專(zhuān)利名稱(chēng)：改良的atp擴(kuò)增方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ATP的擴(kuò)增方法及應(yīng)用該方法的迅速檢測(cè)微生物存在的方法，以及用于檢測(cè)的試劑盒。
背景技術(shù)：
迅速且高靈敏度地檢測(cè)微生物的方法，例如，預(yù)防食物中毒而在食品制造場(chǎng)中檢測(cè)微生物等環(huán)境微生物的控制、食品(例如，牛奶等乳制品)中微生物混入的檢測(cè)等，在食品業(yè)界、酪農(nóng)業(yè)界等中非常重要。以往，應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基檢測(cè)活細(xì)胞的方法，要幾天才能計(jì)數(shù)生存的微生物。
該微生物的檢測(cè)，是利用所有生物中存在的ATP的方法進(jìn)行檢測(cè)。作為ATP的檢測(cè)方法，已知有應(yīng)用蟲(chóng)熒光素酶的生物發(fā)光測(cè)定方法。該方法是依據(jù)測(cè)定ATP而確立的方法(參照DeLuea，M.，W.D.McElroy.Kinetics of the firefly luciferase catalyzed reations.Biochemistry，26921-925(1974))，可作為迅速的衛(wèi)生學(xué)監(jiān)控(Bautista，D.A.等人，Adenosine triphosphate bioluminescence as a method todetermine microbial levels in scald and chill tanks at a poultry abattoir.Poult.Sci.731673-1678(1994))。此外，最近有提案將ATP測(cè)定方法作為反生物恐怖的技術(shù)手段(Spencer，R.C.and N.F.Ligntfoot.Preparedness and response to bioterrorism.J.Infect.，43，104-110(2001))。
但是，以往的ATP測(cè)定方法存在檢測(cè)界限(例如，約104大腸桿菌菌落形成單位(CFU)/測(cè)定)?？梢哉f(shuō)，這樣的靈敏度在工業(yè)或?qū)嶋H應(yīng)用中還不足夠。
通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬顯示，應(yīng)用腺苷酸激酶(ADK)和丙酮酸激酶(PVK)擴(kuò)增ATP時(shí)，可以不應(yīng)用高靈敏度的光度計(jì)即可檢測(cè)出非常低水平的ATP(Chittock，R.S.等人，Kinetic aspects of ATPamplification reactions.Anal.Biochem.225120-126(1998)。但是，實(shí)際上該方法并未實(shí)施。
人們?cè)O(shè)計(jì)了擴(kuò)增ATP的方法，用于測(cè)定微量的ATP(特開(kāi)2001-299390)。

圖1中說(shuō)明了特開(kāi)2001-299390號(hào)公報(bào)中所示的方法。圖1中，ADK是指腺苷酸激酶(adenylate kinase)，polyP是指多磷酸(polyphosphate)、PPK指多磷酸激酶(polyphosphate kinase)。以下，本說(shuō)明書(shū)中有時(shí)使用這些縮寫(xiě)。圖1a表示，在不存在ATP的條件下，理論上，AMP與多磷酸生不成ADP。圖1b表示，在存在ATP的條件下，ADK可催化磷酸基團(tuán)從ATP轉(zhuǎn)移到AMP的反應(yīng)，從而生成2分子ADP(第1反應(yīng))。第1反應(yīng)中產(chǎn)生的2分子ADP，在PPK的作用下，可接受來(lái)自多磷酸的磷酸基團(tuán)，生成2分子ATP(第2反應(yīng))。第2反應(yīng)中產(chǎn)生的2分子ATP可再次在第1反應(yīng)中使用，產(chǎn)生4分子ADP，這4分子ADP在PPK的作用下可轉(zhuǎn)換成4分子ATP。
如同特開(kāi)2001-299390號(hào)公報(bào)中這樣，在過(guò)剩的AMP和多磷酸存在下，通過(guò)調(diào)整ADK和PPK的平衡狀態(tài)，可分別轉(zhuǎn)向ADP生成方向(第1反應(yīng))和ATP生成方向(第2反應(yīng))。第1反應(yīng)與第2反應(yīng)作為1個(gè)反應(yīng)體系，反復(fù)進(jìn)行n次，1個(gè)ATP可擴(kuò)增到2n個(gè)。因此，該方法是很好的ATP擴(kuò)增方法。
特開(kāi)2001-299390號(hào)公報(bào)的方法，其靈敏度比以往的水平高，在能檢測(cè)出細(xì)胞的存在這一點(diǎn)上來(lái)講是很好的方法，但是，該方法是理論上講未出現(xiàn)的ATP非存在條件下的ATP擴(kuò)增，低水平時(shí)，偶爾可以檢測(cè)。欠缺可靠的僅檢測(cè)、擴(kuò)增外源性(從外部添加)ATP是其問(wèn)題所在。也就是說(shuō)，存在的問(wèn)題是，其靈敏度確實(shí)達(dá)不到在單個(gè)細(xì)胞水平擴(kuò)增、檢測(cè)ATP。此外，還存在調(diào)整ADK和PPK的活性等問(wèn)題。
發(fā)明的公開(kāi)因此，人們期望高效的外源性ATP的擴(kuò)增方法，特別是僅擴(kuò)增外源性ATP的方法，以及應(yīng)用該方法能檢測(cè)出1個(gè)細(xì)胞存在的高靈敏度的檢測(cè)方法。
本發(fā)明就是以解決上述課題為目標(biāo)進(jìn)行的。通過(guò)本發(fā)明的ATP擴(kuò)增方法，可檢測(cè)出極微量的ATP，還可檢測(cè)出1個(gè)細(xì)胞的存在。
本發(fā)明提供ATP的擴(kuò)增方法，它包括將多磷酸激酶與腺苷酸激酶的融合蛋白作用于含有ATP、AMP和多磷酸化合物的混合物的步驟。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述多磷酸激酶與腺苷酸激酶的融合蛋白是不包含ADP的融合蛋白。
另外，本發(fā)明提供ATP的檢測(cè)方法，包括將多磷酸激酶與腺苷酸激酶的融合蛋白作用于含有ATP、AMP和多磷酸化合物的混合物，擴(kuò)增ATP的步驟；以及檢測(cè)所擴(kuò)增的ATP的步驟。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述多磷酸激酶與腺苷酸激酶的融合蛋白是不包含ADP的融合蛋白。
此外，本發(fā)明提供一種迅速檢測(cè)微生物存在的方法，包括處理含有微生物的樣品，制備含有ATP的樣品的步驟；將該含有ATP的樣品添加到ATP擴(kuò)增體系，擴(kuò)增ATP的步驟；以及檢測(cè)所擴(kuò)增的ATP的步驟。該ATP擴(kuò)增體系包括AMP、多磷酸化合物及不包含ADP的多磷酸激酶與腺苷酸激酶的融合蛋白。
此外，本發(fā)明提供一種迅速檢測(cè)微生物存在的試劑盒，包括包含AMP、多磷酸化合物及不包含ADP的多磷酸激酶與腺苷酸激酶的融合蛋白在內(nèi)的ATP擴(kuò)增試劑，和檢測(cè)ATP的ATP檢測(cè)試劑。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒中還備有細(xì)胞溶解用試劑。
本發(fā)明還提供ATP的擴(kuò)增方法，它是將腺苷酸激酶以及不包含ADP的多磷酸激酶作用于含有ATP、AMP和多磷酸化合物的混合物。
此外，本發(fā)明提供多磷酸激酶與腺苷酸激酶的融合蛋白，以及不包含ADP的多磷酸激酶與腺苷酸激酶的融合蛋白。
附圖簡(jiǎn)述圖1是應(yīng)用ADK和PPK擴(kuò)增ATP的機(jī)制模式圖。
圖2表示應(yīng)用PPK-ADK及腺苷三磷酸雙磷酸酶處理的PPK-ADK進(jìn)行ATP擴(kuò)增的結(jié)果。
圖3表示對(duì)含有極微量ATP的樣品進(jìn)行ATP擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果。
圖4表示對(duì)含有規(guī)定細(xì)胞濃度的樣品進(jìn)行ATP擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果。
實(shí)施發(fā)明的最佳狀態(tài)(融合蛋白)本發(fā)明中應(yīng)用的多磷酸激酶與腺苷酸激酶的融合蛋白(以下，有時(shí)稱(chēng)作PPK-ADK)，只要其具有PPK活性及ADK活性，對(duì)其結(jié)合狀態(tài)無(wú)特殊限制。優(yōu)選N末端包含PPK，C末端包含ADK的融合蛋白。該融合蛋白，PPK與ADK既可直接結(jié)合，也可通過(guò)間隔片斷(spacer)結(jié)合。另外，融合蛋白的C末端可附加各種不影響酶表達(dá)的標(biāo)簽，對(duì)融合蛋白的純化有用。
編碼PPK的基因ppk及編碼ADK的基因adk，只要這些基因序列確定，對(duì)其來(lái)源無(wú)特殊限制。優(yōu)選應(yīng)用大腸桿菌的序列。
根據(jù)這些基因的序列設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊?，通過(guò)進(jìn)行PCR，可獲得各基因序列。
作為制備ppk基因的適當(dāng)引物，例如，優(yōu)選應(yīng)用以下引物的組合(1)具有用于在ppk基因5’末端的上游導(dǎo)入適當(dāng)?shù)南拗菩悦缸R(shí)別序列的序列的引物；及(2)具有間隔(例如，甘氨酸)序列，且在間隔部位或其下游導(dǎo)入適當(dāng)?shù)南拗菩悦缸R(shí)別序列的序列的引物。將這兩種引物作為一對(duì)進(jìn)行PCR，可很容易地獲得C末端含有間隔序列、表達(dá)PPK的ppk基因片段。
作為制備adk基因的適當(dāng)引物，與ppk基因同樣，優(yōu)選以下引物(1)具有用于在adk基因5’末端的上游導(dǎo)入適當(dāng)?shù)南拗菩悦缸R(shí)別序列的引物；及(2)具有C末端標(biāo)簽(例如，組氨酸)序列，且在C末端標(biāo)簽的下游導(dǎo)入適當(dāng)?shù)南拗菩悦缸R(shí)別序列的序列的引物。將這兩種引物作為一對(duì)進(jìn)行PCR，可很容易地獲得C末端含有標(biāo)簽序列、表達(dá)ADK的adk基因片段。
上述引物的限制性酶，考慮ppk或adk的基因序列、重組載體的克隆位點(diǎn)來(lái)確定。
以大腸桿菌的染色體DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR，分別用限制性酶酶切所得DNA片段，回收包含ppk基因的片段及包含adk基因的片段。將所得包含各基因的片段，按ppk-adk的順序，重組到適當(dāng)?shù)妮d體中，可獲得表達(dá)PPK-ADK融合蛋白的重組載體。
將所得載體導(dǎo)入到合適的宿主(例如，大腸桿菌)中，通過(guò)表達(dá)重組載體，可生產(chǎn)出PPK-ADK融合蛋白。對(duì)于設(shè)計(jì)有組氨酸(His標(biāo)簽)的融合蛋白，可應(yīng)用Hitrap螯合柱(Hitrap chelating column)很容易地純化、回收。
所得融合蛋白PPK-ADK可直接用于ATP擴(kuò)增反應(yīng)。但是，如后面所述，在僅測(cè)定外源性ATP時(shí)，有時(shí)不合適。考慮ADP以與PPK結(jié)合的狀態(tài)存在是其原因。在多磷酸化合物存在下，與PPK結(jié)合的ADP作為PPK底物，其中ADP通過(guò)PPK轉(zhuǎn)換成ATP。也就是說(shuō)，在圖1所示的反應(yīng)體系中，即便ATP非存在的條件下，首先在第2反應(yīng)中由ADP生成ATP，然后ATP被第1反應(yīng)使用，可自動(dòng)地開(kāi)始ATP擴(kuò)增反應(yīng)。因此，為了僅測(cè)定外源性ATP，有必要預(yù)先去除與PPK結(jié)合的ADP。
除去與PPK結(jié)合的不純物ADP，例如，可通過(guò)腺苷三磷酸雙磷酸酶處理進(jìn)行。腺苷三磷酸雙磷酸酶，可從ATP或ADP除去磷酸基團(tuán)，生成AMP。腺苷三磷酸雙磷酸酶處理優(yōu)選在適量的多磷酸存在的條件下進(jìn)行。通過(guò)多磷酸，可促進(jìn)與PPK-ADK結(jié)合的ADP游離，ADP很容易接受腺苷三磷酸雙磷酸酶的攻擊。經(jīng)腺苷三磷酸雙磷酸酶處理的PPK-ADK，可再次用Hitrap螯合柱回收。回收的PPK-ADK，即使經(jīng)腺苷三磷酸雙磷酸酶處理，也可維持其各自的活性(即，PPK活性和ADK活性)。
(應(yīng)用PPK-ADK的ATP的擴(kuò)增)本發(fā)明的應(yīng)用PPK-ADK的ATP的擴(kuò)增是通過(guò)將PPK-ADK作用于ATP、過(guò)剩的AMP及過(guò)剩的多磷酸化合物中進(jìn)行。也就是說(shuō)，通過(guò)向AMP、多磷酸化合物及PPK-ADK的混合物中添加ATP進(jìn)行，或者通過(guò)向ATP、AMP及多磷酸化合物的混合物中添加PPK-ADK進(jìn)行。反應(yīng)形式與圖1相同，重復(fù)進(jìn)行圖1中所示的第1反應(yīng)和第2反應(yīng)，使ATP得到擴(kuò)增。
ATP的擴(kuò)增在適當(dāng)?shù)木彌_液中、適當(dāng)?shù)臏囟?例如30～40℃)、適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(例如，5分～2小時(shí))進(jìn)行。認(rèn)為ATP微量存在時(shí)，優(yōu)選進(jìn)行1小時(shí)的擴(kuò)增反應(yīng)。
作為多磷酸化合物，可應(yīng)用多磷酸或其鹽。優(yōu)選應(yīng)用10～1000個(gè)磷酸，優(yōu)選應(yīng)用10～100個(gè)磷酸直鏈聚合的化合物。多磷酸既可來(lái)源于細(xì)菌，也可化學(xué)合成?；蛘撸瑧?yīng)用多磷酸合成酶從ATP合成。
(ATP的檢測(cè))擴(kuò)增出的ATP的檢測(cè)方法，可使用業(yè)內(nèi)人士常用的方法，無(wú)特殊限制。通常，通過(guò)熒光素酶與ATP的反應(yīng)來(lái)測(cè)定熒光發(fā)光量進(jìn)行。例如，應(yīng)用商品化的應(yīng)用熒光素酶的ATP測(cè)定試劑盒。
(迅速檢測(cè)微生物存在的方法)該方法著眼于所有生物的細(xì)胞中包含ATP，該方法是從含有微生物的樣品中制備含ATP的樣品，應(yīng)用上述ATP擴(kuò)增方法，擴(kuò)增、檢測(cè)ATP的方法。通過(guò)應(yīng)用去除了ADP的PPK-ADK，可僅測(cè)定外源性ATP。例如，由于能擴(kuò)增到可檢測(cè)1個(gè)細(xì)胞中所含ATP的水平，所以可檢測(cè)微生物的存在。以往的方法，每1次測(cè)定，檢測(cè)界限是104個(gè)集落形成單位(CFU)的大腸桿菌，考慮到這些，該方法至少提高到其10000倍。
微生物中也有ADP。應(yīng)用去除了ADP的PPK-ADK時(shí)，向本發(fā)明的擴(kuò)增體系中加入ADP，ADP即轉(zhuǎn)換成ATP，ATP的擴(kuò)增反應(yīng)就開(kāi)始了。因此，為了檢測(cè)微生物而進(jìn)行的前處理中，即便ATP分解成ADP也不影響本發(fā)明的靈敏度，從這一點(diǎn)上講，這是本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)。以下，微生物檢測(cè)中，當(dāng)言及測(cè)定的ATP樣品時(shí)指樣品中包含ADP。
對(duì)從含有微生物的樣品中制備含有ATP的樣品的方法無(wú)特殊限制。雖然可用溶解細(xì)胞的方法，但考慮到細(xì)胞中包含的PPK、ADK等酶的影響，可進(jìn)行加熱處理溶出ATP。最優(yōu)選應(yīng)用溶解細(xì)胞，使ATP溶出，然后進(jìn)行使其它酶失活的加熱處理方法。加熱處理，例如，100℃、進(jìn)行1～5分鐘。細(xì)胞溶解處理，例如，應(yīng)用商品化的ATP測(cè)定試劑盒中附加的溶解緩沖液進(jìn)行。
將進(jìn)行ATP溶解處理而得到的認(rèn)為含ATP的樣品加到AMP、多磷酸化合物及PPK-ADK的混合物中，進(jìn)行ATP擴(kuò)增反應(yīng)。應(yīng)用，例如應(yīng)用熒光素酶的ATP檢測(cè)方法檢測(cè)ATP的存在。若樣品中含有ATP則與熒光素酶進(jìn)行反應(yīng)，可觀察到熒光。由于ATP得到擴(kuò)增，所以沒(méi)必要要求高靈敏度的發(fā)光分析器。
本發(fā)明還提供用于迅速檢測(cè)微生物存在的試劑盒。也就是說(shuō)，本發(fā)明提供包括AMP、多磷酸及不包含ADP的PPK-ADK的ATP擴(kuò)增試劑，以及包括ATP檢測(cè)試劑的檢測(cè)ATP的試劑盒。該試劑盒中還包括溶解細(xì)胞用的試劑。溶解細(xì)胞用的試劑，根據(jù)作為溶解對(duì)象的細(xì)胞(例如，微生物，體細(xì)胞等)的不同而改變其組成成分。
將認(rèn)為含有微生物的樣品進(jìn)行加熱處理，添加到該試劑盒中的ATP擴(kuò)增試劑中，進(jìn)行適當(dāng)時(shí)間的擴(kuò)增反應(yīng)，然后用ATP檢測(cè)試劑確認(rèn)ATP的存在，由此迅速確認(rèn)微生物的存在。通過(guò)應(yīng)用進(jìn)行ADP處理而得到的PPK-ADK，該方法還可能僅檢測(cè)出外源性的ATP。作為ATP檢測(cè)試劑，一般指應(yīng)用熒光素酶熒光素反應(yīng)體系的試劑，術(shù)語(yǔ)“ATP檢測(cè)試劑”還包含生物發(fā)光(熒光)測(cè)定器。
(應(yīng)用ADK及不包含ADP的PPK的ATP擴(kuò)增)另外，本發(fā)明提供擴(kuò)增ATP的方法，它包括將ADK及不包含ADP的PPK作用于ATP、AMP及多磷酸的混合物。不包含ADP的PPK基因。例如可用與上述融合蛋白同樣的方法進(jìn)行制備。簡(jiǎn)而言之，應(yīng)用使ppk基因5’末端上游具有適當(dāng)限制性酶識(shí)別序列的引物，和具有His標(biāo)簽序列、且使其下游具有適當(dāng)限制性酶識(shí)別序列的引物，回收包含能表達(dá)具有His標(biāo)簽的PPK的ppk基因的DNA片段。將所得DNA導(dǎo)入適當(dāng)?shù)妮d體內(nèi)，得到重組載體，將其導(dǎo)入大腸桿菌中，表達(dá)PPK。用Hitrap螯合柱生成PPK，在多磷酸存在下對(duì)其進(jìn)行腺苷三磷酸雙磷酸酶處理，再度加到Hitrap螯合柱上，回收除去了ADP的PPK。通過(guò)圖1所示的反應(yīng)體系，該P(yáng)PK可提供給僅擴(kuò)增、檢測(cè)外源性ATP的方法。
實(shí)施例以下，列舉實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。
該實(shí)施例中，AMP及ATP分別購(gòu)自和光純藥(大阪)及Sigma。用0.2M KCl及1％EDTA(pH10)作為溶劑溶解AMP，用TSH膠SAX柱(TOSOH)再進(jìn)行純化。多磷酸用平均鏈長(zhǎng)65的多磷酸(Sigma)。生物發(fā)光測(cè)定試劑盒(CLSII)包含熒光素和熒光素酶，從Roche購(gòu)入。腺苷三磷酸雙磷酸酶購(gòu)自Sigma。
(實(shí)施例1PPK-ADK的制備)從大腸桿菌(E.coli)獲得的編碼多磷酸激酶的基因(ppk)(參照Akiyama，M等人.The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli.Isolation and sequence of the ppk gene and membrance location ofthe protein.J.Biol.Chem.26722566-22561(1992))的引物如下GGATCTAGATGAATAAAACGGAGTAAAAGT(序列號(hào)1)，及GGAGGATCCGCCGCCGCCGCCTTCAGGTTGTTCGAGTGATTT(序列號(hào)2)。
序列號(hào)1中的引物具有在ppk基因的5’末端導(dǎo)入限制性酶XbaI識(shí)別序列的序列。序列號(hào)2中4個(gè)甘氨酸是為了附著到PPK的C末端而設(shè)計(jì)的，且具有在3’末端導(dǎo)入限制性酶BamHI識(shí)別序列的序列。
獲得大腸桿菌編碼腺苷酸激酶基因的基因(adk))(Brune，M.等人，Cloning and sequencing of the adenylate kinase gene(adk)ofEscherichia coli.Nucleic Acids Res.13，7139-7151(1985))的引物如下GGAGGATCCATGCGTATCATTCTGCTTGGC(序列號(hào)3)，及GGAAAGCTTGCCGAGGATTTTTTCCAG(序列號(hào)4)。
序列號(hào)3的引物具有在adk基因的5’末端導(dǎo)入限制性酶BamHI識(shí)別序列的序列。序列號(hào)4的引物是為將C末端標(biāo)簽組氨酸附著到ADK的C末端而設(shè)計(jì)的，且具有在3’末端導(dǎo)入限制性酶HindIII識(shí)別序列的序列。
以大腸桿菌的染色體DNA為模板，應(yīng)用上述引物，按常規(guī)方法進(jìn)行PCR，分別獲得包含ppk基因和adk基因的DNA片段。將所得含ppk基因的DNA片段，導(dǎo)入pGEMT載體(Promega)中，獲得pGEMTppk。將所得含adk基因的DNA片段，導(dǎo)入pGEMT載體(Promega)中，獲得pGEMTadk。
用XbaI-BamHI處理pGEMTppk而得2.1kb的片段，用BamHI-HindIII處理pGEMTadk而得0.6kb的片段，將兩個(gè)片段與pET載體(Stratagene)的XbaI-HindIII消化物連接，構(gòu)建質(zhì)粒pETppkadk。該質(zhì)粒含有編碼PPK和ADK的融合蛋白的基因，PPK與ADK介4個(gè)甘氨酸結(jié)合，C末端具有His標(biāo)簽。
將質(zhì)粒pETppkadk導(dǎo)入大腸桿菌(E.coli BL21)，將所得轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)2小時(shí)，然后將1mM的IPTG添加到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)4小時(shí)后，離心收集轉(zhuǎn)化體，懸浮到含0.5M NaCl的20mM磷酸緩沖液(pH7)中。用B-PER溶液(Pierce)溶解細(xì)胞，然后在1mM PMSF存在下，用DNase和RNase處理。離心，獲得上清，用0.2μm濾膜過(guò)濾，然后加到Hitrap螯合柱(Amersham Bioscience)上。用0.1M多磷酸、20mM磷酸、0.5M NaCl、50mM咪唑及20％甘油(pH7.4)洗柱。用0.1M多磷酸、20mM磷酸、0.5M NaCl、0.5M咪唑及20％甘油(pH7.4)洗脫P(yáng)PK-ADK融合蛋白。
所得PPK-ADK融合蛋白具有ADK(43U/mg)和PPK(38U/mg)的活性，由AMP和多磷酸可生成ATP。1單位的PPK、37℃可由ADP和多磷酸合成1.0μmol/分的ATP。1單位的ADK、37℃可由ADP合成1.0μmol/分的ATP。
制備含0.16μg PPK-ADK、10μM AMP、400μM多磷酸、8mMMgCl2及60mM Tris-HCl(pH7.4)的混合液50μl，取5μl的反應(yīng)液，與40μl的ATP生物發(fā)光測(cè)定試劑(Roche)混合，立即，用多板熒光測(cè)定儀(ARVO Wallac)測(cè)定熒光強(qiáng)度。
如圖2PPK-ADK所示，在不含ATP的反應(yīng)體系中，ATP發(fā)生擴(kuò)增，可觀察到熒光。探討其原因時(shí)發(fā)現(xiàn)，ADP與PPK結(jié)合，在PPK的作用下，ADP發(fā)生最初圖1所示的第2反應(yīng)，生成ATP，提示有可能這樣ATP得到擴(kuò)增。
(實(shí)施例2除去與PPK-ADK結(jié)合的ADP)為了去除實(shí)施例1中獲得的與PPK-ADK結(jié)合的不純物ADP，在60mM Tris-HCl(pH8)、8mM MgCl2和10mM多磷酸存在下，180μg PPK-ADK與腺苷酸雙磷酸酶(apyrase)(200U)反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)終止后，再用Hitrap螯合柱，回收去除了ADP的PPK-ADK。以下，PPK-ADK是指用腺苷酸雙磷酸酶處理了的PPK-ADK。1單位的腺苷酸雙磷酸酶，可從ATP或ADP、30℃游離1μmol的磷酸。
制備含0.16μg經(jīng)腺苷酸雙磷酸酶處理了的PPK-ADK、10μMAMP、400μM多磷酸、8mM MgCl2及60mM Tris-HCl(pH7.4)的混合液50μl，取5μl的反應(yīng)液，與40μl的ATP生物發(fā)光測(cè)定試劑(Roche)混合，立即，用多板熒光測(cè)定儀(ARVO Wallac)測(cè)定熒光強(qiáng)度。
如圖2所示，用經(jīng)腺苷酸雙磷酸酶處理了的PPK-ADK進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)60分鐘后未觀察到熒光。雖然圖中未示出，向該反應(yīng)液中加入ATP時(shí)，可觀察到熒光。由此可以判斷腺苷酸雙磷酸酶處理，未影響PPK-ADK的ADK活性及PPK活性；以及經(jīng)腺苷酸雙磷酸酶處理去除不純物ADP的結(jié)果是看不到內(nèi)源性ATP增加。因此，認(rèn)為通過(guò)添加ATP而觀察到的熒光是純粹的外源性ATP。因此，經(jīng)腺苷酸雙磷酸酶處理了的PPK-ADK(不含ADP)對(duì)外源性ATP的測(cè)定極其有用。
進(jìn)行腺苷酸雙磷酸酶處理時(shí)，PPK-ADK吸附到Hitrap螯合柱及從同一柱子進(jìn)行洗脫時(shí)，優(yōu)選向洗滌緩沖液和洗脫緩沖液中添加多磷酸。0.1M多磷酸具有從PPK-ADK游離出ADP的效果，對(duì)除去ADP很有效。
(實(shí)施例3超高靈敏度生物發(fā)光測(cè)定法)制備含0.16μg經(jīng)腺苷酸雙磷酸酶處理了的PPK-ADK、10μMAMP、400μM多磷酸、8mM MgCl2及60mM Tris-HCl(pH7.4)的混合液48μl，然后向該混合液中添加2μl的ATP樣品，擴(kuò)增ATP。隨反應(yīng)進(jìn)程取5μl的反應(yīng)液，與40μl的ATP生物發(fā)光測(cè)定試劑(Roche)混合，立即，用多板熒光測(cè)定儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。測(cè)定的熒光與不進(jìn)行ATP擴(kuò)增(不添加PPK-ADK)的情況進(jìn)行比較。熒光值表示不同3次測(cè)定的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。熒光隨時(shí)間變化的增加如圖3所示，60分鐘后ATP擴(kuò)增的結(jié)果如表1所示。
表1

如圖3所示，經(jīng)腺苷酸雙磷酸酶處理了的PPK-ADK，無(wú)外源性ATP時(shí)，盡管進(jìn)行60分鐘的擴(kuò)增處理，一點(diǎn)也無(wú)ATP的擴(kuò)增。還有，如圖3及表1所示，即使ATP的初期濃度低，也可擴(kuò)增到能用熒光測(cè)定的程度。該結(jié)果提示，該ATP擴(kuò)增反應(yīng)，可用于超高靈敏度生物發(fā)光測(cè)定法。即，含0.0033fmol(fmol10-15mol＝3.3amol10-18mol)濃度ATP的樣品，通過(guò)進(jìn)行60分鐘的ATP擴(kuò)增處理，可擴(kuò)增到可檢測(cè)的水平。也就是說(shuō)，可檢測(cè)出數(shù)amol(amol10-18mol)濃度的ATP。與此相對(duì)，以往的生物發(fā)光，測(cè)定發(fā)光必需數(shù)十fmol(fmol10-15mol)濃度的ATP(表1)。這樣，應(yīng)用本發(fā)明的ATP擴(kuò)增法，其生物發(fā)光的敏感度至少提高10000倍以上。
(實(shí)施例4超高靈敏度生物發(fā)光測(cè)定法在單一微生物檢測(cè)中的應(yīng)用)用純水將大腸桿菌的培養(yǎng)液(2×109CFU/ml)稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛取Ｏ蚣?xì)胞懸液(500μl)中加入溶解緩沖液500μl(生物發(fā)光測(cè)定試劑盒，Roche)，100℃，加熱2分鐘，使ATP從細(xì)胞中釋放出來(lái)。取2μl加熱樣品進(jìn)行ATP擴(kuò)增測(cè)定，測(cè)定生物發(fā)光。
測(cè)定的熒光與不進(jìn)行ATP擴(kuò)增(不添加PPK-ADK)的情況進(jìn)行比較。熒光值表示不同3次測(cè)定的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。熒光隨時(shí)間變化的增加如圖4所示，60分鐘后ATP擴(kuò)增的結(jié)果如表2所示。
表2

如圖4及表2所示，熒光量隨測(cè)定法中應(yīng)用的大腸桿菌數(shù)目的不同而變化(圖4)。如表2所示，與不進(jìn)行ATP擴(kuò)增相比，進(jìn)行ATP擴(kuò)增時(shí)熒光發(fā)色顯著增強(qiáng)。不進(jìn)行ATP擴(kuò)增時(shí)，即使達(dá)到表2中10000CFU時(shí)，熒光發(fā)光的強(qiáng)度極低，要想達(dá)到有意義的生物發(fā)光水平，必需數(shù)萬(wàn)CFU的大腸桿菌。與此相對(duì)，應(yīng)用本發(fā)明的ATP擴(kuò)增技術(shù)時(shí)，即使應(yīng)用單一的大腸桿菌(1CFU大腸桿菌水平)這一最低水平，也可觀察到明確的熒光。這提示，與不進(jìn)行ATP擴(kuò)增相比，其生物發(fā)光的敏感度是其10000倍以上。
有報(bào)道，大腸桿菌活細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)ATP水平約7μmol/g干燥菌體(Neuhard，J.，and Y.Nygaard.Purines and pyrimidines.445-473；F.C.Neidhardt等人編著，Escherichia coli and Salmonella typhimuriumcellular and molecular biology，ASM press，Washington，D.C.(1987))。由于1個(gè)大腸桿菌的干重約2.8×10-13g(F.C.Neidhardt.Chemicalcomposition of Escherichia coli.3-6頁(yè)；F.C.Neidhardt等人編著，Escherichia coli and Salmonella typhimuriumcellular and molecularbiology，ASM press，Washington，D.C.(1987))，每一個(gè)大腸桿菌大約含2amol的ATP。該水平的ATP，幾乎與本超高靈敏度生物發(fā)光測(cè)定法的檢測(cè)界限相同。
(實(shí)施例5超高靈敏度生物發(fā)光測(cè)定法在衛(wèi)生學(xué)監(jiān)測(cè)上的應(yīng)用)探討本發(fā)明的方法是否能應(yīng)用于大腸桿菌的拭子監(jiān)測(cè)。將大腸桿菌的細(xì)胞懸浮液涂到聚苯乙烯培養(yǎng)皿上，用空氣干燥的市售棉簽擦取。因?yàn)椋惺勖藓灪写罅康腁TP，所以預(yù)先在121℃進(jìn)行75分鐘的高壓滅菌，使ATP分解為AMP和磷酸。將從4cm2表面積擦拭的樣品浸到400μl溶解緩沖液中，然后100℃加熱2分鐘。向加熱樣品(10μl)中添加ATP擴(kuò)增反應(yīng)液(40μl)，進(jìn)行60分鐘的ATP擴(kuò)增反應(yīng)。將其中25μl用于生物發(fā)光測(cè)定。結(jié)果如表3所示。
表3

通過(guò)這種檢測(cè)，可進(jìn)行大約12大腸桿菌CFU/cm2水平的測(cè)定?？梢耘袛?，本發(fā)明的方法可用于大腸桿菌的拭子監(jiān)測(cè)。
(實(shí)施例6飲料水中細(xì)菌的監(jiān)測(cè))探討本發(fā)明的方法是否對(duì)飲料水中細(xì)菌的檢測(cè)有效。向加熱的水樣品(2μl)中ATP擴(kuò)增反應(yīng)液(50μl)，進(jìn)行60分鐘的ATP擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果如表4所示。表4中，自來(lái)水(1)從廣島市的上水道獲得。自來(lái)水(2)是廣島大學(xué)的再生水。瓶裝水從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。無(wú)菌水是將蒸餾水高壓制備的。池水是廣島大學(xué)的池水。集落數(shù)(CFU)是將1ml水樣涂到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(1.6g蛋白胨，1g酵母提取物，0.5g NaCl，15g瓊脂，1L水)中，28℃培養(yǎng)3天后，計(jì)數(shù)所形成的集落。
表4

該結(jié)果提示，即使在以往的生物發(fā)光測(cè)定法中檢測(cè)不出的水平，也能檢測(cè)出細(xì)菌。如表4的結(jié)果所示，應(yīng)用本發(fā)明的方法，通過(guò)對(duì)水樣品進(jìn)行60分鐘的ATP擴(kuò)增處理，可檢測(cè)出1CFU/ml的細(xì)菌。以往的應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的方法，要檢測(cè)出混入的細(xì)菌，需要典型的數(shù)目(表4)。有自來(lái)水中檢測(cè)出病原菌綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)的報(bào)道(Bert，F(xiàn).等人，Multi-resistant Pseudomonas aeruginosaoutbreak associated with contaminated tap water in a neurosurgeryintensive care unit.J.Hosp.Infect.39，53-62(1998))，應(yīng)用本發(fā)明可容易且迅速地檢測(cè)出類(lèi)似微生物的存在。
(實(shí)施例7檢測(cè)牛奶中的細(xì)菌)探討在奶酪業(yè)中的應(yīng)用。細(xì)菌的混入，給奶業(yè)界帶來(lái)很大的危害，為了檢測(cè)牛奶中的細(xì)菌，需要開(kāi)發(fā)迅速且可信的實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明者探討了檢測(cè)牛奶中金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的高靈敏度的測(cè)定法。將金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)液稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛龋尤氲脚Ｄ讨?。為了除去牛奶中所含?lái)自乳腺和體細(xì)胞的非細(xì)菌性ATP，用0.45μm的膜對(duì)0.5ml牛奶進(jìn)行過(guò)濾。用10ml含0.2％TritonX-100、100mMTris-HCl(pH 7.8)及2mM EDTA的溶液(Olsson，T.等人Extractionand determination of adenosine 5’-trihphosphate in bovine milk by thefirefly luciferase assay.Biotech.Appl.Biochem.8，361-369(1986))洗滌該膜。洗滌后，將該膜浸到200μl溶解緩沖液中，100℃、加熱5分鐘。將加熱的樣品(20μl)進(jìn)行60分鐘的ATP擴(kuò)增。然后，用于生物發(fā)光測(cè)定法。結(jié)果如表5所示。
表5

測(cè)定的結(jié)果是，可檢測(cè)出75CFU(金黃色葡萄球菌)/0.5ml牛奶。金黃色葡萄球菌的檢測(cè)靈敏度低于大腸桿菌，但檢測(cè)出的牛奶中的金黃色葡萄球菌的靈敏度比以往應(yīng)用生物發(fā)光測(cè)定法的靈敏度增大約10000倍。本發(fā)明的迅速確定微生物存在的方法，不僅可用于環(huán)境中的微生物，而且可廣泛應(yīng)用于衛(wèi)生學(xué)上的監(jiān)測(cè)。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的PPK-ADK融合蛋白，作用于ATP、AMP及多磷酸化合物的混合物，擴(kuò)增ATP。特別是通過(guò)應(yīng)用不含不純物ADP的PPK-ADK，可用于僅擴(kuò)增外源性ATP，且可擴(kuò)增單個(gè)細(xì)胞水平的微生物的ATP。可用熒光素酶測(cè)定法等檢測(cè)所擴(kuò)增的ATP。因此，可迅速檢測(cè)出以往經(jīng)幾天才勉勉強(qiáng)強(qiáng)檢測(cè)出的微生物，且即便僅1個(gè)細(xì)胞也可進(jìn)行檢測(cè)。
序列表序列表<110>Japan Science and Technology Agency<120>改良的ATP擴(kuò)增方法及其應(yīng)用<130>P2-04K16119<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ppk正向引物<400>1ggatctagat gaataaaacg gagtaaaagt30<210>2<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ppk反向引物<400>2ggaggatccg ccgccgccgc cttcaggttg ttcgagtgat tt 42<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>adk正向引物
<400>3ggaggatcca tgcgtatcat tctgcttggc 30<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>adk反向引物<400>4ggaaagcttg ccgaggattt tttccag2權(quán)利要求
1.一種ATP的擴(kuò)增方法，它包括將多磷酸激酶與腺苷酸激酶的融合蛋白作用于含有ATP、AMP和多磷酸化合物的混合物的步驟。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中多磷酸激酶與腺苷酸激酶的融合蛋白是不包含ADP的融合蛋白。
3.一種ATP的檢測(cè)方法，它包括將多磷酸激酶與腺苷酸激酶的融合蛋白作用于含有ATP、AMP和多磷酸化合物的混合物，擴(kuò)增ATP的步驟；以及檢測(cè)所擴(kuò)增的ATP的步驟。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中多磷酸激酶與腺苷酸激酶的融合蛋白是不包含ADP的融合蛋白。
5.一種迅速檢測(cè)微生物存在的方法，包括處理含有微生物的樣品，制備含有ATP的樣品的步驟；將該含有ATP的樣品添加到ATP擴(kuò)增體系，擴(kuò)增ATP的步驟；以及檢測(cè)所擴(kuò)增的ATP的步驟，其中，ATP擴(kuò)增體系包括AMP、多磷酸化合物及不包含ADP的多磷酸激酶與腺苷酸激酶的融合蛋白。
6.一種迅速檢測(cè)微生物存在的試劑盒，它包括包含AMP、多磷酸化合物及不包含ADP的多磷酸激酶與腺苷酸激酶的融合蛋白在內(nèi)的ATP擴(kuò)增試劑，和檢測(cè)ATP的ATP檢測(cè)試劑。
7.權(quán)利要求6描述的試劑盒，還備有細(xì)胞溶解用試劑。
8.一種ATP的擴(kuò)增方法，它是將腺苷酸激酶以及不包含ADP的多磷酸激酶作用于含有ATP、AMP和多磷酸化合物的混合物。
9.多磷酸激酶與腺苷酸激酶的融合蛋白。
10.不包含ADP的多磷酸激酶與腺苷酸激酶的融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供的ATP擴(kuò)增方法，其包括將不含ADP的多磷酸激酶與腺苷酸激酶的融合蛋白(PKK－ADK)作用于含有ATP、AMP和多磷酸化合物的混合物，擴(kuò)增ATP，檢測(cè)極微量的外源ATP的步驟。還提供可擴(kuò)增基于ATP擴(kuò)增的，可檢測(cè)出單個(gè)細(xì)胞水平的ATP的超敏感ATP擴(kuò)增方法，和基于該擴(kuò)增方法的微生物檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C12N9/12GK1833032SQ20048002221
公開(kāi)日2006年9月13日 申請(qǐng)日期2004年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月29日
發(fā)明者黑田章夫 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)