專利名稱：：包含或缺乏CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域的修飾的博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在結(jié)合CD11b/CD18方面具有缺陷的修飾的博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶毒素，并涉及其在制備用于治療百日咳和/或預(yù)防博德特氏菌感染的藥物組合物中的用途。本發(fā)明還涉及包含CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域的博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的特定片段及其用途，特別是用于將感興趣的分子導(dǎo)向表達(dá)CD11b的細(xì)胞。博德特氏菌屬包括4種菌種，即百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)、副百日咳博德特氏菌(Bordetellaparapertussis)、支氣管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)和鳥博德特氏菌(Bordetellaavium)。博德特氏菌是革蘭氏陰性球桿菌(coccobacilli)，引起呼吸道感染。百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌是嚴(yán)格人類病原體。支氣管炎博德特氏菌對多種哺乳動(dòng)物具有致病性，但對人罕有致病性，且不同于百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌的是，其能夠在宿主體外存活。鳥博德特氏菌對鳥具有致病性。對人類最具致病性的是百日咳博德特氏菌，其是百日咳這種高傳染性兒童呼吸道疾病的致病因素，百日咳的特征在于支氣管肺炎、發(fā)作性咳嗽和吸氣性哮鳴音。迄今為止，針對百日咳的免疫接種最常使用的是滅活全細(xì)菌。不過，鑒于毒力因子是由細(xì)菌分泌的蛋白質(zhì)而非細(xì)菌本身所組成的，因此此類疫苗并非總是無毒的。因此，這些蛋白質(zhì)可引起嚴(yán)重的病理學(xué)效應(yīng)，既便在細(xì)菌死后依然如此。歐洲專利EP0424158(InstitutPasteur)公開了將博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶用作抗百日咳博德特氏菌和支氣管炎博德特氏菌的保護(hù)性抗原。歐洲專利EP0338169(InstitutPasteur)還公開了來自副百日咳博德特氏菌的活性腺苷酸環(huán)化酶制劑作為抗百日咳的保護(hù)性抗原的用途。也已經(jīng)開發(fā)了一些備選策略，包括使用具有免疫源性的解毒的博德特氏菌毒素制備細(xì)胞疫苗。美國專利SN6,040,427(Locht等，2000)公開了基于解毒的百日咳毒素的疫苗的實(shí)例。在百日咳博德特氏菌產(chǎn)生的各種毒素中，腺苷酸環(huán)化酶(在此也稱為CyaA)是在呼吸道建群(colonization)早期細(xì)菌毒力的關(guān)鍵因素(GoodwinandWeiss，1990；Khelef等，1992)。該毒素使得細(xì)菌能夠逃脫宿主的免疫監(jiān)控，這主要是通過使中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中毒、引起吞噬細(xì)胞功能缺陷和巨噬細(xì)胞凋亡(ConferandEaton，1982；Gueirard等，1998；Harvill等，1999；KhelefandGuiso，1995；Khelef等，1993)。在小鼠呼吸道模型中已經(jīng)清楚地證明了CyaA在百日咳博德特氏菌致病機(jī)理中的作用。實(shí)際上，經(jīng)遺傳學(xué)修飾的缺乏CyaA表達(dá)的百日咳博德特氏菌菌株，其誘導(dǎo)肺部病變和引發(fā)致死性感染的能力被消弱(Khelef等，1994；WeissandGoodwin，1989)。另一方面，在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)CyaA可誘導(dǎo)抗百日咳博德特氏菌在肺部建群的保護(hù)性免疫(Betsou等，1993；Betsou等，1995；Hormozi等，1999)。CyaA是一種1706個(gè)氨基酸殘基的多肽，由4個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域組成腺苷酸環(huán)化酶活性(AC)結(jié)構(gòu)域(1至400位殘基)、疏水性通道形成結(jié)構(gòu)域(500至700位殘基)、鈣結(jié)合性富含甘氨酸/天冬氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域(calcium-bindingglycin/aspartaterichrepeatdomain)(1000至1600位殘基)、和具有分泌信號(hào)的C末端結(jié)構(gòu)域(1600至1706位殘基)。CyaA能夠侵入真核細(xì)胞并將其催化結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)移至胞漿內(nèi)，在此，被內(nèi)源性鈣調(diào)蛋白激活后，其催化ATP轉(zhuǎn)化為cAMP(LadantandUllmann，1999)。cAMP在細(xì)胞漿內(nèi)聚集被認(rèn)為是該毒素引起毒性反應(yīng)的原因(Rogel等，1991)。這種中毒的主要后果是細(xì)胞凋亡以及吞噬功能改變和產(chǎn)生過氧化物(ConferandEaton，1982；Friedman等，1987；Khelef等，1993；Njamkepo等，2000；Pearson等，1987)。百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的完整序列見SEQIDNO1。支氣管炎博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的完整序列見SEQIDNO3。CyaA需要鈣以獲得轉(zhuǎn)移特異性構(gòu)象以便將催化結(jié)構(gòu)域輸送至細(xì)胞漿內(nèi)(RogelandHanski，1992；Rose等，1995)。首先，CyaA是作為無活性的前毒素(即proCyaA)而產(chǎn)生的，經(jīng)?；D(zhuǎn)移酶進(jìn)行翻譯后修飾，這種cyaC基因的產(chǎn)物才成為活性毒素。這種共價(jià)性翻譯后脂肪酸?；瘜τ诙舅剞D(zhuǎn)移通過靶細(xì)胞膜和輸送其催化AC結(jié)構(gòu)域以及對于形成溶血性陽離子選擇性通道來說均是必需的。proCyaA的?；l(fā)生于兩個(gè)不同的位置，Lys-983和Lys-860，其位于保守性RTX?；稽c(diǎn)內(nèi)(Barry等，1991；Hackett等，1994)。盡管Lys-860的?；瘜τ贑yaA的活性似乎是非必需的，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Lys-983的?；侵陵P(guān)重要的(Basar等，2001)。CyaA可穿透許多種類型的細(xì)胞，包括缺乏膜運(yùn)輸?shù)牟溉閯?dòng)物紅細(xì)胞(Bellalou等，1990；Gray等，1999；RogelandHanski，1992)。與此不同的是，CyaA的毒性作用，例如消除吞噬能力和誘導(dǎo)凋亡，主要在免疫細(xì)胞上得到闡述，即中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(ConferandEaton，1982；Khelef等，1993)。此外，在小鼠呼吸道感染中，發(fā)現(xiàn)CyaA對肺泡巨噬細(xì)胞具有特異性毒性(Gueirard等，1998)。包含固定于異源性表位的由百日咳博德特氏菌產(chǎn)生的重組腺苷酸環(huán)化酶毒素的疫苗也在WO93/21324(InstitutPasteur，1993)中公開。最近證實(shí)，CyaA通過αMβ2整聯(lián)蛋白(CD11b/CD18)而特異性結(jié)合于靶細(xì)胞。這種結(jié)合是可飽和的且被抗CD11b單克隆抗體所完全抑制。CyaA對CD11b+細(xì)胞具有選擇性細(xì)胞毒性，說明其與CD11b的相互作用對于催化結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)移和隨后出現(xiàn)的cAMP升高以及細(xì)胞死亡是必需的。此外，在表達(dá)CD11b/CD18異二聚體后，CHO細(xì)胞對CyaA的細(xì)胞毒性的敏感性明顯升高。不僅如此，催化結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)所需的Ca2+離子對于CyaA與CD11b的相互作用也是絕對必需的(Guermonprez等，2001)。CD11b對于CyaA與細(xì)胞相互作用的重要性在一個(gè)系統(tǒng)中被進(jìn)一步證實(shí)，在該系統(tǒng)中，將CyaA用作載體將外來抗原輸送至抗原呈遞細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞。實(shí)際上，僅僅CD11c+CD8α-CD11bhigh亞群的樹突狀細(xì)胞能夠展示相應(yīng)于插入至重組CyaA中的表位的MHCI類肽復(fù)合物(Guermonprez等，2002)。CD11b蛋白β2整聯(lián)蛋白(白細(xì)胞粘附分子)大家族的成員，該家族包括LFA1(CD11a)、MAC-1(CD11b)和p150，95(CD11c)。該家族的成員的不同之處在于其α鏈，其表達(dá)后與β鏈(CD18)形成必不可少的異二聚體(Arnaout，1990)。CD11b也被稱為3型補(bǔ)體受體(CR3)，表達(dá)于巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞、腹膜B-1細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的一個(gè)亞群(Arnaout，1990；Bell等，1999)。其在白細(xì)胞粘附功能方面具有關(guān)鍵的作用并觸發(fā)對覆有補(bǔ)體的顆粒的吞噬作用(DiamondandSpringer，1993)。CD11b結(jié)合各種配體，例如細(xì)胞內(nèi)粘附分子ICAM-1、纖維蛋白原、凝血因子X和失活的補(bǔ)體成分C3b(iC3b)(AltieriandEdgington，1988；Beller等，1982；Diamond等，1990；Wright等，1988)?；贑yaA與CD11b/CD18的結(jié)合特性，歐洲專利申請EP1188446(InstitutPasteur)公開了用于將感興趣的分子，且特別是抗原，導(dǎo)向樹突狀細(xì)胞的包含重組博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的蛋白質(zhì)載體。本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，即百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的自1166位氨基酸至1281位氨基酸的氨基酸序列(SEQIDNO2)中的一或多個(gè)區(qū)域?qū)τ谠摱舅嘏cCD11b/CD18的相互作用是至關(guān)重要的。這一區(qū)域?qū)τ贑yaA結(jié)合CD11b/CD18的能力是必需的，該區(qū)域可進(jìn)一步與作為輔助區(qū)域的CyaA的其他區(qū)域相結(jié)合。這一發(fā)現(xiàn)為制備能夠?qū)⒏信d趣的分子導(dǎo)向樹突狀細(xì)胞的有效而通用的分子輸送載體提供了可能性?；蛘撸蓪⑾佘账岘h(huán)化酶中鑒定的CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域缺失，這有利于設(shè)計(jì)一種安全的細(xì)胞疫苗，用于抵抗博德特氏菌感染，且特別是百日咳博德特氏菌感染。本發(fā)明還提供了所述鑒定的CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域用于產(chǎn)生中和抗體的用途，所述中和抗體能夠阻斷由感染性細(xì)菌產(chǎn)生的天然腺苷酸環(huán)化酶與細(xì)胞受體的相互作用。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種蛋白質(zhì)，其由博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶組成，所述博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域通過一或多個(gè)氨基酸的缺失、取代或插入而被修飾，其中所述蛋白質(zhì)在結(jié)合CD11b/CD18方面具有缺陷，但與識(shí)別野生型博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的抗血清具有特異性反應(yīng)性。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用作抗百日咳的疫苗中的活性成分。因此，CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域中的突變防止了免疫細(xì)胞的潛在陰性作用，例如通過類毒素結(jié)合整聯(lián)蛋白而引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或因CyaA類毒素競爭性結(jié)合CD11b而引起的一些功能性干擾，CyaA類毒素也作為補(bǔ)體受體CR3。在此，術(shù)語“多肽”指的是由肽鍵連接的氨基酸的單鏈，包含至少6個(gè)氨基酸，優(yōu)選地至少10個(gè)氨基酸，且更優(yōu)選地至少50個(gè)氨基酸。術(shù)語“蛋白質(zhì)”指的是一種大分子，其基本上由一或多個(gè)多肽組成。在本發(fā)明中，術(shù)語“博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶”包括鈣調(diào)蛋白依賴性腺苷酸環(huán)化酶，其在博德特氏菌中天然地合成，并且是細(xì)菌在肺內(nèi)建群的最初階段所必需的主要毒力因子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過對百日咳博德特氏菌(人類百日咳的致病因子)腺苷酸環(huán)化酶進(jìn)行修飾而得到本發(fā)明的蛋白質(zhì)。在百日咳博德特氏菌中，腺苷酸環(huán)化酶以一種1706個(gè)氨基酸的多肽(SEQIDNO1)的形式而合成并分泌。鈣調(diào)蛋白依賴性催化活性位于前400個(gè)氨基酸，該區(qū)域在此被稱為“N末端催化結(jié)構(gòu)域”。如先前所述，為了得到活性，通過與cyaC基因產(chǎn)物共表達(dá)進(jìn)行翻譯后修飾，使得所述腺苷酸環(huán)化酶毒素具有侵襲性和溶血性。根據(jù)本發(fā)明，“CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域”這一表述指的是a.百日咳博德特氏菌的CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域，百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的自1166位氨基酸至1281位氨基酸(SEQIDNO2)，或b.博德特氏菌的腺苷酸環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域，相應(yīng)于百日咳博德特氏菌的CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域，通過將所述博德特氏菌的腺苷酸環(huán)化酶的序列與百日咳博德特氏菌的腺苷酸環(huán)化酶的序列進(jìn)行比對而鑒定，采用的是尋找最佳局部比對的算法。尋找最佳局部比對的算法的一個(gè)實(shí)例是BLAST算法(Altschul等，1990)。支氣管炎博德特氏菌的CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域以SEQIDNO4表示。在此，“在結(jié)合CD11b/CD18方面具有缺陷”這一表述指的是本發(fā)明的蛋白質(zhì)不與野生型博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶競爭性結(jié)合表達(dá)CD11b/CD18αMβ2的細(xì)胞?！癈D11b/CD18αMβ2”或“CD11b/CD18”指的是博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的細(xì)胞受體(Guermonprez等，2001)。在后面的實(shí)驗(yàn)部分描述了用于評價(jià)重組毒素與表達(dá)CD11b/CD18αMβ2的細(xì)胞的特異性結(jié)合的結(jié)合分析法的實(shí)例。與野生型博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶相比，本發(fā)明的蛋白質(zhì)與CD11b/CD18αMβ2的結(jié)合親和力低于50％。更優(yōu)選地，本發(fā)明的蛋白質(zhì)的經(jīng)測定的結(jié)合親和力低于10％，且更優(yōu)選地低于5％。在此，術(shù)語“表達(dá)CD11b的細(xì)胞”涉及的是在其表面表達(dá)CD11b/CD18αMβ2的細(xì)胞。具體而言，這些細(xì)胞是粒細(xì)胞/中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、TCD8+亞群和B細(xì)胞亞群以及髓性樹突狀細(xì)胞。為了提供本發(fā)明的蛋白質(zhì)，通過一或多個(gè)氨基酸的插入、缺失或取代對博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域進(jìn)行修飾，所得蛋白質(zhì)在結(jié)合CD11b/CD18方面具有缺陷。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，通過在其中插入一種肽而修飾所述CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域。例如，所述CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域中插入了一種由6至12個(gè)殘基組成的序列。具體的實(shí)施方式包括在1166和1167位殘基之間或1281位和1282位殘基之間(數(shù)字代表野生型百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶中的氨基酸位置)插入含有6至12個(gè)氨基酸的肽而修飾的百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶。在后面的實(shí)驗(yàn)部分描述了在這些位置插入FLAG序列的表位的實(shí)例，在此稱為CyaA1166/FLAG和CyaA1281/FLAG?；蛘?，可將參與結(jié)合CD11b/CD18的殘基缺失或以非功能性殘基取代。在一個(gè)具體實(shí)施例方式中，通過在百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的自1208至1243位殘基區(qū)域或其他博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的相應(yīng)區(qū)域中進(jìn)行一或多個(gè)氨基酸的插入、缺失或取代而對博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶進(jìn)行修飾。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的優(yōu)選實(shí)施方式包括含有一或多個(gè)氨基酸的缺失或被非功能性氨基酸取代的百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶通過完全缺失CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域而修飾。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體的實(shí)施方式，百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶通過缺失自1245位至1273位氨基酸額被修飾，這些氨基酸任選地被非功能性氨基酸取代，例如使用在實(shí)驗(yàn)部分所例舉的一種八肽，在此稱為CyaAA1245-1273?；蛘?，為了確保全面安全地將本發(fā)明的蛋白質(zhì)施用于活生物體，對博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶進(jìn)行修飾以便除去其催化活性。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，通過在N末端催化結(jié)構(gòu)域進(jìn)行一或多個(gè)氨基酸的插入、缺失或取代而進(jìn)一步修飾博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶，其中所述修飾的博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶所具有的催化活性相對于野生型博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的催化活性是降低的。優(yōu)選地，所述催化活性低于野生型博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的催化活性的10％，且更優(yōu)選地，所述催化活性是不明顯的。N末端催化結(jié)構(gòu)域突變的實(shí)例是現(xiàn)有技術(shù)中已知的(例如見WO93/21324，InstitutPasteur)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的實(shí)施方式包括缺失N末端催化結(jié)構(gòu)域的至少1至300位氨基酸、且優(yōu)選地缺失1至373位氨基酸的修飾的博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶?；蛘?，可將二肽插入百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的188和190位殘基之間ATP結(jié)合位點(diǎn)或來自其他博德特氏菌的腺苷酸環(huán)化酶的相應(yīng)殘基之間。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的?；瘏⑴c毒素與CD11b/CD18的結(jié)合以及隨后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。因此，在本發(fā)明的蛋白質(zhì)的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)是非?；?。尤其是，在發(fā)生轉(zhuǎn)錄后?；陌被崽帉Σ┑绿厥暇佘账岘h(huán)化酶進(jìn)行進(jìn)一步修飾。這些氨基酸相應(yīng)于百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的Lys-983和Lys-860。在這一具體實(shí)施例方式中，所述蛋白質(zhì)在腺苷酸環(huán)化酶序列的983和/或860位沒有被酰化。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)沒有被?；?。本發(fā)明的蛋白質(zhì)優(yōu)選地具有免疫原性，但基本上是非毒性蛋白質(zhì)，即所述蛋白質(zhì)在細(xì)胞受體結(jié)合方面具有缺陷，且任選地在腺苷酸環(huán)化酶活性方面具有缺陷，但仍然能夠被抗腺苷酸環(huán)化酶毒素抗體特異性識(shí)別。本發(fā)明還涉及包含上述蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體(pharmaceuticalacceptablevehicle)的藥物組合物。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述組合物是適合施用于人或動(dòng)物的疫苗。所述疫苗優(yōu)選地能夠誘導(dǎo)針對百日咳的免疫。所述疫苗包含免疫保護(hù)和非毒性量的本發(fā)明的蛋白質(zhì)。相應(yīng)地，所述組合物可進(jìn)一步包含一或多種合適的引發(fā)佐劑(primingadjuvant)。其他已知的可與本發(fā)明的蛋白質(zhì)一同施用的抗原也可納入本發(fā)明的疫苗中。此類其他成分包括其他已知的博德特氏菌的保護(hù)性抗原、破傷風(fēng)類毒素和/或白喉類毒素。當(dāng)然，本發(fā)明還涉及用于免疫人或動(dòng)物以抵抗博德特氏菌感染和/或與由博德特氏菌感染引起的疾病有關(guān)的癥狀的方法，該方法包含給該人或動(dòng)物施用本發(fā)明的疫苗。本發(fā)明的疫苗的施用途徑可以是將免疫保護(hù)量的本發(fā)明的蛋白質(zhì)輸送給宿主的任何合適的途徑。不過，優(yōu)選地通過肌內(nèi)或皮下途徑經(jīng)胃腸外施用所述疫苗。如果需要，也可以采用其他施用途徑，例如口服或其他胃腸外途徑，即經(jīng)皮內(nèi)、鼻內(nèi)或靜脈施用。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及本發(fā)明的蛋白質(zhì)在制備用于治療人或動(dòng)物的與百日咳相關(guān)的疾病癥狀和/或用于保護(hù)人或動(dòng)物抵抗與博德特氏菌感染相關(guān)的疾病癥狀的藥物中的用途。當(dāng)然，本發(fā)明還涉及用于治療人或動(dòng)物的博德特氏菌感染和/或與博德特氏菌感染引起的疾病相關(guān)的癥狀的方法，該方法包含給該人或動(dòng)物施用本發(fā)明的藥物。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種能夠結(jié)合CD11b/CD18整聯(lián)蛋白的多肽，所述多肽選自a.具有30至500個(gè)氨基酸、優(yōu)選地50至300個(gè)氨基酸、且更優(yōu)選地50至150個(gè)氨基酸的博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的片段，所述片段包含所述博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域，或包含足以保留與CD11b/CD18結(jié)合的能力的所述野生型CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域的片段，或b.與所述片段具有至少70％相同性、優(yōu)選地至少80％相同性、且更優(yōu)選地至少90％相同性的變體，其中所述變體保留與CD11b/CD18結(jié)合的能力。博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶優(yōu)選地選自百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和支氣管炎博德特氏菌，且更優(yōu)選地為百日咳博德特氏菌。本發(fā)明的多肽可選自那些采用合適的構(gòu)象以結(jié)合CD11b/CD18的多肽。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽可包含博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的其他輔助區(qū)域，這些區(qū)域參與最佳結(jié)合CD11b/CD18。這些區(qū)域更具體地包括由自1416至1648位的區(qū)域組成的氨基酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽是上述b中所定義的變體，其由CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域中的一或多個(gè)10至50個(gè)氨基酸片段組成。例如，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述多肽包含來自百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的自1208至1243位氨基酸的百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶區(qū)域中的至少10至50個(gè)氨基酸的片段。百分比相同性所對應(yīng)的是當(dāng)采用BLAST算法將兩個(gè)序列進(jìn)行比對時(shí)，所述變體中與野生型序列相同的氨基酸的百分比。“保留與CD11b/CD18結(jié)合的能力”這一表述指的是，所述變體與其所能比對的相應(yīng)的野生型片段相比，所述變體保留至少80％的與CD11b/CD18的結(jié)合親和力，且優(yōu)選地至少90％的與CD11b/CD18的結(jié)合親和力。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述多肽與識(shí)別博德特氏菌野生型腺苷酸環(huán)化酶的抗血清、優(yōu)選地與識(shí)別百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶抗血清特異性反應(yīng)。更優(yōu)選地，當(dāng)施用于哺乳動(dòng)物后，所述多肽能夠誘發(fā)特異性識(shí)別博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的抗體。在一個(gè)具體實(shí)施例方式中，所述多肽是百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的片段。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述多肽基本上由CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域組成，且更具體地由百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的自1166至1281位氨基酸(SEQIDNO2)的百日咳博德特氏菌的CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域組成。在其他具體實(shí)施例方式中，所述多肽還包含博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的?；Y(jié)構(gòu)域和/或疏水性結(jié)構(gòu)域。所述?；Y(jié)構(gòu)域包括在SEQIDNO1的700至1000位殘基的相應(yīng)區(qū)域內(nèi)，如WO93/21324所述，并包含Lys983和/或Lys860。疏水性結(jié)構(gòu)域相應(yīng)于SEQIDNO1的500至700位殘基的區(qū)域。優(yōu)選地，所述多肽被施用于哺乳動(dòng)物體內(nèi)后是無毒的。本發(fā)明的多肽與野生型腺苷酸環(huán)化酶競爭結(jié)合CD11b/CD18整聯(lián)蛋白。因此，本發(fā)明還涉及上述多肽在制備用于預(yù)防或治療人類或動(dòng)物的與百日咳相關(guān)的疾病癥狀和/或用于保護(hù)人類或動(dòng)物抵抗博德特氏菌感染相關(guān)的疾病的疫苗或藥物中的用途。更具體地，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的所述多肽以產(chǎn)生抗博德特氏菌感染的保護(hù)性抗體。已經(jīng)有報(bào)道認(rèn)為腺苷酸環(huán)化酶是一種有效的分子輸送載體，能夠?qū)⒉煌乖瓕?dǎo)向樹突狀細(xì)胞，特別是導(dǎo)致產(chǎn)生強(qiáng)效的CD4+以及CD8+T細(xì)胞應(yīng)答(EP1188446，InstitutPasteur)。本發(fā)明現(xiàn)在涉及本發(fā)明的多肽在制備一種用于將感興趣的分子特異性導(dǎo)向表達(dá)CD11b的細(xì)胞的載體中的用途。術(shù)語“特異性”在本申請的說明中指的是當(dāng)所述多肽用作感興趣的分子的載體時(shí)，由于其CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域與CD11b/CD18具有高結(jié)合親和力，其優(yōu)先導(dǎo)向表達(dá)CD11b的細(xì)胞，由此能夠?qū)⒏信d趣的分子以相對于其他細(xì)胞而言具有選擇性的方式導(dǎo)向所述細(xì)胞的表面或所述細(xì)胞的內(nèi)部。具體而言，在一個(gè)實(shí)施方式中，對所述分子或肽的這種導(dǎo)向作用在體內(nèi)是有效的。在其他的實(shí)施方式中，對所述分子的這種導(dǎo)向作用在體外或離體是有效的?！绑w外”指的是靶細(xì)胞是體外培養(yǎng)的細(xì)胞，“離體”指的是靶細(xì)胞是自活生物體中提取出來的、培養(yǎng)于體外的、且準(zhǔn)備再次施用于活生物體的細(xì)胞。由此，本發(fā)明提供了用于設(shè)計(jì)一些組合物的合適的方式，所述組合物適合于施用于需要導(dǎo)向特定的白細(xì)胞且特別是髓性樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的動(dòng)物或人類宿主。本發(fā)明更加具體地涉及用于將感興趣的分子導(dǎo)向表達(dá)CD11b的細(xì)胞的載體，其特征在于所述載體包含與該感興趣的分子相偶聯(lián)的、如上所述的能夠結(jié)合CD11b/CD18的多肽。本發(fā)明還涉及在體外將感興趣的分子導(dǎo)向表達(dá)CD11b的細(xì)胞的方法，所述方法包含a.提供取自活生物體的表達(dá)CD11b的細(xì)胞，b.將所述表達(dá)CD11b的細(xì)胞與本發(fā)明的載體在適合將所述載體導(dǎo)向所述表達(dá)CD11b的細(xì)胞的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明還提供了包含感興趣的分子的表達(dá)CD11b的細(xì)胞，其通過以上所述的方法而獲得。根據(jù)本發(fā)明，“感興趣的分子”這一表述指的是任何分子，優(yōu)選地其不是博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的片段。感興趣的分子還可以選自核酸，例如DNA、RNA、寡核苷酸、反義DNA、質(zhì)粒和粘粒。其還可以選自肽或多肽，且特別是酶、輔酶、受體配體、半抗原、抗原、抗體、及它們的片段。自然，本領(lǐng)域人員能夠根據(jù)所需的用途而選擇合適的分子。感興趣的分子可選自藥物的有效成分、免疫毒素、抗氧化劑、抗生素、生長因子、細(xì)胞內(nèi)激素、細(xì)胞因子、毒素、神經(jīng)遞質(zhì)、抗微生物制劑特別是抗病毒劑、抗細(xì)菌劑、抗寄生蟲劑或抗腫瘤劑，且更廣泛地，任何感興趣的治療性或預(yù)防性制劑。根據(jù)一個(gè)具體的實(shí)施方式，感興趣的分子選自肽、糖肽、脂肽、多糖、寡糖、核酸、脂質(zhì)和化合物。在具體的實(shí)施方式中，感興趣的分子是一種異源性抗原或表位，術(shù)語“異源性”指的是不同于載體自身所含有的腺苷酸環(huán)化酶的抗原決定簇的抗原或表位。將感興趣的分子偶聯(lián)于本發(fā)明的多肽，以提供本發(fā)明的載體。在此，術(shù)語“偶聯(lián)”指的是能夠使得所述感興趣的分子與所述多肽物理性相結(jié)合的任何相互作用。優(yōu)選地，偶聯(lián)是共價(jià)的。可以是直接的共價(jià)偶聯(lián)或通過使用連接劑進(jìn)行間接偶聯(lián)，以形成綴合物?；瘜W(xué)連接方法是本領(lǐng)域已知的。化學(xué)連接可選自例如馬來酰亞胺鍵、肽鍵、二硫鍵或硫醚鍵。例如，可使用N-吡啶基磺?；?活化的硫氫基(N-pyridylsulfonyl-activatedsulfhydryl)的二硫鍵。一個(gè)具體的方法包括給所述多肽添加一種連接物，所述連接物由至少一個(gè)半胱氨酸組成，其可容易地用于進(jìn)行二硫鍵連接。另一種措施包括化學(xué)偶聯(lián)一種生物素基團(tuán)，其能夠與結(jié)合鏈霉抗生物素的分子發(fā)生偶聯(lián)?？赏ㄟ^與不同的半胱氨酸殘基形成二硫鍵而將多個(gè)分子與本發(fā)明的多肽進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，條件是所述偶聯(lián)不會(huì)妨礙與CD11b/CD18的相互作用。表達(dá)CD11b的細(xì)胞的功能特性進(jìn)一步說明了本發(fā)明的所述多肽在制備用于將藥物導(dǎo)向這些特殊細(xì)胞的蛋白質(zhì)載體中的用途。就此而言，在本發(fā)明的一個(gè)具有實(shí)施方式中，所謂的感興趣的分子是藥物的有效成分?？梢詫⑺鲇行С煞忠曰瘜W(xué)方法或遺傳學(xué)方法偶聯(lián)于本發(fā)明的多肽。有利地，感興趣的分子是抗炎藥物，當(dāng)其偶聯(lián)于腺苷酸環(huán)化酶毒素后，被特異性導(dǎo)向參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞如中性粒細(xì)胞表面。由于表達(dá)CD11b的細(xì)胞，且特別是髓性樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，參與了免疫系統(tǒng)和先天性防御系統(tǒng)的重要功能，特別是炎癥性和特異性免疫應(yīng)答，因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的載體被更加具體地設(shè)計(jì)為用于引發(fā)CD4+和CD8+細(xì)胞應(yīng)答，所述應(yīng)答出現(xiàn)在所述感興趣的分子被導(dǎo)向表達(dá)CD11b的細(xì)胞特別是髓性樹突狀細(xì)胞之后。在這一方面，感興趣的分子優(yōu)選地是或包含表位或抗原。更具體地，感興趣的分子尤其可以是選自如下一組的抗原脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原、HIV病毒抗原、流感病毒抗原、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)膜腦膜炎病毒(lymphocyticchoromeningitidisvirus)、表位、人乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原、細(xì)菌抗原、例如結(jié)合分枝桿菌抗原。因此，本發(fā)明提供了在患者體內(nèi)引發(fā)CD4+和CD8+細(xì)胞應(yīng)答的手段，其或者通過在體內(nèi)將抗原或表位導(dǎo)向表達(dá)CD11b的細(xì)胞，或者通過以離體方式將抗原或表位導(dǎo)向提取出來的表達(dá)CD11b的細(xì)胞并將所得細(xì)胞重新施用于所述患者。因此，本發(fā)明涉及用于在體外將抗原或表位導(dǎo)向表達(dá)CD11b的細(xì)胞的方法，該方法包括a.提供取自活生物體的表達(dá)CD11b的細(xì)胞，和b.將所述表達(dá)CD11b的細(xì)胞與攜帶抗原或表位作為感興趣的分子的本發(fā)明的載體在適合將所述載體導(dǎo)向所述表達(dá)CD11b的細(xì)胞的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選地，取自活生物體的表達(dá)CD11b的細(xì)胞是髓性樹突狀細(xì)胞。本發(fā)明還提供了通過如上所述的方法獲得的表達(dá)CD11b的細(xì)胞，其包含異源性抗原或表位。本發(fā)明因此涉及一種用于針對一種抗原對人或動(dòng)物進(jìn)行免疫的細(xì)胞治療產(chǎn)品，其特征在于其包含有效量的通過如上所述的方法獲得的包含異源性抗原或表位的表達(dá)CD11b的細(xì)胞，以及藥學(xué)可接受的載體。本發(fā)明還涉及通過如上所述的方法獲得的包含所述抗原或表位的、表達(dá)CD11b的細(xì)胞在制備一種用于針對一種抗原對人或動(dòng)物進(jìn)行免疫的細(xì)胞治療產(chǎn)品中的用途。更具體地，本發(fā)明提供了用于針對一種抗原對患者進(jìn)行免疫的方法，其包含a.自所述患者提取表達(dá)CD11b的細(xì)胞，b.將所述表達(dá)CD11b的細(xì)胞與攜帶抗原或表位作為感興趣的分子的本發(fā)明的載體在適合將所述載體導(dǎo)向所述細(xì)胞的條件下在體外進(jìn)行培養(yǎng)，c.將有效量的包含所述載體的所述細(xì)胞重新施用于所述患者以引發(fā)CD4+和/或CD8+應(yīng)答，由此針對所述抗原對所述患者進(jìn)行免疫。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述表達(dá)CD11b的細(xì)胞是髓性樹突狀細(xì)胞。本發(fā)明因此還涉及一種藥物組合物，其包含攜帶表位或抗原作為感興趣的分子的本發(fā)明的載體，以及藥學(xué)上可接受的載體。根據(jù)一個(gè)具體的實(shí)施方式，所述組合物是適合施用于人或動(dòng)物的疫苗。優(yōu)選地，所述疫苗能夠誘導(dǎo)針對脊髓灰質(zhì)炎病毒、HIV或淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)膜腦膜炎病毒(lymphocyticchoromeningitidisvirus)的免疫。當(dāng)然，免疫的類型取決于載體所攜帶的所選定的抗原。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述疫苗能夠誘導(dǎo)針對百日咳的免疫。此類疫苗包含免疫保護(hù)和非毒性量的本發(fā)明的載體。因此，所述組合物可進(jìn)一步包含合適的引發(fā)佐劑。本發(fā)明還涉及用于針對病原體感染對人或動(dòng)物進(jìn)行免疫的方法，所述方法包括給所述的人或動(dòng)物施用包含免疫保護(hù)和非毒性量的本發(fā)明的載體的疫苗。本發(fā)明還涉及用于制備本發(fā)明的多肽、蛋白質(zhì)或載體的手段。所述手段包括編碼選自如下多肽的核酸a.本發(fā)明的蛋白質(zhì)，其在結(jié)合CD11b/CD18方面具有缺陷；b.本發(fā)明的多肽，其能夠結(jié)合CD11b/CD18整聯(lián)蛋白；或c.將感興趣的分子導(dǎo)向表達(dá)CD11b的細(xì)胞的載體。尤其是，可采用已知的技術(shù)自編碼任何博德特氏菌菌株的野生型腺苷酸環(huán)化酶的DNA衍生得到本發(fā)明的核酸，例如自基因文庫分離基因，自mRNA模板制備互補(bǔ)鏈或cDNA或通過聚合酶鏈反應(yīng)或來自臨床菌種分離物?；蛘撸赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)合成編碼野生型腺苷酸環(huán)化酶的DNA?？梢詮纳虡I(yè)性保藏機(jī)構(gòu)公開獲得各種博德特氏菌菌株。可采用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)通過對野生型DNA進(jìn)行遺傳工程而對編碼博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的野生型DNA進(jìn)行修飾。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及一種重組核酸，其由編碼本發(fā)明的多肽、蛋白質(zhì)或載體的核酸組成，并被克隆入一種適合在宿主細(xì)胞中表達(dá)所編碼的多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)載體中。任選地，所述重組DNA分子包含額外的編碼序列，其編碼具有免疫刺激特性的載體多肽，所述載體多肽例如為佐劑，或者可用于表達(dá)、純化和/或配制本發(fā)明的多肽。所述編碼序列可與本發(fā)明的用于導(dǎo)向分子的多肽、蛋白質(zhì)或載體的編碼序列置于一個(gè)可讀框內(nèi)。當(dāng)然，表達(dá)載體的選擇取決于所采用的宿主。優(yōu)選地，所述表達(dá)載體是質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒或病毒DNA。本發(fā)明還涉及一種制備方法，其用于制備本發(fā)明的在結(jié)合CD11b/CD18方面具有缺陷的蛋白質(zhì)；如上所述的能夠結(jié)合CD11b/CD18的多肽；或用于將感興趣的分子導(dǎo)向表達(dá)CD11b的細(xì)胞的載體，所述方法的步驟包括將上述重組核酸整合入合適的宿主細(xì)胞以表達(dá)相應(yīng)的感興趣的多肽、蛋白質(zhì)或載體；培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞并回收本發(fā)明的合成的重組多肽、蛋白質(zhì)或載體。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種宿主細(xì)胞，其以本發(fā)明的重組核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)化，且因此包含如上所述的核酸或重組核酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，可通過包括同源重組在內(nèi)的常規(guī)的技術(shù)將所述重組核酸整合入宿主細(xì)胞的基因組中。本發(fā)明的優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括那些屬于大腸桿菌和博德特氏菌屬的細(xì)胞。其他合適的細(xì)胞包括但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母和其他細(xì)菌細(xì)胞。本發(fā)明還包含可通過以本發(fā)明的多肽、蛋白質(zhì)、載體或組合物免疫動(dòng)物或人而獲得的多克隆血清。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述多克隆血清可通過以由博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域組成的多肽、優(yōu)選地由百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的自1166至1281位氨基酸的CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域組成的多肽免疫動(dòng)物或人而獲得。本發(fā)明還涉及特異性針對包含CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明的多肽的單克隆抗體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述單克隆抗體針對位于CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域內(nèi)的表位，優(yōu)選地針對位于百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的自1166至1281位氨基酸的CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域內(nèi)的表位。優(yōu)選地，所述多克隆血清或單克隆抗體能夠阻斷野生型腺苷酸環(huán)化酶與CD11b/CD18的結(jié)合?？赏ㄟ^將所述多克隆血清或單克隆抗體與野生型腺苷酸環(huán)化酶的混合物與CD11b/CD18相結(jié)合的能力與野生型腺苷酸環(huán)化酶單獨(dú)與CD11b/CD18相結(jié)合的能力相比較，進(jìn)行評價(jià)，從而測定所述阻斷。在一個(gè)具體實(shí)施例方式中，所述藥物提供針對博德特氏菌感染的被動(dòng)免疫。為了用于人類生物體，本發(fā)明的抗體可進(jìn)行人源化，例如通過以由上述技術(shù)獲得的單克隆免疫球蛋白的高變區(qū)取代人免疫球蛋白中不具有抗體功能的高變區(qū)部分而進(jìn)行人源化。例如，進(jìn)行抗體人源化的技術(shù)可參見WaldmannT.，June1991，Science，vol.252，p.1657-1662；WinterG.etal，1993，ImmunologyToday，vol.14，No.6，p.243-246；Carter等，May1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.89，p.4285-4289；Singer等，1April1993，JournalofImmunology，vol.150，No.7，p.2844-2857。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其包含所述多克隆血清或單克隆血清、以及藥學(xué)可接受的載體。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多克隆血清或單克隆抗體在制備用于治療人或動(dòng)物的與百日咳相關(guān)的疾病癥狀和/或用于保護(hù)人或動(dòng)物抵抗與博德特氏菌感染相關(guān)的疾病癥狀的藥物中的用途。以下實(shí)驗(yàn)部分給出了用于確定(i)翻譯后酰化在CyaA與CD11b的相互作用中的作用(ii)百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的CD11b相互作用結(jié)構(gòu)域的結(jié)果。圖1.CyaA特異性結(jié)合CD11b細(xì)胞并抑制CyaA-生物素和抗CD11b單克隆抗體兩者與這些細(xì)胞的結(jié)合(A)CHO細(xì)胞或CHO-CD11b細(xì)胞與指定濃度的CyaA進(jìn)行溫育。以抗CyaAMab(5G12)通過FACS檢測表面結(jié)合的CyaA。結(jié)果表示為AMFI＝(與CyaA進(jìn)行溫育的細(xì)胞的MFI值)-(未與CyaA進(jìn)行溫育的細(xì)胞的MFI值)，且結(jié)果代表至少2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。(B)CHO-CD11b與指定濃度的CyaA進(jìn)行預(yù)溫育。然后在持續(xù)存在毒素的情況下分別加入CyaA-生物素(30nM)或抗CDMab(2μg/ml)，并通過FACS測定它們的結(jié)合。(C)與指定濃度的CyaA進(jìn)行預(yù)溫育后，在持續(xù)存在毒素的情況下將CHO-CD11b細(xì)胞或CHO-CD11c細(xì)胞分別與抗CD11b或抗CD11c單克隆抗體進(jìn)行溫育。然后通過FACS測定抗體結(jié)合。對于(B)和(C)，結(jié)果表示為結(jié)合百分比＝(樣品結(jié)合)/(最大結(jié)合)×100，并代表至少2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖2.CyaA或proCyaA與CHO轉(zhuǎn)染體直接結(jié)合CHO-CD11b細(xì)胞(A)或CHO細(xì)胞(B)與指定濃度的CyaA或proCyaA進(jìn)行溫育。以抗CyaAMab(5G12)檢測表面結(jié)合的CyaA。結(jié)果表示為AMFI＝(與CyaA進(jìn)行溫育的細(xì)胞的MFI值)-(未與CyaA進(jìn)行溫育的細(xì)胞的MFI值)，結(jié)果代表2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖3.CyaA的?；瘜τ谂cCHO-CD11b細(xì)胞的穩(wěn)定結(jié)合是必需的CHO-CD11b細(xì)胞與指定濃度的CyaA或proCyaA的進(jìn)行預(yù)溫育。任何在持續(xù)存在CyaA或proCyaA的情況下加入CyaA-生物素(A)或抗CD11bMab(B)。通過FACS測定表面結(jié)合的CyaA-生物素或抗CD11bMab。結(jié)果表示為結(jié)合百分比＝(樣品結(jié)合)/(最大結(jié)合)×100，且代表至少2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖4.CyaA的酰化是CyaA誘導(dǎo)的cAMP聚集和細(xì)胞毒性所必需的CHO-CD11b細(xì)胞與指定濃度的CyaA或proCyaA在37℃溫育20min。然后裂解細(xì)胞并測定cAMP(A)。與此平行地，將CHO-CD11b在存在指定濃度的CyaA或proCyaA的情況下在37℃溫育4小時(shí)后，通過測定釋放至培養(yǎng)基中的乳酸脫氫酶的量而測定毒性(B)。結(jié)果代表至少2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖5.催化結(jié)構(gòu)域不是CyaA與CD11b細(xì)胞相互作用所必需的CHO-CD11b與與指定濃度的CyaA、CyaA1-384或CyaA373-1706進(jìn)行預(yù)溫育。然后將細(xì)胞與CyaA-生物素(A)或抗CD11bMab(B)進(jìn)行溫育。通過FACS測定CyaA-生物素和抗CD11bMab的結(jié)合。結(jié)果表示為結(jié)合百分比＝(樣品結(jié)合)/(最大結(jié)合)×100，且代表至少2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖6.CyaA片段與CD11b細(xì)胞的直接結(jié)合CHO-CD11b細(xì)胞(A，C)或CHO細(xì)胞(B，D)與指定濃度的CyaA、CyaA1-384和CyaA373-1706進(jìn)行溫育。然后以識(shí)別催化結(jié)構(gòu)域的抗CyaA5G12Mab(A，B)或以識(shí)別重復(fù)結(jié)構(gòu)域的抗CyaA6D7Mab(C，D)檢測表面結(jié)合的CyaA。結(jié)果表示為AMFI＝(與CyaA或CyaA片段進(jìn)行溫育的細(xì)胞的MFI值)-(未與CyaA或CyaA片段進(jìn)行溫育的細(xì)胞的MFI值)，且代表至少2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖7.在存在CyaA-FLAG突變體的情況下CyaA-生物素與CHO-CD11b細(xì)胞結(jié)合CHO-CD11b細(xì)胞與CyaA或CyaAFLAG突變體(30nM)進(jìn)行預(yù)溫育。然后在持續(xù)存在CyaA或CyaA-FLAG分子的情況下加入CyaA-生物素。通過以鏈霉抗生物素-PE通過FACS檢測表面結(jié)合的CyaA-生物素。結(jié)果表示為結(jié)合百分比＝(樣品結(jié)合)/(最大結(jié)合)×100，且代表至少2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖8.SDS-Page分析純化的CyaA制劑及其對紅細(xì)胞的侵襲活性(A)根據(jù)已有的方法(Karimova等，1998)，通過DEAE-和苯基瓊脂糖層析法自尿素提取物中純化CyaA/FLAG分子與野生型CyaA。將各大約3μg的各種蛋白質(zhì)在7.5％丙烯酰胺凝膠上電泳并以考馬斯蘭染色進(jìn)行分析。(B)CyaA/FLAG分子對綿羊紅細(xì)胞的侵襲活性。各2μg的各種CyaA蛋白質(zhì)與5×108洗滌綿羊紅細(xì)胞溫育30分鐘，按照已有的方法(Osicka等，2000)測定轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)的AC活性的量。結(jié)果代表3次雙份實(shí)驗(yàn)的平均值(n＝6)。圖9.在存在選定的CyaA-FLAG突變體的情況下CyaA與CHO-CD11b細(xì)胞的結(jié)合CHO-CD11b細(xì)胞與不同濃度(自7.5nM至240nM)的CyaA或CyaAFLAG突變體進(jìn)行預(yù)溫育。在持續(xù)存在CyaA分子的情況下加入CyaA-生物素，并檢測表面結(jié)合的CyaA-生物素。結(jié)果表示為結(jié)合百分比＝(樣品結(jié)合)/(最大結(jié)合)×100，且代表至少2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)部分A.材料和方法A.1CyaA衍生的蛋白質(zhì)的制備、純化和修飾根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方案(Sambrook等，1989)以大腸桿菌菌株XL1-Blue(Stratagene，Amsterdam，Netherlands)作為宿主細(xì)胞進(jìn)行DNA操作。文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了編碼非?；囊吧蚿roCyaA(pACT7)、?；囊吧虲yaA(pT7CACT1)和在其催化結(jié)構(gòu)域具有一個(gè)獨(dú)特的半胱氨酸殘基和OVA表位的重組去毒化CyaA-E5-CysOVA(pCACT-E5-CysOva)的質(zhì)粒{Gmira等，2001；Guermonprez等，2001；Osicka等，2000；Sebo等，1991}。編碼CyaA373-1706(pTRCyaAA1-373)的質(zhì)粒是pTRCAG(Gmira等，2001)的衍生物，其中編碼毒素的催化結(jié)構(gòu)域(位于Ndel和BstBI位點(diǎn)之間)的DNA序列被缺失并被替換為一種合適的合成雙鏈寡核苷酸，其編碼氨基酸序列Met-Gly-Cys-Gly-Asn。制備CyaA的方案已有描述(Karimova等，1998)。所有蛋白質(zhì)均表達(dá)于E.coliBLR菌株(Novagen，MerckKG，Darmstadt，Germany)，并通過如Guermonprez等，2000所述的包括DEAE瓊脂糖和苯基瓊脂糖層析法的兩步程序自內(nèi)含體使之純化到超過95％均質(zhì)(如通過SDS凝膠分析來判斷)。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，以巰基試劑N-(6-(生物素酰胺基)己基)-3′-(2′-吡啶基二硫)丙酰胺(N-(6-(Biotinamido)hexyl)-3′-(2′-pyridyldithio)propiamide，即Biotin-HPDP)(Pierce，Bezons，F(xiàn)rance)對純化的CyaA-E5-CysOVA蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記位點(diǎn)是所述的獨(dú)特的半胱氨酸殘基。將生物素?；腃yaA在DEAE瓊脂糖上進(jìn)行重新純化，以便除去未反應(yīng)的Biotin-HPDP試劑。如Ladant等，1992所述進(jìn)行CyaA-1-384的表達(dá)和純化。通過分光光度分析自278nm的吸光度確定毒素的濃度，采用的分子消光系數(shù)為全長CyaA毒素，141mM-1cm-1；對于CyaA373-1706，113mM-1cm-1；而對于CyaA1-384，28mM-1cm-1。采用先前描述的CyaA分子中的允許插入位點(diǎn)(Osicka等，2000)構(gòu)建CyaA-FLAG分子。我們產(chǎn)生了一組17個(gè)CyaA構(gòu)建體，其在各自的允許位點(diǎn)攜帶用于FLAG表位(Sigma，SaintQuentinFallavier，F(xiàn)rance)的合成八肽插入體Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys。為實(shí)現(xiàn)這一目的，將三對雙鏈合成寡核苷酸對(分別為5′-GTACTGATTATAAAGATGACGATGACAAATCAC+5′-GTACGTGATTTGTCATCGTCATCTTTATAATCA；5′-GTACTTATCGATTATAAAGATGACGATGACAAA+5′-GTACTTTGTCATCGTCATCTTTATAATCGATAA和5′-GTACGTGGATTATAAAGATGACGATGACAAAGC+5′-GTACGCTTTGTCATCGTCATCTTTATAATCCAC)(SEQIDNO5至10)插入此前已經(jīng)引入cyaA內(nèi)部的獨(dú)特的BsrGI位點(diǎn)內(nèi)(Osicka等，2000)，所述寡核苷酸對在所需讀框內(nèi)編碼FLAG表位。通過DNA測序核對正確的插入，在E.coli內(nèi)表達(dá)重組CyaA分子并純化。如先前所述使用綿羊紅細(xì)胞作用靶細(xì)胞(Osicka等，2000)表征選定的CyaA/FLAG分子的侵襲能力。A.2產(chǎn)生抗CyaA單克隆抗體首先以CyaA毒素(20μg，于明礬中)腹腔內(nèi)免疫BALB/c小鼠。每隔大約2周，以10μgCyaA(于明礬中)對小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，共3次。在整個(gè)免疫接種方案過程中，對小鼠進(jìn)行放血，并通過ELISA測試它們的血清是否出現(xiàn)抗CyaA抗體。當(dāng)檢測到明顯的血清滴度時(shí)，給這些小鼠進(jìn)行最后一次強(qiáng)化，并在3天后將它們的脾細(xì)胞與P3X63骨髓瘤細(xì)胞(ATCC，Manassas，USA)融合。通過ELISA來篩選所產(chǎn)生的雜交瘤，篩選出產(chǎn)生CyaA特異性單克隆抗體的雜交瘤。然后選擇高產(chǎn)雜交瘤并通過單個(gè)細(xì)胞有限稀釋法進(jìn)行克隆，隨后將其用于在BALB/c裸鼠中產(chǎn)生腹水，以產(chǎn)生大量的抗CyaA單克隆抗體。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，采用T-GeITM純化試劑盒(Pierce，Bezons，F(xiàn)rance)自腹水中純化單克隆抗體。采用Bio-Rad蛋白質(zhì)分析法(Bio-Rad，MarneslaCoquette，F(xiàn)rance)測定抗體濃度。這些單克隆抗體中的兩種被用于本研究抗體5G12，其與位于1至190位氨基酸內(nèi)的表位反應(yīng)；和抗體6D7，其與位于1006至1706位氨基酸內(nèi)的表位反應(yīng)。A.3細(xì)胞和培養(yǎng)轉(zhuǎn)染了人CD11b/CD18的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO-CD11b細(xì)胞)、轉(zhuǎn)染了人CD11c/CD18的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO-CD11c細(xì)胞)或僅轉(zhuǎn)染了載體的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)由D.Golenbock(BostonUniversitySchoolofMedicine，Boston，MA)惠贈(zèng)，且按照先前所述在有新霉素的調(diào)節(jié)性進(jìn)行培養(yǎng)(Ingalls等，1998)。A.4抗體特異于人CD11b的單克隆抗體(ICRF44，小鼠IgG1，κ)和特異于人CD11c的單克隆抗體(B-Ly6，小鼠IgG1，κ)購自BDPharmingen(LePontdeClaix，F(xiàn)rance)。A.5結(jié)合分析分析方法如Guermonprez等，2001所述。簡言之，將2×105細(xì)胞與指定濃度的CyaA分子在含有4.5mg/ml葡萄糖的無血清的DMEM培養(yǎng)基(LifeTechnologies，CergyPontoise，F(xiàn)rance)中、在96孔培養(yǎng)板中冰上溫育30min。洗滌后，加入25μg/ml的抗CyaA催化結(jié)構(gòu)域Mab(5G12)或抗CyaA重復(fù)結(jié)構(gòu)域Mab(6D7)。在一些實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞與指定濃度的CyaA分子在冰上預(yù)溫育30min。然后，在持續(xù)存在毒素的情況下分別加入CyaA-生物素(30nM)、抗CD11bMab(2μg/ml)或抗CD11cMab(2μg/ml)(BDPharmingen)。洗滌并去除上清液后，將細(xì)胞以山羊抗小鼠IgG-PE(Caltag，LePerrayenYvelines，F(xiàn)rance)或以鏈霉抗生物素-PE(BDPharmingen)的1∶300的稀釋液進(jìn)行染色。末次洗滌后，加入5μg/ml碘化丙啶，將細(xì)胞在FACStarTM(BectonDickinson，LePontdeClaix，F(xiàn)rance)上進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析?；诩?xì)胞對碘化丙啶的排斥進(jìn)行門控以減去聚集的細(xì)胞或死細(xì)胞。自平均熒光強(qiáng)渡(MFI)推算出結(jié)合數(shù)據(jù)，并表示為ΔMFI＝(與CyaA進(jìn)行溫育的細(xì)胞的MFI值)-(未與CyaA進(jìn)行溫育的細(xì)胞的MFI值)或表示為結(jié)合百分比＝(樣品結(jié)合)/(最大結(jié)合)×100。最大結(jié)合相應(yīng)于(與CyaA或抗CD11b在不存在競爭劑的情況下進(jìn)行溫育的細(xì)胞的MFI值)-(僅與培養(yǎng)基進(jìn)行溫育的細(xì)胞的MFI值)。樣品結(jié)合相應(yīng)于(與CyaA或抗CD11b在存在競爭劑的情況下進(jìn)行溫育的細(xì)胞的MFI值)-(僅與培養(yǎng)基進(jìn)行溫育的細(xì)胞的MFI值)。A.6cAMP分析基本上按照如Guermonprez等，2001所述測定聚集在暴露于CyaA毒素的細(xì)胞內(nèi)的環(huán)AMP。簡言之，5×105細(xì)胞與指定濃度的CyaA在DMEM+葡萄糖中在37℃溫育20min。洗滌后，以0.1NHCl裂解并在120℃煮沸5min使得聚集在細(xì)胞漿中的cAMP釋放。以0.1NNaOH進(jìn)行中和后，將樣品加入到預(yù)先以cAMP-BSA綴合物包被的微量滴定板中，然后與經(jīng)過適當(dāng)稀釋的抗cAMP兔抗血清進(jìn)行溫育。洗滌后，以偶聯(lián)了堿性磷酸酶的抗兔抗體檢測抗cAMP抗體。通過與用已知濃度的cAMP得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較而確定各個(gè)樣品的cAMP含量。A.7CyaA侵襲活性通過如Osicka等，2000在先前所述測定CyaA分子的侵襲活性。簡言之，將綿羊紅細(xì)胞與毒素溫育30min，將侵襲活性測定為轉(zhuǎn)移至紅細(xì)胞內(nèi)、并可抵抗通過在細(xì)胞外加入胰蛋白酶進(jìn)行消化的AC活性。B.結(jié)果B.1CyaA特異性結(jié)合CD11b+細(xì)胞并抑制CyaA-生物素和抗CD11b與CD11b+細(xì)胞的結(jié)合為了研究CyaA在其與CD11b的相互作用中的生物學(xué)特征和結(jié)構(gòu)特征的作用，設(shè)計(jì)了兩種互補(bǔ)的分析一種結(jié)合分析以及一種競爭分析。結(jié)合分析包括將CyaA分子與轉(zhuǎn)染的表達(dá)人CD11b/CD18的CHO細(xì)胞(CHO-CD11b細(xì)胞)進(jìn)行溫育，或與模擬轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞進(jìn)行溫育，隨后以一種特異于催化結(jié)構(gòu)域的抗CyaA單克隆抗體(5G12)來檢測與細(xì)胞結(jié)合的毒素。如圖1A所示，采用這種分析，在CD11b+細(xì)胞上特異性檢測到CyaA結(jié)合。在競爭分析中，可測試不同CyaA分子(突變體或片段)與CyaA-生物素或抗CD11b單克隆抗體(Mab)競爭結(jié)合CD11b+細(xì)胞的能力。在此，將CHO-CD11b細(xì)胞與不同濃度的CyaA在冰上溫育30min。然后，在持續(xù)存在CyaA的情況下，加入CyaA-生物素(30nM)或抗CD11bMab(2μg/ml)，并通過FACS評價(jià)其與細(xì)胞的結(jié)合。如圖1B所示，CyaA以劑量依賴性方式有效地抑制了CyaA-生物素和抗CD11b兩者與CHO-CD11b細(xì)胞的結(jié)合。這種抑制作用對CD11b具有特異性，這是因?yàn)镃yaA完全不能與另一種配體(抗CD11cMab)競爭由CHO細(xì)胞表達(dá)的其特異性受體(CD11c)(圖1C)。B.2缺乏CyaA?；绊懫渑cCD11b+細(xì)胞的結(jié)合由于已知CyaA需要在轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行棕櫚?；拍苄惺蛊淝忠u活性并形成溶血性膜通道，因此我們測試了缺乏?；欠裼绊慍yaA與CD11b+細(xì)胞的相互作用。在一種結(jié)合分析中，將CHO細(xì)胞或CHO-CD11b細(xì)胞與CyaA或非?；膒roCyaA進(jìn)行溫育。使用抗CyaA催化結(jié)構(gòu)域Mab(5G12)對結(jié)合進(jìn)行評價(jià)。如圖2A所示，在低濃度，CyaA和proCyaA這兩種分子與CD11b+細(xì)胞的結(jié)合是相當(dāng)接近的，?；腃yaA的結(jié)合效率略微更高一些。這可能是由于其與細(xì)胞膜具有增強(qiáng)的相互作用、CyaA具有更適合于結(jié)合的構(gòu)象和/或CyaA具有與CD11b受體更高的親和力。的確，與CyaA的結(jié)合相比，proCyaA的結(jié)合在明顯更高的前毒素濃度達(dá)到飽和。對這一現(xiàn)象的最簡單的解釋可以是proCyaA結(jié)合CD11b+細(xì)胞的親和力低于CyaA。在高前毒素濃度，proCyaA的聚集和/或寡聚體可能結(jié)合細(xì)胞，隨后，更多的proCyaA被發(fā)現(xiàn)與抗體檢測系統(tǒng)發(fā)生結(jié)合。與此不同，檢測到CyaA或proCyaA與對照CHO細(xì)胞的結(jié)合極低(圖2B)。B.3?；€(wěn)定了CyaA與CD11b+的相互作用為了進(jìn)一步研究CyaA?；谠摱舅嘏cCD11b+細(xì)胞相互作用中的作用，我們測試了非?；膒roCyaA與CyaA競爭結(jié)合CHO-CD11b細(xì)胞的能力。如圖3A所示，與酰化的CyaA相比，非?；膒roCyaA與生物素酰化的CyaA競爭結(jié)合CD11b+細(xì)胞的能力是明顯降低的。為了確定缺乏抑制是否是由于不能與CD11b相互作用，我們評價(jià)了proCyaA阻斷抗CD11b與CHO-CD11b細(xì)胞結(jié)合的能力。的確，與CyaA相比，proCyaA不能抑制抗CD11b與CHO-CD11b細(xì)胞的結(jié)合(圖3B)。由于超過生理學(xué)水平產(chǎn)生cAMP和細(xì)胞毒性是CyaA與CD11b+細(xì)胞相互作用的結(jié)果，因此，我們隨后使用CHO-CD11b細(xì)胞分析這些毒素的功能是否依賴于CyaA的?；?。正如所預(yù)期的，與?；亩舅夭煌?，proCyaA沒有在CHO-CD11b細(xì)胞中誘導(dǎo)任何cAMP的升高(圖4A)，且對這些細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒作用(圖4B)?？傊?，這些結(jié)果清楚地證實(shí)，CyaA的酰化對于毒素與CD11b+細(xì)胞的功能性相互作用是必需的，而且proCyaA與CD11b的結(jié)合不足以在表達(dá)CD11b的細(xì)胞中引發(fā)細(xì)胞毒作用。B.4催化結(jié)構(gòu)域?qū)τ贑yaA與CD11b的相互作用是非必需的在功能上，CyaA由兩種具有獨(dú)立活性的主要結(jié)構(gòu)域組成。N末端結(jié)構(gòu)域具有腺苷酸環(huán)化酶活性(氨基酸1-400)，而羧基末端的溶血素部分(氨基酸400-1706)負(fù)責(zé)將AC結(jié)構(gòu)域輸送至靶細(xì)胞內(nèi)以及百日咳博德特氏菌的溶血活性。為確定CyaA的這兩種功能性結(jié)構(gòu)域在結(jié)合CD11b+細(xì)胞中的作用，我們測試了由殘基1至384編碼的催化結(jié)構(gòu)域CyaA1-384以及由殘基373至1706編碼的溶血性部分CyaA373-1706與CyaA-生物素競爭結(jié)合CHO-CD11b細(xì)胞的能力。如圖5A所示，催化結(jié)構(gòu)域不能抑制CyaA-生物素結(jié)合CHO-CD11b細(xì)胞，而CyaA373-1706顯示出與全長CyaA相同的結(jié)合抑制作用。相似地，催化結(jié)構(gòu)域也不能抑制抗CD11bMab與CHO-CD11b細(xì)胞的結(jié)合(圖5B)。此外，以特異于催化結(jié)構(gòu)域的抗CyaAMab(5G12)進(jìn)行的直接結(jié)合分析沒有發(fā)現(xiàn)CyaA1-384與CHO-CD11b細(xì)胞的表面發(fā)生任何明顯的結(jié)合，而CyaA的結(jié)合則很容易被檢測到(圖6A)。CyaA373-1706與CHO-CD11b細(xì)胞的直接結(jié)合不能被識(shí)別位于CyaA的前200個(gè)氨基酸內(nèi)的表位的5G12Mab檢測到，單卻清楚地被特異于重復(fù)結(jié)構(gòu)域的另一種抗CyaAMab(6D7)清楚地證實(shí)(圖6C)。同樣，以6D7Mab檢測到在缺乏CD11b的CHO細(xì)胞上僅有極弱的CyaA或CyaA373-1706的結(jié)合(圖6B和D)?？傊?，這些結(jié)果清楚地證實(shí)，催化結(jié)構(gòu)域?qū)τ贑yaA與CD11b的相互作用是非必需的，且CyaA/CD11b相互作用結(jié)構(gòu)域位于CyaA373-1706片段內(nèi)。B.5與CD11b相互作用的CyaA結(jié)構(gòu)域位于CyaA重復(fù)區(qū)域內(nèi)為了鑒定CyaA的與CD11b相互作用的區(qū)域，我們表達(dá)并純化了C末端區(qū)域CyaA373-1706的不同亞片段(包括殘基373-1490、或700-1706、或700-1490、或1006-1706)，對這些亞片段在競爭性分析中進(jìn)行了測試。不過，這些多肽無一能夠?qū)yaA-生物素與CHO-CD11b細(xì)胞的結(jié)合構(gòu)成顯著的競爭。這可能是由于這些分離的片段的構(gòu)象發(fā)生了改變。因此，我們采用了突變方法來定位CyaA的CD11b結(jié)合結(jié)構(gòu)域。通過在如材料和方法中所詳細(xì)說明的毒素多肽中的各種所述位點(diǎn)插入FLAG表位(氨基酸序列DYKDDDDK)而構(gòu)建了17種經(jīng)不同修飾的CyaA分子。我們認(rèn)為，在CD11b結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特定位置插入異源性的且高度帶電的肽有可能破壞其與CD11b相互作用的能力。這17種FLAG標(biāo)記的CyaA分子被表達(dá)并被純化至均質(zhì)，并測試其抑制CyaA-生物素與CHO-CD11b細(xì)胞結(jié)合的能力(注意在CyaAA510-515/FLAG和CyaAd1245-1273/FLAG這兩種情況中，CyaA的氨基酸510至515或1245至1273分別被缺失并被插入的FLAG表位所替代)。如圖7所示，在位于殘基1166-1281之間的3個(gè)不同位點(diǎn)插入FLAG表位完全消除了與CD11b的相互作用。當(dāng)以30nM的濃度進(jìn)行測試時(shí)，相應(yīng)的修飾的CyaA基本上不能與CyaA-生物素競爭結(jié)合CD11b。相反，所有其他的以FLAG標(biāo)記的重組CyaA均能夠與CyaA-生物素競爭結(jié)合CD11b+細(xì)胞，但具有不同的效率。引人注目地，這3種在靠近蛋白質(zhì)的羧基末端(即1416位、1623位和1648位)插入FLAG表位的重組CyaA構(gòu)建體與CyaA-生物素競爭結(jié)合CD11b的能力也部分受損。為了進(jìn)一步表征與CD11b相互作用的CyaA結(jié)構(gòu)域，除了被發(fā)現(xiàn)能夠與完整的CyaA同樣有效地結(jié)合CD11+細(xì)胞的4種CyaA/FLAG分子以外，我們集中研究了這3種不能抑制CyaA-生物素與CD11b+細(xì)胞的結(jié)合的CyaA/FLAG分子。這些CyaA分子同樣被表達(dá)并純化至接近均質(zhì)(圖8A)，并通過分析其穿透綿羊紅細(xì)胞膜(RBC)的能力以及將催化結(jié)構(gòu)域輸送至細(xì)胞外加入的胰蛋白酶所無法達(dá)到的區(qū)室的能力而測定其細(xì)胞侵襲活性。如圖8B所示，除了CyaA1387/FLAG，所有其他經(jīng)測試的CyaA/FLAG分子的侵襲活性均在一定程度上受到插入FLAG肽的影響。CyaA524/FLAG的侵襲活性反映了CyaA將催化結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)移至紅細(xì)胞內(nèi)的能力，在殘基524處插入FLAG肽完全消除了CyaA524/FLAG的侵襲活性。而CyaA424/FLAG、CyaA722/FLAG和CyaA1166/FLAG等其他蛋白質(zhì)以及(在較小程度上)CyaAA1245-1273/FLAG和CyaA1281/FLAG蛋白質(zhì)的穿透進(jìn)入RBC的能力則是相當(dāng)?shù)摹Ｈ鐖D9所示，以劑量依賴性方式測試了這些分子與CyaA-生物素競爭結(jié)合CHO-CD11b細(xì)胞的能力。如預(yù)期的，CyaA1166/FLAG、CyaAA1245-1273/FLAG、和CyaA1281/FLAG蛋白質(zhì)不能抑制CyaA-生物素與CD11b+細(xì)胞的結(jié)合，甚至在濃度高達(dá)240nM仍是如此。相反，所有其他CyaA/FLAG構(gòu)建體均以劑量依賴性方式抑制了CyaA-生物素的結(jié)合，與完整的CyaA相似。因此，CyaA1166/FLAG、CyaAA1245-1273/FLAG和CyaA1281/FLAG對結(jié)合缺乏抑制作用的原因不能歸結(jié)于由FLAG插入所引起的一般性的構(gòu)象破壞，這是因?yàn)檫@些構(gòu)建體對RBC的侵襲活性與CyaA424/FLAG蛋白相當(dāng)，而后者可非常高效地與CD11b+細(xì)胞相互作用。綜上所述，這些結(jié)果提供的證據(jù)是引人注目的，其說明由殘基1166和1281所劃定的、并包含位于兩個(gè)保守性RTX重復(fù)模塊(Osicka等，2000)之間的一個(gè)推定的環(huán)(殘基1208-1243)的CyaARTX重復(fù)結(jié)構(gòu)域部分對于CyaA與CD11b+細(xì)胞的相互作用是至關(guān)重要的，且其最有可能代表CyaA的主要整聯(lián)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。C.討論腺苷酸環(huán)化酶毒素(ACT或CyaA)的生物學(xué)活性完全依賴于共價(jià)性的翻譯后脂肪酰化作用。在保守性Lys-983殘基沒有?；那闆r下，CyaA不能將其催化結(jié)構(gòu)域輸送至紅細(xì)胞內(nèi)，因此不能形成溶血通道(Barry等，1991；Basar等，2001；Hackett等，1994)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CyaA能夠以可檢測到的功效穿透許多種真核細(xì)胞。但是，已經(jīng)證實(shí)其主要的靶細(xì)胞是髓性細(xì)胞例如中性粒細(xì)胞和肺巨噬細(xì)胞，這些細(xì)胞對CyaA特別敏感，暴露于CyaA后會(huì)失去功能并發(fā)生凋亡(ConferandEaton，1982；KhelefandGuiso，1995；Khelef等，1993)。最近，我們確實(shí)發(fā)現(xiàn)該毒素具有特異性細(xì)胞受體，一種αMβ2整聯(lián)蛋白(CD11b/CD18)，其僅表達(dá)于免疫細(xì)胞例如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞，且這些細(xì)胞對CyaA高度敏感的原因最有可能是其表達(dá)CD11b(Guermonprez等，2001)。在本研究中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)CyaA酰化在其與CD11b+細(xì)胞的相互作用中具有主要的作用。的確，盡管非?；膒roCyaA能夠與CyaA同樣有效地結(jié)合CD11b+細(xì)胞，但其不能有效地與?；腃yaA競爭結(jié)合CHO-CD11b+細(xì)胞，且完全不能阻斷抗CD11bMab與這些細(xì)胞的結(jié)合。這提示，盡管其仍然能夠與CD11b相互作用，但相互作用的性質(zhì)且特別是proCyaA-CD11b復(fù)合體的親和力和/或穩(wěn)定性顯著不同于成熟CyaA與CD11b的相互作用。此外，盡管proCyaA仍然能夠結(jié)合CD11b受體，但這種相互作用無法使得該前毒素穿透膜。因此，可能需要進(jìn)行?；垣@得能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)移的CyaA構(gòu)象，而這是將催化結(jié)構(gòu)域輸送至細(xì)胞漿并在其中催化ATP轉(zhuǎn)換為cAMP所必需的。在功能上，CyaA可分為兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)域一個(gè)具有腺苷酸環(huán)化酶活性結(jié)構(gòu)域，位于殘基1至400之間，另一個(gè)負(fù)責(zé)溶血活性，位于殘基400至1706內(nèi)(LadantandUllmann，1999)。毒素與靶細(xì)胞發(fā)生相互作用后，催化結(jié)構(gòu)域可被直接轉(zhuǎn)移通過紅細(xì)胞的漿膜。本發(fā)明的數(shù)據(jù)說明，盡管催化結(jié)構(gòu)域通過催化將ATP轉(zhuǎn)換為cAMP而在CyaA的細(xì)胞毒活性中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但該結(jié)構(gòu)域并不是CyaA與其受體相結(jié)合所必需的。這些結(jié)果進(jìn)一步說明，CyaA/CD11b相互作用結(jié)構(gòu)域位于溶血素部分，且更確切地位于包括1166至1281位殘基的富含甘氨酸和天冬氨酸的RTX重復(fù)區(qū)域的部分，正如在對與CD11b+細(xì)胞的結(jié)合具有顯著影響的構(gòu)建體中FLAG表位的插入位點(diǎn)所描繪的。具體而言，插入兩個(gè)RTX重復(fù)模塊之間的并包括殘基1208至1243的一個(gè)推定的環(huán)結(jié)構(gòu)(Osicka等，2000)，可能在CyaA與CD11b+細(xì)胞的相互作用至具有關(guān)鍵的作用。CyaA1166/FLAG、CyaAΔ1245-1273和CyaA1281/FLAG構(gòu)建體分別缺乏與CD11b的相互作用，可能是由于一些結(jié)構(gòu)上的改變，所述結(jié)構(gòu)上的改變選擇性地影響了特異性參與CyaA蛋白與CD11b的相互作用的、一種在功能上至關(guān)重要的節(jié)段。這是十分合理的，因?yàn)樗?種不能結(jié)合CD11b的構(gòu)建體在紅細(xì)胞上的替代分析系統(tǒng)中仍然顯示出明顯的細(xì)胞侵襲活性(相當(dāng)于完整CyaA的20％至50％)，其中毒素活性不依賴于與CD11b的相互作用。這提示FLAG插入位置1166、1245和1281并沒有損害CyaA的總體結(jié)構(gòu)，但相當(dāng)選擇性地消除了這些構(gòu)建體與CD11b+細(xì)胞相互作用的能力。總之，這些結(jié)果提示CyaA的殘基1166至1281描繪了參與毒素與αMβ2整聯(lián)蛋白(CD11b/CD18)的相互作用的整聯(lián)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵部分。這一結(jié)論能夠得到如下結(jié)果的支持，即所有在CyaA的前800個(gè)殘基內(nèi)插入FLAG肽的CyaA變體可與生物素?；耐暾腃yaA充分競爭結(jié)合CD11b。相反，蛋白質(zhì)CyaA1416/FLAG、CyaA/FLAG1623和CyaA/FLAG1648的CD11b結(jié)合能力也有所降低，這提示在毒素的RTX重復(fù)部分羧基末端可能存在CyaA的一種輔助CD11b相互作用結(jié)構(gòu)域。本研究結(jié)果鑒定出區(qū)域1166-1287是CyaA的主要CD11b結(jié)合基序，這為此前觀察到的CyaA與CD11b的結(jié)合是嚴(yán)格鈣依賴性的現(xiàn)象(Guermonprez等，2001)提供了一種有吸引力的解釋。由于RTX結(jié)構(gòu)域參與鈣結(jié)合并在結(jié)合鈣后發(fā)生顯著結(jié)構(gòu)的重排(Rose等，1995)，因此可以推測位于1166-1287這一區(qū)域的CD11b結(jié)合基序可能僅在RTX結(jié)構(gòu)域處于鈣結(jié)合構(gòu)象時(shí)才得以暴露。在此鑒定的位于CyaA的1166-1287位氨基酸區(qū)域中的CD11b結(jié)合基序準(zhǔn)確位于第二和第三個(gè)RTX重復(fù)模塊之間?？梢酝茰y，該節(jié)段的α-螺旋結(jié)構(gòu)參與形成了CD11b的?？课稽c(diǎn)(dockingsite)。CyaA已經(jīng)在小鼠百日咳模型中被用于若干被動(dòng)或主動(dòng)的保護(hù)方案。以抗CyaA特異性抗體或以純化的CyaA進(jìn)行免疫降低了百日咳博德特氏菌在呼吸道建群的時(shí)間并保護(hù)小鼠免于致死性鼻內(nèi)感染(Guiso等，1989；Guiso等，1991)。此外，在感染百日咳博德特氏菌的人類嬰兒的血清中檢測到特異于CyaA的抗體(Arciniega等，1991；Guiso等，1993)。本研究的結(jié)果提示，缺乏CyaA/CD11b相互作用結(jié)構(gòu)域的CyaA分子可被設(shè)計(jì)為用于制備安全的細(xì)胞疫苗以抵抗百日咳博德特氏菌感染。通過在位于CyaA的188和189殘基之間的ATP結(jié)合位點(diǎn)(Fayolle等，1996)插入二肽可容易地滅活這種分子的催化活性，而CD11b相互作用結(jié)構(gòu)域內(nèi)的缺失可保護(hù)免疫細(xì)胞抵抗?jié)撛诘牟涣挤磻?yīng)，例如通過類毒素與整聯(lián)蛋白結(jié)合引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或一些由于與CyaA類毒素競爭結(jié)合CD11b而產(chǎn)生的功能性干擾，CyaA類毒素也可作為補(bǔ)體受體CR3?？傊景l(fā)明的結(jié)果為百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的?；筒煌Y(jié)構(gòu)域在其與CD11b+細(xì)胞相互作用中的作用以及在由這種相互作用隨后所引起的生物學(xué)活性中的作用提供了重要的新的認(rèn)識(shí)。參考文獻(xiàn)Altieri，D.C.andEdgington，T.S.(1988)ThesaturablehighaffinityassociationoffactorXtoADP-stimulatedmonocytesdefinesanovelfunctionoftheMac-1receptor.JBiolChem，263，7007-7015.Arciniega，J.L.，Hewlett，E.L.，Johnson，F(xiàn).D.，Deforest，A.，Wassilak，S.G.，Onorato，I.M.，Manclark，C.R.andBurns，D.L.(1991)Humanserologicresponsetoenvelope-associatedproteinsandadenylatecyclasetoxinofBordetellapertussis.JInfectDis，163，135-142.Arnaout，M.A.(1990)StructureandfunctionoftheleukocyteadhesionmoleculesCD11/CD18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laGlyAsnAsp156515701575AspLeuPheGlyGlyGlnGlyAspAspThrTyrLeuPheGlyAla158015851590GlyTyrGlyHisAspThrIleTyrGluSerGlyGlyGlyHisAsp159516001605ThrIleArgIleAsnAlaGlyAlaAspGlnLeuTrpPheAlaArg161016151620GlnGlyAsnAspLeuGluIleArgIleLeuGlyThrAspAspAla162516301635LeuThrValHisAspTrpTyrArgAspAlaAspHisArgValGlu164016451650AlaIleHisAlaAlaAsnGlnAlaIleAspProAlaGlyIleGlu165516601665LysLeuValGluAlaMetAlaGlnTyrProAspProGlyAlaAla167016751680AlaAlaAlaProProAlaAlaArgValProAspThrLeuMetGln168516901695SerLeuAlaValAsnTrpArg17001705<210>4<211>116<212>PRT<213>Bordetellabronchiseptica<400>4ArgGlyGlyAspAspIleLeuArgGlyGlyLeuGlyLeuAspThrLeu151015TyrGlyGluAspGlyAsnAspIlePheLeuGlnAspAspGluThrVal202530SerAspAspIleAspGlyGlyAlaGlyLeuAspThrValAspTyrSer354045AlaMetIleHisAlaGlyLysIleValAlaProHisGluTyrGlyPhe505560GlyIleGluAlaAspLeuSerGluGlyTrpValArgLysAlaAlaArg65707580ArgGlyMetAspTyrTyrAspSerValArgSerValGluAsnValIle859095GlyThrSerMetLysAspValLeuIleGlyAspAlaGlnAlaAsnThr100105110LeuMetGlyGln115<210>5<211>33<212>DNA<213>primer<400>5gtactgattataaagatgacgatgacaaatcac33<210>6<211>33<212>DNA<213>primer<400>6gtacgtgatttgtcatcgtcatctttataatca33<210>7<211>33<212>DNA<213>primer<400>7gtacttatcgattataaagatgacgatgacaaa33<210>8<211>33<212>DNA<213>primer<400>8gtactttgtcatcgtcatctttataatcgataa33<210>9<211>33<212>DNA<213>primer<400>9gtacgtggattataaagatgacgatgacaaagc33<210>10<211>33<212>DNA<213>primer<400>10gtacgctttgtcatcgtcatctttataatccac3權(quán)利要求1.由博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶組成的蛋白質(zhì)，所述博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域通過一或多個(gè)氨基酸的缺失、取代或插入而被修飾，其中所述蛋白質(zhì)在結(jié)合CD11b/CD18方面具有缺陷，但與識(shí)別野生型博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的抗血清具有特異性反應(yīng)性。2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其中所述博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶通過完全缺失CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域而被修飾。3.權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)，其中所述CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域通過在其中插入一種肽而被修飾。4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，其中所述博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶通過在N末端催化結(jié)構(gòu)域中具有一或多個(gè)氨基酸的插入、缺失或取代而進(jìn)一步被修飾，其中所述修飾的博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶具有的催化活性與野生型博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶活性相比是降低的。5.權(quán)利要求4的蛋白質(zhì)，其中所述博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶通過缺失N末端催化結(jié)構(gòu)域的至少第1至300位氨基酸殘基而被修飾，且優(yōu)選地通過缺失N末端催化結(jié)構(gòu)域的第1至373位氨基酸殘基而被修飾。6.權(quán)利要求4的蛋白質(zhì)，其中所述博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶中被修飾的是發(fā)生翻譯后?；陌被?，這些氨基酸對應(yīng)于百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的Lys983和Lys860。7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，其中所述博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶是百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶。8.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)和藥學(xué)可接受的載體。9.用作疫苗的權(quán)利要求8的組合物，其包含免疫保護(hù)和非毒性量的權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)。10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述組合物還包含一或多種合適的引發(fā)佐劑。11.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)在制備用于預(yù)防或治療人或動(dòng)物的與百日咳相關(guān)的疾病癥狀和/或用于保護(hù)人或動(dòng)物抵抗與博德特氏菌感染相關(guān)的疾病癥狀的藥物中的用途。12.能夠結(jié)合CD11b/CD18的多肽，所述多肽是a.具有30至500個(gè)氨基酸、優(yōu)選地50至300個(gè)氨基酸、且更優(yōu)選地50至150個(gè)氨基酸的博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的片段，所述片段包含所述博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的野生型CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域，或包含所述野生型CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域的足以保留結(jié)合CD11b/CD18的能力的片段，或者b.與所述片段具有至少70％相同性、優(yōu)選地至少80％相同性、且更優(yōu)選地至少90％相同性的所述片段的變體，其中所述變體保留結(jié)合CD11b/CD18的能力。13.權(quán)利要求12的多肽，其中所述多肽能夠增加特異性識(shí)別博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的抗體，優(yōu)選地特異性識(shí)別百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的抗體。14.權(quán)利要求12或13的多肽，其中所述多肽是百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的片段，優(yōu)選地是百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的自1166位氨基酸至1281位氨基酸的片段，且更加優(yōu)選地是包含百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的自1208位氨基酸至1243位氨基酸這一區(qū)域的片段。15.權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)的多肽，其還包含腺苷酸環(huán)化酶的酰化結(jié)構(gòu)域和/或疏水性結(jié)構(gòu)域。16.權(quán)利要求12至15中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽被施用于哺乳動(dòng)物體內(nèi)時(shí)是無毒的。17.權(quán)利要求12至16中任一項(xiàng)的多肽在制備用于預(yù)防或治療人或動(dòng)物的與百日咳相關(guān)的疾病癥狀和/或用于保護(hù)人或動(dòng)物抵抗與博德特氏菌感染相關(guān)的的疾病癥狀的藥物中用途。18.權(quán)利要求12至16中任一項(xiàng)的多肽在制備一種用于將感興趣的分子特異性導(dǎo)向表達(dá)CD11b的細(xì)胞的載體中的用途。19.用于將感興趣的分子導(dǎo)向表達(dá)CD11b/CD18的細(xì)胞的載體，其特征在于所述載體包含權(quán)利要求12至16中任一項(xiàng)的能夠結(jié)合CD11b/CD18的多肽，所述多肽偶聯(lián)于一種感興趣的分子。20.權(quán)利要求19的載體，其中所述感興趣的分子選自肽、糖肽、脂肽、多糖、寡糖、核酸、脂質(zhì)和化合物。21.權(quán)利要求19或20的載體，其中所述感興趣的分子是藥物的有效成分。22.權(quán)利要求19至21中任一項(xiàng)的載體，其中所述感興趣的分子通過化學(xué)連接進(jìn)行偶聯(lián)。23.權(quán)利要求19至22中任一項(xiàng)的載體，其中所述感興趣的分子包含抗原或表位。24.權(quán)利要求23的載體，其中所述感興趣的分子是包含抗原或表位的肽或多肽。25.一種核酸，其編碼以下多肽之一a.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)；b.權(quán)利要求12至16中任一項(xiàng)的多肽；c.權(quán)利要求24的載體。26.通過將權(quán)利要求25的核酸克隆入一種表達(dá)載體中而構(gòu)建的重組核酸，所述表達(dá)載體適合于在宿主細(xì)胞中表達(dá)所編碼的多肽。27.權(quán)利要求26的重組核酸，其中所述表達(dá)載體是質(zhì)粒、粘粒、噬菌?；虿《綝NA。28.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求25的核酸或權(quán)利要求26或27的重組核酸。29.一種藥物組合物，其包含與藥學(xué)上可接受的載體組合的權(quán)利要求12至16中任一項(xiàng)的多肽或權(quán)利要求19至24中任一項(xiàng)的載體。30.藥物組合物，其包含權(quán)利要求23或24的載體，其中所述感興趣的分子是藥物的有效成分。31.權(quán)利要求30的藥物組合物，其中所述組合物是疫苗。32.通過以權(quán)利要求12至16中任一項(xiàng)的多肽或以權(quán)利要求29至31中任一項(xiàng)的組合物免疫動(dòng)物或人而獲得的多克隆血清。33.特異性抗權(quán)利要求12至16的多肽的單克隆抗體。34.權(quán)利要求32的多克隆血清或權(quán)利要求33的單克隆抗體，其中所述多克隆血清或所述單克隆抗體能夠阻斷腺苷酸環(huán)化酶與CD11b/CD18的結(jié)合。35.一種藥物組合物，其包含與藥學(xué)上可接受的載體組合的權(quán)利要求32的多克隆血清或權(quán)利要求33的單克隆抗體。36.權(quán)利要求35的多克隆血清或單克隆抗體在制備一種用于預(yù)防或治療人或動(dòng)物的與百日咳相關(guān)的疾病癥狀和/或用于保護(hù)人或動(dòng)物抵抗與博德特氏菌感染相關(guān)的的疾病癥狀的藥物中用途。37.用于在體外將感興趣的分子導(dǎo)向表達(dá)CD11b的細(xì)胞的方法，所述方法包含a.提供取自活生物體的表達(dá)CD11b的細(xì)胞，b.將所述表達(dá)CD11b的細(xì)胞與權(quán)利要求19至24中任一項(xiàng)的載體在適合于將所述載體導(dǎo)向所述表達(dá)CD11b的細(xì)胞的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述感興趣的分子包含抗原或表位。39.權(quán)利要求37或38的方法，其中所述表達(dá)CD11b的細(xì)胞是髓性樹突狀細(xì)胞。40.通過權(quán)利要求37至39中任一項(xiàng)的方法獲得的包含感興趣的分子的表達(dá)CD11b的細(xì)胞。41.通過權(quán)利要求38的方法獲得的包含抗原或表位的表達(dá)CD11b的細(xì)胞。42.用于針對一種抗原而免疫人或動(dòng)物的細(xì)胞治療產(chǎn)品，其特征在于包含與藥學(xué)可接受的載體組合的有效量的權(quán)利要求41的表達(dá)CD11b的細(xì)胞。43.權(quán)利要求41的表達(dá)CD11b的細(xì)胞在制備用于針對一種抗原而免疫人或動(dòng)物的細(xì)胞治療產(chǎn)品中的用途。44.用于針對一種抗原而免疫患者的方法，所述方法包含，a.自所述患者提取表達(dá)CD11b的細(xì)胞，b.在體外將所述表達(dá)CD11b的細(xì)胞與權(quán)利要求23或24的載體在適合于將所述載體導(dǎo)向所述細(xì)胞的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，c.將有效量的包含所述載體的所述細(xì)胞重新施用至所述患者以引發(fā)CD4+和/或CD8+應(yīng)答，由此針對所述抗原而免疫所述患者。45.權(quán)利要求44的方法，其中所述表達(dá)CD11b的細(xì)胞是髓性樹突狀細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明涉及修飾的博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶毒素，其在結(jié)合CD11b/CD18方面具有缺陷，還涉及其在制備用于治療百日咳和/或用于預(yù)防博德特氏菌感染的藥物組合物中的用途。本發(fā)明還涉及博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的特異性片段，其包含CD11b/CD18相互作用結(jié)構(gòu)域，并涉及其用途，特別是用于將感興趣的分子導(dǎo)向表達(dá)CD11b的細(xì)胞。文檔編號(hào)C12N9/88GK1839152SQ200480023810公開日2006年9月27日申請日期2004年6月18日優(yōu)先權(quán)日2003年6月18日發(fā)明者克洛德·勒克萊爾,穆罕默德·阿扎米伊德里西,達(dá)尼埃爾·拉當(dāng),塞西爾·包切,彼得·塞伯,伊日娜·勞茨卡,拉迪姆·奧西斯卡申請人:巴斯德研究院,國立科學(xué)研究中心