專利名稱：浮萍的葉綠體轉(zhuǎn)化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于浮萍質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法和組合物。
背景技術(shù)：
浮萍(duckweeds)是單子葉科浮萍科(Lemnaceae)的唯一成員。5個屬和38個種都是小的、自由浮動的淡水植物，它們的地理分布跨越全球(Landolt(1986)Biosystematic Investigation on theFamily of DuckweedsThe Family of Lemnaceae-A Monograph StudyGeobatanischen Insitut ETH，Stiftung Rubel，Zurich)。盡管浮萍是已知在形態(tài)上最簡化的植物，不過多數(shù)浮萍種具有大得多的植物的所有組織和器官，包括根、莖、花、種子和葉狀體(fronds)。人們已經(jīng)廣泛地研究了浮萍物種，并且有大量的文獻詳細地記載了它們的生態(tài)學(xué)、系統(tǒng)分類學(xué)、生命周期、代謝、疾病和害蟲易感性、它們的繁殖生物學(xué)、遺傳結(jié)構(gòu)以及細胞生物學(xué)(Hillman(1961)Bot.Review27221；Landolt(1986)Biosystematic Investigation on theFamily of DuckweedsThe Family of Lemnaceae-A Monograph StudyGeobatanischen Institut ETH，Stiftung Rubel，Zurich)。
浮萍的生長習(xí)性對微生物培養(yǎng)方法而言是理想的。通過新葉狀體的無性出芽植物迅速增殖，在宏觀方式上與酵母的無性增殖相似。通過自分生細胞無性出芽實現(xiàn)這種增殖。分生區(qū)域小而且位于葉狀體腹表面，分生細胞位于兩個葉窩(pockets)中，每個在葉狀體中脈的各一側(cè)。小的中脈區(qū)域也是將每個葉狀體與它們的母葉狀體相接的位點及根的起源位點和莖的發(fā)起位點。組織瓣(tissue flap)保護分生葉窩。葉狀體交替地自這些葉窩出芽。倍增時間因物種而不同，短至20到24小時(Landolt(1957)Ber.Schweiz.Bot.Ges.67271；Chang etal.(1977)Bull.Inst。Chem.Acad.Sin.2419；Datko and Mudd(1970)Plant Physiol.6516；Venkataraman et al.(1970)Z.Pflanzenphysiol.62316)。
浮萍的集約培養(yǎng)可造成在每單位時間最高速率的生物質(zhì)累積(Landolt and Kandeler(1987)The Family of Lemnaceae-AMonographic Study Vol.2Phytochemistry，Physiology，application，Bibliography，Veroffentlichungen desGeobotanischen Institutes ETH，Stiftung Rubel Zurich)，干重累積范圍為濕重的6-15％(Till berg et al.(1979)Physiol.Plant.465；Landolt(1957)Ber.Schweiz.Bot.Ges.67271；Stomp，未公開數(shù)據(jù))。據(jù)報告在不同條件下生長的多種浮萍物種的蛋白質(zhì)含量的范圍為15-45％干重(Chang et al(1977)Bull.Inst.Chem.Acad.Sin.2419；Chang and Chui(1978)Z.Pflanzenphysiol.8991；Porath et al.(1979)Aquatic Botany7272；Appenroth et al.(1982)Biochem.Physiol.Pflanz.177251)。根據(jù)這些值，浮萍每升培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)產(chǎn)量水平與酵母基因表達系統(tǒng)中的數(shù)量級相同。
所以，在浮萍中表達重組蛋白質(zhì)的方法可用于大量的研究和商業(yè)應(yīng)用。對于植物分子生物學(xué)研究，就整體而言，可以如酵母一樣在實驗室便利地操作的一個分化的植物系統(tǒng)提供了非?？斓南到y(tǒng)，在該系統(tǒng)中可以分析分離的基因的發(fā)育和生理學(xué)作用。對于商業(yè)生產(chǎn)有價值的多肽，基于浮萍的系統(tǒng)具有很多超過現(xiàn)有的微生物或者細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)點。植物表現(xiàn)出的翻譯后加工與哺乳動物細胞相似，這克服了微生物細胞生產(chǎn)具有生物學(xué)活性的哺乳動物多肽所涉及的主要問題，而且其他作者顯示(Hiatt(1990)Nature 334469)，植物系統(tǒng)具有組裝多亞基蛋白質(zhì)的能力，通常在微生物系統(tǒng)中缺乏該能力。按比例擴大浮萍生物量至重組蛋白商業(yè)生產(chǎn)所需水平比相似的按比例擴大哺乳動物細胞更快而且更經(jīng)濟有效，而且不像其它推薦的植物生產(chǎn)系統(tǒng)，例如大豆和煙草，浮萍可以在完全被限制和控制的生物質(zhì)生產(chǎn)容器中生長，使該系統(tǒng)整合到已有的蛋白質(zhì)生產(chǎn)工業(yè)基礎(chǔ)設(shè)施中容易得多。
已有對轉(zhuǎn)化浮萍的核基因組的方法的介紹，參見例如美國專利號6040498。可以用含有目的核苷酸序列的表達盒通過包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、粒子轟擊或者電穿孔在內(nèi)的多種方法中的任一方法有效地轉(zhuǎn)化浮萍植物或者浮萍結(jié)節(jié)培養(yǎng)物。不過，尚未見有關(guān)浮萍質(zhì)體基因組的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的介紹。浮萍質(zhì)體的轉(zhuǎn)化將很有優(yōu)勢，因為質(zhì)體基因組在每個葉綠體中有多個拷貝并且在每個細胞中有多個葉綠體，所以使用質(zhì)體基因組轉(zhuǎn)化方法能夠在每個植物細胞獲得大量的整合的轉(zhuǎn)基因。
浮萍系統(tǒng)的特征使之成為開發(fā)用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的有效的、基于植物的系統(tǒng)的理想選擇。所以，本發(fā)明提供用于轉(zhuǎn)化浮萍質(zhì)體的方法和組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明提供具有用1個或者更多異源性核苷酸序列轉(zhuǎn)化的質(zhì)體的浮萍植物以及用于生產(chǎn)這些轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組(transplastomic)的浮萍植物的核酸構(gòu)建體和方法。還提供轉(zhuǎn)化的浮萍質(zhì)體和含有這些轉(zhuǎn)化的質(zhì)體的浮萍細胞。
在某些實施方案中，浮萍植物具有用編碼目的多肽的異源性核苷酸序列轉(zhuǎn)化的質(zhì)體。在其它實施方案中，異源性核苷酸序列編碼1個以上的目的多肽。異源性核苷酸序列可含有可用于選擇轉(zhuǎn)化的浮萍細胞的標(biāo)記多肽的編碼序列。
浮萍植物的用異源性核苷酸序列轉(zhuǎn)化的質(zhì)體可以是前質(zhì)體、造粉體、有色體(chromoplasts)、葉綠體、黃化質(zhì)體(etioplasts)或者白色體(leucoplasts)。
本發(fā)明的核酸構(gòu)建體具有同源于浮萍質(zhì)體基因組序列的第一靶向核苷酸序列；至少一個編碼1個或1個以上目的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列異源于浮萍質(zhì)體基因組；和同源于浮萍質(zhì)體基因組序列的第二靶向序列。在某些實施方案中，核酸構(gòu)建體含有可操作地連接于編碼目的多肽的核苷酸序列的表達調(diào)控序列。
在某些實施方案中，用于葉綠體轉(zhuǎn)化的核酸構(gòu)建體具有可增加在浮萍中目的多肽的翻譯效率的核苷酸序列。核酸構(gòu)建體還可以含有一個或者更多個可操作地連接于編碼目的多肽的序列的轉(zhuǎn)錄終止序列。
本發(fā)明提供用于把一個或者更多個異源性核苷酸序列導(dǎo)入到浮萍質(zhì)體基因組中的方法。該方法包括以用于葉綠體轉(zhuǎn)化的核酸構(gòu)建體轟擊浮萍組織的步驟，其中的核酸構(gòu)建體吸收于微粒，并且在可促進核酸構(gòu)建體導(dǎo)入到質(zhì)體基因組中的條件下進行所述轟擊。在某些實施方案中，異源性核苷酸序列被導(dǎo)入到浮萍葉綠體基因組中。
本發(fā)明還提供了用于獲得轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組的浮萍植物的方法。該方法包括在一定條件下以吸收于微粒的用于葉綠體轉(zhuǎn)化的核酸構(gòu)建體轟擊浮萍組織，以使用于葉綠體轉(zhuǎn)化的核酸構(gòu)建體被導(dǎo)入到浮萍組織的至少一個質(zhì)體中的步驟和從浮萍組織再生浮萍植物的步驟。在某些實施方案中，核酸構(gòu)建體包括賦予浮萍組織選擇性表型的選擇性標(biāo)記序列，而且浮萍組織在轉(zhuǎn)化后被保持在選擇性培養(yǎng)基中，其中選擇性培養(yǎng)基優(yōu)選可促進具有用選擇性標(biāo)記序列轉(zhuǎn)化的質(zhì)體的浮萍細胞的生存。


圖1顯示浮萍屬(Lemna)葉綠體基因組16S到23S rRNA區(qū)域的示意圖。詳細內(nèi)容參見實驗部分。
圖2顯示表達載體pBCT01的示意圖。詳細內(nèi)容參見實驗部分。
圖3顯示PCR引物71、248、210和234在pBCT01轉(zhuǎn)基因區(qū)域中的定位。這些引物用于證實pBCT01轉(zhuǎn)基因整合到浮萍葉綠體中。詳細內(nèi)容參見實驗部分。
圖4顯示表達載體pBCT04的結(jié)構(gòu)示意圖。詳細內(nèi)容參見實驗部分。
發(fā)明詳述質(zhì)體是在進行光合作用的植物細胞中發(fā)現(xiàn)的細胞器，而且其在氨基酸、復(fù)合糖、脂肪酸以及色素的生物合成中具有重要作用。有幾種類型的分化植物質(zhì)體，包括造粉體、有色體、葉綠體、黃化質(zhì)體和白色體。所有的這些質(zhì)體衍生自未分化的名為前質(zhì)體的前體質(zhì)體。葉綠體是最常見的質(zhì)體，而且是植物細胞的光合作用位點。每個光合作用植物細胞含有多個葉綠體，典型地每個細胞有50到100個。葉綠體具有它們自己的基因組(名為質(zhì)體基因組的環(huán)狀DNA分子)。每個葉綠體含有多個質(zhì)體基因組拷貝，典型地為50～100個拷貝。
植物質(zhì)體基因組已經(jīng)成為用于導(dǎo)入外來轉(zhuǎn)基因的靶，因為與轉(zhuǎn)化植物細胞核相比，來自轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組(稱為轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組(transplastomes))的轉(zhuǎn)基因的表達具有數(shù)個優(yōu)點。具體而言，由于在每個葉綠體中有多個質(zhì)體基因組拷貝，而且在每個細胞中有多個葉綠體，使用質(zhì)體基因組轉(zhuǎn)化的方法能在每個植物細胞中獲得大量的整合的轉(zhuǎn)基因。與相同的轉(zhuǎn)基因整合到植物細胞核基因組的表達水平相比，這能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因的更高水平的表達。
由于植物質(zhì)體是用于遺傳工程的引人注意的靶點，所以本發(fā)明提供用于浮萍質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法和組合物。本發(fā)明的組合物和方法可用于增加浮萍表達系統(tǒng)的重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)能力。本發(fā)明的組合物包括轉(zhuǎn)化的浮萍質(zhì)體、轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組的浮萍細胞及植物和用于轉(zhuǎn)化浮萍質(zhì)體的核酸構(gòu)建體。本發(fā)明還提供了用于把1個或者更多個異源性核苷酸序列導(dǎo)入到浮萍質(zhì)體基因組中的方法。下面對本發(fā)明組合物和方法進行詳述。
定義術(shù)語“表達”或者“生產(chǎn)”指的是基因產(chǎn)物的生物合成，包括基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄、翻譯和組裝。術(shù)語“浮萍(duckweed)”指的是浮萍科成員。目前該科把浮萍分成如下5個屬和38個種浮萍屬(Lemna)(L.aequinoctialis，L.disperma，L.ecuadoriensis，L.gibba，L.japonica，L.minor，L.miniscula，L.obscura，L.perpusilla，L.tenera，L.trisulca，L.turionifera，L.valdiviana)；紫萍屬(Spirodela)(S.intermedia，S.polyrrhiza)；無根萍屬(Wolffia)(Wa.angusta，Wa.arrhiza，Wa.australina，Wa.borealis，Wa.brasiliensis，Wa.columbiana，Wa.elongata，Wa.globosa，Wa.microscopica，Wa.neglecta)、Wolfiella屬(Wl.caudata，Wl.denticulata，Wl.gladiata，Wl.hyalina，Wl.lingulata，Wl.repunda，Wl.rotunda和Wl.neotropica)和Landoltia屬(L.punctata)。任何其它的浮萍科的屬或種，如果它們存在，則也包括在本發(fā)明中。使用Les等(2002)Systematic Botany 27221-40所述的分類學(xué)方法能對浮萍屬的種進行分類。
用于此處的術(shù)語“浮萍結(jié)節(jié)(duckweed nodule)”指的是包含浮萍細胞的浮萍組織，其中至少大約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或者100％的細胞是分化細胞。用于此處的“分化細胞”是具有至少一個可把它與未分化細胞或者與在其它組織類型中的細胞區(qū)別開的表型特征(例如與眾不同的細胞形態(tài)或者標(biāo)記核酸或蛋白質(zhì)的表達)的細胞。此處所述浮萍結(jié)節(jié)培養(yǎng)物的分化細胞形成在鄰近的細胞壁上融合的互連細胞的覆瓦狀平滑表面，結(jié)節(jié)已開始組織成散布于整個組織的葉狀體原基。結(jié)節(jié)培養(yǎng)物組織的表面具有通過胞間連絲(plasmadesmata)彼此連接的表皮細胞。
在提及核苷酸序列時使用的“可操作地連接”指的是多個核苷酸序列被置于相互具有功能關(guān)系的位置。通常，可操作地連接的DNA序列是連續(xù)的、并且如果必需的話符合閱讀框地連接2個蛋白質(zhì)編碼區(qū)。例如，當(dāng)表達調(diào)控序列位于使它可調(diào)節(jié)編碼目的多肽的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄的位置時，表達調(diào)控序列可操作地連接于編碼目的多肽的核苷酸序列。在另一個例子中，當(dāng)靶向核苷酸序列位于使它能與在靶基因組序列的靶位點同源地重組的位置，以致該表達盒被轉(zhuǎn)移到靶基因組序列中時，靶向核苷酸序列可操作地連接于表達盒。
此處所用的核苷酸序列是“異源于浮萍質(zhì)體基因組的”指的是核苷酸序列不是它所整合到的受體質(zhì)體基因組天然具有的。
A.質(zhì)體本發(fā)明中將要轉(zhuǎn)化的浮萍質(zhì)體可以來自任何細胞類型，并且可以處于分化或者未分化狀態(tài)?？梢允褂玫母∑假|(zhì)體的例子包括未分化的前質(zhì)體、造粉體、有色體、葉綠體、黃化質(zhì)體和白色體。
質(zhì)體包含它們自己的基因組(稱為“質(zhì)體基因組”)。典型地，單個質(zhì)體包含多個質(zhì)體基因組，最典型的為每個質(zhì)體有50到100個質(zhì)體基因組?？梢杂帽景l(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組稱作“受體質(zhì)體基因組”，而已經(jīng)用異源性核苷酸序列轉(zhuǎn)化的受體質(zhì)體基因組稱作“轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組的(transplastomic)”。在某些實施方式中，轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組的質(zhì)體的所有質(zhì)體基因組基本上相同，即，它們都含有轉(zhuǎn)化核酸分子的編碼區(qū)域，并且優(yōu)選含有任何有關(guān)的表達調(diào)控序列，或者至少足夠促進編碼序列表達的任何表達調(diào)控序列。這種轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組的質(zhì)體、含有這種質(zhì)體的細胞和植物被稱為“同轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組的(homotransplastomic)”。
在某些實施方案中，轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組的質(zhì)體是用異源核苷酸序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的。當(dāng)可以在一段時期內(nèi)檢測到異源性核苷酸序列，表明異源性核苷酸序列被質(zhì)體基因組所保持時，顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)化了浮萍質(zhì)體。檢測重組的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，包括例如使用可以檢測異源性核苷酸序列的探針的Southern分析，或者通過PCR擴增轉(zhuǎn)基因。
B.質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體1.表達盒根據(jù)本發(fā)明，可以通過用含有包含在表達盒內(nèi)的編碼目的多肽的核苷酸序列的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化的浮萍質(zhì)體。該表達盒含有可操作地連接到編碼目的多肽的核苷酸序列的表達調(diào)控序列。在本發(fā)明的某些實施方案中，將要導(dǎo)入到浮萍質(zhì)體中的核酸分子含有2個或者更多個表達盒，其中每個編碼至少一個目的多肽。
表達調(diào)控序列可以含有1個或者更多個啟動子序列、1個或者更多個增強子序列或者同時含有啟動子和增強子序列。表達調(diào)控序列可以對于目的核苷酸序列為天然的或者外源的。所說的“天然的”指的是表達調(diào)控序列在野生型基因組中可操作地連接于編碼目的多肽的核苷酸序列。所說的“外源的”指的是表達調(diào)控序列在野生型基因組中不是可操作地連接于編碼目的多肽的核苷酸序列。
表達調(diào)控序列可以衍生自任何生物，只要它們能促進浮萍質(zhì)體中的序列的轉(zhuǎn)錄。植物質(zhì)體啟動子的例子包括但是不局限于來自psbA基因、rbcL基因或者atpB rRNA的啟動子，以及rRNA啟動子諸如來自煙草的16S rRNA啟動子序列。參見Boyton et al.(1988)Nature2401534-1538；Daniell et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8788-92和Sriramn et al.(1998)Plant physiol.1171495-1499；在此處引入其全部內(nèi)容作為參考。示例性的啟動子還包括但是不局限于在Zurawski et al.(1981)Nucleic Acids Res.93251-3270；Zurawski et al.(1982)797699-7703；Krebbers etal.(1982)Nucleic Acids Res.104985-5002.Mullet et al.(1985)Plant Molec.Biol.439-54；Hanley-Bowdoin and Chua(1989)，Mol.Gen.Genet.215217-24；Svab et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 878526-8530；以及Svab and Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90913-17中所述的那些，此處引入其全部內(nèi)容作為參考。還可以通過重組技術(shù)或者通過其它合成手段生成本發(fā)明的表達調(diào)控序列。參見例如NCBI登錄號，AJ276677和ABA276676，此處引入作為參考。
可以選擇表達調(diào)控序列以提供想要的調(diào)節(jié)水平。例如在某些情況中，使用在應(yīng)答特定的環(huán)境刺激(例如熱休克基因啟動子、干旱誘導(dǎo)性基因啟動子、病原誘導(dǎo)性基因啟動子、創(chuàng)傷誘導(dǎo)性基因啟動子和光/暗誘導(dǎo)性基因啟動子)或者植物生長調(diào)節(jié)劑(例如來自用脫落酸、植物生長素、細胞分裂素和赤霉酸誘導(dǎo)的基因的啟動子)時被激活的表達調(diào)控序列可能是有利的。例如用光調(diào)節(jié)表達的基因的表達調(diào)控序列可以用來賦予光調(diào)節(jié)表達。這類基因的例子包括SSU或者葉綠素A/B結(jié)合蛋白基因。參見例如Shiina et al.(1997)Plantphysiol.115477-483和Eilenberg et al.(1998)Planta 206204-14，其全部內(nèi)容引入此處作為參考。
其它的誘導(dǎo)性啟動子也可以用于本發(fā)明。參見，例如美國專利號5925806，其全部內(nèi)容引入此處作為參考。該專利介紹了用于誘導(dǎo)整合在質(zhì)體基因組中的轉(zhuǎn)基因的表達的系統(tǒng)。該方法包括用在組成型或者誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控下的編碼病毒RNA聚合酶的序列轉(zhuǎn)化植物的細胞核，并且把轉(zhuǎn)基因?qū)氲皆撝参锏馁|(zhì)體中，其中轉(zhuǎn)基因可操作地連接于病毒RNA聚合酶特異的啟動子上。然后可以通過誘導(dǎo)該植物的細胞核中的病毒RNA聚合酶的表達誘導(dǎo)該質(zhì)體轉(zhuǎn)基因的表達。
可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)鑒定其它指導(dǎo)浮萍質(zhì)體中轉(zhuǎn)錄的啟動子。例如候選啟動子序列可以被插入到與缺少表達調(diào)控序列的標(biāo)記序列相鄰的位置，然后可以用該表達盒轉(zhuǎn)化浮萍質(zhì)體。之后可以用該標(biāo)記序列的表達水平確定啟動子在浮萍質(zhì)體中的強度。增加核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄效率的方法在本領(lǐng)域是公知的。這樣的方法包括例如多個啟動子串連插入到表達盒中以及添加增強子序列到表達盒中。
表達盒也可以包括轉(zhuǎn)錄終止序列。根據(jù)本發(fā)明，可以使用任何本領(lǐng)域公知的適當(dāng)?shù)慕K止序列。終止區(qū)域可以是轉(zhuǎn)錄起始區(qū)天然的、可以是目的核苷酸序列天然具有的，或者可以衍生自另外的來源。示例性的轉(zhuǎn)錄終止序列包括psbA終止序列和rps16終止序列。其它適當(dāng)?shù)慕K止序列對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是明顯的。
表達盒可以含有多于1個的靶向于整合到質(zhì)體基因組中的編碼序列。在某些實施方案中，每個核苷酸序列將被可操作地連接于1個或者更多個表達調(diào)控序列和轉(zhuǎn)錄終止序列?；蛘?，可以提供多個表達盒。
質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體典型地含有包含編碼目的多肽的核苷酸序列的表達盒。目的多肽可以是任意多肽，例如胰島素、生長激素、α-干擾素、β-干擾素、β-葡糖腦苷脂酶、β-葡糖醛酸糖苷酶(β-glucoronidase)、成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白、p53蛋白質(zhì)、制管張素、苗條蛋白(leptin)、促紅細胞生成素、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、血纖維蛋白溶酶原、單克隆抗體、片段抗原結(jié)合(Fab)片段、細胞因子、受體、人疫苗、動物疫苗、植物多肽、肽和血清白蛋白。本發(fā)明不局限于任何特定的目的多肽的表達。
在某些實施方案中，浮萍質(zhì)體基因組是被工程化的，使之可生產(chǎn)多聚體蛋白質(zhì)(例如單克隆抗體、血紅蛋白、P450氧化酶以及膠原等)。用于在浮萍中生產(chǎn)具有生物活性的多聚體蛋白質(zhì)的一個示例性方法使用含有編碼多肽所有亞基的基因的葉綠體轉(zhuǎn)化載體。參見例如During et al.(1990)plant Mol.Biol.15281和van Engelen etal.(1994)Plant Mol.Biol.261701。然后使用在本文的其它部分所述的方法將該載體導(dǎo)入到浮萍質(zhì)體基因組中。該方法造成在克隆的浮萍細胞或者植物系中表達組裝多聚體蛋白質(zhì)所必需的所有多肽。在某些例子中，例如，為了工業(yè)化或者化學(xué)工藝或者為了診斷、治療或者接種疫苗的目的，可能希望在轉(zhuǎn)化的浮萍植物或者浮萍結(jié)節(jié)培養(yǎng)物中生產(chǎn)比多聚體蛋白質(zhì)的全部亞基少的、或者甚至是單個的蛋白質(zhì)亞基。
在某些實施方案中，質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體包括含有編碼可以用于選擇轉(zhuǎn)化的細胞或者組織的選擇性標(biāo)記多肽的核苷酸序列的表達盒。標(biāo)記多肽包括賦予抗生素抗性的以及賦予除草劑化合物抗性的那些。除草劑抗性基因通常編碼修飾的對除草劑不敏感的目的蛋白質(zhì)或者在除草劑能發(fā)揮作用前在植物中降解或者解毒除草劑的酶。參見DeBlock et al.(1987)EMBO J.62531；DeBlock et al.(1989)Plantphysiol.91691；Fromm et al.(1990)BioTechnology 8833；Gordon-Kamm et al.(1990)Plant Cell 2603。例如使用編碼突變的靶酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)以及乙酰乳酸合酶(ALS)的基因獲得了對甘膦酸酯類(glyphosphate)或者磺酰脲類(sulfonylurea)除草劑的抗性。使用編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphinothricin acetyltransferase)(一種腈水解酶)或者2，4-二氯苯氧乙酸單加氧酶的細菌基因(二者使各自除草劑脫毒)獲得了對草銨膦、溴苯腈(boromoxynil)以及2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的抗性。
為了本發(fā)明的目的，標(biāo)記序列包括但是不局限于編碼氨基糖苷3’-腺苷?；D(zhuǎn)移酶(參見，例如Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90913-917)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(Fraleyet al.(1986)CRC Critical Reviews in Plant Science 41)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶III、氨腈水合酶(Maier-Greiner et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 884250)、天冬酰胺激酶、二氫吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)合酶(Perl et al.(1993))BioTechnology11715)、bar基因(Toki et al.(1992)Plant physiol.1001503；Meagher et al.(1996)Crop Sci.361367)、色氨酸脫羧酶(Goddijnet al.(1993)Plant Mol.Biol.22907)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NEO；Southern et al.(1982)J.Mol.Appl.Gen.1327)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT或HYG；Shimizu et al.(1986)Mol.Cell.Biol.61074)、二氫葉酸還原酶(DHFR；Kwok et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA834552)、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(DeBlock et al.(1987)EMBOJ.62513)、2，2-二氯丙酸脫鹵酶(Buchanan-Wollatron et al.(1989).J.Cell.Biochem.13D330)、乙酰羥酸合酶(美國專利號4761373，Anderson et al.；Haughn et al.(1988)Mol.Gen.Genet.221266)、5-烯醇式丙酮酰莽草酸磷酸合酶(AroA；Comai etal.(1985)Nature 317741)、鹵代芳基腈水解酶(haloarylnitrilase)(WO 87/04181，Stalker et al.)、乙酰輔酶A羧化酶(Parker etal.(1990)Plant Physiol.921220)、二氫蝶酸合酶(sulI；Guerineauet al.(1990)Plant Mol.Biol.15127)和32kDa光系統(tǒng)II多肽(psbA；Hirschberg et al.(1983)Science 2221346(1983))的核苷酸序列。
還包括編碼對慶大霉素(例如aacC1，Wohlleben etal.(1989)Mol.Gen.Genet.217202-208)、氯霉素(Herrera-Estrellaet al.(1983)EMBO J.2987)、氨甲蝶呤(Herrera-Estrella et al.(1983)Nature 303209；Meijer et al.(1991)PlantMol.Biol.16807)、潮霉素(Waldron et al.(1985)PlantMol.Biol.5103；Zhijian et al.(1995)Plant Science108219；Meijer et al.(1991)Plant Mol.Bio.16807)、鏈霉素(Maliga et al.(1973)Nature 255401-402；Etzold etal.(1987)FEBS Lett.219343-346；以及Fromm et al.(1989)PlantMol.Biol.12499-505)大觀霉素(Fromm et al.(1987)EMBO J63233-3237)、林可霉素(Cseplo和Maliga(1984)Mol.Gen.Genet.196407-412；Cseplo et al.(1988)Mol.Gen.Genet.214295-299、博來霉素(Hille et al.(1986)Plant Mol.Biol.7171)、磺胺(Guerineau et al.(1990)Plant Mol.Bio.15127)、溴苯腈(Stalkeret al.(1988)Science 242419)、2，4-D(Streber et al.(1989)BioTechnology 7811)、膦絲菌素(DeBlock et al.(1987)EMBO J.62513)；大觀霉素(Bretagne-Sagnard和Chupeau，TransgenicResearch 5131)的抗性的基因。
bar基因賦予對草銨膦(glufosinate)型除草劑諸如膦絲菌素(PPT)或者雙丙氨酰膦等的除草劑抗性。如上所述，其它的可以用于載體構(gòu)建體的選擇性標(biāo)記包括但是不局限于用于耐受雙丙氨酰膦和膦絲菌素的pat、耐受咪唑啉酮類的ALS、耐受潮霉素的HPH或者HYG、耐受草甘膦(Glyphosate)的EPSP合酶、耐受Hc毒素的Hml、耐受二苯醚(DPE)類除草劑諸如乙氧氟草醚(oxyfluorfen)的protophoryinogen氧化酶和它的變體以及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的和常規(guī)使用的其它選擇性試劑。參見Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3506；Chistopherson Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896314；Yao et al.(1992)Cell 7163；Reznikaff(1992)Mol.Microbiol.62419；Barkley et al.(1980)The Operon 177-220；Hu etal.(1987)Cell 48555；Brown et al.(1987)Cell 49603；Figge etal.(1988)Cell 52713；Deuschle et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 865400；Fuerst et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 862549；Deuschle et al.(1990)Science 248480；Labow etal.(1990)Mol.Cell.Biol.103343；Zambretti et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 893952；Baim et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 885072；Wyborski et al.(1991)Nuc.AcidsRes.194647；Hillenand-Wissman(1989)Topics in Mol.And Struc.Biol.10143；Degenkolb et al.(1991)Antimicrob.AgentsChemother.351591；Kleinschnidt et al.(1988)Biochemistry271094；Gatz et al.(1992)Plant J.2397；Gossen et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895547；Oliva et al.(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36913；Hlavka et al.(1985)Handbook of Experimental Pharmacology 78；Gill et al.(1988)Nature 334721，美國專利號6282837、6288306以及5767373、PCT申請WO0112825以及美國專利申請20010016956。引入這些公開內(nèi)容于此作為參考。
另一個用于本發(fā)明的標(biāo)記多肽的例子是甜菜醛脫氫酶(BADH)。該酶催化毒性甜菜醛轉(zhuǎn)化成無毒的甘氨酸甜菜堿(一種滲透壓保護劑(osmoprotectant))。參見Daniell H.et al.(2001)CurrentGenetics 39109-16)。
上述列出選擇性標(biāo)記序列的用意不在于限定。在本發(fā)明中可以使用任何選擇性標(biāo)記序列。
本發(fā)明提供用于對表達的核苷酸序列的修飾以提高其在浮萍中的表達。一種這樣的修飾是使用質(zhì)體偏好的密碼子合成目的核苷酸序列。例如已顯示，在某些情況下，具有腺嘌呤/胸腺嘧啶含量大于50％的轉(zhuǎn)基因在質(zhì)體中可比具有低含量的腺嘌呤/胸腺嘧啶的轉(zhuǎn)基因更有效地表達。參見，例如美國專利號5545817，引入此處作為參考。合成具有改變的密碼子使用的核苷酸序列的方法是本領(lǐng)域公知的。參見例如美國專利號5380831和5436391，Perlak et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 153324；Iannacome et al.(1997)PlantMol.Biol.34485和Murray et al.，(1989)NucleicAcids.Res.17477，引入此處作為參考。還可以想到基因序列的全部或者任意部分可以被優(yōu)化或者合成。換而言之，也可以使用全部優(yōu)化或者部分優(yōu)化的序列。也可以對目的核苷酸序列進行其它修飾以提高其在浮萍中的表達。這些修飾包括但是不局限于去除假的多聚腺苷酸信號、轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)以及其它這類已很好地表征了的可能對基因表達有害的序列的編碼序列。如果可能，可以修飾序列以避免預(yù)見的mRNA發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)。
2.靶向核苷酸序列本發(fā)明的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體包括第一和第二靶向核苷酸序列(targeting nucleotide sequence)，其中每一個均同源于浮萍質(zhì)體基因組序列。這些靶向核苷酸序列位于表達盒側(cè)翼并且限定將要轉(zhuǎn)移到質(zhì)體基因組的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體區(qū)域的5’和3’末端。靶向核苷酸序列允許通過同源重組使表達盒插入到受體質(zhì)體基因組中。
靶向序列同源于受體質(zhì)體基因組的區(qū)域。典型地，位于表達盒側(cè)翼的靶向核苷酸序列與受體質(zhì)體基因組的被靶向區(qū)域至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或者100％一致，并且能與受體質(zhì)體基因組同源性地重組。
可以使用數(shù)學(xué)運算法則實現(xiàn)兩個序列間的序列比較、一致性百分比以及相似性百分比的測定。在本發(fā)明中，使用GCG軟件包中的GAP程序、采用BLOSUM62記分矩陣(scoring matrix)(參見Henikoff etal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915)以及40、50、60、70或者80的間隙權(quán)重(gap weight)和1、2、3、4、5或者6的長度權(quán)重(length weight)測定兩個核苷酸序列間的一致性百分比。
第一和第二靶向核苷酸序列可以同源于受體質(zhì)體基因組的相同的、重疊的、鄰接的或者獨立的區(qū)域。靶向序列可以同源于受體質(zhì)體基因組的任何區(qū)域，例如包括基因、假基因或者基因間序列的區(qū)域。靶向序列可以設(shè)計成這樣使編碼目的多肽的核苷酸序列被整合到質(zhì)體基因組以致其可操作地連接于1個或者更多浮萍質(zhì)體基因組天然的表達調(diào)控序列。在該實施方案中，天然的表達調(diào)控序列可以用于驅(qū)動編碼目的多肽的核苷酸序列的表達。在另一個實施方案中，靶向核苷酸序列的每個或者二者可以含有可用于驅(qū)動編碼目的多肽的核苷酸序列的表達的1個或者更多個表達調(diào)控序列。
靶向核苷酸序列可以是任意長度，只要其足以允許與受體質(zhì)體基因組同源重組。靶向核苷酸序列含有在長度上少于100個核苷酸的核苷酸序列在某些情況下可足以允許重組。在另外的實施方案中，更長的靶向核苷酸序列可以提供更有效的同源重組。這樣的靶向核苷酸序列可以為長度至少200、300、400、500、600、700、800或者900個核苷酸，或者至少1000個或者更多個核苷酸。
本發(fā)明提供浮萍(Lemna minor)葉綠體基因組16S到23 S rRNA區(qū)域的序列。該核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。在某些實施方案中，靶向核苷酸序列與該序列的至少200、300、400、500、600、700、800或者900個核苷酸，或者至少1000、1500、2000、2500或者3000或者更多個核苷酸同源。不過，本發(fā)明的靶向核苷酸序列可以同源于任何浮萍質(zhì)體基因組序列。另外的非限定性的可以用作靶向序列的基因間區(qū)域的例子包括tRNAGlu(trnE)到tRNA Thr(trnT)區(qū)域、trnE到tRNATyr(trnY)、trnY到tRNAAsp(trnD)區(qū)域、rps8到rps14區(qū)域、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基(rbcL)到乙酰輔酶A羧化酶(accD)β亞基的區(qū)域、細胞色素b(559)(psbE)大亞基多肽到細胞色素f(petA)區(qū)域、tRNAGly(trnG)到tRNAMet(trnM)區(qū)域、psbA到tRNAHis(trnH)區(qū)域、tRNAVal(trnV)到16srRNA區(qū)域、trnV到rps7/rps12區(qū)域以及浮萍質(zhì)體基因組的非必需基因內(nèi)的區(qū)域。
C.轉(zhuǎn)化方法通過用異源于浮萍質(zhì)體基因組的核苷酸序列轉(zhuǎn)化浮萍質(zhì)體制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組的浮萍細胞以及植物?？梢酝ㄟ^隨機插入或者定點整合(例如同源重組)插入異源性核苷酸序列。該異源性核苷酸序列可以被插入到分離的質(zhì)體中或者被轉(zhuǎn)化到在體內(nèi)的質(zhì)體中。轉(zhuǎn)化的質(zhì)體可以用于在體內(nèi)或者離體表達異源性核苷酸序列。
可以通過任何適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化方法實現(xiàn)質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，例如通過植物前質(zhì)體的電穿孔(參見Taylor和Walbot(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825824-28)、基于PEG的方法(參見Goldset al Biotechnology 1195-97、微注射(參見，Neuhas et al.(1987)Theor.Appl.Genet.7430-36)、或者通過粒子轟擊(例如參見Boynton et al.(1988)Science 2401534-38；Svab et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.878526-8530；SVab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90913-917；以及美國專利號5451513、5545817、5545818、5576198以及5866421，其全部引入此處作為參考。)已經(jīng)在美國專利號6040498中介紹了通過粒子轟擊轉(zhuǎn)化浮萍的細胞核，引入此處作為參考。在本發(fā)明的實施方案中，沖擊轉(zhuǎn)化法(ballistic transformation method)包括步驟(a)提供浮萍組織作為靶；(b)朝浮萍組織推進載有葉綠體轉(zhuǎn)化載體的微粒(microprojectile)，推進的速度足以穿透在該組織內(nèi)細胞的壁且在該組織的細胞內(nèi)沉積核苷酸序列，由此提供轉(zhuǎn)化的組織。在本發(fā)明的特定的實施方案中，該方法還包括如下所述的用選擇試劑培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的組織的步驟。在其它備選的實施方案中，在選擇步驟后是由轉(zhuǎn)化的組織再生出轉(zhuǎn)化的浮萍植物的步驟。
可以使用任何沖擊細胞轉(zhuǎn)化裝置實施本發(fā)明。示例性的裝置公開于Sanford et al(1988)Particulate Science and Technology 527；Klein et al.(1987)Nature 32770，以及美國專利號4945050、5036006、5100792、5179022、5204253、5371015以及5478744，其全部內(nèi)容引入此處作為參考。這樣的裝置通常允許控制在轟擊中使用的壓力。用于本方法的壓力典型地介于大約500psi和大約2500psi，例如從大約1100psi到大約2200psi。
可通過沉淀使核苷酸序列固定于微載體粒子上。所使用的精確的沉淀參數(shù)將根據(jù)諸如所采用的粒子加速方法等因素而不同，如本領(lǐng)域公知的。如在EP0270356中所討論的，可以任選地用包封試劑諸如多聚賴氨酸包被載體粒子以改進在其上固定的核苷酸序列的穩(wěn)定性。可以將任何微載體用于本發(fā)明，包括金和鎢。微載體的大小通常介于大約0.6μm和大約1.6μm之間。
將要被轟擊的組織可以是任何浮萍細胞或者組織，包括浮萍葉狀體、浮萍結(jié)節(jié)、片斷化的浮萍結(jié)節(jié)(微結(jié)節(jié)(micronodules))以及部分再生的結(jié)節(jié)。在美國專利號6040498以及美國專利申請?zhí)?9/915873和10/158243中介紹了制備浮萍結(jié)節(jié)、微結(jié)節(jié)以及部分再生的結(jié)節(jié)的方法，其全部內(nèi)容引入此處作為參考。
轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組的浮萍細胞或者結(jié)節(jié)組織可以被再生成轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組的或者同轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組的植物。在美國專利號6040498和美國專利申請?zhí)?9/915873以及10/158243中介紹了從轉(zhuǎn)化的浮萍組織再生成浮萍植物的方法，其全部內(nèi)容引入此處作為參考。本文的其它處也介紹了從結(jié)節(jié)培養(yǎng)物再生轉(zhuǎn)化的浮萍葉狀體的方法。
在本發(fā)明中可以使用多種選擇操作流程。例如在某些實施方案中，可以將轉(zhuǎn)化的葉狀體或者結(jié)節(jié)在一部分選擇過程中保持在暗處，然后移到光照下。在其它的實施方案中，葉狀體或者結(jié)節(jié)在整個選擇過程中保持在光照下。
在某些實施方案中，轉(zhuǎn)化的葉狀體或者結(jié)節(jié)在保持未分化狀態(tài)的培養(yǎng)基中進行選擇，然后將植物移到可誘導(dǎo)葉狀體再生的培養(yǎng)基中，而在其它的實施方案中，在可誘導(dǎo)葉狀體再生的培養(yǎng)基中進行全部的選擇過程。
在某些實施方案中，轉(zhuǎn)化的浮萍質(zhì)體和轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組的浮萍植物以及細胞是同質(zhì)體基因組的(homoplastomic)。可以通過用編碼選擇性標(biāo)記多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化浮萍質(zhì)體、然后在允許表達標(biāo)記多肽的浮萍細胞生存的選擇性培養(yǎng)基中保持轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組的浮萍植物或者細胞來制備同質(zhì)體基因組細胞和植物。在一個實施方案中，選擇性培養(yǎng)基只允許這種浮萍細胞的生長該浮萍細胞是同質(zhì)體基因組的或者其具有的質(zhì)體基本上全部用編碼選擇性標(biāo)記多肽的核苷酸序列所轉(zhuǎn)化、或者其對于編碼選擇性標(biāo)記多肽的核苷酸序列而言是同質(zhì)體基因組的。制備同質(zhì)體基因組的或者其具有的質(zhì)體基本上全部用編碼標(biāo)記多肽的序列所轉(zhuǎn)化的浮萍植物或者細胞可能需要多輪選擇。可以實施Southern分析或者PCR分析以測定轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組浮萍細胞或者植物是否是同質(zhì)體基因組的。
在某些實施方案中，選擇標(biāo)記多肽所賦予的標(biāo)記表型允許選擇具有已與編碼標(biāo)記多肽的序列連接的第二編碼序列的浮萍細胞。該第二編碼序列典型地編碼目的多肽，并且該選出的浮萍細胞可以用于生產(chǎn)該目的多肽。
實驗提供下述實施例的目的是用于舉例說明，不過本發(fā)明不局限于此。
浮萍屬葉綠體轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建用于轉(zhuǎn)化浮萍屬(Lemna)葉綠體的載體。該載體包括設(shè)計成用于與在浮萍屬葉綠體基因組的16S到23S rRNA區(qū)域中的位點同源重組的序列(參見圖1)。用于促進與浮萍屬葉綠體基因組同源重組的序列鑒定如下。將來自煙草、玉米、稻、擬南芥屬和菠菜的葉綠體基因組的16S到23S rRNA區(qū)域比對(align)以確定具有高水平序列一致性的區(qū)域。以在比對中鑒定的保守區(qū)域為基礎(chǔ)，設(shè)計PCR引物擴增浮萍屬葉綠體基因組的16S到23S區(qū)域。這些PCR引物的序列如下所示引物1675′GCTGGTCCGAGAGGATGATC 3′(SEQ ID NO1)引物1665′GTTATAGTTACGGCCGCCGT 3′(SEQ ID NO2)使用標(biāo)準(zhǔn)條件對浮萍種(Lemna minor)基因組DNA實施PCR。將得到的5.4kb的PCR產(chǎn)物克隆到pT7blue載體(Novagen，Madison，WI)中以形成質(zhì)粒pBCT00。然后測定完整的PCR產(chǎn)物的序列并且確認(rèn)其為浮萍屬葉綠體基因組的16S到23S區(qū)域。PCR產(chǎn)物序列如SEQ IDNO3所示。浮萍屬基因組的這個區(qū)域含有16SrRNA基因、tRNA異亮氨酸基因(trnI)、tRNA丙氨酸基因(trnA)和23SrRNA基因。
該載體設(shè)計成將轉(zhuǎn)基因的整合靶向到在trnI和trnA基因間的基因間區(qū)域。包含側(cè)翼連接有用于重組到浮萍屬葉綠體基因組的同源區(qū)域的轉(zhuǎn)基因和選擇性標(biāo)記盒的浮萍屬葉綠體轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建如下。根據(jù)如上所述而獲得的浮萍屬基因組序列，設(shè)計PCR引物從浮萍屬的16S到23S rRNA區(qū)域擴增2.5kb片段。這些引物的序列如下所示引物2075′ACAAGGTAGCCGTACTGGAAGGTGCGGCTG 3’(SEQ ID NO4)引物2035′TTCAACTCCCCGAAGCATTTCGTC 3’(SEQ ID NO5)使用標(biāo)準(zhǔn)條件實施對浮萍種(Lemna minor)基因組DNA的PCR。擴增PCR產(chǎn)物并且克隆到pT7blue載體(Novagen，Madison，WI)中。
為了制備載體pBCT01，把包含具有RbcL核糖體結(jié)合位點(示于SEQ ID NO7)的煙草16S rRNA啟動子(示于SEQ ID NO6)、氨基糖苷3″-腺苷?；D(zhuǎn)移酶(aadA)基因以及煙草的psbA 3′UTR(示于SEQ ID NO8)的大觀霉素/鏈霉素選擇性標(biāo)記盒(NCBI登記號AF061065)用PstI/NsiI克隆，插入到pBCT00的在浮萍屬trnI和trnA間的基因間區(qū)域，制備該質(zhì)粒。質(zhì)粒pCBT04的結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示。
為了制備載體pBCT04，把包含具有RbcL核糖體結(jié)合位點(示于SEQ ID NO7)的煙草16S rRNA啟動子(示于SEQ ID NO6)、氨基糖苷3″-腺苷?；D(zhuǎn)移酶(aadA)基因以及煙草psbA 3′UTR(示于SEQ ID NO8)的卡那霉素選擇性標(biāo)記盒用PstI/NsiI克隆，插入到pBCT00的在浮萍屬trnI和trnA間的基因間區(qū)域，制備該質(zhì)粒。該卡那霉素選擇性標(biāo)記盒創(chuàng)建如下通過PCR擴增編碼氨基糖苷3′磷酸轉(zhuǎn)移酶(NCBI登記號P00554)，然后連接它到具有RbcL結(jié)合位點的煙草16SrRNA啟動子的下游以及煙草psbA 3′UTR的上游。該盒克隆到浮萍屬TrnI和trnA基因間區(qū)域的PstI位點以創(chuàng)建載體pBCT04。質(zhì)粒pCBT04的結(jié)構(gòu)示意圖如圖4所示。
浮萍屬結(jié)節(jié)的制備在這些實施例中，雖然浮萍種(Lemna minor)8627株用于轉(zhuǎn)化，不過可以使用任何浮萍屬株。用于轉(zhuǎn)化的浮萍結(jié)節(jié)培養(yǎng)物制備如下，分離浮萍葉狀體，用無菌手術(shù)刀切去根，然后腹面朝下放置該葉狀體于Murashige and Skong培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，Murashige and Skoog(1962)Physiol.Plant.15473)(pH5.6)上，該培養(yǎng)基添加有5μM2，4-二氯苯氧乙酸、0.5μM 1-苯基-3(1，2，3-噻二唑-5-基)脲脫葉靈(thidiazuron)(Sigma P6186)、3％蔗糖、0.4Difco Bacto瓊脂(Fisher Scientific)和0.15％ Gelrite(Sigma)。葉狀體生長5～6周。此時，出現(xiàn)結(jié)節(jié)(小的淡黃色的細胞團塊)，通常生自腹面的中心部分。從母葉狀體分離開該結(jié)節(jié)組織塊(平均直徑3～6mm大小)，并在添加有3％蔗糖、0.4％Difco Bacto瓊脂、1μM 2，4-二氯苯氧乙酸以及2μM芐基腺嘌呤的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
通過粒子轟擊進行浮萍屬結(jié)節(jié)的葉綠體轉(zhuǎn)化使用QIAGEN Maxi-Prep試劑盒(QIAGEN，Valencia，Ca)制備純化的pBCT01和pBCT04DNA，然后根據(jù)生產(chǎn)商的說明書用純化的DNA包被金微載體(0.6μM，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)。在粒子轟擊之前，在含有MS培養(yǎng)基(用于pBCT01)或者含有添加有5μM 2，4-二氯苯氧乙酸、0.5μM 1-苯基-3(1，2，3-噻二唑-5-基)脲脫葉靈、3％蔗糖、0.4 Difco Bacto瓊脂和0.15％Gelrite(用于pBCT04)的MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿的中央放置大約50個浮萍屬結(jié)節(jié)(直徑大約0.5～10mm)。按照生產(chǎn)商的操作流程用來自Bio-Rad(PDS-1000/He，Bio-Rad，Hercules，CA)的Bio-Rad PDS-1000/Hebiolistic儀在靶距離為9cm、氦壓范圍從1100到2200以及真空度28英寸下轟擊結(jié)節(jié)兩次。
對于pBCT01，在轟擊后，將結(jié)節(jié)于MS培養(yǎng)基上在暗處溫育48小時。然后轉(zhuǎn)移該結(jié)節(jié)到含有25μg/ml大觀霉素二鹽酸的MS培養(yǎng)基中，并且在持續(xù)光照下生長2周(用于pBCT01)。然后轉(zhuǎn)移該結(jié)節(jié)到含有25μg/ml大觀霉素的0.5×SH培養(yǎng)基中，并且在持續(xù)光照下生長。每周一次轉(zhuǎn)移該結(jié)節(jié)到新鮮的培養(yǎng)基中。在6到8周后結(jié)節(jié)在0.5×SH培養(yǎng)基上開始生出葉狀體組織。
對于pBCT04，在轟擊后，在添加有5μM 2，4-二氯苯氧乙酸、0.5μM 1-苯基-3(1，2，3-噻二唑-5-基)脲脫葉靈、3％蔗糖、0.4 DifcoBacto瓊脂和0.15％Gelrite的MS培養(yǎng)基上于暗處溫育該結(jié)節(jié)48小時。然后轉(zhuǎn)移該結(jié)節(jié)到添加有5μM 2，4-二氯苯氧乙酸、0.5μM 1-苯基-3(1，2，3-噻二唑-5-基)脲脫葉靈、3％蔗糖、0.4％Difco Bacto瓊脂、0.15％Gelrite和50μg/ml卡那霉素的MS培養(yǎng)基中并維持4周，然后轉(zhuǎn)移到添加有5μM 2，4-二氯苯氧乙酸、0.5μM 1-苯基-3(1，2，3-噻二唑-5-基)脲脫葉靈、3％蔗糖、0.4％Difco Bacto瓊脂、0.15％Gelrite和100μg/ml卡那霉素的MS培養(yǎng)基中再溫育4周。然后將結(jié)節(jié)置于具有100μg/ml卡那霉素的0.5×SH培養(yǎng)基上溫育8～12周直到葉狀體再生。
通過粒子轟擊進行浮萍屬葉狀體的葉綠體轉(zhuǎn)化為了轉(zhuǎn)化浮萍屬葉狀體，在0.5×SH培養(yǎng)基上的5號Whatman紙片的中央放置大約30個浮萍屬葉狀體，然后如上述對浮萍屬結(jié)節(jié)所述的進行轟擊。在轟擊后，于暗處在0.5×SH培養(yǎng)基上溫育葉狀體48小時，然后轉(zhuǎn)移到添加有3％蔗糖、0.4％Difco Bacto瓊脂、0.15％Gelrite，1μM 2，4-二氯苯氧乙酸、2μM芐基腺嘌呤以及50μg/ml卡那霉素的Murashige和Skong培養(yǎng)基中。每周一次轉(zhuǎn)移葉狀體到新鮮培養(yǎng)基中，進行6到8周，直到生成結(jié)節(jié)組織。轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)組織到含有100μg/ml卡那霉素的0.5×SH中，并且每周一次地轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中，進行6到10周，直至再生成葉狀體。
葉綠體轉(zhuǎn)化體分析為了對pBCT01轉(zhuǎn)基因區(qū)域整合到浮萍屬葉綠體基因組中進行檢測，對生出葉狀體的結(jié)節(jié)組織實施PCR。取在含有25μg/ml大觀霉素的SH培養(yǎng)基上生長8周后的組織用于分析。使用DNeasy DNA抽提試劑盒(QIAGEN，Valencia，CA)從結(jié)節(jié)組織抽提基因組DNA，然后使用標(biāo)準(zhǔn)條件實施PCR。設(shè)計兩個引物組來檢測在同源重組位點的兩側(cè)的整合。引物71和248可檢測重組位點的16S側(cè)的整合并且可擴增1796bp的產(chǎn)物，而引物210和234可檢測23S側(cè)并生成2610bp的產(chǎn)物。引物定位如圖3所示。
引物715′AAAACCCGTCCTCAGTTCGGATTGC 3′(SEQ ID NO9)引物2485′CCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACG 3′(SEQ ID NO10)引物2105′CTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGC 3′(SEQ ID NO11)引物2345′GGTTCGGACCTCCACTTAGT 3′(SEQ ID NO12)在全部6個獨立的浮萍培養(yǎng)物中都產(chǎn)生了預(yù)期的PCR產(chǎn)物，其中這些樣品中有2個表現(xiàn)出特別高的水平的轉(zhuǎn)基因整合。對分離自這些培養(yǎng)物之一的PCR產(chǎn)物測序，其顯示出與pBCT01轉(zhuǎn)基因序列相同，這證明了在轉(zhuǎn)基因和質(zhì)體基因組間的同源性重組。
在說明書中提到的所有出版物和專利申請均指明本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。所有出版物和專利申請在此通過引用并入本文，就象明確并且單獨地指出每個出版物或者專利申請作為參考文獻引入一樣。
盡管為了清楚地理解本發(fā)明，已經(jīng)在前面通過舉例說明和實施例較詳細地描述了本發(fā)明，但是很明顯，在所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)可進行某些改變和修飾。
序列表<110>Biolex，Inc.
Cox，Kevin M.
Peele，Charles G.
<120>浮萍的葉綠體轉(zhuǎn)化<130>40989/279828<150>US 60/484,166<151>2003-07-01<150>US 60/492,179<151>2003-08-01<160>12<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物167<400>1gctggtccga gaggatgatc20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物166<400>2gttatagtta cggccgccgt20<210>3<211>5373<212>DNA<213>浮萍(Lemna minor)<220>
<221>misc_feature<222>3530，4789<223>n＝A，T，C或G<400>3gctggtccga gaggatgatc agccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 60aggcagcagt ggggaatttt ccgcaatggg cgaaagcctg acggagcaat gccgcgtgga 120ggtagaaggc ccacgggtcg tgaacttctt ttctcggaga agaagcaatg acggtatctg 180aggaataagc atcggctaac tctgtgccag cagccgcggt aagacagagg atgcaagcgt 240tatccggaat gattgggcgt aaagcgtctg taggtggctt ttcaagtccg tcgtcaaatc 300ccagggctca accctggaca ggcggtggaa actaccaagc tggagtacgg taggggcaga 360gggaatttcc ggtggagcgg tgaaatgcgt agagatcgga aagaacacca atggcgaaag 420cactctgctg ggccgacact gacactgaga gacgaaagct aggggagcga atgggattag 480ataccccagt agtcctagcc gtaaacgatg gatactaggc gctgtgcgta tcgacccgtg 540cagtgctgta gctaacgcgt taagtatccc gcctggggag tacgttcgca agaatgaaac 600
tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgatgcaaa 660gcgaagaacc ttaccagggc ttgacatgcc gcgaatcctc ttgaaagaga ggggtgcctt 720cgggaacgcg gacacaggtg gtgcatggct gtcgtcagct cgtgccgtaa ggtgttgggt 780taagtcccgc aacgagcgca accctcgtgt ttagttgcca ccattgtgga accctgaaca 840gactgccggt gataagccgg aggaaggtga ggatgacgtc aagtcatcat gccccttatg 900ccctgggcga cacacgtgct acaatggccg ggacaaaggg tcgcgatccc gcgagggtga 960gctaacccca aaaacccgtc ctcagttcgg attgcaggct gcaactcgcc tgcatgaagc 1020cggaatcgct agtaatcgcc ggtcagccat acggcggtga attcgttccc gggccttgta 1080cacaccgccc gtcacactat gggagctggc catgcccgaa gtcgttacct taaccgcaag 1140gggggggatg ccgaaggcgg ggctagtgac tggagtgaag tcgtaacaag gtagccgtac 1200tggaaggtgc ggctggatca cctccttttc agggagagct aatgcttgtt gagtattttt 1260tttggtttga cactgcttca cacccaaaaa gaagcgagct acgtctgagc taagcttgga 1320tatggaagtc ttctttcgtt tcttgacggt gaaataagac caagctcatg agcttattat 1380cctaggtcgg aacaagttga taggatcctt ttacgtcccc atgtccctcc cgtgtggaca 1440catggggacg taaaaaggaa agagagggat ggggtttctc tcgcttttgg catagcaggc 1500ctcccggtgg gaggcccgca cgacgggcta ttagctcagt ggtagagcgc gcccctgata 1560attgcgtcgt tgtgcctggg ctgtgagggc tctcagccac atggatagtt caatgtgctc 1620atcagcgcct gacccggaga tgtggatcat ccaaggcaca ttagcatggc gtactcctcc 1680tgttcgaatc ggagtttgaa accaaactta tcctcaggag gatagatggg gcgattcagg 1740tgagatccaa tgtagatcca actttctatt cactcgtggg atccgggcgg tccggggggg 1800accaacaagg ctcctctctt ctcgagaatc catacatccc ttatcagtgt atggacagct 1860atctctcgag cacaggttta ggttcggcct caacgggaaa atggagcacc taacaacgca 1920tcttcacaga ccaagaacta cgagatcacc ccttttattc tggggtgacg gagggatcgt 1980accattcgag ccttttttca tgcttttcct gaaggtctgg agaaacgtga aattcttttt 2040atctatctct tgactcgaaa tgggagcagg tttgaaaaag gatcttagag tgtctagggt 2100tgggccagga gggtttctta acctcttctt ttttcttccc atcggagttt tttcacaaag 2160acttccatgg taagggggaa gggtggaaca agcaaagcac acttgtagag cgcagtacag 2220cggagagctg tatgctgcgt tcgggaagga tgaatcgctc ctgaaaaaga atctattgat 2280tctcccccaa ttgtttggat cgtaggtgcg atgatttact tcacgggcga ggtctctggt 2340tcaagtccag gatggcccag cggcgccagg gaaaagaata gaagaagcat ctgactcctt 2400catgcatgct ccacttggct cggggggata cagctcagtt ggtagagctc cgctcttgca 2460attgggtcgt tgcgattacg ggttggatgt ctaattgtcc aggcggtaat gatagtatct 2520tgtacctgaa ctggtggctc actttttcta agtaatgggg aagaggaccg aaacatgcca 2580ctgaaagact ctactgagac aaagatgggc tgtcaagaac gtagaggagg taggatgggc 2640agttggtcag atctagtatg gatcgtatat ggaccttagt tggagtcggc ggctctccta 2700gggttccctc atctgggatc cctggggaag aggatcaagt tggcacttgc gaacagcttg 2760atgcactatc tcccttcaac cctttgcgcg aaatgtgaca aaaggaagga aaatccatgg 2820accgacccca tcgtctccac cccgtaggaa ctacgagatc accccaggga cgccttcggc 2880atccaggggt cacggaccga ccatagatcc tgttcaataa gtggaacgca ttagcagtcc 2940gttctctggt tgggcagtaa gggtcggaga agggcaatca ctcgttctta aaaccagcat 3000tcttaaaacc caagagtcgg gcagaaaaag ggggagagtt ctccgttcct gattctcctg 3060tagctggatt ctccggaacc acaagaatcc ttagaatggg attccgactc agcacctttt 3120gatattttga gaagagttgc tctttggaga gcacagtacg atgaaagttg taagctgtgt 3180tcggggggga gttattgtct atcgttggcc tctatagtag aatcagtcgg ggaggcccga 3240gaggcggtgg tttaccctgt ggcggatgtc agcggttcga gtccgcttat ctccagcccg 3300tgaacttagc cgaaactatg atagcaccca attttgacga ttcggcagtt cgatctatga 3360tttatcattc atggacgttg ataagatcct tccatttagc agcaccttag gatggcatag 3420ccttaacatg gcgaggttca aacgaggaaa ggcttacggt ggatacctag gcacccagag 3480acgaggaagg gcgtagtaag cgacgaaatg cttcggggag ttgaaaatan gcatagatcc 3540ggagattccc gaataggtta acctttcgaa ctgctgctga atccatgggc aggcaagaga 3600caacctggcg aactgaaaca tcttagtagc cagaggaaaa gaaagcaaaa gcgattcccg 3660tagtagcggc gagcgaaatg ggagcagcct aaaccgtgaa aacggggttg tgggagagca 3720atacaagcgt cgtgctgcta ggcgaagcgg ttgaatactg caccctagat ggcgaaagtc 3780cagtagccga aagcatcact agcttacgct ctgacccgag tagcatgggg cacgtggaat 3840cccgtgtgaa tcagcaagga ccaccttgca aggctaaata ctcctgggtg accgatagcg 3900aagtagtacc gtgagggaaa ggtgaaaaga acccccatcg gggagtgaaa tagaacatga 3960aaccgtgagc tctcaagcag tgggaggaga atctgatctc tgaccgtgtg cctgttgaag 4020aatgagccgg cgactcatag gcagtggctt ggttaaggga atccaccgga gccgtagcga 4080aagcgagtct tcatagggcg attgtcactg cttatggacc cgaacctggg tgatctatcc 4140atgaccagga tgaagcttgg gtgaaactaa gtggaggtcc gaaccgactg atgttgaaga 4200atcagcggat gagttgtggt taggggtgaa atgccactcg aacccagagc tagctggttc 4260tccccgaaat gcgttgaggc gcagcagttg actggacatc taggggtaaa gcactgtttc 4320ggtgcgggcc gcgagagcgg taccaaatcg aggcaaactc tgaatactag atatgacccc 4380aaaataacgg aggtcaaggt cggccagtga gacgatgggg gataagcttc atcgtcgaga 4440gggaaacagc ccagatcacc agctaaggcc cctaaatgac cgctcagtga taaaggaggt 4500
aggagtgcag agacagccag gaggtttgcc tagaagcagc cacccttgaa agagtgcgta 4560atagctcact gatcgagcgc tcttgcgccg aagatgaacg gggctaagcg atctgccgaa 4620gctgtgggat gtaaaaatgc atcggtaggg gagcgttccg ccttagatag aagcacccgt 4680gcaagcaggt gtggacgaag cggaagcgaa aatgtcggct tgagtaacgc aaacattggt 4740gagaatccaa atgccccgaa aacctaaggg ttcctccgca aggttcgtnc cacggagggt 4800gagtcagggc ctaagatcag gccgaaaggc gtagtcgatg gacaacaggt gaatattcct 4860gtactacccc ttgttggtcc cgagggacgg aggaggctag gttagccgaa agatggttat 4920cggttcaagg acgcaaggtg accctgattt ttcagggtaa gaaggggtag agaaaatgcc 4980tcgagccaat gtctgagtac caggcgctac ggcgctgaag taacccatgc catactccca 5040ggaaaagctc gaacgacctt aaacaagagg gtacctgtac ccgaaaccga cacaggtggg 5100taggtagaga atacctaggg gcgcgagaca actctctcta aggaactcgg caaaatagcc 5160ccgtaacttc gggagaaggg gtgcctcctc acaaaggggg tcgcagtgac caggcccggg 5220cgactgttta ccaaaaacac aggtctccgc aaagtcgtaa gaccatgtat gggggctgac 5280gcctgcccag tgccggaagg tcaaggaagt tggtgacctg atgacagggg agccagcgac 5340cgaagccccg gtgaacggcg gccgtaacta aac 5373<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物207<400>4acaaggtagc cgtactggaa ggtgcggctg 30<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物203<400>5ttcaactccc cgaagcattt cgtc 24<210>6<211>119<212>DNA<213>煙草(Nicotiana tabacum)<400>6gctcccccgc cgtcgttcaa tgagaatgga taagaggctc gtgggattga cgtgaggggg 60cagggatggc tatatttctg ggagcgaact ccgggcgaat acgaagcgct tggatacag119<210>7<211>16<212>DNA<213>煙草<400>7ttgtagggag ggattt16<210>8<211>189<212>DNA<213>Nicotiana tabacaum
<400>8gatcctggcc tagtctatag gaggttttga aaagaaagga gcaataatca ttttcttgtt 60ctatcaagag ggtgctattg ctcctttctt tttttctttt tatttattta ctagtatttt 120acttacatag acttttttgt ttacattata gaaaaagaag gagaggttat tttcttgcat 180ttattcatg 189<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物71<400>9aaaacccgtc ctcagttcgg attgc 25<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物248<400>10ccgcgttgtt tcatcaagcc ttacg 25<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物210<400>11ctgtagaagt caccattgtt gtgc 24<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物234<400>12ggttcggacc tccacttagt20
權(quán)利要求
1.浮萍植物，其具有用異源于浮萍質(zhì)體基因組的至少一個核苷酸序列轉(zhuǎn)化的質(zhì)體，其中，異源于浮萍質(zhì)體基因組的核苷酸序列可操作地連接于能在質(zhì)體中發(fā)揮功能的表達調(diào)控序列。
2.權(quán)利要求1的浮萍植物，其中至少一個異源于浮萍質(zhì)體基因組的核苷酸序列編碼目的多肽。
3.權(quán)利要求2的浮萍植物，其中所述目的多肽選自胰島素、生長激素、α干擾素、β干擾素、β葡糖腦苷脂酶、β葡糖醛酸糖苷酶(β-glucoronidase)、成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白、p53蛋白、制管張素、苗條蛋白、促紅細胞生成素、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、血纖維蛋白溶酶原、單克隆抗體、Fab片段、單鏈抗體、細胞因子、受體、人疫苗、動物疫苗、植物多肽、肽以及血清白蛋白組成的組。
4.權(quán)利要求1的浮萍植物，其中所述質(zhì)體用至少2個異源于浮萍質(zhì)體基因組的編碼目的多肽的核苷酸序列所轉(zhuǎn)化。
5.權(quán)利要求1的浮萍植物，其中所述異源于浮萍質(zhì)體基因組的核苷酸序列包括能用于植物細胞的選擇的標(biāo)記多肽的編碼序列。
6.權(quán)利要求5的浮萍植物，其中所述標(biāo)記多肽賦予對選自大觀霉素和鏈霉素組成的組的至少一種抗生素的抗性。
7.權(quán)利要求1的浮萍植物，其中，用異源于浮萍質(zhì)體基因組的至少一個核苷酸序列轉(zhuǎn)化的質(zhì)體選自前質(zhì)體、造粉體、有色體、葉綠體、黃化質(zhì)體或白色體組成的組。
8.權(quán)利要求9的浮萍植物，其中，用具有至少一個異源于浮萍質(zhì)體基因組的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的質(zhì)體是葉綠體。
9.權(quán)利要求1的浮萍植物，其中，在質(zhì)體中具有功能的表達調(diào)控序列是植物16S rRNA啟動子序列。
10.權(quán)利要求9的浮萍植物，其中，在質(zhì)體中具有功能的表達調(diào)控序列是煙草16S rRNA啟動子序列。
11.權(quán)利要求10的浮萍植物，其中所述煙草16S rRNA啟動子序列是SEQ ID NO6所示核苷酸序列。
12.權(quán)利要求1的浮萍植物，其中所述浮萍植物選自紫萍屬(Spirodela)、無根萍屬(Wolffia)、Wolfiella屬以及浮萍屬(Lemna)組成的組。
13.權(quán)利要求12的浮萍植物，其中所述浮萍植物選自浮萍(Lemnaminor)、Lemna miniscula、Lemna aequinoctialis和Lemna gibba組成的組。
14.一種核酸分子，其包含作為可操作地連接的成分的如下核苷酸序列a)同源于浮萍質(zhì)體基因組序列的第一靶向核苷酸序列；b)包含至少一個編碼目的多肽的核苷酸序列的表達盒的核苷酸序列，其中所述編碼目的多肽的核苷酸序列異源于浮萍質(zhì)體基因組；和c)同源于浮萍質(zhì)體基因組序列的第二靶向核苷酸序列。
15.權(quán)利要求14的核酸分子，其中所述表達盒另外包含可操作地連接于所述編碼目的多肽的核苷酸序列的表達調(diào)控序列。
16.權(quán)利要求14的核酸分子，其中在質(zhì)體中具有功能的表達調(diào)控序列是煙草16S rRNA啟動子序列。
17.權(quán)利要求16的浮萍植物，其中所述煙草16S rRNA啟動子序列是SEQ ID NO6所示核苷酸序列。
18.權(quán)利要求14的核酸分子，另外包含至少一個在浮萍中具有功能的核糖體結(jié)合位點核苷酸序列。
19.權(quán)利要求18的核酸分子，其中所述在浮萍中具有功能的核糖體結(jié)合位點包含如SEQ ID NO7所示的煙草rbcL核糖體結(jié)合位點核苷酸序列。
20.權(quán)利要求14的核酸分子，另外包含轉(zhuǎn)錄終止序列。
21.權(quán)利要求20的核酸分子，其中所述轉(zhuǎn)錄終止序列是SEQ ID NO8所示的煙草psbA基因3′非翻譯區(qū)域的核苷酸序列。
22.權(quán)利要求14的核酸分子，其中至少一個目的多肽是能被用于選擇轉(zhuǎn)化的浮萍細胞的標(biāo)記多肽。
23.權(quán)利要求22的核酸分子，其中標(biāo)記多肽賦予對選自鏈霉素和大觀霉素的抗生素的抗性。
24.權(quán)利要求14的核酸分子，其中所述第一和第二靶向核苷酸序列能夠促進在浮萍質(zhì)體基因組內(nèi)的同源性重組。
25.權(quán)利要求14的核酸分子，其中所述浮萍質(zhì)體是浮萍葉綠體，且所述浮萍質(zhì)體基因組是葉綠體基因組。
26.包含權(quán)利要求14的核酸分子的浮萍葉綠體。
27.包含權(quán)利要求26的葉綠體的浮萍細胞。
28.包含權(quán)利要求27的浮萍細胞的浮萍植物。
29.權(quán)利要求14的核酸分子，其中選自第一靶向核苷酸序列與第二靶向核苷酸序列的至少一個核苷酸序列同源于SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
30.一種核酸分子，包含作為可操作地連接的成分的下述核苷酸序列a)同源于浮萍葉綠體基因組序列的第一靶向核苷酸序列；b)在浮萍中具有功能的表達調(diào)控序列；c)在浮萍中具有功能的核糖體結(jié)合位點核苷酸序列；d)異源于浮萍葉綠體基因組的核苷酸序列，其中所述異源于浮萍葉綠體基因組的核苷酸序列編碼目的多肽；e)在浮萍中具有功能的轉(zhuǎn)錄終止序列；和f)同源于浮萍葉綠體基因組序列的第二靶向核苷酸序列。
31.權(quán)利要求30的核酸分子，其中選自第一靶向核苷酸序列和第二靶向核苷酸序列的至少一個核苷酸序列同源于SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
32.包含權(quán)利要求30的核酸分子的浮萍葉綠體。
33.包含權(quán)利要求32的葉綠體的浮萍細胞。
34.包含權(quán)利要求33的浮萍細胞的浮萍植物。
35.把異源于浮萍質(zhì)體基因組的至少一個核苷酸序列導(dǎo)入到浮萍質(zhì)體中的方法，所述方法包括把吸收于微粒的權(quán)利要求14的核酸分子在一定條件下轟擊浮萍結(jié)節(jié)，所述條件致使所述異源于浮萍質(zhì)體基因組的核苷酸序列被導(dǎo)入到所述浮萍結(jié)節(jié)的至少一個質(zhì)體中。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述浮萍質(zhì)體是浮萍葉綠體。
37.包含至少一個異源于浮萍質(zhì)體基因組的核苷酸序列的浮萍質(zhì)體，其中所述包含至少一個異源于浮萍質(zhì)體基因組的核苷酸序列的浮萍質(zhì)體是通過權(quán)利要求35的方法產(chǎn)生的。
38.包含權(quán)利要求37的浮萍質(zhì)體的浮萍細胞。
39.包含權(quán)利要求38的浮萍細胞的浮萍植物。
40.用于獲得轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組的浮萍植物的方法，所述方法包括步驟a)用吸收于微粒的權(quán)利要求14的核酸分子在一定條件下轟擊浮萍結(jié)節(jié)，所述條件致使異源于浮萍質(zhì)體基因組的所述核苷酸序列被導(dǎo)入到所述浮萍結(jié)節(jié)的至少一個質(zhì)體中；和b)從所述浮萍結(jié)節(jié)再生浮萍植物。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法制備的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組浮萍植物。
42.用于獲得含有穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的質(zhì)體的浮萍植物的方法，所述方法包括步驟a)提供權(quán)利要求14的核酸分子，其中所述核酸分子包含賦予浮萍細胞可選擇的表型的標(biāo)記序列；b)用吸收于微粒的所述核酸分子在一定條件下轟擊浮萍結(jié)節(jié)，所述條件致使所述異源于浮萍質(zhì)體基因組的核苷酸序列被導(dǎo)入到所述浮萍結(jié)節(jié)的至少一個質(zhì)體中；c)在選擇培養(yǎng)基中保持浮萍結(jié)節(jié)，該培養(yǎng)基允許具有可選擇的表型的浮萍細胞生存，由此選擇出含有標(biāo)記序列的浮萍細胞；和d)從所述浮萍結(jié)節(jié)再生浮萍植物。
43.權(quán)利要求42的方法，其中選擇性培養(yǎng)基偏好允許基本上全部質(zhì)體被所述核酸分子轉(zhuǎn)化了的浮萍細胞生存。
44.根據(jù)權(quán)利要求42的方法制備的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組浮萍植物。
45.生產(chǎn)目的多肽的方法，所述方法包括a)用吸收于微粒的權(quán)利要求14的核酸分子在一定條件下轟擊浮萍結(jié)節(jié)，所述條件致使所述異源于浮萍質(zhì)體基因組的核苷酸序列被導(dǎo)入到所述浮萍結(jié)節(jié)的至少一個質(zhì)體中；和b)在一定條件下培養(yǎng)所述浮萍植物，所述條件致使目的多肽從所述核酸分子表達。
46.生產(chǎn)目的多肽的方法，所述方法包括a)用吸收于微粒的權(quán)利要求14的核酸分子在一定條件下轟擊浮萍結(jié)節(jié)，所述條件致使所述異源于浮萍質(zhì)體基因組的核苷酸序列被導(dǎo)入到所述浮萍結(jié)節(jié)的至少一個質(zhì)體中；b)從所述浮萍結(jié)節(jié)再生浮萍植物；和c)在一定條件下培養(yǎng)所述浮萍植物，所述條件致使目的多肽從所述核酸分子表達。
47.一種浮萍細胞，其具有用異源于浮萍質(zhì)體基因組的至少一個核苷酸序列穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的質(zhì)體，其中所述異源于浮萍質(zhì)體基因組的核苷酸序列可操作地連接于能夠在質(zhì)體中發(fā)揮功能的表達調(diào)控序列。
48.用于生產(chǎn)1個或者更多個目的多肽的方法，所述方法包括a)提供根據(jù)權(quán)利要求27的浮萍細胞，其中所述異源于浮萍質(zhì)體基因組的核苷酸序列編碼1個或者更多個目的多肽；和b)在一定條件下培養(yǎng)所述浮萍細胞，所述條件致使目的多肽被表達。
49.具有從由下述核苷酸序列組成的組選出的核苷酸序列的核酸分子a)SEQ ID NO3所示核苷酸序列；b)SEQ ID NO3所示核苷酸序列的片段的核苷酸序列，其中所述片段包括SEQ ID NO3所示核苷酸序列的至少100個連續(xù)的核苷酸；c)SEQ ID NO3所示核苷酸序列的片段的核苷酸序列，其中所述片段包括SEQ ID NO3所示核苷酸序列的至少200個連續(xù)的核苷酸；d)SEQ ID NO3所示核苷酸序列的片段的核苷酸序列，其中所述片段包括SEQ ID NO3所示核苷酸序列的至少400個連續(xù)的核苷酸；e)SEQ ID NO3所示核苷酸序列的片段的核苷酸序列，其中所述片段包括SEQ ID NO3所示核苷酸序列的至少600個連續(xù)的核苷酸；f)SEQ ID NO3所示核苷酸序列的片段的核苷酸序列，其中所述片段包括SEQ ID NO3所示核苷酸序列的至少800個連續(xù)的核苷酸；g)SEQ ID NO3所示核苷酸序列的片段的核苷酸序列，其中所述片段包括SEQ ID NO3所示核苷酸序列的至少1000個連續(xù)的核苷酸；h)與SEQ ID NO3所示核苷酸序列具有至少90％的序列一致性的核苷酸序列，其中所述與SEQ ID NO3具有至少99％的序列一致性的核苷酸序列能夠與浮萍葉綠體基因組同源重組；和i)與SEQ ID NO3所示核苷酸序列具有至少95％的序列一致性的核苷酸序列，其中所述與SEQ ID NO3具有至少95％的序列一致性的核苷酸序列能夠與浮萍葉綠體基因組同源重組。
全文摘要
本發(fā)明提供用于轉(zhuǎn)化浮萍質(zhì)體的方法和組合物。本發(fā)明的組合物和方法可用于增加浮萍表達體系的重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)能力。本發(fā)明的組合物包括轉(zhuǎn)化的浮萍質(zhì)體和轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組的浮萍細胞和植物以及可用于轉(zhuǎn)化浮萍質(zhì)體的核酸構(gòu)建體。本發(fā)明還提供用于把1個或者更多個異源性核苷酸序列導(dǎo)入到浮萍質(zhì)體基因組中的方法。
文檔編號C12N15/82GK1845996SQ200480024830
公開日2006年10月11日 申請日期2004年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月1日
發(fā)明者K·M·寇克斯, C·G·皮勒 申請人:比奧萊克斯公司