專利名稱：作為選擇性ngf途徑抑制劑的人抗ngf中和抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)合神經(jīng)生長因子(NGF)的人單克隆抗體。本發(fā)明還描述了用以治療疼痛和疼痛相關(guān)疾病的組合物和方法。
背景技術(shù)：
美國每天有兩百多萬人因慢性疼痛而致殘(Jessell和Kelly，1991，“Pain and Analgesia”，PRINCIPLES OF NEURAL SCIENCE，第3版，(Kandel，Schwartz和Jessell編輯)，Elsevier，New York)。不幸的是，目前的疼痛治療只是部分有效，而且這些治療中有許多本身會導(dǎo)致人虛弱或者導(dǎo)致危險的副作用。例如，雖然非類固醇抗炎藥(“NSAID”)，如阿司匹林、布洛芬和吲哚美辛對炎性疼痛有中度的效果，但它們同時也是腎臟毒素，劑量高時往往會導(dǎo)致胃腸刺激、潰瘍、出血和精神錯亂。用阿片類治療的患者也常常遭遇精神錯亂，且長期使用阿片類與伴隨出現(xiàn)藥物耐受性和依賴性。局部麻醉劑如利多卡因和美西律在抑制疼痛的同時導(dǎo)致正常感覺的喪失。
疼痛是一種基于從周圍環(huán)境接受并由神經(jīng)系統(tǒng)傳遞和解釋的信號的感知(有關(guān)綜述參見Millan，1999，Prog.Neurobiol.571-164)。有害的刺激如熱覺和觸覺會促使皮膚中的專用感受器將信號傳輸?shù)街袠猩窠?jīng)系統(tǒng)(“CNS”)。這個過程稱作傷害感受，介導(dǎo)這個過程的周圍感覺神經(jīng)元即傷害感受器。取決于來自傷害感受器的信號強度以及CNS對該信號的提取和解析，人可能會或者可能不會將有害刺激感受為疼痛刺激。當(dāng)一個人對疼痛的感知與刺激的強度正確校準(zhǔn)時，疼痛能發(fā)揮其預(yù)期的保護(hù)功能。但是，某些類型的組織損害會導(dǎo)致稱為痛覺過敏或早期痛覺(pronociception)的現(xiàn)象，其中相對無害的刺激被感知為強烈疼痛，這是因為人的疼痛閾已降低。炎癥和神經(jīng)損害均會引起痛覺過敏。受炎癥疾病影響的人往往會體驗到疼痛感覺增強，所述炎癥例如曬傷、骨關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎、心炎、皮炎、肌炎、神經(jīng)炎、膠原血管病(其包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和狼瘡)等。同樣，創(chuàng)傷、外科手術(shù)、截肢、膿腫、灼痛、膠原血管病、脫髓鞘病、三叉神經(jīng)痛、癌癥、慢性酒精中毒、中風(fēng)、丘腦疼痛綜合征、糖尿病、皰疹感染、獲得性免疫缺陷綜合征(“AIDS”)、毒素和化學(xué)療法會造成神經(jīng)損傷，導(dǎo)致過度疼痛。
隨著對傷害感受器在正常和痛覺過敏條件下轉(zhuǎn)導(dǎo)外界信號的機制的認(rèn)識加深，可以把目標(biāo)指向牽涉痛覺過敏的過程，以抑制疼痛閾的下降，從而減少所體驗到的疼痛的量。
已顯示神經(jīng)營養(yǎng)因子在生理和病理疼痛的傳遞中發(fā)揮重要的作用。神經(jīng)生長因子(NGF)看來似乎特別重要(有關(guān)綜述參見McMahon，1996，Phil.Trans.R.Soc.Lond.351431-40；及Apfel，2000，The ClinicalJourstal of Pain16S7-S11)。已顯示局部性和全身給予NGF能引起痛覺過敏和異常性疼痛(Lewin等，1994，Eur.J Neurosci.61903-1912)。在人類中靜脈輸注NGF產(chǎn)生全身肌痛，而局部給予時除了會引起全身效應(yīng)外，還會引起注射部位痛覺過敏和異常性疼痛(Apfel等，1998，Neurology51695-702)。還有大量的證據(jù)暗示內(nèi)源NGF牽涉到以疼痛為主要特征的疾病。例如，出現(xiàn)周圍神經(jīng)損傷之后，NGF在背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)膜細(xì)胞中被上調(diào)至少2個月，已報告在患有各種關(guān)節(jié)炎模型的動物關(guān)節(jié)中NGF水平提高(例如Aloe等，1993，Growth Factors9149-155)。在人類中，患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或者其他類型關(guān)節(jié)炎的患者的滑液中NGF水平提高(例如Aloe等，1992，Arthritis和Rheumatism35351-355)。此外，還已證明，在神經(jīng)性和慢性炎性疼痛模型中，對NGF功能的拮抗能防止痛覺過敏和異常性疼痛。例如，神經(jīng)性疼痛的動物模型(例如神經(jīng)干或脊神經(jīng)結(jié)扎)中，全身注射抗NGF中和抗體能防止異常性疼痛和痛覺過敏(Ramer等，1999，Eur.J.Neurosci.11837-846；及Ro等，1999，Pain79265-274)。本領(lǐng)域公知的抗NGF抗體的實例包括例如PCT公開WO 01/78698、WO 01/64247、WO 02/096458和WO 2004/032870；美國專利第5,844,092號、第5,877,016號和第6,153,189號；Hongo等，2000，Hybridoma19215-227；Hongo等，1993，Cell.Mol.Biol.13559-568；及GenBank檢索號U39608、U39609、L17078或L17077。
顯然，需要安全有效的新型疼痛治療法，特別是把目標(biāo)指向小分子的疼痛介體或惡化體(exacerbator)如NGF的治療法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供在治療上用于控制疼痛的新型人單克隆抗體。具體的說，本發(fā)明提供結(jié)合神經(jīng)生長因子(NGF)的單克隆抗體。優(yōu)選所述單克隆抗體是人單克隆抗體，能中和NGF的生物活性，可用于改善NGF介導(dǎo)的疼痛反應(yīng)的效應(yīng)。本發(fā)明還提供生產(chǎn)本發(fā)明單克隆抗體、最優(yōu)選還將單克隆抗體分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞。本發(fā)明抗體除了在治療和控制疼痛中的用途之外，還用于治療神經(jīng)病性反應(yīng)和炎性疼痛相關(guān)反應(yīng)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包含抗體Fc區(qū)序列和一個或多個標(biāo)識為以下的序列的融合蛋白SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22和SEQ ID NO79-130?？墒褂美缭趪H專利申請公開WO 00/24782中描述的方法制備這種分子，所述專利申請通過引用結(jié)合到本文中。這種分子可例如在哺乳動物細(xì)胞(例如中國倉鼠卵巢細(xì)胞)或者細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌細(xì)胞)中表達(dá)。
在某些方面，本發(fā)明提供包含重鏈和輕鏈的抗體，優(yōu)選單克隆抗體、最優(yōu)選人抗體和人單克隆抗體，其中重鏈包含SEQ ID NO2、SEQID NO4或SEQ ID NO6表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，重鏈的可變區(qū)包含SEQ ID NO10表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。優(yōu)選重鏈包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列。
在某些方面，本發(fā)明提供包含重鏈和輕鏈的抗體，優(yōu)選人抗體，更優(yōu)選單克隆抗體，最優(yōu)選人單克隆抗體，其中重鏈包含選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE重鏈恒定區(qū)或其任何等位變異的重鏈恒定區(qū)(如在Kabat等，1991，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版號91-3242中所討論，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)，重鏈的可變區(qū)包含SEQ ID NO10表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。優(yōu)選本發(fā)明抗體包含SEQ ID NO4表示的IgG2重鏈恒定區(qū)氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
在某些方面，本發(fā)明提供包含重鏈和輕鏈的抗體，優(yōu)選人抗體，更優(yōu)選單克隆抗體，最優(yōu)選人單克隆抗體，其中輕鏈包含SEQ ID NO8表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO12表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
在某些方面，本發(fā)明抗體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO10表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。在其他方面，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO12表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。在另外的方面，重鏈包含任何SEQ ID NO14、SEQ ID NO18或SEQ IDNO20表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。在還其他方面，輕鏈包含任何SEQ ID NO16、20、24表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
本發(fā)明還提供特異性結(jié)合NGF的抗體，其中重鏈包含的可變區(qū)包含SEQ ID NO10表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，輕鏈包含的可變區(qū)包含SEQ ID NO12表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
本發(fā)明進(jìn)一步提供特異性結(jié)合NGF的分離人抗體，其中所述抗體包含(a)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO79表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO80表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；(b)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO81表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO82表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；(c)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO83表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO84表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；或者(d)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO86表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO87表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
在某些方面，本發(fā)明還提供包含重鏈和輕鏈的抗體，其中重鏈包含重鏈可變區(qū)，且其中重鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO10表示的氨基酸序列有至少75％、優(yōu)選80％、更優(yōu)選至少85％、甚至更優(yōu)選至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、最優(yōu)選約99％一致性的序列，其中輕鏈包含輕鏈可變區(qū)，且其中輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO12表示的氨基酸序列有至少80％、優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、最優(yōu)選約99％一致性的序列，其中所述抗體特異性結(jié)合NGF。
本發(fā)明還提供特異性結(jié)合NGF的抗體，其中重鏈包含SEQ ID NO14表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，輕鏈包含SEQ ID NO16表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
在某些方面，本發(fā)明提供包含重鏈和輕鏈的抗體，其中重鏈包含重鏈可變區(qū)，且其中重鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO14、SEQ ID NO18或SEQ ID NO22表示的氨基酸序列有至少75％、優(yōu)選80％、更優(yōu)選至少85％、甚至更優(yōu)選至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、最優(yōu)選約99％一致性的序列，其中輕鏈包含輕鏈可變區(qū)，且其中輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO16表示的氨基酸序列有至少80％、優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、最優(yōu)選約99％一致性的氨基酸序列，其中所述抗體特異性結(jié)合NGF。
本發(fā)明還提供單鏈抗體、單鏈Fv抗體、F(ab)抗體、F(ab)’抗體和F(ab’)2抗體。
在具體方面，本發(fā)明提供包含SEQ ID NO16表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段的輕鏈。
另外，本發(fā)明提供包含任何SEQ ID NO14、SEQ ID NO18或SEQ ID NO22表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段的重鏈。
本發(fā)明還涉及特異性結(jié)合NGF的分離人抗體，其中所述抗體包含(a)人重鏈構(gòu)架區(qū)、人重鏈CDR1區(qū)、人重鏈CDR2區(qū)和人重鏈CDR3區(qū)；及(b)人輕鏈構(gòu)架區(qū)、人輕鏈CDR1區(qū)、人輕鏈CDR2區(qū)和人輕鏈CDR3區(qū)。在某些方面，人重鏈CDR1區(qū)可以是SEQ ID NO22所示的稱為4D4的單克隆抗體(mAb)的重鏈CDR1區(qū)，人輕鏈CDR1區(qū)可以是SEQ ID NO24所示的mAb 4D4的輕鏈CDR1區(qū)。在其他方面，人重鏈CDR2區(qū)可以是SEQ ID NO18所示的mAb 4D4的重鏈CDR2區(qū)，人輕鏈CDR2區(qū)可以是SEQ ID NO20所示的mAb 4D4的輕鏈CDR2區(qū)。在還其他方面，人重鏈CDR3區(qū)是SEQ ID NO14所示的mAb4D4的重鏈CDR3區(qū)，人輕鏈CDR3區(qū)是SEQ ID NO16所示的mAb4D4的輕鏈CDR3區(qū)。
本發(fā)明還提供特異性結(jié)合神經(jīng)生長因子的分離人抗體，所述分離人抗體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包含的重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO10、SEQ ID NO79、SEQ ID NO81、SEQ ID NO83、SEQ ID NO85或SEQ ID NO87表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
本發(fā)明也提供特異性結(jié)合NGF的分離人抗體，所述分離人抗體包含重鏈和輕鏈，其中輕鏈包含的輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO12、SEQID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84、SEQ ID NO86、SEQ IDNO88、SEQ ID NO89、SEQ ID NO90、SEQ ID NO91或SEQ ID NO131表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
本發(fā)明抗體的特征為拮抗與NGF多肽相關(guān)的至少一種體外和/或體內(nèi)活性的能力。優(yōu)選本發(fā)明提供能與NGF多肽高親和性結(jié)合的分離抗人NGF人抗體，其中所述抗體結(jié)合人NGF多肽并以約50×10-12M或更低的解離常數(shù)(KD)(用KinExA測定)與人NGF多肽解離，或者在體外中和試驗中所述抗體以約1×10-8M或更低的IC50抑制NGF誘導(dǎo)的存活。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供具有以下特征的分離抗人NGF人抗體a)在體外中和試驗中以約1×10-9M或更低的IC50抑制NGF誘導(dǎo)的存活；b)具有包含SEQ ID NO14氨基酸序列的重鏈CDR3；c)具有包含SEQ ID NO16氨基酸序列的輕鏈CDR3。
本發(fā)明還提供以高親和性特異性結(jié)合NGF的分離人抗體或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，其中所述抗體或者片段以約1×10-9或更低的KD與人NGF多肽解離，在標(biāo)準(zhǔn)的體外試驗中以約1×10-8M或更低的IC50中和人NGF生物活性，且其中所述抗體或者片段包含的重鏈可變區(qū)包含a)包含下式氨基酸序列的CDR1區(qū)a1a2a3a4a5其中a1是極性親水性氨基酸殘基；a2是芳族氨基酸殘基；a3是脂族、極性疏水性、芳族氨基酸殘基；a4是中性疏水性或脂族氨基酸殘基；a5是脂族或極性親水性氨基酸殘基；b)包含下式氨基酸序列的CDR2區(qū)b1b2b3b4b5b6b7b8b9b10b11b12b13b14b15b16b17其中b1是脂族、極性疏水性或芳族氨基酸殘基；b2是脂族疏水性氨基酸殘基；b3是極性親水性或芳族氨基酸殘基；b4是極性親水性、疏水性或芳族氨基酸殘基；b5-b9獨立是極性親水性或脂族氨基酸殘基；b10是極性親水性、芳族或脂族氨基酸殘基；b11是芳族或疏水性氨基酸殘基；b12是脂族疏水性或極性親水性氨基酸殘基；b13是脂族、疏水性或極性親水性氨基酸殘基；b14和b16獨立是極性親水性氨基酸殘基；b15是脂族或芳族疏水性氨基酸殘基；b17是脂族酸性氨基酸殘基；c)包含下式氨基酸序列的CDR3區(qū)c1c2c3c4c5c6c7c8c9c10c11c12c13c14c15c16c17其中c1不存在或者是脂族氨基酸殘基；c2不存在或者是極性親水性或芳族疏水性氨基酸殘基；c3和c4獨立是不存在或者極性親水性、芳族疏水性或脂族氨基酸殘基；c5不存在或者是極性親水性、脂族或芳族氨基酸殘基；c6不存在或者是極性親水性或脂族氨基酸殘基；c7是極性親水性或脂族氨基酸殘基；c8是極性親水性、疏水性或芳族氨基酸殘基；c9是極性親水性、脂族或芳族疏水性氨基酸殘基；c10是極性親水性、芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸殘基；c11-c13獨立是極性親水性或芳族疏水性氨基酸殘基；c14是脂族或芳族疏水性氨基酸殘基；c15是極性親水性或中性疏水性氨基酸殘基；c16不存在或者是極性親水性氨基酸殘基；c17是芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸殘基。
在一個方面，a1是極性親水性氨基酸殘基；a2是芳族疏水性氨基酸殘基；a3是脂族疏水性氨基酸殘基；a4是中性疏水性；a5是極性親水性氨基酸殘基；b1是脂族或芳族氨基酸殘基；b2是Ile；b3是極性親水性氨基酸殘基；b4是極性親水性或芳族氨基酸殘基；b5-b9獨立是極性親水性或脂族氨基酸殘基；b10是脂族氨基酸殘基；b11是Tyr；b12是脂族疏水性氨基酸殘基；b13是脂族或極性親水性氨基酸殘基；b14和b16獨立是極性親水性氨基酸殘基；b15是脂族疏水性氨基酸殘基；b17是脂族酸性氨基酸殘基；c1不存在或者是脂族氨基酸殘基；c2不存在或者是極性親水性或芳族疏水性氨基酸殘基；c3和c4獨立是不存在或者極性親水性、芳族疏水性或脂族氨基酸殘基；c5不存在或者是極性親水性氨基酸殘基；c6不存在或者是極性親水性或脂族氨基酸殘基；c7是極性親水性或脂族氨基酸殘基；c8是極性親水性、疏水性或芳族氨基酸殘基；c9是極性親水性、脂族或芳族疏水性氨基酸殘基；c10是極性親水性、芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸殘基；c11-c13獨立是極性親水性或芳族疏水性氨基酸殘基；c14是脂族或芳族疏水性氨基酸殘基；c15是極性親水性或中性疏水性氨基酸殘基；c16不存在或者是極性親水性氨基酸殘基；c17是芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸殘基。
在一個具體方面，a1是Ser、Asp或Thr；a2是Tyr；a3是Ala、Ser、Trp或Gly；a4是Met或Ile；a5是His、Gly或Asn；b1是Tyr、Gly、Ile或Asp；b2是Ile；b3是Ser、Thr、Tyr或Asn；b4是Trp、Arg或Pro；b5是Ser、Asn或Gly；b6是Ser、Arg、Asp或Gly；b7是Ser、His或Gly；b8是Ser、Ile、Asp或Thr；b9是Leu、Ile或Thr；b10是Gly、Lys或Phe；b11是Tyr；b12是Ala或Ser；b13是Asp、Gly或Pro；b14是Ser；b15是Val或Phe；b16是Lys或Gln；b17是Gly；c1不存在或是脂族氨基酸殘基；c2不存在或是Tyr；c3和c4獨立是不存在、Tyr、Asn、Val或Glu；c5是不存在、Ser、Gly或Trp；c6是不存在、Ser、Gly、Gtu或Leu；c7是Gly、Arg或Asp；c8是Trp、Pro、Ser或Thr；c9是His、Gly或Tyr；c10是Val、Tyr或Arg；c11-c13獨立是Ser、Phe、Tyr、Asp或Asn；c14是Phe、Val或Gly；c15是Met或Asp；c16是不存在、Asp或Asn；c17是Tyr或Val。
在另一個具體方面，a1是Ser或Asp；a2是Tyr；a3是Ala或Ser；a4是Met或Ile；a5是His或Asn；b1是Tyr或Gly；b2是Ile；b3是Ser、Thr、Tyr或Asn；b4是Trp、Arg或Pro；b5是Ser或Asn；b6是Ser或Arg；b7是His或Gly；b8是Ile或Thr；b9是Leu、Ile或Thr；b10是Gly或Phe；b11是Tyr；b12是Ala或Ser；b13是Asp或Gly；b14是Ser；b15是Val或Phe；b16是Lys或Gln；b17是Gly；c1不存在或是Gly；c2不存在或是Tyr；c3和c4獨立是不存在、Tyr、Gly或Val；c5不存在或是Ser；c6是Ser或Gly；c7是Gly或Arg；c8是Trp或Pro；c9是His、Gly或Tyr；c10是Val或Tyr；c11-c13獨立是Ser、Tyr、Phe或Asp；c14是Phe或Val；c15是Met或Asp；c16不存在或是Asp；c17是Tyr或Val。
在其他具體方面a)重鏈CDR1具有SEQ ID NO22表示的氨基酸序列，重鏈CDR2具有SEQ ID NO18表示的氨基酸序列，重鏈CDR3具有SEQ IDNO14表示的氨基酸序列；b)重鏈CDR1具有SEQ ID NO92表示的氨基酸序列，重鏈CDR2具有SEQ ID NO93表示的氨基酸序列，重鏈CDR3具有SEQ IDNO94表示的氨基酸序列；c)重鏈CDR1具有SEQ ID NO98表示的氨基酸序列，重鏈CDR2具有SEQ ID NO99表示的氨基酸序列，重鏈CDR3具有SEQ IDNO100表示的氨基酸序列；d)重鏈CDR1具有SEQ ID NO104表示的氨基酸序列，重鏈CDR2具有SEQ ID NO105表示的氨基酸序列，重鏈CDR3具有SEQ ID NO106表示的氨基酸序列；e)重鏈CDR1具有SEQ ID NO110表示的氨基酸序列，重鏈CDR2具有SEQ ID NO111表示的氨基酸序列，重鏈CDR3具有SEQ ID NO112表示的氨基酸序列；f)重鏈CDR1具有SEQ ID NO116表示的氨基酸序列，重鏈CDR2具有SEQ ID NO117表示的氨基酸序列，重鏈CDR3具有SEQ ID NO118表示的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供特異性結(jié)合NGF的分離人抗體或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，其中所述抗體或其片段包含的輕鏈可變區(qū)包含a)包含下式氨基酸序列的CDR1區(qū)a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12其中a1是極性親水性氨基酸殘基；a2、a11和a12獨立是脂族或疏水性氨基酸殘基；a3、a5、a7和a8獨立是脂族、極性親水性或疏水性氨基酸殘基；a4是極性親水性氨基酸殘基；a6是脂族或疏水性氨基酸殘基；a9不存在，或是脂族或極性親水性氨基酸殘基；a10是脂族、芳族或疏水性氨基酸殘基；b)包含下式氨基酸序列的CDR2區(qū)b1b2b3b4b5b6b7其中b1是脂族、極性疏水性或疏水性氨基酸殘基；b2是脂族或疏水性氨基酸殘基；b3和b4獨立是極性親水性、脂族或疏水性氨基酸殘基；b5是極性親水性或脂族疏水性氨基酸殘基；b6是極性親水性或脂族疏水性氨基酸殘基；b7是極性親水性氨基酸殘基；c)包含下式氨基酸序列的CDR3區(qū)c1c2c3c4c5c6c7c8c9c10c11c12c13c14c15c16c17其中c1和c2獨立是極性親水性氨基酸殘基；c3是極性親水性、脂族或疏水性氨基酸殘基；c4、c5和c6獨立是脂族、極性親水性或疏水性氨基酸殘基；c7不存在或者是極性親水性或脂族疏水性氨基酸殘基；c8是極性親水性或疏水性氨基酸殘基；c9是極性親水性氨基酸殘基，且其中所述抗體或者片段以約1×10-9或更低的KD與人NGF多肽解離，在標(biāo)準(zhǔn)的體外試驗中以約1×10-8M或更低的IC50中和人NGF生物活性。
在一個方面，a1、a3、a4、a7和a8獨立是極性親水性氨基酸殘基；a2、a6、a11和a12獨立是脂族疏水性氨基酸殘基；a5是極性親水性或脂族氨基酸殘基；a9不存在，或是脂族或極性親水性氨基酸殘基；a10是脂族或芳族氨基酸殘基；b1是脂族、極性疏水性或疏水性氨基酸殘基；b2是脂族疏水性氨基酸殘基；b3、b4和b7獨立是極性親水性氨基酸殘基；b5和b6獨立是極性親水性或脂族疏水性氨基酸殘基；c1和c2獨立是極性親水性氨基酸殘基；c3是極性親水性、脂族或疏水性氨基酸殘基；c4、c5和c6獨立是脂族、極性親水性或疏水性氨基酸殘基；c7不存在或是脂族疏水性氨基酸殘基；c8是疏水性氨基酸殘基；c9是極性親水性氨基酸殘基。
在一個具體方面，a1、a3、a4和a7分別是Arg、Ser、Gln和Ser；a2是Ala；a5是Gly或Ser；a8是Ser或Ile；a9是不存在、Ser或Gly；a10是Ala、Tyr、Trp或Phe；b1是Asp、Gly、Ala或Val；b2和b3分別是ALa和Ser；b4是Ser或Asn；b5是Leu或Arg；b6是Glu、Ala或Gln；b7是Ser或Thr；c1和c2是Gln；c3是Phe、Tyr、Arg或Ala；c4是Asn、Gly或Ser；c5是Ser或Asn；c6是Tyr、Ser、Trp或Phe；c7是不存在、Pro或His；c8是Leu、Trp、Tyr或Arg；c9是Thr。
在另一個具體方面，a1、a2、a3、a4和a7分別是Arg、Ala、Ser、Gln和Ser；a5是Gly或Ser；a8是Ser或Ile；a9是不存在、Ser或Gly；a10是Ala或Tyr；b1是Asp或Gly；b2和b3分別是Ala和Ser；b4是Ser或Asn；b5是Leu或Arg；b6是Glu、Ala或Gln；b7是Ser或Thr；c1和c2是Gln；c3是Phe、Tyr、Arg或Ala；c4是Asn、Gly或Ser；c5是Ser或Asn；c6是Tyr、Ser、Trp或Phe；c7是不存在、Pro或His；c8是Leu、Trp、Tyr或Arg；c9是Thr。
在其他具體方面a)輕鏈CDR1具有SEQ ID NO24表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2有SEQ ID NO20表示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ IDNO16表示的氨基酸序列；b)輕鏈CDR1具有SEQ ID NO95表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO96表示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ IDNO97表示的氨基酸序列；c)輕鏈CDR1具有SEQ ID NO101表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO102表示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ ID NO103表示的氨基酸序列；d)輕鏈CDR1具有SEQ ID NO107表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO108表示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ ID NO109表示的氨基酸序列；e)輕鏈CDR1具有SEQ ID NO113表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO114表示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ ID NO115表示的氨基酸序列；f)輕鏈CDR1具有SEQ ID NO119表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO120表示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ ID NO121表示的氨基酸序列；
g)輕鏈CDR1具有SEQ ID NO122表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO123表示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ ID NO124表示的氨基酸序列；h)輕鏈CDR1具有SEQ ID NO125表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO126表示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ ID NO127表示的氨基酸序列；i)輕鏈CDR1具有SEQ ID NO128表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO129表示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ ID NO130表示的氨基酸序列；j)輕鏈CDR1具有SEQ ID NO132表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO133表示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ ID NO134表示的氨基酸序列。
同時本發(fā)明的一部分是編碼新型抗人NGF人抗體的多核苷酸序列、包含編碼抗人NGF人抗體的多核苷酸序列的載體、用摻入編碼抗人NGF人抗體的多核苷酸的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、包含抗人NGF人抗體的制劑以及制備和使用所述制劑的方法。
本發(fā)明還提供檢測生物樣品中的NGF水平的方法，所述方法包括將樣品與本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段接觸的步驟。本發(fā)明的抗NGF抗體可應(yīng)用于任何已知的分析測定方法，如競爭性結(jié)合測定、直接和間接夾心測定、免疫沉淀測定及酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)(參見Sola，1987，Monoclonal AntibodiesA Manual of Techniques，第147-158頁，CRC Press，Inc.)，以對NGF進(jìn)行檢測和定量。本發(fā)明抗體能以適合于所采用的分析測定方法的親和性結(jié)合NGF。
此外，本發(fā)明提供與NGF產(chǎn)生提高或者與對NGF敏感性提高有關(guān)的疾病的治療方法，所述方法包括將藥學(xué)有效量的包含至少一種本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段的藥物組合物給予有需要個體的步驟。
由某些優(yōu)選實施方案的以下更詳細(xì)描述以及權(quán)利要求書，本發(fā)明具體的優(yōu)選實施方案將變得顯而易見。
附圖簡述

圖1描繪的圖顯示在基于DRG神經(jīng)元的中和生物測定中，從雜交瘤條件培養(yǎng)基純化的4D4單克隆抗體對NGF活性的中和作用。
圖2描繪的圖顯示由人NGF活性刺激的VR1表達(dá)，以及在基于DRG神經(jīng)元的中和生物測定中，從雜交瘤條件培養(yǎng)基純化的抗NGF單克隆抗體(4D4)對NGF活性的中和作用。
圖3描繪的圖顯示在基于DRG神經(jīng)元的中和生物測定中，在滾瓶(R)或在旋動瓶(S)培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)為IgG1或IgG2的瞬時表達(dá)重組抗NGF 4D4單克隆抗體對NGF活性的中和作用。
圖4描繪神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的序列比對。序列上方的編號和二級結(jié)構(gòu)元件指的是成熟人NGF。保守殘基用星號標(biāo)示，具有較低序列同源性的區(qū)域用陰影標(biāo)示。人類NGF是SEQ ID NO135；小鼠NGF是SEQID NO136；BDNF是SEQ ID NO137；NT3是SEQ ID NO138。
圖5顯示14D10(SEQ ID NO98)、6H9(SEQ ID NO104)、7H2(SEQ ID NO110)、4G6(SEQ ID NO116)、14D11(SEQ ID NO92)和4D4(SEQ ID NO22)抗體的抗NGF CDR1重鏈比對和一致性百分率。
圖6顯示14D10(SEQ ID NO99)、6H9(SEQ ID NO105)、7H2(SEQ ID NO111)、4G6(SEQ ID NO117)、14D11(SEQ ID NO93)和4D4(SEQ ID NO18)抗體的抗NGF CDR2重鏈比對和一致性百分率。
圖7顯示14D10(SEQ ID NO100)、6H9(SEQ ID NO106)、7H2(SEQ ID NO112)、4G6(SEQ ID NO118)、14D11(SEQ ID NO94)和4D4(SEQ ID NO14)抗體的抗NGF CDR3重鏈比對和一致性百分率。
圖8顯示14D10(SEQ ID NO95)、6H9(SEQ ID NO107)、7H2(SEQ ID NO113)、4G6a(SEQ ID NO119)、4G6b(SEQ ID NO122)、4G6c(SEQ ID NO125)、4G6d(SEQ ID NO128)、4G6e(SEQ ID NO132)、14D11(SEQ ID NO95)和4D4(SEQ ID NO24)抗體的抗NGFCDR1輕鏈比對和一致性百分率(各圖中的20031028340指4G6a；各圖中的20031028351指4G6b；各圖中的20031071526指4G6c；各圖中的20031028344指4G6d；各圖中的20031000528指4G6e)。
圖9顯示14D10(SEQ ID NO96)、6H9(SEQ ID NO108)、7H2(SEQ ID NO114)、4G6a(SEQ ID NO120)、4G6b(SEQ ID NO123)、4G6c(SEQ ID NO126)、4G6d(SEQ ID NO129)、4G6e(SEQ ID NO133)、14D11(SEQ ID NO96)和4D4(SEQ ID NO20)抗體的抗NGFCDR2輕鏈比對和一致性百分率(各圖中的20031028340指4G6a；各圖中的20031028351指4G6b；各圖中的20031071526指4G6c；各圖中的20031028344指4G6d；各圖中的20031000528指4G6e)。
圖10顯示14D10(SEQ ID NO97)、6H9(SEQ ID NO109)、7H2(SEQ ID NO115)、4G6a(SEQ ID NO121)、4G6b(SEQ ID NO124)、4G6c(SEQ ID NO127)、4G6d(SEQ ID NO130)、4G6e(SEQ ID NO134)、14D11(SEQ ID NO97)和4D4(SEQ ID NO16)抗體的抗NGFCDR3輕鏈比對和一致性百分率(各圖中的20031028340指4G6a；各圖中的20031028351指4G6b；各圖中的20031071526指4G6c；各圖中的20031028344指4G6d；各圖中的20031000528指4G6e)。
圖11顯示14D10(SEQ ID NO82)、6H9(SEQ ID NO84)、7H2(SEQ ID NO86)、4G6a(SEQ ID NO88)、4G6b(SEQ ID NO89)、4G6c(SEQ ID NO90)、4G6d(SEQ ID NO91)、4G6e(SEQ ID NO131)、14D11(SEQ ID NO80)和4D4(SEQ ID NO12)抗體的抗NGF輕鏈比對和一致性百分率(各圖中的20031028340指4G6a；各圖中的20031028351指4G6b；各圖中的20031071526指4G6c；各圖中的20031028344指4G6d；各圖中的20031000528指4G6e)。
圖12顯示4D4(SEQ ID NO10)、4G6(SEQ ID NO87)、14D10(SEQ ID NO81)、14D11(SEQ ID NO79)、7H2(SEQ ID NO85)和6H9(SEQ ID NO83)抗體的抗NGF重鏈比對和一致性百分率。
某些優(yōu)選實施方案的詳細(xì)描述本文在此使用的章節(jié)標(biāo)題只是出于組織目的，不應(yīng)解釋為對所描述的主題進(jìn)行限制。對于任何目的，本申請中引用的所有參考文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。
定義對于重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如電穿孔法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法)可使用常規(guī)技術(shù)。酶反應(yīng)和純化技術(shù)可按照廠商說明書或者按照本領(lǐng)域常用的方式或者按照本文的描述來進(jìn)行。上述技術(shù)和方法通?？砂凑毡绢I(lǐng)域公知的方法，或者如本說明書中引用和討論的各種一般及更具體的參考文獻(xiàn)所述來進(jìn)行。參見例如Sambrook等，2001，MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，對于任何目的其通過引用結(jié)合到本文中。除非提供了具體的定義，本文描述的涉及分析化學(xué)、合成有機化學(xué)及醫(yī)學(xué)和藥物化學(xué)的術(shù)語及實驗室方法和技術(shù)，是本領(lǐng)域所公知和常用的。同樣，可將常規(guī)技術(shù)用于化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、制劑和傳遞以及患者的治療。
依照本發(fā)明公開內(nèi)容應(yīng)用的以下術(shù)語，除非另有指明，應(yīng)被理解為具有以下含義有關(guān)本發(fā)明抗體的詞組“生物性質(zhì)”、“生物特征”和術(shù)語“活性”在本文中可互換使用，包括但不限于表位親和性和特異性(例如抗人NGF人抗體與人NGF的結(jié)合)、拮抗靶多肽的活性(例如NGF活性)的能力、抗體的體內(nèi)穩(wěn)定性以及抗體的免疫原性性質(zhì)。本領(lǐng)域公認(rèn)的抗體其他可鑒定生物性質(zhì)或者特征包括例如交叉反應(yīng)性(通常也就是與靶多肽的非人類同源物或者與其他蛋白質(zhì)或組織的交叉反應(yīng)性)，以及在哺乳動物細(xì)胞中保持蛋白質(zhì)高表達(dá)水平的能力。上述性質(zhì)或特征可用本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)來觀察或測定，包括但不限于ELISA、競爭性ELISA、表面等離子共振分析、體外和體內(nèi)中和試驗(例如實施例2)以及用不同來源(包括人類、靈長類動物或者任何其他可能需要的來源)的組織切片進(jìn)行的免疫組織化學(xué)分析。抗人NGF人抗體的具體活性和生物性質(zhì)在下文實施例中有更詳細(xì)的描述。
本文所用的術(shù)語“分離多核苷酸”應(yīng)當(dāng)指基因組、cDNA的多核苷酸，或者合成起源的多核苷酸，或者它們的某些組合，由于其來源，分離多核苷酸(1)與其中天然發(fā)現(xiàn)該分離多核苷酸的多核苷酸的全部或一部分無關(guān)，(2)與其天然不相連的多核苷酸相連，或者(3)沒有作為更大序列的一部分天然出現(xiàn)。
本文所指的術(shù)語“分離蛋白”意指主題蛋白質(zhì)(1)沒有至少某些其通常發(fā)現(xiàn)與其伴隨的其他蛋白質(zhì)，(2)基本沒有相同來源(例如相同物種)的其他蛋白質(zhì)，(3)由不同物種的細(xì)胞表達(dá)，(4)與至少約50％的與其天然相關(guān)的多核苷酸、脂質(zhì)、碳水化合物或其他物質(zhì)分離，(5)不與該“分離蛋白”天然相連的蛋白質(zhì)部分(通過共價或非共價相互作用)相連，(6)與其天然不相連的多肽(通過共價或非共價相互作用)有效相連，或者(7)在自然界中不出現(xiàn)。這種分離蛋白可由基因組DNA、cDNA、mRNA或合成起源的其他RNA，或者它們的任何組合來編碼。優(yōu)選分離蛋白與見于其所在天然環(huán)境、會干擾其用途(治療、診斷、預(yù)防、研究或者其他用途)的蛋白質(zhì)或多肽或其他污染物基本分開。
“分離”抗體是已被鑒定且已與其所在天然環(huán)境的組分分離和/或從中回收的抗體。抗體天然環(huán)境中的污染成分是會干擾其診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素及其他蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，抗體將被純化(1)至超過Lowry法測定的抗體的95％(重量)，最優(yōu)選超過99％(重量)，(2)至足以獲得至少15個N端或者內(nèi)部氨基酸殘基序列(通過使用旋杯式測序儀)的程度，(3)至均一(通過在還原或非還原條件下使用考馬斯藍(lán)染色或優(yōu)選銀染色進(jìn)行SDS-PAGE)。分離抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)部的原位抗體，因為至少一種抗體的天然環(huán)境的組分不存在。
術(shù)語“多肽”或“蛋白質(zhì)”指具有天然蛋白質(zhì)序列的分子，即由天然細(xì)胞和具體非重組細(xì)胞，或者遺傳工程細(xì)胞或重組細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，包括具有天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列的分子，或者缺失、插入和/或置換天然序列的一個或多個氨基酸的分子。術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”明確包涵抗NGF抗體或缺失、插入和/或置換抗NGF抗體的一個或多個氨基酸的序列。
術(shù)語“多肽片段”指具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或內(nèi)部缺失的多肽。在某些實施方案中，片段至少長為5至約500個氨基酸。可以理解，在某些實施方案中，片段至少長為5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450個氨基酸。特別有用的多肽片段包括功能域，包括結(jié)合域在內(nèi)。在抗NGF抗體的情況中，有用的片段包括但不限于CDR區(qū)、重鏈或輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域、抗體鏈的一部分或者正好是其包括兩個CDR的可變區(qū)等等。
術(shù)語“特異性結(jié)合物”指特異性結(jié)合靶標(biāo)的天然或非天然分子。特異性結(jié)合物的實例包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、核酸、碳水化合物和脂質(zhì)。在某些實施方案中，特異性結(jié)合物是抗體。
術(shù)語“NGF的特異性結(jié)合物”指特異性結(jié)合NGF的任何部分的特異性結(jié)合物。在某些實施方案中，NGF的特異性結(jié)合物是特異性結(jié)合NGF的抗體。
本文所用術(shù)語“免疫功能性免疫球蛋白片段”指含有至少免疫球蛋白重鏈和輕鏈的CDR的多肽片段。本發(fā)明的免疫功能性免疫球蛋白片段能夠結(jié)合抗原。在優(yōu)選的實施方案中，抗原是特異性結(jié)合受體的配體。在這些實施方案中，本發(fā)明的免疫功能性免疫球蛋白片段的結(jié)合防止配體與其受體結(jié)合，阻斷由于配體與受體結(jié)合而產(chǎn)生的生物反應(yīng)。優(yōu)選本發(fā)明免疫功能性免疫球蛋白片段特異性結(jié)合NGF。最優(yōu)選所述片段特異性結(jié)合人NGF。
本文所用的應(yīng)用于某個對象的“天然”指該對象可在自然界中找到。例如，存在于可從自然界來源分離到的生物體(包括病毒)、且未被人們有意修飾的多肽或多核苷酸序列是天然的。
術(shù)語“有效連接”指該術(shù)語所指的組分處于允許它們在合適的條件下執(zhí)行其固有功能的關(guān)系之中。例如，與蛋白質(zhì)編碼序列“有效連接”的控制序列連接到該編碼序列，從而在與控制序列的轉(zhuǎn)錄活性相容的條件下，蛋白質(zhì)編碼序列的表達(dá)得以實現(xiàn)。
本文所用術(shù)語“控制序列”指能夠?qū)崿F(xiàn)它們所連接的編碼序列的表達(dá)、加工或胞內(nèi)定位的多核苷酸序列。這種控制序列的種類可能取決于宿主生物體。在具體實施方案中，原核生物的控制序列可包括啟動子、核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止序列。在其他具體實施方案中，真核生物的控制序列可包括包含一個或多個轉(zhuǎn)錄因子的識別位點的啟動子、轉(zhuǎn)錄增強序列、轉(zhuǎn)錄終止序列和聚腺苷酸化序列。在某些實施方案中，“控制序列”可包括前導(dǎo)序列和/或融合伴侶序列(fusion partnersequence)。
本文所指的術(shù)語“多核苷酸”意指長度為至少10個核苷酸的單鏈或雙鏈核酸聚合物。在某些實施方案中，包含多核苷酸的核苷酸可為核糖核酸或脫氧核糖核酸或任何類型的核苷酸的修飾形式。所述修飾包括如堿基修飾如溴尿苷(bromuridine)、核糖修飾如阿拉伯糖苷和2’，3’-二脫氧核糖及核苷酸間鍵修飾如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯。術(shù)語“多核苷酸”明確包括單鏈和雙鏈形式的DNA。
本文所指術(shù)語“寡核苷酸”包括通過天然和/或非天然寡核苷酸鍵連接在一起的天然的和修飾的核苷酸。寡核苷酸是多核苷酸的子集，包含通常為單鏈且長度為200個核苷酸或更少的成員。在某些實施方案中，寡核苷酸的長度為10-60個核苷酸。在某些實施方案中，寡核苷酸的長度為12、13、14、15、16、17、18、19或20-40個核苷酸。寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈，例如用于構(gòu)建遺傳突變體。本發(fā)明的寡核苷酸對于蛋白質(zhì)編碼序列可以是有義或反義寡核苷酸。
術(shù)語“天然核苷酸”包括脫氧核糖核酸和核糖核酸。術(shù)語“修飾核苷酸”包括帶有修飾或取代糖基等的核苷酸。術(shù)語“寡核苷酸鍵”包括寡核苷酸鍵如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺基磷酸酯、氨基磷酸酯等。參見例如LaPlanche等，1986，Nucl.Acids Res.，149081；Stec等，1984，J.Am.Chem.Soc.，1066077；Stein等，1988，Nucl.Acids Res.，163209；Zon等，1991，Anti-Cancer Drug Design，6539；Zon等，1991，OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUESA PRACTICALAPPROACH，第87-108頁(F.Eckstein編輯)，Oxford University Press，Oxford England；Stec等，美國專利第5,151,510號；Uhlmann和Peyman，1990，Chemical Reviews，90543，對于任何目的這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。寡核苷酸可包括可檢測標(biāo)記，以便能進(jìn)行寡核苷酸或其雜交的檢測。
術(shù)語“載體”包括能夠轉(zhuǎn)運其所連接的另一種核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)粒”，其指另外的DNA節(jié)段可與其連接的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中另外的DNA片段可連接至病毒基因組中。某些載體能夠在引入它們的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點的細(xì)菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如非附加型哺乳動物載體)在被引入到宿主細(xì)胞時可整合到宿主細(xì)胞的基因組中，從而隨著宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)它們有效連接的基因的表達(dá)。這種載體在本文中稱為“重組表達(dá)載體”(或簡稱“表達(dá)載體”)。一般的說，在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體往往以質(zhì)粒的形式出現(xiàn)。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。但是，本發(fā)明包括這種其他類型的表達(dá)載體，例如發(fā)揮等同功能的病毒載體(例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
詞組“重組宿主細(xì)胞”(或簡稱“宿主細(xì)胞”)包括重組表達(dá)載體已引入其中的細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，這種術(shù)語不僅指具體對象細(xì)胞，而且指這種細(xì)胞的后代。因為由于變異或環(huán)境影響，在以后的各代中可能出現(xiàn)某些修飾，這種后代實際上可不與母細(xì)胞完全相同，但它們?nèi)园ㄔ诒疚乃艿男g(shù)語“宿主細(xì)胞”的范圍內(nèi)。有很多種宿主表達(dá)系統(tǒng)可用于表達(dá)本發(fā)明抗體，包括細(xì)菌、酵母、桿狀病毒和哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)(以及噬菌體展示表達(dá)系統(tǒng))。合適的細(xì)菌表達(dá)載體的實例是pUC19。為重組表達(dá)抗體，用一種或多種攜有編碼抗體免疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA片段的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，以使輕鏈和重鏈在宿主細(xì)胞中表達(dá)，并優(yōu)選被分泌到培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中，從所述培養(yǎng)基中可回收到抗體。用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法獲得重鏈和輕鏈基因，將這些基因摻入到重組表達(dá)載體中，并將載體引入到宿主細(xì)胞中，例如Sambrook等，2001，MOLECULAR CLONING，ALABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratories，Ausubel，F(xiàn).M.等(編輯)Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates，(1989)及Boss等的美國專利第4,816,397號中所述。
術(shù)語“宿主細(xì)胞”用以指已用或者能夠用核酸序列轉(zhuǎn)化，然后能夠表達(dá)選定的目的基因的細(xì)胞。該術(shù)語包括母細(xì)胞的后代，不論所述后代是否在形態(tài)上或在遺傳結(jié)構(gòu)上與原始親本完全相同，只要選定的基因存在即可。
術(shù)語“轉(zhuǎn)導(dǎo)”用以指基因從一個細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)菌，通常通過噬菌體轉(zhuǎn)移?！稗D(zhuǎn)導(dǎo)”還指通過逆轉(zhuǎn)錄病毒獲得和轉(zhuǎn)移真核細(xì)胞序列。
術(shù)語“轉(zhuǎn)染”用以指細(xì)胞攝入外來或外源DNA，當(dāng)外源DNA已被引入到細(xì)胞膜之內(nèi)時，細(xì)胞即被“轉(zhuǎn)染”。有多種轉(zhuǎn)染技術(shù)為本領(lǐng)域所公知并公開于本文中。參見例如Graham等，1973，Virology52456；Sambrook 等，2001，MOLECULAR CLONING，ALABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratories；Davis等，1986，BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Elsevier；及Chu等，1981，Gene13197。這種技術(shù)可用以將一種或多種外源DNA部分引入到合適的宿主細(xì)胞中。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化”在本文中用以指細(xì)胞的遺傳特征的變化，當(dāng)細(xì)胞已被修飾從而包含新的DNA時，細(xì)胞即被轉(zhuǎn)化。例如，在細(xì)胞由其天然狀態(tài)被遺傳修飾的情況中，該細(xì)胞被轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)之后，轉(zhuǎn)化DNA可通過在物理整合到細(xì)胞的染色體中與細(xì)胞的DNA重組，或者可作為不復(fù)制的附加型元件而短暫保持，或者可作為質(zhì)粒而獨立復(fù)制。當(dāng)轉(zhuǎn)化DNA隨著細(xì)胞的分裂而復(fù)制時，認(rèn)為該細(xì)胞已被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
當(dāng)術(shù)語“天然出現(xiàn)的”或“天然的”用于生物材料如核酸分子、多肽、宿主細(xì)胞等等時，指可在自然界中發(fā)現(xiàn)且未被人操控的材料。同樣，本文所用的“非天然出現(xiàn)的”或“非天然的”指未在自然界中發(fā)現(xiàn)的或者已被人結(jié)構(gòu)修飾或合成的材料。
術(shù)語“抗原”指能由選擇性結(jié)合物如抗體結(jié)合的分子或分子部分，所述分子或分子部分另外還能夠用于動物中以產(chǎn)生能夠結(jié)合該抗原表位的抗體?？乖哂幸粋€或多個表位。
本領(lǐng)域所公知的術(shù)語“一致性”指通過比較兩種或更多種多肽分子的序列或者兩種或更多種核酸分子的序列而確定的所述序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，“一致性”也指通過兩個或更多個核苷酸序列鏈之間或者兩個或更多個氨基酸序列鏈之間的配對情況確定的，核酸分子之間或多肽之間(視情況而定)的序列相關(guān)性的程度?！耙恢滦浴睖y定的是兩個或更多個序列中(共有的)較小一個的相同配對百分率，空位比對(如果有)通過特殊的數(shù)學(xué)模型或計算機程序(即“算法”)來處理。
術(shù)語“相似性”在本領(lǐng)域中周以指相關(guān)的概念，但與“一致性”不同的是，“相似性”指的是相關(guān)性的度量，其包括完全相同的配對和保守置換的配對。如果兩個多肽序列具有例如10/20的相同氨基酸，其余的均為非保守置換，則一致性百分率和相似性百分率均為50％。在同一個實例中，如果還有5個位置為保守置換，則一致性百分率仍為50％，但相似性百分率將為75％(15/20)。因此，在存在保守置換的情況下，兩個多肽之間的相似性百分率將高于這兩個多肽之間的一致性百分率。
相關(guān)核酸和多肽的一致性和相似性可通過公知的方法容易地計算出來。這種方法包括但不限于COMPUTATIONAL MOLECULARBIOLOGY，(Lesk，A.M.編輯)，1988，Oxford University Press，NewYork；BIOCOMPUTINGINFORMATICS AND GENOME PROJECTS，(Smith，D.W.編輯)，1993，Academic Press，New York；COMPUTERANALYSIS OF SEQUENCE DATA，Part 1，(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.編輯)，1994，Humana Press，New Jersey；von Heinje，G.，SEQUENCEANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，1987，Academic Press；SEQUENCE ANALYSIS PRIMER，(Gribskov，M.和Devereux，J.編輯)，1991，M.Stockton Press，New York；Carillo等，1988，SIAM J.AppliedMath.，481073；及Durbin等，1998，BIOLOGICAL SEQUENCEANALYSIS，Cambridge University Press中描述的那些方法。
優(yōu)選的一致性測定方法被設(shè)計成在受試序列之間產(chǎn)生最大程度的配對。一致性測定方法在可公開獲得的計算機程序中有描述。優(yōu)選的測定兩個序列之間一致性的計算機程序方法包括但不限于GCG程序包，包括GAP(Devereux等，1984，Nucl.Acid Res.，12387；GeneticsComputer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)，BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.，215403-410)。BLASTX程序可從美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)和其他來源公開獲得(BLAST手冊，Altschul等 NCB/NLM/NIH Bethesda，MD 20894；Atschul等，1990，出處同上)。也可用著名的Smith Waterman算法測定一致性。
某些用以比對兩個氨基酸序列的比對方案可能導(dǎo)致兩個序列中只有較短一段區(qū)域配對，而這個較小的比對區(qū)域可具有非常高的序列一致性，盡管兩個全長序列之間并沒有顯著的關(guān)系。因此，在某些實施方案中，選定的比對方法(GAP程序)將導(dǎo)致跨越靶多肽的至少50個連續(xù)氨基酸的比對。
例如，使用GAP計算機算法(Genetics Computer Group，Universityof Wisconsin，Madison，WI)，比對兩個待測定序列一致性百分率的多肽，以對它們各自的氨基酸進(jìn)行最佳配對。(“配對范圍”，由算法確定)。在某些實施方案中，空位開放罰分(將計算為3乘以平均對角線；其中“平均對角線”是所用的比較矩陣的對角線的平均值；“對角線”是由具體比較矩陣分配給各個完全氨基酸配對的分?jǐn)?shù)或數(shù)值)和空位拓展罰分(其通常為空位開放罰分的十分之一)，以及比較矩陣如PAM250或BLOSUM 62與算法一起使用。在某些實施方案中，算法中也使用標(biāo)準(zhǔn)的比較矩陣(PAM 250比較矩陣參見Dayhoff等，1978，Atlas of Protein Sequence and Structure，5345-352；BLOSUM 62比較矩陣參見Henikoff等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci USA，8910915-10919)。
在某些實施方案中，用于多肽序列比較的參數(shù)包括以下算法Needleman等，1970，J.Mol.Biol.，48443-453；比較矩陣Henikoff等，1992(出處同上)的BLOSUM 62；空位罰分12空位長度罰分4相似性閾值0GAP程序可使用以上參數(shù)。在某些實施方案中，上述參數(shù)是使用GAP算法進(jìn)行多肽比較的默認(rèn)參數(shù)(末端空位無罰分)。
術(shù)語“同源性”指蛋白質(zhì)或核酸序列之間的相似性程度。同源信息用于理解某些蛋白質(zhì)或核酸種類的遺傳相關(guān)性?？赏ㄟ^比對和比較序列來確定同源性。通常，為確定氨基酸同源性，將蛋白質(zhì)序列與已知蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。同源序列在其序列上的某處享有共同的功能一致性。盡管較低程度的相似性或一致性并不一定表示缺乏同源性，但較高程度的相似性或一致性通常表示有同源性。
有幾種方法可用來比較一個序列的氨基酸與另一個序列的氨基酸，以確定同源性。通常，這些方法分為以下兩類(1)比較物理特征如極性、電荷和范德華體積，以產(chǎn)生相似性矩陣；(2)基于對來自已知同源蛋白質(zhì)的許多蛋白質(zhì)序列的觀察，比較序列中的氨基酸被任何其他氨基酸的可能置換，以產(chǎn)生可接受點突變矩陣(PAM)。
也可使用作為Vector NTI suite 9.0.0軟件包模塊的程序needle(EMBOSS包)或stretcher(EMBOSS程序包)或程序align X，采用默認(rèn)參數(shù)(例如，空位罰分5，空位開放罰分15，空位拓展罰分6.6)，計算一致性百分率。
本文所用的二十個常見氨基酸及其縮寫遵循常規(guī)用法。參見IMMUNOLOGY-A SYNTHESIS，第2版，(E.S.Golub和D.R.Gren，編輯)，Sinauer AssociatesSunderland，MA，1991，對于任何目的其通過引用結(jié)合到本文中。二十個常見氨基酸的立體異構(gòu)體(例如D-氨基酸)；非天然氨基酸如α-，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸及其他非常見氨基酸也可以作為本發(fā)明多肽的合適組分。非常見氨基酸的實例包括4-羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基賴氨酸、ε-N-乙酰賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥賴氨酸、α-N-甲基精氨酸及其他類似的氨基酸和亞氨基酸(例如4-羥脯氨酸)。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)用法和慣例，在本文所用的多肽符號中，左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。
根據(jù)共同的側(cè)鏈性質(zhì)，可將天然殘基分類如下1)疏水性殘基正亮氨酸(Nor)，Met，Met，Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Trp，Tyr，Pro；2)極性親水性殘基Arg，Asn，Asp，Gln，Glu，His，Lys，Ser，Thr；3)脂族殘基Ala，Gly，Ile，Leu，Val，Pro；4)脂族疏水性殘基Ala，Ile，Leu，Val，Pro；5)中性親水性殘基Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；6)酸性殘基Asp，Glu；7)堿性殘基His，Lys，Arg；8)影響鏈的方向的殘基Gly，Pro；9)芳族殘基His，Trp，Tyr，Phe；10)芳族疏水性殘基Phe，Trp，Tyr。
保守氨基酸置換可能涉及這些類別中的某一類別的成員與同一類別的另一成員互換。保守氨基酸置換可包括非天然氨基酸殘基，其通常通過化學(xué)肽合成而不是在生物體系中合成而摻入。這些包括肽模擬物和氨基酸部分的其它顛倒或反向形式。
非保守置換可包括這些類別中的某一類別的成員與另一類別的成員互換。這種置換殘基可被引入到人抗體中與非人抗體同源的區(qū)域，或者被引入到分子中的非同源區(qū)域。
根據(jù)某些實施方案，在造成這種變化時，可考慮氨基酸的親水性指數(shù)。根據(jù)每種氨基酸的疏水性和電荷特征，給予其親水性指數(shù)。它們?yōu)楫惲涟彼?+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；及精氨酸(-4.5)。
親水性氨基酸指數(shù)在賦予蛋白質(zhì)活性生物功能方面的重要性為本領(lǐng)域所認(rèn)識(參見例如Kyte等，1982，J.Mol.Biol.157105-131)。已知可用某些氨基酸置換具有類似親水性指數(shù)或分?jǐn)?shù)的其他氨基酸，且仍保持類似的生物活性。在根據(jù)親水性指數(shù)造成這種變化時，在某些實施方案中，包括其親水性指數(shù)在±2之內(nèi)的氨基酸置換。在某些實施方案中，包括其親水性指數(shù)在±1之內(nèi)的氨基酸置換，還在某些實施方案中，包括其親水性指數(shù)在±0.5之內(nèi)的氨基酸置換。
本領(lǐng)域還認(rèn)識到，如本文所公開的，可根據(jù)親水性有效地造成相似氨基酸的置換，特別是在所創(chuàng)建的生物功能性蛋白質(zhì)或肽意在用于免疫學(xué)實施方案中的情況下。在某些實施方案中，由其鄰近氨基酸的親水性所決定的蛋白質(zhì)最大局部平均親水性與其免疫原性和抗原性相關(guān)，即與該蛋白質(zhì)的生物性質(zhì)相關(guān)。
已給這些氨基酸殘基分配以下親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；早硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在根據(jù)類似的親水性值造成變化時，在某些實施方案中，包括其親水性指數(shù)在±2之內(nèi)的氨基酸置換，在某些實施方案中，包括其親水性指數(shù)在±1之內(nèi)的氨基酸置換，還在某些實施方案中，包括其親水性指數(shù)在±0.5之內(nèi)的氨基酸置換。還可根據(jù)親水性從一級氨基酸序列鑒別表位。這些區(qū)域也稱為“表位核心區(qū)”。
示例性的氨基酸置換在表1中顯示。
表1氨基酸置換
技術(shù)人員使用公知的技術(shù)，將能夠確定本文表示的多肽的合適變體。在某些實施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過以認(rèn)為對活性不重要的區(qū)域為目標(biāo)，鑒別可改變而又不破壞活性的合適分子區(qū)域。在其他實施方案中，技術(shù)人員能夠鑒別在類似多肽中保守的殘基和分子部分。在其它實施方案中，甚至對于生物活性或?qū)τ诮Y(jié)構(gòu)具有重要性的區(qū)域也可進(jìn)行保守氨基酸置換，而又不破壞生物活性或者對多肽的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響。
另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可檢閱有關(guān)鑒別類似多肽中對活性或結(jié)構(gòu)重要的殘基的結(jié)構(gòu)-功能研究。根據(jù)這種比較研究，技術(shù)人員能夠預(yù)測出蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的重要性，其對應(yīng)于類似蛋白質(zhì)中對活性或結(jié)構(gòu)重要的氨基酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可為這種預(yù)測重要的氨基酸殘基選擇在化學(xué)上類似的氨基酸置換。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還能夠參照類似多肽中的三維結(jié)構(gòu)，對三維結(jié)構(gòu)和氨基酸序列進(jìn)行分析。根據(jù)這種信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參照抗體的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測其氨基酸殘基的排列。在某些實施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇不對預(yù)測位于蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基造成基團(tuán)變化，因為這種殘基可能參與與其他分子的相互作用。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以產(chǎn)生出在各期望氨基酸殘基處包含單個氨基酸置換的試驗變體。然后可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的活性測定法對變體進(jìn)行篩選?？梢杂眠@種變體來收集有關(guān)合適變體的信息。例如，如果發(fā)現(xiàn)特定氨基酸殘基的變化導(dǎo)致活性破壞、不合乎需要的降低或者不合適的活性，則可以避免帶有這種變化的變體。換句話說，根據(jù)從這種常規(guī)實驗收集到的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定應(yīng)避免單獨或者與其他突變一起出現(xiàn)進(jìn)一步的置換的氨基酸。
有許多科學(xué)出版物已致力于研究二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。參見Moult，1996，Curr.Op.in Biotech.7422-427；Chou等，1974，Biochemistry13222-245；Chou等，1974，Biochemistry113211-222；Chou等，1978，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.4745-148；Chou等，1979，Ann.Rev.Biochem.47251-276；及Chou等，1979，Biophys.J.26367-384。此外，目前也有計算機程序可幫助預(yù)測二級結(jié)構(gòu)。一種預(yù)測二級結(jié)構(gòu)的方法基于同源性建模。例如，序列一致性大于30％或者相似性大于40％的兩種多肽或蛋白質(zhì)通常具有類似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)的近期發(fā)展已使二級結(jié)構(gòu)(包括多肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部的潛在折疊數(shù)目)的預(yù)測性提高。參見Holm等，1999，Nucl.Acid.Res.27244-247。有人提出(Brenner等，1997，Curr.Op.Struct.Biol.7369-376)，在具體多肽或蛋白質(zhì)中，折疊的數(shù)目有限，且一旦解析了結(jié)構(gòu)的臨界數(shù)目，結(jié)構(gòu)預(yù)測將明顯變得更加準(zhǔn)確。
另外的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方法包括“串線算法(threading)”(Jones，1997，Curr.Opin.Struct.Biol.7377-87；Sippl等，1996，Structure415-19)、“序型分析”(Bowie等，1991，Science253164-170；Gribskov等，1990，Meth.Enzym.183146-159；Gribskov等，1987，Proc.Nat.Acad.Sci.844355-4358)和“進(jìn)化連鎖”(參見Holm，1999，出處同上；及Brenner，1997，出處同上)。
在某些實施方案中，抗體變體包括糖基化變體，與親本多肽的氨基酸序列相比，其中的糖基化位點數(shù)目和/或類型已改變。在某些實施方案中，比起天然蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)變體包含的N-連接糖基化位點的數(shù)目更多或更少。N-連接糖基化位點特征為以下序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中標(biāo)記為X的氨基酸殘基可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸殘基。產(chǎn)生這種序列的氨基酸殘基置換為N-連接碳水化合物鏈的添加提供潛在的新位點?；蛘撸撔蛄械闹脫Q將會除去現(xiàn)有的N-連接碳水化合物鏈。還提供了N-連接碳水化合物鏈的重排，其中除去一個或多個N-連接糖基化位點(通常為天然N-連接糖基化位點)，且創(chuàng)建一個或多個新的N-連接位點。另外的優(yōu)選抗體變體包括半胱氨酸變體，比起親本氨基酸序列，其中有一個或多個半胱氨酸殘基缺失或被另一種氨基酸(例如絲氨酸)置換。當(dāng)抗體必須重折疊成生物活性構(gòu)象時(比如在不可溶包涵體分離之后)，半胱氨酸變體可能有用。半胱氨酸變體具有的半胱氨酸殘基通常比天然蛋白質(zhì)要少，且通常為偶數(shù)個，以使由非配對半胱氨酸產(chǎn)生的相互作用最少。
在另外的實施方案中，抗體變體可包括包含修飾Fc片段或修飾重鏈恒定區(qū)的抗體。Fc片段(其表示可結(jié)晶片段)或重鏈恒定區(qū)可通過突變進(jìn)行修飾，以賦予抗體改變的結(jié)合特征。參見例如Burton和Woof，1992，Advances in Immunology511-84；Ravetch和Bolland，2001，Annu.Rev.Immunol.19275-90；Shields等，2001，Journal of Biol.Chem2766591-6604；Telleman和Junghans，2000，Immunology100245-251；Medesau等，1998，Eur.J.Immunol.282092-2100；所有這些文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)。這種突變可包括置換、插入、缺失或它們的任何組合，通常通過按照本文描述的方法，以及按照本領(lǐng)域公知的方法(參見例如Sambrook等，MOLECULAR CLONINGA LABORATORYMANUAL，第3版，2001，Cold Spring Harbor，N.Y.及Berger和Kimmel，METHODS IN ENZYMOLOGY，第152卷，Guide to Molecular CloningTechniques，1987，Academic Press，Inc.，San Diego，CA.，這些文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)，使用一種或多種誘變寡核苷酸進(jìn)行定點誘變來產(chǎn)生。
根據(jù)某些實施方案，氨基酸置換作用為如下(1)降低對蛋白酶解的易感性，(2)降低對氧化作用的易感性，(3)改變使蛋白質(zhì)復(fù)合物形成的結(jié)合親和性，(4)改變結(jié)合親和性和/或(5)賦予或修飾這種多肽其他生理化學(xué)或功能性質(zhì)。根據(jù)某些實施方案，在天然序列中(在某些實施方案中，在形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域以外的多肽部分)，可以造成單個或多個氨基酸置換(在某些實施方案中，保守氨基酸置換)。在優(yōu)選的實施方案中，保守氨基酸置換通常并不實質(zhì)上改變親本序列的結(jié)構(gòu)特征(例如置換氨基酸不應(yīng)傾向于使親本序列中出現(xiàn)的螺旋破裂，或者使表征親本序列的其他類型的二級結(jié)構(gòu)破壞)。本領(lǐng)域公認(rèn)的多肽二級和三級結(jié)構(gòu)的實例描述于PROTEINS，STRUCTURES ANDMOLECULAR PRINCIPLES，(Creighton編輯)，1984，W.H.Freeman和Company，New York；INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE(C.Branden和J.Tooze，編輯)，1991，Garland Publishing，New York，N.Y.；及Thornton等，1991，Nature354105，以上各文獻(xiàn)通過引周結(jié)合到本文中。
肽類似物常作為性質(zhì)與模板肽類似的非肽藥物用于制藥工業(yè)中。這些類型的非肽化合物稱為“肽模擬物”。參見Fauchere，1986，Adv.Drug Res.1529；Veber & Freidinger，1985，TINS第392頁；及Evans等，1987，J.Med.Chem.301229，對于任何目的以上文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。這種化合物通常是借助于計算機分子建模而被開發(fā)出來的。在結(jié)構(gòu)上與治療上有用肽類似的肽模擬物可用以產(chǎn)生類似的治療或預(yù)防效果。一般的說，肽模擬物在結(jié)構(gòu)上與模式多肽(即具有某種生化性質(zhì)或藥物活性的多肽)如人抗體相類似，但具有一個或多個肽鍵通過本領(lǐng)域公知的方法任選由選自以下的鍵替換-CH2-NH-、-CH2-S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(順式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-。用同一類型的D-氨基酸對共有序列的一個或者多個氨基酸進(jìn)行系統(tǒng)性置換(例如D-賴氨酸置換L-賴氨酸)，在某些實施方案中可用以產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽。另外，包含共有序列或基本相同的共有序列變體的約束(constrained)肽可用本領(lǐng)域公知的方法來產(chǎn)生(Rizo & Gierasch，1992，Ann.Rev.Biochem.61387，對于任何目的其通過引用結(jié)合到本文中)；例如，通過添加能夠使肽環(huán)化形成分子內(nèi)二硫橋的內(nèi)部半胱氨酸殘基來產(chǎn)生。
“抗體”或“抗體肽”指完整抗體或者與完整抗體競爭特異性結(jié)合的結(jié)合片段。在某些實施方案中，結(jié)合片段由重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。在另外的實施方案中，結(jié)合片段通過對完整抗體進(jìn)行酶法或化學(xué)法切割來產(chǎn)生。結(jié)合片段包括但不限于F(ab)、F(ab′)、F(ab′)2、Fv和單鏈抗體。
術(shù)語“重鏈”包括具有足夠的可變區(qū)序列以賦予NGF特異性的任何免疫球蛋白多肽。術(shù)語“輕鏈”包括具有足夠的可變區(qū)序列以賦予NGF特異性的任何免疫球蛋白多肽。全長重鏈包括一個可變區(qū)結(jié)構(gòu)域VH及三個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3。VH結(jié)構(gòu)域位于多肽的氨基末端，CH3結(jié)構(gòu)域位于羧基末端。本文所用術(shù)語“重鏈”涵括全長重鏈及其片段。全長輕鏈包括一個可變區(qū)結(jié)構(gòu)域VL和一個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域CL。如同重鏈一樣，輕鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域位于多肽的氨基末端。本文所用術(shù)語“輕鏈”涵括全長輕鏈及其片段。F(ab)片段由一條輕鏈及一條重鏈的CH1和可變區(qū)組成。F(ab)分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。F(ab’)片段含有一條輕鏈和一條重鏈，所述重鏈含有CH1和CH2結(jié)構(gòu)域之間的更多恒定區(qū)，這樣在兩條重鏈之間可形成鏈間二硫鍵，形成F(ab’)2分子。Fv區(qū)包含源自重鏈和輕鏈的可變區(qū)，但缺少恒定區(qū)。單鏈抗體是其中重鏈和輕鏈可變區(qū)已由柔性連接基團(tuán)連接而形成單一多肽鏈的Fv分子，該單一多肽鏈形成抗體結(jié)合區(qū)。在國際專利申請公開WO 88/01649和美國專利第4,946,778號和第5,260,203號中對單鏈抗體有更詳細(xì)的描述。
在某些實施方案中，“多特異性”或“多功能性”抗體之外的二價抗體應(yīng)理解為包含具有相同抗原特異性的結(jié)合位點。
在根據(jù)本發(fā)明評估抗體結(jié)合性和特異性時，當(dāng)過量的抗體減少結(jié)合到受體的配體量達(dá)到至少約20％、40％、60％、80％、85％或更高(尤其使用體外競爭性結(jié)合試驗測定)時，則抗體基本抑制配體吸附至受體。
“中和抗體”是指能夠封閉或?qū)嵸|(zhì)上降低與其結(jié)合的靶抗原的效應(yīng)子功能的抗體分子。因此，“中和”抗NGF抗體能夠封閉或?qū)嵸|(zhì)上降低NGF的效應(yīng)子功能，例如受體結(jié)合和/或細(xì)胞反應(yīng)的引發(fā)。“實質(zhì)上降低”意指降低至少約60％，優(yōu)選至少約70％，更優(yōu)選至少約75％，甚至更優(yōu)選至少約80％，還更優(yōu)選至少約85％，最優(yōu)選至少約90％的靶抗原(例如人NGF)效應(yīng)子功能。
術(shù)語“表位”包括能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白或T細(xì)胞受體的任何決定簇，優(yōu)選多肽決定簇。在某些實施方案中，表位決定簇包括分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)，如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷酰基或磺?；?，而且在某些實施方案中，可具有特異性三維結(jié)構(gòu)特征和/或特異性電荷特征。表位是抗原的可被抗體結(jié)合的區(qū)域。在某些實施方案中，當(dāng)抗體在蛋白質(zhì)和/或大分子的復(fù)合混合物中優(yōu)先識別其靶抗原時，則可以說它特異性結(jié)合抗原。在優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)平衡解離常數(shù)≤10-8M，更優(yōu)選當(dāng)平衡解離常數(shù)≤10-9M，最優(yōu)選當(dāng)平衡解離常數(shù)≤10-10M時，則可以說抗體特異性結(jié)合抗原。
當(dāng)某抗體與參比抗體這兩種抗體識別相同表位或空間重疊表位時，則該抗體結(jié)合與參比抗體“基本上相同的表位”。測定兩種抗體是否結(jié)合相同表位或空間重疊表位的最常用和快速的方法是競爭性試驗，其使用標(biāo)記抗原或標(biāo)記抗體，能以所有數(shù)量的不同形式裝配。通常，將抗原固定化于基質(zhì)上，用放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記測定未標(biāo)記抗體封閉標(biāo)記抗體的結(jié)合的能力。
術(shù)語“作用物”在本文中用以表示化學(xué)化合物、化學(xué)化合物的混合物、生物大分子或從生物材料獲得的提取物。
本文所用術(shù)語“標(biāo)記”或“標(biāo)記的”指將可檢測標(biāo)記的摻入，例如通過摻入放射性標(biāo)記氨基酸或使可被標(biāo)記親和素(例如鏈霉親和素，優(yōu)選包含可檢測的標(biāo)記如熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或者可通過光學(xué)或比色方法檢測的酶活性)檢測到的生物素部分連接到多肽。在某些實施方案中，標(biāo)記還具有治療性。各種標(biāo)記多肽和糖蛋白的方法為本領(lǐng)域所公知，且可方便地用于本文公開的方法中。多肽標(biāo)記的實例包括但不限于以下放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99mTc、111In、125I、131I)、熒光標(biāo)記(例如異硫氰酸熒光素或稱FITC、羅丹明或者磷化鑭系(lanthanide phosphors))、酶標(biāo)記(例如辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、半抗原標(biāo)記如生物素基團(tuán)及由第二報道分子識別的預(yù)定多肽表位(例如亮氨酸拉鏈對序列、第二抗體的結(jié)合位點、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域或表位標(biāo)簽)。在某些實施方案中，標(biāo)記通過各種長度的間隔臂(如(CH2)n，其中n＜約20)連接，以減少潛在的空間位阻。
本文所用術(shù)語“生物樣品”包括但不限于來自生命體或以前的生命體的任何數(shù)量的物質(zhì)。所述生物體包括但不限于人類、小鼠、猴、大鼠、兔和其他動物。所述物質(zhì)包括但不限于血液、血清、尿、細(xì)胞、器官、組織、骨、骨髓、淋巴結(jié)和皮膚。
本文所用術(shù)語“藥物”指當(dāng)將其正確給予患者時，能夠誘導(dǎo)期望的治療效果的化學(xué)化合物或組合物。涉及包含一種或多種本發(fā)明抗體的藥物組合物的措辭“治療有效量”按本發(fā)明應(yīng)理解為意指所述藥物組合物的量，其在受照顧患者中能夠消除對外界刺激的靈敏度閾值的下降，使該靈敏度閾值恢復(fù)到可與健康對象中所觀察到的閾值相比的水平。
“病癥”是可受益于本發(fā)明治療的任何疾病?！安“Y”和“疾病”在本文中可互換使用，包括慢性和急性NGF介導(dǎo)病癥或NGF介導(dǎo)的疾病，包括使哺乳動物傾向于發(fā)生所討論病癥的病理情況。
術(shù)語“NGF介導(dǎo)的疾病”和“NGF介導(dǎo)的病癥”涵括與NGF水平升高或?qū)GF敏感性提高有關(guān)的任何醫(yī)學(xué)疾病或病癥，包括但不限于急性痛、牙痛、外傷導(dǎo)致的疼痛、外科手術(shù)疼痛、截肢或膿腫導(dǎo)致的疼痛、灼痛、脫髓鞘病、三叉神經(jīng)痛、癌癥、慢性酒精中毒、中風(fēng)、丘腦痛綜合征、糖尿病、獲得性免疫缺陷綜合征(“AIDS”)、毒素和化療、一般性頭痛、偏頭痛、叢集性頭痛、混合型血管和非血管綜合征(mixed-vascular or non-vascular syndromes)、緊張性頭痛、一般炎癥、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病、狼瘡、骨關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、過敏性腸綜合征、炎性眼病、炎性或不穩(wěn)定性膀胱功能障礙、牛皮癬、炎性組分造成的皮膚不適、曬傷、心炎、皮炎、肌炎、神經(jīng)炎、膠原血管病、慢性炎性疾病、炎性疼痛及相關(guān)痛覺過敏和異常性疼痛、神經(jīng)性疼痛及相關(guān)痛覺過敏和異常性疼痛、糖尿病性神經(jīng)性疼痛、灼痛、交感神經(jīng)維持的疼痛、傳入神經(jīng)阻滯綜合征、哮喘、上皮組織損傷或功能紊亂、單純皰疹、在呼吸、泌尿生殖、胃腸或者血管區(qū)域的內(nèi)臟活動障礙、創(chuàng)傷、燒傷、過敏性皮膚反應(yīng)、瘙癢、白癜風(fēng)、一般性胃腸機能紊亂、結(jié)腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管舒縮性或過敏性鼻炎或者支氣管病、痛經(jīng)、消化不良、胃食管反流、胰腺炎和內(nèi)臟痛。
本文所用術(shù)語“有效量”和“治療有效量”當(dāng)用以指含一種或多種抗人NGF人抗體的運載體或藥物組合物時，指足以產(chǎn)生期望的效果(即對于用本發(fā)明運載體或抗人NGF人抗體治療的情況，期望的效果是例如炎癥和/或疼痛的減少)或者足以幫助NGF的一種或多種生物活性的水平可觀察下降的數(shù)量或劑量。更具體的說，治療有效量是抗人NGF人抗體的量，其足以抑制用作用物體內(nèi)治療的對象中與所討論的疾病(例如炎癥或疼痛)有關(guān)的一種或多種臨床定義的病理過程達(dá)一段時間。在本發(fā)明中，“有效量”的抗人NGF抗體可以防止、停止、控制或降低對與任何疼痛醫(yī)學(xué)疾病有關(guān)的疼痛的感知。在本發(fā)明方法中，術(shù)語“控制”及其語法變體用以指不需要的事件(例如疼痛)的防止、部分或完全抑制、降低、延遲或減緩。有效量可根據(jù)選定的具體運載體或抗人NGF人抗體而變化，同時取決于與待治療患者有關(guān)的多種因素和情況，以及病癥的嚴(yán)重程度。例如，如果運載體或抗人NGF人抗體體內(nèi)給予，則要考慮的因素有患者的年齡、體重和健康狀況，以及在臨床前動物試驗中獲得的劑量-反應(yīng)曲線及毒性數(shù)據(jù)等等。如果作用物待與細(xì)胞進(jìn)行體外接觸，同樣要設(shè)計多個臨床前體外研究，以評估攝入、半壽期、劑量、毒性等參數(shù)。指定作用物的有效量或治療有效量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
本文所用術(shù)語“神經(jīng)生長因子”和“NGF”定義為所有的哺乳動物種類的天然序列NGF，包括SEQ ID NO30所示的重組人1-120。
本文所用的“基本純凈的”或“基本純化的”意指作為主要種類而存在的化合物或種類(即以摩爾量計，它比組合物中的任何其他單獨的種類都豐富得多)。在某些實施方案中，基本純化的部分是其中某些種類占所有存在的大分子種類的至少約50％(以摩爾量計)的組合物。在某些實施方案中，基本純凈的組合物占組合物中存在的所有大分子種類的比例超過約80％、85％、90％、95％或99％。在某些實施方案中，該種類被純化至基本均一(通過常規(guī)檢測方法不能在組合物中檢測到污染種類)，其中組合物基本由單一大分子種類組成。
術(shù)語“患者”包括人類和動物對象。
“治療”指治療性處理和預(yù)防性或防護(hù)性措施。需要接受治療的對象包括已患有病癥的對象，以及易患上病癥的對象或者須預(yù)防病癥的對象。
除非上下文另有要求，單數(shù)形式的術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)含義，復(fù)數(shù)形式的術(shù)語應(yīng)包括單數(shù)含義。
根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，導(dǎo)向NGF的抗體可用以治療神經(jīng)性和炎性疼痛及NGF介導(dǎo)的疾病，包括但不限于上述疼痛和疾病。
本發(fā)明的一個方面提供針對人NGF產(chǎn)生的和對結(jié)合人NGF具有生物和免疫特異性的完全人單克隆抗體。本發(fā)明另一方面提供核酸，其包含的核苷酸序列編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白分子的氨基酸序列，特別是對應(yīng)于其可變區(qū)的序列。本發(fā)明這個方面的具體實施方案是對應(yīng)于互補決定區(qū)(CDR)的序列，具體的說是本發(fā)明提供的重鏈和輕鏈的CDR1至CDR3。本發(fā)明的又一個方面提供表達(dá)免疫球蛋白分子和抗體、優(yōu)選本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞和細(xì)胞系。本發(fā)明還提供抗體的生物學(xué)上和免疫學(xué)上純化的制劑，所述抗體優(yōu)選是針對人NGF產(chǎn)生的和對結(jié)合人NGF具有生物和免疫特異性的單克隆抗體。
在酵母人工染色體(YAC)中，克隆和重建兆堿基大小的人基因座并將所述基因座引入到小鼠種系的能力，為闡明非常大的或粗略作圖的基因座的功能成分以及產(chǎn)生有用的人類疾病模型提供有利的方法。此外，用人的對應(yīng)等價物置換小鼠基因座這種技術(shù)的應(yīng)用，對發(fā)育過程中人基因產(chǎn)物的表達(dá)和調(diào)節(jié)、其與其他系統(tǒng)的通訊以及其在疾病引發(fā)和發(fā)展中的參與情況提供了獨到深入了解。
這種策略的一種重要的實際應(yīng)用是小鼠體液免疫系統(tǒng)的“人源化”。將人免疫球蛋白(Ig)基因座引入到其中的內(nèi)源Ig基因已失活的小鼠，為研究抗體的程序表達(dá)和裝配的基礎(chǔ)機制以及抗體在B細(xì)胞發(fā)育中的作用提供了機會。此外，這種策略為完全人單克隆抗體(MAb)的生產(chǎn)提供了來源。
術(shù)語“人抗體”包括具有基本對應(yīng)于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。在某些實施方案中，人抗體在非人哺乳動物中生產(chǎn)，包括但不限于嚙齒類動物如小鼠和大鼠，及兔類動物如兔。在某些實施方案中，人抗體在雜交瘤細(xì)胞中生產(chǎn)。在某些實施方案中，人抗體用重組法生產(chǎn)。
涉及抗體的術(shù)語“重組”包括通過重組手段制備、表達(dá)、創(chuàng)建或分離得到的抗體。示例性的實例包括用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體、從重組組合人抗體文庫分離的抗體、從轉(zhuǎn)有人免疫球蛋白基因的動物(例如小鼠)分離的抗體(參見例如Taylor，L.D.等，Nucl.Acids Res.206287-6295，(1992)；或者通過任何涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的手段制備、表達(dá)、創(chuàng)建或分離得到的抗體。這種重組人抗體具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。
相比于非人抗體和嵌合抗體，人抗體用于人類治療時具有至少以下三個優(yōu)點1)由于抗體的效應(yīng)子部分是人效應(yīng)子，它可以更好地與人免疫系統(tǒng)的其他部分發(fā)生相互作用(例如更有效地通過依賴補體的細(xì)胞毒性(CDC)或依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)破壞靶細(xì)胞)；2)人免疫系統(tǒng)不會將人抗體識別為外源抗體，因此對這種注射抗體的抗體反應(yīng)比對完全外源的非人抗體或部分外源的嵌合抗體要輕；3)據(jù)報道，注射的非人抗體在人體循環(huán)中的半壽期比人抗體的半壽期要短得多。注射人抗體的半壽期與天然人抗體的半壽期基本相同，使得可以給予更少的劑量和更少的次數(shù)。
因此，預(yù)期完全人抗體能使小鼠MAb或者小鼠衍生化MAb固有的免疫原性反應(yīng)和變應(yīng)性反應(yīng)減至最少，從而提高所給予抗體的效力和安全性。因此，本發(fā)明的完全人抗體可用于治療慢性和復(fù)發(fā)性疼痛，所述疼痛的治療需要反復(fù)給予抗體。因此，本發(fā)明抗NGF抗體的一個特別優(yōu)點在于抗體是完全人抗體，可以非劇烈(non-acute)方式給予患者，同時又使通常伴隨人抗小鼠抗體或其他前述來自非人物種的非完全人抗體的不利反應(yīng)減至最少。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠用大的人Ig基因座片段工程改造小鼠抗體生產(chǎn)缺陷的小鼠品系，使該小鼠不產(chǎn)生小鼠抗體而產(chǎn)生人抗體。大的人Ig片段可保持較大的可變基因多樣性以及抗體生產(chǎn)和表達(dá)的正確調(diào)節(jié)。通過充分利用抗體多樣化和選擇的小鼠細(xì)胞機制和對人蛋白質(zhì)的免疫耐受性的缺乏，這些小鼠品系中再現(xiàn)的人抗體免疫細(xì)胞庫產(chǎn)生對任何目的抗原(包括人抗原)具有高度親和性的抗體。用雜交瘤技術(shù)可生產(chǎn)和選擇出具有期望特異性的抗原特異性人MAb。
可以利用在免疫時能夠不產(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白而產(chǎn)生人抗體的完整免疫細(xì)胞庫的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這種種系突變體小鼠中，將導(dǎo)致在抗原攻擊時產(chǎn)生人抗體(參見例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551-2555，(1993)；Jakobovits等，Nature，362255-258，(1993；Bruggemann等，Yearin Immun.，733(1993)；Nature 1481547-1553(1994)，NatureBiotechnology 14826(1996)；Gross，J.A.等，Nature，404995-999(2000)；及美國專利第5,877,397號、第5,874,299號、第5,814,318號、第5,789,650號、第5,770,429號、第5,661,016號、第5,633,425號、第5,625,126號、第5,569,825號和第5,545,806號(對于任何目的以上各文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中))。人抗體也可在噬菌體展示文庫中生產(chǎn)(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227381(1992)；Marks等，J.Mol.Biol.，222581(1991))。Cole等和Boerner等的技術(shù)也可用來制備人單克隆抗體(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therap，Alan R.Liss，第77頁(1985)及Boerner等，J.Immunol.，147(1)86-95(1991))。
也可使重組人抗體進(jìn)行體外誘變(或者當(dāng)使用轉(zhuǎn)有人Ig序列的動物時，進(jìn)行體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此重組抗體的VH區(qū)和VL區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，其雖然源自與人種系VH序列和VL序列相關(guān)的序列，但可能沒有天然存在于體內(nèi)人抗體種系細(xì)胞庫中。
在某些實施方案中，技術(shù)人員可以將來自人類以外的物種的恒定區(qū)與人可變區(qū)一起用于這種小鼠中，以產(chǎn)生嵌合抗體。
天然抗體的結(jié)構(gòu)天然抗體的結(jié)構(gòu)單元通常包含四聚體。每個這種四聚體通常由完全相同的兩對多肽鏈組成，每對鏈具有一條全長“輕”鏈(分子量通常約為25kDa)和一條全長“重”鏈(分子量通常約為50-75kDa)。每條輕鏈和重鏈的氨基末端部分通常包括含約100-110個或者更多個氨基酸、通常負(fù)責(zé)抗原識別的可變區(qū)。每條鏈的羧基末端通常確定負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能的恒定區(qū)。人輕鏈通常分為κ輕鏈和λ輕鏈。重鏈通常分為μδ、γ、α或ε重鏈，并分別確定抗體的同種型為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有幾個亞類，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM的亞類包括但不限于IgM1和IgM2。IgA類似地可細(xì)分成亞類，包括但不限于IgA1和IgA2。通常在全長輕鏈和重鏈內(nèi)部，可變區(qū)和恒定區(qū)通過含約12個或者更多個氨基酸的“J”區(qū)連接，重鏈同時還包括含約10個或更多個氨基酸的“D”區(qū)。參見例如FUNDAMENTALIMMUNOLOGY，第7章，第2版，(Paul，W.編輯)，1989，Raven Press，N.Y.(對于任何目的其通過引用整體結(jié)合到本文中)。每個輕/重鏈對的可變區(qū)通常形成抗原結(jié)合位點。
可變區(qū)通常展示相同的一般結(jié)構(gòu)，即相對保守的框架區(qū)(FR)與三個高變區(qū)(也稱互補決定區(qū)或CDR)連接。每一對的兩條鏈的CDR通常通過框架區(qū)排列，這使與特定表位的結(jié)合成為可能。輕鏈和重鏈的可變區(qū)從N端到C端通常包含F(xiàn)R1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4結(jié)構(gòu)域。每個結(jié)構(gòu)域的氨基酸排布通常是按照Kabat Sequencesof Proteins of Immunologcal Interest(1987和1991，National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.)或者Chothia & Lesk，1987，J.Mol.Biol.196901-917；Chothia等，1989，Nature342878-883的定義來進(jìn)行的。
雙特異性或雙功能性抗體雙特異性或雙功能性抗體通常是具有兩個不同的重鏈/輕鏈對和兩個不同結(jié)合位點的人工雜交抗體。雙特異性抗體可通過多種方法來生產(chǎn)，包括但不限于雜交瘤的融合或F(ab′)片段的連接。參見例如Songsivilai & Lachmann，1990，Clin.Exp.Immunol.79315-321；Kostelny等，1992，J.Immunol1481547-1553。
抗體的制備本發(fā)明提供結(jié)合人NGF的抗體?？赏ㄟ^用全長NGF或其片段進(jìn)行免疫來生產(chǎn)這些抗體。本發(fā)明抗體可以是多克隆抗體或者單克隆抗體，和/或可以是重組抗體。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明抗體是例如通過免疫能夠產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物而制備的人抗體(參見例如國際專利申請公開WO 93/12227)。
本發(fā)明抗NGF抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的互補決定區(qū)(CDR)可移植到同一物種或另一物種的框架區(qū)(FR)。在某些實施方案中，抗NGF抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的CDR可移植到共有人FR。為創(chuàng)建共有人FR，比對幾個人重鏈或輕鏈氨基酸序列中的FR，以鑒別共有氨基酸序列?？筃GF抗體重鏈或輕鏈的FR可用來自不同的重鏈或輕鏈的FR置換?？筃GF抗體的重鏈和輕鏈的FR中的稀有氨基酸通常不被置換，而其余的FR氨基酸則可被置換。稀有氨基酸是特殊的氨基酸，其通常在FR中不能找到它們的位置。本發(fā)明抗NGF抗體的移植可變區(qū)可與不同于抗NGF抗體恒定區(qū)的恒定區(qū)一起使用?；蛘?，移植可變區(qū)是單鏈Fv抗體的一部分，CDR移植描述于例如美國專利第6,180,370號、第5,693,762號、第5,693,761號、第5,585,089號和第5,530,101，它們對于任何目的通過引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明抗體優(yōu)選用轉(zhuǎn)基因小鼠來制備，所述轉(zhuǎn)基因小鼠的抗體產(chǎn)生細(xì)胞中插入了很大一部分的人抗體產(chǎn)生基因座，且進(jìn)一步被工程改造成在產(chǎn)生內(nèi)源鼠抗體方面出現(xiàn)缺陷。這種小鼠能夠產(chǎn)生人免疫球蛋白分子和抗體，不產(chǎn)生或者產(chǎn)生量大為減少的鼠免疫球蛋白分子和抗體。用以獲得這種結(jié)果的技術(shù)在本說明書中公開的專利、專利申請和參考文獻(xiàn)中有公開。在優(yōu)選的實施方案中，技術(shù)人員可采用如在國際專利申請公開WO 98/24893中公開的方法，所述公開對于任何目的通過引用結(jié)合到本文中。也參見Mendez等，1997，Nature Genetics15146-156，對于任何目的其通過引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明單克隆抗體(mAb)可通過多種技術(shù)生產(chǎn)，包括常規(guī)的單克隆抗體方法，例如Kohler和Milstein的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)(1975，Nature256495)。雖然優(yōu)選體細(xì)胞雜交程序，但原則上也可采用其他生產(chǎn)單克隆抗體的技術(shù)，例如B淋巴細(xì)胞的病毒或者癌基因轉(zhuǎn)化。
優(yōu)選的制備雜交瘤的動物系統(tǒng)是小鼠。已很好地確立在小鼠中生產(chǎn)雜交瘤，且免疫方案和分離免疫脾細(xì)胞以供融合的技術(shù)為本領(lǐng)域所公知。融合伙伴(例如鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合程序也是公知的。
在優(yōu)選的實施方案中，導(dǎo)向NGF的人單克隆抗體可用攜有人免疫系統(tǒng)而不是小鼠免疫系統(tǒng)部分的轉(zhuǎn)基因小鼠來生產(chǎn)。這些轉(zhuǎn)基因小鼠在本文稱為“HuMab”小鼠，含有編碼非重排人(μ和γ)重鏈和κ輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，以及使內(nèi)源μ和κ鏈基因座失活的靶向突變(Lonberg等，1994，Nature368856-859)。因此，小鼠對小鼠IgM或κ的表達(dá)減少，且為響應(yīng)免疫，引入的人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因發(fā)生類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變，以產(chǎn)生高度親和性人IgGк單克隆抗體(Lonberg等，出處同上；Lonberg和Huszar，1995，Intern.Rev.Immunol.1365-93；Harding和Lonberg，1995，Ann.N.Y.Acad.Sci.764536-546)。HuMab小鼠的制備在Taylor等，1992，Nucleic Acids Res.206287-6295；Chen等，1993，International Immunology5647-656；Tuaillon等，1994，J.Immunol.1522912-2920；Lonberg等，1994，Nature368856-859；Lonberg，1994，Handbook of Exp.Pharmacology11349-101；Taylor等，1994，International Immunology6579-591；Lonberg &Huszar，1995，Intern.Rev.Immunol.1365-93；Harding & Lonberg，1995，Ann.N.Y.Acad.Sci764536-546；Fishwild等，1996，Nature Biotechnology14845-851中有詳細(xì)的描述，所有這些文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用整體結(jié)合到本文中。另外參見Lonberg和Kay的美國專利第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,789,650號；第5,877,397號；第5,661,016號；第5,814,318號；第5,874,299號和第5,770,429，以及Surani等的美國專利第5,545,807號；1993年6月24日出版的國際專利申請公開WO 93/1227；1992年12月23日出版的WO 92/22646；及1992年3月19日出版的WO 92/03918，所有這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用整體結(jié)合到本文中?；蛘撸韵聦嵤├忻枋龅腍co7、Hco12和KM轉(zhuǎn)基因小鼠可用來產(chǎn)生人抗NGF抗體。
本發(fā)明提供對生物活性人NGF多肽具有特異性且能中和所述多肽的人單克隆抗體。本發(fā)明還提供抗體重鏈和輕鏈氨基酸序列，所述序列對NGF多肽具有高度特異性，且與NGF多肽結(jié)合時能將其中和。這種高度特異性使得抗人NGF人抗體及具有類似特異性的人單克隆抗體成為NGF相關(guān)疾病的有效免疫療法。
在一個方面，本發(fā)明提供結(jié)合的表位與本文提供的4D4抗體相同或基本相同的分離人抗體。
在一個方面，本發(fā)明提供包含至少SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24和79-130所示的氨基酸序列之一的分離人抗體，所述抗體能以高度親和性結(jié)合NGF多肽表位，且具有拮抗NGF多肽活性的能力。優(yōu)選這些抗體結(jié)合的表位與本文提供的4D4抗體相同或基本相同。
在優(yōu)選的實施方案中，分離人抗體以1×10-9M或更低的解離常數(shù)(KD)結(jié)合NGF多肽，且在體外中和試驗中以1×10-7M或更低的IC50抑制NGF誘導(dǎo)的存活。在更優(yōu)選的實施方案中，分離人抗體以1×10-10M或更低的解離常數(shù)(KD)結(jié)合NGF多肽，且在體外中和試驗中以1×10-8M或更低的IC50抑制NGF誘導(dǎo)的存活。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，分離抗NGF人抗體以1×10-11M或更低的解離常數(shù)(KD)結(jié)合人NGF多肽，且在體外中和試驗中以1×10-9M或更低的IC50抑制NGF誘導(dǎo)的存活。本文提供了符合以上結(jié)合和中和標(biāo)準(zhǔn)的抗人NGF人抗體的實例。
本發(fā)明的最優(yōu)選抗人NGF人抗體在本文中稱為4D4，其具有SEQID NO12和SEQ ID NO10分別所示的VL多肽序列和VH多肽序列。編碼4D4的VL和VH的多核苷酸序列分別如SEQ ID NO11和SEQ ID NO9所示。本發(fā)明抗人NGF人抗體的性質(zhì)在實施例中明確公開。本文顯示的對NGF多肽的高度親和性及拮抗NGF多肽活性的高能力特別值得注意。
如實施例9中的一般描述，抗人NGF人抗體的解離常數(shù)(KD)可通過表面等離子共振進(jìn)行測定。通常，表面等離子共振分析是使用BIAcore系統(tǒng)(Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ)，通過表面等離子共振(SPR)測定配體(固定化于生物傳感器基質(zhì)上的重組NGF多肽)和分析物(溶液中的抗體)之間的實時結(jié)合相互作用。也通過固定化分析物(生物傳感器基質(zhì)上的抗體)和呈遞配體(溶液中的重組V)進(jìn)行表面等離子分析?？谷薔GF人抗體的解離常數(shù)(KD)也可用KinExA方法來測定。在本發(fā)明的某些實施方案中，抗體以大約10-8M-10-12M的KD結(jié)合NGF。本文所用術(shù)語“KD”意指特定抗體-抗原相互作用的解離常數(shù)。對于本發(fā)明的目的，KD如實施例9所述進(jìn)行測定。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明抗體屬IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型。優(yōu)選抗體屬IgG3同種型。更優(yōu)選抗體屬IgG1同種型。最優(yōu)選抗體屬IgG2同種型。在其他實施方案中，本發(fā)明抗體屬IgM、IgA、IgE或IgD同種型。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，抗體包含人κ輕鏈和人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈。包含IgG1或IgG2重鏈恒定區(qū)的本發(fā)明抗體的表達(dá)描述于以下實施例中。在具體實施方案中，抗體的可變區(qū)連接到IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型的恒定區(qū)之外的恒定區(qū)。在某些實施方案中，本發(fā)明抗體已被克隆，以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。
在某些實施方案中，針對抗NGF抗體的重鏈和輕鏈的保守修飾(以及針對編碼核苷酸的相應(yīng)修飾)將產(chǎn)生具有與本文公開的抗NGF抗體類似的功能特征和化學(xué)特征的抗NGF抗體。相反，可通過選擇如下重鏈和輕鏈的氨基酸序列中的置換，實現(xiàn)抗NGF抗體的功能特征和/或化學(xué)特征的實質(zhì)修飾，所述重鏈和輕鏈在保持(a)置換部位的分子骨架結(jié)構(gòu)，例如折疊或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點處的分子電荷或疏水性或者(c)側(cè)鏈的大小這三方面的作用相差很大。
例如，“保守氨基酸置換”可涉及用非天然氨基酸殘基置換天然氨基酸殘基，結(jié)果對置換位置的氨基酸殘基的極性或電荷有極少或沒有影響。此外，如前面對“丙氨酸掃描誘變”所述，多肽中的任何天然殘基也可用丙氨酸置換。
期望的氨基酸置換(無論是保守置換還是非保守置換)可由本領(lǐng)域技術(shù)人員在需要這種置換的時候進(jìn)行確定。在某些實施方案中，氨基酸置換可用來鑒別抗NGF抗體的重要殘基，或者用來提高或降低本文描述的抗NGF抗體的親和性。
眾所周知，氨基酸序列中的微小變化，如缺失、插入或置換一個、少數(shù)或甚至幾個氨基酸可導(dǎo)致出現(xiàn)具有基本相同性質(zhì)的原始蛋白質(zhì)等位形式。因此，除了本文明確描述的抗體之外，其他“基本同源的”抗體也可用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種重組DNA技術(shù)容易地設(shè)計和制備出來。一般的說，可通過多種公知技術(shù)如定點誘變，容易地實現(xiàn)基因的修飾。因此，本發(fā)明設(shè)想具有與本文公開的抗NGF人抗體基本類似特征的“變異的”或“突變的”抗NGF人抗體(參見例如WO00/56772，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。因此，涉及抗NGF人抗體的術(shù)語“變體”或“突變體”意指如下的任何結(jié)合分子(分子X)(i)其中重鏈高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3或者輕鏈的高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3作為整體分別與SEQ ID NO14、18和22或者SEQ IDNO16、20和24所示的高變區(qū)具有至少80％的同源性，優(yōu)選至少90％的同源性，更優(yōu)選至少95％的同源性，(ii)其中所述變體或突變體能夠抑制人NGF的活性，其抑制程度與框架區(qū)完全相同于分子X的參比抗NGF人抗體相同。
一般地，抗NGF人抗體變體的輕鏈和/或重鏈CDR作為整體，將分別與SEQ ID NO14、18和22和/或SEQ ID NOS16、20和24所示的氨基酸序列有至少約80％的氨基酸序列一致性，優(yōu)選至少約85％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約90％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約91％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約92％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約93％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約94％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約95％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約96％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約97％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約98％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約99％的氨基酸序列一致性。
更優(yōu)選地，抗NGF人抗體變體的輕鏈可變區(qū)作為整體，將與SEQID NO12、80、82、84、86、88、89、90或91所示的氨基酸序列有至少約80％的氨基酸序列一致性，還更優(yōu)選至少約81％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約82％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約83％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約84％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約85％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約86％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約87％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約88％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約89％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約90％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約91％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約92％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約93％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約94％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約95％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約96％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約97％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約98％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約99％的氨基酸序列一致性，和/或重鏈可變區(qū)作為整體，將與SEQ ID NO10、81、83、85、或87所示的氨基酸序列有至少約70％的氨基酸序列一致性，優(yōu)選至少約75％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約80％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約81％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約82％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約83％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約84％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約85％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約86％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約87％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約88％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約89％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約90％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約91％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約92％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約93％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約94％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約95％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約96％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約97％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約98％的序列一致性，還更優(yōu)選至少約99％的氨基酸序列一致性。
涉及多核苷酸的“變體”意指與本發(fā)明多核苷酸序列具有至少約75％核酸序列一致性的核酸分子。一般地，多核苷酸的變體與本文公開的新型核酸序列將有至少約75％的核酸序列一致性，更優(yōu)選至少約80％的核酸序列一致性，還更優(yōu)選至少約81％的核酸序列一致性，還更優(yōu)選至少約82％的核酸序列一致性，還更優(yōu)選至少約83％的核酸序列一致性，還更優(yōu)選至少約84％的核酸序列一致性，還更優(yōu)選至少約85％的核酸序列一致性，還更優(yōu)選至少約86％的核酸序列一致性，還更優(yōu)選至少約87％的核酸序列一致性，還更優(yōu)選至少約88％的核酸序列一致性，還更優(yōu)選至少約89％的核酸序列一致性，還更優(yōu)選至少約90％的核酸序列一致性，還更優(yōu)選至少約91％的核酸序列一致性，還更優(yōu)選至少約92％的核酸序列一致性，還更優(yōu)選至少約93％的核酸序列一致性，還更優(yōu)選至少約94％的核酸序列一致性，還更優(yōu)選至少約95％的核酸序列一致性，還更優(yōu)選至少約96％的核酸序列一致性，還更優(yōu)選至少約97％的核酸序列一致性，還更優(yōu)選至少約98％的核酸序列一致性，還更優(yōu)選至少約99％的核酸序列一致性。
在具體實施方案中，本發(fā)明提供與本發(fā)明抗體有一部分一致性的抗體，或者包含的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、CDR1、CDR2或CDR3區(qū)與本文實施例10和圖5-10所示的本發(fā)明重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、CDR1、CDR2或CDR3區(qū)有一部分一致性的抗體。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合神經(jīng)生長因子、包含重鏈和輕鏈的分離人抗體，其中所述重鏈包含的重鏈可變區(qū)包含如下氨基酸序列其與SEQ ID NO10表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或75％的一致性；與SEQID NO81表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、80％、85％或95％的同源性；與SEQ ID NO83表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、80％、85％或95％的一致性；與SEQ ID NO85表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、80％或85％的一致性；與SEQ ID NO87表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、75％或80％的一致性；與SEQ ID NO79表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少56％的一致性。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合神經(jīng)生長因子、包含重鏈和輕鏈的分離人抗體，其中所述輕鏈包含的輕鏈可變區(qū)包含如下氨基酸序列其與SEQ ID NO12表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、75％、80％或90％的一致性；與SEQ ID NO80表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、85％或90％的一致性；與SEQ IDNO88表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、74％、90％或94％的一致性；與SEQ ID NO89表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、80％、85％或87％的一致性；與SEQ ID NO90表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、85％、90％或94％的一致性；與SEQ ID NO91表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、85％、90％、95％或99％的一致性；與SEQ ID NO82表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、80％、90％、95％或96％的一致性；與SEQ ID NO84表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％的一致性；或者與SEQ ID NO86表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％的一致性。
在某些其他實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合神經(jīng)生長因子、包含人重鏈CDR1的分離人抗體，其中所述重鏈CDR1是以下的氨基酸序列，其與SEQ ID NO98、SEQ ID NO105、SEQ ID NO110或SEQ ID NO22表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少40％或60％的一致性。
在其他實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合神經(jīng)生長因子、包含人重鏈CDR2的分離人抗體，其中所述重鏈CDR2是以下的氨基酸序列其與SEQ ID NO99表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、82％或94％的一致性；與SEQ IDNO106表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或76％的一致性；與SEQ ID NO18表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少59％的一致性；與SEQ ID NO117表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％的一致性；與SEQ ID NO111表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、75％或80％的一致性。
在還其他實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合神經(jīng)生長因子、包含人輕鏈CDR1的分離人抗體，其中所述CDR1是以下的氨基酸序列其與SEQ ID NO101表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或80％的一致性；與SEQ ID NO95表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、75％、80％或90％的一致性；與SEQ ID NO119表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少75％、80％或90％的一致性；與SEQ ID NO122表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少75％、80％或90％的一致性；與SEQ ID NO125表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少80％的一致性；與SEQ ID NO24表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少75％、80％或90％的一致性；與SEQ ID NO107表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或80％的一致性；或者與SEQ ID NO113表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或80％的一致性。
在另外的實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合神經(jīng)生長因子、包含人輕鏈CDR2的分離人抗體，其中所述CDR2是以下的氨基酸序列其與SEQ ID NO102表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或85％的一致性；與SEQ ID NO96表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％的一致性；與SEQ ID NO120表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％的一致性；與SEQ IDNO123表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％的一致性；與SEQ ID NO126表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或85％的一致性；與SEQ ID NO129表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或85％的一致性；與SEQ ID NO20表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％的一致性；與SEQ ID NO108表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或85％的一致性；與SEQ ID NO133表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％的一致性；或者與SEQ ID NO114表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或85％的一致性。
在其他實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合神經(jīng)生長因子、包含人輕鏈CDR3的分離人抗體，其中所述CDR3是以下的氨基酸序列其與SEQ ID NO103表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或85％的一致性；與SEQ ID NO97表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或85％的一致性；與SEQ ID NO121表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或78％的一致性；與SEQ ID NO127表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或78％的一致性；與SEQ ID NO130表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或78％的一致性；與SEQ ID NO16表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或78％的一致性；與SEQ ID NO109表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或85％的一致性；與SEQ ID NO134表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少78％的一致性；或者與SEQ ID NO115表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少85％的一致性。
4D4抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的序列分別在SEQ ID NO10和12中顯示。但是，許多潛在的CDR-接觸殘基易被其他氨基酸置換，且仍讓抗體保持對抗原相當(dāng)?shù)挠H和性。同樣，許多不與重鏈和輕鏈中的CDR接觸的框架殘基能容納相應(yīng)位置的氨基酸被來自其他人抗體的人共有氨基酸或來自其他小鼠抗體的氨基酸置換，又不對人抗體的親和性或非免疫原性造成顯著的損失?？梢赃x擇各種另外的氨基酸，以產(chǎn)生各種形式的本文所公開抗NGF抗體及其片段，其具有親和性、特異性、非免疫原性、制備容易性和其他需要性質(zhì)的可變組合。
在另外的實施方案中，本發(fā)明抗體可在雜交瘤細(xì)胞系之外的細(xì)胞系中表達(dá)。在這些實施方案中，編碼特定抗體的序列可用來轉(zhuǎn)化合適的哺乳動物宿主細(xì)胞。根據(jù)這些實施方案，轉(zhuǎn)化可用任何已知的用以將多核苷酸引入到宿主細(xì)胞中的方法來實現(xiàn)，包括例如將多核苷酸包裝在病毒中(或包裝到病毒載體中)并用病毒(或載體)轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，或者通過本領(lǐng)域公知的轉(zhuǎn)染方法來實現(xiàn)，如美國專利第4,399,216號、第4,912,040號、第4,740,461號和第4,959,455號(所有這些專利對于任何目的通過引用結(jié)合到本文中)所例示的轉(zhuǎn)染方法。通常，所用的轉(zhuǎn)化方法可取決于待轉(zhuǎn)化的宿主。用以將異源多核苷酸引入到哺乳動物細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、polybrene介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔法、多核苷酸包入脂質(zhì)體中及DNA直接顯微注射到細(xì)胞核中。
用標(biāo)準(zhǔn)的連接技術(shù)，將本發(fā)明NGF抗體的重鏈恒定區(qū)、重鏈可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)或輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的編碼核酸分子插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。在優(yōu)選的實施方案中，將抗NGF抗體重鏈恒定區(qū)或輕鏈恒定區(qū)附加到適當(dāng)?shù)目勺儏^(qū)的C端，并連接到表達(dá)載體中。通常對載體進(jìn)行選擇，使其在所采用的特定宿主細(xì)胞中具有功能(即載體與宿主機制相容，使得基因的擴(kuò)增和/或基因的表達(dá)能夠發(fā)生)。有關(guān)表達(dá)載體的綜述參見METH.ENZ.185(Goeddel編輯)，1990，AcademicPress。
通常，用于任何宿主細(xì)胞的表達(dá)載體會含有用于維持質(zhì)粒和克隆和表達(dá)外源核苷酸序列的序列。這種序列在某些實施方案中合稱為“側(cè)翼序列”，通常包括一種或多種以下核苷酸序列啟動子、一種或多種增強子序列、復(fù)制起點、轉(zhuǎn)錄終止序列、含有供體和接納體剪接位點的完全內(nèi)含子序列、編碼多肽分泌前導(dǎo)序列的序列、核糖體結(jié)合位點、聚腺苷酸化序列、用以插入編碼待表達(dá)多肽的核酸的多接頭區(qū)、及選擇標(biāo)記元件。這些序列的每一個在下文中討論。
任選載體可含有“標(biāo)記”編碼序列，即位于抗NGF抗體多肽編碼序列的5′或3′末端的寡核苷酸分子；該寡核苷酸序列編碼聚組氨酸(如六組氨酸)或者另一種“標(biāo)記”，如FLAG、HA(血凝素流感病毒)或myc(存在針對其的市售抗體)。這種標(biāo)記通常在多肽表達(dá)時融合至多肽，可作為對宿主細(xì)胞中的NGF抗體進(jìn)行親和純化和檢測的手段。可例如使用針對標(biāo)記的抗體作為親和基質(zhì)，通過柱色譜法實現(xiàn)親和純化。任選隨后可通過各種手段，如使用某些用于進(jìn)行切割的肽酶，使標(biāo)記從純化的抗NGF抗體多肽除去。
側(cè)翼序列可以是同源的(即來自與宿主細(xì)胞相同的物種和/或株系)、異源的(即來自宿主細(xì)胞物種或株系之外的物種)、雜交的(即來自不止一種來源的側(cè)翼序列的組合)、合成的或者天然的。這樣，側(cè)翼序列的來源可以是任何原核或真核生物體、任何脊椎動物或無脊椎動物生物體、或任何植物，條件是側(cè)翼序列在宿主細(xì)胞機制中具有功能，且能夠被宿主細(xì)胞機制激活。
用于本發(fā)明載體的側(cè)翼序列可通過任何本領(lǐng)域公知的幾種方法來獲得。通常，用于本文的側(cè)翼序列先前已經(jīng)通過作圖和/或限制性內(nèi)切核酸酶酶切消化鑒定，并因此可用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶從合適的組織來源分離出來。在某些情況下，側(cè)翼序列的完全核苷酸序列可能是已知的。在這一點上，可用本文描述的核酸合成或克隆方法合成側(cè)翼序列。
不管側(cè)翼序列的全部或者僅有一部分是已知的，其都可以通過用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來獲得，和/或通過用合適的探針，如來自同一種或另一種物種的寡核苷酸和/或側(cè)翼序列片段，篩選基因組文庫來獲得。在側(cè)翼序列未知的情況下，含有側(cè)翼序列的DNA片段可從可能含有例如編碼序列或者甚至另一種或幾種基因的更大一段DNA分離出來。可如下實現(xiàn)分離通過限制性內(nèi)切核酸酶酶切消化產(chǎn)生合適的DNA片段，然后用瓊脂糖凝膠純化法、Qiagen柱色譜(Chatsworth，CA)或技術(shù)人員公知的其他方法進(jìn)行分離。為實現(xiàn)這個目的而選擇合適的酶對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
復(fù)制起點通常是可從市場購得的原核表達(dá)載體的一部分，該起點協(xié)助載體在宿主細(xì)胞中的擴(kuò)增。如果所選擇的載體不含有復(fù)制起點位點，則可以根據(jù)已知的序列通過化學(xué)法合成一個位點，并將其連接到載體中。例如，質(zhì)粒pBR322(New England Biolabs，Beverly，MA)的復(fù)制起點適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，各種病毒起點(例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒(VSV)或乳頭瘤病毒HPV或BPV的起點)可用于在哺乳動物細(xì)胞中克隆載體。通常，復(fù)制起點組分對于哺乳動物表達(dá)載體來說不是必要的(例如，SV40起點經(jīng)常只是因為它還含有病毒早期啟動子才被使用)。
轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于多肽編碼區(qū)末端的3′，用以終止轉(zhuǎn)錄。通常，原核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄終止序列是富含G-C的片段，緊接著poly-T序列。雖然該序列可容易地從文庫中克隆出來，或者甚至作為載體的一部分而從市場購得，還也可用本文描述的核酸合成方法容易地合成出來。
選擇標(biāo)記基因編碼對于生長于選擇性培養(yǎng)基的宿主細(xì)胞的存活和生產(chǎn)所必需的蛋白質(zhì)。典型的選擇標(biāo)記基因編碼具有如下作用的蛋白質(zhì)(a)賦予原核宿主細(xì)胞對抗生素或其他毒素(例如氨芐青霉素、四環(huán)素或卡那霉素)的抗性；(b)補充細(xì)胞的營養(yǎng)缺陷；或(c)供應(yīng)不能從合成培養(yǎng)基或確定成分培養(yǎng)基獲得的關(guān)鍵性營養(yǎng)物。優(yōu)選的選擇標(biāo)記是卡那霉素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因及四環(huán)素抗性基因。新霉素抗性基因也可有利地用于原核和真核宿主細(xì)胞的選擇。
可用其他選擇基因來擴(kuò)增待表達(dá)的基因。擴(kuò)增是這樣的過程，其中生產(chǎn)對細(xì)胞生長或存活具有關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)所需要的基因在重組細(xì)胞的連續(xù)世代的染色體中串連重復(fù)。合適的哺乳動物選擇標(biāo)記的實例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因和無啟動子胸苷激酶基因。使哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)化子處于選擇壓力中，其中只有轉(zhuǎn)化子才能依靠載體中存在的選擇性基因唯一生存。通過在將培養(yǎng)基中選擇因子的濃度逐次提高的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，來施加選擇壓力，從而導(dǎo)致選擇性基因和編碼另一種基因產(chǎn)物(如結(jié)合NGF多肽的抗體)的DNA同時擴(kuò)增。結(jié)果，從擴(kuò)增DNA合成出的多肽如抗NGF抗體的量增加。
核糖體結(jié)合位點通常是mRNA的翻譯起始所必需的，其特征為Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。該位點元件通常位于啟動子的3′，位于待表達(dá)多肽的編碼序列的5′。
在某些情況下，如需要在真核宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中糖基化的情況下，可以對各種前序列進(jìn)行操作，以增進(jìn)糖基化作用或提高產(chǎn)量。例如，可以改變具體信號肽的肽酶切割位點，或添加前序列，這也可以影響糖基化作用。最終蛋白質(zhì)產(chǎn)物在-1位置(相對于成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸)可能具有一個或多個隨表達(dá)產(chǎn)生的、尚未完全被除去的另外氨基酸。例如，最終蛋白質(zhì)產(chǎn)物可具有一個或多個在肽酶切割位點發(fā)現(xiàn)的連接到氨基末端的氨基酸殘基。或者，使用某些酶切割位點時，如果酶在成熟多肽內(nèi)的這種區(qū)域進(jìn)行切割，會導(dǎo)致出現(xiàn)所需多肽的略微截短形式。
本發(fā)明的表達(dá)和克隆載體通常會含有被宿主生物體識別，且有效連接到編碼抗NGF抗體的分子的啟動子。啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因的起始密碼子的上游(即5′)的非轉(zhuǎn)錄序列(通常在約100至1000bp之內(nèi))，其控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。啟動子通常可歸入以下兩類之一誘導(dǎo)型啟動子和組成型啟動子。誘導(dǎo)型啟動子響應(yīng)培養(yǎng)條件中的某種變化(如營養(yǎng)物的存在或缺乏或者溫度的變化)，引發(fā)其控制下的DNA轉(zhuǎn)錄水平提高。另一方面，組成型啟動子均勻地轉(zhuǎn)錄它們所有效連接的基因，也就是說，對基因表達(dá)的控制極少或者沒有。已知有許多可被各種潛在宿主細(xì)胞識別的啟動子。合適的啟動子如下有效連接到編碼本發(fā)明抗NGF抗體(包含重鏈或輕鏈)的DNA用限制性酶酶切消化將啟動子從源DNA中除去，并將期望的啟動子序列插入到載體中。
供與酵母宿主一起使用的合適啟動子也是本領(lǐng)域公知的。酵母增強子可有利地與酵母啟動子一起使用。供與哺乳動物宿主細(xì)胞一起使用的合適啟動子是公知的，包括但不限于從病毒如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒和最優(yōu)選猴病毒40(SV40)的基因組獲得的啟動子。其他合適的哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子，例如熱休克啟動子和肌動蛋白啟動子。
可能具有重要性的另外啟動子包括但不限于SV40早期啟動子(Bernoist和Chambon，1981，Nature290304-10)；CMV啟動子(Thomsen等，1984，Proc.Natl.Acad.USA81659-663)；Rous肉瘤病毒的3′長末端重復(fù)序列中包含的啟動子(Yamamoto等，1980，Cell22787-97)；皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.781444-45)；金屬硫蛋白基因中的啟動子和調(diào)節(jié)序列(Brinster等，1982，Nature29639-42)；及原核啟動子如β-內(nèi)酰胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，753727-31)；或者tac啟動子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，8021-25)。同樣具有重要性的是顯示組織特異性且已應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物的以下動物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)在胰腺腺泡細(xì)胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(qū)(Swift等，1984，Cell38639-46；Ornitz等，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50399-409(1986)；MacDonald，1987，Hepatology7425-515)；在胰腺β細(xì)胞中有活性的胰島素基因控制區(qū)(Hanahan，1985，Nature315115-22)；在淋巴樣細(xì)胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)(Grosschedl等，1984，Cell38647-58；Adames等，1985，Nature318533-38；Alexander等，1987，Mol.Cell.Biol.，71436-44)；在睪丸細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞和肥大細(xì)胞中有活性的小鼠乳腺癌病毒控制區(qū)(Leder等，1986，Cell45485-95)；在肝臟中有活性的清蛋白基因控制區(qū)(Pinkert等，1987，Genes和Devel.1268-76)；在肝臟中有活性的甲胎蛋白基因控制區(qū)(Krumlauf等，1985，Mol.Cell.Biol.，51639-48；Hammer等，1987，Science23553-58)；在肝臟中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(Kelsey等，1987，Genes和Devel.1161-71)；在髓樣細(xì)胞中有活性的β珠蛋白基因控制區(qū)(Mogram等，1985，Nature315338-40；Kollias等，1986，Cell4689-94)；在大腦中少突膠質(zhì)細(xì)胞中有活性的髓鞘堿性蛋白基因控制區(qū)(Readhead等，1987，Cell48703-12)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)(Sani，1985，Nature314283-86)；及在下丘腦中有活性的促性腺素釋放激素基因控制區(qū)(Mason等，1986，Science2341372-78)。
增強子序列可插入到載體中，以增強高等真核生物對編碼本發(fā)明抗NGF抗體(包含輕鏈或重鏈)的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強子是DNA的順式作用元件，長度通常為10-300bp，作用于啟動子以增強轉(zhuǎn)錄作用。增強子相對不依賴于方向和位置，其已被發(fā)現(xiàn)于轉(zhuǎn)錄單位的5′和3′位置。已知有幾種增強子序列可得自哺乳動物基因(例如珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰島素)。但是，通常使用來自病毒的增強子。本領(lǐng)域公知的SV40增強子、巨細(xì)胞早期啟動子增強子、多瘤病毒增強子和腺病毒增強子是用以激活真核啟動子的示例性增強子元件。雖然增強子在載體中可能位于編碼序列的5′和3′，但它通常位于啟動子5′的位點。
可從起始載體如市售載體構(gòu)建本發(fā)明表達(dá)載體。這種載體可含有或不含有所有期望的側(cè)翼序列。在載體中不再存在本文描述的一種或多種側(cè)翼序列的情況下，可以個別地獲得側(cè)翼序列并將它們連接到載體中。用以獲得每一種側(cè)翼序列的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。
在載體已被構(gòu)建出來，且編碼組成抗NGF抗體的輕鏈、重鏈或者輕鏈和重鏈的核酸分子已插入到載體的正確位點之后，可將所完成的載體插入到合適的宿主細(xì)胞中，以進(jìn)行擴(kuò)增和/或多肽表達(dá)。可通過公知的方法將抗NGF抗體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到選定的宿主細(xì)胞中，方法包括轉(zhuǎn)染、感染、磷酸鈣共沉淀、電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或者其他已知的技術(shù)。所選擇的方法經(jīng)常在部分上由待使用的宿主細(xì)胞的類型決定。這些方法和其他合適的方法對技術(shù)人員是公知的，在例如Sambrook等(出處同上)中有闡述。
宿主細(xì)胞當(dāng)在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)時，會合成抗NGF抗體，所述抗體隨后可從培養(yǎng)基中收集(如果宿主細(xì)胞將抗體分泌到培養(yǎng)基中)或者直接從產(chǎn)生抗體的宿主細(xì)胞收集(如果不分泌抗體)。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞的選擇往往取決于各種因素，如期望的表達(dá)水平、活性所要求或所必需的多肽修飾(如糖基化和磷酸化)及折疊成生物活性分子的容易程度。
可用作表達(dá)宿主的哺乳動物細(xì)胞系是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于可獲自美國典型培養(yǎng)物中心(ATCC)的無限增殖化細(xì)胞系，包括但不限于中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如Hep G2)和多種其他細(xì)胞系。在某些實施方案中，可通過確定哪種細(xì)胞系具有高表達(dá)水平且能組成型地產(chǎn)生具有NGF結(jié)合性質(zhì)的抗體，來選擇細(xì)胞系。在另一個實施方案中，可以選擇不會產(chǎn)生自身抗體，但有能力產(chǎn)生和分泌異源抗體的B細(xì)胞譜系的細(xì)胞系。
本發(fā)明抗體可用于檢測生物樣品中的NGF和鑒定能產(chǎn)生NGF蛋白的細(xì)胞或組織。特異性結(jié)合NGF的本發(fā)明抗體可用于NGF介導(dǎo)疾病的治療。所述抗體能用于結(jié)合試驗中，以檢測NGF和抑制NGF與NGF受體形成復(fù)合物。所述結(jié)合NGF和阻斷與其他結(jié)合化合物相互作用的抗體在調(diào)節(jié)NGF介導(dǎo)的疾病方面可能具有治療性用途。在優(yōu)選的實施方案中，抗NGF抗體可阻斷NGF與其受體的結(jié)合，這可能會導(dǎo)致NGF誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)被破壞。
本發(fā)明還涉及一種或多種本發(fā)明抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療患者中由NGF表達(dá)增加或?qū)GF敏感性提高而造成的疼痛病癥或疾病(例如本文公開的任一種病癥或疾病)。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供包含治療有效量的一種或多種本發(fā)明抗體以及藥物可接受稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑的藥物組合物。優(yōu)選可接受的制劑材料在所采用的劑量和濃度下對接受者無毒。在優(yōu)選的實施方案中，提供了包含治療有效量的抗NGF抗體的藥物組合物。
在某些實施方案中，可接受的制劑材料優(yōu)選在所采用的劑量和濃度下對接受者無毒。
在某些實施方案中，藥物組合物可含有用以調(diào)節(jié)、維持或保持例如組合物的pH、摩爾滲透壓濃度、粘度、透明度、顏色、等滲性、氣味、無菌度、穩(wěn)定性、溶解或釋放速率、吸收或穿透速率的制劑材料。在這種實施方案中，合適的制劑材料包括但不限于氨基酸(甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸)；抗微生物劑、抗氧化劑(如抗壞血酸、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉)；緩沖劑(如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)；膨脹劑(如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合劑(如乙二胺四乙酸(EDTA)；絡(luò)合劑(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-環(huán)狀糊精或羥丙基-β-環(huán)狀糊精)；填充劑；單糖；二糖；及其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(zhì)(如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑、矯味劑和稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成鹽反荷離子(如鈉)；防腐劑(如苯扎氯胺、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨醇)；懸浮劑；表面活性劑或濕潤劑(如泊洛沙姆、PEG、脫水山梨糖酯、聚山梨酯如聚山梨酯20、聚山梨酯80、triton、氨丁三醇、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊)；穩(wěn)定性增強劑(如蔗糖或山梨醇)；張力增強劑(如堿金屬鹵化物，優(yōu)選氯化鈉或氯化鉀，甘露糖醇、山梨糖醇)；傳遞介質(zhì)；稀釋劑；賦形劑和/或藥物佐劑。參見REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，(A.R.Gennaro編輯)，1990，Mack Publishing Company。
在某些實施方案中，最佳的藥物組合物往往由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)例如預(yù)定的給藥途徑、傳遞形式和期望的劑量來決定。參見例如REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，出處同上。在某些實施方案中，這種組合物可能影響本發(fā)明抗體的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和體內(nèi)清除速率。
在某些實施方案中，藥物組合物中的主要運載體或載體在性質(zhì)上可以是含水載體或非水載體。例如，合適的運載體或載體可以是注射用水、生理鹽水溶液或人工腦脊液，可能補充有常用于胃腸外給藥組合物的其他材料。中性緩沖鹽水或者混合有血清白蛋白的鹽水是另外的示例性運載體。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明藥物組合物包含pH約7.0-8.5的Tris緩沖液，或者pH約4.0-5.5的乙酸緩沖液，且可進(jìn)一步包含山梨醇、蔗糖、吐溫-20和/或其合適的替代物。在本發(fā)明某些實施方案中，抗NGF抗體組合物可如下制備，以供保存將選定的具有期望純度的組合物與任選的配制物(REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES，出處同上)混合成凍干餅或水溶液的形式。此外，在某些實施方案中，可用適當(dāng)?shù)馁x形劑如蔗糖，將抗NGF抗體產(chǎn)品配制成凍干物。
可以選擇本發(fā)明藥物組合物，以供胃腸外傳遞。另外，也可選擇組合物，以供吸入，或者供通過消化道傳遞，如口服傳遞。這種藥物可接受的組合物的制備在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍之內(nèi)。
制劑成分優(yōu)選以給藥位點可接受的濃度存在。在某些實施方案中，用緩沖劑將組合物維持在生理pH或者稍低的pH，通常在約5至約8的pH范圍。
當(dāng)設(shè)想胃腸外給藥時，用于本發(fā)明的治療性組合物可以無熱源的、胃腸外可接受水溶液的形式提供，其包含期望的抗NGF抗體與藥物可接受的運載體。特別適合的胃腸外注射用運載體是無菌蒸餾水，抗NGF抗體在其中配制成無菌的等滲溶液并被適當(dāng)?shù)乇４?。在某些實施方案中，制劑可能涉及將期望的分子與為產(chǎn)品(其能夠通過長效制劑注射來遞送)提供控釋或緩釋的介質(zhì)一起配制，所述介質(zhì)如可注射微球體、生物可腐蝕顆粒、聚合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、玻珠或脂質(zhì)體。在某些實施方案中，也可使用具有提高在體循環(huán)中持續(xù)時間的作用的透明質(zhì)酸。在某些實施方案中，可使用可植入藥物遞送裝置，以引入期望的抗體分子。
可配制本發(fā)明藥物組合物，以供吸入。在這些實施方案中，抗NGF抗體可方便地配制成可吸入干粉。在優(yōu)選的實施方案中，也可用推進(jìn)劑配制抗NGF抗體吸入溶液，供作氣霧劑傳遞。在某些實施方案中，可將溶液霧化。肺部給藥及其配制方法在國際專利申請PCT/US94/001875(其通過引用結(jié)合到本文中)中有進(jìn)一步的描述，所述專利申請描述了化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的肺部傳遞法。
還設(shè)想制劑可口服給予。以這種方式給予的抗NGF抗體可與常用于調(diào)配固體劑型(如片劑和膠囊劑)的載體一起或不與其一起進(jìn)行配制。在某些實施方案中，可設(shè)計膠囊劑，以在生物利用度最大和體循環(huán)前降解最小的點在胃腸道中釋放出制劑的活性部分。可包括另外的介質(zhì)，以促進(jìn)抗NGF抗體的吸收。也可采用稀釋劑、矯味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、片劑崩解劑和粘合劑。
優(yōu)選所提供的本發(fā)明藥物組合物包含有效量的一種或多種抗NGF抗體，其與適合于制造片劑的無毒賦形劑混合。通過將片劑溶解于無菌水或另一種適當(dāng)?shù)倪\載體中，可將溶液配制成單位劑量形式。合適的賦形劑包括但不限于惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖、或磷酸鈣；或者粘合劑，如淀粉、明膠或阿拉伯膠；或者潤滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。
另外的藥物組合物對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯然的，包括涉及緩釋或控釋傳遞制劑中抗NGF抗體的制劑。用以配制多種其他緩釋或控釋傳遞方式，如脂質(zhì)體載體、生物可腐蝕微?；蚨嗫撞Ｖ楹烷L效注射劑的技術(shù)，對本領(lǐng)域技術(shù)人員也是公知的。參見例如，國際專利申請PCT/US93/00829(其通過引用結(jié)合到本文中)，該專利申請描述了用以遞送藥物組合物的多孔聚合物微粒的控制釋放。緩釋制劑可包括定型制件形式的半透性聚合物基質(zhì)，例如薄膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)包括聚酯、水凝膠、聚交酯(如美國專利第3,773,919號和歐洲專利申請公開EP 058481所公開，各專利通過引用結(jié)合到本文中)、L-谷氨酸和γ-L-谷氨酸乙酯的共聚物(Sidman等，1983，Biopolymers22547-556)、聚(甲基丙烯酸-2-羥乙酯)(Langer等，1981，J.Biomed.Mater.Res.15167-277和Langer，1982，Chem.Tech.1298-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等，出處同上)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(歐洲專利申請公開EP 133,988)。緩釋組合物還可包括能通過任何本領(lǐng)域公知的幾種方法制備的脂質(zhì)體。參見例如Eppstein等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.UNA823688-3692；歐洲專利申請公開EP 036,676；EP 088,046和EP 143,949，這些文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。
用于體內(nèi)給藥的藥物組合物通常作為無菌制劑來提供?？赏ㄟ^濾過無菌過濾膜來實現(xiàn)滅菌。當(dāng)組合物凍干時，可在凍干和再生之前或之后用這種方法進(jìn)行滅菌。供胃腸外給藥的組合物可以凍干形式保藏，或者保藏于溶液中。胃腸外組合物通常裝入具有無菌入口的容器，例如具有可用皮下注射針刺穿的塞子的靜脈溶液袋或小瓶。
一旦配制好藥物組合物，其可以溶液、懸浮液、凝膠、乳濁液、固體的形式，或者作為脫水或凍干粉末保藏于無菌小瓶中。這種制劑可以以現(xiàn)成可用的形式或者以給藥前可再生的形式(例如凍干形式)進(jìn)行保藏。
本發(fā)明還提供用以產(chǎn)生單劑量給藥單位的藥盒。每個本發(fā)明藥盒可裝有含有干燥蛋白質(zhì)的第一容器和含有含水制劑的第二容器。在本發(fā)明的某些實施方案中，提供裝有單室和多室預(yù)灌裝注射器(例如液體注射器和lyosyringe)的藥盒。
待進(jìn)行治療性應(yīng)用的含抗NGF抗體的藥物組合物的有效量取決于例如治療內(nèi)容和目標(biāo)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，用于治療的適當(dāng)劑量水平部分根據(jù)所遞送的分子、抗NGF抗體所應(yīng)用的適應(yīng)癥、給藥途徑以及患者的大小(體重、體表面積或器官大小)和/或狀態(tài)(年齡和總體健康狀況)而變化。在某些實施方案中，臨床醫(yī)生可滴定劑量和修改給藥途徑，以獲得最佳治療效果。取決于上述因素，典型的劑量可在約0.1μg/kg至高達(dá)約30mg/kg或更高的范圍內(nèi)。在優(yōu)選的實施方案中，劑量可在0.1μg/kg至約30mg/kg的范圍內(nèi)；更優(yōu)選在1μg/kg至約30mg/kg的范圍內(nèi)；或者甚至更優(yōu)選在5μg/kg至約30mg/kg的范圍內(nèi)。
給藥頻率往往取決于所用制劑中具體抗NGF抗體的藥物動力學(xué)參數(shù)。通常，臨床醫(yī)生給予組合物，直到達(dá)到能實現(xiàn)期望效果的劑量。因此，組合物可以單劑量給予，或者以兩個或多個劑量(可能含有或不含有相同量的期望分子)隨時間推移來給予，或者通過植入裝置或插管進(jìn)行連續(xù)輸液來給予。適當(dāng)劑量的進(jìn)一步改進(jìn)可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)進(jìn)行，這在他們?nèi)粘?zhí)行的任務(wù)范圍內(nèi)?？赏ㄟ^使用適當(dāng)?shù)膭┝?反應(yīng)數(shù)據(jù)，對適當(dāng)劑量加以確定。在某些實施方案中，本發(fā)明抗體可長時間給予患者。長期給予本發(fā)明抗體能使通常伴隨針對非人動物中人抗原(例如在非人物種中產(chǎn)生的非完全人抗體)產(chǎn)生的抗體的不利免疫或變應(yīng)性反應(yīng)減至最少。
藥物組合物的給藥途徑與已知的方法相一致，例如口服給藥；通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)(實質(zhì)內(nèi))、腦室內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、動脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)(intraportal)或病灶內(nèi)(intralesional)途徑注射給藥；通過緩釋系統(tǒng)或通過植入裝置給藥。在某些實施方案中，可通過大劑量注射或連續(xù)輸液給予組合物，或者通過植入裝置給予組合物。
也可通過植入已吸收有或包入了期望分子的薄膜、海綿或其它適當(dāng)材料，局部給予組合物。在使用植入裝置的某些實施方案中，植入裝置可植入到任何合適的組織和器官中，期望分子的遞送可通過擴(kuò)散、定時釋放大劑量或連續(xù)給予來進(jìn)行。
還期望在活體外使用本發(fā)明的抗NGF抗體藥物組合物。在這種情況下，使從患者體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織或器官暴露于抗NGF抗體藥物組合物，隨后將細(xì)胞、組織和/或器官植回患者體內(nèi)。
具體地說，可通過植入用本文所述方法基因工程改造的細(xì)胞以表達(dá)和分泌多肽，來遞送抗NGF抗體。在某些實施方案中，這種細(xì)胞可以是動物細(xì)胞或人類細(xì)胞，且可以是自體同源細(xì)胞、異源細(xì)胞或異種細(xì)胞。在某些實施方案中，細(xì)胞可以是無限增殖化細(xì)胞。在其他實施方案中，為降低出現(xiàn)免疫反應(yīng)的可能性，可使細(xì)胞包囊化，以避免周圍組織的浸潤。在其它實施方案中，包囊材料通常是生物相容性、半透性高分子包裹物或薄膜，其允許蛋白質(zhì)產(chǎn)物釋放，但防止細(xì)胞被患者的免疫系統(tǒng)或者被來自周圍組織的其他有害因素破壞。
實施例以下實施例，包括所進(jìn)行的實驗和所得到的結(jié)果，只供說明目的，不能被理解為限制本發(fā)明。
實施例1從大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生人NGF蛋白rHu-NGF(1-120)的克隆用具有SEQ ID NO27和SEQ ID NO28所示序列的寡核苷酸引物及標(biāo)準(zhǔn)的PCR技術(shù)，從cDNA擴(kuò)增編碼人NGF的核苷酸序列。5′引物產(chǎn)生NdeI限制性酶切位點和緊接在成熟序列的密碼子1(絲氨酸)之前的甲硫氨酸起始密碼子。3′引物產(chǎn)生緊接在終止密碼子之后的BamHI限制性酶切位點。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化，用限制性內(nèi)切核酸酶NdeI和BamHI消化，然后連接到同樣用NdeI和BamHI消化的載體pCFM1656。將連接的DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌657株感受態(tài)宿主細(xì)胞中。篩選具有產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物和擁有攜帶正確核苷酸序列(即SEQID NO29)的質(zhì)粒的能力的克隆。重組人NGF 1-120的氨基酸序列如SEQ ID NO30所示。
表達(dá)載體pCFM1656(ATCC #69576)來源于美國專利第4,710,473號描述的表達(dá)載體系統(tǒng)。pCFM1656質(zhì)粒可如下來源于所述的pCFM836質(zhì)粒(專利第4,710,473號)(a)通過用T4聚合酶進(jìn)行末端補平，然后進(jìn)行平端連接，破壞兩個內(nèi)源NdeI限制性酶切位點；(b)用得自pCFM636(專利第4,710,473號)的含有PL啟動子的類似片段，替換獨特AatII和ClaI限制性酶切位點之間的含有合成PL啟動子的DNA序列；然后(c)用由具有SEQ ID NO31和SEQ ID NO32所示核苷酸序列的兩個探針退火獲得的寡核苷酸，置換獨特ClaI和KpnI限制性酶切位點之間的小DNA序列。
大腸桿菌K12宿主株(Amgen 657株)是獲自大腸桿菌遺傳儲備中心(E.coli Genetic Stock Center，Yale University，New Haven，CT(CGSC6159株)的大腸桿菌W1485(為K12株)的衍生物。
rHu-NGF (1-120)的表達(dá)在豐富培養(yǎng)基中以補料分批方式發(fā)酵含有NGF表達(dá)構(gòu)建物(如上所述)的大腸桿菌細(xì)胞。細(xì)胞在30℃下生長至OD(600nm處)為49，然后通過變溫至42℃進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后4小時離心收獲細(xì)胞。最終OD為75。表達(dá)產(chǎn)率經(jīng)測定為大約0.15g/L。
rHu-NGF(1-120)的重折疊與純化細(xì)胞糊在微觀流體裝置(Microfluidizer)中裂解，在10,000Xg離心30分鐘，沉淀用1％脫氧膽酸洗滌，如上離心，然后所得沉淀用冷水洗滌，再次離心。將所得沉淀(WIB—洗滌包涵體)重新懸浮于變性劑8M鹽酸胍，50mM Tris pH 8.5(含10mM DTT)，在室溫下溶解1小時，在10,000Xg離心30分鐘，小心傾析上清液，然后在4℃含氧化還原對的含水緩沖液中稀釋25倍，持續(xù)5天。然后滴定所得重折疊物至pH 3.0，濾過0.45uM過濾器。用Sp-Sepharose快速流動柱以標(biāo)準(zhǔn)NaCl梯度純化重折疊物。隨后濃縮得自陽離子交換柱的合并液，并將等分部分凍藏于-80℃。蛋白質(zhì)的純度通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行測定，通過考馬斯藍(lán)染色進(jìn)行分析。通過這種方法獲得的純化蛋白質(zhì)超過主帶的90％。
實施例2抗神經(jīng)生長因子(NGF)人單克隆抗體的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因HuMab小鼠和KM小鼠用轉(zhuǎn)基因小鼠HCo7、HCo12、HCo7+HCo12和KM品系(它們每一個都表達(dá)人抗體基因)制備抗NGF完全人單克隆抗體。在這些小鼠品系的每一個中，內(nèi)源小鼠κ輕鏈基因已如Chen等(1993，EMBO J.12811-820)所述被純合地破壞，內(nèi)源小鼠重鏈基因已如國際專利申請公開WO 01/09187(通過引用結(jié)合到本文中)的實施例1所描述被純合地破壞。這些小鼠品系的每一個均攜有如Fishwild等(1996，NatureBiotechnology14845-851)所述的人κ輕鏈轉(zhuǎn)基因KCo5。HCo7品系攜有如美國專利第5,545,806號、第5,625,825號和第5,545,807號(通過引用結(jié)合到本文中)描述的HCo7人重鏈轉(zhuǎn)基因。HCo12品系攜有如國際專利申請公開WO 01/09187(通過引用結(jié)合到本文中)的實施例2所描述HCo12人重鏈轉(zhuǎn)基因。HCo7+HCo12品系攜有HCo7和HCo12重鏈轉(zhuǎn)基因，對每個轉(zhuǎn)基因來說都是半純合的。KM小鼠包含如Tomizuka等(1997，Nature Genet.16，133-143和2000，Proc.Natl.Acad.Sci，97，722-727)所描述的SC20重鏈轉(zhuǎn)基因。該轉(zhuǎn)基因沒有整合到小鼠染色體中，相反作為獨立的染色體片段而增殖。該片段包括大約15MB的人染色體14。它包含整個人重鏈基因座，包括所有VH、D和JH基因節(jié)段及所有重鏈恒定區(qū)同種型。所有這些品系在本文中稱為HuMab小鼠。
HuMab免疫
為產(chǎn)生抗NGF完全人單克隆抗體，用來源于大腸桿菌細(xì)胞的純化重組NGF作為抗原(實施例1)免疫HuMab小鼠。HuMab小鼠的一般免疫方案描述于Lonberg等(1994，Nature368856-859；Fishwild等，出處同上，及國際專利申請公開WO 98/24884，上述各文獻(xiàn)的教導(dǎo)通過引用結(jié)合到本文中)。小鼠第一次灌注抗原時為6-16周齡。用純化重組NGF抗原制劑(25-100μg)，通過腹膜內(nèi)(IP)或皮下(SC)免疫HuMab小鼠。
如下實現(xiàn)HuMab轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫用完全弗氏佐劑中的抗原進(jìn)行兩次注射，隨后2-4周內(nèi)用完全弗氏佐劑中的抗原進(jìn)行IP免疫(共達(dá)9次免疫)。每種抗原免疫幾打小鼠。共有118只HCo7、HCo12、HCo7+HCo12和KM品系的小鼠用NGF抗原免疫。通過眶后取血監(jiān)測免疫應(yīng)答。
為選出產(chǎn)生結(jié)合人HGF的抗體的HuMab小鼠，如Fishwild等(出處同上)所述通過ELISA檢測免疫小鼠的血清。簡單的說，用1-2μg/mLPBS中的得自大腸桿菌的純化重組NGF(實施例1)涂布微量滴定板(50μL/孔)，在4℃下孵育過夜，然后用200μL/孔的溶于PBS/Tween(0.05％)的5％雞血清封閉。將NGF免疫小鼠的血漿稀釋液加入到每個孔中，在環(huán)境溫度下孵育1-2小時。用PBS/Tween洗滌微量滴定板，然后在室溫下與綴合辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗人IgG Fc-特異性多克隆試劑孵育1小時。微量滴定板洗滌后，用ABTS底物(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，目錄號A-1888，0.22mg/mL)顯影，通過在415-495nm波長下測定光密度(OD)進(jìn)行分光光度分析。具有足夠滴度的抗NGF人免疫球蛋白的小鼠用來如下文所述產(chǎn)生單克隆抗體。
生產(chǎn)抗NGF人單克隆抗體的雜交瘤的產(chǎn)生通過在小鼠處死前2天用抗原靜脈內(nèi)強化，制備用以生產(chǎn)單克隆抗體的小鼠，之后將其脾臟取出。采用標(biāo)準(zhǔn)的方案，從HuMab小鼠分離小鼠脾細(xì)胞，周PEG將其融合到小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。通常，對每種抗原，執(zhí)行10-20個融合。
簡單的說，用50％PEG(Sigma)，將得自免疫小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液融合到四分之一數(shù)量的P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC，檢索號CRL 1580)。以大約1×105/孔將細(xì)胞涂布于平底微量滴定板，之后在選擇性培養(yǎng)基中孵育約2周，所述選擇性培養(yǎng)基含有10％胎牛血清、10％P388D1-(ATCC，檢索號CRL TIB-63)條件培養(yǎng)基、DMEM(Mediatech，目錄號CRL 10013，含高含量葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉)中的3-5％origen(IGEN)加上5mMHEPES、0.055mM 2-巰基乙醇、50mg/mL慶大霉素和1xHAT(Sigma，目錄號CRLP-7185)。1-2周后，將細(xì)胞培養(yǎng)于用HT置換HAT的培養(yǎng)基中。
篩選所得雜交瘤，找出能生產(chǎn)抗原特異性抗體的雜交瘤。通過ELISA篩選單獨的孔(如上所述)，找出人抗NGF單克隆IgG抗體。一旦出現(xiàn)大量雜交瘤生長，通常在10-14天后對培養(yǎng)基進(jìn)行監(jiān)測。重新涂布分泌抗體的雜交瘤，再次篩選，如果仍為人IgG陽性，則通過有限稀釋亞克隆抗NGF單克隆抗體至少兩次。然后體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量的抗體，供鑒定用。
結(jié)合NGF的人單克隆抗體的選擇用如上所述的ELISA試驗篩選顯示與NGF免疫原呈陽性反應(yīng)性的雜交瘤。亞克隆分泌高親合力結(jié)合NGF的單克隆抗體的雜交瘤，并進(jìn)一步進(jìn)行表征。從每個雜交瘤選出一個保留親本細(xì)胞反應(yīng)性(通過ELISA測定)的克隆，用來制備5-10個小瓶裝細(xì)胞庫，并保藏于液氮中。
進(jìn)行同種型特異性ELISA，以確定按本文公開而生產(chǎn)出來的單克隆抗體的同種型。在這些實驗中，用1μg/mL的小鼠抗人κ輕鏈的PBS溶液，以50μL/孔涂布微量滴定板，并在4℃下孵育過夜。微量滴定板用5％雞血清封閉后，與得自每個受試單克隆抗體的上清液及純化的同種型對照反應(yīng)。在環(huán)境溫度下孵育微量滴定板1-2小時。然后各孔與各種人IgG特異性辣根過氧化物酶綴合山羊抗人多克隆抗血清反應(yīng)，微量滴定板如上所述進(jìn)行顯影和分析。
對于從雜交瘤上清液純化得到的、經(jīng)ELISA檢測顯示與NGF顯著結(jié)合的單克隆抗體，用下文描述的多種生物測定法，進(jìn)一步檢測其生物活性。
實施例3選擇和克隆具有有效NGF中和活性的抗NGF抗體通過測定每個修飾肽封閉NGF誘導(dǎo)香草素受體-1(VR1)表達(dá)的能力，來評價原先在實施例2中鑒定為NGF活性抑制劑(即NGF“中和”)的抗體的有效性。
背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元培養(yǎng)物在無菌條件下，一個接一個地從19天齡(E19)胚胎大鼠的所有脊髓節(jié)段剖分背根神經(jīng)節(jié)(DRG)，所述胚胎大鼠通過外科手術(shù)從定時懷孕、定期麻醉的Sprague-Dawley大鼠(Charles River，Wilmington，MA)的子宮中取出。將DRG收集于用冰預(yù)冷的、含5％熱滅活馬血清(GibcoBRL)的L-15培養(yǎng)基(GibcoBRL，Grand Island，NY)，除去任何疏松結(jié)締組織和血管。將DRG在無Ca2+和Mg2+的Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)，pH7.4(GibcoBRL)中漂洗兩次。然后用木瓜蛋白酶解離系統(tǒng)(Worthington Biochemical Corp.，F(xiàn)reehold，NJ)將DRG解離為單細(xì)胞懸浮液。簡單的說，將DRG在消化溶液(含有20U/ml木瓜蛋白酶的Earle平衡鹽溶液(EBSS))中，37℃下孵育50分鐘。通過用火琢巴氏吸管在解離培養(yǎng)基中研磨，使細(xì)胞解離，所述解離培養(yǎng)基由MEM/Ham′sF12(1∶1)、1mg/ml卵類黏蛋白抑制劑和1mg/ml卵清蛋白以及0.005％脫氧核糖核酸酶I(DNA酶)組成。
以200xg將解離的細(xì)胞沉淀5分鐘，然后重新懸浮于含1mg/ml卵類黏蛋白抑制劑、1mg/ml卵清蛋白和0.005％DNA酶的EBSS中。以200xg使細(xì)胞懸浮液離心通過含10mg/ml卵類黏蛋白抑制劑、10mg/ml卵清蛋白的梯度溶液，持續(xù)6分鐘，以除去細(xì)胞碎片，然后濾過88-μm尼龍篩(Fsher Scientific，Pittsburgh，PA)，以除去所有的凝塊。用血細(xì)胞計測定細(xì)胞數(shù)目，在完全培養(yǎng)基中以10×103個細(xì)胞/孔將細(xì)胞接種于用聚鳥氨酸100μg/mL(Sigma，St.Louis，MO)和小鼠層粘連蛋白1μg/mL(GibcoBRL)涂布的96孔板。所述完全培養(yǎng)基由極限必需培養(yǎng)基(MEM)和Ham′s F12(1∶1)、青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100μg/ml)及10％熱滅活馬血清(GibcoBRL)組成。將培養(yǎng)物保持在37℃、5％CO2和100％濕度。為控制非神經(jīng)元細(xì)胞的生長，培養(yǎng)基中包含5-氟-2′-脫氧尿苷(75，uM)和尿苷(180，cEM)。
用NGF和抗NGF進(jìn)行處理平板接種兩小時后，用重組人β-NGF(Amgen)或重組大鼠β-NGF(R&D Systems，Minneapolis，MN)以10ng/ml(0.38nM)的濃度處理細(xì)胞。將包含連續(xù)稀釋抗NGF抗體(R&D Systems)的陽性對照涂敷于每個培養(yǎng)板。用3.16倍連續(xù)稀釋，加入十個濃度的受試抗體。所有樣品在加入到培養(yǎng)物之前均稀釋于完全培養(yǎng)基中。孵育時間為40小時，之后進(jìn)行VR1表達(dá)的測定。
DRG神經(jīng)元中VR1表達(dá)的測定培養(yǎng)物用含4％多聚甲醛的Hanks平衡鹽溶液固定15分鐘，用Superblock(Pierce，Rockford，IL)封閉，并在室溫下用0.25％Nonidet P-40(Sigma)的Tris-HCl(Sigma)-緩沖鹽水(TBS)透化處理1小時。培養(yǎng)物用含0.1％吐溫20(Sigma)的TBS漂洗一次，接著在室溫下與兔抗VR1 IgG孵育一個半小時，然后再在室溫下與Eu標(biāo)記抗兔第二抗體(Wallac Oy，Turku，芬蘭)孵育1小時。每次抗體孵育之后，用TBS(3×5分鐘，慢慢振搖)進(jìn)行洗滌。將加強溶液(150μl/孔，Wallac Oy)加入到培養(yǎng)物中。然后用時間分辨熒光計(Wallac Oy)測量熒光信號。通過與NGF滴定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(0-1000ng/ml)比較，測定用修飾肽處理的樣品中的VR1表達(dá)。通過與不經(jīng)NGF處理的對照比較，確定NGF對DRG神經(jīng)元中VR1表達(dá)的抑制百分率(與最大可能抑制相比較)。結(jié)果在表2和5中給出。
細(xì)胞系標(biāo)記為#110-#129。細(xì)胞系#119、#124和#125的抗體顯示極強的NGF中和活性(圖1)。#124細(xì)胞系是親本細(xì)胞系，也稱為4D4。#119和#125細(xì)胞系是4D4親本的亞克隆。使包含雜交瘤#124(4D4)的原始小瓶中的另外樣品生長，并標(biāo)記為#167(4D4)。
使由雜交瘤#167(4D4)產(chǎn)生的抗體進(jìn)行與前面樣品一樣的基于DRG神經(jīng)元的NGF中和試驗。抗體#167(4D4)顯示強烈的抗NGF活性，IC50為0.50nM(圖2)，這與樣品#119、#124和#125的活性一致。這四個樣品的活性在表2中顯示。
表2
N端測序和質(zhì)譜制備純化的抗NGF雜交瘤抗體樣品，供蛋白質(zhì)測序和LC/MS分析。通過用Amicon centriprep-30將培養(yǎng)基濃縮至體積小于15ml，從條件培養(yǎng)基中純化抗體。用PBS洗滌一批rProA(Pharmacia)樹對脂4x，在最后一次洗滌之后用PBS調(diào)成50％漿液。將適當(dāng)量的rProA樹脂(大約5ug抗體/ul樹脂，但所用樹脂不少于50ul)加入到抗體樣品中，于4℃下孵育過夜。離心Ab-樹脂混合物，收集未結(jié)合的級分。加入0.5mlPBS，并將樣品轉(zhuǎn)移到0.45um Spin-X(CoStar)管，然后以10000rpm離心樣品3分鐘。接著用0.5ml PBS洗滌樹脂至少3次，然后加入1.5x樹脂體積的0.1M甘氨酸(pH 2.7)，在室溫下孵育10分鐘，然后以10000rpm再次離心3分鐘，收集上清液。再重復(fù)這個洗脫步驟兩次，然后用二十五分之一體積的1.0M tris(pH 9.2)中和合并的上清液。
用新的Spin-x管(0.2um)進(jìn)行最后一次過濾步驟之后，以人IgG為標(biāo)準(zhǔn)，用標(biāo)準(zhǔn)的Bradford測定法，或者使用在280處的吸光度(對于較大的樣本)，對抗體進(jìn)行定量。還用2ug的各樣品與2ug的人IgG1，k(Sigma)跑膠。為進(jìn)行質(zhì)譜分析，使4微克的樣品去糖基化、還原，并加樣到與Finingan LCQ質(zhì)譜儀在線連接的HPLC(HP1090)。通過反相HPLC使輕鏈與重鏈分離。還收集輕鏈和重鏈，供N端蛋白質(zhì)測序分析。
抗NGF#167(4D4)抗體樣品的輕鏈和重鏈的N端序列與抗NGF#119(4D4)抗體樣品的兩個N端序列吻合。此外，抗體的測量質(zhì)量表明，得自#167和#119雜交瘤的分離抗體相同?？筃GF#167的輕鏈的去疊合測量質(zhì)量(23096)與抗NGF Ab#119的輕鏈的測量質(zhì)量(23096)吻合。
克隆抗NGF抗體重鏈和輕鏈用表達(dá)最強NGF結(jié)合單克隆抗體的雜交瘤4D4.D7作為原始材料，用TRIzol試劑(Invitrogen)分離總RNA。用具有突出端銜接頭(5′-GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT-3′)(SEQ ID NO33)的隨機引物，合成cDNA第一鏈，用GeneRacerTM試劑盒(Invitrogen)按照廠商說明書進(jìn)行5′RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增)制備試驗。為制備完全輕鏈的編碼cDNA，正向引物用GeneRacerTM嵌套引物，反向引物用5′-GGG GTC AGG CTG GAA CTG AGG-3′(SEQ ID NO34)。為制備編碼重鏈可變區(qū)的cDNA，正向引物用GeneRacerTM嵌套引物，反向引物用5′-TGA GGA CGC TGA CCA CAC G-3′(SEQ ID NO 35)。將RACE產(chǎn)物克隆到pCR4-TOPO(Invitrogen)中，并測定序列。用共有序列設(shè)計用于全長抗體鏈PCR擴(kuò)增的引物。
為制備編碼抗NGF 4D4.D7κ輕鏈的cDNA，5′PCR引物編碼信號序列的氨基末端、XbaI限制性酶切位點和最優(yōu)化的Kozak序列(5′-CAGCAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA CAT GAG GGT GCC CGCTCA GCT CCT GGG-3′；SEQ ID NO36)。3′引物編碼羧基末端和終止密碼子以及SalI限制性酶切位點(5′-CTT GTC GAC TCA ACA CTCTCC CCT GTT GAA GCT C-3′；SEQ ID NO37)。將所得PCR產(chǎn)物片段純化，用XbaI和SalI消化，然后凝膠分離，并連接到哺乳動物表達(dá)載體pDSRα20(參見國際申請公開WO 90/14363，其對于任何目的通過引用結(jié)合到本文中)。pDSRα20通過用定點誘變使pDSRα19中的核苷酸2563從“鳥苷”變成“腺苷”而產(chǎn)生。)。
為制備編碼抗NGF4D4.D7重鏈的cDNA，5′PCR引物編碼信號序列的氨基末端、XbaI限制性酶切位點和最優(yōu)化的Kozak序列(5′-CAGCAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA GTT GGG GCT GTG CTGGGT TTT CCT TGT T-3′；SEQ ID NO38)。3′引物編碼羧基末端和終止密碼子以及SalI限制性酶切位點(5′-GCA TGT CGA CTC ATT TACCCG GAG ACA GGG AGA G-3′；SEQ ID NO39)。將所得產(chǎn)物純化，用XbaI和SalI消化，凝膠分離，并連接到pDSRα20載體。
通過將核苷酸序列翻譯成預(yù)測的氨基酸并把氨基酸的分子量加在一起而測算，抗NGF Ab 4D4克隆的輕鏈的DNA序列的計算質(zhì)量(23099)與通過質(zhì)譜分析測量出來的測量質(zhì)量吻合。在儀器偏差范圍內(nèi)，抗-NGF Ab#167的重鏈的去疊合測量質(zhì)量(49479)與抗-NGF Ab#119的重鏈的測量質(zhì)量(49484)吻合，也與抗NGF Ab 4D4克隆的重鏈的DNA序列的理論質(zhì)量(49484)吻合(表3)。
N末端蛋白序列和LC/MS的數(shù)據(jù)證實，雜交瘤#119表達(dá)與雜交瘤#167相同的抗體。此外，基于序列的抗體計算質(zhì)量進(jìn)一步確證該觀察結(jié)果。
表3--質(zhì)譜分析結(jié)果匯總
實施例4抗NGF抗體在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中的表達(dá)通過用磷酸鈣方法，將4D4重鏈/pDSRα19 IgG2或4D4-重鏈/pDSRα19 IgG1和NGF-к/pDSRα19質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到二氫葉酸還原酶缺陷型(DHFR-)無血清適應(yīng)中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中，實現(xiàn)4D4抗NGFmAb的穩(wěn)定表達(dá)。在含有透析血清但不含次黃嘌呤-胸苷的培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以確保表達(dá)HDFR酶的細(xì)胞的生長。用例如ELISA的試驗法篩選轉(zhuǎn)染的克隆，以檢測條件培養(yǎng)基中4D4抗NGF mAb的表達(dá)。使表達(dá)量最高的克隆處于濃度不斷增加的甲氨喋呤(MTX)之下，以進(jìn)行HDFR擴(kuò)增。用例如ELISA的試驗法篩選MTX擴(kuò)增克隆，以檢測條件培養(yǎng)基中表達(dá)更高的4D4抗NGF mAb。使表達(dá)量最高的克隆進(jìn)行亞克隆，以獲得均一的群體，創(chuàng)建細(xì)胞庫。
可用與以上描述的產(chǎn)生抗NGF單克隆抗體相同的方案，在HDFR缺陷型中國倉鼠卵巢細(xì)胞中產(chǎn)生本發(fā)明重組抗NGF抗體。將編碼本發(fā)明每種抗NGF抗體完全重鏈或輕鏈的DNA序列克隆到表達(dá)載體中。用能夠表達(dá)適當(dāng)抗NGF抗體的完全重鏈的表達(dá)載體和表達(dá)適當(dāng)抗NGF抗體的完全輕鏈的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染CHO缺陷型細(xì)胞。例如，為產(chǎn)生抗NGF抗體，用能夠表達(dá)包含SEQ ID N040所示氨基酸序列的完全重鏈的載體和能夠表達(dá)包含SEQ ID NO44所示氨基酸序列的完全輕鏈的載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。表4總結(jié)了具有各種IgG重鏈恒定區(qū)的4D4抗體的完全重鏈和完全輕鏈。
表4
實施例5鑒定抗NGF 4D4抗體的活性檢測在生長于旋動培養(yǎng)(S)或滾瓶培養(yǎng)(R)條件下的細(xì)胞中產(chǎn)生的瞬時表達(dá)的抗NGF 4D4抗體，以確認(rèn)它們在如上所述(實施例3)進(jìn)行的基于DRG神經(jīng)元的NGF中和生物測定中中和NGF的能力。
使NGF抗體在無血清懸浮液適應(yīng)293T細(xì)胞中瞬時表達(dá)。用500mL或1L培養(yǎng)物進(jìn)行轉(zhuǎn)染。簡單的說，在4℃下，以2,500RPM離心細(xì)胞接種物(5.0×105個細(xì)胞/mL X培養(yǎng)物體積)10分鐘，除去條件培養(yǎng)基。將細(xì)胞重新懸浮于無血清DMEM，在4℃下，以2,500RPM再次離心10分鐘。吸出洗滌溶液后，在1L或3L旋動培養(yǎng)瓶中，將細(xì)胞重新懸浮于生長培養(yǎng)基[DMEM/F12(3∶1)+1X胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒補充物+1X Pen Strep Glut+2mM L-谷氨酰胺+20mM HEPES+0.01％Pluronic F68]。在磁力攪拌板上以125RPM維持旋動瓶培養(yǎng)物，所述磁力攪拌板置于維持在37℃和5％CO2的加濕培養(yǎng)箱中。在50mL錐形瓶中將質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合。在無血清DMEM中制備DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物，體積為最終培養(yǎng)物體積的5％。首先將1μg質(zhì)粒DNA/mL培養(yǎng)物加入無血清DMEM，然后加入1μl X-TremeGeneRO-1539/mL培養(yǎng)物。將復(fù)合物在室溫下孵育大約30分鐘，然后加入到旋動瓶中的細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染/表達(dá)進(jìn)行7天之后，在4℃下，以4,000RPM離心60分鐘收獲條件培養(yǎng)基。
對于滾瓶瞬時轉(zhuǎn)染，我們使用了生長和維持于DMEM的293T貼壁細(xì)胞，所述DMEM補充有5％FBS+1X非必需氨基酸+1X PenStrep Glut+1X丙酮酸鈉。將大約4-5×107個293T細(xì)胞接種于850cm2滾瓶過夜。然后在第二天，用FuGene6轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染先前接種細(xì)胞。用大約6.75mL無血清DMEM制備DNA-轉(zhuǎn)染試劑混合物。首先加入675μl FuGene6轉(zhuǎn)染試劑，然后加入112.5μg質(zhì)粒DNA。在室溫下孵育所得復(fù)合物30分鐘。然后將全部的混合物加入到滾瓶中。滾瓶用5％CO2氣體混合物充氣，蓋緊，置于37℃培養(yǎng)箱中，所述培養(yǎng)箱放在以0.35 RPM旋轉(zhuǎn)的滾架(roller rack)上。轉(zhuǎn)染進(jìn)行24小時后，用100mL DMEM+1X胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒補充物+1X Pen Strep Glut+1X非必需氨基酸+1X丙酮酸鈉置換培養(yǎng)基。通常，每個滾瓶獲得兩份100ml 48小時收獲物。將收獲的無血清條件培養(yǎng)基集中在一起，在4℃下以4,000RPM離心30分鐘。
4D4.IgG1和4D4.IgG2對人NGF均顯示強活性，IC50值約為0.14nM至約0.2nM(圖2)?；钚栽囼灥慕Y(jié)果在表5中匯總。這些抗體對大鼠NGF顯示極少活性(圖3)。這些結(jié)果與從上述雜交瘤直接檢測得出的抗體活性類似。
表5
hNGF＝人NGF，rNGF＝大鼠NGF，R＝滾瓶培養(yǎng)，S＝旋動培養(yǎng)實施例6抗NGF抗體的生產(chǎn)抗NGF抗體在CHO細(xì)胞的克隆系中表達(dá)產(chǎn)生。對于每次生產(chǎn)運行，將單個小瓶中的細(xì)胞解凍到無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中。先讓細(xì)胞在T形瓶中生長，接著在旋動瓶中生長，然后在不銹鋼反應(yīng)器中生長，逐步放大到2000L生物反應(yīng)器。生產(chǎn)是在2000L生物反應(yīng)器中用補料分批培養(yǎng)方式進(jìn)行的，將含濃縮培養(yǎng)基成分的營養(yǎng)物原料添加到反應(yīng)器中，以維持細(xì)胞的生長和培養(yǎng)物的生存力。生產(chǎn)持續(xù)大約兩周，期間抗NGF抗體由細(xì)胞組成型產(chǎn)生，并被分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中。
將生產(chǎn)反應(yīng)器控制在預(yù)定的pH、溫度和溶氧水平pH通過加入二氧化碳?xì)夂吞妓徕c進(jìn)行控制；溶氧通過通入空氣、氮氣和氧氣進(jìn)行控制。
在生產(chǎn)結(jié)束時，將細(xì)胞培養(yǎng)液加進(jìn)圓盤式離心機，使培養(yǎng)物上清液與細(xì)胞分離。通過深度濾膜，然后是0.2μm過濾器，進(jìn)一步澄清濃縮液。然后通過切向流超濾法濃縮澄清的條件培養(yǎng)基。濃縮條件培養(yǎng)基15至30倍。然后所得的濃縮條件培養(yǎng)基進(jìn)行純化加工，或者凍藏以待日后純化。
實施例7與其他神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的交叉反應(yīng)性在不同的生物試驗中，檢測4D4抗體對人NT3或者人BDNF的交叉反應(yīng)性，包括針對人NT3的DRG神經(jīng)元存活試驗，及針對人BDNF的培養(yǎng)DA神經(jīng)元中DA攝入的試驗。
用NT3、抗NT3和抗NGF處理DRG培養(yǎng)物平板接種兩小時后，用重組hNT-3 100ng/ml(3.8nM)處理DRG細(xì)胞(分離程序在以上實施例3中描述)。連續(xù)稀釋的抗hNT3抗體(R&D)用作陽性對照樣本。以10個點的3.16倍連續(xù)稀釋的各種濃度加入未知樣本(抗NGF Ab樣本)。所有樣本在加入到培養(yǎng)物之前先在完全培養(yǎng)基中稀釋。
DRG神經(jīng)元中MAP2表達(dá)的測定培養(yǎng)物用含4％多聚甲醛的Hanks平衡鹽溶液固定15分鐘，用Superblock(Pierce)封閉1小時，并在室溫(RT)下用0.25％Nonidet P-40(Sigma)的Tris-HCl(Sigma)-緩沖鹽水(TBS)透化處理1小時。培養(yǎng)物用含0.1％吐溫20(Sigma)的TBS漂洗一次，接著在室溫下與小鼠抗MAP2IgG(Chemicon，Temecula，CA)孵育1.5小時，然后再在室溫下與Eu標(biāo)記抗小鼠第二抗體(Wallac Oy，Turku，芬蘭)孵育1小時。每次抗體孵育之后，用TBS(3 x 5分鐘，輕輕振搖)進(jìn)行洗滌。將增強溶液(150μl/孔，Wallac Oy)加入到培養(yǎng)物中，然后用時間分辨熒光計(Wallac Oy)測量熒光信號。
胚胎中腦培養(yǎng)使用19天齡(E19)胚胎Sprague-Dawley大鼠(Jackson Labs)。將富集多巴胺能神經(jīng)元的腹側(cè)中腦組織切除下來，并轉(zhuǎn)移到冷的Dulbecco磷酸緩沖鹽水(DPBS)，pH 7.4，不含Ca++和Mg++(Gibco)。用木瓜蛋白酶解離系統(tǒng)(Worthington Biochemical Corp.，F(xiàn)reehold，NJ)將組織片段解離為單細(xì)胞懸浮液。簡單的說，將組織片段在消化溶液(含有20單位/ml木瓜蛋白酶在Earle平衡鹽溶液(EBSS))中，37℃下孵育50分鐘。通過用火琢巴氏吸管在解離培養(yǎng)基中研磨，使細(xì)胞解離，所述解離培養(yǎng)基由MEM/Ham′s F12(1∶1)、1mg/ml卵類黏蛋白抑制劑和1mg/ml卵清蛋白以及0.005％脫氧核糖核酸酶I(DNA酶)組成。以200xg將解離的細(xì)胞沉淀5分鐘，然后重新懸浮于含1mg/ml卵類黏蛋白抑制劑、1mg/ml卵清蛋白和0.005％DNA酶的EBSS中。以200xg使細(xì)胞懸浮液離心通過含10mg/ml卵類黏蛋白抑制劑、10mg/ml卵清蛋白的梯度溶液，持續(xù)6分鐘，以除去細(xì)胞碎片；然后濾過25μg Nitex尼龍篩(Tetko，Inc.)，以除去凝塊。以100,000/cm2的密度將解離細(xì)胞平板接種于組織培養(yǎng)板中。如前所述(Louis JC等，J.Pharmacol.Exp.Ther.1992；2621274-1283.)，用聚鳥氨酸100μg/ml(Sigma)和小鼠層粘連蛋白1μg/ml(GibcoBRL)預(yù)先涂布組織培養(yǎng)板。培養(yǎng)基由極限必需培養(yǎng)基(MEM)/Ham′s F12(1∶1)、12％馬血清(GibcoBRL)、100μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白和2.5μg/ml胰島素(Sigma)組成。培養(yǎng)物在37℃、5％CO2和100％濕度下保持6天。
用BDNF和抗BDNF或抗NGF處理中腦培養(yǎng)物平板接種兩小時后，以10ng/ml的濃度將BDNF加入到細(xì)胞中，然后加入系列濃度的抗NGF Ab樣品。抗BDNF抗體(在Amgen公司產(chǎn)生)用作陽性對照樣本。
中腦神經(jīng)元中的DA攝入如前所述(Friedman，L.和Mytilineou，C.，Neuroscience Letters1987；7965-72)進(jìn)行多巴胺攝入試驗。在第6天，用預(yù)加溫的含5.6mM葡萄糖、1.3mM EDTA和0.5mM帕吉林(單胺氧化酶抑制劑)的Krebs-Ringer磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗滌培養(yǎng)物一次。在37℃下，將培養(yǎng)物在含50nM[3H]DA(NEN)的攝入緩沖液中孵育60分鐘。通過除去攝入緩沖液停止攝入，用Krebs-Ringer磷酸鹽緩沖液洗滌培養(yǎng)物三次。通過將液體閃爍混合物OpticPhase SuperMix(Wallac)直接加入到培養(yǎng)物中，使細(xì)胞裂解，以釋放出[3H]DA。然后用Microbeta-Plus液體閃爍計數(shù)器(Wallac，Inc.)計算細(xì)胞裂解物的放射性。通過將0.5mMGBR12909(高親和性DA攝入位點的特異性抑制劑，Heikkila RE和Mazino L，European Journal of Pharmacology 1984；103241-8)加入到攝入緩沖液中，來估算低親和性DA攝入，然后總攝入量與其相減，得到高親和性DA攝入值。
表6
實施例8供抗NGF抗體結(jié)合的表位的鑒定通過有限蛋白酶解進(jìn)行表位作圖在4℃下，將5微克(μg)NGF在0.1M Tris緩沖液(pH7.5)中與4D4(11μg)孵育30分鐘。然后在37℃下，用1μg蛋白酶(枯草桿菌蛋白酶)消化所得的復(fù)合物。將HPLC肽圖互相比較，以找出受4D4抗體保護(hù)的肽。NGF的有限蛋白酶解表明，有幾種主要的肽最初從NGF中釋放出來。特別令人感興趣的是，肽S18.3、S18.5和S34.4得以產(chǎn)生，并受到抗體保護(hù)免遭蛋白酶解。其他峰沒有明顯形成出來或者得到保護(hù)。兩個實驗(1小時和2小時消化)中的受保護(hù)肽在表7中顯示。
表7
從肽的峰高計算出保護(hù)百分率。S18.5含有兩條肽，但在280nm處的吸光度檢測發(fā)現(xiàn)，只有一條肽(SSSHPIFHR；SEQ ID NO46)受到4D4抗體的保護(hù)，因為添加4D4抗體后另一條肽(HWNSY；SEQ ID NO47)的峰保持不變。肽S18.3是S34.4的C端部分，兩者均來自相同的環(huán)區(qū)。N端和中央環(huán)區(qū)也是可能的表位。
Microcon分離經(jīng)消化的肽在4℃下，將枯草桿菌蛋白酶消化過的材料(各3μg)在0.1M Tris緩沖液(pH 7.5)中與活性4D4抗體和失活的單克隆抗體(#162)(8μg)一起孵育30分鐘。用Microcon 10(Millipore Corp.，Bedford，Mass)分離結(jié)合/未結(jié)合肽，通過HPLC分析這兩個級分(結(jié)合和未結(jié)合)，找出結(jié)合抗體的肽。用4D4抗體和#162處理并用Microcon分離之后，通過HPLC比較未結(jié)合級分，鑒定出兩個耗減的峰，回收所述兩個峰，其表示抗體結(jié)合的肽。4D4結(jié)合肽是S1(4.4)----SRKAVRR(113-119)(SEQ ID NO49)，C-端；S2(28.3)----EVMVL(35-39)(SEQ ID NO50)，環(huán)區(qū)。
G另外用Lys-C(K)消化NGF樣本24小時。不加變性劑將半胱氨酸殘基還原和羧甲基化。將樣本與單克隆抗體4D4和AMG162一起孵育，接著用Microcon 100進(jìn)行分離。用反相HPLC分析結(jié)合和未結(jié)合的部分。只有兩條如下所示的肽被鑒定為抗體結(jié)合K肽。由序列分析測定的這兩條肽的計算質(zhì)量與它們的質(zhì)譜觀測結(jié)果一致。如下所示，這兩條肽位于N端和C端區(qū)域。
K1(37.6)----SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDK(SEQ ID NO51)計算質(zhì)量＝2821；觀測質(zhì)量＝2828.2；N-端K2(39.5)----QAAWRFIRIDTACVCVLSRK(SEQ ID NO52)計算質(zhì)量＝2452；觀測質(zhì)量＝2459.5；C-端前述的表位作圖實驗表明，至少有三個區(qū)域是4D4抗體的可能表位，包括N-端區(qū)域(1-9)、內(nèi)部區(qū)域(46-57)和C-端區(qū)域(96-98)。此外，AspN消化揭示，由---SSHPIFHRGEFSVC---(SEQ ID NO53)組成的肽片段受4D4抗體的保護(hù)，而胰蛋白酶消化揭示，由---SSHPIFHR---(SEQ ID NO54)組成的肽片段不受4D4抗體的保護(hù)。因此，在N端，序列GEFSVC(SEQ ID NO55)對于與4D4抗體的結(jié)合是最重要的。
為更清楚地明確抗NGF抗體4D4.IgG1的表位，根據(jù)完整的人成熟NGF(hNGF)序列(表8)，用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)由合成法產(chǎn)生總共23種肽。這些肽長為15個氨基酸，重疊達(dá)10個氨基酸，C端以半胱氨酸結(jié)尾，以便綴合到基質(zhì)。上述人抗hNGF Ab 4D4.IgG1用于作圖實驗。
表8
用5％DMSO，1mM EDTA，pH 6.23將人NGF肽片段稀釋到PBS中。最終肽濃度歸一化為同一摩爾濃度55μM(約100μg/ml)。在室溫下，將肽以100μl/孔在Reacti-Bind馬來酰亞胺活化的96孔微量滴定板(Pierce目錄號15150)中孵育2小時，然后在4℃下攪拌孵育過夜。人NGF(100μg/ml)用作陽性對照樣本。用洗滌緩沖液(KPL)洗滌微量滴定板，用0.2％脫脂奶粉(溶于PBS-EDTA緩沖液，pH 6.23)在室溫下封閉2小時，然后用5％BSA再封閉1小時。然后微量滴定板用各種濃度(0，3，10，30μg/ml)的人抗NGF抗體孵育，接著用山羊抗hFc Ab-HRP(KPL)孵育，達(dá)2小時。用TMB底物使信號顯影，加入終止液(KPL)后，在450nm處讀數(shù)。
在23種人NGF肽當(dāng)中，至少觀察到4個主要的峰，顯示有4D4結(jié)合。這些峰對應(yīng)于下列的肽肽#1(SEQ ID NO56)，SSSHPIFHRGEFSVC(1-15)；肽#10(SEQ ID NO65)，NSVFKQYFFETKARD(46-60)；肽#16-17(SEQ ID NO71-SEQ ID NO72)，WNSYATTTHTFVKAL---(76-95)；及肽#18-21(SEQ ID NO73-SEQ ID NO76)，TTTHT---LSRKC(100-115)。
如在Weismann等(1999，Nature401184-8)中所描述，4D4的四個結(jié)合峰位于NGF中的N-端、C-端、內(nèi)部結(jié)構(gòu)域以及環(huán)L2和環(huán)L4。這些結(jié)果匯總于表9中。
表9
Wiesmann等揭示了結(jié)合trkA受體的hNGF的晶體結(jié)構(gòu)，顯示N端(殘基2-9)對于受體結(jié)合是重要的(Wiesmann等，1999，Nature401184-8)。NGF中這個節(jié)段的殘基對于其對trkA的特異性強于對trkB或trkC受體這一點也是重要的?？贵w4D4對人NGF的選擇性比對小鼠/大鼠NGF以及BDNF和NT-3要強，這很可能是由于人NGF和其他神經(jīng)營養(yǎng)蛋白之間的N端差異造成的。
抗體4D4結(jié)合肽#10(SEQ ID NO65)(NSVFK---，46-60)和肽#17(SEQ ID NO72)(TTTHTFVKALTMDGKC，81-95)，這兩條肽分別對應(yīng)于環(huán)L2和環(huán)L4，這兩個環(huán)代表了神經(jīng)營養(yǎng)蛋白當(dāng)中序列多樣性高于平均水平的七個獨特區(qū)域中的兩個。NGF和BDNF之間這七個區(qū)域的交換實驗顯示，L2和L4對NGF的生物活性是重要的。此外，將環(huán)L2和環(huán)L4中的五個NT3殘基用NGF中的殘基置換，引入了類似NGF的活性，同時保持了NT3活性。因此，L2和L4可能是抗體4D4選擇性結(jié)合NGF而不是結(jié)合BDNF或NT-3的區(qū)域。
抗體4D4同樣結(jié)合肽#16(SEQ ID NO71)(WNSYATTTHTFVKAL，76-90)，與NGF晶體結(jié)構(gòu)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)域吻合。這個區(qū)域在人NGF和小鼠NGF之間100％同源，但與其他神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的截然不同。與其對人NGF的活性相比，4D4對大鼠/小鼠NGF的活性弱得多。因此，與NGF的這個部分結(jié)合對物種特異性來說很可能不是關(guān)鍵的，但對于神經(jīng)營養(yǎng)蛋白當(dāng)中的選擇性來說是重要的。
抗體4D4同樣結(jié)合NGF的C端區(qū)域(肽#19-21(SEQ ID NO74-SEQ ID NO76)TMDGK---LSRKC，91-115)，這個區(qū)域是人NGF中使NGF與其他神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(BDNF和NT3)區(qū)別開來的區(qū)域之一。與這個區(qū)域結(jié)合有助于解釋為什么4D4對其他神經(jīng)營養(yǎng)蛋白不具有活性。此外，人NGF和小鼠NGF之間在C端有單個氨基酸差異，提示這單個氨基酸可能是造成4D4對人NGF的選擇性強于對大鼠/小鼠NGF的選擇性的原因之一，這與觀察到在N端有物種差異相似。
最后，4D4也與肽#10(SEQ ID NO65)(---KARDC，50-60)所示的人NGF內(nèi)部結(jié)構(gòu)域相互作用，這個結(jié)構(gòu)域是NGF優(yōu)先結(jié)合trkA而不是trkB或trkC的重要區(qū)域，這進(jìn)一步解釋了4D4對人NGF的選擇性中和活性。
實施例9
通過KinExA測定單克隆抗體的親和性通過KinExA測定Ab 4D4(38859-80)對huNGF(29714-91)的結(jié)合。簡單的說，用huNGF預(yù)涂布Reacti-Gel 6x(Pierce)，并用BSA封閉。在室溫下，將10pM和30pM的Ab4D4樣品與各種濃度的huNGF(Amgen)孵育8小時，然后流過涂有huNGF的玻珠。用熒光(Cy5)標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體(Jackson Immune Research)對玻珠結(jié)合抗體的量進(jìn)行定量。結(jié)合信號與處于平衡狀態(tài)的游離抗體的濃度成正比。用雙曲線單點同質(zhì)結(jié)合模型(dual-curve one-site homogeneous binding model)(KinExTM軟件)對競爭曲線進(jìn)行非線性回歸，得到解離平衡常數(shù)(KD)。對于Ab 4D4結(jié)合huNGF，KD為約4pM。
實施例10另外的抗NGF抗體的鑒定選擇按以上實施例2和3的描述產(chǎn)生和鑒定的另外抗NGF抗體(稱為14D10、6G9、7H2、14F11和4G6)，進(jìn)行進(jìn)一步的研究。簡單的說，檢測條件培養(yǎng)基，尋找結(jié)合活性。純化培養(yǎng)基中的抗體并測序。將條件培養(yǎng)基中的抗體的預(yù)測質(zhì)量與其質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)相比較。克隆抗體。如上所述，使其中的兩個克隆在CHO細(xì)胞中表達(dá)，并檢測活性。結(jié)果在表10中顯示。
表10
然后將這些抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的序列與4D4抗體序列相比較，同時相互比較(圖5和6)。由這些比較所鑒定得出的重鏈可變區(qū)的同源性百分率在表11中顯示。輕鏈可變區(qū)的同源性百分率在表12中顯示。另外，各種抗體的CDR區(qū)的同源性百分率在圖5-10中顯示。
表11
表12
應(yīng)當(dāng)理解，前述公開內(nèi)容強調(diào)本發(fā)明的具體特定實施方案，與其等同的所有修改方案或者替代方案落入后附權(quán)利要求書所闡明的本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。
序列表<110>Kenneth，WildTreanor，JamesHuang，HaichunInoue，HeatherZhang，Tie J.
Martin，F(xiàn)rank<120>作為選擇性NGF途徑抑制劑的人抗NGF中和抗體<130>02-1240<150>US 60/487,431<151>2003-07-15<160>138<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>990<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)
<400>1gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg60ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg120tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca180ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc240tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc300aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga360ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct420gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg480tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac540agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag600gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc660aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag720ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc780gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg840ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg900cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg960cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990<210>2<211>330<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr20 25 30Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50 55 60Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65 70 75 80Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys85 90 95Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys100 105 110Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro115 120 125Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys130 135 140Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp145 150 155 160Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu165 170 175Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu180 185 190His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn195 200 205Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly210 215 220Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu225 230 235 240Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cy8 Leu Val Lys Gly Phe Tyr245 250 255Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe275 280 285Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn290 295 300Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr305 310 315 320Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys325 330<210>3<211>978<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>3gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag60agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg120tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca180ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc240tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc300aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc360ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc420gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc480gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt540gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc600aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg660cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac720caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg780
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960tccctgtctc cgggtaaa 978<210>4<211>326<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg15 10 15Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr20 25 30Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50 55 60Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr65 70 75 80Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys85 90 95Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro100 105 110Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp115 120 125Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly145 150 155 160Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn165 170 175Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp180 185 190Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro195 200 205Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu210 215 220Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn225 230 235 240Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile245 250 255Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr260 265 270Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys275 280 285Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys290 295 300Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu305 310 315 320Ser Leu Ser Pro Gly Lys325<210>5<211>981<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>5gccagcacca aggggccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag60
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300aaatatggtc ccccatgccc atcatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtgraca agagcaggtg gcaggagggg 900aatgtcttct catgctccgt gakgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960ctctccctgt ctctgggtaa a 981<210>6<211>327<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>6Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg1 5 10 15Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50 55 60Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr65 70 75 80Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys85 90 95Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro100 105 110Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys115 120 125Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val130 135 140Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp145 150 155 160Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe165 170 175Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp180 185 190Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu195 200 205Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg210 215 220Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys225 230 235 240Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp245 250 255Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys260 265 270Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser290 295 300Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser305 310 315 320Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys325<210>7<211>321<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>7cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300agcttcaaca ggggagagtg t 321<210>8<211>107<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>8Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu15 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe20 25 30Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln35 40 45Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser50 55 60Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu65 70 75 80Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser85 90 95Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys100 105<210>9<211>369<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>9gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggctt caccttaaga agttatagca tgaactgggt tcgccaggct 120ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtcgta gtagtcatac catattctac 180gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ttcactgtat 240ctgcaaatgg acagcctgag agacgaggac acggctatgt attactgtgc gagagtatat 300agcagtggct ggcacgtctc tgattatttt gactactggg gccagggaat cctggtcacc 360gtttcctca 369<210>10<211>123<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)<400>10Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Arg Ser Tyr20 25 30Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Tyr Ile Ser Arg Ser Ser His Thr Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Val Tyr Ser Ser Gly Trp His Val Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>11<211>321<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>11gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca120ggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgctcac tttcggcgga 300gggaccaagg tggagatcaa a 321<210>12<211>107<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>12Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>13<211>42<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)
<400>13gtatatagca gtggctggca cgtctctgat tattttgact ac42<210>14<211>14<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>14Val Tyr Ser Ser Gly Trp His Val Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr1 5 10<210>15<211>27<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>15caacagttta atagttaccc gctcact 27<210>16<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>16Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr1 5<210>17
<211>51<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>17tacattagtc gtagtagtca taccatattc tacgcagact ctgtgaaggg c 51<210>18<211>17<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>18Tyr Ile Ser Arg Ser Ser His Thr Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly<210>19<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>19gatgcctcca gtttggaaag t 21<210>20<211>7
<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>20Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser1 5<210>21<211>15<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>21agttatagca tgaac 15<210>22<211>5<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>22Ser Tyr Ser Met Asn1 5<210>23<211>33<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)
<400>23cgggcaagtc agggcattag cagtgcttta gcc 33<210>24<211>11<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>24Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala1 5 10<210>25<211>1131<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>25gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctctggg60ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg120tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca180ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc240tacacctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagctc300aaaaccccac ttggtgacac aactcacaca tgcccacggt gcccagagcc caaatcttgt360gacacacctc ccccgtgccc acggtgccca gagcccaaat cttgtgacac acctcccccg420tgcccacggt gcccagagcc caaatcttgt gacacacctc ccccatgccc acggtgccca480gcacctgaac tcctgggagg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggatacc540
cttatgattt cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 600cccgaggtcc agttcaagtg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 660ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 720caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 780cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggacagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 840ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 900ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca gcgggcagcc ggagaacaac 960tacaacacca cgcctcccat gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1020accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacatcttct catgctccgt gatgcatgag 1080gctctgcaca accgcttcac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a1131<210>26<211>376<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>26Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg1 5 10 15Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr20 25 30Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50 55 60Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65 70 75 80Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro100 105 110Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg115 120 125Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys130 135 140Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro145 150 155 160Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys165 170 175Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val180 185 190Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr195 200 205Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu210 215 220Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His225 230 235 240Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys245 250 255Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln260 265 270Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met275 280 285Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro290 295 300Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn305 310 315 320Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu325 330 335Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln355 360 365Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly370 375<210>27<211>29<212>DNA<213>人工<220>
<223>人NGF的PCR引物<400>27acaccacata tgtcatcatc ccatcccat 29<210>28<211>40<212>DNA<213>人工<220>
<223>人NGF的PCR引物<400>28accacaggat cctccttatg cacgacgcac agctttacgg 40<210>29<211>375<212>DNA
<213>人工<220>
<223>編碼重組人met-NGF的核苷酸序列<400>29catatgtcat catcccatcc catcttccac aggggcgaat tctcggtgtg tgacagtgtc60agcgtgtggg ttggggataa gaccaccgcc acagacatca agggcaagga ggtgatggtg120ttgggagagg tgaacattaa caacagtgta ttcaaacagt acttttttga gaccaagtgc180cgggacccaa atcccgttga cagcgggtgc cggggcattg actcaaagca ctggaactca240tattgtacca cgactcacac ctttgtcaag gcgctgacca tggatggcaa gcaggctgcc300tggcggttta tccggataga tacggcctgt gtgtgtgtgc tcagccgtaa agctgtgcgt360cgtgcataag gatcc 375<210>30<211>121<212>PRT<213>人工<220>
<223>重組人met-NGF的氨基酸序列(1-120)<400>30Met Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys1 5 10 15Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile20 25 30Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser35 40 45
Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro50 55 60Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr65 70 75 80Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys85 90 95Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val100 105 110Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala115 120<210>31<211>55<212>DNA<213>人工<220>
<223>產(chǎn)生表達(dá)載體pCFM1656(ATCC#69576)的5′引物序列<400>31cgatttgatt ctagaaggag gaataacata tggttaacgc gttggaattc ggtac 55<210>32<211>49<212>DNA<213>人工<220>
<223>產(chǎn)生表達(dá)載體pCFM1656(ATCC#69576)的3′引物序列<400>32taaactaaga tcttcctcct tattgtatac caattgcgca accttaagc 49
<210>33<211>24<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物<220>
<221>不確定<222>(18)..(23)<223>n為a、c、t或g<400>33ggccggatag gcctccannn nnnt24<210>34<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物<400>34ggggtcaggc tggaactgag g 21<210>35
<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物<400>35tgaggacgct gaccacacg 19<210>36<211>54<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物<400>36cagcagaagc ttctagacca ccatggacat gagggtgccc gctcagctcc tggg 54<210>37<211>34<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物
<400>37cttgtcgact caacactctc ccctgttgaa gctc 34<210>38<211>55<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物<400>38cagcagaagc ttctagacca ccatggagtt ggggctgtgc tgggttttcc ttgtt 55<210>39<211>34<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物<400>39gcatgtcgac tcatttaccc ggagacaggg agag 34<210>40<211>449<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)
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20 25 30Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>87<211>124<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>87Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Asp Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Gln Trp Leu Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>88<211>107<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>88Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>89<211>107<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>89
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Pro Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp His Arg85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>90<211>108<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>90Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser20 25 30Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu65 70 75 80Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro
85 90 95Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>91<211>107<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>91Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>92<211>5<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>92
Thr Tyr Trp Ile Gly1 5<210>93<211>17<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>93Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe Gln1 5 10 15Gly<210>94<211>16<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>94Asn Tyr Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asn Val1 5 10 15<210>95<211>11<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>95
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp Leu Ala1 5 10<210>96<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>96Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser1 5<210>97<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>97Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Trp Thr1 5<210>98<211>5<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>98Asp Tyr Ala Met His1 5<210>99
<211>17<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>99Gly Ile Ser Trp Asn Arg Gly Ile Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly<210>100<211>17<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>100Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Arg Pro Gly Tyr Phe Tyr Tyr Val Met Asp1 5 10 15Val<210>101<211>12<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>101Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Gly Phe Leu Ala1 5 10
<210>102<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>102Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr1 5<210>103<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>103Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr1 5<210>104<211>5<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>104Asp Tyr Ala Met His1 5<210>105<211>17
<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>105Gly Ile Ser Trp Asn Arg Gly Ile Ile Gly Tyr Ala Gly Ser Val Lys1 5 10 15Gly<210>106<211>17<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>106Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Arg Pro Gly Tyr Phe Tyr Tyr Val Met Asp1 5 10 15Val<210>107<211>12<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>107Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10<210>108
<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>108Val Ala Ser Ser Arg Ala Thr1 5<210>109<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>109Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr1 5<210>110<211>5<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>110Asp Tyr Ala Met His1 5<210>111<211>17<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)<400>111Gly Ile Thr Trp Asn Ser Gly Ile Leu Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly<210>112<211>11<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>112Glu Gly Ser Gly Arg Tyr Tyr Asn Phe Asp Tyr1 5 10<210>113<211>12<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>113Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10<210>114<211>7<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)<400>114Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr1 5<210>115<211>8<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>115Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Tyr Thr1 5<210>116<211>5<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>116Asp Tyr Gly Met Asn1 5<210>117<211>17<212>PRT<213>智人(Homo sapien)
<400>117Asp Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly<210>118<211>15<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>118Glu Gln Trp Leu Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val1 5 10 15<210>119<211>11<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>119Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala1 5 10<210>120<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>120
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser1 5<210>121<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>121Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr1 5<210>122<211>11<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>122Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10<210>123<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>123Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr1 5
<210>124<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>124Gln Gln Arg Ser Asn Trp His Arg Thr1 5<210>125<211>12<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>125Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10<210>126<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>126Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr1 5<210>127<211>9
<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>127Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr1 5<210>128<211>11<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>128Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Alal 5 10<210>129<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>129Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr1 5<210>130<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapien)
<400>130Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp Thr1 5<210>131<211>108<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>131Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser20 25 30Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro85 90 95Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>132<211>11<212>PRT<213>智人(Homo sapien)
<400>132Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10<210>133<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>133Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr1 5<210>134<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>134Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr1 5<210>135<211>120<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>135Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys20 25 30Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val35 40 45Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val50 55 60Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys65 70 75 80Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln85 90 95Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu100 105 110Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala115 120<210>136<211>120<212>PRT<213>小家鼠(mus musculus)<400>136Ser Ser Thr His Pro Val Phe His Met Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp1 5 10 15Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys20 25 30Gly Lys Glu Val Thr Val Leu Ala Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val35 40 45Phe Arg Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Ala Ser Asn Pro Val50 55 60Glu Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Thr Asp Glu Lys Gln85 90 95Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu100 105 110Ser Arg Lys Ala Thr Arg Arg Ala115 120<210>137<211>126<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>137His Ser Asp Pro Ala Arg Arg His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu1 5 10 15Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys20 25 30Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys35 40 45Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys50 55 60Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys65 70 75 80Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala85 90 95Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp ArgPhe Ile Arg Ile100 105110Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg115 120 125<210>138<211>119
<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>138Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp Ser1 5 10 15Glu Ser Leu Trp Val Thr Asp Lys Ser Ser AlaIle Asp Ile Arg Gly20 25 30His Gln Val Thr Val Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro Val35 40 45Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Val Lys50 55 60Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gln Cys Lys65 70 75 80Thr Ser Gln Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu85 90 95Val Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu100 105 110Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr11權(quán)利要求
1.一種特異性結(jié)合NGF的分離人抗體，其中所述抗體包含具有重鏈可變區(qū)的重鏈和輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含與SEQ IDNO10表示的氨基酸序列有至少80％序列一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中所述輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO12表示的氨基酸序列有至少90％序列一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
3.權(quán)利要求1的抗體，其中所述輕鏈包含人輕鏈CDR1，所述CDR1具有與SEQ ID NO24表示的氨基酸序列有至少85％一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
4.權(quán)利要求1的抗體，其中所述輕鏈包含人輕鏈CDR3，所述CDR3具有與SEQ ID NO16表示的氨基酸序列有至少85％一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
5.權(quán)利要求1的抗體，其中所述重鏈包含的重鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO10表示的氨基酸序列有至少90％一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
6.權(quán)利要求1的抗體，其中所述重鏈包含人重鏈CDR2，所述CDR2具有與SEQ ID NO18表示的氨基酸序列有至少80％一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
7.權(quán)利要求1的抗體，所述抗體包含(a)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO10表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO12表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；(b)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO14表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO16表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；(c)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO18表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO16表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；或者(d)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO22表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO16表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
8.權(quán)利要求1的抗體，其中所述重鏈包含的重鏈可變區(qū)具有SEQID NO10表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，所述輕鏈包含的輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO12表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
9.權(quán)利要求1的抗體，其中所述重鏈包含可變區(qū)和恒定區(qū)，其中所述可變區(qū)包含SEQ ID NO10表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合或免疫原性片段。
10.權(quán)利要求9的抗體，其中所述重鏈包含任何SEQ ID NO14、SEQ ID NO18、SEQ ID NO22表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合或免疫原性片段。
11.權(quán)利要求1的抗體，其中所述輕鏈包含可變區(qū)和恒定區(qū)，其中所述可變區(qū)包含SEQ ID NO12表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合或免疫原性片段。
12.權(quán)利要求11的抗體，其中所述重鏈包含SEQ ID NO16表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合或免疫原性片段。
13.權(quán)利要求1的抗體，所述抗體包含a.人重鏈框架區(qū)、人重鏈CDR1區(qū)、人重鏈CDR2區(qū)和人重鏈CDR3區(qū)，其中所述人重鏈CDR3區(qū)是SEQ ID NO14所示的重鏈CDR3區(qū)；b.人輕鏈框架區(qū)、人輕鏈CDR1區(qū)、人輕鏈CDR2區(qū)和人輕鏈CDR3區(qū)，其中所述人輕鏈CDR3區(qū)是SEQ ID NO16所示的輕鏈CDR3區(qū)。
14.權(quán)利要求13的分離人抗體，其中所述人重鏈CDR2區(qū)是SEQID NO18所示的重鏈CDR2區(qū)，所述人輕鏈CDR2區(qū)是SEQ ID NO20所示的輕鏈CDR2區(qū)。
15.權(quán)利要求13的分離人抗體，其中所述人重鏈CDR1區(qū)是SEQID NO22所示的重鏈CDR1區(qū)，所述人輕鏈CDR1區(qū)是SEQ ID NO24所示的輕鏈CDR1區(qū)。
16.權(quán)利要求13的抗體，其中所述抗體以約1×10-9或更低的KD與人NGF多肽解離，在標(biāo)準(zhǔn)的體外試驗中以約1×10-8M或更低的IC50中和人NGF生物活性。
17.權(quán)利要求16的抗體，其中所述抗體以約1×10-10或更低的KD與人NGF多肽解離，在標(biāo)準(zhǔn)的體外試驗中以約1×10-9M或更低的IC50中和人NGF生物活性。
18.權(quán)利要求17的抗體，其中所述抗體以約1×10-11或更低的KD與人NGF多肽解離，在標(biāo)準(zhǔn)的體外試驗中以約0.2×10-9M或更低的IC50中和人NGF生物活性。
19.權(quán)利要求1的抗體，其中所述重鏈和輕鏈通過柔性連接基團(tuán)連接，形成單鏈抗體。
20.權(quán)利要求19的抗體，所述抗體是單鏈Fv抗體。
21.權(quán)利要求1的抗體，所述抗體是Fab抗體。
22.權(quán)利要求1的抗體，所述抗體是Fab′抗體。
23.權(quán)利要求1的抗體，所述抗體是(Fab′)2抗體。
24.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是完全人抗體。
25.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體抑制NGF信號傳導(dǎo)。
26.一種治療患者中疾病的方法，所述疾病由NGF的表達(dá)增加或?qū)GF的敏感性提高導(dǎo)致，所述方法包括給予患者藥物有效量的權(quán)利要求25的抗體。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述疾病是急性痛、牙痛、外傷導(dǎo)致的疼痛、外科手術(shù)疼痛、截肢或膿腫導(dǎo)致的疼痛、灼痛、脫髓鞘病、三叉神經(jīng)痛、癌癥、慢性酒精中毒、中風(fēng)、丘腦痛綜合征、糖尿病、獲得性免疫缺陷綜合征(“AIDS”)、毒素、化療、一般性頭痛、偏頭痛、叢集性頭痛、混合型血管或非血管綜合征、緊張性頭痛、一般炎癥、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病、狼瘡、骨關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、炎性腸病、過敏性腸綜合征、炎性眼病、炎性或不穩(wěn)定性膀胱功能障礙、牛皮癬、炎性組分造成的皮膚不適、曬傷、心炎、皮炎、肌炎、神經(jīng)炎、膠原血管病、慢性炎性疾病、炎性疼痛及相關(guān)痛覺過敏和異常性疼痛、神經(jīng)性疼痛及相關(guān)痛覺過敏和異常性疼痛、糖尿病性神經(jīng)性疼痛、灼痛、交感神經(jīng)維持的疼痛、傳入神經(jīng)阻滯綜合征、哮喘、上皮組織損傷或功能紊亂、單純皰疹、在呼吸、泌尿生殖、胃腸或者血管區(qū)域的內(nèi)臟活動障礙、創(chuàng)傷、燒傷、過敏性皮膚反應(yīng)、瘙癢、白癜風(fēng)、一般性胃腸機能紊亂、結(jié)腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管舒縮性或過敏性鼻炎或者支氣管病、痛經(jīng)、消化不良、胃食管反流、胰腺炎或內(nèi)臟痛。
28.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含藥物可接受的載體和治療有效量的權(quán)利要求25的抗體。
29.一種治療患者中疾病的方法，所述疾病由NGF的表達(dá)增加或?qū)GF的敏感性提高導(dǎo)致，所述方法包括給予患者權(quán)利要求28的藥物組合物。
30.一種檢測生物樣品中的NGF的方法，所述方法包括a.在能讓抗體結(jié)合NGF的條件下使樣品與權(quán)利要求1的抗體接觸；b.測量樣品中結(jié)合抗體的水平。
31.一種特異性結(jié)合神經(jīng)生長因子的分離人抗體，所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈包含的重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO10、SEQ ID NO79、SEQ ID NO81、SEQ ID NO83、SEQ ID NO85或SEQ ID NO87表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
32.權(quán)利要求31的抗體，其中所述重鏈包含的重鏈可變區(qū)包含與任何SEQ ID NO81、SEQ ID NO83、SEQ ID NO85、SEQ ID NO87或SEQ ID NO79表示的氨基酸序列有至少90％一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
33.一種特異性結(jié)合NGF的分離人抗體，所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述輕鏈包含的輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO12、SEQ IDNO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84、SEQ ID NO86、SEQ ID NO88、SEQ ID NO89、SEQ ID NO90、SEQ ID NO91或SEQ ID NO131表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
34.權(quán)利要求33的分離人抗體，其中所述輕鏈包含的輕鏈可變區(qū)包含與任何SEQ ID NO12、SEQ ID NO80、SEQ ID NO88、SEQ IDNO89、SEQ ID NO90、SEQ ID NO91、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84、SEQ ID NO86或SEQ ID NO131表示的氨基酸序列有至少85％一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
35.權(quán)利要求33的抗體，其中所述輕鏈包含的輕鏈可變區(qū)包含如下氨基酸序列a.與SEQ ID NO80表示的氨基酸序列有至少89％或94％的一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；b.與SEQ ID NO88表示的氨基酸序列有至少91％或94％的一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；c.與SEQ ID NO89表示的氨基酸序列有至少86％或87％的一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；d.與SEQ ID NO90表示的氨基酸序列有至少87％、91％或94％的一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；e.與SEQ ID NO91表示的氨基酸序列有至少86％、94％、96％或99％的一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；f.與SEQ ID NO82表示的氨基酸序列有至少91％、95％或96％的一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；g.與SEQ ID NO84表示的氨基酸序列有至少86％、94％、95％、98％或99％的一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；h.與SEQ ID NO86表示的氨基酸序列有至少86％、94％、95％、98％或99％的一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；或者i.與SEQ ID NO131表示的氨基酸序列有至少86％、89％、91％或96％的一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
36.一種特異性結(jié)合NGF的分離人抗體，所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈包含任何SEQ ID NO14、SEQ ID NO18、SEQ IDNO22、SEQ ID NO92、SEQ ID NO93、SEQ ID NO94、SEQ IDNO98、SEQ ID NO99、SEQ ID NO100、SEQ ID NO104、SEQ ID NO105、SEQ ID NO106、SEQ ID NO110、SEQ ID NO111、SEQ ID NO112、SEQ ID NO116、SEQ ID NO117或SEQ ID NO118表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
37.權(quán)利要求36的分離人抗體，其中所述重鏈包含人重鏈CDR2，其中所述重鏈CDR2是與SEQ ID NO99、SEQ ID NO106、SEQ ID NO117、SEQ ID NO111表示的氨基酸序列有至少80％一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
38.一種特異性結(jié)合NGF的分離人抗體，所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述輕鏈包含任何SEQ ID NO16、SEQ ID NO20、SEQ IDNO24、SEQ ID NO95、SEQ ID NO96、SEQ ID NO97、SEQ ID NO101、SEQ ID NO102、SEQ ID NO103、SEQ ID NO107、SEQ ID NO108、SEQ ID NO109、SEQ ID NO113、SEQ ID NO114、SEQ ID NO115或者任何SEQ ID NO119-134表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
39.權(quán)利要求38的分離人抗體，所述抗體包含人輕鏈CDR1，其中所述CDR1是與SEQ ID NO101、SEQ ID NO95、SEQ ID NO119、SEQ ID NO122、SEQ ID NO125、SEQ ID NO107、SEQ ID NO113表示的氨基酸序列有至少85％一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
40.權(quán)利要求38的分離人抗體，所述抗體包含人輕鏈CDR3，其中所述CDR3是與SEQ ID NO103、SEQ ID NO97、SEQ ID NO121、SEQ ID NO127、SEQ ID NO130、SEQ ID NO109、SEQ ID NO115、SEQ ID NO134表示的氨基酸序列有至少85％一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
41.一種特異性結(jié)合NGF的分離人抗體，所述抗體包含的重鏈或重鏈片段包含CDR3，所述CDR3包含選自SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO94、SEQ ID NO97、SEQ ID NO100、SEQ ID NO103、SEQ ID NO106、SEQ ID NO109、SEQ ID NO112、SEQ ID NO115、SEQ ID NO118、SEQ ID NO121、SEQ ID NO124、SEQ ID NO127、SEQ ID NO130、SEQ ID NO134和其變體的氨基酸序列，其中所述變體包含不超過一個氨基酸置換、插入或缺失。
42.一種特異性結(jié)合NGF的分離人抗體，所述抗體包含與選自SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20和SEQ ID NO22和其變體的序列有至少90％一致性的氨基酸序列，其中所述變體包含不超過一個氨基酸置換、插入或缺失。
43.權(quán)利要求31、33、36、38、41或42的抗體，其中所述重鏈和輕鏈通過柔性連接基團(tuán)連接，形成單鏈抗體。
44.權(quán)利要求43的抗體，所述抗體是單鏈Fv抗體。
45.權(quán)利要求31、33、36、38、41或42的抗體，所述抗體是Fab抗體。
46.權(quán)利要求31、33、36、38、41或42的抗體，所述抗體是Fab′抗體。
47.權(quán)利要求31、33、36、38、41或42的抗體，所述抗體是(Fab′)2抗體。
48.權(quán)利要求31、33、36、38、41或42的抗體，其中所述抗體是完全人抗體。
49.權(quán)利要求31、33、36、38、41或42的抗體，其中所述抗體抑制NGF的信號傳導(dǎo)。
50.一種治療患者中疾病的方法，所述疾病由NGF的表達(dá)增加或?qū)GF的敏感性提高導(dǎo)致，所述方法包括給予患者藥物有效量的權(quán)利要求49的抗體。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述疾病是是急性痛、牙痛、外傷導(dǎo)致的疼痛、外科手術(shù)疼痛、截肢或膿腫導(dǎo)致的疼痛、灼痛、脫髓鞘病、三叉神經(jīng)痛、癌癥、慢性酒精中毒、中風(fēng)、丘腦痛綜合征、糖尿病、獲得性免疫缺陷綜合征(“AIDS”)、毒素、化療、一般性頭痛、偏頭痛、叢集性頭痛、混合型血管或非血管綜合征、緊張性頭痛、一般炎癥、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病、狼瘡、骨關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、炎性腸病、過敏性腸綜合征、炎性眼病、炎性或不穩(wěn)定性膀胱功能障礙、牛皮癬、炎性組分造成的皮膚不適、曬傷、心炎、皮炎、肌炎、神經(jīng)炎、膠原血管病、慢性炎性疾病、炎性疼痛及相關(guān)痛覺過敏和異常性疼痛、神經(jīng)性疼痛及相關(guān)痛覺過敏和異常性疼痛、糖尿病性神經(jīng)性疼痛、灼痛、交感神經(jīng)維持的疼痛、傳入神經(jīng)阻滯綜合征、哮喘、上皮組織損傷或功能紊亂、單純皰疹、在呼吸、泌尿生殖、胃腸或者血管區(qū)域的內(nèi)臟活動障礙、創(chuàng)傷、燒傷、過敏性皮膚反應(yīng)、瘙癢、白癜風(fēng)、一般性胃腸機能紊亂、結(jié)腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管舒縮性或過敏性鼻炎或者支氣管病、痛經(jīng)、消化不良、胃食管反流、胰腺炎或內(nèi)臟痛。
52.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含藥物可接受的載體和治療有效量的權(quán)利要求49的抗體。
53.一種治療患者中疾病的方法，所述疾病由NGF的表達(dá)增加或?qū)GF的敏感性提高導(dǎo)致，所述方法包括給予患者權(quán)利要求52的藥物組合物。
54.一種檢測生物樣品中的NGF的方法，所述方法包括a.在能讓抗體結(jié)合NGF的條件下使樣品與權(quán)利要求31、33、36、38、41或42的抗體接觸；b.測量樣品中結(jié)合抗體的水平。
55.一種核酸分子，所述核酸分子編碼權(quán)利要求31、33、36、38、41或42的抗體。
56.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求55的核酸。
57.一種分離的細(xì)胞系，所述分離細(xì)胞系產(chǎn)生權(quán)利要求31、33、36、38、41或42任一項的抗體。
58.一種NGF特異性結(jié)合物，所述結(jié)合物包含至少一種選自SEQID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ IDNO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22，以及任何SEQ ID NO79-130的氨基酸序列，且其中所述抗體能結(jié)合NGF。
59.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含藥物可接受的載體和治療有效量的權(quán)利要求58的結(jié)合物。
60.一種治療患者中疾病的方法，所述疾病由NGF的表達(dá)增加或?qū)GF的敏感性提高導(dǎo)致，所述方法包括給予患者權(quán)利要求58的藥物組合物。
61.權(quán)利要求58的結(jié)合物，所述結(jié)合物是蛋白質(zhì)。
62.一種核酸分子，所述核酸分子編碼權(quán)利要求61的結(jié)合物。
63.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求62的核酸。
64.一種分離的細(xì)胞系，所述分離細(xì)胞系產(chǎn)生權(quán)利要求63的結(jié)合物。
65.一種治療患者中疾病的方法，所述疾病由NGF的表達(dá)增加或?qū)GF的敏感性提高導(dǎo)致，所述方法包括給予患者藥物有效量的權(quán)利要求58的結(jié)合物。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述疾病是是急性痛、牙痛、外傷導(dǎo)致的疼痛、外科手術(shù)疼痛、截肢或膿腫導(dǎo)致的疼痛、灼痛、脫髓鞘病、三叉神經(jīng)痛、癌癥、慢性酒精中毒、中風(fēng)、丘腦痛綜合征、糖尿病、獲得性免疫缺陷綜合征(“AIDS”)、毒素、化療、一般性頭痛、偏頭痛、叢集性頭痛、混合型血管或非血管綜合征、緊張性頭痛、一般炎癥、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病、狼瘡、骨關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、炎性腸病、過敏性腸綜合征、炎性眼病、炎性或不穩(wěn)定性膀胱功能障礙、牛皮癬、炎性組分造成的皮膚不適、曬傷、心炎、皮炎、肌炎、神經(jīng)炎、膠原血管病、慢性炎性疾病、炎性疼痛及相關(guān)痛覺過敏和異常性疼痛、神經(jīng)性疼痛及相關(guān)痛覺過敏和異常性疼痛、糖尿病性神經(jīng)性疼痛、灼痛、交感神經(jīng)維持的疼痛、傳入神經(jīng)阻滯綜合征、哮喘、上皮組織損傷或功能紊亂、單純皰疹、在呼吸、泌尿生殖、胃腸或者血管區(qū)域的內(nèi)臟活動障礙、創(chuàng)傷、燒傷、過敏性皮膚反應(yīng)、瘙癢、白癜風(fēng)、一般性胃腸機能紊亂、結(jié)腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管舒縮性或過敏性鼻炎或者支氣管病、痛經(jīng)、消化不良、胃食管反流、胰腺炎或內(nèi)臟痛。
67.一種檢測生物樣品中的NGF的方法，所述方法包括a.在能讓結(jié)合物結(jié)合NGF的條件下使樣品與權(quán)利要求58的結(jié)合物接觸；b.測量樣品中結(jié)合抗體的水平。
68.一種分離核酸分子，所述分離核酸分子包含編碼任何SEQ IDNO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO40、SEQ ID NO41、SEQ ID NO42、SEQ ID NO43、SEQ ID NO44或者任何SEQ ID NO79-134表示的氨基酸的核苷酸序列。
69.一種特異性結(jié)合NGF的分離人抗體或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，其中所述抗體或片段包含的重鏈可變區(qū)包含a)包含下式氨基酸序列的CDR1區(qū)a1a2a3a4a5其中a1是極性親水性氨基酸殘基；a2是芳族氨基酸殘基；a3是脂族、極性疏水性、芳族氨基酸殘基；a4是中性疏水性或脂族氨基酸殘基；a5是脂族或極性親水性氨基酸殘基；b)包含下式氨基酸序列的CDR2區(qū)b1b2b3b4b5b6b7b8b9b10b11b12b13b14b15b16b17其中b1是脂族、極性疏水性或芳族氨基酸殘基；b2是脂族疏水性氨基酸殘基；b3是極性親水性或芳族氨基酸殘基；b4是極性親水性、疏水性或芳族氨基酸殘基；b5-b9獨立是極性親水性或脂族氨基酸殘基；b10是極性親水性、芳族或脂族氨基酸殘基；b11是芳族或疏水性氨基酸殘基；b12是脂族疏水性或極性親水性氨基酸殘基；b13是脂族、疏水性或極性親水性氨基酸殘基；b14和b16獨立是極性親水性氨基酸殘基；b15是脂族或芳族疏水性氨基酸殘基；b17是脂族酸性氨基酸殘基；c)包含下式氨基酸序列的CDR3區(qū)c1c2c3c4c5c6c7c8c9c10c11c12c13c14c15c16c17其中c1不存在或者是脂族氨基酸殘基；c2不存在或者是極性親水性或芳族疏水性氨基酸殘基；c3和c4獨立是不存在或者極性親水性、芳族疏水性或脂族氨基酸殘基；c5不存在或者是極性親水性、脂族或芳族氨基酸殘基；c6不存在或者是極性親水性或脂族氨基酸殘基；c7是極性親水性或脂族氨基酸殘基；c8是極性親水性、疏水性或芳族氨基酸殘基；c9是極性親水性、脂族或芳族疏水性氨基酸殘基；c10是極性親水性、芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸殘基；c11-c13獨立是極性親水性或芳族疏水性氨基酸殘基；c14是脂族或芳族疏水性氨基酸殘基；c15是極性親水性或中性疏水性氨基酸殘基；c16是不存在或者極性親水性氨基酸殘基；c17是芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸殘基，且其中所述抗體或片段以約1×10-9M或更低的KD與人NGF多肽解離，在標(biāo)準(zhǔn)的體外試驗中以約1×10-8M或更低的IC50中和人NGF生物活性。
70.權(quán)利要求69的抗體或片段，其中a1是極性親水性氨基酸殘基；a2是芳族疏水性氨基酸殘基；a3是脂族疏水性氨基酸殘基；a4是中性疏水性；a5是極性親水性氨基酸殘基；b1是脂族或芳族氨基酸殘基；b2是Ile；b3是極性親水性氨基酸殘基；b4是極性親水性或芳族氨基酸殘基；b5-b9獨立是極性親水性或脂族氨基酸殘基；b10是脂族氨基酸殘基；b11是Tyr；b12是脂族疏水性氨基酸殘基；b13是脂族或極性親水性氨基酸殘基；b14和b16獨立是極性親水性氨基酸殘基；b15是脂族疏水性氨基酸殘基；b17是脂族酸性氨基酸殘基；c1不存在或者是脂族氨基酸殘基；c2不存在或者是極性親水性或芳族疏水性氨基酸殘基；c3和c4獨立是不存在或者是極性親水性、芳族疏水性或脂族氨基酸殘基；c5不存在或者是極性親水性氨基酸殘基；c6不存在或者是極性親水性或脂族氨基酸殘基；c7是極性親水性或脂族氨基酸殘基；c8是極性親水性、疏水性或芳族氨基酸殘基；c9是極性親水性、脂族或芳族疏水性氨基酸殘基；c10是極性親水性、芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸殘基；c11-c13獨立是極性親水性或芳族疏水性氨基酸殘基；c14是脂族或芳族疏水性氨基酸殘基；c15是極性親水性或中性疏水性氨基酸殘基；c16不存在或者是極性親水性氨基酸殘基；c17是芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸殘基。
71.權(quán)利要求69的抗體或片段，其中a1是Ser、Asp或Thr；a2是Tyr；a3是Ala、Ser、Trp或Gly；a4是Met或Ile；A5是His、Gly或Asn；b1是Tyr、Gly、Ile或Asp；b2是Ile；b3是Ser、Thr、Tyr或Asn；b4是Trp、Arg或Pro；b5是Ser、Asn或Gly；b6是Ser、Arg、Asp或Gly；b7是Ser、His或Gly；b8是Ser、Ile、Asp或Thr；b9是Leu、Ile或Thr；b10是Gly、Lys或Phe；b11是Tyr；b12是Ala或Ser；b13是Asp、Gly或Pro；b14是Ser；b15是Val或Phe；b16是Lys或Gln；b17是Gly；c1不存在或是脂族氨基酸殘基；c2不存在或是Tyr；c3和c4獨立是不存在、Try、Asn、Val或Glu；c5是不存在、Ser、Gly或Trp；c6是不存在、Ser、Gly、Glu或Leu；c7是Gly、Arg或Asp；c8是Trp、Pro、Ser或Thr；c9是His、Gly或Tyr；c10是Val、Tyr或Arg；c11-c13獨立是Ser、Phe、Tyr、Asp或Asn；c14是Phe、Val或Gly；c15是Met或Asp；c16是不存在、Asp或Asn；c17是Tyr或Val。
72.權(quán)利要求69的抗體或片段，其中a1是Ser或Asp；a2是Tyr；a3是Ala或Ser；a4是Met或Ile；a5是His或Asn；b1是Tyr或Gly；b2是Ile；b3是Ser、Thr、Tyr或Asn；b4是Trp、Arg或Pro；b5是Ser或Asn；b6是Ser或Arg；b7是His或Gly；b8是Ile或Thr；b9是Leu、Ile或Thr；b10是Gly或Phe；b11是Tyr；b12是Ala或Ser；b13是Asp或Gly；b14是Ser；b15是Val或Phe；b16是Lys或Gln；b17是Gly；c1不存在或是Gly；c2不存在或是Tyr；c3和c4獨立是不存在、Tyr、Gly或Val；c5不存在或是Ser；c6是Ser或Gly；c7是Gly或Arg；c8是Trp或Pro；c9是His、Gly或Tyr；c10是Val或Tyr；c11-c13獨立是Ser、Tyr、Phe或Asp；c14是Phe或Val；c15是Met或Asp；c16不存在或是Asp；c17是Tyr或Val。
73.權(quán)利要求69的抗體，其中a)重鏈CDR1具有SEQ ID NO22表示的氨基酸序列，重鏈CDR2具有SEQ ID NO18表示的氨基酸序列，重鏈CDR3具有SEQ ID NO14表示的氨基酸序列；b)重鏈CDR1具有SEQ ID NO92表示的氨基酸序列，重鏈CDR2具有SEQ ID NO93表示的氨基酸序列，重鏈CDR3具有SEQ ID NO94表示的氨基酸序列；c)重鏈CDR1具有SEQ ID NO98表示的氨基酸序列，重鏈CDR2具有SEQ ID NO99表示的氨基酸序列，重鏈CDR3具有SEQ ID NO100表示的氨基酸序列；d)重鏈CDR1具有SEQ ID NO104表示的氨基酸序列，重鏈CDR2具有SEQ ID NO105表示的氨基酸序列，重鏈CDR3具有SEQ ID NO106表示的氨基酸序列；e)重鏈CDR1具有SEQ ID NO110表示的氨基酸序列，重鏈CDR2具有SEQ ID NO111表示的氨基酸序列，重鏈CDR3具有SEQ ID NO112表示的氨基酸序列；f)重鏈CDR1具有SEQ ID NO116表示的氨基酸序列，重鏈CDR2具有SEQ ID NO117表示的氨基酸序列，重鏈CDR3具有SEQ ID NO118表示的氨基酸序列。
74.一種特異性結(jié)合NGF的分離人抗體或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，其中所述抗體或片段包含的輕鏈可變區(qū)包含a)包含下式氨基酸序列的CDR1區(qū)a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12其中a1是極性親水性氨基酸殘基；a2、a11和a12獨立是脂族或疏水性氨基酸殘基；a3、a5、a7和a8獨立是脂族、極性親水性或疏水性氨基酸殘基；a4是極性親水性氨基酸殘基；a6是脂族或疏水性氨基酸殘基；a9不存在，或是脂族或極性親水性氨基酸殘基；a10是脂族、芳族或疏水性氨基酸殘基；b)包含下式氨基酸序列的CDR2區(qū)b1b2b3b4b5b6b7其中b1是脂族、極性疏水性或疏水性氨基酸殘基；b2是脂族或疏水性氨基酸殘基；b3和b4獨立是極性親水性、脂族或疏水性氨基酸殘基；b5是極性親水性或脂族疏水性氨基酸殘基；b6是極性親水性或脂族疏水性氨基酸殘基；b7是極性親水性氨基酸殘基；c)包含下式氨基酸序列的CDR3區(qū)c1c2c3c4c5c6c7c8c9c10c11c12c13c14c15c16c17其中c1和c2獨立是極性親水性氨基酸殘基；c3是極性親水性、脂族或疏水性氨基酸殘基；c4、c5和c6獨立是脂族、極性親水性或疏水性氨基酸殘基；c7不存在或者是極性親水性或脂族疏水性氨基酸殘基；c8是極性親水性或疏水性氨基酸殘基；c9是極性親水性氨基酸殘基，且其中所述抗體或者片段以約1×10-9或更低的KD與人NGF多肽解離，在標(biāo)準(zhǔn)的體外試驗中以約1×10-8M或更低的IC50中和人NGF生物活性。
75.權(quán)利要求74的抗體或片段，其中a1、a3、a4、a7和a8獨立是極性親水性氨基酸殘基；a2、a6、a11和a12獨立是脂族疏水性氨基酸殘基；a5是極性親水性或脂族氨基酸殘基；a9不存在，或是脂族或極性親水性氨基酸殘基；a10是脂族或芳族氨基酸殘基；b1是脂族、極性疏水性或疏水性氨基酸殘基；b2是脂族疏水性氨基酸殘基；b3、b4和b7獨立是極性親水性氨基酸殘基；b5和b6獨立是極性親水性或脂族疏水性氨基酸殘基；c1和c2獨立是極性親水性氨基酸殘基；c3是極性親水性、脂族或疏水性氨基酸殘基；c4、c5和c6獨立是脂族、極性親水性或疏水性氨基酸殘基；c7不存在或是脂族疏水性氨基酸殘基；c8是疏水性氨基酸殘基；c9是極性親水性氨基酸殘基。
76.權(quán)利要求75的抗體或片段，其中a1、a3、a4和a7分別是Arg、Ser、Gln和Ser；a2是Ala；a5是Gly或Ser；a8是Ser或Ile；a9是不存在、Ser或Gly；a10是Ala、Tyr、Trp或Phe；b1是Asp、Gly、Ala或Val；b2和b3分別是Ala和Ser；b4是Ser或Asn；b5是Leu或Arg；b6是Glu、Ala或Gln；b7是Ser或Thr；c1和c2是Gln；c3是Phe、Tyr、Arg或Ala；c4是Asn、Gly或Ser；c5是Ser或Asn；c6是Tyr、Ser、Trp或Phe；c7是不存在、Pro或His；c8是Leu、Trp、Tyr或Arg；c9是Thr。
77.權(quán)利要求75的抗體或片段，其中a1、a2、a3、a4和a7分別是Arg、Ala、Ser、Gln和Ser；a5是Gly或Ser；a8是Ser或Ile；a9是不存在、Ser或Gly；a10是Ala或Tyr；b1是Asp或Gly；b2和b3分別是Ala和Ser；b4是Ser或Asn；b5是Leu或Arg；b6是Glu、Ala或Gln；b7是Ser或Thr；c1和c2是Gln；c3是Phe、Tyr、Arg或Ala；c4是Asn、Gly或Ser；c5是Ser或Asn；c6是Tyr、Ser、Trp或Phe；c7是不存在、Pro或His；c8是Leu、Trp、Tyr或Arg；c9是Thr。
78.權(quán)利要求74的抗體，其中a)輕鏈CDR1具有SEQ ID NO24表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO20表示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ ID NO16表示的氨基酸序列；b)輕鏈CDR1具有SEQ ID NO95表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO96表示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ ID NO97表示的氨基酸序列；c)輕鏈CDR1具有SEQ ID NO101表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO102表示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ ID NO103表示的氨基酸序列；d)輕鏈CDR1具有SEQ ID NO107表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO108表示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ ID NO109表示的氨基酸序列；e)輕鏈CDR1具有SEQ ID NO113表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO114表示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ ID NO115表示的氨基酸序列；f)輕鏈CDR1具有SEQ ID NO119表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO120表示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ ID NO121表示的氨基酸序列；g)輕鏈CDR1具有SEQ ID NO122表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO123表示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ ID NO124表示的氨基酸序列；h)輕鏈CDR1具有SEQ ID NO125表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO126表示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ ID NO127表示的氨基酸序列；i)輕鏈CDR1具有SEQ ID NO128表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO129表示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ ID NO130表示的氨基酸序列；j)輕鏈CDR1具有SEQ ID NO132表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO133表示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ ID NO134表示的氨基酸序列。
79.一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼權(quán)利要求69-78任一項的抗體或片段。
80.一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含權(quán)利要求79的多核苷酸。
81.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求80的表達(dá)載體。
82.權(quán)利要求81的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
83.權(quán)利要求82的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
84.一種用以治療疼痛病癥或疾病的藥物，所述病癥或疾病與NGF的表達(dá)增加或?qū)GF的敏感性提高有關(guān)，所述藥物包含藥物有效量的單克隆抗體或其免疫功能性免疫球蛋白片段，或者單克隆抗體或片段的藥物可接受鹽，及藥物可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，其中所述單克隆抗體是至少一種權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
85.權(quán)利要求84的藥物，其中所述單克隆抗體包含(a)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO10表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO12表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；(b)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO14表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO16表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；(c)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO18表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO16表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；或者(d)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO20表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO16表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
86.一種用以治療疼痛病癥或疾病的藥物，所述病癥或疾病與NGF的表達(dá)增加或?qū)GF的敏感性提高有關(guān)，所述藥物包含藥物有效量的單克隆抗體或其免疫功能性免疫球蛋白片段，及藥物可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，所述抗體或片段包含與SEQ ID NO10表示的氨基酸序列有至少80％序列一致性的氨基酸序列，或者與SEQ IDNO12表示的氨基酸序列有至少90％序列一致性的氨基酸序列。
87.權(quán)利要求86的藥物，其中所述單克隆抗體以約1×10-9M或更低的KD與人NGF多肽解離，在標(biāo)準(zhǔn)的體外試驗中以約1×10-8M或更低的IC50中和人NGF生物活性。
88.權(quán)利要求86的藥物，其中所述抗體以約1×10-10M或更低的KD與人NGF多肽解離，在標(biāo)準(zhǔn)的體外試驗中以約1×10-9M或更低的IC50中和人NGF生物活性。
89.權(quán)利要求86的藥物，其中所述抗體以約1×10-11M或更低的KD與人NGF多肽解離，在標(biāo)準(zhǔn)的體外試驗中以約0.2×10-9M或更低的IC50中和人NGF生物活性。
90.藥物有效量的權(quán)利要求1的抗體在制備藥物中的用途，所述藥物適合用于治療與NGF的表達(dá)增加或?qū)GF的敏感性提高有關(guān)的疼痛病癥或疾病。
91.權(quán)利要求90的用途，其中所述單克隆抗體以約1×10-9M或更低的KD與人NGF多肽解離，在標(biāo)準(zhǔn)的體外試驗中以約1×10-8M或更低的IC50中和人NGF生物活性。
92.權(quán)利要求90的用途，其中所述抗體以約1×10-10M或更低的KD與人NGF多肽解離，在標(biāo)準(zhǔn)的體外試驗中以約1×10-9M或更低的IC50中和人NGF生物活性。
93.權(quán)利要求90的用途，其中所述抗體以約1×10-11M或更低的KD與人NGF多肽解離，在標(biāo)準(zhǔn)的體外試驗中以約0.2×10-9M或更低的IC50中和人NGF生物活性。
94.權(quán)利要求93的用途，其中所述疼痛病癥或疾病選自急性痛、牙痛、外傷導(dǎo)致的疼痛、外科手術(shù)疼痛、截肢或膿腫導(dǎo)致的疼痛、灼痛、脫髓鞘病、三叉神經(jīng)痛、癌癥、慢性酒精中毒、中風(fēng)、丘腦痛綜合征、糖尿病、獲得性免疫缺陷綜合征(“AIDS”)、毒素、化療、一般性頭痛、偏頭痛、叢集性頭痛、混合型血管或非血管綜合征、緊張性頭痛、一般炎癥、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病、狼瘡、骨關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、炎性腸病、過敏性腸綜合征、炎性眼病、炎性或不穩(wěn)定性膀胱功能障礙、牛皮癬、炎性組分造成的皮膚不適、曬傷、心炎、皮炎、肌炎、神經(jīng)炎、膠原血管病、慢性炎性疾病、炎性疼痛及相關(guān)痛覺過敏和異常性疼痛、神經(jīng)性疼痛及相關(guān)痛覺過敏和異常性疼痛、糖尿病性神經(jīng)性疼痛、灼痛、交感神經(jīng)維持的疼痛、傳入神經(jīng)阻滯綜合征、哮喘、上皮組織損傷或功能紊亂、單純皰疹、在呼吸、泌尿生殖、胃腸或者血管區(qū)域的內(nèi)臟活動障礙、創(chuàng)傷、燒傷、過敏性皮膚反應(yīng)、瘙癢、白癜風(fēng)、一般性胃腸機能紊亂、結(jié)腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管舒縮性或過敏性鼻炎或者支氣管病、痛經(jīng)、消化不良、胃食管反流、胰腺炎或內(nèi)臟痛。
95.一種特異性結(jié)合NGF的分離人抗體，其中所述抗體包含(a)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO79表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO80表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；(b)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO81表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO82表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；(c)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO83表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO84表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；或者(d)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO86表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO87表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
全文摘要
本發(fā)明提供了與人神經(jīng)生長因子(NGF)相互作用或結(jié)合并因此中和NGF功能的抗體。本發(fā)明還提供了所述抗體的藥物組合物，及通過給予藥物有效量的抗NGF抗體來中和NGF的功能、特別是治療NGF相關(guān)病癥(例如慢性疼痛)的方法。本發(fā)明也提供了用抗NGF抗體檢測樣品中NGF的量的方法。
文檔編號C12N5/10GK1849138SQ200480026242
公開日2006年10月18日 申請日期2004年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月15日
發(fā)明者K·D·小維爾德, J·J·S·特里諾爾, H·黃, H·伊諾埃, T·J·張, F·馬丁 申請人:安姆根有限公司, 米德列斯公司