專利名稱：針對(duì)白介素－1受體的抗體及其應(yīng)用的制作方法
專利說明針對(duì)白介素-1受體的抗體及其應(yīng)用 本發(fā)明涉及針對(duì)白介素-1受體(IL-1R)的抗體、它們的生產(chǎn)方法、包含所述抗體的藥物組合物及其應(yīng)用。
由于IL-1在炎性疾病中所發(fā)揮的重要作用以及涉及炎癥和與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)的關(guān)節(jié)破壞，由促炎細(xì)胞因子白介素-1(IL-1α和IL-1β)激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑已成為很多關(guān)注的焦點(diǎn)。
已經(jīng)描述了許多蛋白質(zhì)，其參與轉(zhuǎn)錄因子核因子κB(NF-κB)以及應(yīng)激-活化的蛋白激酶如p38促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的受體后(post-receptor)活化。白介素-1受體(IL-1R，Swiss Prot.P14778，CD 121a)是該信號(hào)系統(tǒng)的一員，其為先天免疫和炎癥應(yīng)答的關(guān)鍵性決定因素。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療方法在最近幾年中，一部分由于對(duì)該病癥嚴(yán)重程度的認(rèn)識(shí)提高以及一部分由于對(duì)細(xì)胞因子在該疾病免疫發(fā)病機(jī)理中重要作用的理解的重大進(jìn)展而經(jīng)歷了較大的發(fā)展轉(zhuǎn)變。主要的焦點(diǎn)是基于以TNFα和IL-1為目標(biāo)的理論。最近公開的研究證實(shí)一些以TNFα為目標(biāo)的生物制劑的使用引起了類風(fēng)濕病的癥狀和征候的持續(xù)改善，并且進(jìn)一步證實(shí)TNFα阻斷保護(hù)關(guān)節(jié)免于結(jié)構(gòu)破壞。Anakinra是一種白介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)，其阻斷IL-1介導(dǎo)的作用。
美國專利號(hào)6,511,665要求保護(hù)一種單克隆抗體，其特異性地結(jié)合人IL-1受體并且阻斷IL-1與IL-1受體的結(jié)合。
本發(fā)明的目的是提供新的針對(duì)IL-1R的抗體，其是用于如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎性疾病治療的有價(jià)值的方法。
發(fā)明概述 意外地發(fā)現(xiàn)存在針對(duì)IL-1R的抗體，其對(duì)于IL-1介導(dǎo)的IL-8分泌的抑制顯示35pM或更低的IC-50值(在人胚胎肺成纖維細(xì)胞如MRC-5細(xì)胞中)。
本發(fā)明的抗體具有對(duì)天然和變性IL-1R特異的表位并且抑制IL-1結(jié)合IL-1R以及隨后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(核因子κB(NF-κB)的激活)?？贵w與糖基化形式的IL-1R的可溶性結(jié)構(gòu)域結(jié)合并且顯示300pM，優(yōu)選200pM或更低的親合力(KD)。對(duì)于與去糖基化的IL-1R的結(jié)合，抗體顯示顯著降低的親和力。
本發(fā)明的抗體在體外和體內(nèi)抑制IL-1結(jié)合IL-1R，由此抑制由IL-1、IL-1受體和IL-1Racp(白介素-1受體輔助蛋白；Q9NPH3)組成的三元復(fù)合物的形成。
本發(fā)明包括結(jié)合人IL-1R并且抑制人IL-1與IL-1R結(jié)合的抗體，其特征在于所述的抗體優(yōu)選可獲自雜交瘤細(xì)胞系MAK＜h-IL-1RI＞2D8(DSMACC 2601)或是嵌合的、人源化的或T細(xì)胞表位缺失的抗體變體或所述抗體的片段，其對(duì)于人成纖維細(xì)胞MRC5(ATCC CCL 171)中IL-1介導(dǎo)的IL-8分泌的抑制顯示35pM或更低的IC-50值。
本發(fā)明的抗體優(yōu)選不顯示效應(yīng)子功能(ADCC和CDC)并且因此是IgG4的同型。尤其優(yōu)選的是絲氨酸228至脯氨酸的突變(Angal，S.，等.，Mol.Immunol.30(1993)105-108)?；蛘咚隹贵w是IgG1的同型并且優(yōu)選在CH1和CH2之間約氨基酸220-240的鉸鏈區(qū)中和/或在CH2和CH3之間約氨基酸330的第二個(gè)結(jié)構(gòu)域間(inter-domain)區(qū)域中修飾(依照Kabat編號(hào)，參見例如Johnson，G，和Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28(2000)214-218)以避免效應(yīng)子功能。IgG類別的轉(zhuǎn)換可通過用來自所需類別的抗體(如IgG1或IgG4)的重鏈和輕鏈來交換所述抗體的恒定重鏈和輕鏈來容易地進(jìn)行。這些方法是現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知的。
本發(fā)明的抗體對(duì)需要抗炎治療的病人顯示益處。本發(fā)明的抗體具有新的和創(chuàng)造性的性能，對(duì)患有上述疾病、尤其是患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者產(chǎn)生益處。本發(fā)明的抗體其特征在于以上提及的性能。
進(jìn)一步優(yōu)選該抗體是大鼠來源的且包括按照Kabat的大鼠抗體的抗體序列框。優(yōu)選Kabat序列中將氨基酸10(絲氨酸)從VL鏈(DEL10)缺失和/或VH鏈的氨基酸26(甘氨酸)變?yōu)楣劝彼?G26E)。優(yōu)選抗體為利用WO 98/08097中所述的方法缺失T細(xì)胞表位的。
進(jìn)一步優(yōu)選IL-1R拮抗劑(Arend W.P.，J.Clin.Invest.88(1991)1445-1451)在高至100μM(IL-1R拮抗劑)的濃度下不抑制IL-1R(10nM)結(jié)合本發(fā)明的固定化抗體，即本發(fā)明的抗體與IL-1R的結(jié)合不受IL-1R拮抗劑的抑制。
恒定區(qū)優(yōu)選為按照Kabat，E.(見下文)的人IgG1或人IgG4恒定區(qū)。優(yōu)選的恒定區(qū)在

圖14、15和16中顯示。
本發(fā)明還包括編碼抗體的核酸。所編碼的多肽能夠與以下定義的各個(gè)其它抗體鏈裝配在一起 抗體重鏈，包括作為CDR的SEQ ID NO1的CDR1(氨基酸45-54)、CDR2(氨基酸69-84)和CDR3(氨基酸117-123)，抗體輕鏈，包括作為CDR的SEQ ID NO2的CDR1(氨基酸43-57)、CDR2(氨基酸73-79)和CDR3(氨基酸112-120)。CDR編號(hào)和定義按照Kabat，E.(參見例如Johnson，G.，和Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28(2000)214-218)，包括信號(hào)序列。
優(yōu)選地，所述核酸編碼多肽，該多肽為由SEQ ID NO1的可變區(qū)(VH)組成的重鏈和由SEQ ID NO2的可變區(qū)(VL)組成的輕鏈。
抗體優(yōu)選為單克隆抗體和，此外為嵌合抗體(人恒定鏈)、人源化抗體并且尤其優(yōu)選為T細(xì)胞表位缺失的抗體。
該抗體與由SEQ ID NOs1-2的可變鏈表征的抗體競爭性地結(jié)合人IL-1R。
該抗體進(jìn)一步表征為300pM或更低、優(yōu)選200pM(KD)或更低以及更優(yōu)選約70-200pM的親合力。
本發(fā)明因此還包括選自上述本發(fā)明IL-1R抗體的重鏈的CDR1、CDR2、CDR3和輕鏈的CDR1、CDR2、CDR3的多肽以及編碼核酸。
本發(fā)明進(jìn)一步提供生產(chǎn)上述本發(fā)明拮抗性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
本發(fā)明優(yōu)選的雜交瘤細(xì)胞系，雜交瘤細(xì)胞系MAK＜h-IL-1RI＞2D8根據(jù)用于專利程序的國際認(rèn)可的微生物保藏布達(dá)佩斯條約，于2003年7月10日保藏在德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)，德國，保藏號(hào)DSMACC 2601。
可獲自所述細(xì)胞系的抗體為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案。優(yōu)選的還有所有抗體，其可以由圖7至10和14至16中所示的可變區(qū)和恒定區(qū)組合(combine)，并且在人成纖維細(xì)胞MRC5(ATCC CCL 171)中對(duì)于IL-1介導(dǎo)的IL-8分泌的抑制顯示35pM或更低的IC-50值。這些序列是為了得到改進(jìn)的抗體通過修飾抗體2D8的序列而獲得的序列的實(shí)例，所述改進(jìn)的抗體保持了抗體2D8的IC50和/或表位特征的優(yōu)良性能。上述抗體中，來自圖7和8(T細(xì)胞表位缺失的)或來自圖9和10(人源化的)的輕鏈和重鏈與來自圖14和圖15或16的恒定區(qū)組合。尤其優(yōu)選的為抗體DEI5/7、DEI4/7、DEI2/4、DEI5/4、DEI4/5、DEI5/5、HUM2/2、HUM2/3、DEI1/8、DEI2/8、DEI2/9、DEI4/9、DEI5/8和DEI5/9。
本發(fā)明進(jìn)一步提供用于鑒定和/或制備本發(fā)明的具有改進(jìn)性能的針對(duì)IL-1R的抗體的方法。在該方法中，為了當(dāng)施予人時(shí)使抗體具有更低的免疫原性，將抗體2D8的多肽序列通過氨基酸的突變、缺失或添加而修飾。通常，在可變的重鏈和輕鏈中修飾可達(dá)約50個(gè)氨基酸以降低免疫原性。通過2D8的多肽序列和Kabat(loc.cit.)提供的人抗體序列的比較和/或可變鏈中T細(xì)胞表位的鑒定和除去來進(jìn)行修飾。上述修飾的實(shí)例在圖7-10中顯示?？赏ㄟ^在這些圖的加框氨基酸中的一種或多種改變來生成有用的抗體。優(yōu)選地，修飾可變鏈的加框區(qū)域內(nèi)的約20-50個(gè)氨基酸。
本發(fā)明因此提供用于制備本發(fā)明抗體的方法，其特征在于在抗體2D8的可變區(qū)的序列中，對(duì)圖7-10所示的各個(gè)加框氨基酸突變、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，制備含有核酸的表達(dá)載體，所述核酸編碼在連續(xù)讀框內(nèi)的所述修飾的抗體可變區(qū)和另外的人恒定區(qū)(優(yōu)選如圖14-16所示)，在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，重組生產(chǎn)的抗體輕鏈和重鏈裝配在一起成為本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼上述抗體的核酸、包含所述核酸的表達(dá)載體以及包含用于上述抗體重組生產(chǎn)的所述載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步提供用于上述抗體重組生產(chǎn)的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和/或骨關(guān)節(jié)炎的方法，包括將有效量的本發(fā)明針對(duì)IL-1R的拮抗性抗體給藥于診斷為患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者(因此需要所述治療)。該抗體優(yōu)選以藥物組合物的形式給藥。
本發(fā)明進(jìn)一步包括按照本發(fā)明的抗體在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和制備本發(fā)明的藥物組合物中的應(yīng)用。此外，本發(fā)明包括用于制備本發(fā)明藥物組合物的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步包括一種藥物組合物，其包含藥物有效量的本發(fā)明的抗體，以及任選地緩沖液和/或另外的對(duì)于制藥目的的抗體配制有用的賦形劑。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包括在藥物可接受載體中的所述抗體的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物可以包括在制造件或試劑盒中。
本發(fā)明進(jìn)一步包括一種包含本發(fā)明核酸的載體，其能在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)所述核酸。
本發(fā)明進(jìn)一步包括包含本發(fā)明載體的原核或真核宿主細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步包括用于生產(chǎn)本發(fā)明重組人抗體的方法，其特征在于在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的核酸以及從上述細(xì)胞回收所述抗體。本發(fā)明進(jìn)一步包括通過上述重組方法可獲得的抗體。
發(fā)明詳述 術(shù)語″抗體″包含抗體的各種形式，包括但不局限于完整的抗體、抗體片段、人源化抗體、嵌合抗體、T細(xì)胞表位缺失的抗體和此外遺傳改造的抗體，只要保留本發(fā)明的特征性質(zhì)。
″抗體片段″包括全長抗體的一部分，通常至少為其抗原結(jié)合部分或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括雙抗體、單鏈抗體分子、免疫毒素和由抗體片段形成的多特異性的抗體。此外，抗體片段包括單鏈多肽，其具有VH鏈的特性，即能和VL鏈一起裝配，或具有與IL-1R結(jié)合的VL鏈的特性，即能和VH鏈一起裝配為功能性抗原結(jié)合口袋(pocket)且因此提供抑制IL-1與IL-1R結(jié)合的性質(zhì)。
如此處使用的術(shù)語″單克隆抗體″或″單克隆抗體組合物″指單一氨基酸組成的抗體分子的制劑。術(shù)語″嵌合抗體″指包括來自大鼠的可變區(qū)，即結(jié)合區(qū)域，以及至少源自不同來源或物種的一部分恒定區(qū)的單克隆抗體，通常通過重組DNA技術(shù)制得。尤其優(yōu)選包括大鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。上述大鼠/人的嵌合抗體是包括編碼大鼠免疫球蛋白可變區(qū)的DNA片段和編碼人免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA片段的免疫球蛋白基因表達(dá)的產(chǎn)物。本發(fā)明包含的″嵌合抗體″的其它形式是其中原始抗體的種類或亞類已經(jīng)修飾或變化的那些抗體。所述″嵌合的″抗體也稱為″類別-轉(zhuǎn)變的抗體″。用于產(chǎn)生嵌合抗體的方法包括常規(guī)的重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，目前為本領(lǐng)域熟知。參見，例如，Morrison，S.L.，等.，Proc.Natl.Acad Sci.USA81(1984)6851-6855；美國專利5,202,238和5,204,244。
術(shù)語″人源化抗體″指其中構(gòu)架或″互補(bǔ)性決定區(qū)″(CDR)已經(jīng)修飾以包括與親本免疫球蛋白相比具有不同特異性的免疫球蛋白的CDR的抗體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將大鼠CDR植入人抗體的框架區(qū)以制備″人源化抗體″。參見，例如，Riechmann，L，等.，Nature 332(1988)323-327以及Neuberger，M.S.，等.，Nature 314(1985)268-270。尤其優(yōu)選的CDR與用于嵌合的和雙功能的抗體的上述識(shí)別抗原的代表性序列相對(duì)應(yīng)。本發(fā)明人源化抗體的實(shí)例在圖9和10中顯示。
術(shù)語“T細(xì)胞表位缺失的抗體”指通過除去人T細(xì)胞表位(蛋白質(zhì)內(nèi)具有結(jié)合II類MHC分子能力的肽序列)而修飾以消除或降低免疫原性的抗體。通過該方法，肽的氨基酸側(cè)鏈和具有II類MHC結(jié)合溝的特異結(jié)合口袋之間的相互作用得到鑒定。所鑒定的免疫原性區(qū)域被突變以消除免疫原性。上述方法通常在，例如，WO 98/52976中描述。有用的和按照本發(fā)明的T細(xì)胞表位缺失的抗體可變區(qū)的實(shí)例在圖7和8中顯示。
如此處使用的，″結(jié)合″指抗體以約300pM或更低、優(yōu)選約200pM或更低(KD)、更優(yōu)選約70-200pM的親合力與IL-1R的結(jié)合。
如此處使用的術(shù)語″核酸分子″，意指包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但優(yōu)選為雙鏈DNA。
如此處使用的″可變區(qū)″(輕鏈可變區(qū)(VL))，重鏈可變區(qū)(VH))表示直接參與抗體與抗原的結(jié)合的輕鏈和重鏈對(duì)中的每一個(gè)?？勺兊妮p和重鏈的結(jié)構(gòu)域具有相同的一般結(jié)構(gòu)并且每個(gè)結(jié)構(gòu)域包括四個(gè)框架(FR)區(qū)，其序列廣泛保守，通過三個(gè)″高變區(qū)″(或互補(bǔ)性決定區(qū)，CDR)連接。構(gòu)架區(qū)采用β-折疊構(gòu)象并且CDR可形成連接該β-折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈的CDR通過框架區(qū)保持其三維結(jié)構(gòu)并且與來自另一條鏈的CDR形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。抗體的重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在本發(fā)明抗體的結(jié)合特異性/親合力中起著尤其重要的作用，因此提供本發(fā)明的另一個(gè)目的。
在此處所用的術(shù)語″高變區(qū)″或″抗體的抗原-結(jié)合部分″指抗體的負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的氨基酸殘基。高變區(qū)包括來自″互補(bǔ)性決定區(qū)″或″CDR″的氨基酸殘基?！蹇蚣堋寤颉錐R″區(qū)為除如此處定義的高變區(qū)殘基以外的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)。因此，抗體的輕和重鏈包括結(jié)構(gòu)域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4的N-至C-末端。尤其是，重鏈的CDR3是抗原結(jié)合貢獻(xiàn)最大的區(qū)域。CDR和FR區(qū)按照Kabat等的標(biāo)準(zhǔn)定義(Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5th ed.，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991))和/或來自″高變環(huán)″的那些殘基確定。
如此處使用的術(shù)語″與IL-1R結(jié)合″表示在體外ELISA測定，優(yōu)選在利用生物素化的人IL-1R和鏈親和素包被的微量滴定板的結(jié)合測定中抗體對(duì)IL-1R的結(jié)合親合力。還可以通過Biacore測定法(Biacore AB，Uppsala，瑞典)研究對(duì)IL-1R的結(jié)合親合力。結(jié)合親合力由術(shù)語kon(來自抗體/抗原復(fù)合物的抗體的締合速率常數(shù))、koff(解離常數(shù))和KD(kon/koff)定義。本發(fā)明的抗體顯示300pM或更低、優(yōu)選200pM或更低，以及更優(yōu)選70-200pM的KD并且抑制對(duì)IL-1R的結(jié)合和優(yōu)選與IL-1R在與IL-1相同的位點(diǎn)上結(jié)合。
術(shù)語″IL-1R表達(dá)細(xì)胞″指表達(dá)IL-1受體的所述細(xì)胞。上述細(xì)胞有，例如，諸如MRC5細(xì)胞的人成纖維細(xì)胞。
本發(fā)明的抗體顯示與IL-1R在和抗體2D8相同的表位上結(jié)合，或者由于結(jié)合的空間位阻而被抑制與IL-1R結(jié)合。結(jié)合抑制可通過利用固定的IL-1R和抗體2D8的競爭測定法檢測。50％或更多的信號(hào)減少表明該抗體與抗體2D8競爭。
術(shù)語″表位″指能特異性結(jié)合抗體的蛋白決定簇。表位通常由分子的化學(xué)活性表面組群組成，例如氨基酸或糖側(cè)鏈并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特性以及特定的電荷特性。構(gòu)象和非構(gòu)象的表位區(qū)別在于在變性溶劑存在時(shí)與前者而不是與后者的結(jié)合喪失。本發(fā)明抗體特異性結(jié)合的IL-1R的表位通過本發(fā)明的抗體結(jié)合天然和變性的IL-1R來識(shí)別。本發(fā)明的抗體結(jié)合人IL-1R(糖基化的、可溶性的胞外域)比結(jié)合去糖基化的IL-1R(用N-糖苷酶F處理后，通過蛋白質(zhì)印跡測定)要強(qiáng)約至少50倍，優(yōu)選至少100倍。因此，對(duì)于與去糖基化的IL-1R的結(jié)合，本發(fā)明的抗體顯示顯著降低的親合力。
本發(fā)明的抗體另外包括，具有″保守序列修飾″、核苷酸和氨基酸序列修飾而不影響或改變上述本發(fā)明抗體特性的這樣的抗體?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如定點(diǎn)誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變引入修飾。保守的氨基酸替代包括其中氨基酸殘基用具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換的那些。具有類似側(cè)鏈氨基酸殘基的家族已在本領(lǐng)域中確定。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，酸性側(cè)鏈的(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，不帶電的極性側(cè)鏈的(例如甘氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非極性側(cè)鏈的(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，β-支鏈的(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈的(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，人抗-IL-1R抗體中預(yù)測的非必需氨基酸殘基可優(yōu)選用來自相同側(cè)鏈家族的另一個(gè)氨基酸殘基替換。
氨基酸替代可通過以Riechmann，L，等.，Nature 332(1988)323-327和Queen，C.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033所述的分子建模為基礎(chǔ)的誘變來進(jìn)行。
本發(fā)明的抗體優(yōu)選在體內(nèi)(獼猴(Cynomolgus)或人)表現(xiàn)約至少5天，優(yōu)選8-15天的血清半衰期。
本發(fā)明的抗體優(yōu)選通過重組方法產(chǎn)生。所述方法在本領(lǐng)域中眾所周知并且包括在原核和真核細(xì)胞中的蛋白表達(dá)以及隨后抗體多肽的分離和常規(guī)純化至藥物可接受的純度。為了蛋白表達(dá)，將編碼輕和重鏈或其片段的核酸通過標(biāo)準(zhǔn)方法插入表達(dá)載體中。表達(dá)在合適的原核或真核宿主細(xì)胞如CHO細(xì)胞、NS0細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、COS細(xì)胞、酵母或大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行，并且從細(xì)胞回收抗體(上清或裂解后的細(xì)胞)。
抗體的重組生產(chǎn)在本領(lǐng)域中眾所周知并且例如在Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.，等.，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner，R.G，Drug Res.48(1998)870-880的綜述文章中描述。
抗體可以以整個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或部分純化或基本上純的形成存在。為了消除其它細(xì)胞組分或其它雜質(zhì)，例如其它細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)，通過包括堿性/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及其它本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行純化。參見Ausubel，F(xiàn).，等.，編輯Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，紐約(1987)。
在NS0細(xì)胞中的表達(dá)在例如Barnes，L.M.，等.，Cytotechnology 32(2000)109-123；Barnes，L.M.，等.，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270中描述。瞬時(shí)表達(dá)通過，例如Durocher，Y.，等.，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述。可變域的克隆通過Orlandi，R.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter，P.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Norderhaug，L.，等.，J.Immunol.Methods 204(1997)77-87描述。優(yōu)選的瞬時(shí)表達(dá)體系(HEK 293)在Schlaeger，E.-J.，和Christensen，K.，Cytotechnology 30(1999)71-83中以及在Schlaeger，E.-J.，J.Immunol.Methods 194(1996)191-199中描述。
適于原核生物的調(diào)控序列，例如，包括啟動(dòng)子、任選地操縱子序列、和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和聚腺苷酸化信號(hào)。
當(dāng)將核酸放置到與另一個(gè)核酸序列的功能關(guān)系中時(shí)其是″可操作連接的″。例如，如果作為參與多肽分泌的前導(dǎo)肽表達(dá)，則先導(dǎo)序列或分泌性前導(dǎo)序列的DNA與多肽DNA是可操作連接的；如果影響序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子或增強(qiáng)子與編碼序列是可操作連接的；或者如果為了促進(jìn)翻譯而置入，則核糖體結(jié)合位點(diǎn)與編碼序列是可操作連接的。通常，″可操作連接的″指連接的DNA序列是緊接的，并且在分泌性前導(dǎo)序列的情況下是緊接的和在讀框內(nèi)的。然而，增強(qiáng)子不必是緊接的。連接通過在便利的限制性位點(diǎn)的連接反應(yīng)完成。如果不存在所述位點(diǎn)，通常的做法是使用合成的寡核苷酸連接物或接頭。
單克隆抗體通過常規(guī)的免疫球蛋白純化方法如例如，A蛋白-瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養(yǎng)基中合適地分離。編碼單克隆抗體的DNA和RNA很容易利用常規(guī)方法分離和測序。雜交瘤細(xì)胞可用作所述DNA和RNA的來源。一旦分離，DNA可插入表達(dá)載體，其隨后轉(zhuǎn)染入不另外產(chǎn)生免疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞如HEK 293細(xì)胞、CHO細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞中，以在宿主細(xì)胞中獲得重組單克隆抗體的合成。
人IL-1R抗體的氨基酸序列變體是通過將合適的核苷酸變化引入抗體DNA中，或通過肽合成來制備。然而，上述修飾僅在很有限的范圍內(nèi)，例如如上所述的范圍內(nèi)進(jìn)行。例如，該修飾不改變上述抗體特性如IgG同型和表位結(jié)合，但是可以改善重組生產(chǎn)的產(chǎn)率、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或促進(jìn)純化。
任何不參與維持抗-IL-1R抗體適當(dāng)構(gòu)象的半胱氨酸殘基也可以通常用絲氨酸替代，以改進(jìn)分子的氧化穩(wěn)定性和防止異常交聯(lián)。反之，可以將半胱氨酸鍵加入抗體以改進(jìn)其穩(wěn)定性(尤其當(dāng)抗體是諸如Fv片段的抗體片段時(shí))。
抗體的另一個(gè)類型的變體改變了抗體最初的糖基化模式。通過改變意指缺失一個(gè)或多個(gè)抗體中存在的糖部分，和/或添加一個(gè)或多個(gè)抗體中不存在的糖基化位點(diǎn)?？贵w的糖基化一般是N-聯(lián)的。N-聯(lián)的是指糖部分附著于天門冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天門冬酰胺-X-絲氨酸和天門冬酰胺-X-蘇氨酸，其中X為除脯氨酸外的任何氨基酸，是將糖部分與天門冬酰胺側(cè)鏈酶促連接的識(shí)別序列。因此，多肽中這些三肽序列任何一個(gè)的存在產(chǎn)生一個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。糖基化位點(diǎn)添加至抗體是通過改變氨基酸序列以使其包含一個(gè)或多個(gè)上述三肽序列(用于N-聯(lián)糖基化位點(diǎn))而方便地完成。
編碼抗-IL-1R抗體的氨基酸序列變體的核酸分子通過本領(lǐng)域已知的各種方法制備。這些方法包括，但不限于，從天然源分離(在天然存在的氨基酸序列變體的情況下)或通過寡核苷酸-介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變、PCR誘變和盒式誘變較早制備的變體或非-變體形式的人源化或T細(xì)胞表位缺失的抗-IL-1R抗體來制備。
共價(jià)修飾的另一種類型包括化學(xué)或酶催化偶聯(lián)糖苷至抗體。這些方法因?yàn)槠洳恍枰诰哂蠳-或O-聯(lián)糖基化能力的宿主細(xì)胞中生產(chǎn)抗體而是便利的。取決于所用的偶聯(lián)方式，糖可以附著于(a)精氨酸和組氨酸，(b)游離羧基，(c)游離巰基如半胱氨酸的巰基，(d)游離羥基如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的羥基，(e)芳香族殘基如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的殘基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。這些方法在WO 87/05330和在Aplin，J.D.，和Wriston，J.C.Jr.，CRC Crit.Rev.Biochem.4(1981)259-306中描述。
抗體上存在的任何糖部分的除去可通過化學(xué)或酶學(xué)方法完成?；瘜W(xué)去糖基化需要抗體暴露于化合物三氟甲磺酸，或等價(jià)化合物。該處理導(dǎo)致除了連接的糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)以外大多數(shù)或所有糖的裂解，而留下完好的抗體?；瘜W(xué)去糖基化在Sojahr，H.T.，和Bahl，O.P.，Arch.Biochem.Biophys.259(1987)52-57以及Edge，A.S.，等.Anal.Biochem.118(1981)131-137中描述?？贵w上糖部分酶促裂解可通過使用Thotakura，N.R.，和Bahl，O.P.，Meth.Enzymol.138(1987)350-359所述的各種內(nèi)-和外-切糖苷酶而完成。
抗體共價(jià)修飾的另一種類型包括將抗體與各種非蛋白質(zhì)類聚合物的一種，例如，聚乙二醇、聚丙二醇、或聚氧化烯，以美國專利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述的方式連接。
本發(fā)明優(yōu)選包括編碼與IL-1R結(jié)合的多肽的核酸片段，其中所述多肽抑制IL-1與IL-1R的結(jié)合，選自由SEQ ID NO1的可變區(qū)組成的重鏈(VH)和由SEQ ID NO2的可變區(qū)組成的輕鏈(VL)。
重建的重鏈和輕鏈可變區(qū)與啟動(dòng)子、翻譯起始、恒定區(qū)、3′未翻譯端、聚腺苷酸化以及轉(zhuǎn)錄終止序列結(jié)合以形成表達(dá)載體構(gòu)建體。重鏈和輕鏈表達(dá)構(gòu)建體可結(jié)合成為單一載體，共-轉(zhuǎn)染、依次轉(zhuǎn)染或分開轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，其隨后融合形成表達(dá)兩條鏈的單一宿主細(xì)胞。
因此，本發(fā)明提供用于本發(fā)明重組人抗體生產(chǎn)的方法，其特征在于在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼由SEQ ID NO1的可變區(qū)(VH)組成的重鏈，以及由SEQ ID NO2的可變區(qū)(VL)和人輕鏈恒定區(qū)(CL)組成的輕鏈的核酸，并且從上述細(xì)胞回收所述抗體。
本發(fā)明進(jìn)一步包括本發(fā)明的抗體用于體外IL-1R診斷的應(yīng)用，優(yōu)選通過免疫測定法測定樣品的IL-1R和本發(fā)明抗體之間的結(jié)合。
在另一方面，本發(fā)明提供一種組合物，例如藥物組合物，包含本發(fā)明的單克隆抗體的一種或組合，或其抗原結(jié)合部分，與藥物可接受載體一起配制。
如此處使用的，″藥物可接受載體″包括生理上相容的任何和所有溶劑、分散劑、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲的和吸收延緩試劑等等。優(yōu)選地，載體適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊柱或表皮的給藥(例如通過注射或輸注)。
″藥物可接受鹽″指保持抗體所需生物活性且不帶來任何不想要的毒性效果的鹽(參見例如Berge，S.M.，等.，J.Pharm.Sci.66(1977)1-19)。所述鹽包括在本發(fā)明內(nèi)。所述鹽的實(shí)例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括源自非毒性無機(jī)酸的那些鹽，如鹽酸鹽。
本發(fā)明的組合物可通過本領(lǐng)域已知的各種方法給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，給藥途徑和/或方式將取決于所需的結(jié)果而改變。
為了以某種給藥途徑給藥本發(fā)明化合物，為防其失活，用材料包被化合物或?qū)⒒衔锱c材料共同-給藥將是必需的。例如，化合物可以在合適的載體，例如脂質(zhì)體或稀釋劑中給藥于患者。藥物可接受的稀釋劑包括鹽水和水性緩沖液。
藥物可接受載體包括無菌水溶液或分散體以及用于無菌可注射溶液或分散體臨時(shí)制備的無菌粉劑。用于藥物活性物質(zhì)的上述介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域已知的。
如此處使用的短語″腸胃外給藥″和″腸胃外施用″指除了腸內(nèi)以外的給藥方式以及局部給藥方式，通常通過注射，包括但不限于，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外以及胸骨內(nèi)的注射和輸注。
這些組合物還可包含賦形劑如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。可通過滅菌方法或無菌制備條件，以及通過包含各種抗菌劑和抗真菌劑，例如對(duì)羥苯甲酸、氯丁醇、苯酚、山梨酸等等而確保防止微生物的存在。組合物中包含等滲劑，如糖、氯化鈉等等也是所需的。另外，可注射藥物形式的延長吸收可通過包含延遲吸收的試劑如單硬脂酸鋁和明膠來完成。
不管選擇怎樣的給藥途徑，將可以以合適的水合形式使用的本發(fā)明的化合物和/或本發(fā)明的藥物組合物通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法配制為藥物可接受的劑型。
本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可以改變以獲得一定量的活性成分，其有效獲得對(duì)特定患者、組合瓦和給藥方式所期望的治療反應(yīng)，而對(duì)患者是非毒性的。所選的劑量水平將取決于各種藥物動(dòng)力學(xué)因素而變化，所述藥物動(dòng)力學(xué)因素包括所用的本發(fā)明特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性、給藥途徑、給藥時(shí)間、所用特定化合物的排出速率、治療的持續(xù)時(shí)間、與所用的特定組合物聯(lián)合使用的其它藥物、化合物和/或材料、接受治療的患者年齡、性別、體重、病癥、一般健康狀況和先前的病史以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中熟知的類似因素。
組合物必須是無菌的和流體的以使組合物可通過注射器傳遞。除了水之外，載體可以是等滲的緩沖鹽水溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等等)和其合適的混合物。
可例如通過使用包衣如卵磷脂、在分散體情形中通過保持所需粒徑和通過使用表面活性劑來保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。多數(shù)情況下，優(yōu)選組合物中包括等滲試劑，例如糖、多元醇如甘露糖醇或山梨糖醇和氯化鈉。注射組合物的長期吸收可通過在組合物中包含延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁或明膠來實(shí)現(xiàn)。
如上所述，當(dāng)活性物質(zhì)得到合適保護(hù)時(shí)，化合物可經(jīng)口服給藥，例如和惰性稀釋劑或可吸收的可食用載體一起。
本發(fā)明的抗體可用于治療患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎且需要所述治療的患者。因此，本發(fā)明包括用于治療患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供用于制備藥物組合物的方法，藥物組合物包括有效量的本發(fā)明的抗體和藥物可接受載體，以及本發(fā)明的抗體用于上述方法的應(yīng)用。
提供以下實(shí)施例、參考文獻(xiàn)和序列表以幫助理解發(fā)明，本發(fā)明的真實(shí)范圍在后附的權(quán)利要求中闡述。應(yīng)當(dāng)理解在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)下可對(duì)所述的方法進(jìn)行改變。
附圖簡述 圖1 2D8抗體的ELISA結(jié)合測定 圖2 2D8抗體對(duì)IL-1R的親合力的測定 圖3 2D8抗體與配體IL-1與IL-1R的結(jié)合的競爭作用 圖4 三元復(fù)合物構(gòu)建hIL-1/hIL-1R/hIL-1R AcP被2D8抗體抑制 上面的線hIL-1/hIL-1R與hIL-1R Acp的結(jié)合 底下的線添加抗體2D8 圖5 MRC-5細(xì)胞中IL-1誘導(dǎo)的IL-8生產(chǎn)的抑制 圖6 人血中IL-1誘導(dǎo)的IL-8生產(chǎn)的抑制 圖7 T細(xì)胞表位缺失的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列 圖8 T細(xì)胞表位缺失的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列 圖9 人源化的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列 圖10 人源化的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列 圖11 IL-1R的氨基酸序列 粗體N潛在的糖基化位點(diǎn) 圖12 用糖苷酶處理后糖基化的IL-1R的SDS PAGE分析 圖13 2D8與糖基化和去糖基化的IL-1R的蛋白質(zhì)印跡 圖14 輕鏈恒定區(qū) 圖15 重鏈(IgG4)恒定區(qū) 圖16 重鏈(IgG1)恒定區(qū) 圖17 DEI5/8的重鏈和輕鏈 序列描述 SEQ ID NO1 大鼠2D8的重鏈可變區(qū)；氨基酸1-19信號(hào)序列，20-134可變區(qū)，135-139大鼠來源的末端片段 SEQ ID NO2 大鼠2D8的輕鏈可變區(qū)；氨基酸1-20信號(hào)序列，21-129可變區(qū)，130-138大鼠來源的末端片段 SEQ ID NO3 2D8嵌合H-鏈(大鼠/人)(IgG1)的氨基酸序列 SEQ ID NO4 2D8嵌合H-鏈(大鼠/人)(IgG4)的氨基酸序列 SEQ ID NO5 2D8嵌合L-鏈(大鼠/人)的氨基酸序列 SEQ ID NO6 HURVH的氨基酸序列(圖7和圖9) SEQ ID NO7 HURDIVHv1的氨基酸序列(圖7) SEQ ID NO8 HURDIVHv2的氨基酸序列(圖7) SEQ ID NO9 HURDIVHv3的氨基酸序列(圖7) SEQ ID NO10 HURDIVHv4的氨基酸序列(圖7) SEQ ID NO11 HURDIVHv5的氨基酸序列(圖7) SEQ ID NO12 HURDIVHv6的氨基酸序列(圖7) SEQ ID NO13 HURVK的氨基酸序列(圖8和圖10) SEQ ID NO14 HURDIVKv4的氨基酸序列(圖8) SEQ ID NO15 HURDIVKv5的氨基酸序列(圖8) SEQ ID NO16 HURDIVKv7的氨基酸序列(圖8) SEQ ID NO17 HURDIVKv8的氨基酸序列(圖8) SEQ ID NO18 HURDIVKv9的氨基酸序列(圖8) SEQ ID NO19 HURDIVKv10的氨基酸序列(圖8) SEQ ID NO20 HUR HuVHv1的氨基酸序列(圖9) SEQ ID NO21 HUR HuVHv2的氨基酸序列(圖9) SEQ ID NO22 HUR HuVHv3的氨基酸序列(圖9) SEQ ID NO23 AAB67785-1的氨基酸序列(圖9) SEQ ID NO24 HUR HuVKvl的氨基酸序列(圖10) SEQ ID NO25 HUR HuVKv2的氨基酸序列(圖10) SEQ ID NO26 HUR HuVKv3的氨基酸序列(圖10) SEQ ID NO27 CAD43025的氨基酸序列(圖10) SEQ ID NO28 IL-1R的氨基酸序列(圖11) SEQ ID NO29 輕鏈恒定區(qū)的序列(圖14) SEQ ID NO30 重鏈IgG4的序列(圖15) SEQ ID NO31 IgG1恒定區(qū)的序列(圖16) SEQ ID NO32 DEI5/8的重鏈序列(圖17) SEQ ID NO33 DEI5/8的輕鏈序列(圖17) 實(shí)施例 實(shí)施例1 針對(duì)h-IL-1R的大鼠單克隆抗體的產(chǎn)生 雜交瘤的培養(yǎng) 產(chǎn)生的大鼠單克隆抗體在RPMI 1640和10％無血清Hyclone培養(yǎng)基(BioWhittaker)中37℃和5％CO2下培養(yǎng)。
免疫方法和雜交瘤開發(fā) 5只Sprague Dawley大鼠用SF9昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)的重組人IL-1R免疫。初次免疫(100μg蛋白質(zhì))經(jīng)腹膜在完全弗氏佐劑中進(jìn)行。所有其它的免疫用不完全弗氏佐劑進(jìn)行。單克隆抗體通過NSO細(xì)胞與大鼠脾細(xì)胞的融合產(chǎn)生。
實(shí)施例2 IL-1R特異的ELISA 免疫小鼠血清或培養(yǎng)物上清中抗體的抗-IL-1R效價(jià)通過抗原特異的ELISA測定。PBSBSA(PBS/1％BSA)中0.125μg/ml濃度的可溶的生物素化h-IL-1R在振蕩器上室溫包被96孔平板1h(用鏈親和素預(yù)包被)。其后用PBSBSA室溫封閉孔30min。血清在PBSBSA中預(yù)稀釋1/100并且連續(xù)稀釋至1/6400。上清通過計(jì)算在1/100至1/10000的范圍內(nèi)在PBSBSA中稀釋。稀釋的血清或上清加至孔并且在振蕩器上室溫溫育2h。前-采吸的血清或培養(yǎng)基用作陰性對(duì)照。125ng/ml的大鼠抗-人-IL-1R-抗體(克隆2D8)用作陽性對(duì)照。隨后，平板用PBS/0.05％吐溫20洗滌三次并且在PBSBSA中1∶18750稀釋，和辣根過氧化物酶(HRP)-偶聯(lián)的兔-抗-大鼠IgG(Bethyl Laboratories Inc.)在振蕩器上室溫溫育1h。孔用PBS/0.05％吐溫20洗滌4次并且用新制備的TM Blue(Intergen Company)溶液在振蕩器上室溫下暗處進(jìn)行顯色15-20min。在370nm下測定吸光度，492nm作為參考波長?？蛇x擇地，顯色反應(yīng)可通過將20μl 1M H2SO4加至每個(gè)孔而終止；在這種情況下在450nm進(jìn)行測量，690nm作為參考波長。結(jié)果在圖1中顯示。
實(shí)施例3 抗-hIL-1R抗體結(jié)合性質(zhì)的測定 測定在BIACORE3000上利用CM5芯片進(jìn)行。偶聯(lián)以胺偶聯(lián)進(jìn)行。所用的緩沖液為PBST(PBS+0.05％吐溫)pH 7.4，25℃。
a)抗-hIL-1R抗體對(duì)IL-1R的親合力的測定 對(duì)于親合力測定，將抗-Fcγ抗體(兔-抗-人)偶聯(lián)至芯片表面用于呈遞針對(duì)IL-1R的抗體?？?IL-1R抗體與抗-Fcγ抗體結(jié)合并且重組人IL-1R胞外域以溶液中的各種濃度加入。締合通過IL-1R 60s的注射來測定，解離通過用緩沖液洗滌芯片表面3min來測定。抗體的親合常數(shù)KD(Kon/Koff)為 抗體2D8 100pM 嵌合2D8(IgG1)93pM 嵌合2D8(IgG4)105pM 所有抗體的所有測定的數(shù)據(jù)范圍在70-120pM之間，因此該三個(gè)抗體的親合力在相同的范圍內(nèi)。
b)抗-hIL-1R抗體和配體IL-1與IL-1R的結(jié)合的競爭作用 對(duì)于這些測定使用與a)中相同的方法。如果hIL-1R結(jié)合抗-hIL-1R抗體2D8，hIL-1就不再結(jié)合該受體。該抗體封閉了受體上hIL-1的結(jié)合位點(diǎn)(圖3)。
c)三元復(fù)合物建立hIL-1/hIL-1R/hIL-1R AcP被抗體抗-hIL-1R 2D8抑制 為了檢測三元復(fù)合物，將多克隆抗-IgG抗體偶聯(lián)至芯片表面用于展呈融合蛋白Fc/hIL-1R AcP(Swiss Prot Q9NPH3；R&D Sytems)。檢測到溶液中hIL-1/hIL-1R復(fù)合物與固定的hIL-1R AcP的結(jié)合。當(dāng)與hIL-1R溫育時(shí)，抗體抗-hIL-1R 2D8抑制了該三元復(fù)合物hIL-1/hIL-1R/hIL-1R AcP的形成(圖4)。
實(shí)施例4 a)MRC-5細(xì)胞中IL-1誘導(dǎo)的IL-8生產(chǎn)的抑制 人成纖維細(xì)胞中IL-1誘導(dǎo)的IL-8生產(chǎn)的抑制以細(xì)胞生物測定法測定。將人胚胎肺成纖維細(xì)胞MRC-5用h-IL1β刺激并且用一步ELISA測定IL-8的生產(chǎn)。通過添加抗-h-IL-1R抗體對(duì)刺激的抑制證實(shí)該抗體的阻斷功能。
生物測定法按照以下測定步驟進(jìn)行 第1天MRC-5細(xì)胞以2.5×103細(xì)胞/孔的密度接種入100μl的培養(yǎng)基中(10％FBS)并且在恒溫箱中溫育24h。
第2天除去培養(yǎng)基并且將樣品加入50μl測定培養(yǎng)基(1％FBS)(當(dāng)檢測純化的抗體時(shí))或雜交瘤-培養(yǎng)基SF(當(dāng)檢測雜交瘤上清時(shí))。雜交瘤上清的最佳稀釋在1∶1000和1∶1,000,000之間)。溫育在恒溫箱中進(jìn)行30min。隨后將h-IL-1β，50μl/孔(2×濃縮的！)加入測定-培養(yǎng)基中(1％FBS，或者如果檢測雜交瘤-上清，2％FBS)至最終1％的FBS濃度。另外的溫育在37℃進(jìn)行7h并且將上清(80μl)轉(zhuǎn)移至另一個(gè)96-孔平板中。
b)h-IL-8-ELISA 該測定法(Miller，M.D.，和Krangel，M.S.，crit.Rev.Immunol.12(1992)17-46)用未稀釋的上清按照制造商的方案(R&D Systems，USA)進(jìn)行(用于血液和腦脊髓液體樣品的方案)。最大刺激(無抗體的對(duì)照)大約為750pg/ml IL-8。IL-8分泌受抗體抑制的IC50在圖5中顯示并且為 抗體2D8 7.2pM(1.08ng/ml) 嵌合2D8(IgG1)4.7pM(0.71ng/ml) 嵌合2D8(IgG4)5.1pM(0.77ng/ml) 使用本發(fā)明抗體的所有實(shí)驗(yàn)的范圍為4.0-35.0pM。
在該MRC-5生物測定法中2D8和可商購的IL-1R抗體的比較在表1中顯示 表1 制備商目錄號(hào)#克隆宿主IgG類型抗原中和*IC-50 2D8大鼠IgG2a是1.08ng/ml AntigenixMC260020R11大鼠IgG2aCD121a是＞100ng/ml AntigenixMC261020R12大鼠IgG2aCD121a不是＞100ng/ml PBL Biomedical Laboratories21808-1RMHlR-1大鼠IgG2aCD121a是33ng/ml PBL Biomedical Laboratories21809-1RMH1R-2大鼠IgG2aCD121a不是＞100ng/ml Cell SciencesCM2028RMHL-1大鼠IgG2aCD121a是＞100ng/ml R&D SystemsMAB26935730小鼠IgG1s-IL-1RI未知＞100ng/ml BD Pharmingen551388HIL1R-M1小鼠IgG1，κCD121a未知＞100ng/ml Biotrend0100-024249/20小鼠IgG1s-IL-1RI是＞100ng/ml 基于圖7-10的氨基酸序列，通過誘變構(gòu)建一系列人源化的和T細(xì)胞抗原缺失的抗體并且通過h-IL-8-ELISA研究IC50。相對(duì)于抗體2D8(1.0)的結(jié)果在表2中顯示。
所用縮寫的說明 HUM圖9和10序列的組合 DEI圖7和8序列的組合 HUM2/2HURHuVHv2和HURHuVKv2序列的組合 DEI1/8HURDIVHv1和HURDIVKv8序列的組合 表2 抗體 生物測定法第一次實(shí)驗(yàn)第二次實(shí)驗(yàn)均值 2D8--1.0 DEI5/73.41.22.3 DEI4/73.43.53.5 DEI2/42.52.02.3 DEI5/43.11.92.5 DEI4/51.54.53.0 DEI5/55.23.94.6 HUM2/20.91.01.0 HUM2/30.81.51.2 DEI1/83.20.72.0 DEI2/83.31.42.4 DEI2/92.72.82.8 DEI4/95.24.14.7 DEI5/81.72.22.0 DEI5/91.62.82.2 c)通過ELISA測定免疫活性 通過ELISA測定抗體和2D8抗體相比的相對(duì)免疫活性。將可溶性的生物素化人IL-1R室溫下包被至96-孔-平板1h(用鏈親和素預(yù)包被)。用BSA封閉后稀釋抗體并加到孔中，并且在室溫下溫育兩小時(shí)。將平板洗滌三次且與辣根-過氧化物酶(POD)-偶聯(lián)的兔-抗-大鼠-IgG在室溫下溫育1h。在進(jìn)一步洗滌后通過加入TM-BlueR并且在370nm測量吸光度來測定結(jié)合的抗體的量。
結(jié)果顯示在表3中。 表3抗體 ELISA第一個(gè)實(shí)驗(yàn)第二個(gè)實(shí)驗(yàn)均值2D8--1.0DEI5/71.31.51.4DEI4/72.12.12.1DEI2/41.51.81.7DEI5/41.91.81.9DEI4/53.02.22.6DEI5/53.13.43.3HUM2/21.31.61.4HUM2/32.22.12.2DEI1/82.12.22.2DEI2/81.52.62.1DEI2/91.41.81.6DEI4/92.22.62.4DEI5/81.41.91.7DEI5/91.32.21.9 實(shí)施例5 人血液中IL-1誘導(dǎo)的IL-8生產(chǎn)的抑制 為了評(píng)估抗體2D8抑制人血液中IL-1-誘導(dǎo)的IL-8生產(chǎn)的阻斷能力，進(jìn)行一種生物測定法。用肝素(19U/ml)收集的人血液用10ng/ml h-IL1β刺激并且用一步ELISA測定IL-8的生產(chǎn)。在人活體外測定法中刺激被添加抗-h-IL-1R抗體抑制證實(shí)了抗體的阻斷功能。生物測定法按照實(shí)施例4的描述進(jìn)行，除了在存在或不存在抗體時(shí)與IL-1的溫育在37℃進(jìn)行16h并且按照制造商的方案(R&D Systems，USA)檢測1∶5稀釋的樣品中IL-8的存在。人血液中IL-1誘導(dǎo)的IL-8生產(chǎn)受到100ng/ml濃度的2D8抗體～50％的抑制(參見圖6)。
實(shí)施例6 抗體的重組生產(chǎn) 構(gòu)建用于表達(dá)由人恒定區(qū)連接鼠可變區(qū)組成的嵌合抗體的載體。在表達(dá)載體pSVgpt中構(gòu)建由抗-IL1R大鼠VH連接人IgG1和人IgG4恒定區(qū)組成的兩個(gè)嵌合重鏈表達(dá)載體。在表達(dá)載體pSVhyg中構(gòu)建由抗-IL1R大鼠VK連接人Cκ組成的嵌合輕鏈載體。將包括前導(dǎo)序列信號(hào)肽、前導(dǎo)序列內(nèi)含子和鼠免疫球蛋白啟動(dòng)子的5′側(cè)翼序列和包括剪接位點(diǎn)和內(nèi)含子序列的3′側(cè)翼序列引入嵌合表達(dá)載體。重鏈和輕鏈表達(dá)載體通過電穿孔法共-轉(zhuǎn)染入NS0細(xì)胞(ECACC No 85110503，一種不生產(chǎn)免疫球蛋白的小鼠骨髓瘤)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆通過人IgG的ELISA進(jìn)行人抗體生產(chǎn)的篩選。
實(shí)施例7 IL-1R的去糖基化 從轉(zhuǎn)化的SF9昆蟲細(xì)胞上清純化的5μg重組可溶性人1型IL-1受體(IL-1R，氨基酸序列(參見圖11))分別與3mU神經(jīng)氨酸酶(N)(RocheDiagnostics GmbH，DE；No.269611)、0.3UN-糖苷酶F(Roche DiagnosticsGmbH，DE；No.1365185)和0.15mU UO-糖苷酶(Roche DiagnosticsGmbH，DE；No.1347101)在37℃溫育17小時(shí)。離心后樣品通過SDS-PAGE分析。
SDS-PAGE分析(圖12)證實(shí)與N-糖苷酶F(泳道3)溫育后IL-1R(泳道1)的分子量降低了約9kDa而與神經(jīng)氨酸酶(泳道2)和O-糖苷酶(泳道4)溫育后沒有觀察到分子量的顯著變化。N-糖苷酶F與神經(jīng)氨酸酶(泳道5)、N-糖苷酶F和O-糖苷酶(泳道6)或者所有的三個(gè)(泳道8)的組合沒有導(dǎo)致糖側(cè)鏈的更進(jìn)一步的任何裂解。神經(jīng)氨酸酶和O-糖苷酶的組合沒有除去任何糖側(cè)鏈(泳道7)。
數(shù)據(jù)表明IL-1R在一個(gè)或多個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)被糖基化并且該N-聯(lián)糖基化可通過與N-糖苷酶F溫育而徹底除去。未檢測到O-聯(lián)糖基化。
2D8抗體的蛋白質(zhì)印跡數(shù)據(jù)在圖13中顯示(泳道同圖12)。
實(shí)施例8 表位的測定 抗原分子上抗體的結(jié)合區(qū)(表位)通過印跡和肽掃描分析測定。
對(duì)于印跡分析，將天然或變性的重組、可溶性的人IL-1R(rshIL-1R)樣品直接點(diǎn)樣至膜上，與抗-hIL1R抗體溫育并且用抗-FCγ-POD-抗體通過化學(xué)發(fā)光檢測而檢測。此外，rshIL-1R用N-糖苷酶F去糖基化并且糖基化的和去糖基化的rshIL-1R在還原的變性條件下在SDS-PAGE上分離。蛋白質(zhì)印跡至PVDF-膜上，與抗-hIL-1R抗體溫育并且用抗-FCγ-POD-抗體通過化學(xué)發(fā)光檢測而檢測。
斑點(diǎn)印跡分析表明本發(fā)明的抗體在天然和變性條件下特異性地結(jié)合rshIL-1R。最后，蛋白質(zhì)印跡分析表明本發(fā)明的抗體僅識(shí)別糖基化的rshIL1R(天然或變性的)。去糖基化的hIL1R未在蛋白質(zhì)印跡分析中檢測到。其它糖基化的蛋白質(zhì)(例如促紅細(xì)胞生成素、羧肽酶Y)不被本發(fā)明的抗體識(shí)別，因此糖基化rshIL-1R的識(shí)別是高度特異性的。
另外，合成代表rshIL1R胞外結(jié)構(gòu)域的生物素化的肽(20個(gè)氨基酸)用于抗-IL-1R/rshIL-1R肽掃描分析中。該肽重疊10個(gè)氨基酸并且包含惰性N-末端生物素化的間隔區(qū)。該生物素化的肽偶聯(lián)至鏈親和素包被的微量滴定板，與抗-hIL1R抗體溫育并且用抗-FCγ-抗體檢測。結(jié)合的多肽代表IL-1R的識(shí)別序列表位。
實(shí)施例9 在存在IL-1R拮抗劑時(shí)2D8和DEI5/8與IL-1R的結(jié)合 抗-IL-1R抗體與IL-1R的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用通過利用Biacore3000系統(tǒng)的表面等離子共振(surface plasmon resonance)來分析。通過兩分鐘持續(xù)時(shí)間的注射測定結(jié)合速率；通過三分鐘持續(xù)時(shí)間的洗滌步驟測定解離速率。從原始曲線減去陰性對(duì)照的數(shù)據(jù)用于系統(tǒng)固有的基線偏移的校正以及用于噪聲信號(hào)的降低?？贵w和固定至芯片表面的IL-1R的兩種測定形式用于該研究。
a)抗-IL-1R抗體2D8通過胺偶聯(lián)共價(jià)固定于芯片表面上(CM5)。為了測定在抑制研究中用作對(duì)照的最大信號(hào)，將IL-1R以10nM的濃度在傳質(zhì)條件下注射。IL-1R(10nM)結(jié)合的抑制通過將IL-1R與增加濃度的(0.78-100nM)IL-1R拮抗劑，IL-1β或DEI5/8預(yù)溫育(在HBS-P緩沖液中室溫下至少20min)來測定。隨后，將樣品注入流動(dòng)的細(xì)胞中并且測定與固定的2D8抗體的相互作用。
b)將IL-1β通過胺偶聯(lián)共價(jià)固定于芯片表面上(CM5)。為了測定用作對(duì)照值的最大信號(hào)，將IL-1R以10nM的濃度在傳質(zhì)條件下注射。rshIL-1R(10nM)結(jié)合的抑制通過將IL-1R與增加濃度的(0.78-100nM)IL-1R拮抗劑，rhIL-1β或DEI5/8預(yù)溫育來測定。隨后，將樣品注入流動(dòng)的細(xì)胞中并且測定與rhIL-1β的相互作用。
第一個(gè)測定法中IL-1R拮抗劑在100μM濃度時(shí)沒有顯示對(duì)IL-1R結(jié)合的抑制。IL-1β在8nM顯示半最大抑制(IC50)，DEI5/8為2nM。第二個(gè)測定法中4nM的IL-1R拮抗劑顯示抑制活性(IC50)，DEI5/8為2nM并且2D8為2nM。
由于IL-1R拮抗劑在高至100μM的濃度并不抑制IL-1R結(jié)合2D8，可推斷2D8和IL-1R拮抗劑并不以競爭性的方式與IL-1R的結(jié)合。在結(jié)合后2D8誘導(dǎo)IL-1R立即構(gòu)象改變。IL-1R的這種構(gòu)象改變不再允許IL-1R拮抗劑再結(jié)合該受體。在結(jié)合受體中，相對(duì)IL-1R拮抗劑，2D8和DEI5/8顯示變構(gòu)抑制。IL-1β抑制IL-1R與2D8的結(jié)合，表明IL-1β和2D8與IL-1R競爭性結(jié)合。
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Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210>5
<211>217
<212>PRT
<213>嵌合的(大鼠/人)
<400>5
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ala Pro Val Leu Ala Val Ser Leu Glu Gln
1 5 10 15
Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Asn Arg Gly
20 25 30
Val Ser Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Gln Gln Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Leu Ala Phe Gly Val Pro Ala Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro
65 70 75 80
Val Glu Thr Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Gly
85 90 95
His Pro Asp Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210>6
<211>115
<212>PRT
<213>大鼠
<400>6
Gln Leu Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Glu Leu Ser Leu Thr Ser Asn
20 25 30
Ser Ile Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Met Ile Trp Ser Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210>7
<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>HURDIVHv1
<400>7
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1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr Ser Asn
20 25 30
Ser Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Met Ile Trp Ser Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210>8
<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>HURDIVHv2
<400>8
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr Ser Asn
20 25 30
Ser Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Met Ile Trp Ser Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Ser Thr Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
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<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>HURDIVHv3
<400>9
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1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr Ser Asn
20 25 30
Ser Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Met Ile Trp Ser Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
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Arg Tyr Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
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<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>HURDIVHv4
<400>10
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
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35 40 45
Gly Met Ile Trp Ser Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210>11
<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>HURDIVHv5
<400>11
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr Ser Asn
20 25 30
Ser Ile Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Met Ile Trp Ser Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Ser Thr Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210>12
<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>HURDIVHv6
<400>12
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr Ser Asn
20 25 30
Ser Ile Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Met Ile Trp Ser Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210>13
<211>110
<212>PRT
<213>大鼠
<400>13
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1 5 10 15
Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Asn Arg Gly
20 25 30
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35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Leu Ala Phe Gly Val Pro Ala Arg
50 55 60
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65 70 75 80
Val Glu Thr Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Gly
85 90 95
His Pro Asp Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210>14
<211>111
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>HURDIVKv4
<400>14
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Asn Arg
20 25 30
Gly Val Ser Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Leu Ala Phe Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Gly His Pro Asp Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210>15
<211>111
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>HURDIVKv5
<400>15
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Asn Arg
20 25 30
Gly Val Ser Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Leu Ala Phe Gly Val Pro Ala
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
<210>16
<211>111
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>HURDIVKv7
<400>16
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Asn Arg
20 25 30
Gly Val Ser Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Leu Ala Phe Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Gly His Pro Asp Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210>17
<211>111
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>HURDIVKv8
<400>17
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Asn Arg
20 25 30
Gly Val Ser Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Leu Ala Phe Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Gly His Pro Asp Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210>18
<211>111
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>HURDIVKv9
<400>18
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Asn Arg
20 25 30
Gly Val Ser Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
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50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
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Gly His Pro Asp Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210>19
<211>111
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>HURDIVKv10
<400>19
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Asn Arg
20 25 30
Gly Val Ser Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
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50 55 60
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Gly His Pro Asp Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210>20
<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>HUR HuVH v1
<400>20
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Glu Leu Ser Leu Thr Ser Asn
20 25 30
Ser Ile Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile Trp Ser Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210>21
<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>HUR HuVH v2
<400>21
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Glu Leu Ser Leu Thr Ser Asn
20 25 30
Ser Ile Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile Trp Ser Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
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100 105 110
Val Ser Ser
115
<210>22
<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>HUR HuVH v3
<400>22
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Glu Leu Ser Leu Thr Ser Asn
20 25 30
Ser Ile Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Met Ile Trp Ser Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210>23
<211>119<212>PRT
<213>人工的
<220><223>AAB67785-1
<400>23
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Glu Ala Ala Ala Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>24
<211>111
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>HUR HuVK v1
<400>24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Asn Arg
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50 55 60
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Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
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Gly His Pro Asp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>25
<211>111
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>HUR HuVK v2
<400>25
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Asn Arg
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Gly His Pro Asp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>26
<211>111
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>HUR HuVK v3
<400>26
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Asn Arg
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Gly His Pro Asp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>27
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CAD43025
<400>27
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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<210>28
<211>313
<212>PRT
<213>智人
<400>28
Asp Lys Cys Lys Glu Arg Glu Glu Lys Ile Ile Leu Val Ser Ser Ala
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20 25 30
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130 135 140
Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn Ile His Phe Ser Gly Val Lys Asp Arg
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Val Ser Pro Ala Asn Glu Thr Met Glu Val Asp Leu Gly Ser Gln Ile
210 215 220
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225 230 235 240
Lys Trp Asn Gly Ser Val Ile Asp Glu Asp Asp Pro Val Leu Gly Glu
245 250 255
Asp Tyr Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala Asn Lys Arg Arg Ser Thr Leu
260 265 270
Ile Thr Val Leu Ash Ile Ser Glu Ile Glu Ser Arg Phe Tyr Lys His
275 280 285
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Ile Gln Leu Ile Tyr Pro Val Thr Asn
305 310
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<211>107
<212>PRT
<213>智人
<400>29
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210>30
<211>327
<212>PRT
<213>智人
<400>30
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210>31
<211>330
<212>PRT
<213>智人
<400>31
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210>32
<211>442
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>DEI 5/8的重鏈
<400>32
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr Ser Asn
20 25 30
Ser Ile Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Met Ile Trp Ser Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Ser Thr Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210>33
<211>218
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>DEI 5/8的輕鏈
<400>33
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Asn Arg
20 25 30
Gly Val Ser Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Leu Ala Phe Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Gly His Pro Asp Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 21權(quán)利要求
1.與人IL-1R結(jié)合并且抑制人IL-1與IL-1R結(jié)合的抗體，其特征在于所述抗體可獲自雜交瘤細(xì)胞系MAK<h-IL-1RI>2D8(DSM ACC 2601)或者是嵌合的、人源化的或T細(xì)胞表位缺失的抗體變體或所述抗體的片段，其在人成纖維細(xì)胞如MRC5(ATCC CCL 171)中對(duì)于IL-1介導(dǎo)的IL-8和IL-6分泌的抑制顯示35pM或更低的IC50值。
2.權(quán)利要求1的抗體，其特征在于所述抗體由雜交瘤細(xì)胞系MAK<h-IL-1RI>2D8(DSM ACC 2601)生產(chǎn)。
3.權(quán)利要求1或2的抗體，其特征在于所述抗體是IgG4同型或IgG1同型，其在CH1和CH2之間約氨基酸220-240的鉸鏈區(qū)中和/或CH2和CH3之間約氨基酸330的第二個(gè)結(jié)構(gòu)域間區(qū)域中被修飾(依照Kabat編號(hào))。
4.權(quán)利要求1的抗體，其特征在于所述抗體顯示選自圖7至10和圖14至16的可變區(qū)和恒定區(qū)。
5.權(quán)利要求1至4的抗體，其特征在于約300pM或更低的親合力(KD)。
6.權(quán)利要求1至5的抗體，其特征在于包括以下序列作為互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)
a)重鏈中作為CDR的SEQ ID NO1的CDR1(氨基酸45-54)、CDR2(氨基酸69-84)和CDR3(氨基酸117-123)，和
b)輕鏈中作為CDR的SEQ ID NO2的CDR1(氨基酸43-57)、CDR2(氨基酸73-79)和CDR3(氨基酸112-120)。
7.權(quán)利要求1至6的抗體，其特征在于所述抗體為大鼠來源的。
8.權(quán)利要求1至7的抗體，其可獲自雜交瘤細(xì)胞系MAK<h-IL-1RI>2D8(DSM ACC 2601)。
9.權(quán)利要求1至8的抗體在制備藥物組合物中的應(yīng)用。
10.含有藥物有效量的權(quán)利要求1至8的抗體的藥物組合物。
11.雜交瘤細(xì)胞系MAK<h-IL-1RI>2D8(DSMACC 2601)。
12.制備藥物組合物的方法，所述組合物包含藥物有效量的權(quán)利要求1至8的抗體。
13.編碼能夠與以下定義的各自其它的抗體鏈一起裝配的多肽的核酸，其中所述多肽為
a)包括作為CDR的SEQ ID NO1的CDR1(氨基酸45-54)、CDR2(氨基酸69-84)和CDR3(氨基酸117-123)的抗體重鏈，或
b)包括作為CDR的SEQ ID NO2的CDR1(氨基酸43-57)、CDR2(氨基酸73-79)和CDR3(氨基酸112-120)的抗體輕鏈。
14.包含權(quán)利要求13的核酸的表達(dá)載體，其能夠在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)所述核酸。
15.包含權(quán)利要求14的載體的原核或真核宿主細(xì)胞。
16.一種生產(chǎn)多肽的方法，所述多肽結(jié)合IL-1R并且抑制IL-1與IL-1R的結(jié)合，該方法的特征在于在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求13的編碼重鏈的核酸和編碼輕鏈的核酸以及從上述細(xì)胞回收所述多肽。
17.治療需要抗炎治療的患者的方法，其特征在于向所述患者施用治療有效量的權(quán)利要求1-8的抗體。
18.制備本發(fā)明的抗體的方法，其特征在于在抗體2D8可變區(qū)的序列中，對(duì)圖7-10所示的各個(gè)加框氨基酸突變、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，制備含有核酸的表達(dá)載體，所述核酸編碼在連續(xù)讀框內(nèi)的所述修飾的抗體可變區(qū)和另外的如圖14-16所示的人恒定區(qū)，在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，重組生產(chǎn)的抗體輕鏈和重鏈裝配在一起成為本發(fā)明的抗體。
全文摘要
結(jié)合人IL－1R并且抑制人IL－1與IL－1R結(jié)合的抗體，其特征在于所述抗體可獲自雜交瘤細(xì)胞系MAK＜h－IL－1RI＞2D8(DSM ACC 2601)或是嵌合的、人源化的或T細(xì)胞表位缺失的抗體變體或所述抗體的片段，其在如MRC5(ATCC CCL 171)的人成纖維細(xì)胞中對(duì)于IL－1介導(dǎo)的IL－8和IL－6分泌的抑制顯示35pM或更低的IC50值，對(duì)于炎性疾病的治療具有有利的性能。
文檔編號(hào)C12N5/12GK1849338SQ200480026109
公開日2006年10月18日 申請(qǐng)日期2004年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月10日
發(fā)明者I·巴特克, F·卡爾, A·基佐尼蒂, E·歐吉, G·費(fèi)爾蒂希, A·漢密爾頓, M·蘭岑德費(fèi)爾, P·呂格爾, R·舒馬赫, T·特魯伊特 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司