性的雄性和雌性親本系。此外，為了獲得想要的響應(yīng)除草劑施用的‘條件性’能育，需要以這樣的方式對兩個系進行基因工程改造，所述方式使得對除草劑的耐受性不擴展到所有組織中，而是以組織特異性的方式表達以使各個所要求的花組織保持選擇性易感性。因此，在一個系(雌性親本系)中，必須使植物的營養(yǎng)組織和雌性組織具有對除草劑施用的耐受性同時雄花組織的關(guān)鍵部分必須保持對除草劑施用的易感性，而在另一個系(雄性親本系)下，相反地只需要雌配子形成組織的一些關(guān)鍵部分保持易感性。即使可以實現(xiàn)這個，仍有許多關(guān)于雜交種子和F1代的進一步問題需要克服。假定該代作物必定包含至少兩個能夠提供對除草劑抗性的基因，也需要該相同的除草劑也可用于作物中雜草的控制。然而，很難想象除草劑、組織特異性啟動子區(qū)域和可允許相同除草劑在F1代中這樣使用的耐受性基因的組合。很可能在對F1代施用除草劑后，雜交作物展現(xiàn)營養(yǎng)耐受性但卻產(chǎn)生很少量或不產(chǎn)生谷粒。例如，對于除草劑草甘膦，通常的抗性機制是表達EPSP合酶的抗性形式。鑒定允許R-EPSPS在所有組織中和在所有時間(除了在雄蕊或柱頭發(fā)育的關(guān)鍵階段外)充分表達的啟動子區(qū)域或啟動子區(qū)域組合是非常困難的。關(guān)于這個問題最直接的方式是使用反義或類似的方法，其中R-EPSPS基因的表達由組織非特異性/組成型啟動子驅(qū)動而在例如雄蕊中由于反義EPSPS基因(參見例如WO99/46396)的表達導(dǎo)致只有局部和短暫地抑制。然而，在這種情況下，在雄蕊(或柱頭)中表達的抑制由顯性基因驅(qū)動。很清楚，對于任何這樣的機制，對F1代施用除草劑可導(dǎo)致由于顯性雄性和雌性條件性不育基因的相加效應(yīng)造成的不育無收益的作物。
本發(fā)明提供了克服使廉價商業(yè)除草劑DL膦絲菌素能夠用于雜草控制和在雜交谷物生產(chǎn)中用作雜交試劑的問題的方法，此外，所述方法提供了所得的雜交谷物或水稻，在所述作物中可安全地將DL膦絲菌素(或L-膦絲菌素)用于雜草控制而基本上沒有產(chǎn)量損失。作為進一步的利益，來自F1代的自交種子(以后可在隨后的作物中產(chǎn)生自生植物)更容易管理，因為如果用控制量的DL膦絲菌素噴霧其自身通常是不育的。對于從F1代植物到野草(例如紅米)或其它谷類作物的花粉異型雜交的后代也是如此。本發(fā)明提供了將商業(yè)除草劑制劑DL膦絲菌素的非毒害植物的組分D-膦絲菌素轉(zhuǎn)化成有活性的L型的基因和酶。將L-膦絲菌素轉(zhuǎn)化成N-乙酰L-膦絲菌素的PAT基因也是已知的并且被商業(yè)地用于在作物中提供對DL膦絲菌素的耐受性。進一步與本實施例緊密相關(guān)的觀察是令人吃驚地發(fā)現(xiàn)包含在大麥質(zhì)體藍素啟動子區(qū)域的有效表達控制之下的PAT基因的小麥基本上在生殖上對以高達至少2kg/ha比例施用的DL膦絲菌素具有耐受性。因此描述于實施例6中的構(gòu)建體的至關(guān)重要的特征是提供抗性性狀的PAT基因在啟動子區(qū)域的有效控制之下表達，所述構(gòu)建體用于提供本實施例的植物，所述啟動子區(qū)域提供基本上只在綠色組織中的表達。這種有用的啟動子區(qū)域的特征在于其應(yīng)當(dāng)以這樣的方式表達PAT，所述方式使其充分保護所有的非綠色花組織免受葉片施用的DL膦絲菌素的損害，同時僅在花組織中自身提供最低水平的PAT表達并且在被靶向條件性不育的部分中水平尤其低。當(dāng)PAT在大麥質(zhì)體藍素啟動子區(qū)域的有效控制之下表達時，這種狀況似乎是相符的，因為基本上所有噴施的L-膦絲菌素通過葉片進入體內(nèi)并且在其被轉(zhuǎn)運到發(fā)育中的花組織之前被截住并被轉(zhuǎn)化成非毒害植物的N-乙酰-L-膦絲菌素。因此，在本發(fā)明中，在親本系中導(dǎo)致組織選擇性不育效果的L-膦絲菌素只是通過D-氨基酸氧化酶從韌皮部流動的非毒害植物的D-膦絲菌素中短暫和局部地產(chǎn)生。通過將驅(qū)動PAT表達的花控制元件與在互補的成對構(gòu)建體(實施例5)中驅(qū)動D-氨基酸氧化酶表達的元件進行精確配比，可以確保在F1雜種中，在靶花組織中L-膦絲菌素的瞬間爆發(fā)被相應(yīng)的在相同時間內(nèi)和相同局部組織中的PAT表達的暴發(fā)快速中和。因此，在雜種中所述除草劑的施用不會誘導(dǎo)不育性效果。然而，在進一步的代中，雜交種的花對應(yīng)PAT和D-氨基酸氧化酶將會分離，從而所得的植物再次成為依賴于控制量的DL膦絲菌素施用的雄性或雌性不育。
使用實施例6和7中描述的方法，將描述于實施例5中的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入小麥或(使用標準的超二元載體方法)轉(zhuǎn)化入水稻中，接著被選擇和再生出幼苗。選擇T0轉(zhuǎn)化體事件(使用農(nóng)民用的無性繁殖以保持未處理的系)并且可選擇地使用基本上如實施例1和2中所描述的方法選擇適合事件用于培育雄性近親交配親本或雌性近親交配親本系，所述雄性近親交配親本系是依賴于DL膦絲菌素施用的條件性雌性不育，所述雌性近親交配親本系是依賴于DL膦絲菌素施用的條件性雄性不育。最好的系表現(xiàn)最好的除草劑耐受性，最少的產(chǎn)量損失，最明顯的條件性不育表型等。選擇可選擇的雄性親本和雌性親本系并任選地與合適的優(yōu)良系回交多代。全面表征在這些最終選擇的事件中的基因插入，如對條件性能育的遺傳和除草劑抗性性狀的基因表征和所表達的基因產(chǎn)物的表征。
然后以合適的比例在田間將所選擇的雌性和雄性親本系一起間作，并以合適的0.05至5kg/ha比例噴施DL膦絲菌素直至開花早期(選擇以最優(yōu)化雜交種子的產(chǎn)量)。所產(chǎn)生的種子具有有利方面其可長出不僅受益于雜種優(yōu)勢而且對含有DL膦絲菌素的除草劑制劑具有耐受性的植物，從而可使用DL膦絲菌素在作物中選擇性控制雜草。所述雜交種子也具有有利方面其表達的除草劑耐受性性狀僅能部分地傳遞給之后的自交代或異型雜交入相關(guān)的雜草中。因此，例如，由本發(fā)明產(chǎn)生的雜交水稻可在使用DL膦絲菌絲作為雜草控制劑的情況下生長而無明顯的產(chǎn)量損失。然而作為來自雜交水稻的花粉與紅米雌性親本的異型雜交后代的紅米植物的后代，其在營養(yǎng)生長上對DL膦絲菌素的處理具有耐受力但卻具有減少的自稔性(歸因于花組織中D-氨基酸氧化酶的表達)，從而產(chǎn)生很少的谷粒。因此通過使用本發(fā)明的雜交水稻，可使用DL膦絲菌素控制雜草，同時大大減少紅米污染谷粒的未來風(fēng)險，所述污染是由于通過異型雜交轉(zhuǎn)入緊密相關(guān)的紅米中的除草劑抗性性狀造成。類似地，在噴施DL膦絲菌素后，從雜種作物中長出的的第二代自生(volunteer)水稻或小麥絕大部分不產(chǎn)生谷粒。
實施例9.使用多核苷酸的玉米的轉(zhuǎn)化/再生，所述多核苷酸包含優(yōu)先地在雄性生殖組織中表達并編碼能夠氧化D-膦絲菌素的酶的嵌合基因。
將RA8-D-氨基酸氧化酶-nos表達盒克隆入上述的系列bluescript sk載體pBLRA8_RGF58KM213T、pBLRA8_RGF58KM213S等。任選地，將這些載體和包含選擇標記的DNA例如pUbiHyg或pSOG35一起用于共轟擊；如例如WO 98/39462的實施例11中所描述的，使用潮霉素或氨甲喋呤進行選擇和再生。
可選擇地，將pZEN18_BLRA8_RGF58KM 213S等直接用于轟擊或轉(zhuǎn)移至硅碳化物須晶(whisker)上再導(dǎo)入玉米細胞中，如例如WO00/66748的實施例12和13中所描述的，在草甘膦上選擇和再生玉米植物。
可選擇地，使用包含超二元載體的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米。例如，在一系列與WO 00/66748描述的相似的步驟中通過一系列亞克隆和同源重組將pZEN18表達盒和BLRA8_F58KD-氨基酸氧化酶嵌合基因從pZEN18_BLRA8_RGF58K切出并克隆入來源于pSB1的超二元載體的T-DNA的右和左邊界之間的位點上。用包含超二元載體的農(nóng)桿菌感染來自未成熟胚的植物材料，所述載體包含草甘膦標記基因和本發(fā)明的嵌合基因。如WO 00/66748中所描述的使用草甘膦選擇和再生植物。
從來自轉(zhuǎn)化體的植物的葉組織中提取DNA并進行PCR以檢測選擇性標記基因和編碼突變體D-氨基酸氧化酶的基因的存在。繁殖PCR陽性的植物。在開花期收集雄蕊和花藥并制備RNA。通過Northern分析確定DNA的表達。此外，使用pET載體在大腸桿菌中表達突變D-氨基酸氧化酶基因并部分純化。從SDS凝膠上切下所表達的蛋白的蛋白帶并用于產(chǎn)生多克降抗體。通過Western分析將這些抗體用于在花組織和其它組織中檢測表達。
實施例10.定點誘變以產(chǎn)生具有進一步提高的氧化D-膦絲菌素和/或D-天冬氨酸等的能力的、來源于纖細紅酵母D-氨基酸氧化酶的F58K突變體形式的進一步的突變體。
本實施例關(guān)注編碼纖細紅酵母D-氨基酸氧化酶變體的基因的產(chǎn)生，所述D-氨基酸氧化酶的變體具有提高的氧化D-膦絲菌素和/或其它酸性側(cè)鏈D-氨基酸的能力。這些基因用于本發(fā)明的優(yōu)選實施方案(描述于其它實施例中)中，在所述實施方案中產(chǎn)生了依賴于D-膦絲菌素或D-天冬氨酸施用的條件性不育。在特定的本實施例中，除了F58K突變之外，這些基因還編碼具有在位點‘213’和/或在位點‘238’上存在單個氨基酸變化的酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道使用完全類似的方法用相同組的可選擇的氨基酸在同等優(yōu)選的位點223上取代酪氨酸以產(chǎn)生相似的系列突變。在天然的蛋白序列基序RCTMDSS(SEQ ID NO6)中在‘213’位點上的甲硫氨酸被標志為M。在天然的序列基序GGTYGVG(SEQ ID NO7)中在位點238上的酪氨酸被標志為‘Y’。存在許多本領(lǐng)域已知的方法，所述方法提供編碼在這些位點中的一個或兩個位點上具有氨基酸變化的系列D-氨基酸氧化酶變體的系列基因。用于誘變的DNA模板的選擇也依賴于想要的用途。因此，例如，當(dāng)想要突變基因在植物中表達時，編碼纖細紅酵母D-氨基酸氧化酶的植物最優(yōu)化的合成DNA例如編碼SEQ ID NO3的突變體形式F58K突變體是合適的起始點。在另一方面，當(dāng)想要直接使用突變體基因作為起始點以進一步進行多輪的隨機誘變和在基于酵母或大腸桿菌的選擇系統(tǒng)(如實施例11中的)中得到改進，那么天然DNA序列的或經(jīng)最優(yōu)化用于在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)表達的合成序列的F58K突變體更合適。
用于提供合適的纖細紅酵母D-氨基酸氧化酶變體的優(yōu)選的方法是通過使用Strategenes Quickchange mutagenesis試劑盒使用簡并寡核苷酸進行的。根據(jù)廠商說明書進行所使用的方法。
例如在編碼天然纖細紅酵母DNA序列(所述序列編碼D-氨基酸氧化酶)的突變體形式的F58K突變體是用于誘變的模板DNA的情況下，成對的‘上’(RGMUTTOP)和‘下’(RGMUTBOT)簡并寡核苷酸的合適長度可以是50-250個核苷酸并且經(jīng)設(shè)計在其中包含下列序列區(qū)域RGMUTTOP在其中包含序列(SEQ ID NO4)tccccatgcaagcgatgcacgNNNgactcgtccgaccccgcttctcccgcctacatcattccccgaccaggtggcgaagtcatctgcggcgggacgNNNggcgtgggagactgggacttg.
RGMUTBOT在其中包含序列(SEQ ID NO5)caagtcccagtctcccacgccNNNcgtcccgccgcagatgacttcgccacctggtcggggaatgatgtaggcgggagaagcggggtcggacgagtcNNNcgtgcatcgcttgcatgggga此外，這兩個寡核苷酸，RGMUTTOP和RGMUTBOT在各端包含序列，所述序列在兩個寡核苷酸相互退火時將形成5’和3’末端，所述末端恰好與在合適的單一限制性位點對上切割所述模板DNA建立的末端匹配(即經(jīng)設(shè)計以使退火的寡核苷酸可取代從編碼D-氨基酸氧化酶的模板DNA切出的單一限制性片段)。
將0.5至1.0μg各寡核苷酸轉(zhuǎn)入0.5ml Eppendorf離心管中并在合適的溫度(例如94℃，依賴于經(jīng)計算的解鏈點)下加熱5分鐘，然后通過冷卻到室溫慢慢退火。然后用兩種限制性酶(根據(jù)模板DNA上的兩個單一限制性位點，所述位點橫跨包含兩個要被取代的密碼子的區(qū)域和表征退火DNA末端)切割模板DNA(例如pYES6/CT酵母穿梭載體)，凝膠純化，用退火的寡核苷酸連接，轉(zhuǎn)化入酵母中以表達通過誘變建立的可選擇的D-氨基酸氧化酶。然后，如描述的，選擇在以D-膦絲菌素類似物(例如D-高半胱氨酸)或D-膦絲菌素(當(dāng)PAT基因共表達時)作為唯一氮源時生長最好的酵母克隆作為包含具有想要性質(zhì)的突變體D-氨基酸氧化酶編碼序列的酵母?？蛇x擇地在除了酵母以外的一些微生物中和例如在大腸桿菌溶原性細菌中的pET載體的T7啟動子表達控制之下進行D-氨基酸氧化酶的表達。在這種情況下，在轉(zhuǎn)化之后，可挑揀單個菌落，重復(fù)涂板、生長、誘導(dǎo)、裂解和使用本領(lǐng)域已知的方法(例如，測定過氧化物產(chǎn)生的熒光測定篩選法或測定氨或2-酮酸產(chǎn)生的比色測定法)篩選想要的針對D-膦絲菌素的底物活性。可在2ml的微量滴定板小孔中合適地培養(yǎng)受試生物體轉(zhuǎn)化體，原位裂解并就D-氨基酸氧化酶的活性可選擇地使用膦絲菌素或D-天冬氨酸作為底物(依賴于最想檢測的活性)進行比色測定。選擇產(chǎn)生最高活性水平的系?？蛇x擇地，進一步轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因大腸桿菌系以使其表達PAT基因(例如，組成型地表達)和用IPTG誘導(dǎo)以使其表達‘受試’突變體D-氨基酸氧化酶。選擇在基本培養(yǎng)基上表現(xiàn)最佳生長的經(jīng)誘導(dǎo)的系，所述基本培養(yǎng)基以膦絲菌素(或，任選地，膦絲菌素類似物)作為主要的氮源(任選地包括少量的銨離子)。
任選地，不僅基于最大化利用D-膦絲菌素或其它酸性側(cè)鏈D-α氨基酸的能力而且基于提高的熱力學(xué)穩(wěn)定性(例如在酶測定之前將提取物或細胞系接受短時間熱處理或?qū)⒓毎谏叩幕蚪档偷臏囟认屡囵B(yǎng))或其它性質(zhì)來篩選系。
培養(yǎng)所選擇的酵母或其它微生物克隆，制備DNA和通過校正(proofreading)PCR克隆全長D-氨基酸氧化酶DNA序列并通過使用Invitrogens Zero Blunt TOPO試劑盒將其克隆入pCRBlunt II。確定所選擇的克隆的特征性D-氨基酸氧化酶編碼序列。將這些D-氨基酸氧化酶編碼序列進一步亞克隆以在pET載體(例如Novagen pET 24a)中表達和轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 DE3中。在發(fā)酵罐中將細胞培養(yǎng)在含有100μg/ml卡那霉素的LCM50培養(yǎng)基中，用IPTG誘導(dǎo)，收獲，破碎和部分純化提取物并就D-氨基酸氧化酶活性(如下面描述的)進行測定。選擇編碼D-氨基酸氧化酶的D-氨基酸氧化酶基因，所述選擇的酶產(chǎn)生可接受的穩(wěn)定性和在pH7.0下對D-膦絲菌素具有每mg純蛋白最高活性(kcat/Km)。
此外，產(chǎn)生編碼特定地被靶向的D-氨基酸氧化酶的一系列特定DNA序列。特別是產(chǎn)生編碼纖細紅酵母D-氨基酸氧化酶的F58K突變體形式的基因，所述D-氨基酸氧化酶突變體在位點213、223和238上具有進一步的突變變化，并且特別是在位點213上，野生型甲硫氨酸被His、Lys、Arg、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代，和/或在位點223上野生型酪氨酸被His、Lys、Arg、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代，和/或在位點238上野生型酪氨酸被His、Lys、Arg、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代。所使用的方法與上述方法相同，所不同的是不用寡核苷酸混合物，設(shè)計單個寡核苷酸對，并用于實現(xiàn)各個單或雙氨基酸的改變。克隆各所得到的突變體D-氨基酸氧化酶編碼序列以使其在Novagen pET 24A的T7啟動子后面以進行表達(未標記)并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 DE3中。在1.0升發(fā)酵罐中將所述細胞培養(yǎng)在含有100μg/ml卡那霉素的LCM50培養(yǎng)基中，用1mM IPTG誘導(dǎo)表達并通過低速離心收獲。
LC50培養(yǎng)基包含(1升)KH2PO4(3g)、Na2HPO4(6g)、NaCl(0.5g)、酪蛋白水解物(Oxoid)(2g)、(NH4)2SO4(10g)、酵母提取物(Difco)(10g)、甘油(35g)(在溶液中制備這些組分并高壓滅菌)。將下列額外組分以液體形式過濾滅菌并加入到培養(yǎng)基中MgSO4(2.5ml，246.5mg/ml溶液)、鹽酸硫胺素(1ml，8mg/ml溶液)CaCl2.2H2O(0.2ml，147g/l溶液)，*FeSO4.7H2O/檸檬酸母液(2ml)、**微量元素溶液(5ml)并配制到1升。
*每100ml FeSO4.7H2O/檸檬酸母液由FeSO4.7H2O(0.415mg)、檸檬酸(0.202mg)組成。
**每1ml微量元素溶液組合物含有AlCl3.6H2O(20mg)、CoCl2.6H2O(8mg)、KCo(SO4)2.12H2O(2mg)、CuCl2.H2O(2mg)、H3BO3(1mg)、KI(20mg)、MnSO4.H2O(0.8mg)、N2MoO4.2H2O(4mg)、ZnSO4.7H2O(4mg)。
在水中清洗大約7g濕重的細胞。將細胞懸浮在等體積的含有2mMEDTA、2mM DTT和0.01mM FAD的pH7.050mM/Mops/KOH緩沖液中。使用玻璃勻漿器使細胞均勻地懸浮，然后在Constant Systems(BudBrooke Rd，Warwick U.K.)Basic Z細胞破裂器中使用一個棒杵(shot head)以13500psi破壞細胞。將粗提取物在30,000g下保持冷凍(大約4℃)離心1小時并棄去沉淀。將一些提取蛋白跑SDS PAGE凝膠并用考馬斯亮蘭染色，并且通過與類似方法制備的只含有‘空’pET載體的細胞提取物進行平行比較，估計在提取物中2-50％的總可溶性蛋白是D-氨基酸氧化酶。將一些提取蛋白交換到含有0.01mM FAD的pH7.0 50mM Mops/KOH緩沖液中。在標準的氧電極小室(在25℃下在0和飽和濃度的氧之間校正)中用相同的緩沖液稀釋該溶液。任選地，進一步使用離子交換、苯基瓊脂糖、分級硫酸銨沉淀和凝膠過濾純化D-氨基酸氧化酶。在25℃下通過向稀釋的酶中加入200mM DL膦絲菌素的銨鹽溶液或通過加入25mM D-天冬氨酸開始進行測定。為了測量Vmax和Km值，以正常的方式改變底物濃度。在總蛋白和據(jù)估計的D-氨基酸氧化酶的純度基礎(chǔ)上估計Vmax值。基于SDS PAGE，突變體D-氨基酸氧化酶在粗蛋白提取物中通常構(gòu)成15-35％的可溶性蛋白(或更高，當(dāng)D-氨基酸氧化酶進一步純化時)。在氧電極小室中最終的反應(yīng)體積是2ml。小室中蛋白的最終量最高可以達到5mg，依賴于被測量的活性水平。測量氧消耗(在減去基線的偏差后)速率。
在上述條件下獲得的實施例結(jié)果如下。野生型纖細紅酵母D-氨基酸氧化酶沒有表現(xiàn)出可檢測的氧化D-膦絲菌素的能力并且當(dāng)D-天冬氨酸用作底物時只表現(xiàn)較低的活性(大約30nmol/min/mg)(與當(dāng)使用25mM D-丙氨酸作為底物時＞40μmol/min/mg的對照速率相比)。F58K突變體形式對膦絲菌素表現(xiàn)較低的活性(＞大約15nmol/min/mg)和對D-天冬氨酸表現(xiàn)中等活性(大約1.8μmol/min/mg)。F58KM213S雙突變體形式對D-天冬氨酸表現(xiàn)非常高的活性大約為40μmol/min/mg，而對DL膦絲菌素，大約為3.2μmol/min/mg的高水平活性。F58KM2X3S雙突變體針對D-膦絲菌素的Km估計約為12mM。三突變體F58K，M213S，Y223H針對D-膦絲菌素表現(xiàn)大約0.4μmol/min/mg和針對D-天冬氨酸表現(xiàn)大約0.7umol/min/mg的中等活性。
在對照實驗中，在可檢測水平上沒有觀察到純L型被氧化而，依賴于濃度，純D型被氧化的速率高達DL外消旋體被氧化速率的2倍。
使用基于Konno的‘Methods for the Detection ofD-Amino-Acid Oxidase’.Biol.Proced.Online.(1998)May 14；127-31中的方法的更高通量的測定方法獲得額外的結(jié)果。這是個在使用氧電極測定進行更精確分析之前用于進行最初的突變體篩選的特別有用的方法。將如上所述獲得的D-氨基酸氧化酶基因的隨機/定點突變體以Ndel/EcoRI片段克隆入PET24或PET21載體(Novagen)并通過熱激轉(zhuǎn)化入BL21-CodonPlus(DE3)-RP Competent細胞(Stratagene)中。在選擇和涂板后，挑出單個菌落并在30℃下在包含大的2ml小孔的96孔板中在1ml L Broth(+卡那霉素或氨芐青霉素+氯霉素)中培養(yǎng)過夜。然后將板低速離心，將細胞沉淀到板底部并小心移走上清液。然后通過在0.5ml新鮮L培養(yǎng)基(無抗生素)中渦旋重新懸浮細胞并在30℃下進一步振蕩溫育2小時。再加入0.5ml L Broth+4μl IPTG，然后把板放回振蕩培養(yǎng)箱(30℃)中培養(yǎng)3小時。將板再次離心以使細胞沉淀下來，除去上清液并將板在-80℃下冷凍10分鐘。然后將板回復(fù)到實驗室溫度并在酶測定之前裂解細胞沉淀。向各小孔中加入包含1mg/ml溶菌酶的0.4ml CelLyticB(Sigma)并放置10分鐘。向各孔中加入玻璃珠，然后密閉小孔用玻璃珠研磨2分鐘。然后將板離心將殘渣分離出來。然后通過加入30μl受試D-氨基酸(例如，D-谷氨酸，D-天冬氨酸或DL草銨膦的銨或鉀鹽，以例如5、10、25、50/100或200mM在水中的濃度)和30μl 0.133M pH約8.3的焦磷酸鹽緩沖液(包括1μl/ml的β巰基乙醇和5mg/ml過氧化氫酶)、20μl 0.1mM FAD和10μl 70％甲醇對10μl所得的上清液提取物進行測定。然后將板溫育以使測定在室溫下進行10-60分鐘，之后加入100μl 10％的TCA終止各孔中的反應(yīng)。然后從各孔中取出50μl放入新板的對應(yīng)孔中，其中新板的各孔含有50μl 5M KOH。然后將含有0.5％Purpald’(4-氨基-5-肼-1，2，4-三唑-3-硫醇)的50μl 0.5M HCl加入各小孔并將板在室溫下放置15分鐘。過后，向各小孔中加入50μl包含0.75％高碘酸鉀的0.2M KOH，最后向各小孔中加入5μl異丙醇以防止forming。然后在550nm測量板中各小孔的光密度。高水平的D-氨基酸氧化酶活性對應(yīng)著高OD讀數(shù)。通過使用標準的酮酸添加可對測定進行定量，并且基于蛋白濃度(使用標準的方法例如Bradford或Lowry方法測量的)計算比活性?；谔崛∥镏锌偟鞍椎陌俜直?通過考馬斯染色SDS PAGE估計的)估計DAMOX的比活性，其是D-氨基酸氧化酶。通過使用上述測定顯示，例如在25mM D-膦絲菌素底物濃度的情況下，纖細紅酵母D-氨基酸氧化酶的F58K，M213T雙突變體形式的活性大約超過F58K，M213S形式的2-5倍(參見表1)。
表1獲自基于板的測定的實施例結(jié)果，所述測定用于比較以D-膦絲菌素為底物的D-氨基酸氧化酶的突變體形式的活性。
在上述條件下使用25mM DL膦絲菌素為底物進行測定。在這些條件下包含酶的野生型形式的提取物不產(chǎn)生任何可檢測的顏色。在對纖細紅酵母DAMOX的F58K，M213T突變體形式的提取物進行30分鐘的測定后在550nm獲得的光密度超過F58K，M213S突變體形式的類似提取物的兩倍。因為在高光密度時測定變成了非線性，因此估計在所述測定條件下F58K，M213T突變體形式的活性絕對超過F58K，M213S形式2-5倍。
實施例11.進行隨機誘變和選擇以產(chǎn)生F58K D-氨基酸氧化酶基因的進一步突變體，所述突變體編碼具有提高的氧化D-膦絲菌素的特異性(kcat/Km)的酶將密碼子最優(yōu)化的用于在酵母中表達并編碼纖細紅酵母D-氨基酸氧化酶的F58K突變體形式或F58K，M213S或F58K，M213雙突變體形式的DNA序列以HindIII/PmeI片段克隆入Invitrogen的pYES6/CT穿梭載體中并位于GAL1啟動子的下游。類似地，將這些DNA序列以XbaI片段克隆入pAUR123蛋白表達穿梭載體(Panvera)并位于ADHI組成型啟動子的下游。在大腸桿菌中進行這些載體的構(gòu)建然后將其轉(zhuǎn)化入S288C啤酒糖酵母中。如果合適，使用PAT基因分別取代pYES6/CT/pAUR123載體上的殺稻瘟素或aureobasidin抗生素抗性基因并使用DL膦絲菌素而非抗生素保持選擇。使用各種誘變方法建立D-氨基酸氧化酶的進一步突變體變體。例如，通過Mn2+毒化的PCR產(chǎn)生多個D-氨基酸氧化酶編碼序列的變體，將所述混合群體克隆入兩個穿梭載體的GAL1或ADH1啟動子的前面，轉(zhuǎn)化入酵母，用PAT基因進一步轉(zhuǎn)化酵母，并就新序列提供給酵母在以膦絲菌素為主要氮源的基本培養(yǎng)基上快速生長的能力進行篩選。可選擇地直接對經(jīng)轉(zhuǎn)化的酵母進行突變和選擇。例如，將用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母在化學(xué)誘變劑例如EMS存在的情況下在發(fā)酵罐中培養(yǎng)在氮受限的培養(yǎng)基中(所述培養(yǎng)基包含20-100mM DL膦絲菌素)并誘導(dǎo)D-氨基酸氧化酶表達(例如，培養(yǎng)在以半乳糖為碳源的培養(yǎng)基上)。在連續(xù)繼代培養(yǎng)后，鑒定在以膦絲菌素作為主要氮源的培養(yǎng)基上生長最快的繼代培養(yǎng)物，涂板并將所述D-氨基酸氧化酶編碼序列進行亞克隆、測序和在大腸桿菌中表達以進一步表征。
在進一步優(yōu)選的方法中，通過大腸桿菌株系XL1-red的擴增和傳代在兩個穿梭載體上進行誘變。該株系在三個主要的DNA修復(fù)途徑中具有缺陷，mut S、mut D和mut T。在DNA復(fù)制過程中這導(dǎo)致突變率增加了大約5000倍。所使用的實驗方案依照Stratagene。例如，將10ng穿梭載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL1-red中，培養(yǎng)細胞，然后涂布在含有氨芐青霉素的L-Broth上培養(yǎng)24小時。通過從板上刮取菌落轉(zhuǎn)入L broth中，各板匯集超過200個轉(zhuǎn)化體菌落，然后以1∶100和1∶1000稀釋培養(yǎng)并在37℃下在L-broth/氨芐青霉素上連續(xù)繼代培養(yǎng)1-2周以使大量細胞分裂繼續(xù)進行。從許多板開始進行類似的過程。從培養(yǎng)過夜的細胞中制備小批量的穿梭載體DNA并轉(zhuǎn)化回酵母中。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的酵母并且如上所述選擇包含改進的D-氨基酸氧化酶的菌落。
可選擇地，在除了酵母以外的一些微生物中和例如在大腸桿菌溶原性細菌中的pET載體的t7啟動子的表達控制下進行D-氨基酸氧化酶的表達和選擇。在這種情況下，將D-氨基酸氧化酶編碼序列(任選地通過Mn2+毒化的PCR誘變)克隆入pET載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL1red中，在多代傳代后，轉(zhuǎn)化回大腸桿菌溶原性細菌例如大腸桿菌BL212DE3中。然后挑出單個菌落，影印鋪板，培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)，裂解和使用本領(lǐng)域已知的方法(例如，用于檢測過氧化物產(chǎn)生的熒光測定篩選方法或用于檢測2-酮酸或銨產(chǎn)生的比色測定方法)篩選想要的針對D-膦絲菌素的底物活性。可選擇地，進一步轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因大腸桿菌系以使其表達PAT基因(例如，組成型表達)和用IPTG誘導(dǎo)以使其表達‘受試’突變型D-氨基酸氧化酶。選擇在基本培養(yǎng)基上表現(xiàn)最佳生長的經(jīng)誘導(dǎo)的系，所述基本培養(yǎng)基以膦絲菌素(或，任選地，膦絲菌素類似物)作為主要的氮源(任選地包括少量的銨離子)。
任選地用于酵母選擇的培養(yǎng)基含有低濃度的溶劑(例如，0.1％DMSO)。
實施例12.對映體純的D型膦絲菌素的生產(chǎn)用具有克隆(未標記)的在T7啟動子后面表達的PAT編碼序列(A02774)的Novagen pET 24A轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 DE3 codon plus RIL。將這些細胞在10升發(fā)酵罐內(nèi)在含有卡那霉素的LCM50培養(yǎng)基中培養(yǎng)至大約40OD600nm的密度，用0.2mM IPTG誘導(dǎo)，通過低速離心收集并迅速轉(zhuǎn)移至含有9.91g D/L膦絲菌素(PPT)銨鹽的基本培養(yǎng)基中。
基本培養(yǎng)基(1升內(nèi))為將Na2HPO4(6g)、KH2PO4(3g)、NaCl(1g)、NH4Cl(1g)溶解在水中并進行高壓滅菌，過濾滅菌后加入下列溶液CaCl2(1ml，14.7g/l)、MgSO4(1ml，246.5g/l)、鹽酸硫胺素(5ml，1mg/ml)葡萄糖(30ml，單獨高壓滅菌的20％溶液)、DMSO 0.5ml。
發(fā)酵詳述如下。用LB broth培養(yǎng)的含有PAT基因的大腸桿菌BL21DE3 codon plus RIL的接種體(200ml)接種在10升裝有LCM50培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中并保持在30℃，200rpm攪拌速度，pH6.5，達50％空氣飽和的氧濃度下。大約12小時后，所述培養(yǎng)物長到OD600nm大約為30。然后通過加入0.2mM IPTG誘導(dǎo)PAT表達。1.5小時后，所述培養(yǎng)物進一步培養(yǎng)至OD600nm大約為40，接著離心收集細胞，在8升基本培養(yǎng)基中清洗細胞。再將細胞離心一次，然后在發(fā)酵罐中重新懸浮于終體積10升的基本培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有9.91g商業(yè)可購得的D/L膦絲菌素的銨鹽和進一步的0.2mM IPTG。將溫度增加到37℃并且通過質(zhì)子和磷NMR監(jiān)控發(fā)醇罐培養(yǎng)基中的樣品以確定a)葡萄糖顯著降低和需要補料的時間和b)將膦絲菌素轉(zhuǎn)化成N-乙酰膦絲菌素的程度。經(jīng)過大約12小時的過程，向發(fā)罐中加入大約500克葡萄糖。在數(shù)小時后觀察到N-乙酰膦絲菌素開始形成并且在大約20小時后達到超過93％的L-PPT(46.5％v的D/L)轉(zhuǎn)化成N-乙酰-L-PP。迅速收獲發(fā)酵培養(yǎng)基，通過低速離心取出細胞。
使用離子交換層析從發(fā)酵培養(yǎng)基中純化D-PPT。將發(fā)酵培養(yǎng)基(約9.51)貯存在4℃。用H+形式的900mlDowex 50W-X8 200-400目陽離子交換樹脂(用HCl預(yù)制的)與其混合以使樹脂上部的上清液pH降到大約pH3.0。讓Dowex樹脂在重力作用下沉淀出來并將上清液連同21漂洗Dowex樹脂的水輕輕倒出，然后離心澄清。棄去經(jīng)洗滌的Dowex(最終被回收)。然后用乙酸乙酯(1/4上清液的體積)通過分液漏斗提取澄清的上清液，保留水相部分(約12l)。然后再加入2.3升H+形式的Dowex 50W-X8樹脂并且攪拌大約12l的溶液。然后讓樹脂沉定出來。這個階段樹脂上方上清液的pH大約為pH1.6。輕輕倒出上清液并棄去，用大約12升水清洗樹脂，再沉淀。再一次棄去上清液并將樹脂傾倒在燒結(jié)的Buchner漏斗過濾器上并進一步用4.5l水(以除去絕大部分殘留的N-乙酰-膦絲菌素)漂洗。用15L 0.4M氫氧化銨將主要包含D-膦絲菌素的級分從樹脂中洗脫出來，接著用1.4l水漂洗樹脂。該包含D-膦絲菌素的級分的pH大約為11.4。任選地，通過加入例如0.13摩爾醋酸和大約600mlH+形式的陽離子交換樹脂將其降至大約pH10。如果已加入，讓樹脂沉淀出來。然后將D-膦絲菌素(上清液)級分加到565ml(5×28cm)的OH-形式的Dowex 1X8-400目陰離子交換樹脂柱(用NaOH預(yù)平衡和用水清洗)上。對柱子使用超過17個柱床體積的0M至0.32M醋酸銨梯度。收集55ml級分。通過215nm的UV，還有通過質(zhì)子和31P NMR監(jiān)控級分。該分析表明在級分39和78之間洗脫出高純度的膦絲菌素。N-乙酰膦絲菌素作為未結(jié)合材料被洗脫在早期的組分中，一些谷氨酸在更后的級分79-90中洗脫。級分63至78(對應(yīng)于6-7.6床體積)構(gòu)成了大量高純度的膦絲菌素。將膦絲菌素級分冷凍干燥并且通過質(zhì)子和磷NMR發(fā)現(xiàn)其非常純(除了醋酸以外，沒有其它可見的峰，超過95％的有機材料是膦絲菌素)，盡管基于計算的和觀察到的干重之間的差異發(fā)現(xiàn)通常有一些無機鹽(例如氯化銨)殘留物殘留在膦絲菌素樣品中。為了實踐目的，當(dāng)使用D-膦絲菌素(例如噴施植物)時，可認為無機物是惰性的并且當(dāng)D-膦絲菌素溶液由稱量的干樣品制備時無機物只需用來考慮調(diào)節(jié)計算的濃度。
預(yù)期根據(jù)上述方法分離的膦絲菌素應(yīng)當(dāng)基本上是對映體純的D-膦絲菌素。根據(jù)Hori等人(2002)J.Chrom.B 776，191-198的熒光HPLC分析方法證實這點。例如，將50μl的商業(yè)購得的DL膦絲菌素(0.01-10μg/ml)或樣品溶解在0.1M pH8.5的硼酸緩沖液中并與200μl相同的硼酸緩沖液混合。然后加入50μl 18mM FLEC((+)-1-(9-芴基)乙基氯甲酸酯)并將混合物在40℃下進一步溫育30分鐘。使用500μl乙酸乙酯振蕩3分鐘除去過量的FLEC。取出100μl底部的水層進行HPLC分析。
用77％10mM醋酸銨水溶液(pH5.0)23％乙腈以0.8ml/分鐘流速平衡Inertsil ODS2(15×4.6)5tμM partical HPLC柱。將2μl樣品注射入柱中并等度洗脫60分鐘，并且使用具有260nm激發(fā)波長和305nm發(fā)射波長的熒光檢測進行監(jiān)控。觀察到膦絲菌素的D和L同分異構(gòu)體被清楚地分開并且分別在12.4和13.4分鐘被洗脫。對根據(jù)本方法分離的D-膦絲菌素樣品進行檢測并估計超過99％的對映體過量。這是基于摻加已知量的商業(yè)購得的DL膦絲菌素和下列觀察結(jié)果的基礎(chǔ)上估計的相對于樣品產(chǎn)生的12.4分鐘的明顯單峰背景，可以檢測到右旋13.4分鐘峰的多小的增加。
此外，基于峰的整合和與標準曲線的比較，HPLC方法用于估計膦絲菌素的量。此外通過NMR信號的整合來估計膦絲菌素的總量。
據(jù)估計，總體上，從大約9.91g DL外消旋體開始，產(chǎn)生大約1.9g(38％產(chǎn)率)純D-膦絲菌素銨鹽，超過99％的對映體過量。50-70％的樣品干重包含始終攜帶的無機鹽。任選地這些鹽可通過進一步的離子交換和冷凍干燥(在交換成碳酸銨后)除去。
序列表<110>Syngenta Limited<120>選擇性產(chǎn)生雄性或雌性不育植物的方法<130>PPD70629<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1aactgcagct ttttggttag cgaatgc 27<210>2<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2cagactagtt ttagctaatt tctttaagta aaaac 35<210>3<211>1107<212>DNA<213>纖細紅酵母<400>3atgggatccc aaaagagggt tgtggtgctg ggttccggcg tgataggact cagctccgcg60
cttatacttg cccggaaggg gtactccgtc cacatcctgg cccgggacct cccagaggat 120gttagctcac agaccttcgc gtccccttgg gctggagcca actggacccc ttttatgacc 180ctcactgacg gcccgaggca ggcaaagtgg gaggagtcta cattcaagaa gtgggtggaa 240cttgtgccaa cggggcatgc catgtggttg aagggaacca ggcgtttcgc ccaaaatgag 300gacggactgc tcggtcactg gtacaaagat atcaccccca attatagacc cttgccctct 360tccgaatgtc caccaggcgc tattggcgtg acttatgaca cattgtcagt gcacgctcca 420aagtactgcc aatacctcgc aagggagctc cagaagctgg gggcgacatt cgagcgccgc 480accgttactt ccctcgagca agcttttgat ggggctgacc tcgtcgttaa cgcgacgggg 540ctgggtgcca agtccatcgc tggcatcgat gaccaggcgg ccgagcctat tcgcggtcaa 600acggtgctcg tcaagtcgcc ctgcaaaagg tgtactatgg acagctcgga cccggcatca 660ccggcgtaca tcatcccgcg gccaggaggc gaagtgattt gcggcggtac gtacggggtc 720ggagactggg atctctcggt caacccagag accgtccagc gcatcctcaa acactgcctg 780cgcctggatc cgactatttc ttcggacggc acaatcgaag gcatcgaggt gctgcggcat 840aacgtcggac tcagaccggc gaggagggga ggccctcgcg ttgaagccga gaggattgtt 900cttccacttg acagaacgaa gagccccctc tcactgggcc gtgggagcgc tcgtgcggcc 960aaggagaagg aggtgacttt ggtgcatgcc tacggtttct ccagcgctgg ctatcaacag 1020tcttggggcg cagccgaaga cgtcgcacaa ttggtcgatg aggcgtttca gaggtatcat 1080ggggccgccc gcgagtctaa gctctga 1107<210>4<211>120<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(22)..(22)<223>其中n＝a，t，c或g.
<220>
<221>misc_feature<222>(23)..(23)<223>其中n＝a，t，c或g.
<220>
<221>misc_feature<222>(24)..(24)<223>其中n＝a，t，c或g.
<220>
<221>misc_feature<222>(97)..(97)<223>其中n＝a，t，c或g.
<220>
<221>misc_feature<222>(98)..(98)<223>其中n＝a，t，c或g.
<220>
<221>misc_feature<222>(99)..(99)<223>其中n＝a，t，c或g.
<400>4tccccatgca agcgatgcac gnnngactcg tccgaccccg cttctcccgc ctacatcatt60ccccgaccag gtggcgaagt catctgcggc gggacgnnng gcgtgggaga ctgggacttg 120
<210>5<211>120<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(22)..(22)<223>其中n＝a，t，c或g.
<220>
<221>misc_feature<222>(23)..(23)<223>其中n＝a，t，c或g.
<220>
<221>misc_feature<222>(24)..(24)<223>其中n＝a，t，c或g.
<220>
<221>misc_feature<222>(97)..(97)<223>其中n＝a，t，c或g.
<220>
<221>misc_feature<222>(98)..(98)<223>其中n＝a，t，c或g.
<220>
<221>misc_feature<222>(99)..(99)<223>其中n＝a，t，c或g.
<400>5caagtcccag tctcccacgc cnnncgtccc gccgcagatg acttcgccac ctggtcgggg60aatgatgtag gcgggagaag cggggtcgga cgagtcnnnc gtgcatcgct tgcatgggga 120<210>6<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>基序<400>6Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser1 5<210>7<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>基序<400>7Gly Gly Thr Tyr Gly Val Gly1 權(quán)利要求
1.產(chǎn)生雄性或雌性不育植物的方法，所述方法包括步驟用編碼至少一種酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物材料，所述酶與非毒害植物的物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生毒害植物的物質(zhì)，并將這樣轉(zhuǎn)化的材料再生成植物，其中對植物施用所述非毒害植物的物質(zhì)直至雄性或雌性配子形成和/或成熟的時期，這樣非毒害植物的物質(zhì)使毒害植物的物質(zhì)得以產(chǎn)生，所述毒害植物的物質(zhì)選擇性地阻止所述配子的形成或使其無功能，其中所述酶優(yōu)先地在雄性或雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達并且所述非毒害植物的物質(zhì)是D-α氨基酸，或非蛋白D-α氨基酸的肽衍生物，其特征在于所述酶是可獲自纖細紅酵母的突變型D-氨基酸氧化酶，所述氧化酶在位點58上包含賴氨酸而不是野生型序列中的苯丙氨酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述非毒害植物的物質(zhì)與至少一種其它的物質(zhì)混合施用，所述其它的物質(zhì)選自安全劑、殺配子劑、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)劑、細胞色素P450誘導(dǎo)劑、除草劑、肥料、殺線蟲劑、增效劑、殺蟲劑、殺真菌劑、激素、植物生長調(diào)節(jié)劑和細胞色素P450抑制劑。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中將所述非毒害植物的物質(zhì)施用于葉子，并且是韌皮部流動的和代謝穩(wěn)定的可氧化的酶的底物，其中所述酶提供所述毒害植物的產(chǎn)物，作為直接或間接的來自非毒害植物的物質(zhì)的毒害植物的產(chǎn)物。
4.前面權(quán)利要求的方法，其中所述毒害植物的產(chǎn)物是以過氧化物和/或過氧化物陰離子形式產(chǎn)生的間接的毒害植物的產(chǎn)物。
5.權(quán)利要求3或4中任一項的方法，其中所述非毒害植物的物質(zhì)是D-天冬氨酸或D-谷氨酸，并且所述酶將所述氨基酸氧化成2-酮酸同時將氧還原成過氧化物陰離子。
6.前面任一權(quán)利要求的方法，其中當(dāng)與野生型序列對比時所述酶包含在位點213、223和/或238上的替代。
7.前面權(quán)利要求的方法，其中所述氧化酶在位點213上具有選自His、Ser、Thr、Cys、Gln、Gly、Asn和Ala的氨基酸，和/或在位點238上具有選自His、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Gly和Ala的氨基酸，和/或在位點223上具有選自His、Ser、Thr、Cys、Ala、Gly、Gln和/或Asn的氨基酸。
8.前面權(quán)利要求的方法，其中位點213上的所述氨基酸是Ser或Thr。
9.權(quán)利要求3-8中任一項的方法，其中所述酶被靶向至除過氧化物酶體之外的部位。
10.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述非毒害植物的物質(zhì)是膦絲菌素的D對映體或雙丙氨膦的D對映體。
11.權(quán)利要求1或2中任一項的方法，其中所述非毒害植物的物質(zhì)包含于混合物中，所述混合物包含毒害植物的物質(zhì)，其中所述酶將氨基酸氧化成2-酮酸同進將氧還原成過氧化物陰離子。
12.前面權(quán)利要求的方法，其中所述酶是可獲自纖細紅酵母的突變型D-氨基酸氧化酶或D-天冬氨酸氧化酶，當(dāng)與野生型序列相比時所述突變型D-氨基酸氧化酶在位點213和/或238和/或223包含替代。
13.前面權(quán)利要求的方法，其中所述可獲自紅酵母的氧化酶在位點213上具有選自His、Ser、Thr、Cys、Gln、Gly、Asn和Ala的氨基酸，和/或在位點238上具有選自His、Ser、Thr、Cys、Gln、Gly、Asn和Ala的氨基酸，和在位點223上具有選自His、Ser、Thr、Cys、Gln、Gly、Asn和Ala的氨基酸。
14.前面權(quán)利要求的方法，其中在位點213上的所述氨基酸是Ser或Thr。
15.權(quán)利要求10-13中任一項的方法，其中所述混合物包含D和L膦絲菌素并且所述植物材料基本上只在綠色組織和/或花組織中表達PAT基因，所述花組織產(chǎn)生不同于被導(dǎo)致無功能的配子的配子。
16.可獲自纖細紅酵母的能夠氧化膦絲菌素的突變型D-氨基酸氧化酶，所述氧化酶在位點58上包含賴氨酸而不是野生型序列中的苯丙氨酸。
17.權(quán)利要求14的氧化酶，所述氧化酶進一步在至少一個選自213、223、238的位點上包含氨基酸替代。
全文摘要
產(chǎn)生雄性或雌性不育植物的方法，所述方法包括步驟用編碼至少一個酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物材料，所述酶與非毒害植物的物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生毒害植物的物質(zhì)，并將所得的經(jīng)轉(zhuǎn)化的材料再生成植物，其中對植物施用所述非毒害植物的物質(zhì)直至雄性或雌性配子形成和/或成熟的時期，這樣非毒害植物的物質(zhì)提供毒害植物的物質(zhì)的產(chǎn)生，所述毒害植物的物質(zhì)選擇性地阻止所述配子體的形成或使其無功能，其中所述酶優(yōu)先地在雄性或雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達并且所述非毒害植物的物質(zhì)是D－α氨基酸，或非蛋白D－α氨基酸的肽衍生物，其特征在于所述酶是可獲自纖細紅酵母的突變型D－氨基酸氧化酶，所述氧化酶在位點58上包含賴氨酸而不是野生型序列中的苯丙氨酸。
文檔編號C12N9/06GK101076593SQ200480019677
公開日2007年11月21日 申請日期2004年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月8日
發(fā)明者R·達勒, T·R·豪克斯, P·A·湯普森, R·維尼爾 申請人:辛根塔有限公司