專利名稱：：用附著或非附著鳥細胞系生產(chǎn)痘病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用鳥細胞系尤其是鳥胚胎干細胞來生產(chǎn)活的或減毒痘病毒的方法，尤其是牛痘病毒，天然的或修飾的，該方法包括用病毒顆粒感染所述細胞。
背景技術(shù)：
：在歷史上，已知牛痘病毒被成功用于免疫對抗天花，根據(jù)WHO在1980年將其滅絕。從那時起，已經(jīng)暫停牛痘接種。目前，認(rèn)為該病毒的復(fù)活是潛在的威脅，對于未受保護的人群是毀滅性的。問題是在USA僅有1.5億劑量天花疫苗可獲得，F(xiàn)DA已經(jīng)作出方針并簽定合同來生產(chǎn)大量對抗天花的疫苗單元藥劑。更多信息在http//www.bt.cdc.gov/Agent/Smallpox/SmallpoxConsensus.pdf.可獲得。然而，加快生產(chǎn)需要新的生產(chǎn)方法和合適的細胞系。本發(fā)明中，我們描述了來自鳥物種的新細胞系(附著或非附著的)，可以用作醫(yī)藥公司生產(chǎn)疫苗的基質(zhì)。這些新的細胞源自鳥胚胎，并可以替換目前所用的蛋或原代胚胎成纖維細胞。傳統(tǒng)上，通過使用減弱或滅活形式的傳染劑，疫苗誘導(dǎo)對疾病的免疫性。目前減毒的痘病毒特征如在人細胞中不存在復(fù)制和免疫響應(yīng)的良好誘導(dǎo)，使得使用例如MVA(修飾的病毒安卡拉)作為載體的新疫苗策略得到發(fā)展。MVA是牛痘病毒(VV)的高度減毒株，最初在該疾病滅絕之前作為天花的安全疫苗來開發(fā)。MVA源自Ankara株，通過原代雞胚胎成纖維細胞(CEF)超過570連續(xù)傳代，且作為該適應(yīng)的結(jié)果，和親本株相比較，含有幾個大的基因組缺失。MVA在大多數(shù)哺乳動物細胞系中不再復(fù)制且在動物中是非致病性的。更重要地，當(dāng)MVA作為天花疫苗對多于100,000人包括免疫降低的個體給藥時，沒有報道過嚴(yán)重并發(fā)癥。通過分子生物學(xué)的傳統(tǒng)技術(shù)，可以獲得含有編碼所關(guān)心治療的特定肽或蛋白質(zhì)的外源DNA的重組MVA。這些重組病毒注射后，在體內(nèi)能夠刺激免疫系統(tǒng)來對抗特定抗原如腫瘤抗原。目前，發(fā)展了這些疫苗載體的新世代，或可以發(fā)展來對抗人或動物的傳染病和對抗各種腫瘤類型(黑素瘤、前列腺癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、肝癌……)。DrexlerI等(1998J.GenVirol.79347-352)已經(jīng)觀察到高度減毒的修飾的牛痘病毒安卡拉(MVA)在幼倉鼠腎細胞(病毒繁殖的潛在宿主)中復(fù)制，但在各種人轉(zhuǎn)化的和原代細胞中沒有復(fù)制；因此，MVA的宿主范圍受到限制。此外，該高度減毒的痘病毒株沒有產(chǎn)生生產(chǎn)性的感染(MossB，DevBiolStand199455-63)。例如，BlanchardTJ等(1998J.Gen.Virol.791159-1167)已經(jīng)報道了修飾的牛痘病毒安卡拉在人細胞中進行有限的復(fù)制并缺少幾個免疫調(diào)節(jié)蛋白。此外，產(chǎn)量必須與天花疫苗大規(guī)模生產(chǎn)的經(jīng)濟能力相適應(yīng)。MVA強有力的安全記錄以及在接種個體中引起的有效細胞和體液免疫反應(yīng)在MVA用作重組載體來免疫對抗人和動物傳染病中已經(jīng)產(chǎn)生了相當(dāng)大的科學(xué)和工業(yè)興趣，尤其是對抗HIV和癌癥。假設(shè)MVA適應(yīng)CEF，則可以在在這樣的細胞中生長成高滴定度，且目前的臨床批量重組MVA疫苗候選者是在原代CEF上生產(chǎn)的。然而，CEF的建立需要制備原代組織培養(yǎng)物的經(jīng)驗并依賴保持于特定無病原體條件下的雞的雞蛋。此外，生產(chǎn)方法是工作量巨大的且難以標(biāo)準(zhǔn)化，由于原代細胞僅存活有限的代數(shù)一些傳代并因此連續(xù)從胚胎化的蛋制得。雖然疫苗生產(chǎn)者可以解決生產(chǎn)用于I期和II期臨床試驗的批量MVA原料這樣的局限性，按比例擴大用于III期臨床試驗的基于CEF的生產(chǎn)方法和最終用于后期產(chǎn)品商業(yè)化仍然存在嚴(yán)重的障礙。本發(fā)明解決的問題是提供用于復(fù)制牛痘病毒的細胞系，其避免了上述問題且其可以滿足管理機構(gòu)的需要。這就是本發(fā)明的目的。理想地，這樣的細胞系是完全管理順從的；全部用已知的歷史來表征細胞。此外，細胞系是非致瘤的，遺傳未改變的，且在長期培養(yǎng)中是穩(wěn)定的。細胞系能夠復(fù)制病毒并適于在無血清培養(yǎng)基中穩(wěn)定附著和懸浮生長。在這點上，發(fā)明者研究了用于復(fù)制病毒用途的鳥細胞。本發(fā)明報道了建立的新的鳥源自胚胎的干細胞，其詳述于我們的共同未決申請PCT/FR03/00735(WO03/076601)中，對于復(fù)制痘病毒特別穩(wěn)定，尤其是正痘病毒如牛痘病毒。因為疫苗大規(guī)模生產(chǎn)的過程需要無限的細胞增殖，發(fā)明者選定檢測鳥源自胚胎的干細胞復(fù)制病毒的能力。然而，為了將鳥源自胚胎的干細胞在體外維持長的時間段，需要觀察特定培養(yǎng)和維持條件，如Pain等(1996，Development1222339-2348)；US6,114,168和EP787180中所述的，且這些培養(yǎng)條件是高成本的。問題是能夠在經(jīng)濟培養(yǎng)基中維持鳥源自胚胎的干細胞的培養(yǎng)而避免障礙如細胞分化和衰老。本發(fā)明的內(nèi)容中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)生長因子、血清和/或滋養(yǎng)層的撤除導(dǎo)致鳥源自胚胎的干細胞群的分離，該細胞可以在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中無限生長。此外，除了大部分是非附著細胞的造血干細胞，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)獲得的細胞呈現(xiàn)表型。然而，對于病毒疫苗的工業(yè)生產(chǎn)，非附著細胞是優(yōu)選的。該表型是有利的，因為其既容易處理，避免了使用用于分離的蛋白水解酶，又因為通過非粘著細胞的體外培養(yǎng)而獲得高細胞密度。本發(fā)明描述了鳥源自胚胎的干細胞的生產(chǎn)，其變成自發(fā)地非附著的或通過撤出滋養(yǎng)層而獲得非附著性。由于懸浮生長，這些細胞系完全適于生物反應(yīng)器中疫苗的工業(yè)生產(chǎn)。除了它們在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長的特征，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些細胞系可以復(fù)制特定病毒，產(chǎn)量等于或甚至高于現(xiàn)有方法獲得的產(chǎn)量，其使得這些細胞系尤其適于疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容因此，第一方面，本發(fā)明涉及在鳥源自胚胎的干細胞中復(fù)制病毒的方法，更具體地為牛痘病毒，如天然或重組牛痘病毒。本發(fā)明的方法包括步驟將病毒顆粒接種到所述鳥源自胚胎的干細胞，在無生長因子、滋養(yǎng)細胞和/或動物血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞直至發(fā)生細胞裂解，新產(chǎn)生的病毒顆粒釋放于所述培養(yǎng)基中。本發(fā)明鳥干細胞的接種用0.001至0.5的m.o.i.(多次感染)來進行，優(yōu)選實施方案中為0.01至0.5，最優(yōu)選實施方案中為0.01至0.1。該方法用于生產(chǎn)疫苗，尤其是對抗痘病毒科的疫苗，特別是抗天花的疫苗。所述鳥源自胚胎的干細胞系是通過以下方法可獲得的，該方法包括a)在含有使其生長的所有因子和滋養(yǎng)層，優(yōu)選滅活的，以及補體失活的血清的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)鳥細胞，優(yōu)選鳥胚胎的；b)通過改變培養(yǎng)基來傳代，以致獲得所述因子、血清和/或滋養(yǎng)層漸進性的或完全的清除，c)建立能夠在不存在外源生長因子，和/或滅活滋養(yǎng)層和/或低含量血清或無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中繁殖的附著或非附著的鳥細胞系；結(jié)果，步驟c)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基仍然含有低含量血清(即，約2％或更少)，所述方法可以任選的包括另外的步驟d)用選自以下的培養(yǎng)基改變不再含有外源生長因子、不再含有滅活滋養(yǎng)層和低含量血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，-補充血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(i)并用無血清培養(yǎng)基稀釋，然后培養(yǎng)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(i)中連續(xù)傳代的所述鳥細胞，其中無血清培養(yǎng)基的比例逐漸提高直到所述不含有外源生長因子、不含有滅活滋養(yǎng)層和低含量血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基完全消失；-補充血清的無血清培養(yǎng)基(SFM)(ii)，然后培養(yǎng)在所述培養(yǎng)基(ii)中的連續(xù)傳代過程中的所述鳥細胞，其中血清的比例逐漸降低至獲得無血清培養(yǎng)基；-無血清培養(yǎng)基(SFM)(iii)，然后在培養(yǎng)基(iii)中培養(yǎng)所述鳥細胞；然后在將適應(yīng)培養(yǎng)基改變的所述鳥細胞維持于無血清培養(yǎng)基中。如在此所用的術(shù)語《鳥》指的是生物分類學(xué)《ava》分類的任何種、亞種或?qū)?，如但不限于，這樣的生物如雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉、鸚鵡、雀類、鷹、烏鴉、鴕鳥、鴯鹋和食火雞。術(shù)語包括原雞(gallusgallus)的各種株，或雞(例如白來杭雞(WhiteLeghorn)、米奴加雞(BrownLeghorn)、BarredRock、Sussex、NewHampshire、RhodeIsland、Ausstralorp、Minorca、Amrox、CaliforniaCray、ItalianPartidge-colored)，以及火雞、雉、鵪鶉、鴨、鴕鳥和其它常規(guī)喂養(yǎng)家禽的株。優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的鳥細胞是雞細胞。如在此所用的術(shù)語“使其生長的因子”意思是鳥細胞在培養(yǎng)物中存活和生長必需的生長因子。根據(jù)本發(fā)明，生長因子包括營養(yǎng)因子和細胞因子。營養(yǎng)因子主要是SCF、IGF-1和bFGF。細胞因子主要是通過與gp130蛋白質(zhì)相關(guān)的受體而作用的細胞因子，如LIF、白細胞介素11、白細胞介素6、白細胞介素6受體、CNTF、制瘤素和促心激素(cardiotrophin)。步驟a)的鳥細胞選自鳥胚胎細胞，更優(yōu)選選自鳥胚胎干細胞和鳥原代細胞。優(yōu)選實施方案中，細胞是從分離的X期胎盤細胞的懸浮群分離的全能性或多能性鳥胚胎干細胞，胎盤細胞是從鳥胚胎獲得的，更優(yōu)選為雞胚胎(參見EYAL-GILADI’sclassificationEYAL-GILADI和KOCHAN，1976，《Fromcleavagetoprimitivestreackformationacomplementarynormaltableandanewlookatthefirststagesofthedevelopmentinthechick》.“GeneralMorphology”Dev.Biol.49321-337)。鳥胚胎干細胞的特征是在39℃培養(yǎng)時包括48至72小時的慢的倍增時間來表征這些。為了獲得漸進性的或完全的生長因子、血清和/或滋養(yǎng)層的清除，可以同時、連續(xù)或分開進行本發(fā)明方法步驟b)中的培養(yǎng)基改變。培養(yǎng)基清除的次序可以選自-滋養(yǎng)層/血清/生長因子；-滋養(yǎng)層/生長因子/血清；-血清/生長因子/滋養(yǎng)層；-血清/滋養(yǎng)層/生長因子；-生長因子/血清/滋養(yǎng)層；-生長因子/滋養(yǎng)層/血清；優(yōu)選實施方案中，清除的次序是生長因子/滋養(yǎng)層/血清。特定實施方案中，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中建立的細胞系是附著干細胞，其在不存在滅活滋養(yǎng)層下增殖。在這點上，上述方法中，步驟b)包括培養(yǎng)基成分的清除(生長因子單獨或血清單獨或生長因子然后血清或血清然后生長因子)。另一實施方案中，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中建立的細胞系是非附著干細胞，其在無外源生長因子的培養(yǎng)基中懸浮增殖。在這點上，上述方法中，步驟b)包括滋養(yǎng)層漸進性的或全部的清除和然后任選的培養(yǎng)基其它成分(生長因子和血清)的清除。另一實施方案中，本發(fā)明涉及上述的方法，其中建立的細胞系是非附著干細胞，其在沒有血清的培養(yǎng)基(無血清培養(yǎng)基)中懸浮增殖。另一實施方案中，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中建立的細胞系是非附著干細胞，其在無外源生長因子和血清的培養(yǎng)基中懸浮增殖。另一可替換的方案中，步驟b)包括生長因子漸進性的或完全的清除之后，任選的為血清漸進性的清除。另一可替換的方案中，步驟b)包括生長因子和/或血清漸進性的或完全的清除之后，任選的為滋養(yǎng)層的清除。此外，建立的細胞系是在血清耗盡的培養(yǎng)基中尤其在無血清培養(yǎng)基中增殖的細胞。表述血清耗盡理解為意思是血清濃度隨著時間逐漸降低。該方法使得可以選擇克隆，該克隆適于這些新的，愈加劇烈的條件直至獲得穩(wěn)定細胞系，其能夠在血清耗盡的培養(yǎng)基中或完全無血清的培養(yǎng)基中生長。更準(zhǔn)確地，方法的步驟a)包括在完全培養(yǎng)基中的約7×104/cm2至8×104/cm2鳥細胞接種于培養(yǎng)瓶中。優(yōu)選，用約7.3×104/cm2(4×106細胞/55cm2或4×106細胞/100mm培養(yǎng)皿)來接種?！巴耆囵B(yǎng)基”，意思是補充生長因子和動物血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基的實例描述于Pain等(1996，Development1222339-2348)，EP787,180和US6,114,168、US5,340,740、US6,656,479和US5,830,510中。根據(jù)本發(fā)明，“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”意思是有傳統(tǒng)培養(yǎng)基配方的培養(yǎng)基，其自身至少使細胞存活，甚至更好，使細胞生長?；A(chǔ)培養(yǎng)基的實例是BME(基礎(chǔ)Eagle培養(yǎng)基)、MEM(最小Eagle培養(yǎng)基)、培養(yǎng)基199、DMEM(Dulbecco’s改良Eagle培養(yǎng)基)、GMEM(Glasgow改良Eagle培養(yǎng)基)、DMEM-HamF12、Ham-F12和Ham-F10、Iscove’s改良Dulbecco’s培養(yǎng)基、MacCoy’s5A培養(yǎng)基、RPMI1640。基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括無機鹽(例如，CaCl2、KCl、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4、MgSO4，……)、氨基酸、維生素(硫胺素、核黃素、葉酸、D-泛酸鈣，……)和其它成分如葡萄糖、β-巰基乙醇、丙酮酸鈉。可以示意地區(qū)分兩類生長因子細胞因子和營養(yǎng)因子。細胞因子主要是通過與gp130蛋白相關(guān)的受體而作用的細胞因子。因此，LIF、白細胞介素11、白細胞介素6、白細胞介素6受體、CNTF、制瘤素和促心激素具有相似的作用模式，在特定鏈?zhǔn)荏w的水平募集，后者與單體或有時雜二聚形式的gp130蛋白結(jié)合。營養(yǎng)因子主要是SCF、IGF-1和bFGF。更優(yōu)選，完全培養(yǎng)基含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰島素生長因子(IGF-1)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素6受體(IL-6R)、干細胞因子(SCF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，任選的白細胞介素11(IL-11)和動物血清。步驟a)的鳥細胞，優(yōu)選鳥胚胎細胞在完全培養(yǎng)基中的幾次傳代過程中培養(yǎng)。培養(yǎng)基補充至少一種選自LIF、IGF-1、CNTF、IL-6、IL6R、SCF、bFGF、IL-11、制瘤素或促心激素的生長因子。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，完全培養(yǎng)基是補充IGF-1、CNTF、IL-6、IL6R、SCF、bFGF、任選的IL-11的基礎(chǔ)培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基中含有的生長因子IGF-1、CNTF、IL-6、IL6R、SCF、bFGF、任選的IL-11的濃度約為0.01至10ng/ml，優(yōu)選0.1至5ng/ml，更優(yōu)選約為1ng/ml。約傳代3至10次后，清除完全培養(yǎng)基中的生長因子(步驟b)。優(yōu)選，對于每種生長因子，從一個傳代至另一個傳代，在一個步驟中直接進行清除?；蛘?，逐漸進行生長因子的清除，通過漸進性降低完全培養(yǎng)基中生長因子的濃度。更優(yōu)選的實施方案中，同時進行至少兩種生長因子的生長因子清除。優(yōu)選的實施方案中，生長因子的清除是以兩輪清除進行的首先，直接從完全培養(yǎng)基中除去SCF、IL6、IL6R，任選的IL11；然后在含有IGF1和CNTF，任選的IL-11并補充動物血清的完全培養(yǎng)基中維持鳥細胞培養(yǎng)至少一個傳代。其次，從培養(yǎng)基中直接除去IGF1和CNTF，任選的IL11，其最終含有僅補充血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。通常，在約傳代20至30次時全部清除生長因子。優(yōu)選實施方案中，在生長因子去除后進行滋養(yǎng)細胞的去除。滋養(yǎng)細胞的去除是漸進性的并進行數(shù)個傳代?，F(xiàn)在以低于步驟a)的濃度將鳥細胞接種于燒瓶中，約4×104細胞/cm2至5×104細胞/cm2。以約4.2×104細胞/cm2將滋養(yǎng)細胞接種于瓶中。瓶中滋養(yǎng)細胞的濃度逐漸降低。實際上，相同濃度的滋養(yǎng)細胞用于2至4次傳代，然后較低濃度的滋養(yǎng)細胞用于另外的2至4次傳代，同樣繼續(xù)。然后，瓶接種約4.2×104滋養(yǎng)細胞/cm2，然后約2.2×104滋養(yǎng)細胞/cm2，然后約1.8×104滋養(yǎng)細胞/cm2，然后約1.4×104滋養(yǎng)細胞/cm2，然后約1.1×104滋養(yǎng)細胞/cm2，然后約0.9×104滋養(yǎng)細胞/cm2，然后約0.5×104滋養(yǎng)細胞/cm2。然后燒瓶接種6.5×104鳥細胞/cm2至7.5×104鳥細胞/cm2且無滋養(yǎng)細胞。假定中，鳥細胞隨著燒瓶中滋養(yǎng)細胞濃度的降低沒有良好的形狀，然后在繼續(xù)滋養(yǎng)細胞清除之前用相同的滋養(yǎng)細胞濃度培養(yǎng)鳥細胞額外的代數(shù)。另一優(yōu)選實施方案中，在生長因子和滋養(yǎng)細胞清除后進行血清清除。通過選自以下的培養(yǎng)基來改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基-補充血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(i)并用新的無血清培養(yǎng)基(ii)稀釋。然后鳥細胞培養(yǎng)基(i)中通過連續(xù)傳代來培養(yǎng)，其中無血清培養(yǎng)基的比例逐漸提高至補充血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基完全消失(漸進性稀釋)。-補充血清的新的無血清培養(yǎng)基(ii)。然后在培養(yǎng)基(ii)中通過連續(xù)傳代來培養(yǎng)鳥細胞，其中血清比例逐漸降低至獲得無血清培養(yǎng)基(漸進性隔絕排除)。-沒有補充血清的新的無血清培養(yǎng)基(ii)。然后將鳥細胞直接在無血清培養(yǎng)基(ii)中培養(yǎng)(直接排除)。在一優(yōu)選實施方案中，通過漸進性排除除去血清。第一個實施方案中，血清清除的方法(themethodofserumdeprivationproce)根據(jù)本發(fā)明，“無血清培養(yǎng)基”(SEM)意思是立即使用的細胞培養(yǎng)基，即不需要添加血清使細胞存活和細胞生長。該培養(yǎng)基沒有必需的化學(xué)限定，可以含有各種來源的水解物，例如來自植物。優(yōu)選，所述SFM是“非動物來源”限定的，即不含有動物或人來源的成分(FAO狀態(tài)“無動物來源”)。SFM中，由重組蛋白替代天然血清蛋白?；蛘?，根據(jù)本發(fā)明的SFM培養(yǎng)基不含有蛋白質(zhì)(PF培養(yǎng)基“無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基”)和/或化學(xué)限定的(CDM培養(yǎng)基“化學(xué)限定培養(yǎng)基”)。SFM培養(yǎng)基存在數(shù)個優(yōu)勢(i)首先，這樣的培養(yǎng)基是管理順應(yīng)性的(實際上，沒有偶發(fā)物質(zhì)如BSE、病毒污染的風(fēng)險)；(ii)純化過程的最佳化；(iii)由于更好限定的培養(yǎng)基，過程中更好的再現(xiàn)性。可購得的SFM培養(yǎng)基實例是VPSFM(InVitrogen參考11681-020，2003目錄)，OptiPro((InVitrogen參考12309-019，2003目錄)，Episerf(InVitrogen參考10732-022，2003目錄)，Pro293S-CDM(Cambrex參考12765Q，2003目錄)，LC17(Cambrex參考BESP302Q)，ProCHO5-CDM(Cambrex參考12-766Q，2003目錄)，HyQSFM4CHO(Hyclone參考SH30515-02)，HyQSFM4CHO-Utility(Hyclone參考SH30516.02)，HyQPF293(Hyclone參考SH30356.02)，HyQPFVero(Hyclone參考SH30352.02)，Ex細胞293培養(yǎng)基(JRHBiosciences參考14570-1000M)，Excell325PFCHO無蛋白培養(yǎng)基(JRHBiosciences參考14335-1000M)，Ex細胞VPRO培養(yǎng)基(JRHBiosciences參考14560-1000M)，Ex細胞302無血清培養(yǎng)基(JRHBiosciences參考14312-1000M)。本發(fā)明還涉及獲得鳥細胞系的方法，優(yōu)選非轉(zhuǎn)化細胞系，能夠在無血清培養(yǎng)基中生長；那些細胞系在任選的含有滋養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所述方法包括步驟-在完全培養(yǎng)基和任選的用滋養(yǎng)層培養(yǎng)鳥細胞，優(yōu)選非轉(zhuǎn)化的。鳥細胞可以是上述步驟a)中的鳥細胞，本發(fā)明方法建立的鳥細胞系，如EB1、EB14或S86N45(也稱為EB45)，或其它鳥源自胚胎的細胞系如DF1(US5,672,485和US6,207,415)；-通過改變或變化培養(yǎng)基至少培養(yǎng)一個傳代，為了獲得血清的完全清除，通過漸進性的或直接清除血清。-建立能夠在無血清培養(yǎng)基中生長的附著或非附著鳥細胞系。本發(fā)明依賴于這樣的發(fā)現(xiàn)通過從基礎(chǔ)培養(yǎng)基中簡單除去血清不能進行從補充動物血清的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基到無血清培養(yǎng)基的傳代，而是需要改變培養(yǎng)基的類型，應(yīng)該是無血清培養(yǎng)基(SFM)。此外，當(dāng)鳥細胞系生長需要生長因子或滋養(yǎng)細胞時，優(yōu)選在清除生長因子和/或滋養(yǎng)細胞后清除血清。滋養(yǎng)細胞是動物細胞，其優(yōu)選通過照射或用絲裂霉素化學(xué)處理而滅活的?？梢栽谶z傳上修飾滋養(yǎng)細胞以表達生長因子如SCF。優(yōu)選，滋養(yǎng)細胞是小鼠成纖維細胞系如STO(美國典型培養(yǎng)物保藏中心ATCCN°CRL-1503)。上述方法可以另外包括步驟，其中步驟c)中獲得的細胞接受大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)基的選擇或適應(yīng)，以致獲得適于確定用于人類或動物治療的疫苗生產(chǎn)的克隆。該方法導(dǎo)致新的鳥源自胚胎的細胞系的建立，其維持體外培養(yǎng)相當(dāng)長的時間。有利地，源自步驟c)中所獲得細胞系的細胞能夠增殖至少50天、100天、150天、300天或優(yōu)選至少600天。600天不構(gòu)成時間限制，因為更長時間段后獲得的細胞系仍然是活的。因此，認(rèn)為這些細胞系能夠在無外源生長因子、血清和/或滅活滋養(yǎng)層的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中無限生長。表述“細胞系”理解為意思是能夠在體外培養(yǎng)中無限增殖而保持或多或少相同程度形態(tài)學(xué)和表型特征的任何細胞群。當(dāng)然，上述方法可以獲得源自建立細胞系所獲得細胞的細胞克隆。這些克隆在遺傳上與通過分裂衍生的細胞是相同的。建立的細胞系和源自其(步驟c或d)的細胞優(yōu)選是源自胚胎的鳥干細胞系，更確切地那些細胞是多能性的鳥源自胚胎的干細胞。通過本發(fā)明方法可獲得的鳥源自胚胎的干細胞是小的、圓的、單個的細胞，在39℃具有約24小時或更短的倍增時間。通過本發(fā)明方法可獲得的細胞至少是傳代p60的、至少p70、至少p80、至少p90、至少p100、至少p110、至少p120或至少p1300或更后的。根據(jù)本發(fā)明的鳥源自胚胎的干細胞具有至少一個以下特征-高的核-細胞質(zhì)比例，-內(nèi)源堿性磷酸酶活性，-內(nèi)源端粒酶活性，-與選自抗體SSEA-1(TEC01)、SSEA-3或EMA-1的特異性抗體的反應(yīng)性。-短于本發(fā)明方法步驟a)鳥細胞倍增時間(39℃48至72h)的倍增時間，相同培養(yǎng)條件下約24小時或更短。-這些細胞系和源自其的細胞能夠在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中增殖至少50天、100天、150天、300天，或優(yōu)選至少600天，尤其是在補充各種本領(lǐng)域技術(shù)人員常用添加劑的培養(yǎng)基中如DMEM、GMEM、HamF12或McCoy。添加劑中，包括非必需氨基酸、維生素和丙酮酸鈉。然而，細胞能夠在無谷氨酰胺的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中增殖。-這些細胞系和源自其的細胞具有作為附著細胞或作為懸浮細胞生長的特征。優(yōu)選，本發(fā)明的細胞系具有全部上述特征。本發(fā)明建立的鳥細胞系和源自其的細胞用于生物制劑如重組肽和蛋白質(zhì)(即，抗體、激素、細胞因子，……)、病毒、病毒載體、病毒顆粒和病毒疫苗的生產(chǎn)。更確切地，本發(fā)明建立的鳥細胞系和源自其的細胞用于病毒和/或相關(guān)載體和顆粒的復(fù)制，用于生產(chǎn)活的或減毒的、重組的或未重組的、對抗疾病如癌癥和傳染病的疫苗。病毒、相關(guān)的病毒載體、病毒顆粒和病毒疫苗優(yōu)選選自腺病毒、嗜肝DNA病毒、皰疹病毒、正粘病毒、乳多泡病毒、副粘病毒、細小核糖核酸病毒、痘病毒、呼腸孤病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶病毒。優(yōu)選實施方案中，病毒、相關(guān)的病毒載體、病毒顆粒和病毒疫苗屬于痘病毒科，更優(yōu)選屬于脊索痘病毒科(chordopoxviridae)。更優(yōu)選，病毒或相關(guān)的病毒載體、病毒顆粒和病毒疫苗是禽痘病毒，選自雞痘病毒、金絲雀痘病毒(即ALVAC)、燈芯草雀痘病毒、八哥痘病毒(mynahpoxvirus)、鴿子痘病毒、鸚鵡痘病毒(psittacinepoxvirus)、鵪鶉痘病毒、麻雀痘病毒、燕八哥痘病毒、火雞痘病毒。根據(jù)另一優(yōu)選實施方案，病毒是牛痘病毒。另一實施方案中，病毒、相關(guān)的病毒載體、病毒顆粒和疫苗屬于正粘病毒科，尤其是流行性感冒病毒，和屬于副粘病毒族，尤其是麻疹病毒、腮腺炎病毒和風(fēng)疹病毒。本發(fā)明還涉及在本發(fā)明建立的鳥細胞系中表達和/或產(chǎn)生的生物制劑，尤其是蛋白質(zhì)和疫苗。優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明建立的附著或非附著鳥干細胞系的用途，該細胞系是遺傳、生物或化學(xué)未修飾的，能夠在培養(yǎng)物中無限增殖，并具有上述特征，用于復(fù)制活的或減毒的正痘病毒科的病毒，更特別的是的或減毒的牛痘病毒或重組牛痘病毒。本發(fā)明的目的在于用如上所限定的附著或非附著細胞來生產(chǎn)活的或減毒疫苗的用途，包括培養(yǎng)根據(jù)上述方法在步驟c)或d)中建立的附著或非附著細胞系，將病毒顆粒接種所述細胞，并在上述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞直至發(fā)生細胞裂解，收集釋放于所述培養(yǎng)基中的新產(chǎn)生的病毒顆粒。本發(fā)明對于生產(chǎn)屬于正痘病毒科的減毒病毒尤其有用，尤其是牛痘病毒，Lister-Elstree牛痘病毒株，修飾的牛痘病毒如可以從ATCC(ATCC編號VR-1508)獲得的修飾牛痘病毒安卡拉(MVA)，NYVAC(Tartaglia等，1992Virology188217-232)，LC16m8(SugimotoetYamanouchi1994Vaccine12675-681)，CV178(Kempe等，1968Pediatrics42980-985)和其它重組病毒。有利地，感染源自建立的細胞系的細胞，以生產(chǎn)活的牛痘病毒或減毒病毒，其是修飾的牛痘病毒和/或重組牛痘?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的任何技術(shù)感染所述細胞?；蛘撸D(zhuǎn)染或修飾源自建立細胞系的細胞，以生產(chǎn)活的牛痘病毒或減毒病毒，其是修飾的牛痘病毒和/或重組牛痘。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的任何技術(shù)來修飾所述細胞，尤其是通過非同源的或同源的，直接和/或條件重組(Cre-Lox或FLP-FRT系統(tǒng))，通過任何載體、質(zhì)粒、病毒或重組病毒尤其是通過逆轉(zhuǎn)錄病毒或重組逆轉(zhuǎn)錄病毒幫助的來轉(zhuǎn)化。一特定實施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)活的或減毒疫苗的方法如抗天花的疫苗，包括培養(yǎng)根據(jù)上述方法的步驟c)或d)中建立的附著或非附著細胞系，將病毒顆粒接種所述細胞，并在上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞直至發(fā)生細胞裂解，收集釋放于所述培養(yǎng)基中的新產(chǎn)生的病毒顆粒。本發(fā)明對于生產(chǎn)屬于痘病毒科的減毒病毒特別有用，尤其是牛痘病毒，Lister-Elstree牛痘病毒株，修飾的牛痘病毒如可以從ATCC(ATCC編號VR-1508)獲得的修飾牛痘病毒安卡拉(MVA)，NYVAC(Tartaglia等，1992Virology188217-232)，LC16m8(SugimotoetYamanouchi1994Vaccine12675-681)，CV178(Kempe等，1968Pediatrics42980-985)和其它重組牛痘病毒。例如，可以使用MVA如抗天花的疫苗。第二個特定實施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)活的或減毒疫苗的方法，如抗疾病的疫苗，更優(yōu)選后天的或傳染病，所述方法包括培養(yǎng)根據(jù)上述方法的步驟c)或d)中建立的附著或非附著細胞系，將病毒重組顆粒接種所述細胞，并在上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞直至發(fā)生細胞裂解，收集釋放于所述培養(yǎng)基中的新產(chǎn)生的病毒重組顆粒。例如，可以使用重組MVA來表達對抗以下疾病的抗原-后天性疾病，如但無限制，前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、乳癌、黑素瘤；-傳染病，如但無限制，AIDS(HIV病毒)、甲肝、乙肝、丙肝、瘧疾、狂犬病、黃熱病、日本腦炎、腮腺炎、麻疹、風(fēng)疹。通過上述方法生產(chǎn)的疫苗是本發(fā)明的一部分。對于說明書的剩余部分，將參考以下的圖例。圖1本發(fā)明一細胞系的生長曲線，顯示細胞的長期復(fù)制。圖2S86N45(EB45)(附著)和EB14(懸浮)細胞的群倍增時間。圖3溫度對S86N45(EB45)細胞生長動力學(xué)的影響。圖4本發(fā)明一細胞系的生長曲線，顯示細胞隨著血清清除(達2％血清)的長期復(fù)制。圖5S86N45(EB45)和EB14細胞在無血清培養(yǎng)基(SFM)中生長的適應(yīng)。圖6EB14懸浮細胞在2L生物反應(yīng)器中無血清培養(yǎng)基中的培養(yǎng)。圖7本發(fā)明一細胞系的生長曲線(S86N16)，顯示細胞隨著滋養(yǎng)層撤除的長期復(fù)制。圖8顯示鳥干細胞形態(tài)特征的照片。N核，n核仁，C細胞質(zhì)(分離的S86N99，40倍放大，用SonyCyber-shot數(shù)碼相機拍攝)圖9顯示附著或懸浮鳥干細胞的堿性磷酸酶活性的照片。固定后(0.1％甲醛/0.5％戊二醛，4℃30分鐘)，將細胞在1×PBS中漂洗兩次，并在NBT/BCIP溶液中(硝基藍四唑氯0.375mg/ml，5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽0.188mg/ml，0.1MTrispH9.5，0.05MMgCl2，0.1MNaCl)37℃孵育10至30分鐘。通過兩次1×PBS洗滌來停止反應(yīng)，并拍攝照片。A-說明了在無滋養(yǎng)層或因子的條件下培養(yǎng)的附著細胞系S86N45p87獲得的內(nèi)源堿性磷酸酶的特征性紫羅蘭染色，(40倍放大，SonyCyber-shot數(shù)碼相機)。B-說明了從8次傳代維持懸浮的EB14細胞系獲得的內(nèi)源堿性磷酸酶的特征性紫羅蘭染色，該細胞系源自S86N45細胞，在無滋養(yǎng)層或因子的條件下懸浮培養(yǎng)(20倍放大，SonyCyber-shot數(shù)碼相機)。C-S86N45(EB45)細胞特異性標(biāo)記。圖10CEF和附著S86N45(EB45)細胞的病毒敏感性(感染后72小時-MOI0.1)。圖11CEF和附著S86N45(EB45)細胞在各種多次感染(MOI)的病毒敏感性(感染后48小時)圖12附著S86N45(EB45)細胞上MVA-GFP的增殖動力學(xué)。圖13懸浮EB14細胞上MVA-GFP的增殖動力學(xué)。圖14DMEM-F12培養(yǎng)基上生長的S86N45(EB45)細胞上MVA-GFP復(fù)制。圖15DMEM-F12培養(yǎng)基上生長的S86N45(EB45)細胞上野生型MVA病毒的復(fù)制(MOI0.1)圖16含有血清培養(yǎng)上懸浮EB14細胞上的MVA復(fù)制(MOI0.2)圖17無血清培養(yǎng)基中懸浮EB14細胞上的MVA復(fù)制(MOI0.01)圖18無血清培養(yǎng)基中懸浮EB14細胞上的MVA產(chǎn)量(MOI0.01)具體實施例方式實施例1附著細胞的產(chǎn)生和建立打開蛋，在打開過程中從蛋白中分離出蛋黃。直接或借助Pasteur移液管，或借助小的吸附濾紙(Whatmann3M紙)從蛋黃中取出胚胎，紙片預(yù)先用打孔機裁出穿孔環(huán)的形式?？椎闹睆郊s為5mm。將這些小環(huán)在烤爐中使用干熱滅菌約30分鐘。將這小紙環(huán)放置于蛋黃表面，并居中于胚胎上，因此使紙環(huán)圍繞胚胎。然后用小剪刀剪裁后者，并整個取出放置于裝滿PBS或生理鹽水的培養(yǎng)皿中。因此清洗掉環(huán)帶出胚胎的介質(zhì)中過多的蛋黃和胎盤，因此用Pasteur移液管收集無過量的卵黃磷蛋白。兩種情況中，將胚胎放置于含有生理介質(zhì)(1×PBS，Tris葡萄糖、培養(yǎng)基等等)的管中。然后將胚胎機械分離并接種于“滋養(yǎng)”放入限定的培養(yǎng)基中。用于培養(yǎng)的優(yōu)選條件中，優(yōu)選將包括MacCoy或DF12的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，補充初始濃度12至8％的胎牛血清，1％的非必需氨基酸，1％商業(yè)來源的維生素混合物，終濃度1mM的丙酮酸鈉，終濃度0.2mM的β-巰基乙醇，終濃度2.9mM的谷氨酰胺，抗生素的初始混合物，含有10ng/ml終濃度的慶大霉素，100U/ml終濃度的青霉素和100μg/ml終濃度的鏈霉素。細胞頭幾次傳代后不久，不再將抗生素混合物加入培養(yǎng)基中。表述不久理解為意思是通常開始3至5次傳代后。還可以加入核苷混合物，該混合物如上制得(Pain等，1996)。在這些相同條件下測試的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，給予了相似結(jié)果的是HamF12、GlasgowMEM和DMEM培養(yǎng)基，后者補充終濃度8mg/l的生物素。通過比較，生物素濃度為MacCoy培養(yǎng)基中0.2mg/ml，HamF12中0.0073mg/l，商業(yè)DMEM和GMEM培養(yǎng)基中為0。加入培養(yǎng)基中的生長因子和細胞因子優(yōu)選是重組的因子和細胞因子，包括終濃度1ng/ml的小鼠SCF，終濃度1至5ng/ml的IGF-1，終濃度1ng/ml的CNTF，終濃度1ng/ml的IL-6，和終濃度0.5ng/ml至1ng/ml的可溶IL-6受體。一些實驗中，可以在頭幾次傳代過程中加入一些其它因子。例如達3或10次傳代，可以將終濃度1ng/ml的bFGF和終濃度1ng/ml的IL-11加入培養(yǎng)基中。進行該培養(yǎng)基中滅活“滋養(yǎng)層”上的接種，滋養(yǎng)層由建立的小鼠成纖維細胞系構(gòu)成，如STO細胞。一些情況中，用簡單表達載體轉(zhuǎn)染這些細胞，載體可以在STO細胞中組成型表達如鳥SCF的生長因子。因此，該“滋養(yǎng)層”產(chǎn)生了在細胞膜中可溶和/或附著形式的因子。將細胞初次直接接種于該培養(yǎng)基后，根據(jù)觀察到的原代細胞的附著速率，可以加入新鮮培養(yǎng)基或第二天部分改變培養(yǎng)基，然后在隨后的日子中部分或全部改變。根據(jù)情況約4至7后，分離初始培養(yǎng)物并轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)皿中滅活滋養(yǎng)層上的相同初始培養(yǎng)基中。三至五次傳代后，在滅活STO細胞滋養(yǎng)層上培養(yǎng)細胞，STO細胞是非轉(zhuǎn)染的或用編碼抗生素抗性如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素抗性基因等等表達載體轉(zhuǎn)染的。約二十次傳代后，將細胞漸進性清除生長因子和細胞因子。表述“逐漸清除”理解為意思是從培養(yǎng)基中生長因子接著生長因子去除，或生長因子組接著生長因子組去除。第一個實施方案中，在一個傳代，首先除去全部SCF，然后在兩個或三個傳代后，例如除去另一種生長因子如IGF-1。如果細胞沒有呈現(xiàn)形態(tài)改變或平均增殖速率的改變，然后除去其它因子，如CNTF和IL-6。第二個優(yōu)選實施方案中，以生長因子組接著生長因子組來進行生長因子的清除。除去包括SCF、IL6、IL6R和IL11的第一組生長因子，然后除去包括IGF1和CNTF的第二組。第三個實施方案中，該清除還可以是劇烈的。在這種情況中一次除去所有的因子。然后觀察細胞，如果僅傳代數(shù)天后其增殖速率改變了。較后面的溶液通常是被實踐過的。因此獲得各種分離物并維持非常長的時間段。表述非常長的時間段理解為意思是大約數(shù)周次的時間段，最小為50天，優(yōu)選長于200至400天的時間段，在時間上無限制。觀察到長于600天的時間段。與所用的支持物無關(guān)，用蛋白水解分離酶分離所有附著細胞，如鏈霉蛋白酶、膠原酶、分散酶、胰蛋白酶等等。優(yōu)選，為了避免任何可能的動物來源的污染，使用細菌來源的蛋白水解酶。這些細胞具有所示特定形態(tài)的胚胎干細胞的特征，例如，通過圖8的照片，即大小小、大的核-細胞質(zhì)比例，具有至少一個清楚可見核仁的核，和非常小的細胞質(zhì)。通過以或多或少緊密實體形式物質(zhì)生長來表征這些細胞。附著和非附著細胞呈現(xiàn)與許多抗體的交叉反應(yīng)性，如上Pain等(1996)以及專利US6,114,168和EP787,180中所述的。還存在內(nèi)源端粒酶活性成份，且是這些細胞“干”性能中的重要因素。獲得不同的細胞分離物，并維持長時間段。表1說明了這些分離物的一些特征。表1注意到術(shù)語“停止”不對應(yīng)于細胞增殖的結(jié)束，而是實驗者故意停止細胞培養(yǎng)物的。世代數(shù)n通過公式X＝2n獲得或X是理論的細胞累積數(shù)目。該數(shù)字是可獲得的，因為每次傳代和每次接種中進行細胞計數(shù)。培養(yǎng)的完整記載因此是可獲得的。S86N45細胞也稱為EB45。實施例2細胞的傳代干細胞尤其是體干細胞和胚胎干細胞的特征之一是它們在體外增殖相當(dāng)長時間段的能力。為了繁殖和傳代細胞，在傳代數(shù)小時之前用新鮮培養(yǎng)基來改變和替換培養(yǎng)基。圖1中所示的曲線說明了細胞生長和建立的特征。實施例3倍增時間和平均分化時間3.1用培養(yǎng)中建立的細胞和之前實施例中所示的細胞開始，計算平均分裂時間。對于獲得的所有獨立分離物，在連續(xù)傳代過程中增殖速率略有提高，因此導(dǎo)致在細胞建立過程中的平均分裂時間改變。附著階段中，最初將細胞接種于滅活滋養(yǎng)層上并以1至2×106細胞每100mm培養(yǎng)皿(55cmm2培養(yǎng)皿)的恒定起始接種密度有規(guī)律地傳代。表2說明了3個建立的細胞類型倍增時間(d)和平均分裂時間(以小時計的MDT)為培養(yǎng)時間的函數(shù)。觀察到在建立過程中平均倍增時間縮短。表2用以下公式d＝(1/Log2×(LogX2/X1))×1(T2-T1)建立以天數(shù)表示時間段的平均倍增時間d，其中X2和X1是時間T2和T1的細胞總數(shù)。該公式是實施例1中所示公式X＝2n計算世代數(shù)N的直接結(jié)果。然后通過將d除以24小時獲得以小時計的平均分裂時間(MDT)。*在該建立過程中Valo細胞在不存在滋養(yǎng)層的塑料支持物上傳代。當(dāng)細胞對該新環(huán)境重新適應(yīng)時，倍增時間縮短，然后再增加。3.2-雞具有39℃的體溫。因此S86N45(EB45)和EB14細胞生長動力學(xué)的分析開始在39℃進行。在這些條件下，細胞表征為非常短的世代時間，通常15至20小時(圖2)。實施例4細胞培養(yǎng)溫度S86N45(EB45)和EB14細胞在39℃非常快的周期對于有效的MVA病毒生產(chǎn)是次優(yōu)的。因此還分析了37℃和35℃的細胞生長(圖3)。如所期望的，細胞周期在37℃降低。這樣的條件原則上更適于病毒增殖并因此在以下所述的MVA實驗中選用。相關(guān)地注意到S86N45(EB45)細胞和EB14細胞還可以在35℃生長，雖然具有更短的動力學(xué)。S86N45和EB14細胞對低溫(35℃甚至33℃)的適應(yīng)對于活的減毒的熱敏感性病毒疫苗的生產(chǎn)尤其有用。實施例5細胞系增殖血清含量的控制5.1-低血清濃度的培養(yǎng)基獲得這些細胞系的過程中，所用的培養(yǎng)基是常規(guī)培養(yǎng)基，含有補充各種添加劑如非必需氨基酸、維生素和丙酮酸鈉的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM、GMEM、HamF12、McCoy等等)。該復(fù)合培養(yǎng)基包括胎牛血清，其仍然是培養(yǎng)基的關(guān)鍵成分，盡管可以逐漸使用不同來源的成分，包括植物成分。提出了控制并使細胞習(xí)慣相對低比例胎牛血清的方法。因此可以用低百分比的血清維持細胞的高增殖(分裂時間＞1)(例如S86N16細胞的情況中為2％)。圖4所示的曲線說明了所給細胞類型S86N16細胞的血清相對減少。還計算了倍增時間和平均分裂時間，并列于表3中。注意到平均分裂時間隨著血清相對減少的函數(shù)而提高。盡管在上述條件下培養(yǎng)一段時間后觀察到恢復(fù)期。盡管該時間保持低于24h(d＞1)，其已經(jīng)代表了就工業(yè)化而言非常有利的增殖，甚至在2％血清濃度，其已經(jīng)是相對低的了。為了提高該時間和再進一步最佳化培養(yǎng)條件，可以觀察關(guān)于使用不同代謝物的改進。表3S86N16細胞的倍增時間和平均分裂時間對于10％的條件取傳代p204和p179之間的樣本，對于7.5％的取p198至p176之間的，對于3.75％的取p224至p201之間的，對于2％的取p216和p199之間的。5.2-對無血清培養(yǎng)基的適應(yīng)&在生物反應(yīng)器中生長通過S86N45(EB45)和EB14細胞對無血清培養(yǎng)基的適應(yīng)獲得了主要的進一步提高。測試了幾種配方并鑒定了使S86N45(EB45)和EB14細胞有效生長的一對無血清培養(yǎng)基配方(圖5)。此外，可以進一步擴大EB14細胞在含有血清的和無血清培養(yǎng)基中的培養(yǎng)，因為在2L生物反應(yīng)器中重復(fù)證明了有效生長(圖6)。此外，EB14細胞還可以在3L攪拌罐生物反應(yīng)器中有效生長并達到超過2百萬細胞/ml的密度。實施例6滋養(yǎng)層細胞的清除為了獲得如上所述的胚胎干細胞，在初始培養(yǎng)條件下，滅活細胞層是必需的。在多次傳代后，不再有該滋養(yǎng)層是必需的。只有“培養(yǎng)處理的”塑料是重要的。實際上，一些真核干細胞的特征之一是以附著形式增殖。為了有助于細胞的附著，所用的各種塑料材料是“培養(yǎng)”處理的。在其制造過程中它們經(jīng)受了處理，在塑料表面添加了電荷，該電荷促進了細胞胞外基質(zhì)的附著。相反，細胞培養(yǎng)未處理的塑料，通常稱為細菌學(xué)性質(zhì)的塑料，沒有通過添加特定滋養(yǎng)層來處理表面。細胞附著于此是非常困難的，甚至不可能，或然后誘導(dǎo)形態(tài)學(xué)改變，和通常劇烈的行為。根據(jù)其中進行的接種兩種塑料性質(zhì)之間的區(qū)別使其可以獲得具有不同行為的細胞。滅活“滋養(yǎng)層”的逐漸清除使其可以在一些傳代后獲得直接接種于“培養(yǎng)處理的”塑料上的干細胞同源培養(yǎng)物。S86N16細胞維持于存在和不存在滅活“滋養(yǎng)層”的細胞的比較生長曲線列于圖7中。細胞的這種適應(yīng)是漸進性的，以致沒有失去初始維持于“滋養(yǎng)層”上細胞的干細胞特征。因此完成漸進性清除。獲得在塑料上增殖的細胞是清除方法的完成。表4中，分裂時間顯示細胞對其環(huán)境的敏感性。如在血清漸進性清除的情況中，在限定條件下的一些傳代后獲得適應(yīng)，伴隨對細胞的恢復(fù)效果。表4對于1.2×106、0.5×106和0.3×106滋養(yǎng)細胞的3個條件，取傳代p154和p131之間的樣本，對于單獨在塑料上的條件，取p161和p139之間的樣本。實施例7細胞生長因子的清除在初始培養(yǎng)條件下，生長因子的存在是必需的?？梢允疽獾貐^(qū)分兩類因子細胞因子和營養(yǎng)因子。細胞因子主要是通過與gp130蛋白相關(guān)的受體作用的細胞因子。因此，LIF、白細胞介素11、白細胞介素6、CNTF、制瘤素和促心激素具有相似的作用模式，在特定鏈?zhǔn)荏w的水平募集，后者與單體或有時雜二聚形式中的gp130蛋白結(jié)合。一些情況中，可溶形式受體的組合，所述形式中特別是白細胞介素6和CNTF的受體，可以提高所觀察到的增殖效果。之前已經(jīng)顯示加入這些細胞因子中的至少一種對于獲得胚胎干細胞是必需的。營養(yǎng)因子主要是SCF、IGF-1和bFGF，如上所述，其也用于培養(yǎng)的開始。它們的存在對于獲得和擴增細胞也是必需的。通過漸進性減少這些生長因子，一些傳代后在沒有添加外源生長因子而可以獲得使胚胎或體干細胞增殖的培養(yǎng)條件。用于表征這些細胞的不同標(biāo)記通常對于沒有因子維持的細胞是陽性的。實施例8所用培養(yǎng)基的比較接種于不同培養(yǎng)基，沒有獲得相同頻率的細胞。培養(yǎng)基組成的比較使一種成分的鑒定尤其困難。更可能的是整個組合物使得細胞的生理學(xué)得到提高。優(yōu)選培養(yǎng)基中，注意到HamF12培養(yǎng)基、MacCoy培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、DMEM-F12培養(yǎng)基和富含生物素的DMEM培養(yǎng)基。用這樣的分離物開始，在這些不同的培養(yǎng)基中進行適應(yīng)試驗。實施例9非附著細胞的建立在干細胞連續(xù)傳代的過程中，直接接種于細菌學(xué)培養(yǎng)皿的高密度接種可以在一些傳代后獲得胚胎細胞，其從其基質(zhì)上脫離并以小的規(guī)則聚合體的形式懸浮增殖。在幾次傳代中通過更多稀釋，機械分離且沒有使用蛋白水解酶來促進該增殖。通常進行培養(yǎng)物的攪拌，但并不表示是獲得非附著細胞的特征因素。和附著細胞一樣，這些細胞具有干細胞的特征性形態(tài)，即，大小小，大的核-細胞質(zhì)比例，具有至少一個清楚可見核仁的核和小的細胞質(zhì)。這些細胞通過或多或少緊密的小聚合體生長來表征(圖8)。這些非附著細胞呈現(xiàn)與多種抗體的交叉反應(yīng)性，如上Pain等(1996)中所述的。這些細胞對于內(nèi)源端粒酶活性也是陽性的(如實施例10中所列的，對于EB1、EB4和EB5細胞)。非附著階段中，細胞在不同培養(yǎng)基中呈現(xiàn)高度增殖。初始接種密度和新鮮培養(yǎng)基非常規(guī)律的供給提供了高密度，約高于1×106細胞每ml。表5總結(jié)了一些分離物的主要特征(親本細胞、形成懸浮的初始傳代、懸浮培養(yǎng)維持的天數(shù)、維持自動停止之前獲得的傳代數(shù)和世代)。因此可以注意到一種分離物與另一種分離物之間形成懸浮的傳代(參見分離物EB1和EB14)以及增殖速率(參見分離物EB3和EB14)可以不同。表5注意到術(shù)語“開始”對應(yīng)于非附著下放置的細胞。我們還發(fā)現(xiàn)數(shù)次傳代后在任何時刻可以從用或不用滋養(yǎng)層增殖的附著干細胞獲得非附著細胞。實施例10所建立細胞的表征用如上所述(Pain等，1996)的相同標(biāo)準(zhǔn)來表征維持長培養(yǎng)時間的干細胞。因此可以有規(guī)律地檢測內(nèi)源堿性磷酸酶活性，通過圖9a-9b的照片來說明，內(nèi)源端粒酶活性(圖9c)以及與特定抗體如抗體SSEA-1(TEC-01)和EMA-1的反應(yīng)性。細胞系建立過程中重要標(biāo)準(zhǔn)之一是端粒酶的存在。在細胞維持培養(yǎng)的過程中，使用TRAP檢測試劑盒(端粒酶PCR酶聯(lián)免疫吸附測定，Roche)來進行各種測試，經(jīng)過不同的培養(yǎng)傳代后，細胞檢測為陽性。因此，對于S86N16細胞、S86N45(EB45)細胞，以及對于源自其的非附著形式的EB1、EB4和EB5細胞，端粒酶活性是可檢測的(參見表6)。認(rèn)為維持于原代培養(yǎng)中的CEFs(雞胚胎成纖維細胞)是陰性的。OD＜0.2的閾值是試劑盒推薦的作為陰性極限的閾值。所有分析都以相等的2000個細胞來進行。表6不同傳代中各種細胞端粒酶活性的測定*CEF雞胚胎成纖維細胞特別重要，本發(fā)明的細胞保存一些實質(zhì)性的“干細胞”特征。它們表達已知在小鼠、雞和人胚胎干細胞中存在的一系列干細胞特異性標(biāo)記(例如，堿性磷酸酶、SSEA-1、EMA-1、端粒酶)(圖9)。如所期望的，在加入視黃酸(RA)或DMSO誘導(dǎo)細胞分化的實驗中失去這些標(biāo)記的表達(表7和圖9c)。它們在體外無限復(fù)制(圖1)；數(shù)個候選細胞系培養(yǎng)已經(jīng)超過一年而沒有特定障礙，如分化。表7ES細胞特異性標(biāo)記“在用視黃酸分化時，標(biāo)記表達減少”以標(biāo)記細胞的百分比來表示標(biāo)記SSEA1和EMA1。實施例11細胞的轉(zhuǎn)染和誘導(dǎo)用各種表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染維持長時間生長的干細胞。已經(jīng)顯示鳥干細胞是可以轉(zhuǎn)染的(Pain等，1996)。尤其是，非附著細胞得到轉(zhuǎn)染，各種分選系統(tǒng)使其可以鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞(細胞分選、極限稀釋等等)。可以在干細胞未分化階段進行這些遺傳修飾。一旦獲得該修飾，然后誘導(dǎo)細胞自然分化或通過加入分化誘導(dǎo)劑。這種情況下，可以使用濃度10-8M至10-6M的視黃酸，或終濃度1至2％的二甲亞砜或濃度為10-4至10-8M的丁酸鈉，或終濃度1至5μg/ml的佛波醇酯(TPA、PMA等等)或脂多糖(LPS)。另一實施例中，在懸浮液中細胞可以形成胚狀體，在組成它們的細胞分離或非分離后，可以使該胚狀體粘著塑料。然后這些分化的細胞增殖，但對于長時間增殖具有更有限的能力。通過針對影響細胞增殖的基因的遺傳修飾，可以使這些分化的細胞能夠長時間增殖。實施例12用病毒感染非附著鳥細胞系(EB1)的實驗方案細胞的擴增以0.2×106細胞/ml的濃度將EB1或EB4細胞接種于培養(yǎng)基中，優(yōu)選MacCyo’s5A、HAMF12或DMEM培養(yǎng)基，或任何所關(guān)心的培養(yǎng)基，含有5％血清，通常50ml的初始體積。在39℃和7.5％CO2的條件下維持培養(yǎng)，伴隨攪拌。為了達到100至250ml終培養(yǎng)體積的1至3×106細胞/ml的細胞濃度，每天加入新鮮培養(yǎng)基3至4天，使其擴增持續(xù)。收集懸浮細胞并在約1000rpm離心10分鐘。將沉淀重懸浮于20至50ml的1×PBS(磷酸鹽緩沖鹽)中。然后將細胞計數(shù)、離心并將沉淀的細胞以3至5×106細胞/ml的終濃度放入無血清培養(yǎng)基中。然后在這些條件下制得幾個管子，每管含有3至5×106細胞。病毒的制備和感染將具有已知滴定度的病毒儲備在37℃快速解凍并以10×至1000×最終感染所需濃度的滴定度稀釋于無血清培養(yǎng)基中。根據(jù)病毒的類型用所關(guān)心病毒以0.01至0.5的m.o.i.(感染復(fù)數(shù))感染細胞，其包括將0.1至10％體積/體積的病毒懸浮液加入細胞沉淀中。在通常為33℃至37℃的病毒最佳溫度孵育1小時后，將細胞再次離心并小心除去培養(yǎng)基。為了限制初始病毒對隨后過程的影響，發(fā)現(xiàn)該步驟通常是必需的。一種可能性是用含有血清的培養(yǎng)基(5％血清)直接稀釋細胞至終濃度0.2至1×106細胞/ml而沒有再次離心，并再次孵育。上清液和細胞的收集孵育2至4天后，根據(jù)特定病毒的病毒動力學(xué)和潛在的致細胞病變作用，收集含有細胞或細胞碎片的培養(yǎng)基。根據(jù)病毒，只有沉淀或上清液是所關(guān)心的并含有病毒顆粒。收集細胞并離心。將收集的上清液在2500rpm再次離心5至10分鐘，并在顆粒純化之前保存于-80℃。為了進行滴定，收集等份試樣。將細胞沉淀放入5ml無血清培養(yǎng)基中，超聲處理并在2500rpm離心5至10分鐘。將獲得的上清液保存于-80℃直至等份試樣的純化和滴定。比較各種所進行條件之間的病毒感染和生產(chǎn)效率。對于具有致細胞病變作用的病毒，通常通過溶菌斑技術(shù)來進行滴定。實施例13用病毒感染附著鳥細胞系(S86N45)的實驗方案細胞的擴增在感染48小時之前將細胞以0.03至0.06×106細胞/cm2的濃度接種于T150瓶中的培養(yǎng)基中，優(yōu)選，MacCyo’s5A、HAMF12或DMEM培養(yǎng)基，或任何其他所關(guān)心的培養(yǎng)基，含有5％血清。將它們維持于39℃和7.5％CO2。感染將具有已知滴定度的病毒儲備在37℃快速解凍并以10×至1000×最終感染所需濃度的滴定度稀釋于無血清培養(yǎng)基中。根據(jù)病毒的類型，用所關(guān)心的病毒以0.01至0.5的m.o.i.(感染復(fù)數(shù))感染細胞，其包括將0.1至10％體積/體積的病毒懸浮液加入細胞單層中。感染通常在含有0％血清的最小培養(yǎng)基(對于75cm2瓶5至10ml)中進行。在通常為33至37℃的病毒最佳溫度孵育1小時后，將20ml5％培養(yǎng)基加入瓶中。特定情況中，用PBS洗滌細胞，以便除去可能粘著在細胞上的顆粒。在致細胞病變病毒的情況中，為了監(jiān)控表明感染良好進程的細胞裂解的出現(xiàn)，感染后每天觀察細胞。上清液和細胞的收集孵育2至4天后，根據(jù)特定病毒的病毒動力學(xué)和潛在的致細胞病變作用，收集含有上清細胞或細胞碎片的培養(yǎng)基。根據(jù)病毒，只有沉淀或上清液是所關(guān)心的并含有病毒顆粒。收集細胞并離心。將收集的上清液在2500rpm再次離心5至10分鐘，并在顆粒純化之前保存于-80℃。為了進行滴定，收集等份試樣。將細胞沉淀放入5ml無血清培養(yǎng)基中，超聲處理并在2500rpm離心5至10分鐘。將獲得的上清液保存于-80℃直至純化等份試樣的和滴定。比較各種所進行條件之間的病毒感染和生產(chǎn)效率。對于具有致細胞病變作用的病毒，通常通過溶菌斑技術(shù)來進行滴定。實施例14修飾牛痘病毒安卡拉(MVA)在EB45細胞系和EB14細胞系的附著和非附著鳥干細胞上的復(fù)制在EB45(S86N45)和EB14細胞上進行一系列實驗來測定它們各自對MVA感染的敏感性、MVA增殖的動力學(xué)和病毒產(chǎn)量。用于這些研究中的MVA是表達受體GFP蛋白(MVA-GFP)的重組MVA載體或非重組MVA病毒。在所有實驗中包括新鮮制得的雞胚胎成纖維細胞(CEF)作為對照細胞。14.1-安全性考慮在冰凍條件下接受MVA病毒(滴定度為0.5ml指管中2.5×107TCID50/ml)。出于安全性原因，在控制條件下(-80℃冰箱中)保存MVA病毒和感染的細胞，將污染的塑料材料放入次氯酸溶液中超過1小時，然后放入袋子中用于全部和完全的高壓鍋滅活。14.2-病毒生產(chǎn)14.2.1-附著S86N45(EB45)細胞在感染前一天將1×106附著細胞接種于100mm培養(yǎng)皿中，20mL培養(yǎng)基。24小時后，丟棄培養(yǎng)基，在37℃用接種物與細胞孵育(2mL無血清培養(yǎng)基，0.01或0.1TCID/細胞的感染復(fù)數(shù))。1小時后，丟棄接種物，將20mL預(yù)先溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基加入細胞中，在37℃5％CO2中保持孵育。為了病毒制備，用刮刀收集感染的細胞，轉(zhuǎn)移進50mLFalconTM管中并在室溫1200RPM下旋轉(zhuǎn)。收集上清液(胞外病毒，EV)，并將細胞沉淀物(胞內(nèi)病毒，IV)稀釋于1或2mL培養(yǎng)基中。將EV和IV兩個樣品接受三次融-凍循環(huán)，然后將它們超聲處理。在室溫2500rpm離心10分鐘后，將EV和IV樣品等分并保存于-80℃直至滴定。14.2.2-懸浮EB14細胞在加入以培養(yǎng)基中0.01或0.1TCID/細胞的moi病毒接種物前一天，將0.4×106/mLEB14細胞接種于125mL旋轉(zhuǎn)瓶中的40mL培養(yǎng)基中(16×106細胞)，。病毒孵育一小時后，加入80mL預(yù)熱的培養(yǎng)基。在期望的旋轉(zhuǎn)條件下在37℃和5％CO2保持孵育。然后在感染后各個時間收集感染細胞，轉(zhuǎn)入50mLFalconTM管中并在室溫1200RPM下旋轉(zhuǎn)。收集上清液(胞外病毒，EV)，并將細胞沉淀物(胞內(nèi)病毒，IV)稀釋于5或10mL培養(yǎng)基中。將EV和IV兩個樣品接受三次融-凍循環(huán)，然后將它們超聲處理。在室溫2500rpm離心10分鐘后，將EV和IV樣品等分并保存于-80℃直至滴定。14.3-病毒滴定14.3.1-通過TCID50終點稀釋方法滴定MVA通過TCID50終點稀釋方法在CEF或DF-1細胞上進行MVA病毒的滴定。試驗測定了樣品含有足夠劑量的傳染病毒來產(chǎn)生感染。TCID50測定為細胞培養(yǎng)物累積數(shù)的一半產(chǎn)生了致細胞病變作用(CPE)。一個病毒樣品滴定需要一個平底P96。簡短地，每孔接種15000CEF細胞/100μL。接種十一孔的八排。八排表示病毒樣品的高度系列10倍的稀釋度(即，10-2至10-9)。對于每個系列稀釋度，在無血清培養(yǎng)基中形成1mL混合物，將100μL混合物分配于10個相應(yīng)的稀釋孔中，第十一排是對照的非感染孔。將P96板在37℃，5％CO2孵育。5至10天后，通過Reed-Muench方法通過記錄陽性CPE孔來計算病毒滴定度。14.4-對MVA感染的易感性和滴定度的結(jié)果14.4.1-首先使用重組MVA-GFP載體研究了EB45(S86N45)和EB14細胞對MVA感染的固有易感性。選擇該特異性載體用于這些研究來簡化感染細胞的監(jiān)控和定量。因此用不同感染復(fù)數(shù)(moi)處理EBx和CEF細胞，且在感染后數(shù)天通過熒光顯微鏡和熒光計數(shù)法(fluorocytometry)來分析細胞。如圖10和11所示，所有在感染后48小時仍然是活著的附著EB45細胞強烈表達了受體GFP蛋白，甚至當(dāng)使用低至0.1TCID50/細胞的moi時。重要的，圖10還說明了當(dāng)和CEF細胞相比較時，EB45和EB14細胞更小的大小。總而言之，這些結(jié)果清楚地證明了附著EB45和EB14細胞對MVA感染的高度敏感性。14.4.2-以下的表8列出了所進行的各種MVA-GFP感染實驗中獲得的結(jié)果。所有樣品均滴定2次。表8滴定度的結(jié)果14.3-EB14和EB45細胞上的MVA增殖通過MVA-GFP復(fù)制的動力學(xué)定量分析來測定懸浮EB14和附著EB45細胞上的MVA增殖。EB45細胞在培養(yǎng)皿中的DMEM-F12培養(yǎng)基中生長，并用0.1的moi感染，而EB14細胞在用0.2的moi感染之前，在120ml旋轉(zhuǎn)瓶中的DMEM-F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。然后在感染后的各個時間通過FACS分析定量感染細胞的百分比。如圖12和13中所示的，在感染后48小時(EB45)或72小時(EB14)，所有仍然存活的細胞表達GFP。14.4-生長于含有血清培養(yǎng)基中的附著EB45細胞上的病毒產(chǎn)量14.4.1-使用生長于DMEM-F12中的細胞來分析附著EB45細胞的病毒生產(chǎn)力。發(fā)現(xiàn)MVA在DMEM-F12中的EB45中非常有效地復(fù)制來獲得高于對照CEF細胞所獲得的產(chǎn)量(圖14)。14.4.2-更多系列的實驗中，非重組MVA病毒(來自ATCC)用于CEF細胞和EB45細胞上的比較復(fù)制證實之前使用MVA-GFP載體的結(jié)果，用該MVA病毒再次獲得較高的產(chǎn)量(圖15)。總而言之，這些結(jié)果證明附著EB45細胞對MVA感染的高度敏感性和有效的病毒生產(chǎn)，其高于雞胚胎成纖維細胞。此外，所有這些實驗在標(biāo)準(zhǔn)條件下進行。因此有理由表明在最佳化的實驗條件下可以獲得更高的病毒產(chǎn)量，尤其是通過使用最佳細胞培養(yǎng)基。14.5-含有血清培養(yǎng)基中懸浮EB14細胞上的病毒產(chǎn)量使用生長于DMEM-F12培養(yǎng)基中的細胞測定了旋轉(zhuǎn)瓶中EB14細胞的病毒生產(chǎn)力。使用0.1感染復(fù)數(shù)的第一系列實驗結(jié)果顯示于圖16中。這些數(shù)據(jù)支持之前用附著細胞獲得的結(jié)果并證實了懸浮EB14細胞有效生產(chǎn)重組MVA病毒的能力，產(chǎn)量接近于100TCID50/細胞，高于雞胚胎成纖維細胞所獲得的兩倍。14.6-生長于無血清培養(yǎng)基的懸浮EB14細胞上的病毒產(chǎn)量理想地，在生物反應(yīng)器中的無血清培養(yǎng)基中的懸浮細胞上進行病毒疫苗生產(chǎn)。為了研究MVA在無血清培養(yǎng)基中的生產(chǎn)，開始了一系列實驗，其中EB14懸浮細胞已經(jīng)用旋轉(zhuǎn)瓶中無血清培養(yǎng)基中兩種不同感染復(fù)數(shù)(0.01&0.1)的MVA-GFP載體感染。細胞的FACS分析證實了EB14細胞在兩種實驗條件下的有效感染(圖17)。此外，并如所期望的，這些實驗顯示了當(dāng)使用0.1的moi時感染更快，而0.01的moi的細胞存活更長并能夠在較長的時間段生產(chǎn)病毒后代(數(shù)據(jù)未顯示)。病毒產(chǎn)量的分析證實了通過無血清和無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中懸浮生長的懸浮EB14細胞獲得了有效的MVA生產(chǎn)(圖18)。高于罕有的用CEF細胞獲得的病毒產(chǎn)量是常規(guī)獲得的。此外，感染顆粒分布的分析表明大多數(shù)病毒粒子保留于細胞中，僅有部分分泌于上清液中(圖18)。EB14和S86N45細胞很好地表征為在無血清培養(yǎng)基中可以懸浮或作為附著細胞有效生長的非遺傳修飾鳥胚胎干細胞。發(fā)明者證明細胞對感染是高度敏感的以及重組和非重組修飾牛痘病毒安卡拉的增殖，且結(jié)果表明病毒生產(chǎn)至少高于對照CEF細胞兩到三倍?？偠灾?，這些特征構(gòu)成了本發(fā)明的細胞，主要是EB14和EB45，為替代現(xiàn)有的用于基于MVA載體的生產(chǎn)基于蛋的或基于CEF的生產(chǎn)系統(tǒng)的非常有前景的細胞。參考文獻BabaTW，HumphriesEIL(1985).轉(zhuǎn)化濾泡的形成對于鳥造白細胞組織增生病毒誘導(dǎo)的淋巴瘤是必要的但不是充分的(Formationofatransformedfollicleisnecessarybutnotsufficientfordevelopmentofanavianleukosisvirus-inducedlymphoma.)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82213-216.BeugH，vonKirchbachA，DoderleinG，ConscienceJF，GrafT.(1979).通過七株缺陷鳥白血病病毒轉(zhuǎn)化的雞造血細胞顯示出三種截然不同的分化表型(Chickenhematopoieticcellstransformedbysevenstrainsofdefectiveavianleukemiavirusesdisplaythreedistinctphenotypesofdifferentiation.)Cell18375-390.GuilhotC，BenchaibiM，F(xiàn)lechonJE，SamarutJ.(1993).12S腺病毒E1A蛋白使鳥細胞永生化并與鳥RB產(chǎn)物相互作用(The12SadenoviralE1AproteinimmortalizesaviancellsandinteractswiththeavianRBproduct.)Oncogene8619-624KawaguchiT，NomuraK，HirayamaY，KitagawaT.(1987).雞干細胞癌細胞系LMH的建立和表征(Establishmentandcharacterizationofachickenhepatocellularcarcinomacellline，LMH.)CancerRes1987474460-4464.KimH，YouS，F(xiàn)arrisJ.FosterLK，F(xiàn)osterDN.(2001).p53在永生化雞胚胎成纖維細胞中的轉(zhuǎn)錄后滅活(Post-transcriptionalinactivationofp53inimmortalizedchickenembryofibroblastcells.)Oncogene203306-3310.KimH，YouS，KimIJ，F(xiàn)osterLK，F(xiàn)arrisJ，AmbadyS，PoncedeLeonFA，F(xiàn)osterDN.(2001).常見永生化雞胚胎成纖維細胞的p53和E2F-1功能的改變(Alterationsinp53andE2F-1functioncommontoimmortalizedchickenembryofibroblasts.)Oncogene202671-2682.LiuJL，KleinPA，MoscoviciMG，MoscoviciC.(1992).識別正常和逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化的雞造血細胞的單克隆抗體(Monoclonalantibodiesrecognizingnormalandretrovirus-transformedchickenhematopoieticcells.)Virology189583-591.MoscoviciC，MoscoviciMG，JimenezH，LaiMM，HaymanMJ，VogtPK.(1977).源自日本鵪鶉化學(xué)誘導(dǎo)腫瘤的連續(xù)組織培養(yǎng)細胞系(ContinuoustissueculturecelllinesderivedfromchemicallyinducedtumorsofJapanesequail.)Cell1195-103.MossB.(1994)用于疫苗發(fā)展的復(fù)制和宿主限制非復(fù)制疫苗病毒載體(Replicatingandhost-restrictednon-replicatingvacciniavirusvectorsforvaccinedevelopment.)DevBiolStand.8255-63.PainB.，ClarkM.E.，ShenM.，NakazawaH.，SakuraiM.，SamarutJ.，EtchesRJ.(1996).具有多形態(tài)發(fā)生潛能的鳥胚胎干細胞的長期體外培養(yǎng)和表征(Long-terminvitrocultureandcharacterisationofavianembryonicstemcellswithmultiplemorphogeneticpotentialities.)Development1222339-2348.PainB.，ChenevierP.，SamarutJ.(1999).雞胚胎干細胞和轉(zhuǎn)基因策略(Chickenembryonicstemcellsandtransgenicstrategies.)CellsTissuesOrgans165212-219.SamarutJ，GazzoloL.(1982).鳥成紅細胞增多癥病毒感染的靶細胞分化并變成轉(zhuǎn)化的(Targetcellsinfectedbyavianerythroblastosisvirusdifferentiateandbecometransformed.)Cell28921-929.SmithJRandPereira-SmithOM(1996).復(fù)制衰退暗示體內(nèi)老化和腫瘤抑制(Replicativesenescenceimplicationsforinvivoagingandtumorsuppression.)Science273，63-67.權(quán)利要求1.復(fù)制痘病毒和重組衍生物如天然或重組牛痘病毒的方法，包括步驟將病毒顆粒接種鳥源自胚胎的干細胞，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞直至發(fā)生細胞裂解，新產(chǎn)生的病毒顆粒釋放于所述培養(yǎng)基中。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用0.01至0.5的m.o.i.(感染復(fù)數(shù))來進行接種。3.根據(jù)權(quán)利要求1至2之一的方法，其中所述牛痘病毒是修飾的牛痘病毒如修飾的牛痘病毒安卡拉(MVA)或重組牛痘病毒。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3之一的方法，用于生產(chǎn)抗天花的疫苗。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一的方法，其中所述的鳥源自胚胎的干細胞系是通過由以下步驟組成的方法可獲得的a)在含有所有使其生長的因子和滅活滋養(yǎng)層的培養(yǎng)基中培養(yǎng)鳥胚胎細胞，b)通過改變培養(yǎng)基傳代，以致獲得所述因子、血清和/或滋養(yǎng)層漸進性的或全部的清除，c)建立能夠在不存在外源生長因子、血清和/或滅活滋養(yǎng)層的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中增殖的附著或非附著細胞系。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中步驟c)中獲得的所述鳥干細胞能夠增殖至少600天。7.根據(jù)權(quán)利要求5至6之一的方法，其中所述鳥干細胞是鳥胚胎干細胞或鳥體干細胞。8.根據(jù)權(quán)利要求5至7之一的方法，其中步驟b)包括培養(yǎng)基成分(生長因子單獨或血清單獨或生長因子然后血清或血清然后生長因子)的清除。9.根據(jù)權(quán)利要求5至7之一的方法，其中步驟b)包括滋養(yǎng)層漸進性的或全部的清除，然后任選的培養(yǎng)基其它成分(生長因子和血清)的清除。10.根據(jù)權(quán)利要求5至9之一的方法，其中所述鳥細胞系是在無外源生長因子的培養(yǎng)基中懸浮增殖的非附著干細胞。11.根據(jù)權(quán)利要求5至9之一的方法，其中所述鳥細胞系是在無血清培養(yǎng)基(無血清培養(yǎng)基)中懸浮增殖的非附著干細胞。12.根據(jù)權(quán)利要求1至9之一的方法，其中所述鳥細胞系是在無外源生長因子和血清的培養(yǎng)基中懸浮增殖的非附著干細胞。13.根據(jù)權(quán)利要求1至12之一的方法，其中所述鳥細胞系具有至少一個以下的特征-高的核-細胞質(zhì)比例，-內(nèi)源堿性磷酸酶活性，-內(nèi)源端粒酶活性，-與選自SSEA-1(TEC01)、SSEA-3和EMA-1抗體的特異性抗體的反應(yīng)性。14.根據(jù)權(quán)利要求1至13之一的方法，其中所述鳥細胞系在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，尤其在補充有添加劑如非必需氨基酸、維生素和丙酮酸鈉的DMEM、GMEM、HamF12或McCoy的培養(yǎng)基。15.生產(chǎn)活的或減毒的疫苗如抗天花疫苗的方法，包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求5至14之一限定方法步驟c)中建立的附著或非附著細胞系，將病毒顆粒接種所述細胞并在如上所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞直至發(fā)生細胞裂解，新產(chǎn)生的病毒顆粒釋放于所述培養(yǎng)基中。16.如權(quán)利要求10至12之一限定的非附著細胞的用途，用于生產(chǎn)活的或減毒的屬于正痘病毒科的疫苗，尤其是牛痘病毒，修飾的牛痘病毒如修飾的牛痘病毒安卡拉(MVA)和重組牛痘病毒。17.根據(jù)權(quán)利要求16的用途，用于生產(chǎn)抗天花的疫苗。18.根據(jù)權(quán)利要求16的用途，用于生產(chǎn)抗癌癥的疫苗。全文摘要本發(fā)明涉及復(fù)制痘病毒如牛痘病毒的方法，包括步驟將病毒顆粒接種鳥胚胎干細胞，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞直至發(fā)生細胞裂解，新產(chǎn)生的病毒顆粒釋放于所述培養(yǎng)基中。文檔編號C12N15/863GK1826406SQ200480021167公開日2006年8月30日申請日期2004年7月22日優(yōu)先權(quán)日2003年7月22日發(fā)明者F·格埃納克斯,B·潘申請人:維渦里斯公司