專利名稱：用于診斷、監(jiān)測和治療肥胖和/或糖尿病的組合物、試劑和試劑盒以及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肥胖和糖尿病標(biāo)記物，涉及可以檢測肥胖和糖尿病標(biāo)記物轉(zhuǎn)錄物和翻譯產(chǎn)物的試劑，涉及用于檢測肥胖和糖尿病標(biāo)記物轉(zhuǎn)錄物和翻譯產(chǎn)物的試劑盒，涉及用于篩查和診斷個(gè)體中的肥胖和糖尿病以及監(jiān)測診斷為患有肥胖和糖尿病的患者中的治療反應(yīng)、疾病進(jìn)展和疾病復(fù)發(fā)的方法和試劑盒，涉及特異性結(jié)合于肥胖和/或糖尿病標(biāo)記物轉(zhuǎn)錄物的翻譯產(chǎn)物的化合物，涉及用幾種肥胖和糖尿病標(biāo)記物或其翻譯產(chǎn)物的組合物作為治療劑治療肥胖和/或糖尿病，涉及用于治療肥胖和/或糖尿病的組合物和方法。
背景技術(shù)：
肥胖在美國是第二重要的可預(yù)防性的死亡原因。估計(jì)在美國，肥胖影響58,000,000人，每年導(dǎo)致300,000人死亡，并且其發(fā)病率逐漸增加?；加性摷膊〉膫€(gè)體患高血壓、脂紊亂、冠心病、II型糖尿病、中風(fēng)、膽囊疾病、骨關(guān)節(jié)炎、睡眠呼吸暫停、呼吸問題和某些癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加。
當(dāng)攝取的能量相對使用的能量過量時(shí)，發(fā)生肥胖。該過量的原因在不同的患者之間可能是不同的，并且認(rèn)為來源于多種遺傳學(xué)、社會(huì)和環(huán)境因素。目前的研究支持以下觀點(diǎn)，即，在相同的環(huán)境條件下，不同的人以不同的速度增長體重，他們獲得的量似乎是遺傳決定的。已經(jīng)提出了自然選擇導(dǎo)致我們的遠(yuǎn)古祖先獲得了“健壯基因”，它們加強(qiáng)了從每次飽食儲(chǔ)存脂肪的能力，以便維持身體經(jīng)過下一次饑荒。在目前的過度的高脂肪、高卡路里“西方式”食物的環(huán)境中，“健壯基因”成為一種傾向。
越來越多的科學(xué)家和醫(yī)生開始反對傳統(tǒng)的觀點(diǎn)，即不良的飲食控制和缺乏鍛煉是肥胖的原因，他們越來越傾向于將其看作一種醫(yī)學(xué)狀況。健康經(jīng)濟(jì)學(xué)家用前瞻性研究和國家健康統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算了1995年美國的肥胖造成的損失為992億美元。到2005年，估計(jì)全球?qū)⒂谐^1億2千萬人肥胖。肥胖在美國的經(jīng)濟(jì)影響目前已經(jīng)與糖尿病相似，并且并列于心臟病和高血壓。醫(yī)學(xué)研究者計(jì)算出在超重的美國人中診斷的至少88％的II型糖尿病所有病例、57％的冠心病病例、11％的乳腺癌和10％的結(jié)腸癌可以歸因于肥胖。
世界衛(wèi)生組織將肥胖狀況分類為流行病，并且建立了特派工作組以解決對人類健康和的最大威脅。
仍然需要肥胖和/或糖尿病特異性標(biāo)記物。仍然需要能夠用于檢測患者樣品中肥胖和/或糖尿病標(biāo)記物的存在的試劑和試劑盒。仍然需要能夠用于檢測患者樣品中發(fā)生肥胖和/或糖尿病的未來傾向的試劑和試劑盒。仍然需要篩查和診斷患有肥胖和/或糖尿病的個(gè)體的方法和監(jiān)測診斷為患有肥胖和/或糖尿病的患者中的治療反應(yīng)、疾病進(jìn)展和疾病復(fù)發(fā)的方法。
仍然需要用于確定肥胖個(gè)體所患有的肥胖和/或糖尿病的類型的試劑、試劑盒和方法。仍然需要能夠特異性導(dǎo)向于肥胖和/或糖尿病相關(guān)細(xì)胞的組合物。仍然需要治療懷疑患有肥胖和/或糖尿病的個(gè)體的改進(jìn)的方法。
術(shù)語表以下說明書和權(quán)利要求中常常會(huì)用到多個(gè)術(shù)語，所述術(shù)語的含義應(yīng)該根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行如下解釋“肥胖和/或糖尿病核酸序列”——SEQ ID NO1-SEQ ID NO4和SEQ ID NO22-SEQ ID NO25的任一個(gè)中所示的序列、與所述序列具有至少90％同一性的序列(參見下文表2)和上述序列的長度為至少15b.p.的片段。這些序列是編碼天然和已知的Adiponectin的天然存在的可變剪接變體的序列，所述Adiponectin在Locus Link中描述為基因座Hs.9370，編號(hào)為NM_004797，它是244個(gè)氨基酸的人30kDa糖蛋白的編碼序列。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)，本發(fā)明的新變體是得自Adiponectin的可變剪接的天然存在的序列，而不僅僅是該基因的截短、突變或片段形式。
——SEQ ID NO5-SEQ ID NO9和SEQ ID NO26-SEQ ID NO30的任一個(gè)中所示的序列、與所述序列具有至少90％同一性的序列(參見下文表2)和上述序列的長度為至少15b.p.的片段。這些序列是編碼天然和已知的Adiponectin的天然存在的可變剪接變體的序列，所述Adiponectin在Locus Link中描述為基因座Mm.11450，編號(hào)為NM_009605，它是247個(gè)氨基酸的小鼠30kDa糖蛋白的編碼序列。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)，本發(fā)明的新變體是得自Adiponectin的可變剪接的天然存在的序列，而不僅僅是該基因的截短、突變或片段形式。
——SEQ ID NO10-SEQ ID NO11和SEQ ID NO31-SEQ ID NO32的任一個(gè)中所示的序列、與所述序列具有至少90％同一性的序列(參見下文表2)和上述序列的長度為至少15b.p.的片段。這些序列是編碼天然和已知的Ghrelin的天然存在的可變剪接變體的序列，所述Ghrelin在Locus Link中描述為基因座Hs.51738，編號(hào)為NM_016362，它是117個(gè)氨基酸的人13kDa糖蛋白的編碼序列。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)，本發(fā)明的新變體是得自Ghrelin的可變剪接的天然存在的序列，而不僅僅是該基因的截短、突變或片段形式。
——SEQ ID NO12-SEQ ID NO18和SEQ ID NO33-SEQ ID NO39的任一個(gè)中所示的序列、與所述序列具有至少90％同一性的序列(參見下文表2)和上述序列的長度為至少15b.p.的片段。這些序列是編碼天然和已知的11-β-HSD的天然存在的可變剪接變體的序列，所述11-β-HSD在Locus Link中描述為基因座Hs.3290，編號(hào)為NM_005525，它是292個(gè)氨基酸的人32kDa糖蛋白的編碼序列。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)，本發(fā)明的新變體是得自11-β-HSD的可變剪接的天然存在的序列，而不僅僅是該基因的截短、突變或片段形式。
——SEQ ID NO19-SEQ ID NO21和SEQ ID NO40-SEQ ID NO42的任一個(gè)中所示的序列、與所述序列具有至少90％同一性的序列(參見下文表2)和上述序列的長度為至少15b.p.的片段。這些序列是編碼天然和已知的11-β-HSD的天然存在的可變剪接變體的序列，所述11-β-HSD在Locus Link中描述為基因座Mm.15483，編號(hào)為NM_008288，它是292個(gè)氨基酸的小鼠32kDa糖蛋白的編碼序列。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)，本發(fā)明的新變體是得自11-β-HSD的可變剪接的天然存在的序列，而不僅僅是該基因的截短、突變或片段形式。
下表1概括了肥胖和/或糖尿病相關(guān)基因變體和它們與原始序列的不同
表1
SEQ ID NOS1-21是核苷酸序列。
SEQ ID NOS22-42是由SEQ ID NOS 1-21編碼的蛋白序列。
表2SEQ ID NO1-9 Adiponectin變體SEQ ID NO1NM_004797_T1|長度4517CTGATTCCATACCAGAGGGGCTCAGGATGCTGTTGCTGGGAGCTGTTCTACTGCTATTAGCTCTGCCCGGGCATGACCAGGAAACCACGACTCAAGGGCCCGGAGTCCTGCTTCCCCTGCCCAAGGGGGCCTGCACAGGTTGGATGGCGGGCATCCCAGGGCATCCGGGCCATAATGGGGCCCCAGGCCGTGATGGCAGAGATGGCACCCCTGGTGAGAAGGGTGAGAAAGGAGATCCAGGTCTTATTGGTCCTAAGGGAGACATCGGTGAAACCGGAGTACCCGGGGCTGAAGGTCCCCGAGGCTTTCCGGGAATCCAAGGCAGGAAAGGAGAACCTGGAGAAGGTGCCTATGTATACCGCTCAGCATTCAGTGTGGGATTGGAGACTTACGTTACTATCCCCAACATGCCCATTCGCTTTACCAAGATCTTCTACAATCAGCAAAACCACTATGATGGCTCCACTGGTAAATTCCACTGCAACATTCCTGGGCTGTACTACTTTGCCTACCACATCACAGTCTATATGAAGGATGTGAAGGTCAGCCTCTTCAAGAAGGACAAGGCTATGCTCTTCACCTATGATCAGTACCAGGAAAATAATGTGGACCAGGCCTCCGGCTCTGTGCTCCTGCATCTGGAGGTGGGCGACCAAGTCTGGCTCCAGGTGTATGGGGAAGGAGAGCGTAATGGACTCTATGCTGATAATGACAATGACTCCACCTTCACAGGCTTTCTTCTCTACCATGACACCAACTGATCACCACTAACTCAGAGCCTCCTCCAGGCCAAACAGCCCCAAAGTCAATTAAAGGCTTTCAGTACGGTTAGGAAGTTGATTATTATTTAGTTGGAGGCCTTTAGATATTATTCATTCATTTACTCATTCATTTATTCATTCATTCATCAAGTAACTTTAAAAAAATCATATGCTATGTTCCCAGTCCTGGGGAGCTTCACAAACATGACCAGATAACTGACTAGAAAGAAGTAGTTGACAGTGCTATTTTGTGCCCACTGTCTCTCCTGATGCTCATATCAATCCTATAAGGCACAGGGAACAAGCATTCTCCTGTTTTTACAGATTGTATCCTGAGGCTGAGAGAGTTAAGTGAATGTCTAAGGTCACACAGTATTAAGTGACAGTGCTAGAAATCAAACCCAGAGCTGTGGACTTTGTTCACTAGACTGTGCCCTTTTATAGAGGTACATGTTCTCTTTGGAGTGTTGGTAGGTGTCTGTTTCCCACCTCACCTGAGAGCCATTGAATTTGCCTTCCTCATGAATTAAAACCTCCCCCAAGCAGAGCTTCCTCAGAGAAAGTGGTTCTATGATGAAGTCCTGTCTTGGAAGGACTACTACTCAATGGCCCCTGCACTACTCTACTTCCTCTTACCTATGTCCCTTCTCATGCCTTTCCCTCCAACGGGGAAAGCCAACTCCATCTCTAAGTGCTGAACTCATCCCTGTTCCTCAAGGCCACCTGGCCAGGAGCTTCTCTGATGTGATATCCACTTTTTTTTTTTTTTGAGATGGAGTCTCACTCTGTCACCCAGGCTGGAGTACAGTGACACGACCTCGGCTCACTGCAGCCTCCTTCTCCTGGGTCCAAGCAATTATTGT
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SEQ ID NO8U37222_T4|長度1028ATGAGACCTGGCCACTTTCTCCTCATTTCTGTCTGTACGATTGTCAGTGGATCTGACGACACCAAAAGGGCTCAGGATGCTACTGTTGCAAGCTCTCCTGTTCCTCTTAATCCTGCCCAGTCATGCCGAAGATGACGTTACTACAACTGAAGAGCTAGCTCCTGCTTTGGTCCCTCCACCCAAGGGAACTTGTGCAGGTTGGATGGCAGGCATCCCAGGACATCCTGGCCACAATGGCACACCAGGCCGTGATGGCAGAGATGGCACTCCTGGAGAGAAGGGAGAGAAAGGAGATGCAGGTCTTCTTGGTCCTAAGGGTGAGACAGGAGATGTTGGAATGACAGGAGCTGAAGGGCCACGGGGCTTCCCCGGAACCCCTGGCAGGAAAGGAGAGCCTGGAGAAGCCGCTTATGTGTATCGCTCAGCGTTCAGTGTGGGGCTGGAGACCCGCGTCACTGTTCCCAATGTACCCATTCGCTTTACTAAGATCTTCTACAACCAACAGAATCATTATGACGGCAGCACTGGCAAGTTCTACTGCAACATTCCGGGACTCTACATTTACTGGCTTTCTTCTCTACCATGATACCAACTGACTGCAACTACCCATAGCCCATACACCAGGAGAATCATGGAACAGTCGACACACTTTCAGCTTAGTTTGAGAGATTGATTTTATTGCTTAGTTTGAGAGTCCTGAGTATTATCCACACGTGTACTCACTTGTTCATTAAACGACTTTATAAAAAATAATTTGTGTTCCTAGTCCAGAAAAAAAGGCACTCCCTGGTCTCCACGACTCTTACATGGTAGCAATAACAGAATGAAAATCACATTTGGTATGGGGGCTTCACAATATTCGCATGACTGTCTGGAAGTAGACCATGCTATTTTTCTGCTCACTGTACACAAATATTGTTCACATAAACCCTATAATGTAAATATGAAATACAGTGATTACTCTTCTCACAGGCTGAGTGTATGAATTCTAAAGACCCATAAGTATTAAAGTGGTAGGGATAAATTGGSEQ ID NO9U37222_T5|長度306ATGAGACCTGGCCACTTTCTCCTCATTTCTGTCTGTACGATTGTCAGTGGATCTGACGACACCAAAAGGGCTCAGGATGCTACTGTTGCAAGCTCTCCTGTTCCTCTTAATCCTGCCCAGTCATGCCGAAGATGACGTTACTACAACTGAAGAGCTAGCTCCTGCTTTGGTCCCTCCACCCAAGGGAACTTGTGCAGGTTGGATGGCAGGCATCCCAGGACATCCTGGCCACATAAAAATATAATTCGAGGGGCATCCACCAGGCCGGCTGAATTGTGCCAAAATATGGCACTTCCTGCAAGATAASEQ ID NO10-11 Ghrelin變體SEQ ID NO10NM_016362_T1|長度665ACTCTGGATGGGTGCTGTTTAGACAAACGCCGTCTCCTATATAAGACCTGACAGCACAGGCACCACTCCGCCAGGACTGCAGGCCCACCTGTCTGCAACCCAGCTGAGGCCATGCC
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AGGAACTCCTGAGCCCTGGTGAGTGGTCTTAGAACAGTCCTGCCTGATACTTCTGTAAGCCCTACCCACAAAAGTATCTTTCCAGAGATACACAAATTTTGGGGTACACCTCATCATGAGAAATTCTTGCAACACTTGCACAGTGAAAATGTAATTGTAATAAATGTCACAAACCACTTTGGGGCCTGCAGTTGTGAACTTGATTGTAACTATGGATATAAACACATAGTGGTTGTATCGGCTTTACCTCACACTGAATGAAACAATGATAACTAATGTAACATTAAATATAATAAAGGTAATATCAACTTTGTAAATGCASEQ ID NO20XM_110304_T3|長度1181ACTGTTGGCCTCTGGAWTCAGAGGCTGCTGCCTGCCTGGGAGGTTGTAGAAAGCTCTGCAGGTTTTCTTCGTGTGTCCTACAGGGCGCCCTGAGCCAGGTCCCTGTTTGATGGCAGTTATGAAAAATTACCTCCTCCCGATCCTGGTGCTCTTCCTGGCCTACTACTACTATTCTACAAATGAAGAGTTCAGACTCCAGAAGGTAGTGTCTCGCTGCCTTGAACTCGGAGCAGCCTCTGCTCACTACATTGCTGGCACTATGGAAGACATGACATTTGCGGAGCAATTTATTGTCAAGGCGGGAAAGCTCATGGGCGGACTGGACATGCTTATTCTAAACCACATCACTCAGACCTCGCTGTCTCTCTTCCATGACGACATCCACTCTGTGCGAAGAGTCATGGAGGTCAACTTCCTCAGCTACGTGGTCATGAGCACAGCCGCCTTGCCCATGCTGAAGCAGAGCAATGGCAGCATTGCCGTCATCTCCTCCTTGGCTGGGAAAATGACCCAGCCTATGATTGCTCCCTACTCTGCAAGCAAGTTTGCTCTGGATGGGTTCTTTTCCACCATTAGAACAGAACTCTACATAACCAAGGTCAACGTGTCCATCACTCTCTGTGTCCTTGGCCTCATAGACACAGAAACAGCTATGAAGGAAATCTCTGGGATAATTAACGCCCAAGCTTCTCCCAAGGAGGAGTGCGCCCTGGAGATCATCAAAGGCACAGCTCTACGCAAAAGCGAGGTGTACTATGACAAATCGCCTTTGACTCCAATCCTGCTTGGGAACCCAGGAAGGAAGATCATGGAATTTTTTTCATTACGATATTATAATAAGGACATGTTTGTAAGTAACTAGGAACTCCTGAGCCCTGGTGAGTGGTCTTAGAACAGTCCTGCCTGATACTTCTGTAAGCCCTACCCACAAAAGTATCTTTCCAGAGATACACAAATTTTGGGGTACACCTCATCATGAGAAATTCTTGCAACACTTGCACAGTGAAAATGTAATTGTAATAAATGTCACAAACCACTTTGGGGCCTGCAGTTGTGAACTTGATTGTAACTATGGATATAAACACATAGTGGTTGTATCGGCTTTACCTCACACTGAATGAAACAATGATAACTAATGTAACATTAAATATAATAAAGGTAATATCAACTTTGTAAATGCASEQ ID NO21XM_110304_T4|長度845ACTGTTGGCCTCTGGAWTCAGAGGCTGCTGCCTGCCTGGGAGGTTGTAGAAAGCTCTG
CAGGTTTTCTTCGTGTGTCCTACAGGGCGCCCTGAGCCAGGTCCCTGTTTGATGGCAGTTATGAAAAATTACCTCCTCCCGATCCTGGTGCTCTTCCTGGCCTACTACTACTATTCTACAAATGAAGAGTTCAGACCAGAAATGCTCCAGGGAAAGAAAGTGATTGTCACTGGGGCCAGCAAAGGGATTGGAAGAGAAATGGCATATCATCTGTCAAAAATGGGAGCCCATGTGGTATTGACTGCCAGGTCGGAGGAAGGTCTCCAGAAGGTAGTGTCTCGCTGCCTTGAACTCGGAGCAGCCTCTGCTCACTACATTGCTGGCACTATGGAAGACATGACATTTGCGGAGCAATTTATTGTCAAGGCGGGAAAGCTCATGGGCGGACTGGACATGCTTATTCTAAACCACATCACTCAGACCTCGCTGTCTCTCTTCCATGACGACATCCACTCTGTGCGAAGAGTCATGGAGGTCAACTTCCTCAGCTACGTGGTCATGAGCACAGCCGCCTTGCCCATGCTGAAGCAGAGCAATGGCAGCATTGCCGTCATCTCCTCCTTGGCTGGGGGAAGAACAGTTCCACAACAGAGAAGTCGCAGTGTTACTCCTGACTCCCGCGGCCCGTGATTAATATCACCAGCCACAGAATGGACTGGAACCCTGTATCGATCTGGTGGGATTGGATATAACGAACATAGAATTACTCCTGAGACTACCAGAACTGAATAGTTCAAATCAAATCATGCCAGAATATCAGACAAATCCAAATGGCAAAACAGTTGCASEQ ID NO22-30 Adiponectin變體產(chǎn)物SEQ ID NO22NP_004788_P1|長度244|轉(zhuǎn)錄物1WTMLLLGAVLLLLALPGHDQETTTQGPGVLLPLPKGACTGWMAGIPGHPGHNGAPGRDGRDGTPGEKGEKGDPGLIGPKGDIGETGVPGAEGPRGFPGIQGRKGEPGEGAYVYRSAFSVGLETYVTIPNMPIRFTKIFYNQQNHYDGSTGKFHCNIPGLYYFAYHITVYMKDVKVSLFKKDKAMLFTYDQYQENNVDQASGSVLLHLEVGDQVWLQVYGEGERNGLYADNDNDSTFTGFLLYHDTNSEQ ID NO23NP_004788_P2|長度160|轉(zhuǎn)錄物2MPGAEGPRGFPGIQGRKGEPGEGAYVYRSAFSVGLETYVTIPNMPIRFTKIFYNQQNHYDGSTGKFHCNIPGLYYFAYHITVYMKDVKVSLFKKDKAMLFTYDQYQENNVDQASGSVLLHLEVGDQVWLQVYGEGERNGLYADNDNDSTFTGFLLYHDTNSEQ ID NO24NP_004788_P3|長度153|轉(zhuǎn)錄物3MLLLGAVLLLLALPGHDQETTTQGPGVLLPLPKGACTGWMAGIPGHPGHNGAPGRDGRDGTPGEKGEKGDPGLIGPKGDIGETGVPGAEGPRGFPGIQGRKGEPGEGALLSPTCPFALPRSSTISKTTMMAPLVNSTATFLGCTTLPTTSQSI
SEQ ID NO25NP_004788_P4|長度166|轉(zhuǎn)錄物4MLLLGAVLLLLALPGHDQETTTQGPGVLLPLPKGACTGWMAGIPGHPGHNGAPGRDGRDGTPGEKGEKGDPGLIGPKGDIGETGVPGAEGPRGFPGIQGRKGEPGEGAYVYRSAFSVGLETYVTIPNMPIRFTKIFYNQQNHYDGSTGKFHCNIPGLYLHRLSSLPSEQ ID NO26NP_033735_P1|長度247 |轉(zhuǎn)錄物1WTMLLLQALLFLLILPSHAEDDVTTTEELAPALVPPPKGTCAGWMAGIPGHPGHNGTPGRDGRDGTPGEKGEKGDAGLLGPKGETGDVGMTGAEGPRGFPGTPGRKGEPGEAAYMYRSAFSVGLETRVTVPNVPIRFTKIFYNQQNHYDGSTGKFYCNIPGLYYFSYHITVYMKDVKVSLFKKDKAVLFTYDQYQEKNVDQASGSVLLHLEVGDQVWLQVYGDGDHNGLYADNVNDSTFTGFLLYHDTNSEQ ID NO27NP_033735_P2|長度160|轉(zhuǎn)錄物2MTGAEGPRGFPGTPGRKGEPGEAAYVYRSAFSVGLETRVTVPNVPIRFTKIFYNQQNHYDGSTGKFYCNIPGLYYFSYHITVYMKDVKVSLFKKDKAVLFTYDQYQEKNVDQASGSVLLHLEVGDQVWLQVYGDGDHNGLYADNVNDSTFTGFLLYHDTNSEQ ID NO28NP_033735_P3|長度156|轉(zhuǎn)錄物3MLLLQALLFLLILPSHAEDDVTTTEELAPALVPPPKGTCAGWMAGIPGHPGHNGTPGRDGRDGTPGEKGEKGDAGLLGPKGETGDVGMTGAEGPRGFPGTPGRKGEPGEAASLFPMYPFALLRSSTTNRI IMTAALASSTATFRDSTTSLTTSRCTSEQ ID NO29NP_033735_P4|長度169|轉(zhuǎn)錄物4MLLLQALLFLLILPSHAEDDVTTTEELAPALVPPPKGTCAGWMAGIPGHPGHNGTPGRDGRDGTPGEKGEKGDAGLLGPKGETGDVGMTGAEGPRGFPGTPGRKGEPGEAAYVYRSAFSVGLETRVTVPNVPIRFTKIFYNQQNHYDGSTGKFYCNIPGLYIYWLSSLPSEQ ID NO30NP_033735_P5|長度76|轉(zhuǎn)錄物5MLLLQALLFLLILPSHAEDDVTTTEELAPALVPPPKGTCAGWMAGIPGHPGHIKIKFEGHPPGRLNCAKIWHFLQD
SEQ ID NO31-32 Ghrelin變體SEQ ID NO31NP_057446|長度117|轉(zhuǎn)錄物1WTMPSPGTVCSLLLLGMLWLDLAMAGSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPRALAGWLRPEDGGQAEGAEDELEVRFNAPFDVGIKLSGVQYQQHSQALGKFLQDILWEEAKEAPADKSEQ ID NO32NP_057446|長度116|轉(zhuǎn)錄物2MPSPGTVCSLLLLGMLWLDLAMAGSSFLSPEHQRVQVRPPHKAPHVVPALPLSNQLCDLEQQRHWASVFSQSTKDSGSDLTVSGRTWGLRVLNRLFPPSSRERSRRSHQPSCSPELSEQ ID NO33-42 HSD11B變體SEQ ID NO33NP_005516|長度292|轉(zhuǎn)錄物1WTMAFMKKYLLPILGLFMAYYYYSANEEFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREMAYHLAKMGAHVVVTARSKETLQKVVSHCLELGAASAHYIAGTMEDMTFAEQFVAQAGKLMGGLDMLILNHITNTSLNLFHDDIHHVRKSMEVNFLSYVVLTVAALPMLKQSNGSIVVVSSLAGKVAYPMVAAYSASKFALDGFFSSIRKEYSVSRVNVSITLCVLGLIDTETAMKAVSGIVHMQAAPKEECALEIIKGGALRQEEVYYDSSLWTTLLIRNPCRKILEFLYSTSYNMDRFINKSEQ ID NO34NP_005516|長度163|轉(zhuǎn)錄物2MAFMKKYLLPILGLFMAYYYYSANEEFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREMAYHLAKMGAHVVVTASSAHYIAGTMEDMTFAEQFVAQAGKLMGGLDMLILNHITNTSLNLFHDDIHHVRKSMEVNFLSYVVLTVAALPMLKQSNGSMCALLLECYHVVHLSSXSEQ ID NO35NP_005516|長度295|轉(zhuǎn)錄物3MAFMKKYLLPILGLFMAYYYYSANEEFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREMAYHLAKMGAHVVVTARSKETLQKVVSHCLELGAASAHYIAGTMEDMTFAEQFVAQAGKLMGGLDMLILNHITNTSLNLFHDDIHHVRKSMEVNFLSYVVLTVAALPMLKQSNGSIVVVSSLAGKVAYPMVAAYSASKFALDGFFSSIRKEYSVSRVNVSITLCVLGLIDTETAMKAVSGIVHMQAAPKEECALEIIKGGALRQEEVYYDSSLWTTLLIRNPCRKILEFLYSTSYNMEGLFCLMFI
SEQ ID NO36NP_005516|長度274|轉(zhuǎn)錄物4MAFMKKYLLPILGLFMAYYYYSANEEFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREMAYHLAKMGAHVVVTARSKETLQKVVSHCLELGAASAHYIAGTMEDMTFAEQFVAQAGKLMGGLDMLILNHITNTSLNLFHDDIHHVRPMLKQSNGSIVVVSSLAGKVAYPMVAAYSASKFALDGFFSSIRKEYSVSRVNVSITLCVLGLIDTETAMKAVSGIVHMQAAPKEECALEIIKGGALRQEEVYYDSSLWTTLLIRNPCRKILEFLYSTSYNMDRFINKSEQ ID NO37NP_005516|長度274|轉(zhuǎn)錄物5MAFMKKYLLPILGLFMAYYYYSANEEFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREMAYHLAKMGAHVVVTASSAHYIAGTMEDMTFAEQFVAQAGKLMGGLDMLILNHITNTSLNLFHDDIHHVRKSMEVNFLSYVVLTVAALPMLKQSNGSIVVVSSLAGKVAYPMVAAYSASKFALDGFFSSIRKEYSVSRVNVSITLCVLGLIDTETAMKAVSGIVHMQAAPKEECALEIIKGGALRQEEVYYDSSLWTTLLIRNPCRKILEFLYSTSYNMDRFINKSEQ ID NO38NP_005516|長度262|轉(zhuǎn)錄物6MLQGKKVIVTGASKGIGREMAYHLAKMGAHVVVTARSKETLQKVVSHCLELGAASAHYIAGTMEDMTFAEQFVAQAGKLMGGLDMLILNHITNTSLNLFHDDIHHVRKSMEVNFLSYVVLTVAALPMLKQSNGSIVVVSSLAGKVAYPMVAAYSASKFALDGFFSSIRKEYSVSRVNVSITLCVLGLIDTETAMKAVSGIVHMQAAPKEECALEIIKGGALRQEEVYYDSSLWTTLLIRNPCRKILEFLYSTSYNMDRFINKSEQ ID NO39NP_005516|長度244|轉(zhuǎn)錄物7MAFMKKYLLPILGLFMAYYYYSANEEFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREMAYHLAKMGAHVVVTARSKETLQKVVSHCLELGAASAHYIAGTMEDMTFAEQFVAQAGKLMGGLDMLILNHITNTSLNLFHDDIHHVRKSMEVNFLSYVVLTVAALPMLKQSNGSIVVVSSLAETAMKAVSGIVHMQAAPKEECALEIIKGGALRQEEVYYDSSLWTTLLIRNPCRKILEFLYSTSYNMDRFINKSEQ ID NO40XP_110304|長度292|轉(zhuǎn)錄物1WTMAVMKNYLLPILVLFLAYYYYSTNEEFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREMAYHLSKMGAHVVLTARSEEGLQKVVSRCLELGAASAHYIAGTMEDMTFAEQFIVKAGKLMGGLDMLILNHITQTSLSLFHDDIHSVRRVMEVNFLSYVVMSTAALPMLKQSNGSIAVISSLAGK
MTQPMIAPYSASKFALDGFFSTIRTELYITKVNVSITLCVLGLIDTETAMKEISGIINAQASPKEECALEIIKGTALRKSEVYYDKSPLTPILLGNPGRKIMEFFSLRYYNKDMFVSNSEQ ID NO41XP_110304|長度250|轉(zhuǎn)錄物8MAVMKNYLLPILVLFLAYYYYSTNEEFRLQKVVSRCLELGAASAHYIAGTMEDMTFAEQFIVKAGKLMGGLDMLILNHITQTSLSLFHDDIHSVRRVMEVNFLSYVVMSTAALPMLKQSNGSIAVISSLAGKMTQPMIAPYSASKFALDGFFSTIRTELYITKVNVSITLCVLGLIDTETAMKEISGIINAQASPKEECALEIIKGTALRKSEVYYDKSPLTPILLGNPGRKIMEFFSLRYYNKDMFVSNSEQ ID NO42XP_110304|長度192|轉(zhuǎn)錄物9MAVMKNYLLPILVLFLAYYYYSTNEEFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREMAYHLSKMGAHVVLTARSEEGLQKVVSRCLELGAASAHYIAGTMEDMTFAEQFIVKAGKLMGGLDMLILNHITQTSLSLFHDDIHSVRRVMEVNFLSYVVMSTAALPMLKQSNGSIAVISSLAGGRTVPQQRSRSVTPDSRGP“肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物”，有時(shí)也稱作“肥胖和/或糖尿病蛋白”或“肥胖和/或糖尿病變體多肽”——是指由肥胖和/或糖尿病變體核酸序列編碼的氨基酸序列，所述核酸序列是作為可變剪接的結(jié)果獲得的天然存在的mRNA序列。所述氨基酸序列可以是肽、蛋白、以及具有化學(xué)修飾的氨基酸(見下文)的肽或蛋白，如糖肽或糖蛋白。肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物如SEQ ID NO22-SEQ ID NO42的任意一個(gè)所示。該術(shù)語也包括添加、缺失、取代(見下文)一個(gè)或多個(gè)氨基酸或?qū)σ粋€(gè)或多個(gè)氨基酸進(jìn)行了化學(xué)修飾的(見下文)所述序列的同源物(見下文)以及具有至少10個(gè)氨基酸的所述序列的片段(見下文)。
“肥胖和/或糖尿病相關(guān)變體核酸序列的片段”——SEQ ID NO1-SEQ ID NO21的任意一個(gè)的部分序列，其包含含有變體和原始序列之間的核苷酸變異的區(qū)域。這些區(qū)域(在氨基酸水平)描述于上文表1。
“肥胖和/或糖尿病相關(guān)變體產(chǎn)物的片段”——由上述核酸片段編碼的氨基酸序列，包含上文表1所示的變體與原始序列不同的區(qū)域。
“核酸序列”——由DNA核苷酸、RNA核苷酸或這兩種類型的組合組成的序列，并且可以包含天然核苷酸、化學(xué)修飾的核苷酸和合成的核苷酸。
“氨基酸序列”——由20種天然存在的氨基酸中的任意氨基酸、經(jīng)化學(xué)修飾的氨基酸(見下文)、或由合成的氨基酸組成的序列。
“變體/產(chǎn)物的同源物”——添加、缺失或取代了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的變體的氨基酸序列。例如，根據(jù)表1的解釋，改變的氨基酸應(yīng)該位于變體與原始序列不同的區(qū)域內(nèi)。
“保守取代”——一類氨基酸被同類的氨基酸取代，其中所述類是由共同的生理化學(xué)氨基酸側(cè)鏈特性和天然同源蛋白中的高取代頻率而限定，所述取代頻率是由例如標(biāo)準(zhǔn)Dayhoff頻率交換矩陣或BLOSUM矩陣確定的。已經(jīng)分類了6大類的氨基酸側(cè)鏈，包括I類(Cys)；II類(Ser，Thr，Pro，Ala，Gly)；III類(Asn，Asp，Gln，Glu)；IV類(His，Arg，Lys)；V類(Ile，Leu，Val，Met)；和VI類(Phe，Tyr，Trp)。例如，用另一個(gè)III類的殘基，如Asn、Gln或Glu取代Asp，是保守取代。
“非保守取代”——將屬于一類的氨基酸取代為屬于另一類的氨基酸；例如，用III類殘基，如Asp、Asn、Glu或Gln取代II類殘基Ala。
“化學(xué)修飾的”——指本發(fā)明的產(chǎn)物時(shí)，表示通過天然過程，如加工或其它翻譯后修飾，或通過本領(lǐng)域公知的化學(xué)修飾技術(shù)而修飾了至少一個(gè)氨基酸殘基的產(chǎn)物(蛋白)。在多種公知的修飾中，典型但并非唯一的例子包括乙?；?、?；⑿刘；?、酰胺化、ADP-核糖基化、糖基化、GPI錨形成、脂或脂衍生物的共價(jià)連接、甲基化、豆蔻酰化、聚乙二醇化、異戊二烯化、磷酸化、遍在蛋白化或相似的方法。
“生物活性的”——是指具有某類生物活性，例如結(jié)合肥胖和/或糖尿病相關(guān)基因或結(jié)合其它已知的原始肥胖和/或糖尿病相關(guān)基因的激動(dòng)劑的能力。
“免疫活性的”——定義了天然、重組或合成變體產(chǎn)物或其片段在適當(dāng)?shù)膭?dòng)物或細(xì)胞中誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答和結(jié)合特異性抗體的能力。因此，例如，變體產(chǎn)物的免疫活性片段是指保留了變體產(chǎn)物的某些或全部免疫原性特性，如能夠結(jié)合特異性抗變體產(chǎn)物抗體或能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生所述抗體的免疫應(yīng)答或?qū)е庐a(chǎn)生變體的特定免疫細(xì)胞增殖的片段。
“最優(yōu)比對”——定義為得到最高百分同一性評分的比對。所述比對可以采用多種可商購的序列分析程序，如采用等于1的ktup、缺省參數(shù)和缺省PAM的局部比對程序LALIGN進(jìn)行。優(yōu)選的比對是用來自MacVectorTM的CLUSTAL-W程序進(jìn)行的比對，采用等于10.0的開放空位罰分，等于0.1的延伸的空位罰分，以及BLOSUM相似性矩陣進(jìn)行操作。如果需要將空位插入第一個(gè)序列以將其與第二個(gè)序列進(jìn)行最優(yōu)比對，僅僅采用與相應(yīng)的氨基酸殘基配對的殘基計(jì)算百分同一性(即，該計(jì)算不考慮位于第一個(gè)序列的“空位”中的第二個(gè)序列)。在將已知基因序列與新變體進(jìn)行比對的情況下，最優(yōu)比對總是包括將兩個(gè)序列的相同部分一起進(jìn)行比對，然后將兩個(gè)序列彼此不同的序列保持分開和不進(jìn)行比對。
“具有至少90％同一性”——關(guān)于兩個(gè)氨基酸或核酸序列，是指當(dāng)對序列進(jìn)行最優(yōu)比對時(shí)，相同的殘基的百分比。因此，90％氨基酸序列同一性是指兩個(gè)或更多個(gè)最優(yōu)比對的多肽序列中90％的氨基酸是相同的。
“具有變體核酸序列的分離的核酸分子”——是指包含肥胖和/或糖尿相關(guān)變體核酸編碼序列的核酸分子。所述分離的核酸分子可以包括肥胖和/或糖尿病相關(guān)變體核酸序列作為獨(dú)立的插入物；可以包括與其它編碼序列融合的肥胖和/或糖尿病相關(guān)變體核酸序列，它們一起編碼融合蛋白，其中變體編碼序列是決定性的編碼序列(例如，其它編碼序列可能編碼信號(hào)肽)；肥胖和/或糖尿病相關(guān)變體核酸序列可以與非編碼序列，如內(nèi)含子或?qū)φ赵?，例如啟?dòng)子和終止子元件或有效用于在合適的宿主中表達(dá)編碼序列的5′和/或3′非編碼區(qū)組合；或者可以是載體，其中肥胖和/或糖尿病相關(guān)變體蛋白編碼序列是異源的。
“表達(dá)載體”——是指具有在外源細(xì)胞中插入和表達(dá)異源DNA片段的能力的載體。許多原核和真核表達(dá)載體是公知的和/或可商購的。選擇合適的表達(dá)載體在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
“缺失”——是核苷酸或氨基酸序列中的改變，其中分別缺少了一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸殘基。
“插入”或“添加”——是核苷酸或氨基酸序列中的改變，其導(dǎo)致與天然存在的序列相比，分別增加了一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸殘基。
“取代”——分別用不同的核苷酸或氨基酸替代一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸。至于氨基酸序列，取代可以是保守的或非保守的。
“抗體”——是指IgG，IgM，IgD，IgA和IgG抗體。該定義包括多克隆抗體或單克隆抗體。該術(shù)語是指完整抗體或包含抗變體產(chǎn)物抗體的抗原結(jié)合域的抗體片段，如沒有Fc部分的抗體、單鏈抗體、基本僅僅由抗體的可變抗原結(jié)合域組成的片段等。
“治療疾病”——是指給予有效緩解與疾病相關(guān)的癥狀、減輕疾病的嚴(yán)重程度或治愈疾病，或防止疾病發(fā)生的治療物質(zhì)。
“檢測”——是指檢測疾病、紊亂、病理或正常狀況的方法。該術(shù)語可以指檢測發(fā)生疾病的傾向以及通過確定疾病的嚴(yán)重程度而確定患者的預(yù)后。
“探針”——肥胖和/或糖尿病變體核酸序列，或其互補(bǔ)序列，用于檢測樣品中其它相似序列或與該序列具有一定同源性的序列的存在。該檢測是通過鑒定探針和測定的序列之間的雜交復(fù)合體而進(jìn)行的。探針可以與固體支持物或可檢測標(biāo)記。
“原始的肥胖和/或糖尿病相關(guān)基因”——由于可變剪接而改變了氨基酸或核酸序列，從而得到本發(fā)明的肥胖和/或糖尿病相關(guān)變體。原始的核酸序列對于人Adiponectin是描述于SEQ ID NO1的人肥胖和/或糖尿病相關(guān)基因的序列，原始的氨基酸序列是由其編碼的序列；對于小鼠Adiponectin是SEQ ID NO5，原始的氨基酸序列是由其編碼的序列；對于Ghrelin是SEQ ID NO10，原始的氨基酸序列是由其編碼的序列；對于人11-β-HSD是SEQ ID NO12，原始的氨基酸序列是由其編碼的序列；對于小鼠11-β-HSD是SEQ ID NO19，原始的氨基酸序列是由其編碼的序列。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及分離的核酸分子，具有選自下組的序列SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21及其包含至少15個(gè)核苷酸的片段。本發(fā)明涉及包含SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的分離的核酸分子和包含SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的片段的分離的核酸分子，所述片段包含至少15個(gè)氨基酸。
本發(fā)明涉及可以使用SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的序列作為模板而擴(kuò)增產(chǎn)物的PCR引物。
本發(fā)明涉及篩查、診斷、監(jiān)測個(gè)體的肥胖和/或糖尿病的方法。該方法包括檢測樣品中包含選自SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的存在、不存在或量。所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的存在或量，指示肥胖和/或糖尿病。
本發(fā)明涉及治療患肥胖和/或糖尿病的個(gè)體的方法，包括給予具有選自SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的序列的轉(zhuǎn)錄物的翻譯產(chǎn)物的步驟。
本發(fā)明涉及用于篩查、診斷、監(jiān)測個(gè)體的肥胖和/或糖尿病的試劑盒。
本發(fā)明涉及由選自SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的核酸序列編碼的蛋白及其免疫原性片段。
本發(fā)明涉及特異性結(jié)合于由選自SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的核酸序列編碼的蛋白上的表位的抗體。
本發(fā)明涉及特異性結(jié)合于由選自SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的核酸序列編碼的蛋白上的表位的抗體，其與可檢測標(biāo)記或活性劑連接。
本發(fā)明涉及藥物組合物，該藥物組合物包含特異性結(jié)合于由選自SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的核酸序列編碼的蛋白上的表位的抗體，所述抗體與活性劑連接。
本發(fā)明涉及治療懷疑患有肥胖和/或糖尿病的個(gè)體的方法。該方法包括給予個(gè)體抗體的步驟，該抗體特異性結(jié)合于由選自SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的核酸序列編碼的蛋白上的表位，并且與活性劑連接。
本發(fā)明涉及給個(gè)體的肥胖和/或糖尿病細(xì)胞送遞核酸分子的方法。該方法包括給予個(gè)體藥物組合物的方法，該藥物組合物包含特異性結(jié)合于由選自SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的核酸序列編碼的蛋白上的表位的抗體和核酸分子。
附圖簡述

圖1表示人來源的4個(gè)氨基酸序列(描述于SEQ ID NO22-SEQID NO25)彼此之間以及與原始序列的多重比對。
圖2表示小鼠來源的5個(gè)氨基酸序列(描述于SEQ ID NO26-SEQ ID NO30)彼此之間以及與原始序列的多重比對。
圖3表示人來源的兩個(gè)氨基酸序列(描述于SEQ ID NO31-SEQID NO32)與原始序列的比對。
圖4表示人來源的7個(gè)氨基酸序列(描述于SEQ ID NO33-SEQ IDNO39)彼此之間以及與原始序列的多重比對。
圖5表示人來源的3個(gè)氨基酸序列(描述于SEQ ID NO40-SEQ IDNO42)彼此之間以及與原始序列的多重比對。
圖6表示人來源的4個(gè)核酸序列(描述于SEQ ID NO1-SEQ IDNO4)彼此之間以及與原始序列的多重比對。
圖7表示小鼠來源的5個(gè)核酸序列(描述于SEQ ID NO5-SEQ IDNO9)彼此之間以及與原始序列的多重比對。
圖8表示人來源的兩個(gè)核酸序列(描述于SEQ ID NO10-SEQ IDNO11)與原始序列的比對。
圖9表示人來源的7個(gè)核酸序列(描述于SEQ ID NO12-SEQ IDNO18)彼此之間以及與原始序列的多重比對。
圖10表示人來源的3個(gè)氨基酸序列(描述于SEQ ID NO19-SEQID NO21)彼此之間以及與原始序列的多重比對。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述申請人特此引入在本公開內(nèi)容中引用的所有參考文獻(xiàn)的完整內(nèi)容。此外，當(dāng)以一個(gè)范圍、優(yōu)選范圍、或一系列高優(yōu)選值和低優(yōu)選值給出量、濃度或其它值或參數(shù)時(shí)，應(yīng)該理解，這如同特別公開了由任意一對任意上限或優(yōu)選值和任意下限或優(yōu)選值形成的所有范圍，而無論是否單獨(dú)公開了范圍。當(dāng)此處指出數(shù)字值的范圍時(shí)，除非特別指出，該范圍意欲包括其終點(diǎn)，以及該范圍內(nèi)的所有整數(shù)和分?jǐn)?shù)。當(dāng)限定一個(gè)范圍時(shí)，本發(fā)明的范圍并不限于指出的特定值。
肥胖和/或糖尿病變體核酸序列本發(fā)明的核酸序列包括編碼肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物及其片段和類似物的核酸序列。或者，核酸序列可以是與上述編碼序列互補(bǔ)，或與所述編碼序列的區(qū)域互補(bǔ)的序列?；パa(bǔ)序列的長度足夠避免編碼序列的表達(dá)。核酸序列可以是RNA形式或DNA形式，并且包括信使RNA、合成RNA和DNA、cDNA和基因組DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈的，并且如果是單鏈，可以是編碼鏈或非編碼(反義、互補(bǔ))鏈。核酸序列也可以包括dNTPs、rNTPs以及非天然存在的序列。該序列可以是氨基酸序列和核酸序列之間的雜交體的一部分。
在一般的實(shí)施方案中，核酸序列與SEQ ID NO2-SEQ ID NO4或SEQ ID NO6-SEQ ID NO9或SEQ ID NO11或SEQ ID NO13-SEQ ID NO18或SEQ ID NO20-SEQ ID NO21所示序列的任意一個(gè)具有至少90％同一性。
核酸序列可以包括編碼序列自身。另一方面，編碼區(qū)可以與其它編碼序列，如編碼融合蛋白或信號(hào)肽的那些序列組合，與非編碼序列，如有效用于在合適的宿主內(nèi)表達(dá)編碼序列的內(nèi)含子和控制元件、啟動(dòng)子和終止子元件或5′和/或3′非翻譯區(qū)組合，和/或位于載體或宿主環(huán)境中，其中將變體核酸序列作為異源序列而導(dǎo)入。
本發(fā)明的核酸序列也可以包括與使得能夠純化變體產(chǎn)物的標(biāo)記物序列框內(nèi)融合的肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物編碼序列。例如，在細(xì)菌宿主的情況下，標(biāo)記物序列可以是六組氨酸標(biāo)志，其提供與標(biāo)記物融合的成熟多肽的純化，或當(dāng)使用哺乳動(dòng)物宿主，如COS-7細(xì)胞時(shí)，標(biāo)記物序列可以是血凝素(HA)標(biāo)志。HA標(biāo)志相當(dāng)于來源于流感血凝素蛋白的表位(Wilson，I.，et al.Cell 37767(1984))。
本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括上文所定義的片段，此處也稱作寡核苷酸，它們通常具有相當(dāng)于核酸序列的編碼序列區(qū)的至少17個(gè)堿基，優(yōu)選17-30個(gè)堿基。根據(jù)公知方法，這些片段可以用作探針、引物，并且當(dāng)互補(bǔ)時(shí)，也可以作為反義劑。
如上文所述，核酸序列可以基本上如SEQ ID NO2-SEQ ID NO4或SEQ ID NO6-SEQ ID NO9或SEQ ID NO11或SEQ ID NO13-SEQ ID NO18或SEQ ID NO20-SEQ ID NO21所述，或者可以是其片段或上文所解釋，與上述序列具有至少90％同一性?；蛘?，由于遺傳密碼的簡并性質(zhì)，該序列可以是編碼SEQ ID NO23-SEQ ID NO25或SEQ ID NO27-SEQ ID NO30或SEQ ID NO32或SEQ ID NO34-SEQ ID NO39或SEQ ID NO41-SEQ ID NO42的氨基酸序列的任意一個(gè)或所述氨基酸的片段或類似物的序列。
A.制備核酸序列可以通過用能夠與編碼此處公開的肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的核酸序列雜交、或可以PCR擴(kuò)增編碼此處公開的肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的核酸序列的寡核苷酸探針獲得核酸序列。從多種組織制備的cDNA文庫是可以商購的，并且，用于篩選和分離cDNA克隆的程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。所述技術(shù)描述于，例如，Sambrook et al.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd Edition)，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.和Ausubel FM et al.(1989)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，New York，N.Y。
可以延伸核酸序列，以獲得上游和下游序列，如啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)元件和5′和3′非翻譯區(qū)(UTRs)?？色@得的轉(zhuǎn)錄物序列的延伸可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方法進(jìn)行，如PCR或引物延伸(Sambrook et al.，supra)，或通過使用例如Marathon RACE試劑盒(Clontech，Cat.#K1802-1)進(jìn)行的RACE方法進(jìn)行。
或者，可以采用“限制位點(diǎn)”PCR(Gobinda et al.PCR MethodsAppl.2318-22(1993))的技術(shù)，該技術(shù)使用通用引物提取鄰接于已知基因座的側(cè)翼序列。首先，在接頭序列的引物和已知區(qū)域的特異性引物存在下擴(kuò)增基因組DNA。擴(kuò)增的序列用相同的接頭引物和第一種特異性引物內(nèi)部的另一種特異性引物進(jìn)行第二輪PCR。用合適的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄每一輪PCR的產(chǎn)物，并且用逆轉(zhuǎn)錄酶測序。
可以使用背馳引物，基于已知區(qū)域，用反向PCR擴(kuò)增或延伸序列(Triglia，T.et al.，Nucleic Acids Res.168186(1988))?？梢杂肙LIGO4.06引物分析軟件(1992；National Biosciences Inc，Plymouth，Minn.)，或另一種合適的程序設(shè)計(jì)引物，該引物長度為22-30個(gè)核苷酸，具有50％或更多的GC含量，并且在大約68-72℃的溫度下與靶序列退火。該方法使用幾種限制酶以制備已知基因區(qū)中的合適的片段。然后通過分子內(nèi)連接對該片段環(huán)化，并且用作PCR模板。
捕獲PCR(Lagerstrom，M.et al.，PCR Methods Appl.1111-19(1991))是一種用于對人和酵母人工染色體DNA中的已知序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法。捕獲PCR也要求多次限制酶消化和連接，以便在PCR之前將工程化的雙鏈序列置于DNA分子的側(cè)翼部分。
可以用于提取側(cè)翼序列的另一種方法是Parker，J.D.，et al.，Nucleic Acids Res.193055-60(1991)的方法。此外，可以使用PCR、巢式引物和PromoterFinderTM文庫在基因組DNA中“行走”(PromoterFinderTM；Clontech，Palo Alto，CA)。該過程避免了對篩選文庫的需要，并且可以用于發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子/外顯子連接。用于篩選全長cDNAs的優(yōu)選文庫是進(jìn)行了大小選擇以包括更大cDNAs的那些。同樣，隨機(jī)引物文庫是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈儗ǜ嗪谢虻?’和上游區(qū)的序列。
如果寡d(T)文庫不產(chǎn)生全長cDNA，那么隨機(jī)引物文庫可以特別有用?；蚪M文庫用于延伸到5’非翻譯調(diào)節(jié)區(qū)中。
也可以根據(jù)公知的合成方法，通過固相方法制備本發(fā)明的核酸序列和寡核苷酸。典型地，分別合成最多達(dá)大約100個(gè)堿基的片段，然后連接形成最多達(dá)幾百個(gè)堿基的連續(xù)序列。
B.用肥胖和/或糖尿病變體核酸生產(chǎn)肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物根據(jù)本發(fā)明，上文指出的核酸序列可以用作指導(dǎo)肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物表達(dá)的重組DNA分子。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，生產(chǎn)具有在人類基因組中天然存在的SEQ ID NO2-SEQ ID NO4或SEQ ID NO6-SEQ ID NO9或SEQID NO11或SEQ ID NO13-SEQ ID NO18或SEQ ID NO20-SEQ IDNO21中存在的密碼子以外的密碼子的肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物編碼核苷酸序列是有利的。可以選擇特定原核或真核宿主優(yōu)選的密碼子(Murray，E.et al.Nucleic Acids Res.17477-508(1989))，以便例如，增加變體產(chǎn)物表達(dá)速度或生產(chǎn)具有需要的特性的重組RNA轉(zhuǎn)錄物，如比天然存在的序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物更長的半衰期。
可以對本發(fā)明的核酸序列進(jìn)行工程化，以便為了多種目的改變肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物編碼序列，所述目的包括，但不限于，修飾產(chǎn)物的克隆、加工和/或表達(dá)的改變。例如，可以使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)，如定點(diǎn)誘變而導(dǎo)入改變，以插入新的限制位點(diǎn)、改變糖基化模式、改變密碼子偏好等。
本發(fā)明也包括包含上文廣泛描述的一種或多種序列的重組構(gòu)建體。所述構(gòu)建體包括載體，如質(zhì)?；虿《据d體，其中以正向或反向方向插入了本發(fā)明的核酸序列。在該實(shí)施方案的優(yōu)選方面，所述構(gòu)建體還包含調(diào)節(jié)序列，包括，例如與序列可操作性連接的啟動(dòng)子。大量合適的載體和啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且是可商購的。用于原核和真核宿主的合適的克隆和表達(dá)載體也描述于Sambrook，et al.(上文)。
本發(fā)明也涉及用本發(fā)明的載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞和通過重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的產(chǎn)物。用本發(fā)明的載體對宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程化(即，轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)，所述載體可以是，例如，克隆載體或表達(dá)載體。載體可以是例如質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等形式。工程化的宿主細(xì)胞可以在經(jīng)過修飾以適用于激活啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增變體核酸序列的表達(dá)的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件，如溫度、pH等，是以前用于為進(jìn)行表達(dá)而選擇的宿主細(xì)胞中的那些，并且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
本發(fā)明的核酸序列可以包含在用于表達(dá)產(chǎn)物的多種表達(dá)載體中。所述載體包含染色體、非染色體和合成DNA序列，如SV40的衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；衍生自質(zhì)粒和噬菌體DNA、病毒DNA的組合的載體，所述病毒如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和假狂犬病病毒。然而，可以使用任何其它的載體，只要它是可復(fù)制的，并且在宿主中是可存活的?？梢酝ㄟ^多種程序?qū)⒑线m的DNA序列插入載體。概言之，通過本領(lǐng)域公知的程序?qū)NA序列插入合適的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。所述程序和相關(guān)的亞克隆程序也被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
將表達(dá)載體中的DNA序列可操作性連接于合適的轉(zhuǎn)錄控制序列(啟動(dòng)子)以指導(dǎo)mRNA合成。所述啟動(dòng)子的例子包括LTR或SV40啟動(dòng)子、大腸桿菌lac或trp啟動(dòng)子、噬菌體λPL啟動(dòng)子和其它已知能夠控制原核或真核細(xì)胞或其病毒中的基因表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體也包含用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。載體也可以包含用于擴(kuò)增表達(dá)的合適序列。此外，表達(dá)載體優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或例如大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
可以使用含有上文所述合適的DNA序列以及合適的啟動(dòng)子或控制序列的載體轉(zhuǎn)化合適的宿主，以使得宿主表達(dá)蛋白。合適的表達(dá)宿主的例子包括細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌、傷寒沙門氏菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞，如果蠅和夜蛾Sf9；動(dòng)物細(xì)胞，如CHO，COS，HEK 293或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物細(xì)胞等。根據(jù)此處的教導(dǎo)，合適的宿主細(xì)胞的選擇被認(rèn)為是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。本發(fā)明不受所使用的宿主細(xì)胞的限制。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，可以根據(jù)肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的用途而選擇多種表達(dá)載體。例如，當(dāng)誘導(dǎo)抗體需要大量肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物時(shí)，可能需要指導(dǎo)容易純化的融合蛋白的高水平表達(dá)的載體。所述載體包括，但不限于，多功能大腸桿菌克隆和表達(dá)載體，如Bluescript(Stratagene)，其中可以將肥胖和/或糖尿病變體多肽編碼序列與氨基端Met和隨后β-半乳糖苷酶的7個(gè)殘基的編碼序列框內(nèi)連接，以便生產(chǎn)雜交蛋白；pIN載體(Van Heeke & Schuster J.Biol.Chem.2645503-5509(1989))；pET載體(Novagen，Madison WI)等。
在啤酒糖酵母中，可以使用多個(gè)含有組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如α因子、醇脫氫酶和PGH啟動(dòng)子的載體。綜述可參見Ausubelet al.(上文)和Grant et al.(Methods in Enzymology 153516-544(1987))。
當(dāng)使用植物表達(dá)載體時(shí)，可以通過許多啟動(dòng)子中的任意一個(gè)驅(qū)動(dòng)序列編碼變體產(chǎn)物的表達(dá)。例如，可以單獨(dú)使用病毒啟動(dòng)子，如CaMV的35S和19S啟動(dòng)子(Brisson et al.，Nature 310511-514(1984))或與TMV的ω前導(dǎo)序列(Takamatsu et al.，EMBO J.6307-311(1987))組合使用?；蛘?，可以使用植物啟動(dòng)子，如RUBISCO的小亞基(Coruzzi et al.，EMBO J.31671-1680(1984)；Broglie et al.，Science 224838-843(1984))；或熱激啟動(dòng)子(Winter J andSinibaldi R.M.，Results Probl.Cell Differ.1785-105(1991))。可以通過直接DNA轉(zhuǎn)化或病原體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染將這些構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞。關(guān)于所述技術(shù)的綜述，參見Hobbs S.or Murry L.E.(1992)in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology，McGraw Hill，New York，N.Y.，pp 191-196；或Weissbach and Weissbach(1988)Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，New York，N.Y.，pp 421-463。
也可以在昆蟲系統(tǒng)中表達(dá)肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物。在一個(gè)所述系統(tǒng)中，將Autographa californica核型多角體病毒(AcNPV)用作在草地夜蛾細(xì)胞中或粉蚊夜蛾幼蟲中表達(dá)外源基因的載體。可以將肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物編碼序列克隆到病毒的非必須區(qū)，如多角體蛋白基因，并且置于多角體啟動(dòng)子的控制下。肥胖和/或糖尿病編碼序列的成功插入，將使得多角體蛋白基因失活并產(chǎn)生缺乏外殼蛋白的重組病毒。然后將重組病毒用于感染草地夜蛾細(xì)胞或粉蚊夜蛾幼蟲，其中表達(dá)了變體蛋白(Smith et al.，J.Virol.46584(1983)；Engelhard，E.K.et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 913224-7(1994))。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，可以使用多種基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)腺病毒用作表達(dá)載體時(shí)，可以將肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物編碼序列連接到由晚期啟動(dòng)子和三分前導(dǎo)序列組成的腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯復(fù)合物中。插入病毒基因組的非必須的E1或E3區(qū)，將得到能夠在感染的宿主細(xì)胞中表達(dá)變體蛋白的可存活的病毒(Logan and Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813655-59(1984)。此外，可以用轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，如勞斯肉瘤病毒(RSV)增強(qiáng)子來增加在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
變體產(chǎn)物編碼序列的有效翻譯也可能需要特異性起始信號(hào)。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子和鄰近的序列。在肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物編碼序列的情況下，將其起始密碼子和上游序列插入合適的表達(dá)載體，可以不需要其它的翻譯控制信號(hào)。但是，當(dāng)僅僅將編碼序列或其部分插入時(shí)，必須提供包括ATG起始密碼子的外源轉(zhuǎn)錄控制信號(hào)。此外，起始密碼子必須在正確的讀框中，以確保完整插入物的轉(zhuǎn)錄。外源轉(zhuǎn)錄元件和起始密碼子可以是病毒來源，可以是天然的和合成的?？梢酝ㄟ^導(dǎo)入適用于所使用的細(xì)胞系統(tǒng)的增強(qiáng)子而增強(qiáng)表達(dá)效率(Scharf，D.et al.，Results Probl.Cell Differ.20125-62(1994)；Bittner et al.，Meth.Enzymol.153516-544(1987))。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含上文所述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，或者宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞?？梢酝ㄟ^磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-右旋糖酐介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，and Battey，I.(1986)Basic Methods in MolecularBiology)將構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。也可以采用無細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)，用來源于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的RNA生產(chǎn)多肽。
可以選擇宿主細(xì)胞株，以選擇其調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)或以需要的方式加工表達(dá)的蛋白的能力。所述蛋白的修飾包括，但不限于，乙?；?、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和?；Ｇ懈睢扒?原”形式的蛋白的翻譯后加工對于正確的插入、折疊和/或功能也可以是重要的。不同的宿主細(xì)胞，如CHO，HeLa，MDCK，293，WI38等，具有所述翻譯后活性的特定細(xì)胞機(jī)制和特征性機(jī)理，可以對其進(jìn)行選擇以用于確保導(dǎo)入的外源蛋白的正確修飾和加工。
對于重組蛋白的長期高產(chǎn)率生產(chǎn)，優(yōu)選穩(wěn)定的表達(dá)。例如，可以用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)或內(nèi)源表達(dá)元件和選擇標(biāo)記基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化穩(wěn)定表達(dá)變體產(chǎn)物的細(xì)胞系。在導(dǎo)入載體后，可以讓細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長1-2天，然后將其轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基中。選擇標(biāo)記的目的是賦予對選擇的抗性，其存在允許生長和回收成功表達(dá)導(dǎo)入的序列的細(xì)胞?？梢杂眠m于細(xì)胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)增殖穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的抗性簇。
可以使用任何數(shù)目的選擇系統(tǒng)回收轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。這些包括，但不限于，單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler M.，et al.，Cell 11223-32(1977))和腺苷磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Lowy I.，et al.，Cell 22817-23(1980))基因，可以將其分別用于tk-或aprt-細(xì)胞。同樣，也可以將抗代謝物、抗生素或除草劑抗性用作選擇基礎(chǔ)，例如，賦予對氨甲喋呤的抗性的dhfr(Wigler M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 773567-70，(1980))；賦予對氨基糖苷類新霉素和G-418的抗性的npt(Colbere-Garapin，F(xiàn).et al.，J.Mol.Biol.1501-14(1981))；和賦予對chlorsulfuron和膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶抗性的als或pat(Murry，上文)。已經(jīng)描述了其它可選擇的基因，如允許細(xì)胞利用吲哚代替色氨酸的trpB，或允許細(xì)胞利用組氨醇代替組氨酸的hisD(Hartman S.C.and R.C.Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.858047-51，(1988))。使用可見標(biāo)記已經(jīng)在花青素、β-葡糖醛酸酶及其底物、GUS和熒光素酶及其底物、熒光素及ATP等標(biāo)記獲得了普及，所述標(biāo)記不僅廣泛用于鑒定轉(zhuǎn)化體，也用于對特定載體系統(tǒng)引起的瞬時(shí)或穩(wěn)定蛋白表達(dá)量進(jìn)行定量(Rhodes，C.A.et.al.，MethodsMol.Biol.55121-131(1995))。
可以在適于從細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)和回收編碼的蛋白的條件下培養(yǎng)用編碼肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。由重組細(xì)胞生產(chǎn)的產(chǎn)物可以取決于所使用的序列和/或載體而分泌到細(xì)胞內(nèi)或包含在細(xì)胞內(nèi)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員能理解的，可以用指導(dǎo)通過原核或真核細(xì)胞膜分泌肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的信號(hào)序列設(shè)計(jì)包含編碼肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的核苷酸序列的表達(dá)載體。
也可以將肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物作為具有一個(gè)或多個(gè)添加以促進(jìn)蛋白純化的額外多肽結(jié)構(gòu)域的重組蛋白而表達(dá)。所述純化促進(jìn)結(jié)構(gòu)域包括，但不限于金屬螯合肽，如使得能夠在固定化的金屬上進(jìn)行純化的組氨酸-色氨酸組件、使得能夠在固定化的免疫球蛋白上進(jìn)行純化的蛋白A結(jié)構(gòu)域、和在FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)(Immunex Corp.，Seattle，Wash.)中使用的結(jié)構(gòu)域。在純化結(jié)構(gòu)域和肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物之間引入蛋白酶可切割的多肽接頭序列，對促進(jìn)純化是有用的。一種這樣的表達(dá)載體提供了融合蛋白的表達(dá)，所述融合蛋白包含與通過腸激酶切割位點(diǎn)隔開的聚組氨酸區(qū)域融合的變體多肽。組氨酸殘基促進(jìn)了在IMIAC(固定化的金屬離子親和層析，如Porath，et al.，Protein Expr.Purif.3263-281(1992)中的描述)上的純化，而腸激酶切割位點(diǎn)提供了用于從融合蛋白分離變體多肽的工具。pGEX載體(Promega，Madison，Wis.)也可用于表達(dá)作為與谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合的融合多肽的外源多肽。通常，所述融合蛋白是可溶的，并且可以通過吸附于配體-瓊脂糖珠(如在GST-融合體的情況下是谷胱苷肽-瓊脂糖)然后在游離配體存在下洗脫，很容易從裂解的細(xì)胞純化。
在轉(zhuǎn)化合適的宿主菌株并且使宿主菌株生長到合適的細(xì)胞密度時(shí)，通過合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)變或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)所選擇的啟動(dòng)子，并且培養(yǎng)細(xì)胞額外的一段時(shí)間。通常通過離心收獲細(xì)胞，通過物理或化學(xué)方法破壞，將得到粗提取物保留用于進(jìn)一步純化?？梢酝ㄟ^包括凍-融循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破壞或使用細(xì)胞裂解劑的任何常規(guī)方法，或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它方法破壞在蛋白表達(dá)中使用的微生物細(xì)胞。
可以通過本領(lǐng)域公知的多種方法中的任意方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收并純化肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物，包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析、和凝集素層析。在完成成熟蛋白構(gòu)型的過程中，可以根據(jù)需要使用蛋白重折疊步驟。最后，可以使用高效液相層析(HPLC)用于最后的純化步驟。
C.利用核酸序列的診斷應(yīng)用本發(fā)明的核酸序列可以用于多種診斷目的。通過檢測編碼肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的mRNA的存在，可以用核酸序列檢測和定量肥胖和/或糖尿病變體在患者細(xì)胞，如活檢組織中的表達(dá)?；蛘?，該測定可以用于檢測血清或血液中的可溶性變體。該測定通常包括從組織或血清獲得總mRNA，并且將mRNA與核酸探針接觸。所述探針是至少20個(gè)核苷酸，優(yōu)選20-30個(gè)核苷酸的核酸分子，能夠在雜交條件下與包含在編碼肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的核酸分子中的序列雜交，檢測與探針雜交的mRNA的存在，從而檢測變體的表達(dá)。該測定可以用于區(qū)分肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的不存在、存在和過量表達(dá)，以及用于監(jiān)測治療干涉期間肥胖和/或糖尿病變體表達(dá)的水平。此外，該測定可用于比較本發(fā)明的肥胖和/或糖尿病變體水平與經(jīng)改變而得到變體的原始肥胖和/或糖尿病序列，或比較相互之間的水平，該比較可以具有某些生理含義。
本發(fā)明也包括使用核酸序列診斷由遺傳缺陷變體序列導(dǎo)致的疾病或得到肥胖和/或糖尿病變體的原始肥胖和/或糖尿病序列與本發(fā)明的新的肥胖和/或糖尿病變體的比例發(fā)生改變的疾病。可以通過比較缺陷的(即突變的)肥胖和/或糖尿病變體編碼區(qū)的序列與正常編碼區(qū)的序列而檢測這些序列。編碼突變的肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的序列與正常變體產(chǎn)物活性的關(guān)系可以改變。此外，可以將編碼突變的肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的序列插入合適的載體，用于在功能測定系統(tǒng)(如在HEK293細(xì)胞的變體蛋白缺陷株中的比色測定、互補(bǔ)實(shí)驗(yàn))中表達(dá)，作用證明或鑒定突變的另一種方法。一旦鑒定了突變基因，可以篩查感興趣群體中突變基因的攜帶者。
可以通過多種技術(shù)在DNA水平檢測攜帶本發(fā)明的核酸序列中的突變的個(gè)體。用于診斷的核酸可以獲自患者的細(xì)胞，包括，但不限于例如獲自血液、尿、唾液、胎盤、組織活檢物和尸檢材料?？梢灾苯訉⒒蚪MDNA用于檢測或可以通過使用PCR進(jìn)行酶促擴(kuò)增(Saiki，etal.，Nature 324163-166(1986))然后用于分析?？梢詫NA或cDNA用于相同的目的。例如，可以將與本發(fā)明的核酸互補(bǔ)的PCR引物用于鑒定和分析本發(fā)明基因中的突變。通過擴(kuò)增產(chǎn)物與正?；蛐拖啾鹊拇笮「淖兌鴻z測突變和插入。
可以通過將擴(kuò)增的DNA與放射性標(biāo)記的本發(fā)明的RNA或放射標(biāo)記的本發(fā)明的反義DNA序列雜交。也可以通過核酸酶保護(hù)測定，如RNA酶和S1保護(hù)或化學(xué)裂解方法(如Cotton，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 854397-4401(1985))或通過解鏈溫度的差異發(fā)現(xiàn)特定位點(diǎn)的序列改變。也可以用“分子信標(biāo)”(Kostrikis L.G.et al.，Science 2791228-1229(1998))，即一種含有與本發(fā)明的核酸互補(bǔ)的探針序列的發(fā)夾形、單鏈合成寡核苷酸檢測點(diǎn)突變或其它序列改變，以及監(jiān)測變體產(chǎn)物的表達(dá)水平。所述診斷方法對產(chǎn)前檢測特別有用。
另一種用于檢測突變的方法使用兩個(gè)DNA探針，所述探針設(shè)計(jì)為與靶的具有鄰接堿基的鄰接區(qū)雜交，其中已知或懷疑突變的區(qū)域位于或鄰近所述鄰接的堿基?？梢栽谶B接酶的存在下，在鄰接的堿基處連接兩個(gè)探針，但只能在兩個(gè)探針都在探針連接區(qū)域正確進(jìn)行堿基配對的條件下連接。然后可以通過連接的探針的存在與否檢測突變的存在與否。
例如美國專利No.5,547,839中描述的基于通過雜交進(jìn)行測序(SBH)的寡核苷酸陣列方法也適用于檢測肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物編碼序列中的突變。在典型的方法中，DNA靶分析物與在微芯片上形成的寡核苷酸陣列雜交。然后可以從靶與陣列結(jié)合的模式“讀出”靶的序列。
D.核酸序列的治療用途本發(fā)明的核酸序列也可以用于治療用途。關(guān)于本發(fā)明的第二方面(即，抑制肥胖和/或糖尿病變體的表達(dá))，可以通過反義技術(shù)調(diào)節(jié)肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的表達(dá)，該技術(shù)通過互補(bǔ)核酸序列，即反義DNA或RNA與編碼變體產(chǎn)物的基因的控制區(qū)、5’區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)的雜交而控制基因表達(dá)。例如，將編碼本發(fā)明的產(chǎn)物的核酸序列的5’編碼部分用于設(shè)計(jì)長度為大約10-40個(gè)堿基對的反義寡核苷酸。來源于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，如從起始位點(diǎn)開始的-10到+10位置之間的寡核苷酸是優(yōu)選的。將反義DNA寡核苷酸設(shè)計(jì)為與參與轉(zhuǎn)錄的核酸序列的區(qū)域互補(bǔ)(Lee etal.，Nucl.Acids Res.63073(1979)；Cooney et al.，Science241456(1988)；和Dervan et al.，Science 2511360(1991))，從而防止變體產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和生產(chǎn)。反義RNA寡核苷酸與mRNA體內(nèi)雜交并且阻斷mRNA分子翻譯為變體產(chǎn)物(Okano，J.Neurochem.56560(1991))?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的程序?qū)⒎戳x構(gòu)建體送遞到細(xì)胞，以便可以體內(nèi)表達(dá)反義RNA或DNA。反義可以是反義mRNA或能夠編碼所述反義mRNA的DNA。反義mRNA或其編碼DNA可以與編碼肥胖和/或糖尿病變體蛋白的序列或者與所述序列的片段互補(bǔ)，其長度足夠抑制蛋白產(chǎn)物生產(chǎn)。也可以將反義技術(shù)用于抑制一種變體相對于另一種變體的表達(dá)，或抑制變體相對于原始序列的表達(dá)。
關(guān)于本發(fā)明的第一方面，即，肥胖和/或糖尿病變體的表達(dá)，可以通過提供在合適的控制元件的控制下編碼所述肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的編碼序列而增加肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的表達(dá)，所述控制元件在需要的宿主中終止所述編碼序列的表達(dá)。
本發(fā)明的核酸序列可以與合適的藥用載體組合使用。所述組合物包含治療有效量的化合物和藥學(xué)可接受的載體或附形劑。所述載體包括，但不限于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其組合。所述制劑應(yīng)當(dāng)適于給藥模式。
本發(fā)明的產(chǎn)物也可以通過在體內(nèi)表達(dá)所述多肽而用于本發(fā)明，通常稱作“基因治療”?？梢杂镁幋a多肽的核酸序列(DNA或RNA)對來自患者的細(xì)胞進(jìn)行離體工程化，然后給用所述多肽治療的患者提供工程化的細(xì)胞。所述方法是本領(lǐng)域公知的。例如，通過使用含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，可以通過本領(lǐng)域公知的程序?qū)?xì)胞進(jìn)行工程化。
類似地，可以對細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)工程化，用于通過本領(lǐng)域公知的程序體內(nèi)表達(dá)多肽。如本領(lǐng)域公知的，可以將用于生產(chǎn)包含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生產(chǎn)細(xì)胞給予患者，以便對細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)工程化并且在體內(nèi)表達(dá)多肽。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，通過所述方法給予本發(fā)明的產(chǎn)物的這些和其它方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該是顯而易見的。例如，用于對細(xì)胞進(jìn)行工程化的表達(dá)載體可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒以外的那些，例如，可以用于在與合適的送遞載體組合后對細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)工程化的腺病毒。
可以得到上述逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括，但不限于，鼠莫洛尼白血病病毒、脾壞死病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒，如勞斯肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒、禽白細(xì)胞增多癥病毒、長臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和哺乳動(dòng)物腫瘤病毒。
將逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體用于轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系以形成生產(chǎn)細(xì)胞系?？梢员晦D(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞包括，但不限于Miller描述的PE501，PA317，psi-2，psi-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，psi-CRE，psi-CRIP，GP+E-86，GP+envAm12，和DAN細(xì)胞系(Human Gene Therapy，Vol.1，pg.5-14，(1990))。載體可以通過本領(lǐng)域公知的任何方法轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。所述方法包括，但不限于電穿孔、使用脂質(zhì)體和CaPO4沉淀。在一種替代方式中，可以將逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體包裹到脂質(zhì)體中，或與脂質(zhì)偶聯(lián)，然后給予宿主。
生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生包含編碼多肽的核酸序列的傳染性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒。然后可以用所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼多肽的核酸序列?？梢赞D(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括，但不限于胚胎干細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞、以及造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。
可以將導(dǎo)入細(xì)胞的基因置于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如放射誘導(dǎo)的Egr-1啟動(dòng)子(Maceri，H.J.，et al.，Cancer Res.56(19)4311(1996))的控制下，以刺激反應(yīng)于放射，如用于治療腫瘤的放射治療的變體產(chǎn)生或反義抑制。
肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物本發(fā)明的基本純化的肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物定義為由本發(fā)明的核酸序列編碼的產(chǎn)物。氨基酸序列優(yōu)選是與SEQ ID NO23-SEQ IDNO25或SEQ ID NO27-SEQ ID NO30或SEQ ID NO32或SEQ IDNO34-SEQ ID NO39或SEQ ID NO41-SEQ ID NO42所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。蛋白或多肽可以是上文所定義的成熟和/或修飾的形式，例如通過切除前導(dǎo)序列進(jìn)行修飾。也包括具有來源于肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，優(yōu)選至少5-20個(gè)殘基的蛋白片段，以及上文解釋的同源物。
序列變異優(yōu)選是上文定義的認(rèn)為是保守取代的那些。因此，例如，優(yōu)選通過上文所述的保守取代得到的具有與SEQ ID NO23-SEQ IDNO25或SEQ ID NO27-SEQ ID NO30或SEQ ID NO32或SEQ IDNO34-SEQ ID NO39或SEQ ID NO41-SEQ ID NO42所示產(chǎn)物具有至少90％序列同一性的序列的蛋白也是本發(fā)明的一部分，前提是它與經(jīng)改變(通常，取代是在變體與原始序列不同的區(qū)域，例如表1所示)得到它的原始肽不同。在更特定的實(shí)施方案中，蛋白具有或含有SEQ IDNO23-SEQ ID NO25或SEQ ID NO27-SEQ ID NO30或SEQ IDNO32或SEQ ID NO34-SEQ ID NO39或SEQ ID NO41-SEQ ID NO42所示序列。肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物可以是(i)其中上文所列序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選保守氨基酸殘基)取代的序列，或(ii)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包含取代的基團(tuán)的序列，或(iii)其中肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物與另一種化合物融合的序列，所述另一種化合物如增加蛋白半衰期的化合物(例如聚乙二醇(PEG))、或作為將蛋白導(dǎo)向于其靶組織或靶細(xì)胞群的導(dǎo)向工具的部分(如抗體)，或(iv)其中額外的氨基酸與肥胖和/或糖尿病產(chǎn)物融合的序列。根據(jù)此處的教導(dǎo)，所述片段、變體和衍生物被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
A.肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的制備上文描述了用于生產(chǎn)和分離肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的重組方法。
除了重組生產(chǎn)，可以采用固相技術(shù)通過直接肽合成(參見Stewartet al.，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co，San Francisco；Merrifield J.，J.Am.Chem.Soc.852149-2154(1963))而生產(chǎn)變體產(chǎn)物的片段和部分。可以用人工技術(shù)或通過自動(dòng)化進(jìn)行體外肽合成。例如，根據(jù)制造商提供的說明，可以用AppliedBiosystems 431A肽合成儀(Perkin Elmer，F(xiàn)oster City，Calif.)完成自動(dòng)化合成?？梢詥为?dú)化學(xué)合成肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的片段，并且用化學(xué)方法組合以生產(chǎn)全長分子。
B.利用肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的治療用途和組合物本發(fā)明的肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物通常用于治療肥胖和/或糖尿病。
可以通過設(shè)計(jì)在靶器官或組織提供一致的和可預(yù)測的化合物濃度的許多途徑和方法中的任何一種，給予肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物或片段?？梢詥为?dú)給予含產(chǎn)物的組合物，或與其它的試劑如穩(wěn)定化合物組合，和/或與其它藥劑，如藥物或激素組合。
可以通過多種途徑給予含肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的組合物，包括，但不限于口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、局部、舌下或直腸途徑，以及通過鼻施用。含肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的組合物也可以通過脂質(zhì)體給藥。所述給藥途徑和合適的制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
可以通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射給予肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物。類似地，可以將產(chǎn)物注射到身體的其它局部區(qū)域。也可以通過鼻吹入法給予所述產(chǎn)物。腸內(nèi)給藥也是可以的。對于所述給藥，可以將產(chǎn)物配制于合適的膠囊或酏劑中用于口服給藥，或配制于栓劑中用于直腸給藥。
前述示例性給藥方式可能需要將產(chǎn)物配制于合適的載體中，包括，例如油膏、凝膠或栓劑。合適的制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
產(chǎn)物的劑量將根據(jù)所選擇的特定多肽的效力和治療指數(shù)而改變。
用于治療方法中的治療性組合物可以包括無菌可注射溶液中的產(chǎn)物、口服送遞載體中的多肽、適于鼻給藥的氣溶膠中的產(chǎn)物、或噴霧化形式的產(chǎn)物，所有這些都是根據(jù)公知方法制備的。所述組合物包含治療有效量的化合物和藥學(xué)可接受的載體或附形劑。所述載體包括，但不限于，鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其組合。本發(fā)明的產(chǎn)物也可以用于調(diào)節(jié)內(nèi)皮分化和增殖，以及用于離體或體外調(diào)節(jié)例如細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞凋亡。
抗病毒抗體A.合成在本發(fā)明的另一方面，將純化的變體產(chǎn)物用于生產(chǎn)抗病毒抗體，所述抗體具有與肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的活性、分布和表達(dá)相關(guān)的診斷和治療用途。
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備抗肥胖和/或糖尿病變體的抗體。所述抗體可以包括，但不限于，多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體、Fab片段和通過Fab表達(dá)文庫制備的片段。抗體，即抑制二聚體形成的那些，對于治療用途是特別優(yōu)選的。
用于抗體誘導(dǎo)的肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的片段不需要以生物學(xué)活性為特征，但必須以免疫學(xué)活性為特征；但是，蛋白片段或寡肽必須是抗原性的。用于誘導(dǎo)特異性抗體的肽可以具有SEQ ID NO23-SEQ ID NO25或SEQ ID NO27-SEQ ID NO30或SEQ ID NO32或SEQ ID NO34-SEQ ID NO39或SEQ ID NO41-SEQ ID NO42所示序列的至少5個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少10個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列。它們優(yōu)選應(yīng)該模擬天然蛋白的氨基酸序列的一部分，并且可以含有小的天然存在分子的完整氨基酸序列。肥胖和/或糖尿病變體蛋白氨基酸的短片段可以與其它蛋白如匙孔血藍(lán)蛋白的片段和針對嵌合分子產(chǎn)生的抗體融合?？梢詫⒈绢I(lǐng)域公知的程序用于生產(chǎn)抗肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的抗體。
為了生產(chǎn)抗體，可以通過注射肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物或保留免疫原性特性的任何部分、片段或寡肽而免疫各種宿主，包括羊、兔、大鼠、小鼠等。根據(jù)宿主的物種，可以用多種佐劑增加免疫應(yīng)答。所述佐劑包括，但不限于弗氏佐劑、礦物凝膠，如氫氧化鋁，和表面活性物質(zhì)，如溶血卵磷脂、多元醇、聚陰離子、肽、油乳狀液、匙孔血藍(lán)蛋白的和二硝基苯酚。BCG(bacilli Calmette-Guerin)和小棒桿菌是潛在有用的人佐劑。
可以用任何技術(shù)制備抗肥胖和/或糖尿病變體蛋白的單克隆抗體，該技術(shù)通過連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞系生產(chǎn)抗體分子。這些包括，但不限于最初由Koehler和Milstein描述的雜交瘤技術(shù)(Nature 256495-497(1975))，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor et al.，Immunol.Today 472(1983)；Cote et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802026-2030(1983))和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole，et al.，Mol.Cell Biol.62109-120(1984))。
也可以使用開發(fā)用于生產(chǎn)“嵌合抗體”的技術(shù)，將小鼠抗體基因剪接于人抗體基因，以獲得具有合適抗原特異性和生物活性的分子(Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855(1984)；Neuberger et al.，Nature 312604-608(1984)；Takedaet al.，Nature 314452-454(1985))。或者，可以改進(jìn)對生產(chǎn)單鏈抗體所描述的技術(shù)(U.S.Pat.No.4,946,778)以適于生產(chǎn)變體蛋白的特異性單鏈抗體。
也可以按照Orlandi等的描述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA863833-3837(1989))，和Winter G and Milstein C.(Nature349293-299(1991))，通過體內(nèi)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞群中的生產(chǎn)或通過篩選重組免疫球蛋白文庫或組而制備抗體。
也可以制備含有肥胖和/或糖尿病變體蛋白的特異性結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。例如，所述片段包括，但不限于可以通過用胃蛋白酶消化抗體分子制備的F(ab′)2片段和可以通過還原F(ab′)2片段的二硫鍵而制備的Fab片段?；蛘撸梢詷?gòu)建Fab表達(dá)文庫，以便允許迅速和容易鑒定具有所需特異性的單克隆Fab片段(Huse W.D.et al.，Science 2561275-1281(1989))。
B.抗體的診斷用途用于使用具有建立的特異性的多克隆或單克隆抗體的競爭性結(jié)合或免疫放射性測量分析的多種方案是本領(lǐng)域公知的。所述免疫測定通常涉及肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物及其特異性抗體之間的復(fù)合物形成和復(fù)合物形成的測量。優(yōu)選的是利用與特異性變體產(chǎn)物上的兩個(gè)不干擾的表位反應(yīng)的單克隆抗體的兩位點(diǎn)、基于單克隆的免疫測定，但也可以使用競爭性結(jié)合測定。這些測定描述于Maddox D.E.，等人的文獻(xiàn)(J.Exp.Med.1581211(1983))。
特異性結(jié)合于肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的抗體可以用于通過肥胖和/或糖尿病變體的超量表達(dá)或表達(dá)不足而診斷特征在于表達(dá)本發(fā)明的新的肥胖和/或糖尿病變體(正常情況下不表達(dá))的狀況或疾病，也可以用于檢測這樣的疾病，其中本發(fā)明的肥胖和/或糖尿病變體和發(fā)生改變而得到變體的原始肥胖和/或糖尿病序列的量之間的比例發(fā)生了改變?；蛘?，所述抗體可以用于監(jiān)測用肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物治療的患者的測定中。用于變體蛋白的診斷性測定包括利用抗體和標(biāo)記檢測人類體液或細(xì)胞或組織提取物中的變體產(chǎn)物的方法?？梢允褂媒?jīng)過修飾或未修飾的本發(fā)明的產(chǎn)物和抗體。通常，通過與報(bào)道分子共價(jià)或非共價(jià)連接，可以標(biāo)記蛋白和抗體。多種報(bào)道分子是本領(lǐng)域公知的。
多種利用各自蛋白的特異性多克隆或單克隆抗體測量肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的方案是本領(lǐng)域公知的。其例子包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)和熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)。如上文所述，優(yōu)選的是利用與特異性變體產(chǎn)物上的兩個(gè)不干擾的表位反應(yīng)的單克隆抗體的兩位點(diǎn)、基于單克隆的免疫測定，但也可以使用競爭性結(jié)合測定。這些測定描述于Maddox D.E.，等人的文獻(xiàn)(上文)和其它文獻(xiàn)。所述方案提供了診斷肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物表達(dá)水平改變或異常的基礎(chǔ)。通過在本領(lǐng)域公知的適于復(fù)合物形成的條件下將采集自正常受試者，優(yōu)選人的體液或細(xì)胞提取物與抗肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的抗體混合，確立肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物表達(dá)的正?；驑?biāo)準(zhǔn)值?？梢酝ㄟ^多種方法，優(yōu)選通過光測量法對標(biāo)準(zhǔn)復(fù)合物形成進(jìn)行定量。然后，可以將從正常樣品獲得的標(biāo)準(zhǔn)值與從優(yōu)先受疾病影響的受試者的樣品獲得的值進(jìn)行比較。標(biāo)準(zhǔn)值和受試者值的差異確定了疾病狀態(tài)的存在。
抗體測定可以用于確定存在于體液樣品中的肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的水平，以便確定它是否在組織被表達(dá)，是否被過量表達(dá)或表達(dá)不足，或作為可變產(chǎn)物的肥胖和/或糖尿病變體水平如何與藥物治療相對應(yīng)的指標(biāo)。
C.抗體的治療用途除了診斷用途，所述抗體可以具有治療用途，用于阻斷或降低病理狀況中的肥胖和/或糖尿病變體產(chǎn)物的活性，其中通過所述降低，可以達(dá)到有益效果。
使用的抗體優(yōu)選是通過公知的球蛋白-基因文庫方法制備的人源化單克隆抗體，或人Mab。通常通過IV注射，給予作為無菌溶液的抗體，但是其它的腸胃外途徑也是合適的。通?？贵w的給藥量是約1-15mg/kg受試者體重。例如用每1-7天給藥而繼續(xù)進(jìn)行治療，直到觀察到治療改進(jìn)。
盡管參照特定方法和實(shí)施方案描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，可以進(jìn)行多種修改和改變而不背離本發(fā)明。
實(shí)施例1——分離以等于2的MOI，用表達(dá)包含SEQ ID NO23-SEQ ID NO25或SEQ ID NO27-SEQ ID NO30或SEQ ID NO32或SEQ ID NO34-SEQ ID NO39或SEQ ID NO41-SEQ ID NO42的氨基酸序列的肥胖和/或糖尿病變體(AC-肥胖和/或糖尿病變體)的桿狀病毒感染Sf-9細(xì)胞。在28℃，連續(xù)振蕩(90rpm)下生長細(xì)胞。在感染后(hpi)60小時(shí)，收集培養(yǎng)基，通過以5000rpm離心5分鐘而從培養(yǎng)基分離細(xì)胞。采用SP-Sepharose柱，通過陽離子交換層析分離10mL培養(yǎng)基。用PBS pH6.5平衡柱子，并且在將樣品加樣到柱子上后，用PBS洗滌柱子，以洗脫未結(jié)合的蛋白(流通級分)。用濃度逐漸增加的NaCl，以2mL/min(5％NaCl/min)的流速進(jìn)行洗脫。
對不同的級分進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并且用抗肥胖和/或糖尿病變體抗體進(jìn)行蛋白印跡。
實(shí)施例2——分泌以等于2的MOI，用表達(dá)肥胖和/或糖尿病變體(AC-肥胖和/或糖尿病變體)的桿狀病毒感染Sf-9細(xì)胞。在28℃，連續(xù)振蕩(90rpm)下生長細(xì)胞，在感染后(hpi)24、48和60小時(shí)收集1mL樣品。離心后，用裂解緩沖液(50mM Tris pH 7.5，1％ triton X100，和蛋白酶抑制劑混合物)在4℃下裂解細(xì)胞沉淀30分鐘，并且超聲處理30秒。以14000rpm離心樣品10分鐘，將上清液指定為Pellet。將樣品緩沖液補(bǔ)加到40μL Pellet制劑和40μL培養(yǎng)基(指定培養(yǎng)基)，在15％SDS-PAGE上電泳。電泳后，對凝膠進(jìn)行半干蛋白轉(zhuǎn)移，以便轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將所述膜與抗肥胖和/或糖尿病變體溫育2小時(shí)，并且與第二抗-兔抗體再溫育1小時(shí)。
用商購的蛋白印跡檢測試劑盒進(jìn)行信號(hào)檢測。
序列表<110>Mintz，Liat<120>用于診斷、監(jiān)測和治療肥胖和/或糖尿病的組合物、試劑和試劑盒以及方法<130>28238-001<150>US 10/659,782<151>2003-09-11<160>42<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>4517<212>DNA<213>人<400>1ctgattccat accagagggg ctcaggatgc tgttgctggg agctgttcta ctgctattag 60ctctgcccgg gcatgaccag gaaaccacga ctcaagggcc cggagtcctg cttcccctgc 120ccaagggggc ctgcacaggt tggatggcgg gcatcccagg gcatccgggc cataatgggg 180ccccaggccg tgatggcaga gatggcaccc ctggtgagaa gggtgagaaa ggagatccag 240gtcttattgg tcctaaggga gacatcggtg aaaccggagt acccggggct gaaggtcccc 300gaggctttcc gggaatccaa ggcaggaaag gagaacctgg agaaggtgcc tatgtatacc 360gctcagcatt cagtgtggga ttggagactt acgttactat ccccaacatg cccattcgct 420ttaccaagat cttctacaat cagcaaaacc actatgatgg ctccactggt aaattccact 480gcaacattcc tgggctgtac tactttgcct accacatcac agtctatatg aaggatgtga 540aggtcagcct cttcaagaag gacaaggcta tgctcttcac ctatgatcag taccaggaaa 600ataatgtgga ccaggcctcc ggctctgtgc tcctgcatct ggaggtgggc gaccaagtct 660ggctccaggt gtatggggaa ggagagcgta atggactcta tgctgataat gacaatgact 720ccaccttcac aggctttctt ctctaccatg acaccaactg atcaccacta actcagagcc 780tcctccaggc caaacagccc caaagtcaat taaaggcttt cagtacggtt aggaagttga 840ttattattta gttggaggcc tttagatatt attcattcat ttactcattc atttattcat 900tcattcatca agtaacttta aaaaaatcat atgctatgtt cccagtcctg gggagcttca 960caaacatgac cagataactg actagaaaga agtagttgac agtgctattt tgtgcccact1020gtctctcctg atgctcatat caatcctata aggcacaggg aacaagcatt ctcctgtttt1080tacagattgt atcctgaggc tgagagagtt aagtgaatgt ctaaggtcac acagtattaa1140gtgacagtgc tagaaatcaa acccagagct gtggactttg ttcactagac tgtgcccttt1200tatagaggta catgttctct ttggagtgtt ggtaggtgtc tgtttcccac ctcacctgag1260agccattgaa tttgccttcc tcatgaatta aaacctcccc caagcagagc ttcctcagag1320aaagtggttc tatgatgaag tcctgtcttg gaaggactac tactcaatgg cccctgcact1380
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<400>21actgttggcc tctggawtca gaggctgctg cctgcctggg aggttgtaga aagctctgca 60ggttttcttc gtgtgtccta cagggcgccc tgagccaggt ccctgtttga tggcagttat 120gaaaaattac ctcctcccga tcctggtgct cttcctggcc tactactact attctacaaa 180tgaagagttc agaccagaaa tgctccaggg aaagaaagtg attgtcactg gggccagcaa 240agggattgga agagaaatgg catatcatct gtcaaaaatg ggagcccatg tggtattgac 300tgccaggtcg gaggaaggtc tccagaaggt agtgtctcgc tgccttgaac tcggagcagc 360ctctgctcac tacattgctg gcactatgga agacatgaca tttgcggagc aatttattgt 420caaggcggga aagctcatgg gcggactgga catgcttatt ctaaaccaca tcactcagac 480ctcgctgtct ctcttccatg acgacatcca ctctgtgcga agagtcatgg aggtcaactt 540cctcagctac gtggtcatga gcacagccgc cttgcccatg ctgaagcaga gcaatggcag 600cattgccgtc atctcctcct tggctggggg aagaacagtt ccacaacaga gaagtcgcag 660tgttactcct gactcccgcg gcccgtgatt aatatcacca gccacagaat ggactggaac 720cctgtatcga tctggtggga ttggatataa cgaacataga attactcctg agactaccag 780aactgaatag ttcaaatcaa atcatgccag aatatcagac aaatccaaat ggcaaaacag 840ttgca 845<210>22<211>244<212>PRT<213>人<400>22Met Leu Leu Leu Gly Ala Val Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Gly His1 5 10 15Asp Gln Glu Thr Thr Thr Gln Gly Pro Gly Val Leu Leu Pro Leu Pro20 25 30Lys Gly Ala Cys Thr Gly Trp Met Ala Gly Ile Pro Gly His Pro Gly35 40 45His Asn Gly Ala Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr Pro Gly Glu50 55 60Lys Gly Glu Lys Gly Asp Pro Gly Leu Ile Gly Pro Lys Gly Asp Ile65 70 75 80Gly Glu Thr Gly Val Pro Gly Ala Glu Gly Pro Arg Gly Phe Pro Gly85 90 95Ile Gln Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly Glu Gly Ala Tyr Val Tyr Arg100 105 110
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Leu Asp Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr Asn Thr Ser Leu Asn Leu115 120 125Phe His Asp Asp Ile His His Val Arg Lys Ser Met Glu Val Asn Phe130 135 140Leu Ser Tyr Val Val Leu Thr Val Ala Ala Leu Pro Met Leu Lys Gln145 150 155 160Ser Asn Gly Ser Ile Val Val Val Ser Ser Leu Ala Gly Lys Val Ala165 170 175Tyr Pro Met Val Ala Ala Tyr Ser Ala Ser Lys Phe Ala Leu Asp Gly180 185 190Phe Phe Ser Ser Ile Arg Lys Glu Tyr Ser Val Ser Arg Val Asn Val195 200 205Ser Ile Thr Leu Cys Val Leu Gly Leu Ile Asp Thr Glu Thr Ala Met210 215 220Lys Ala Val Ser Gly Ile Val His Met Gln Ala Ala Pro Lys Glu Glu225 230 235 240Cys Ala Leu Glu Ile Ile Lys Gly Gly Ala Leu Arg Gln Glu Glu Val245 250 255Tyr Tyr Asp Ser Ser Leu Trp Thr Thr Leu Leu Ile Arg Asn Pro Cys260 265 270Arg Lys Ile Leu Glu Phe Leu Tyr Ser Thr Ser Tyr Asn Met Asp Arg275 280 285Phe Ile Asn Lys290<210>34<211>163<212>PRT<213>人<220>
<221>綜合特征<222>(163)..(163)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<400>34Met Ala Phe Met Lys Lys Tyr Leu Leu Pro Ile Leu Gly Leu Phe Met1 5 10 15Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Ala Asn Glu Glu Phe Arg Pro Glu Met Leu
20 25 30Gln Gly Lys Lys Val Ile Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile Gly Arg35 40 45Glu Met Ala Tyr His Leu Ala Lys Met Gly Ala His Val Val Val Thr50 55 60Ala Ser Ser Ala His Tyr Ile Ala Gly Thr Met Glu Asp Met Thr Phe65 70 75 80Ala Glu Gln Phe Val Ala Gln Ala Gly Lys Leu Met Gly Gly Leu Asp85 90 95Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr Asn Thr Ser Leu Asn Leu Phe His100 105 110Asp Asp Ile His His Val Arg Lys Ser Met Glu Val Asn Phe Leu Ser115 120 125Tyr Val Val Leu Thr Val Ala Ala Leu Pro Met Leu Lys Gln Ser Asn130 135 140Gly Ser Met Cys Ala Leu Leu Leu Glu Cys Tyr His Val Val His Leu145 150 155 160Ser Ser Xaa<210>35<211>295<212>PRT<213>人<400>35Met Ala Phe Met Lys Lys Tyr Leu Leu Pro Ile Leu Gly Leu Phe Met1 5 10 15Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Ala Asn Glu Glu Phe Arg Pro Glu Met Leu20 25 30Gln Gly Lys Lys Val Ile Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile Gly Arg35 40 45Glu Met Ala Tyr His Leu Ala Lys Met Gly Ala His Val Val Val Thr50 55 60Ala Arg Ser Lys Glu Thr Leu Gln Lys Val Val Ser His Cys Leu Glu65 70 75 80Leu Gly Ala Ala Ser Ala His Tyr Ile Ala Gly Thr Met Glu Asp Met
85 90 95Thr Phe Ala Glu Gln Phe Val Ala Gln Ala Gly Lys Leu Met Gly Gly100 105 110Leu Asp Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr Asn Thr Ser Leu Asn Leu115 120 125Phe His Asp Asp Ile His His Val Arg Lys Ser Met Glu Val Asn Phe130 135 140Leu Ser Tyr Val Val Leu Thr Val Ala Ala Leu Pro Met Leu Lys Gln145 150 155 160ser Asn Gly Ser Ile Val Val Val Ser Ser Leu Ala Gly Lys Val Ala165 170 175Tyr Pro Met Val Ala Ala Tyr Ser Ala Ser Lys Phe Ala Leu Asp Gly180 185 190Phe Phe Ser Ser Ile Arg Lys Glu Tyr Ser Val Ser Arg Val Asn Val195 200 205Ser Ile Thr Leu Cys Val Leu Gly Leu Ile Asp Thr Glu Thr Ala Met210 215 220Lys Ala Val Ser Gly Ile Val His Met Gln Ala Ala Pro Lys Glu Glu225 230 235 240Cys Ala Leu Glu Ile Ile Lys Gly Gly Ala Leu Arg Gln Glu Glu Val245 250 255Tyr Tyr Asp Ser Ser Leu Trp Thr Thr Leu Leu Ile Arg Asn Pro Cys260 265 270Arg Lys Ile Leu Glu Phe Leu Tyr Ser Thr Ser Tyr Asn Met Glu Gly275 280 285Leu Phe Cys Leu Met Phe Ile290 295<210>36<211>274<212>PRT<213>人<400>36Met Ala Phe Met Lys Lys Tyr Leu Leu Pro Ile Leu Gly Leu Phe Met1 5 10 15Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Ala Asn Glu Glu Phe Arg Pro Glu Met Leu
20 25 30Gln Gly Lys Lys Val Ile Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile Gly Arg35 40 45Glu Met Ala Tyr His Leu Ala Lys Met Gly Ala His Val Val Val Thr50 55 60Ala Arg Ser Lys Glu Thr Leu Gln Lys Val Val Ser His Cys Leu Glu65 70 75 80Leu Gly Ala Ala Ser Ala His Tyr Ile Ala Gly Thr Met Glu Asp Met85 90 95Thr Phe Ala Glu Gln Phe Val Ala Gln Ala Gly Lys Leu Met Gly Gly100 105 110Leu Asp Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr Asn Thr Ser Leu Asn Leu115 120 125Phe His Asp Asp Ile His His Val Arg Pro Met Leu Lys Gln Ser Asn130 135 140Gly Ser Ile Val Val Val Ser Ser Leu Ala Gly Lys Val Ala Tyr Pro145 150 155 160Met Val Ala Ala Tyr Ser Ala Ser Lys Phe Ala Leu Asp Gly Phe Phe165 170 175Ser Ser Ile Arg Lys Glu Tyr Ser Val Ser Arg Val Asn Val Ser Ile180 185 190Thr Leu Cys Val Leu Gly Leu Ile Asp Thr Glu Thr Ala Met Lys Ala195 200 205Val Ser Gly Ile Val His Met Gln Ala Ala Pro Lys Glu Glu Cys Ala210 215 220Leu Glu Ile Ile Lys Gly Gly Ala Leu Arg Gln Glu Glu Val Tyr Tyr225 230 235 240Asp Ser Ser Leu Trp Thr Thr Leu Leu Ile Arg Asn Pro Cys Arg Lys245 250 255Ile Leu Glu Phe Leu Tyr Ser Thr Ser Tyr Asn Met Asp Arg Phe Ile260 265 270Asn Lys
<210>37<211>274<212>PRT<213>人<400>37Met Ala Phe Met Lys Lys Tyr Leu Leu Pro Ile Leu Gly Leu Phe Met15 10 15Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Ala Asn Glu Glu Phe Arg Pro Glu Met Leu20 25 30Gln Gly Lys Lys Val Ile Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile Gly Arg35 40 45Glu Met Ala Tyr His Leu Ala Lys Met Gly Ala His Val Val Val Thr50 55 60Ala Ser Ser Ala His Tyr Ile Ala Gly Thr Met Glu Asp Met Thr Phe65 70 75 80Ala Glu Gln Phe Val Ala Gln Ala Gly Lys Leu Met Gly Gly Leu Asp85 90 95Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr Asn Thr Ser Leu Asn Leu Phe His100 105 110Asp Asp Ile His His Val Arg Lys Ser Met Glu Val Asn Phe Leu Ser115 120 125Tyr Val Val Leu Thr Val Ala Ala Leu Pro Met Leu Lys Gln Ser Asn130 135 140Gly Ser Ile Val Val Val Ser Ser Leu Ala Gly Lys Val Ala Tyr Pro145 150 155 160Met Val Ala Ala Tyr Ser Ala Ser Lys Phe Ala Leu Asp Gly Phe Phe165 170 175Ser Ser Ile Arg Lys Glu Tyr Ser Val Ser Arg Val Asn Val Ser Ile180 185 190Thr Leu Cys Val Leu Gly Leu Ile Asp Thr Glu Thr Ala Met Lys Ala195 200 205Val Ser Gly Ile Val His Met Gln Ala Ala Pro Lys Glu Glu Cys Ala210 215 220Leu Glu Ile Ile Lys Gly Gly Ala Leu Arg Gln Glu Glu Val Tyr Tyr225 230 235 240
Asp Ser Ser Leu Trp Thr Thr Leu Leu Ile Arg Asn Pro Cys Arg Lys245 250255Ile Leu Glu Phe Leu Tyr Ser Thr Ser Tyr Asn Met Asp Arg Phe Ile260 265 270Asn Lys<210>38<211>262<212>PRT<213>人<400>38Met Leu Gln Gly Lys Lys Val Ile Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile1 5 10 15Gly Arg Glu Met Ala Tyr His Leu Ala Lys Met Gly Ala His Val Val20 25 30Val Thr Ala Arg Ser Lys Glu Thr Leu Gln Lys Val Val Ser His Cys35 40 45Leu Glu Leu Gly Ala Ala Ser Ala His Tyr Ile Ala Gly Thr Met Glu50 55 60Asp Met Thr Phe Ala Glu Gln Phe Val Ala Gln Ala Gly Lys Leu Met65 70 75 80Gly Gly Leu Asp Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr Asn Thr Ser Leu85 90 95Asn Leu Phe His Asp Asp Ile His His Val Arg Lys Ser Met Glu Val100 105 110Asn Phe Leu Ser Tyr Val Val Leu Thr Val Ala Ala Leu Pro Met Leu115 120 125Lys Gln Ser Asn Gly Ser Ile Val Val Val Ser Ser Leu Ala Gly Lys130 135 140Val Ala Tyr Pro Met Val Ala Ala Tyr Ser Ala Ser Lys Phe Ala Leu145 150 155 160Asp Gly Phe Phe Ser Ser Ile Arg Lys Glu Tyr Ser Val Ser Arg Val165 170 175Asn Val Ser Ile Thr Leu Cys Val Leu Gly Leu Ile Asp Thr Glu Thr180 185 190
Ala Met Lys Ala Val Ser Gly Ile Val His Met Gln Ala Ala Pro Lys195 200 205Glu Glu Cys Ala Leu Glu Ile Ile Lys Gly Gly Ala Leu Arg Gln Glu210 215 220Glu Val Tyr Tyr Asp Ser Ser Leu Trp Thr Thr Leu Leu Ile Arg Asn225 230 235 240Pro Cys Arg Lys Ile Leu Glu Phe Leu Tyr Ser Thr Ser Tyr Asn Met245250 255Asp Arg Phe Ile Asn Lys260<210>39<211>244<212>PRT<213>人<400>39Met Ala Phe Met Lys Lys Tyr Leu Leu Pro Ile Leu Gly Leu Phe Met1 5 10 15Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Ala Asn Glu Glu Phe Arg Pro Glu Met Leu20 25 30Gln Gly Lys Lys Val Ile Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile Gly Arg35 40 45Glu Met Ala Tyr His Leu Ala Lys Met Gly Ala His Val Val Val Thr50 55 60Ala Arg Ser Lys Glu Thr Leu Gln Lys Val Val Ser His Cys Leu Glu65 70 75 80Leu Gly Ala Ala Ser Ala His Tyr Ile Ala Gly Thr Met Glu Asp Met85 90 95Thr Phe Ala Glu Gln Phe Val Ala Gln Ala Gly Lys Leu Met Gly Gly100 105 110Leu Asp Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr Asn Thr Ser Leu Asn Leu115 120 125Phe His Asp Asp Ile His His Val Arg Lys Ser Met Glu Val Asn Phe130 135 140Leu Ser Tyr Val Val Leu Thr Val Ala Ala Leu Pro Met Leu Lys Gln145 150 155 160
Ser Asn Gly Ser Ile Val Val Val Ser Ser Leu Ala Glu Thr Ala Met165 170 175Lys Ala Val Ser Gly Ile Val His Met Gln Ala Ala Pro Lys Glu Glu180 185 190Cys Ala Leu Glu Ile Ile Lys Gly Gly Ala Leu Arg Gln Glu Glu Val195 200 205Tyr Tyr Asp Ser Ser Leu Trp Thr Thr Leu Leu Ile Arg Asn Pro Cys210 215 220Arg Lys Ile Leu Glu Phe Leu Tyr Ser Thr Ser Tyr Asn Met Asp Arg225 230 235 240Phe Ile Asn Lys<210>40<211>292<212>PRT<213>小鼠<400>40Met Ala Val Met Lys Asn Tyr Leu Leu Pro Ile Leu Val Leu Phe Leu1 5 10 15Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Thr Asn Glu Glu Phe Arg Pro Glu Met Leu20 25 30Gln Gly Lys Lys Val Ile Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile Gly Arg35 40 45Glu Met Ala Tyr His Leu Ser Lys Met Gly Ala His Val Val Leu Thr50 55 60Ala Arg Ser Glu Glu Gly Leu Gln Lys Val Val Ser Arg Cys Leu Glu65 70 75 80Leu Gly Ala Ala Ser Ala His Tyr Ile Ala Gly Thr Met Glu Asp Met85 90 95Thr Phe Ala Glu Gln Phe Ile Val Lys Ala Gly Lys Leu Met Gly Gly100 105 110Leu Asp Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr Gln Thr Ser Leu Ser Leu115 120 125Phe His Asp Asp Ile His Ser Val Arg Arg Val Met Glu Val Asn Phe130 135 140
Leu Ser Tyr Val Val Met Ser Thr Ala Ala Leu Pro Met Leu Lys Gln145 150 155 160Ser Asn Gly Ser Ile Ala Val Ile Ser Ser Leu Ala Gly Lys Met Thr165 170 175Gln Pro Met Ile Ala Pro Tyr Ser Ala Ser Lys Phe Ala Leu Asp Gly180 185 190Phe Phe Ser Thr Ile Arg Thr Glu Leu Tyr Ile Thr Lys Val Asn Val195 200 205Ser Ile Thr Leu Cys Val Leu Gly Leu Ile Asp Thr Glu Thr Ala Met210 215 220Lys Glu Ile Ser Gly Ile Ile Asn Ala Gln Ala Ser Pro Lys Glu Glu225 230 235 240Cys Ala Leu Glu Ile Ile Lys Gly Thr Ala Leu Arg Lys Ser Glu Val245 250 255Tyr Tyr Asp Lys Ser Pro Leu Thr Pro Ile Leu Leu Gly Asn Pro Gly260 265 270Arg Lys Ile Met Glu Phe Phe Ser Leu Arg Tyr Tyr Asn Lys Asp Met275 280 285Phe Val Ser Asn290<210>41<211>250<212>PRT<213>小鼠<400>41Met Ala Val Met Lys Asn Tyr Leu Leu Pro Ile Leu Val Leu Phe Leu1 5 10 15Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Thr Asn Glu Glu Phe Arg Leu Gln Lys Val20 25 30Val Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gly Ala Ala Ser Ala His Tyr Ile Ala35 40 45Gly Thr Met Glu Asp Met Thr Phe Ala Glu Gln Phe Ile Val Lys Ala50 55 60Gly Lys Leu Met Gly Gly Leu Asp Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr65 70 75 80
Gln Thr Ser Leu Ser Leu Phe His Asp Asp Ile His Ser Val Arg Arg85 90 95Val Met Glu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Val Val Met Ser Thr Ala Ala100 105 110Leu Pro Met Leu Lys Gln Ser Asn Gly Ser Ile Ala Val Ile Ser Ser115 120 125Leu Ala Gly Lys Met Thr Gln Pro Met Ile Ala Pro Tyr Ser Ala Ser130 135 140Lys Phe Ala Leu Asp Gly Phe Phe Ser Thr Ile Arg Thr Glu Leu Tyr145 150 155 160Ile Thr Lys Val Asn Val Ser Ile Thr Leu Cys Val Leu Gly Leu Ile165 170 175Asp Thr Glu Thr Ala Met Lys Glu Ile Ser Gly Ile Ile Asn Ala Gln180 185 190Ala Ser Pro Lys Glu Glu Cys Ala Leu Glu Ile Ile Lys Gly Thr Ala195 200 205Leu Arg Lys Ser Glu Val Tyr Tyr Asp Lys Ser Pro Leu Thr Pro Ile210 215 220Leu Leu Gly Asn Pro Gly Arg Lys Ile Met Glu Phe Phe Ser Leu Arg225 230 235 240Tyr Tyr Asn Lys Asp Met Phe Val Ser Asn245 250<210>42<211>192<212>PRT<213>小鼠<400>42Met Ala Val Met Lys Asn Tyr Leu Leu Pro Ile Leu Val Leu Phe Leu1 5 10 15Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Thr Asn Glu Glu Phe Arg Pro Glu Met Leu20 25 30Gln Gly Lys Lys Val Ile Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile Gly Arg35 40 45Glu Met Ala Tyr His Leu Ser Lys Met Gly Ala His Val Val Leu Thr50 55 60
Ala Arg Ser Glu Glu Gly Leu Gln Lys Val Val Ser Arg Cys Leu Glu65 70 75 80Leu Gly Ala Ala Ser Ala His Tyr Ile Ala Gly Thr Met Glu Asp Met85 90 95Thr Phe Ala Glu Gln Phe Ile Val Lys Ala Gly Lys Leu Met Gly Gly100 105 110Leu Asp Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr Gln Thr Ser Leu Ser Leu115 120 125Phe His Asp Asp Ile His Ser Val Arg Arg Val Met Glu Val Asn Phe130 135 140Leu Ser Tyr Val Val Met Ser Thr Ala Ala Leu Pro Met Leu Lys Gln145 150 155 160Ser Asn Gly Ser Ile Ala Val Ile Ser Ser Leu Ala Gly Gly Arg Thr165 170 175Val Pro Gln Gln Arg Ser Arg Ser Val Thr Pro Asp Ser Arg Gly Pro180 185 190
權(quán)利要求
1.分離的核酸序列，選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ IDNO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21及其互補(bǔ)序列。
2.核酸片段，包含權(quán)利要求1的分離的核酸序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基對區(qū)段。
3.權(quán)利要求2的核酸片段，包含權(quán)利要求1的分離的核酸序列的15-30個(gè)連續(xù)堿基對區(qū)段。
4.包含權(quán)利要求2的核酸片段的引物。
5.包含權(quán)利要求2的核酸片段的探針。
6.權(quán)利要求1的分離的核酸序列，其中至少一個(gè)優(yōu)選的密碼子替代了所述序列的至少一個(gè)密碼子。
7.由權(quán)利要求1的分離的核酸序列編碼的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求7的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列選自SEQ IDNO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO32，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35，SEQID NO36，SEQ ID NO37，SEQ ID NO38，SEQ ID NO39，SEQ ID NO41和SEQ ID NO42。
9.包含權(quán)利要求8的氨基酸序列的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸區(qū)段的肽。
10.權(quán)利要求9的肽，包含權(quán)利要求8的氨基酸序列的5-20個(gè)連續(xù)氨基酸區(qū)段。
11.包含權(quán)利要求1的分離的核酸序列的表達(dá)載體，所述序列與用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述序列的控制元件可操作性連接。
12.用權(quán)利要求11的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
13.反義寡核苷酸，包含選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20和SEQ IDNO21的核酸序列的反向互補(bǔ)序列的10-40個(gè)連續(xù)堿基對區(qū)段。
14.檢測肥胖和/或糖尿病相關(guān)基因的至少一個(gè)變體核酸序列在生物樣品中的存在的方法，包括以下步驟(a)將選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ IDNO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21或其互補(bǔ)序列的分離的核酸序列與生物樣品中的核酸物質(zhì)雜交；和(b)檢測由步驟(a)產(chǎn)生的雜交復(fù)合物；其中雜交復(fù)合物的存在與至少一種變體核酸在生物樣品中的存在相關(guān)。
15.測定生物樣品中的變體核酸序列水平的方法，包括以下步驟(a)將選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ IDNO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21或其互補(bǔ)序列的分離的核酸序列與生物樣品中的核酸物質(zhì)雜交；和(b)確定由步驟(a)產(chǎn)生的雜交復(fù)合物的量；和(c)對雜交復(fù)合物的量進(jìn)行歸一化，以提供生物樣品中的變體核酸序列水平。
16.確定第一種生物樣品中肥胖和/或糖尿病相關(guān)基因變體的核酸序列水平與第二種生物樣品中通過可變剪接制備的變體的比例的方法，包括以下步驟(a)確定第一種生物樣品中肥胖和/或糖尿病相關(guān)基因變體的第一種核酸序列的水平；(b)確定第二種生物樣品中可變剪接形式的變體的第二種核酸序列的水平；和(c)比較步驟(a)和步驟(b)獲得的水平，以得到比例。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述第一種生物樣品和第二種生物樣品是相同的樣品。
18.權(quán)利要求16的方法，其中第一種核酸序列和第二種核酸序列是mRNA轉(zhuǎn)錄物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中第一種核酸序列和第二種核酸序列沉積在核酸芯片上。
20.鑒定能夠影響肥胖和/或糖尿病相關(guān)蛋白與所述蛋白的受體結(jié)合親和力的化合物的方法，包括以下步驟(a)提供選自SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO27，SEQID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO32，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO37，SEQ ID NO38，SEQID NO39，SEQ ID NO41和SEQ ID NO42的氨基酸序列；(b)在肥胖和/或糖尿病相關(guān)基因的至少一種受體的存在下使候選化合物與氨基酸序列接觸；(c)確定候選化合物對氨基酸序列與至少一種受體的結(jié)合的影響；和(d)選擇能夠影響肥胖和/或糖尿病相關(guān)蛋白與所述蛋白的受體的結(jié)合親和力的化合物。
21.確定第一種生物樣品中肥胖和/或糖尿病相關(guān)蛋白變體的水平與第二種生物樣品中通過可變剪接制備的變體的比例的方法，包括以下步驟(a)確定第一種生物樣品中肥胖和/或糖尿病相關(guān)基因變體的第一種氨基酸序列的水平；(b)確定第二種生物樣品中可變剪接形式的變體的第二種氨基酸序列的水平；和(c)比較步驟(a)和步驟(b)獲得的水平，以得到比例。
22.通過聚合酶鏈反應(yīng)檢測特異性肥胖和/或糖尿病相關(guān)核酸序列的方法，包括以下步驟(a)用引物對擴(kuò)增特異性肥胖和/或糖尿病相關(guān)核酸序列，其中至少一個(gè)引物包含選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21及其互補(bǔ)序列的核酸序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基對片段；和(b)檢測步驟(a)的核酸產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及13種新的肥胖和/或糖尿病相關(guān)基因的可變剪接變體。
文檔編號(hào)C12N9/04GK101023184SQ200480026203
公開日2007年8月22日 申請日期2004年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月11日
發(fā)明者利亞特·明茨 申請人:利亞特·明茨