專利名稱：蛋白質(zhì)從酵母的分泌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含核酸序列的表達(dá)構(gòu)建體，所述核酸序列編碼可通過酵母細(xì)胞加工的穿梭肽構(gòu)建體；涉及包含此類構(gòu)建體的對應(yīng)表達(dá)載體；涉及在其幫助下重組制備靶蛋白的方法；涉及用其轉(zhuǎn)化的宿主；涉及穿梭肽及編碼所述穿梭肽的核酸序列；涉及編碼與外源蛋白質(zhì)融合的此類穿梭肽的核酸序列；涉及用此種穿梭肽制備的疏水蛋白及涉及疏水蛋白用于涂布物體例如皮革的用途。
現(xiàn)有技術(shù)a)酵母中的表達(dá)酵母廣泛用作用于異源蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主。原因是酵母表達(dá)系統(tǒng)具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榕c細(xì)菌及其它真核細(xì)胞相比，酵母可以較高密度生長且能夠進(jìn)行蛋白質(zhì)糖基化及翻譯后修飾。此外，由于酵母對細(xì)胞裂解具有高度抗性且生長培養(yǎng)基一般包含低量外源蛋白質(zhì)，通過酵母產(chǎn)生及分泌的產(chǎn)物可以簡單方式純化。此外，酵母在便宜營養(yǎng)培養(yǎng)基中以高密度比其它真核細(xì)胞更快地生長。
在現(xiàn)有技術(shù)中可發(fā)現(xiàn)用于在酵母中表達(dá)及分泌異源蛋白質(zhì)的多種不同方法。因此，例如，US 5,642,487描述了用于在酵母中重組產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括用編碼結(jié)構(gòu)元件的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化酵母，所述結(jié)構(gòu)元件的表達(dá)盒編碼動(dòng)物肽神經(jīng)激素的前導(dǎo)序列、產(chǎn)生α-螺旋結(jié)構(gòu)的銜接頭序列、加工信號及結(jié)構(gòu)基因。
自現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)一步知道用通過酵母產(chǎn)生的信息素α-因子基因的調(diào)節(jié)元件控制酵母中異源蛋白質(zhì)的表達(dá)。因此，例如，α-因子信號前導(dǎo)肽序列用于表達(dá)異源蛋白質(zhì)(參照例如，US 5,010,182)。
此外，出版的美國專利申請US 2003/0077831公開了用于在酵母中表達(dá)異源蛋白質(zhì)的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含，側(cè)翼為合適轉(zhuǎn)錄起始及翻譯起始及終止序列的雜合前體多肽的編碼序列，所述雜合前體多肽的元件包含酵母分泌的蛋白質(zhì)的信號肽及前導(dǎo)肽和異源蛋白質(zhì)，其側(cè)翼為所述異源蛋白質(zhì)N末端及C末端前肽序列的異源蛋白質(zhì)。
b)疏水蛋白疏水蛋白為小的富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，其包含大約100個(gè)氨基酸殘基且具有令人感興趣的技術(shù)性質(zhì)。它們能使疏水性表面親水。它們使親水性表面成為疏水的。
然而，有許多關(guān)于疏水蛋白及其應(yīng)用的專利因此，例如，WO-A-96/41882描述了來自可食用真菌的疏水蛋白(參照SEQ ID NO21及22)。WO-A-00/58342涉及通過相提取對包含疏水蛋白的融合蛋白的純化。WO-A-01/57066描述了由于亞硫酸鹽處理，疏水蛋白的穩(wěn)定化、溶解及其相關(guān)經(jīng)改進(jìn)的應(yīng)用。WO-A-01/57076描述了通過吸附到特氟隆(Teflon)珠且通過去污劑如吐溫(Tween)于低溫洗脫純化疏水蛋白。WO-A-01/57528描述了通過應(yīng)用吐溫及達(dá)85攝氏度的溫度將疏水蛋白固定到表面。
WO-A-01/74864描述了絲狀細(xì)菌，特別是鏈霉菌種(Streptomyces sp.)的非典型疏水蛋白(僅僅一個(gè)二硫橋)，稱為RdIA及RdIB(參照SEQ ID NO19及20)。疏水蛋白用于多種物體如窗戶、隱形眼鏡、車輛的表面處理。進(jìn)一步建議在重組宿主中產(chǎn)生于此描述的蛋白質(zhì)，所述宿主釋放所述蛋白質(zhì)至培養(yǎng)基中。去除宿主后，預(yù)計(jì)包含疏水蛋白的培養(yǎng)基適合用于表面涂布。沒有提供實(shí)際表達(dá)及分泌的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供方法，所述方法可能使酵母中特別是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中表達(dá)的同源或特別是異源蛋白質(zhì)自酵母細(xì)胞分泌到周圍培養(yǎng)基中。特別地，提供了能自宿主細(xì)胞分泌重組產(chǎn)生的疏水蛋白的方法。
我們發(fā)現(xiàn)通過提供包含編碼穿梭肽構(gòu)建體的核酸序列的表達(dá)構(gòu)建體能實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，所述穿梭肽構(gòu)建體可通過酵母細(xì)胞加工，具有式(Sig-SP)并且所述表達(dá)構(gòu)建體在5’-3’方向包含核酸序列，其編碼a)信號肽(Si)，其可加工地連接b)所述酵母細(xì)胞分泌的至少一種穿梭肽(SP)。
通過構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)疏水蛋白DewA(具有根據(jù)SEQ IDNO13編碼序列的根據(jù)SEQ IN NO14的成熟蛋白質(zhì)；具有根據(jù)SEQ INNO15編碼核酸序列的信號序列SEQ ID NO16的前蛋白質(zhì))作為異源靶蛋白(Targ)的實(shí)例以模型方式示例實(shí)現(xiàn)以上目的。該蛋白質(zhì)為I類疏水蛋白，即能自組裝分泌的真菌外被蛋白的代表。
特別地，編碼靶蛋白(DewA)的DNA序列(SEQ ID NO13)與編碼粟酒裂殖酵母肽信息素(P因子，成熟P因子的根據(jù)SEQ ID NO6的氨基酸序列)的DNA序列(成熟P因子的SEQ ID NO5)的3’端融合。產(chǎn)生的融合蛋白包含用于分泌所述信息素所需的所有信號序列及與其融合的靶蛋白，特別是可去除的信號肽(SEQ ID NO4)。分泌包含融合蛋白的蛋白酶解加工。結(jié)果，信息素(P因子)(SEQ ID NO6)及靶蛋白(疏水蛋白，SEQ ID NO14)獨(dú)自分泌到培養(yǎng)基中。
本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)是令人驚奇的，因?yàn)镻因子前蛋白質(zhì)(成熟信息素的N末端)的實(shí)際調(diào)節(jié)元件控制顯然不足以控制酵母細(xì)胞對靶蛋白的分泌。只有應(yīng)用其中額外的共分泌蛋白質(zhì)組分(成熟信息素)可加工地位于待分泌的靶蛋白上游的構(gòu)建體才能使所述靶蛋白以所希望的方式分泌到培養(yǎng)基中。
發(fā)明詳述a)一般信息在說明書及附圖中蛋白質(zhì)序列一般以“單字母密碼”標(biāo)明。
根據(jù)本發(fā)明，通過宿主細(xì)胞，特別是通過酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)且通過內(nèi)源性細(xì)胞機(jī)制通過細(xì)胞膜從細(xì)胞分泌，優(yōu)選分泌至周圍培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)為“可分泌的”。
根據(jù)本發(fā)明，如果蛋白質(zhì)前體可通過在宿主細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外酶解加工轉(zhuǎn)化為成熟形式，那么蛋白質(zhì)前體(即原來表達(dá)形式的蛋白質(zhì)，例如在成熟的經(jīng)加工蛋白質(zhì)中不再存在N和/或C末端肽序列的前蛋白質(zhì))為“可加工的”。
如果待加工蛋白質(zhì)中的個(gè)別蛋白質(zhì)區(qū)通過肽鍵連接，該肽鍵可以通過宿主細(xì)胞蛋白酶切割，則存在“可加工的鍵”。
“加工”可在成熟經(jīng)加工蛋白質(zhì)(靶蛋白)序列的N末端發(fā)生，且適當(dāng)時(shí)也在C末端發(fā)生。
雖然“同源”靶蛋白原來在根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的宿主中表達(dá)且因此為宿主內(nèi)源性蛋白質(zhì)，由于用本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化所述宿主，它通過宿主細(xì)胞分泌。
“異源”靶蛋白原來在根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的宿主中不表達(dá)且因此不為內(nèi)源性宿主蛋白質(zhì)，但由于用本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化所述宿主，它通過宿主細(xì)胞分泌。
“穿梭肽”為在根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的宿主細(xì)胞中可加工的“穿梭肽構(gòu)建體”的部分。它與其在C和/或N末端，優(yōu)選N末端連接的一個(gè)或多個(gè)可加工的調(diào)節(jié)肽片段，如信號序列、前導(dǎo)序列一起形成所述穿梭肽構(gòu)建體。與信號肽相反，例如，穿梭肽為通過宿主細(xì)胞分泌的多肽。優(yōu)選在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行調(diào)節(jié)元件的加工。甚至優(yōu)選穿梭肽在C末端與靶蛋白可加工地融合時(shí)，穿梭肽也保持可分泌的。此C末端加工，即在分泌過程中蛋白酶解除去靶蛋白優(yōu)選例如在通過宿主細(xì)胞包膜期間，或在細(xì)胞外間隙，例如在周圍培養(yǎng)基中，通過內(nèi)源性細(xì)胞蛋白酶進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明的“表達(dá)構(gòu)建體”或“表達(dá)盒”包含在特定宿主系統(tǒng)如，特別是酵母細(xì)胞中控制表達(dá)所需的用于轉(zhuǎn)錄的起始及終止信號及適當(dāng)時(shí)翻譯信號，其有效連接如以上定義的可加工的穿梭肽構(gòu)建體的編碼核酸序列。表達(dá)構(gòu)建體特別包含轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。編碼序列的5’上游包含在宿主細(xì)胞中可操作的組成型或誘導(dǎo)型、自身或異源的、天然或合成的啟動(dòng)子。此外表達(dá)構(gòu)建體包含許多限制酶切位點(diǎn)，例如用于將所述構(gòu)建體插入到表達(dá)載體中的限制酶切位點(diǎn)。此外，表達(dá)構(gòu)建體可包含選擇標(biāo)記基因。
“表達(dá)載體”描述了通過將本發(fā)明的表達(dá)盒導(dǎo)入到復(fù)制子，例如導(dǎo)入到質(zhì)粒、粘?；虿《局锌色@得的構(gòu)建體。此種載體能自主復(fù)制或能整合到宿主基因組中且包含的所需的控制序列，所述所需的控制序列用于控制編碼如以上定義的可加工穿梭肽構(gòu)建體的根據(jù)本發(fā)明的核酸序列的轉(zhuǎn)錄和(適當(dāng)時(shí))翻譯。
b)優(yōu)選實(shí)施方案本發(fā)明首先涉及表達(dá)構(gòu)建體，所述表達(dá)構(gòu)建體包含編碼可通過酵母細(xì)胞加工，具有式(Sig-SP)的穿梭肽構(gòu)建體的核酸序列并且在5’-3’方向包含核酸序列，其編碼a)信號肽(Sig)，其可加工地連接b)通過所述酵母細(xì)胞分泌的至少一種穿梭肽(SP)；和適當(dāng)時(shí)，促進(jìn)加工和/或分泌并位于編碼信號肽序列的5’-或3’-端的一個(gè)或多個(gè)核酸序列。
編碼SP及Sig的序列在相同讀框內(nèi)且，此外，在翻譯期間在Sig的C末端及SP的N末端之間形成可加工序列。所述可加工序列的實(shí)例為人工導(dǎo)入的、可蛋白酶解切割的天然或合成的銜接頭序列，然而，所述銜接頭序列優(yōu)選為Sig的C末端或SP的N末端的部分?？蓪︺暯宇^序列進(jìn)行加工使經(jīng)切割序列完全或部分存在于Sig的C末端或SP的N末端。只要對SP的分泌能力沒有實(shí)質(zhì)的不利作用且特別不會(huì)防止SP分泌的能力，那么經(jīng)切割序列完全或部分存在于SP的N末端是可能的。
本發(fā)明特別涉及編碼表達(dá)構(gòu)建體，所述表達(dá)構(gòu)建體編碼來自更廣義上通過酵母加工的多肽的可加工穿梭肽。所述酵母為特別選自子囊菌(ascomycetes)的酵母。優(yōu)選選自原子囊菌(Archiascomycetes)綱裂殖酵母(Schizosaccaromycetales)目的酵母，且酵母特別優(yōu)選選自裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬，如粟酒裂殖酵母。雖然有數(shù)據(jù)表明負(fù)型細(xì)胞也分泌P因子，但是優(yōu)選用與交配因子(信息素)匹配的菌株(即正型細(xì)胞用于正因子(P因子)且負(fù)型細(xì)胞用于負(fù)因子(M因子)。
可加工的穿梭肽構(gòu)建體特別來自酵母的信息素前蛋白質(zhì)，所述信息素從所述前蛋白質(zhì)通過N及C末端加工產(chǎn)生。信息素優(yōu)選具有通過加工可除去的N末端多肽，所述多肽特別包含加工和/或分泌前蛋白質(zhì)所需的元件，如信號肽和適當(dāng)時(shí)，前導(dǎo)肽，以及所需的蛋白酶切割位點(diǎn)。
真菌信息素是已知的且例如對擔(dān)子菌(basidiomycetes)如玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)(Urban，M.，Kahmann，R.和Bolker，M.(1996)Thebiallelic a mating type locus of Ustilago maydisremnants of an additionalpheromone gene indicate evolution from a multiallelic ancestor(Mol GenGenet 250(4)414-420))或Coprinopsis cinera(Halsall，J.R.，Milner，M.J.和Casselton，L. A.(2000)Three subfamilies of pheromone and receptorgenes generate multiple B mating specificites in the mushroom Coprineuscinereus(Genetics 154(3)1115-1123))及對于子囊菌如粟酒裂殖酵母(Imai，Y和Yamamoto，M.(1995)The fission yeast mating pheromoneP-factorits molecular structure，gene structure，and ability to induce geneexpression and G1 arrest in the mating partner(Genes Dev 8(3)328-338)，Davey，J.(1992)Mating pheromones of the fission yeastSchizosaccharomyces pombepurification and structural characterizationof M-factor and isolation and analysis of two genes encoding thepheromone(EMBO J 11(3)951-960))、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(Michaelis，S.和Herskowitz，I.(1988)The a-factor pheromone ofSaccharomyces cerevisiae is essential for mating(MOL cell Biol8(3)1309-1318)、Kurjan，J.和Herskowitz，I.(1982)Struture of a yeastpheromone gene(MF-alpha)a putative alpha-factor precursor containsfour tandem copies of mature alpha-factor(Cell 30(3)933-943))、Kluyveromyces delphensis(Wong，S.，F(xiàn)ares，M.A.，Zimmermann，W.，Butler，G.和Wolfe，K.H.(2003)Evidence from comparative genomics fora complete sexual cycle in the‘a(chǎn)sexual’pathogenic yeast Candida glabrata(Genome Biol 4(2)R 10))及克魯維酵母(Saccharomyceskluyveri)(Egel-Mitani，M.和Hansen，M.T.(1987)Nucleotide sequence ofthe gene encoding the Saccharomyces kluyveri alpha mating pheromone(Nucleic Acids Res 15(15)6303))進(jìn)行描述。
根據(jù)本發(fā)明合適的信息素為相對小肽(例如，5至40個(gè)或8至30個(gè)氨基酸)。它們的一級序列一般不顯示顯著同源性。它們形成為前蛋白質(zhì)，其經(jīng)蛋白酶解加工并釋放到培養(yǎng)基中。
特別合適的信息素或?qū)?yīng)前蛋白質(zhì)的實(shí)例為來自粟酒裂殖酵母的“P因子”及“M因子”及它們的前蛋白質(zhì)(參見Imai，Y和Yamamoto，M.(1995)The fission yeast mating pheromone P-factorits molecular structure，genestructure，and ability to induce gene expression and G1 arrest in themating partner (Genes Dev 8(3)328-338)，Davey，J.(1992)Matingpheromones of the fission yeast Schizosaccharomyces pombepurificationand structural characterization of M-factor and isolation and analysis oftwo genes encoding the pheromone(EMBO J 11(3)951-960)，Kjaerulff，S.，Davey，J.和Nielsen，O.(1994)Analysis of the structural genes encodingM-factor in the fission yeast Schizosaccharomyces pombeidentification ofa third gene，mfm3(Mol Cell Biol 14(6)3895-3905))。
例如，P因子前蛋白質(zhì)具有根據(jù)SEQ ID NO9的DNA序列及根據(jù)SEQ ID NO10的蛋白質(zhì)序列。前蛋白質(zhì)包含與四個(gè)連續(xù)信息素肽序列橋接的N末端信號肽序列，它們通過加工可以分離(見圖3)。
在本發(fā)明優(yōu)選的構(gòu)建體中，設(shè)計(jì)可加工的穿梭肽構(gòu)建體以包含與C末端可加工的信息素多肽(Pher)的N末端可加工地連接的信號多肽(Sig)。
信號多肽特別包含信息素前蛋白質(zhì)的可蛋白酶解除去的天然信號肽(例如通過SEQ ID NO3編碼的SEQ ID NO4)或與其相同。
進(jìn)一步優(yōu)選包含C末端蛋白酶切割位點(diǎn)的C末端加工的信息素多肽。
表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)一步優(yōu)選包含編碼與穿梭肽構(gòu)建體(Sig-SP)的C末端可加工連接的同源或異源靶蛋白(Targ)的核酸序列。
本發(fā)明優(yōu)選涉及上述類型的表達(dá)構(gòu)建體，所述表達(dá)構(gòu)建體包含編碼融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白可通過酵母細(xì)胞加工且具有式Sig-L1n-Pher-L2m-Targ其中Sig、Pher及Targ如以上定義，L1及L2為可加工接頭或銜接頭序列且n及m相互獨(dú)立地為0或1。然而，優(yōu)選n為1且m為0。
L1及L2可為天然或合成接頭。它們包含至少一個(gè)可蛋白酶解加工的肽序列。適當(dāng)時(shí)，具有促進(jìn)例如加工、分泌、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯功能的其它效應(yīng)子可與L1和/或L2相關(guān)。
特別優(yōu)選表達(dá)構(gòu)建體，其中編碼可加工的穿梭肽構(gòu)建體的核酸序列包含與編碼成熟P因子信息素(Pher)的根據(jù)SEQ ID NO5核酸序列或其功能等同物有效連接的根據(jù)SEQ ID NO3的信號多肽(Sig)編碼序列或其功能等同物。
優(yōu)選地，不存在L2接頭。相比，優(yōu)選提供L1接頭，其包含編碼根據(jù)SEQ ID NO10中的氨基酸殘基21至30的多肽的序列。這里L(fēng)1橋接信號肽與前激素的第一個(gè)信息素構(gòu)件(SEQ ID NO10中的31至57位)。L1的C末端對應(yīng)于蛋白酶解加工所需的蛋白酶識別序列。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼可加工的穿梭肽構(gòu)建體的核酸序列包含根據(jù)SEQ ID NO1的序列。
在粟酒裂殖酵母中存在的第二種信息素M因子的幫助下，原則上也可應(yīng)用相同方法且用于表達(dá)任意同源及異源靶蛋白。有三種基因組基因(mfm1+，SEQ ID NO42；mfm2+，SEQ ID NO45；mfm3+SEQ ID NO48)，它們每種情況下編碼M因子——具有負(fù)交配類型的細(xì)胞的信息素。首先從每種基因產(chǎn)生在分泌過程中加工的前蛋白質(zhì)(SEQ ID NO43、46及49)。最后，分別通過SEQ ID NO44、47及50編碼的M因子(YTPKVPYMC；SEQ ID NO51)作為成熟信息素釋放到培養(yǎng)基中(參照圖9)。
因此根據(jù)本發(fā)明合適的其他穿梭肽構(gòu)建體可來自編碼與M因子信息素功能性連接的M因子信號肽的根據(jù)SEQ ID NO42、45或48的編碼序列。對應(yīng)編碼穿梭肽序列的非限制性實(shí)例包括，例如，根據(jù)SEQ ID NO42的1至117位核苷酸殘基；根據(jù)SEQ ID NO45的1至123位核苷酸殘基；或根據(jù)SEQ ID NO48的1至114位核苷酸殘基；或從它們得到的功能等同構(gòu)建體，其控制M因子信息素的分泌及加工和與所述信息素C末端且可蛋白酶解除去地連接的同源或異源靶蛋白的分泌及加工。功能等同物可包含未改變或經(jīng)修飾(例如通過缺失單個(gè)或多個(gè)核酸殘基)形式的位于成熟M因子(SEQ ID NO44、47或50)編碼序列的5’上游的序列片段，且因此編碼穿梭肽，其具有改變的氨基酸序列并例如將成熟M因子肽序列與例如C末端截短的信號序列片段功能性連接。
只要根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的靶蛋白(Targ)可通過宿主細(xì)胞以根據(jù)本發(fā)明的方式作為具有穿梭肽(SP)的融合蛋白部分進(jìn)行表達(dá)、分泌及加工，所述靶蛋白就可來自任意原核或真核生物，特別是人、動(dòng)物或酵母。經(jīng)分泌及加工的產(chǎn)物可具有治療用途或可具有其它有益的可應(yīng)用性質(zhì)。可在這里談及的有治療用途的蛋白質(zhì)的實(shí)例為免疫球蛋白、肽激素、生長因子、淋巴因子、蛋白酶抑制劑等等?？稍谶@里談及的具有令人感興趣應(yīng)用的其它性質(zhì)的靶蛋白的實(shí)例尤其是疏水蛋白。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶蛋白為疏水蛋白，特別是I類疏水蛋白。
典型疏水蛋白為具有8個(gè)半胱氨酸的保守基序(X2-38-C-X5-9-C-C-C11-39-C-X8-23-C-X5-9-C-C-X6-18-C-X2-13)的相對小(100±25個(gè)氨基酸)的中等疏水蛋白質(zhì)。疏水蛋白可在親水-疏水界面裝配以產(chǎn)生蛋白質(zhì)膜。此種I類疏水蛋白的團(tuán)聚體在SDS中是不可溶的，而II類疏水蛋白團(tuán)聚體在SDS中是可溶的(Wessels，J.G.H.(1997)HydrophobinsProteins that change the nature of the fungal surface.Adv Microb Physiol381-45)。
根據(jù)本發(fā)明可應(yīng)用的疏水蛋白特別來自真菌，例如來自子囊菌如曲霉屬，特別是構(gòu)巢曲霉的子囊菌。
有用的疏水蛋白從上述現(xiàn)有技術(shù)中也是已知的且不限于來自真菌的疏水蛋白。
有用的疏水蛋白的非限制性實(shí)例選自SEQ ID NO14(DewA)、SEQ IDNO19(RdIA)、SEQ ID NO20(RdIB)、SEQ ID NO21(HYP1)、SEQ IDNO22(HYP4)及SEQ ID NO56(RodA)。
p52750(DewA)MRFIVSLLAF TAAATATALP ASAAKNAKLA TSAAFAKQAE GTTCNVGSIACCNSPAETNN DSLLSGLLGA GLLNGLSGNT GSACAKASLI DQLGLLALVDHTEEGPVCKN IVACCPEGTTNCVAVDNAGA GTKAEq9I190(RdIA)MLKKAMVAAA AAASVIGMSA AAAPQALAIG DDNGPAVANG NGAESAFGNSATKGDMSPQL SLVEGTLNKP CLGVEDVNVA VINLVPIQDI NVLADDLNQQCADNSTQAKR DGALSHVLED LSVLSANGEGRq934f8(RdIB)MIKKVVAYAA IAASVMGASA AAAPQAMAIG DDSGPVSANG NGASQYFGNSMTTGNMSPQM ALIQGSFNKP CIAVSDIPVS VIGLVPIQDL NVLGDDMNQQCAENSTQAKR DGALAHLLEDVSILSSNGEG GKGHYP1_AGABI(P49072)MISRVLVAAL VALPALVTAT PAPGKPKASS QCDVGEIHCC DTQQTPDHTSAAASGLLGVP INLGAFLGFD CTPISVLGVG GNNCAAQPVC CTGNQFTALINALDCSPVNV NL
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本發(fā)明還涉及表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含與至少一個(gè)調(diào)節(jié)核酸序列有效連接的如以上定義的表達(dá)構(gòu)建體。
本發(fā)明還涉及重組微生物，其包含如以上定義的至少一個(gè)表達(dá)載體或表達(dá)構(gòu)建體，其適當(dāng)時(shí)穩(wěn)定整合到宿主基因組。
根據(jù)本發(fā)明的“重組微生物”包含至少一個(gè)本發(fā)明的表達(dá)載體或本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體且在最廣義上來自酵母。所述酵母特別來自子囊菌。優(yōu)選的酵母選自原子囊菌綱裂殖酵母目，且特別優(yōu)選選自裂殖酵母屬，如粟酒裂殖酵母。
本發(fā)明還涉及可通過酵母細(xì)胞加工且來自酵母信息素前蛋白質(zhì)的穿梭肽構(gòu)建體，信息素可從所述前蛋白質(zhì)通過N及C末端加工得到并且是可分泌的。
優(yōu)選包含與C末端加工的信息素多肽N末端可加工地連接的信號多肽的穿梭肽構(gòu)建體。
所述信號多肽優(yōu)選為信息素前蛋白質(zhì)的可蛋白酶解除去的天然信號多肽，且C末端加工的信息素多肽包含C末端蛋白酶切割位點(diǎn)。
優(yōu)選的穿梭肽構(gòu)建體來自酵母的信息素前蛋白質(zhì)，特別是粟酒裂殖酵母P因子及M因子的前蛋白質(zhì)。特別優(yōu)選的穿梭肽包含根據(jù)SEQ ID NO2的氨基酸序列或其功能等同物。
本發(fā)明還涉及重組制備靶蛋白的方法，所述方法包括培養(yǎng)如以上定義的重組微生物，表達(dá)編碼所述靶蛋白的核酸序列及分離分泌到培養(yǎng)基中的靶蛋白，例如如以上定義的疏水蛋白。
本發(fā)明還涉及編碼如以上定義的穿梭肽構(gòu)建體的核酸；還涉及編碼如以上定義的融合蛋白的核酸，所述融合蛋白可通過酵母細(xì)胞加工且包含靶蛋白。
本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明方法可獲得的疏水蛋白。
最后，本發(fā)明涉及此類疏水蛋白用于表面處理的用途，其包含處理具體選自玻璃、纖維、織品、皮革、上漆物品，例如機(jī)動(dòng)車輛、膜、正面 物體的表面。
本發(fā)明還涉及疏水蛋白的用途，其用于處理纖維、織品及皮革表面。
c)發(fā)明的其它實(shí)施方案c1)多肽/蛋白質(zhì)本發(fā)明也包含特別公開或應(yīng)用的多肽/蛋白質(zhì)的“功能等同物”。這用于立即產(chǎn)生的融合蛋白及其組分，即靶蛋白(Targ)、穿梭肽(SP)，如信息素(Pher)，也用于信號肽(Sig)及接頭。用于多肽/蛋白質(zhì)的一般術(shù)語下文將只為“多肽”。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，特別公開多肽的“功能等同物”或類似物為與其不同但是具有目的生物學(xué)活性的多肽。類似穿梭肽將還適合用于控制靶蛋白的分泌及加工。對應(yīng)地，穿梭肽組分的功能等同物，如信號多肽、信息素、接頭也欲還具有融合蛋白有效分泌及加工與靶蛋白釋放所需的性質(zhì)。
本發(fā)明多肽的“功能等同物”，如靶蛋白、穿梭肽在C和/或N末端可包含特別是自蛋白酶解切割產(chǎn)生的天然接頭或銜接頭序列的剩余物。
根據(jù)本發(fā)明，“功能等同物”特別表示突變蛋白質(zhì)，所述突變蛋白質(zhì)在上述特定序列的至少一個(gè)序列位置具有不同于特別談及的氨基酸的至少一個(gè)氨基酸，但仍然具有一種上述生物活性。因此“功能等同物”包含通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、替代(參照下表中的實(shí)例)、缺失和/或倒位可獲得的突變蛋白質(zhì)，只要它們產(chǎn)生具有本發(fā)明性質(zhì)譜的突變蛋白質(zhì)，在任意序列位置發(fā)生所述修飾是可能的。
適合用于氨基酸替代的殘基的實(shí)例為最初殘基 替代實(shí)例Ala SerArg LysAsn Gln；HisAsp GluCys SerGln AsnGlu AspGly ProHis Asn；GlnIle Leu；ValLeu Ile；ValLys Arg；Gln；GluMet Leu；IlePhe Met；Leu；TyrSer ThrThr SerTrp TyrTyr Trp；PheVal Ile；Leu當(dāng)突變體與未改變多肽具有質(zhì)量上匹配的活性圖式時(shí)也特別是功能等同的。這表示，例如，經(jīng)修飾穿梭肽在相同宿主中以較高或較低效率表達(dá)或分泌相同靶蛋白；或經(jīng)修飾靶蛋白具有升高或降低的藥理學(xué)作用或經(jīng)修飾的可應(yīng)用的性質(zhì)。
“功能等同物”在以上意義中也包含所描述的多肽前體和所述多肽的功能衍生物及鹽。表達(dá)“鹽”表示本發(fā)明蛋白質(zhì)分子的羧基的鹽及氨基的酸加成鹽。羧基鹽可以本身已知的方法制備且包含無機(jī)鹽例如，鈉、鈣、銨、鐵及鋅鹽且也包括與有機(jī)堿例如，胺，如三乙醇胺、精氨酸、賴氨酸、哌啶等等形成的鹽。本發(fā)明同樣涉及酸加成鹽，例如與無機(jī)酸如鹽酸或硫酸形成的鹽及與有機(jī)酸如乙酸及草酸形成的鹽。
本發(fā)明多肽的“功能衍生物”可同樣在已知技術(shù)的幫助下由功能性氨基酸側(cè)基或它們的N或C末端制備。此類衍生物包含，例如，羧酸基團(tuán)的脂族酯、與銨或伯胺或仲胺反應(yīng)可獲得的羧酸基團(tuán)的酰胺；通過與?；磻?yīng)制備的游離氨基的N-?；苌?；或通過與?；磻?yīng)制備的游離羧基的O-酰基衍生物。
當(dāng)然，“功能等同物”也包含從與特別談及的生物不同的生物可獲得的多肽和天然存在變體。例如，可能通過同源序列區(qū)的序列比較區(qū)建立并根據(jù)本發(fā)明的特定指導(dǎo)確定等同酶。
“功能等同物”也包含片段，優(yōu)選例如具有目的生物學(xué)功能的本發(fā)明多肽的個(gè)別結(jié)構(gòu)域或序列基序。
“功能等同物”也為融合蛋白，所述融合蛋白具有一個(gè)上述多肽序列或從其衍生的功能等同物和功能性N或C末端連接(即具有融合蛋白部分的相互可忽略的功能損害)與所述多肽序列功能不同的至少一個(gè)其他異源序列。此類異源序列的非限制性實(shí)例為例如信號肽、酶、免疫球蛋白、表面抗原、受體或受體配體。
本發(fā)明也包含的“功能等同物”為特別談及的多肽的同系物。根據(jù)Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448的算法計(jì)算，所述同系物與任意特別公開的序列具有至少60％，優(yōu)選至少75％，特別是至少85％，例如90％、95％或99％同源性。本發(fā)明同源多肽的同源性百分?jǐn)?shù)特別表示基于文中特別描述的任意氨基酸序列總長度的氨基酸殘基的同一性百分?jǐn)?shù)。
對于可能的蛋白質(zhì)糖基化，本發(fā)明的等同物包含去糖基化或糖基化形式的多肽及可通過改變糖基化模式獲得的經(jīng)修飾形式。
本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽的同系物可通過誘變，例如通過蛋白質(zhì)點(diǎn)突變或截短以本身已知的方式產(chǎn)生。
c2)核酸序列本發(fā)明的核酸序列，特別是編碼任意以上多肽和它們的功能等同物的核酸序列包含單鏈及雙鏈DNA及RNA序列，例如也包含cDNA及mRNA。
文中談及的所有核酸序列為天然來源或可以本身已知的方式通過核苷酸構(gòu)件的化學(xué)合成，例如通過個(gè)體重疊的、互補(bǔ)核酸構(gòu)件的片段縮合制備。
可以本身已知的方式，例如根據(jù)亞磷酰胺方法(Voet，Boet，2ndedition，Wiley Press New York，896-897頁)進(jìn)行寡核苷酸的化學(xué)合成。利用DNA聚合酶Klenow片段及連接反應(yīng)合成寡核苷酸的裝配及缺口的填補(bǔ)及一般克隆方法在Sambrook等人(1989)，Molecular CloningA laboratorymanual，Cold Spring Harbor Laboratory Press中描述。
本發(fā)明還涉及編碼任意以上多肽及它們的功能等同物的核酸序列，所述核酸序列可以例如通過用人工核苷酸類似物獲得。
本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明多肽或其生物學(xué)活性部分的分離的核酸分子且涉及適合用作例如用于鑒定或擴(kuò)增本發(fā)明編碼核酸的雜交探針或引物的核酸片段。
本發(fā)明的核酸分子還可包含編碼基因區(qū)3’和/或5’端的非翻譯序列。
“分離的”核酸分子自所述核酸的天然來源中存在的其它核酸分子除去且另外，通過重組技術(shù)制備時(shí)，基本上不含其它細(xì)胞材料或培養(yǎng)基或化學(xué)合成時(shí)不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品。
可通過分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)及根據(jù)本發(fā)明提供的序列信息分離本發(fā)明的核酸分子。例如，可通過應(yīng)用任意特別公開的全序列或其片段作為雜交探針以及標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)(例如，在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndedition，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989描述的)從合適cDNA文庫分離cDNA。此外，可能用基于所述序列產(chǎn)生的寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)分離包含任意公開序列或其片段的核酸分子?？蓪⒁栽摲绞綌U(kuò)增的核酸克隆到合適載體并通過DNA序列分析表征。
本發(fā)明進(jìn)一步包含與特別描述的核苷酸序列或其片段互補(bǔ)的核酸分子。
所述核苷酸序列能產(chǎn)生可用于在其它細(xì)胞類型及生物中鑒定和/或克隆同源序列的探針及引物。此類探針或引物一般包含在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明核酸序列的有義鏈或?qū)?yīng)反義鏈的至少約12個(gè)，優(yōu)選至少約25個(gè)，例如約40、50或75個(gè)保守核苷酸雜交的核苷酸序列區(qū)。
本發(fā)明的其他核酸序列來自特別公開序列且通過單個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、替代、插入或缺失而與其不同，但仍編碼具有目的性質(zhì)譜的多肽。
與特別談及序列以及其天然存在變體例如剪接變體或等位變體比較，本發(fā)明還包括包含“沉默”突變或根據(jù)特定來源或宿主生物的密碼子使用進(jìn)行修飾的核酸序列。本發(fā)明還涉及可通過保守核苷酸替代(用相同電荷、大小、極性和/或溶解性的氨基酸置換所述氨基酸)可獲得的序列。
本發(fā)明還涉及來自由于序列多態(tài)性從特別公開的核酸得到的分子。這些遺傳多態(tài)性可由于自然變異存在于群體中個(gè)體之間。這些自然變異一般引起基因核苷酸序列中1至5％的變化。
本發(fā)明還包含與上述編碼序列雜交或與其互補(bǔ)的核酸序列。篩選基因組或cDNA文庫時(shí)可發(fā)現(xiàn)這些多核苷酸，且適當(dāng)時(shí)，用合適引物通過PCR擴(kuò)增且例如隨后用合適探針分離這些多核苷酸。
能與多核苷酸“雜交”的性質(zhì)表示在嚴(yán)格條件下，多核苷酸或寡核苷酸結(jié)合近乎互補(bǔ)序列的能力，而在這些條件下非互補(bǔ)配偶體之間不發(fā)生非特異結(jié)合。為此目的，序列應(yīng)70-100％，優(yōu)選90-100％互補(bǔ)。能互相特異結(jié)合的互補(bǔ)序列的性質(zhì)用于例如RNA印跡或DNA印跡技術(shù)或用于PCR或RT-PCR中的引物結(jié)合。一般長度為30或30個(gè)以上堿基對的寡核苷酸用于此目的。例如在RNA印跡技術(shù)中，嚴(yán)格條件表示于50-70℃，優(yōu)選60-65℃用洗滌溶液，例如含有0.1％SDS的0.1％SSC緩沖液(20X SSC3MNaCl、0.3M檸檬酸鈉，pH7.0)洗脫非特異雜交的cDNA探針或寡核苷酸。如上述，這表示只有高度互補(bǔ)的核酸保持互相結(jié)合。設(shè)定嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，且例如，在Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中描述。
c3)表達(dá)構(gòu)建體及載體本發(fā)明還涉及表達(dá)構(gòu)建體，其包含在調(diào)節(jié)核酸序列的遺傳控制下的編碼根據(jù)本發(fā)明的待表達(dá)多肽的核酸序列；且涉及包含至少一個(gè)所述表達(dá)構(gòu)建體的載體。
此種本發(fā)明的構(gòu)建體優(yōu)選包含特定編碼序列5’上游啟動(dòng)子及3’下游終止子序列和適當(dāng)時(shí)，其他常見調(diào)節(jié)元件，其在每種情況下有效連接編碼序列。
“有效連接”表示啟動(dòng)子、編碼序列、終止子及適當(dāng)時(shí)，其它調(diào)節(jié)元件的順序排列，從而每個(gè)調(diào)節(jié)元件可以根據(jù)需要完成在表達(dá)編碼序列中的功能。
有效連接序列的實(shí)例為靶定序列以及增強(qiáng)子、多腺苷酸化信號等等。其它調(diào)節(jié)元件包含選擇標(biāo)記、擴(kuò)增信號、復(fù)制起點(diǎn)等等。合適調(diào)節(jié)序列例如在Goeddel，Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述。
基因構(gòu)建體可包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的編碼核酸序列。
可應(yīng)用的啟動(dòng)子的實(shí)例為酵母啟動(dòng)子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、nmt1、nmt41及nmt81。
可談及的用于粟酒裂殖酵母的合適啟動(dòng)子的實(shí)例為nmt1、nmt41、nmt81、adh1、fbp1、SV40或CaMV。進(jìn)一步信息參見(http//pingu.salk.edu/～forsburg/vectors.htm#exp)。啟動(dòng)子在它們的轉(zhuǎn)錄速率方面不同。選擇取決于所希望的表達(dá)水平。這因此用于其它酵母。
合適的酵母啟動(dòng)子，例如在此處特別作為參考的已公布的美國專利申請2003/0077831中描述。
也可以應(yīng)用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如，光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，尤其是溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
談及的調(diào)節(jié)序列意在使得可能定向表達(dá)所述核酸序列及蛋白質(zhì)。取決于宿主生物，這表示例如只在誘導(dǎo)后基因表達(dá)或過表達(dá)或它立即表達(dá)或過表達(dá)。
在這方面，調(diào)節(jié)序列或調(diào)節(jié)因子可以主動(dòng)方式優(yōu)選影響表達(dá)且因此增加或降低表達(dá)。因此，調(diào)節(jié)元件可通過應(yīng)用強(qiáng)轉(zhuǎn)錄信號如啟動(dòng)子和/或“增強(qiáng)子”在轉(zhuǎn)錄水平有益地增強(qiáng)。然而，除此之外，也可能例如通過提高mRNA穩(wěn)定性增強(qiáng)翻譯。
通過合適啟動(dòng)子與合適編碼核苷酸序列及與終止子信號或聚腺苷酸化信號融合制備表達(dá)盒。為此目的，應(yīng)用一般重組及克隆技術(shù)，例如在T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1982)及在T.J.Silhavy，M.L. Berman和L. W.Enqist，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)及在Ausubel，F(xiàn).M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)中描述的技術(shù)。
通過將重組核酸構(gòu)建體或基因構(gòu)建體有益地插入到使得所述構(gòu)建體在宿主中最佳表達(dá)可能的宿主特異載體，在合適宿主生物中所述表達(dá)重組核酸構(gòu)建體或基因構(gòu)建體。載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的且例如在“克隆載體”(Pouwels P.H.等人，eds.，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中找到。除質(zhì)粒外，載體還表示本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它載體，例如，噬菌體、病毒，如SV40、CMV、桿狀病毒及腺病毒、轉(zhuǎn)座子、IS元件、噬菌粒、粘粒及線性或環(huán)狀DNA。這些載體可在宿主生物中自主復(fù)制或隨染色體復(fù)制。
可在這里特別談及的根據(jù)本發(fā)明合適的表達(dá)載體的實(shí)例為適于酵母粟酒裂殖酵母的構(gòu)建體(參見，例如(http//pingu.salk.edu/～forsburg/vectors.html#exp)。
其它實(shí)例為pART1(McLeod，M.，Stein，M.和Beach，D.(1987)The product of themei3+gene expressed under control of the mating type locus，inducesmeiosis and sporulation in fission yeast.EMBO J.6729-736，pCHY21(Hoffman，C.S.和Winston，F(xiàn).(1991).Glucose repression oftranscription of the schizosaccharomyces pombe fbp1 gene occurs by acamp signaling pathway.Genes Dev.5561-571)，REP1、REP3、REP4(Maundrell，K.(1990).nmt1 of fission yeasta highlytranscribed gene completely repressed by thiamine.J.Biol.Chem.26510857-10864)，REP41、REP42、PEP81、PEP82(Basi，G.，Schmid，E和Manudrell，K.(1993).TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoteraffect transcription effciency but not the transcription start point orthiamine repressibility.Gene 123131-136)。
用于在釀酒酵母中表達(dá)的酵母表達(dá)載體為如pYEpSec1(Baldari等人，(1987)Embo J.6229-234)、pMFa(kurjan和Herskowitz(1982)Cell 30933-943)、pJRY88(Schultz等人(1987)Gene 54113-123)及pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。合適用于在其它真菌如絲狀真菌中的載體及構(gòu)建載體的方法包括在van den Hondel，C.A.M.J.J.&Punt，P.J.(1991)“Gene transfer systems and vectordevelopment for filamentous fungi，inApplied Molecular Genetics ofFungi，J.F.Peberdy等人，eds.，pp.1-28，Cambridge University PressCambridge中詳細(xì)描述的載體及方法。
其它合適的表達(dá)系統(tǒng)在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular cloningA Laboratory Manual，2ndedition，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989的第16及17章中描述。
c4)重組微生物在本發(fā)明載體的幫助下，可能制備例如用至少一個(gè)本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化且可用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的重組微生物。
有利地，將以上描述的本發(fā)明重組構(gòu)建體導(dǎo)入到合適宿主系統(tǒng)中并表達(dá)。優(yōu)選地，這包括用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的熟悉的克隆及轉(zhuǎn)染方法，例如，共沉淀、原生質(zhì)體融合、電穿孔、反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染等等，以便使談及的核酸在特定表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。合適的系統(tǒng)例如在Current Protocols inMolecular Biology，F(xiàn).Ausubel等人，編者，Wiley Interscience，New York1997，或Sambrook等人，Molecular cloningA Laboratory Manual，2ndedition，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989中描述。
合適宿主生物原則上為能使本發(fā)明的核酸、它們的等位變體、它們的功能等同物或衍生物表達(dá)的任意生物。優(yōu)選的宿主生物為酵母。
用于將外源DNA導(dǎo)入到酵母細(xì)胞的方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。所述導(dǎo)入可例如通過根據(jù)Hinnen等人(1978，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，751919-1935)的原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化進(jìn)行。例如用于粟酒裂殖酵母的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法可參見Alfa等人(Alfa，C.，F(xiàn)antes，P.，Hyams，J.，McLeod，M.和Warbrick，E.(1993)Experiments with fission yeast.Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York)或用于釀酒酵母的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法可參見Kaiser等人(Kaiser，C.，Michaelis，S.和Mitchell，A.(1994)Methods in Yeast Genetics.Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)。
在酵母中常常應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記物選擇轉(zhuǎn)化體。在這種情況下，待轉(zhuǎn)化的菌株缺乏產(chǎn)生特定代謝產(chǎn)物所需的蛋白質(zhì)。通過應(yīng)用的載體將對應(yīng)的活性蛋白質(zhì)導(dǎo)入到細(xì)胞中。常常應(yīng)用的標(biāo)記物為例如尿嘧啶、亮氨酸、組氨酸或色氨酸生物合成的基因。
可通過載體中或在表達(dá)盒中也包括的標(biāo)記基因選擇成功轉(zhuǎn)化的生物。此類標(biāo)記基因的實(shí)例為抗生素抗性基因及酶的基因，所述酶的基因催化產(chǎn)色反應(yīng)，其導(dǎo)致所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞染色。然后可通過自動(dòng)細(xì)胞分選選擇染色的轉(zhuǎn)化細(xì)胞?？赏ㄟ^包含對應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基或營養(yǎng)床(nutrient bed)篩選用載體成功轉(zhuǎn)化的且攜帶適當(dāng)抗生素抗性基因(例如G418或潮霉素)的微生物?？赏ㄟ^親和層析將暴露于細(xì)胞表面的標(biāo)記物蛋白質(zhì)用于篩選。
宿主生物與用于所述生物的適當(dāng)載體如質(zhì)粒、病毒或噬菌體，例如包含RNA聚合酶/啟動(dòng)子系統(tǒng)的質(zhì)粒、噬菌體8或其它溫和噬菌體或轉(zhuǎn)座子和/或其它有益調(diào)節(jié)序列的組合組成表達(dá)系統(tǒng)。
c5)靶蛋白的重組制備本發(fā)明還涉及用于重組制備如以上定義的靶蛋白的方法。
根據(jù)已知方法可培養(yǎng)及發(fā)酵重組微生物。例如對于粟酒裂殖酵母，合適的培養(yǎng)條件在Alfa等人(Alfa，C.，F(xiàn)antes，P.，Hyams，J.，McLeod，M.和Warbrick，E.(1993)Experiments with fission yeast.Cold Spring HarborLaboratory Press，New York)及Gutz等人(Gutz，H.，Heslot，H.，Leupold，U.和Loprieno，U.(1974)Schizosaccharomyces pombe.InHandbook ofGenetics 1，pp 395-446，Plenum Press New York)中詳細(xì)描述，或?qū)τ卺劸平湍傅暮线m培養(yǎng)條件在Kaiser等人(Kaiser，C.，Michaelis，S.和Mitchell，A.(1994)Methods in Yeast Genetics.Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)中詳細(xì)描述。
如果靶蛋白分泌到培養(yǎng)物上清液中，根據(jù)已知蛋白質(zhì)分離方法，自上清液中除去細(xì)胞并自上清液中獲得靶蛋白。
用已知的層析方法如分子篩層析(凝膠過濾)、離子交換層析如Q-Sepharose層析及疏水層析及用其它常規(guī)方法如超濾、結(jié)晶、鹽析、透析及非變性凝膠電泳可對靶蛋白進(jìn)行純化。合適的方法例如在Cooper，F(xiàn).G.，Biochemische Arbeitsmentoden[最初標(biāo)題The Tools of Biochemistry]，Verlag Walter de Gruyter，Berlin，New York或在Scopes，R.，ProteinPurification，Springer Verlag，New York，Heidelberg，Berlin中描述。
通過用簡化純化的編碼經(jīng)改變的多肽或融合蛋白的載體系統(tǒng)也有助于重組蛋白質(zhì)的分離。此類合適修飾的實(shí)例為作為錨的“標(biāo)記物”，例如已知作為六組氨酸錨或可通過抗體作為抗原識別的表位的修飾(例如，在Harlow，E.和Lane，D.1988，AntibodiesA Laboratory Manual.ColdSpring Harbor(N.Y.)Press中描述)。這些錨可用于將蛋白質(zhì)附著到固相支持體，例如，可裝入層析柱或可在微量滴定板或另一支持體應(yīng)用上的聚合物基質(zhì)。
這些錨也可同時(shí)用于識別蛋白質(zhì)。此外，通過用常規(guī)標(biāo)記物如熒光染料、與底物反應(yīng)后形成可檢測反應(yīng)產(chǎn)物的酶標(biāo)記物或放射性標(biāo)記，單獨(dú)或聯(lián)合用于衍生蛋白質(zhì)的所述錨可識別所述蛋白質(zhì)。
c6)用疏水蛋白表面處理用疏水蛋白處理表面以改變例如疏水或親水表面性質(zhì)原則上是已知的，且現(xiàn)在通過本發(fā)明極大簡化，本發(fā)明的疏水蛋白重組制備提供充足的起始材料。
考慮到現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)(例如WO-A-01/57066，其描述由于亞硫酸鹽處理對疏水蛋白的穩(wěn)定化、溶解及其相關(guān)改進(jìn)應(yīng)用；或WO-A-01/57076，其描述通過吸附到特氟隆珠且于低溫通過去污劑如吐溫洗脫純化疏水蛋白；或WO-A-01/57528，其描述通過應(yīng)用吐溫及達(dá)85攝氏度的溫度將疏水蛋白固定到表面)，非常多的固體材料如玻璃、纖維、織物、皮革、上漆物品、膜、正面可用疏水蛋白涂布。
以下非限制性實(shí)例參考附圖更詳細(xì)描述了本發(fā)明，所述附圖中

圖1描述了根據(jù)本發(fā)明制備的用于自粟酒裂殖酵母分泌疏水蛋白的多種構(gòu)建體。
圖2A)描述了DewA基因(SEQ ID NO39)的基因組序列；兩個(gè)內(nèi)含子的序列用下劃線標(biāo)出；B)描述了氨基酸序列且圓括號中為構(gòu)巢曲霉DewA蛋白質(zhì)對應(yīng)的DNA序列；信號序列用粗體印刷且信號序列后的部分序列對應(yīng)于成熟DewA序列；C)描述了氨基酸序列且圓括號中為HA-Tag的對應(yīng)DNA序列。
圖3A)描述了氨基酸序列且圓括號中為P因子前蛋白質(zhì)的對應(yīng)DNA序列；信號序列用粗體印刷；信號序列后用下劃線標(biāo)出的部分序列對應(yīng)于四個(gè)成熟信息素肽的序列；鄰近信號肽的信息素稱作P因子；B)描述了氨基酸序列且在圓括號中為可除去信號肽的對應(yīng)DNA序列，且其下游為P因子前蛋白質(zhì)的6個(gè)氨基酸(用下劃線標(biāo)出)；C)描述了氨基酸序列且在圓括號中為本發(fā)明“P穿梭”的對應(yīng)DNA序列；信號序列用粗體印刷，信號序列后用下劃線標(biāo)出的部分序列對應(yīng)于成熟P因子的序列。
圖4描述了本發(fā)明的融合蛋白，其包含“P穿梭”序列(粗體標(biāo)出信號序列；下劃線標(biāo)出成熟P蛋白質(zhì))、成熟DewA(雙下劃線標(biāo)出)及C末端融合的HA標(biāo)記(SEQ ID NO18；通過SEQ IN NO17編碼)。
圖5描述了粟酒裂殖酵母中疏水蛋白的免疫學(xué)檢測。對于免疫學(xué)檢測，將構(gòu)巢曲霉疏水蛋白基因DewA及RodA與HA標(biāo)記融合，克隆到pJR1-3XL表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到粟酒裂殖酵母中。“膜級分”及“胞質(zhì)蛋白質(zhì)”通過SDS-PAGE分級分離。用HA抗體進(jìn)行Western分析檢測。大小標(biāo)準(zhǔn)(KDa)在左邊標(biāo)明。A應(yīng)用包含無插入物載體(pJR1-3XL，陰性對照)、HA標(biāo)記的對照蛋白質(zhì)(陽性對照)及包含具有內(nèi)含子的HA標(biāo)記的DewA基因的載體(DewA-HA(+內(nèi)含子)的培養(yǎng)物的樣品。B每種情況下應(yīng)用包含載體(pJR1-3XL，陰性對照)，包含無內(nèi)含子的HA標(biāo)記DewA基因的載體(DewA-HA(-內(nèi)含子)或包含有內(nèi)含子的HA標(biāo)記的RodA基因(RodA-HA(+內(nèi)含子)的載體的培養(yǎng)樣品。
圖6描述了在粟酒裂殖酵母中疏水蛋白表達(dá)的免疫學(xué)檢測。PDewAHA蛋白質(zhì)在粟酒裂殖酵母中表達(dá)。收獲細(xì)胞，將培養(yǎng)物上清液分為等分試樣且一份用TCA沉淀。SDA-PAGE及在HA抗體幫助下的蛋白質(zhì)印跡之后對蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。通過*標(biāo)明的帶對應(yīng)于前體蛋白質(zhì)(大約18kD，上面的帶)及成熟形式(大約17kD，下面的帶)。
圖7描述了在粟酒裂殖酵母中疏水蛋白表達(dá)的檢測。粟酒裂殖酵母細(xì)胞用通過強(qiáng)啟動(dòng)子(pJR1-3XL)或弱啟動(dòng)子(pJR1-81XL)表達(dá)P+6DewA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。細(xì)胞染色體上攜帶含有c-myc標(biāo)記的prp1基因形式，c-myc標(biāo)記作為對照以排除裂解細(xì)胞對培養(yǎng)物上清液的污染。收獲細(xì)胞(沉淀物)，培養(yǎng)物上清液用TCA沉淀(上清液)。SDA-PAGE及在針對HA(A)或針對c-myc(B)抗體幫助下進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡之后對蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。
圖8描述了在“P穿梭”方法幫助下分泌的檢測。粟酒裂殖酵母細(xì)胞用通過弱啟動(dòng)子(pJR1-81XL)表達(dá)PfakDewA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。收獲細(xì)胞(沉淀物)且培養(yǎng)物上清液用TCA沉淀(SN)。SDA-PAGE及在針對HA抗體幫助下進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡之后對蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。
圖9描述了每種情況下編碼粟酒裂殖酵母M因子(對于成熟因子為SEQ ID NO51)的三種基因A)描述了mfm1+-基因的序列；B)描述了mfm2+-基因的序列；C)描述了mfm3+-基因的序列。
圖10描述了RodA基因。RodA基因的基因組序列(SEQ ID NO52)包含在對應(yīng)編碼ORF(SEQ ID NO53)中不存在的兩個(gè)內(nèi)含子(下劃線標(biāo)出)。前蛋白質(zhì)(SEQ ID NO54)包含在成熟蛋白質(zhì)(SEQ ID NO56；通過SEQIN NO55編碼)中不存在的可除去的信號序列(用粗體印刷)。
實(shí)驗(yàn)部分一般實(shí)驗(yàn)詳情a)一般克隆方法除非另外注明，用于本發(fā)明目的進(jìn)行的克隆步驟，例如，限制性切割、瓊脂糖凝膠電泳、DNA片段的純化、核酸轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜及尼龍膜、DNA片段的連接、大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、細(xì)菌培養(yǎng)、噬菌體增殖及重組DNA的序列分析如通過在Sambrook等人(1989)上述引文中描述的進(jìn)行。
根據(jù)生產(chǎn)商信息，通過NucleoSpin提取試劑盒(ExtractKit)(Machery-Nagel，Düren，德國)自反應(yīng)混合物或在凝膠電泳后純化DNA且在NucleoSpin質(zhì)?？焖偌兓噭┖?Plasmid Quick PureKit)(Machery-Nagel，Düren，德國)幫助下自大腸桿菌分離質(zhì)粒DNA。
根據(jù)生產(chǎn)商信息應(yīng)用限制酶(Invitrogen)。根據(jù)生產(chǎn)商信息在T4連接酶(Promega，Mannheim，德國)幫助下進(jìn)行DNA連接。
根據(jù)生產(chǎn)商信息，用Gene Pulser II儀器(BIO-RAD，Munich，德國)及2-mm電穿孔小杯(Biozym Diagnostik，Hess.Oldendorf，德國)通過電穿孔進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化。在含有氨芐青霉素(150mg/l)的LB培養(yǎng)基(Lennox，1955，Virology 1190)上選擇轉(zhuǎn)化體。
b)聚合酶鏈反應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)商信息，在Combizyme DNA聚合酶(Invitek，Berlin，德國)幫助下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每種情況下每100μl反應(yīng)體積用1pmol的適當(dāng)引物。
c)培養(yǎng)如在Alfa等人(Alfa，C.，F(xiàn)antes，P.，Hyams，J.，McLeod，M.和Warbrick，E.(1993)Experiments with fission yeast.Cold Spring HarborLaboratory Press，New York)及Gutz等人(Gutz，H.，Heslot，H.，Leupold，U.和Loproieno，U.(1974)Schizosaccharomyces pombe.InHandbook ofGenetics 1，pp 395-446，Plenum Press，New York)中的描述培養(yǎng)粟酒裂殖酵母。
如在Alfa等人(Alfa，C.，F(xiàn)antes，P.，Hyams，J.，McLeod，M.和Warbrick，E.(1993)Experiments with fission yeast.Cold Spring HarborLaboratory Press，New York)及Gutz等人(Gutz，H.，Heslot，H.，Leupold，U.和Loproieno，U.(1974)Schizosaccharomyces pombe.InHandbook ofGenetics 1，pp 395-446，Plenum Press，New York)中的描述培養(yǎng)重組菌株。
d)細(xì)胞破碎對于表達(dá)的快速控制，通過離心(5分鐘，3,500×g)除去細(xì)胞且細(xì)胞沉淀物直接用Laemmli緩沖液(Laemmli，U.K.(1970)Cleavage of structuralproteins during the assembly of the head of bacteriophage T4(Nature 227680-685))吸收用于凝膠電泳。
對于細(xì)胞破碎，通過于3,500×g離心5分鐘收獲的細(xì)胞。在1ml 1×PBS中重新懸浮細(xì)胞沉淀物并加入1個(gè)體積的玻璃珠。將混合物渦旋5分鐘，并除去玻璃珠上的上清液。
e)應(yīng)用的生物對于大腸桿菌工作應(yīng)用菌株DH5α(Invitrogen)、XL10-Gold(Stratagene)或BL21(BioLabs)。
粟酒裂殖酵母菌株來自德國Institute for Genetics of TechnischeUniversitt Dresden的G.Rdel博士教授小組的裂殖酵母收藏中心。
實(shí)施例1DewA及DewAHA表達(dá)構(gòu)建體的制備及克隆到載體pJR1-3XL中a)DewA基因的基因組DNA序列的分離及內(nèi)含子的除去如在Kaiser等人(Kaiser，C.，Michaelis，S.和Mitchell，A.(1994)Methods in Yeast Genetics.Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork)中分離的構(gòu)巢曲霉染色體DNA由A.Brakhage博士教授(Hanover，德國)友情提供。
用染色體DNA作為模板和引物SpDewBamrev及ScDewBamfor對大約550bp基因組DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
ScDewBamfor5’-TAA TAA GGA TCC ATG CGC TTC ATC GTC TCT CTC C-3’(SEQ ID NO41)SpDewBamrev5’-TAA TAA GGA TCC TTA CTC AGC CTT GGT ACC GGC-3’(SEQ ID NO28)反應(yīng)混合物通過凝膠電泳分級分離且如以上描述洗脫對應(yīng)的DNA帶。側(cè)翼為通過引物導(dǎo)入的BamHI切割位點(diǎn)的片段根據(jù)生產(chǎn)商信息用限制性內(nèi)切酶BamHI(Invitrogen)切割并自反應(yīng)混合物純化(參見上文)。
載體pUC18(Yanisch-Pron，C.，Vieira，J.和Messing，J.(1985)Improved M13 phage cloning vectors and host strainsNucleotidesequences of M13mp18 and pUC19 vectors.Gene 33103)同樣用BamHI切割，通過凝膠電泳分級分離且隨后自凝膠洗脫(參見上文)。
連接載體及片段(參見上文)且將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。在質(zhì)粒制備及隨后的限制性消化后對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定?？寺『?，所克隆PCR產(chǎn)物的正確DNA序列通過測序證實(shí)，且對于下文制備的所有構(gòu)建體也通過測序證實(shí)。根據(jù)Sanger等人(Sanger.F.，Nicklen，S.和Coulson，A.R.(1977)DNA sequencing with chain terminating inhibitors.Proc Natl AcadSci USA 745463-5467.)進(jìn)行測序反應(yīng)。在“Thermo-Sequenase fluorescentlabeled primer cycie sequencing kit with 7-deaza-dGTP”(AmershamPharamacia Biotech，F(xiàn)reiburg，德國)及5’IRD800標(biāo)記引物(MWG BiotechAG，Ebersberg，德國)幫助下進(jìn)行測序反應(yīng)。對產(chǎn)物分級分離并用自動(dòng)測序系統(tǒng)LI-COR 4000/4200(MWG Biotech AG，Ebersberg，德國)對序列進(jìn)行分析。
含有內(nèi)含子、克隆到pUC18載體的BamHI切割位點(diǎn)中的基因組DewA基因的構(gòu)建體稱作pDewAgen。
通過“重疊延伸PCR”(OEP)(參考Pogulis，R.j.，Vallejo，A.N.和Pease，L.R.In Vitro recombination and mutagenesis by overlap extension PCR.Methods Mol Biol.1996；57167-76)除去基因組DewA DNA中存在的兩個(gè)內(nèi)含子(參見基因組DewA序列SEQ ID NO39)。
用pDewAgen構(gòu)建體的DNA作為模板，在引物對ScDewBamfor/DewI1rev、DewI1for/DewI2rev及DewI2for/SpDewBamrev的幫助下，對DewA的可讀框(ORF)的亞片段進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增。
ScDewBamfor5′-TAA TAA GGA TCC ATG CGC TTC ATC GTC TCT CTC C-3′(SEQ ID NO41)Dewl1rev5′-GT GTG GTC GAC GAG AGC GAG CAG ACC CAG CTG-3′(SEQ ID NO24)Dewl1for5′-CAG CTG GGT CTG CTC GCT CTC GTC GAC CAC AC-3′(SEQ ID NO23)Dewl2rev5′-GTC GAC GGC AAC ACA GTT GGT GGT TCC CTC-3′(SEQ ID NO26)Dewl2for5′-GAG GGA ACC ACC AAC TGT GTT GCC GTC GAC-3′(SEQ ID NO25)SpDewBamrev5′-TAA TAA GGA TCC TTA CTC AGC CTT GGT ACC GGC-3′(SEQ ID NO28)這些亞片段通過凝膠電泳分級分離并純化。在最后PCR中，用所述亞片段作為模板及遠(yuǎn)側(cè)引物ScDewBamfor及ScDewBamrev擴(kuò)增無內(nèi)含子的ORF。大約410bp PCR產(chǎn)物通過凝膠電泳分級分離、純化且用限制性內(nèi)切酶BamHI切割。通過遠(yuǎn)側(cè)引物導(dǎo)入適當(dāng)?shù)那懈钗稽c(diǎn)。對切割片段進(jìn)行純化并克隆到同樣用BamHI切割的pUC18載體。將載體及片段連接(參見上文)并將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。質(zhì)粒小量制備后，鑒定重組質(zhì)粒且通過測序證實(shí)所克隆的ORF的正確序列。以這種方式獲得的構(gòu)建體(pDewAORF)作為模板用于對應(yīng)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。
b)DewHA(+內(nèi)含子)及DewHA(-內(nèi)含子)表達(dá)構(gòu)建體的制備及C末端血凝素標(biāo)記的導(dǎo)入由于不能獲得針對DewA的特異抗體，通過OEP將DewA與HA表位融合以檢測異源表達(dá)。首先，在初次PCR中，利用引物對SpDewXhofor/DewAHArev及DewAHAfor/DewAHANcorev。
SpDewXhofor5′-TAA TAA CTC GAG ATG CGC TTC ATC GTC TCT CTC C-3′(SEQ ID NO27)DewAHArev5′-TCC ACG CGG AAC CAG CTC AGC CTT GGT ACC-3′(SEQ ID NO30)DewAHAfor5′-GGT ACC AAG GCT GAG CTG GTT CCG CGT GGA-3′(SEQ ID NO29)DewAHANcorev5′-ATT ATT CCA TGG CTA TTA GCG GCC GCA CTG AGC AGC-3′(SEQ IDNO31)pDewAgen構(gòu)建體的DNA作為模板用于制備DewHA(+內(nèi)含子)，且pDewAORF構(gòu)建體的DNA作為模板用于制備DewHA(-內(nèi)含子)。攜帶HA標(biāo)記DNA序列的載體yEP351HA(Kettner，K.，F(xiàn)riederichs，S.，Schlapp，T.和Rdel G(2001)Expression of a VEGP-like protein from Parapoxvirusovis in the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomycespombe.Protein Expr Purif Aug；22(3)479-83)用作模板與DewAHAfor/DewAHANcorev用于PCR。通過引物對SpDewShofor/DewAHANcorev及各自亞片段在最終PCR中將編碼HA表位的DNA與特定DewA-DNA融合。以這種方式擴(kuò)增的片段5’側(cè)翼為XhoI限制性切割位點(diǎn)且3’側(cè)翼為NcoI限制性切割位點(diǎn)，用遠(yuǎn)側(cè)引物導(dǎo)入所述XhoI及NcoI兩個(gè)限制性切割位點(diǎn)。片段通過凝膠電泳分級分離、純化且用限制性內(nèi)切酶XhoI及NcoI切割并自反應(yīng)混合物中純化。
載體pJR1-3XL(Moreno，M.B.，Duran，A.和Ribas，J.C.A family ofmultifunctional thiamine-repressible expression vectors for fission yeast.Yeast.2000 Jun 3016(9)861-72)同樣用限制酶XhoI及NcoI切割，通過凝膠電泳分級分離并純化。將載體與片段連接(參見上文)且將連接混合物通過電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。質(zhì)粒小量制備后，鑒定重組質(zhì)粒且所克隆ORF的正確序列通過測序證實(shí)。在以此種方式獲得的DewA-HA(+內(nèi)含子)及DewA-HA(-內(nèi)含子)表達(dá)質(zhì)粒中，粟酒裂殖酵母中融合構(gòu)建體的表達(dá)處于強(qiáng)nmt1啟動(dòng)子控制下。
c)DewA-HA(+內(nèi)含子)及DewA-HA(-內(nèi)含子)的表達(dá)如通過Schiestl及Gietz(Schiestl，R.H.和Gietz，R.D.(1989)Highefficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleicacids as a carrier.Curr Genet 16339-346)描述的，將根據(jù)a)及b)獲得的DewA-HA(+內(nèi)含子)及DewA-HA(-內(nèi)含子)載體轉(zhuǎn)化到粟酒裂殖酵母宿主菌株KO103(h-sade6-M210leu1-32his7-366)中。通過leu1-32突變引起的粟酒裂殖酵母菌株的亮氨酸營養(yǎng)缺陷型通過存在于表達(dá)載體上的釀酒酵母LEU2基因互補(bǔ)。因此可能在沒有亮氨酸的基本培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化體。通過蛋白質(zhì)印跡分析研究在對應(yīng)酵母轉(zhuǎn)化體中融合蛋白的表達(dá)。
抗HA抗體(編號1583816，抗HA(12CA5)小鼠單克隆抗體)及抗c-myc抗體(編號1667149，抗c-myc抗體)購自Roche Diagnostics(Mannheim，德國)。
培養(yǎng)后，收獲酵母轉(zhuǎn)化體，用玻璃珠破碎，且除去3,500×g離心上清液。每種情況下應(yīng)用50μg 20.000×g沉淀物(“膜級分”)及50μg上清液(“胞質(zhì)蛋白質(zhì)”)并在SDS-PAGE中分級分離。用HA抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析中的檢測。圖5描述了結(jié)果。大小標(biāo)準(zhǔn)(kDa)在左邊標(biāo)出。在圖5A中，應(yīng)用含有無插入物的載體(pJR1-3XL，陰性對照)、HA標(biāo)記的對照蛋白質(zhì)(陽性對照)或包含有內(nèi)含子的HA標(biāo)記的DewA基因(DewA-HA(+內(nèi)含子))的載體的培養(yǎng)物樣品。在圖5B中，每種情況下應(yīng)用含有載體(pJR1-3XL，陰性對照)或包含無內(nèi)含子的HA標(biāo)記的DewA基因(DewA-HA(-內(nèi)含子)或有內(nèi)含子的HA標(biāo)記的RodA基因(Rod-AHA(+內(nèi)含子))的培養(yǎng)物樣品。
類似地根據(jù)實(shí)施例1a)及1b)的信息制備RodAHA(+內(nèi)含子)。RodA是來自構(gòu)巢曲霉的另一疏水蛋白。
實(shí)施例2制備用于分泌包含PDewAHA構(gòu)建體的表達(dá)的DewA載體的表達(dá)載體a)包含P因子信號肽編碼序列的PDewAHA構(gòu)建體的制備為了優(yōu)化蛋白質(zhì)從粟酒裂殖酵母細(xì)胞的分泌，將在裂殖酵母中無效的構(gòu)巢曲霉蛋白質(zhì)的真正分泌信號首先用粟酒裂殖酵母P因子的可除去信號肽替換。P因子作為肽信息素通過細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中。它在細(xì)胞中作為前體蛋白質(zhì)(前蛋白質(zhì))合成，所述前體蛋白質(zhì)由可除去的N末端信號序列及四個(gè)拷貝的P因子組成，每種情況下通過短間隔序列分隔，且在分泌過程中，經(jīng)歷成熟，包括信號序列的除去及四個(gè)P因子肽的蛋白酶解釋放。
P因子信號序列首先通過PCR且以粟酒裂殖酵母基因組DNA作為模板，用引物對SigPXhofor/PDewArev擴(kuò)增，并純化對應(yīng)的PCR產(chǎn)物。
SigPXhofor5′-TAA TTT CTC GAG ATG AAG ATC ACC GCT GTC ATT GCC CTT TTA TTC TCAC-3′(SEQ ID NO34)PDewArev5′-GGC AGA GGC CGG GAG TGG AAT AGG TGA GGC-3′(SEQ ID NO33)以引物對PDewfor/DewAHANcorev及DewAHA(-內(nèi)含子)構(gòu)建體DNA作為模板得到的PCR產(chǎn)物同樣通過凝膠電泳分級分離并純化。
PDewfor5′-GCC TCA CCT ATT CCA CTC CCG GCC TCT GCC-3′(SEQ ID NO32)DewAHANcorev5′-ATT ATT CCA TGG CTA TTA GCG GCC GCA CTG AGC AGC-3′(SEQ IDNO31)在使用遠(yuǎn)側(cè)引物SigPXhofor/DewAHANcorev的最終PCR中，這兩種初次PCR產(chǎn)物用作模板。以這種方式擴(kuò)增的PDewAHA片段5’側(cè)翼為XhoI限制性切割位點(diǎn)且3’端為NcoI限制性切割位點(diǎn)，所述兩個(gè)酶切位點(diǎn)均借助以上引物導(dǎo)入。在通過這個(gè)片段(PDewAHA)編碼的融合蛋白中，構(gòu)巢曲霉DewA的可除去的信號序列通過P因子前體蛋白質(zhì)的可除去的信號肽替換。
PDewAHA片段用限制性內(nèi)切酶XhoI及NcoI切割，通過凝膠電泳分級分離并連接到用相同限制性內(nèi)切酶切割的pJR1-3XL載體中(參見上文)。將載體及片段連接(參見上文)且將連接混合物通過電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。質(zhì)粒小量制備后，鑒定重組質(zhì)粒且通過測序證實(shí)所克隆的ORF的正確序列。獲得的構(gòu)建體稱作PDewAHA。
b)表達(dá)與實(shí)施例1c)類似進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
PDewAHA蛋白質(zhì)在粟酒裂殖酵母中表達(dá)。收獲細(xì)胞，將培養(yǎng)物上清液等分且將一份用TCA沉淀。TCA沉淀物用Laemmli緩沖液吸收(Laemmli，U.K.(1970)Cleavage of structural proteins during theassembly of the head of bacteriophage T4(Nature 227680-685))。研究細(xì)胞沉淀物、上清液及TCA沉淀的上清液。SDA-PAGE及用HA抗體進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡后檢測蛋白質(zhì)。圖6描述了結(jié)果。通過*標(biāo)明的帶對應(yīng)于前體蛋白質(zhì)(大約18kD，上面的帶)及成熟形式(大約17kD，下面的帶)。
分析顯示沒有觀察到有效分泌?？沙因子信號肽的N末端融合不足夠用于分泌融合的疏水蛋白。
實(shí)施例3制備用于分泌包含P+6DewAHA構(gòu)建體的所表達(dá)的DewA載體的表達(dá)載體a)包含P因子信號肽編碼序列，C末端延伸6個(gè)氨基酸的P+6DewAHA構(gòu)建體的制備為保證對分泌重要的信號肽的真正序列環(huán)境，通過OEP，在初次PCR反應(yīng)中使用引物對SigPXhofor/P+6DewArev及P+6DewAfor/DewAHANcorev與作為模板的PDewAHA構(gòu)建體DNA，通過6個(gè)C末端連接的氨基酸(P+6DewA)延伸融合蛋白中所述信號肽的序列SigPXhofor5′-TAA TTT CTC GAG ATG AAG ATC ACC GCT GTC ATT GCC CTT TTA TTC TCAC-3′(SEQ ID NO34)P+6DewArev5′CAC ACC AGG ATC GGC AAC TGG AAT AGG TGA GGC-3′(SEQ ID NO36)P+6DewAfor5′GTT GCC GAT CCT GGT GTG CTC CCG GCC TCT GCC-3′(SEQ ID NO35)DewAHANcorev5′ATT ATT CCA TGG CTA TTA GCG GCC GCA CTG AGC AGC-3′(SEQ IDNO31)且在最終PCR反應(yīng)中使用引物對SigPXhofor/DewAHANcorev。
P+6DewA片段用限制性內(nèi)切酶XhoI及NcoI切割，通過凝膠電泳分級分離并連接到用相同限制性內(nèi)切酶切割的pJR1-3XL載體中(參見上文)，且將連接混合物通過電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。質(zhì)粒小量制備后，鑒定重組質(zhì)粒且通過測序證實(shí)克隆的ORF的正確序列。將P+6DewA片段也克隆到pJR-81XL載體中。這里，融合基因的轉(zhuǎn)錄處于弱nmt81啟動(dòng)子的控制下。此構(gòu)建體欲用于檢測pJR1-3XL構(gòu)建體中非常高的轉(zhuǎn)錄對分泌的負(fù)面影響。
對應(yīng)的構(gòu)建體稱作P+6DewA/pJR1-3XL及P+6DewA/pJR1-81XL。與實(shí)施例2a類似進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
與實(shí)施例2a類似進(jìn)行pJR1-3XL中擴(kuò)增序列的克隆。
b)表達(dá)與實(shí)施例2b)類似進(jìn)行表達(dá)。
用通過強(qiáng)啟動(dòng)子(pJR1-3XL)及弱啟動(dòng)子(pJR1-81XL)表達(dá)P+6DewA的兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化粟酒裂殖酵母細(xì)胞。細(xì)胞染色體上攜帶具有c-myc標(biāo)記的prp1基因形式，所述標(biāo)記作為對照以排除裂解細(xì)胞對培養(yǎng)物上清液的污染。收獲(沉淀)細(xì)胞且將培養(yǎng)物上清液用TCA沉淀(上清液)。沉淀物用Laemmli緩沖液吸收并同樣分析。SDA-PAGE及用針對HA的抗體(圖7A)及針對c-myc的抗體(Roche Diagnositcs)(圖7B)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡后對蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。
如圖7示出的，此構(gòu)建體也不合適用于有效分泌。
實(shí)施例4制備用于分泌包含PfakDewAHA構(gòu)建體的表達(dá)的DewA載體的表達(dá)載體a)制備包含編碼包括P因子信號肽的成熟的第一種P因子序列的PfakDewAHA構(gòu)建體DewAHA通過OEP與成熟P因子序列的羧基末端融合。用引物對SigPXhofor/PfakDewArev及粟酒裂殖酵母基因組DNA作為模板
SigPXhotor5′-TAA TTT CTC GAG ATG AAG ATC ACC GCT GTC ATT GCC CTT TTA TTC TCAC-3′(SEQ ID NO34)PfakDewArev5′-GGC AGA GGC CGG GAG GCG CTT TTT CAA GTT GGG TC-3′(SEQ IDNO38)和引物對PfakDewAfor/DewAHANcorev及P+6DewA/pJR-81XL構(gòu)建體的DNA作為模板PfakDewAfor5′-AAC TTG AAA AAG CGC CTC CCG GCC TCT GCC-3′(SEQ ID NO37)DewAHANcorev5′ATT ATT CCA TGG CTA TTA GCG GCC GCA CTG AGC AGC-3′(SEQ IDNO31)的初次PCR反應(yīng)中獲得的PCR片段通過凝膠電泳分離，純化且用作模板用于借助引物對SigPXhofor/DewAHANcorev的最終PCR。以這種方式獲得的PfakDewA片段用限制性內(nèi)切酶XhoI及NcoI切割，通過凝膠電泳分級分離并連接到用相同限制性內(nèi)切酶切割的pJR1-81XL載體中(參見上文)。將連接混合物通過電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。質(zhì)粒小量制備后，鑒定重組質(zhì)粒且通過測序證實(shí)所克隆的ORF的正確序列。此構(gòu)建體稱作PfakDewA/pJR-81XL。在此構(gòu)建體中，編碼包括第一個(gè)氨基端信息素的P因子前蛋白質(zhì)并編碼疏水蛋白的融合序列處于nmt81啟動(dòng)子的控制下。
與實(shí)施例2a類似進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但應(yīng)用pJR1-81XL表達(dá)載體。
與實(shí)施例2a類似將擴(kuò)增序列克隆到pJR1-81XL中。為此，將用限制性內(nèi)切酶XhoI及NcoI切割的擴(kuò)增DNA克隆到pJR1-81XL表達(dá)載體的XhoI及NcoI切割位點(diǎn)中。
b)表達(dá)與實(shí)施例3a)類似進(jìn)行表達(dá)。
沉淀細(xì)胞且將培養(yǎng)物上清液用TCA沉淀。沉淀物用Laemmli緩沖液吸收并同樣地分析。SDA-PAGE及使用針對HA的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡后檢測蛋白質(zhì)。圖8描述了結(jié)果，其表明借助此構(gòu)建體獲得的疏水蛋白有效分泌到培養(yǎng)基中。因此，對應(yīng)的融合蛋白包含在它們的真正背景中分泌所需的所有P因子前蛋白質(zhì)序列。P因子自身可蛋白酶解除去。
實(shí)施例5所表達(dá)的疏水蛋白吸附到特氟隆的顯微鏡檢查利用熒光標(biāo)記的HA抗體(Molecular Probes，目錄號A-21287)，顯微鏡檢查所表達(dá)的疏水蛋白向特氟隆的吸附。
培養(yǎng)根據(jù)實(shí)施例1至4中任意一個(gè)制備的經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。分別收獲細(xì)胞及適當(dāng)時(shí)收獲上清液。用不含疏水蛋白基因的對應(yīng)載體轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)的細(xì)胞和對應(yīng)的培養(yǎng)物上清液作為參考樣品。
將細(xì)胞機(jī)械破碎(振動(dòng)研磨機(jī))。將特氟隆板在細(xì)胞破碎溶液中或在上清液中于室溫孵育18小時(shí)，且用水沖洗(3×10分鐘)。然后將經(jīng)處理的特氟隆在PBS中與熒光標(biāo)記的抗體孵育，接著再用PBS沖洗(3×15分鐘)且在氮?dú)鈬娚淦髦懈稍?。最后，在熒光顯微鏡下進(jìn)行評估。
對參考樣品沒有觀察到熒光(結(jié)果沒有顯示)，但在細(xì)胞勻漿物或培養(yǎng)物上清液(此時(shí)疏水蛋白通過表達(dá)細(xì)胞分泌)中孵育后斑點(diǎn)狀熒光是明顯的。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>蛋白質(zhì)從酵母的分泌<130>M/44234<160>56<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>171<212>DNA<213>粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)<220>
<221>CDS<222>(1)..(171)<223>
<400>1atg aag atc acc gct gtc att gcc ctt tta ttc tca ctt gct gct gcc48Met Lys Ile Thr Ala Val Ile Ala Leu Leu Phe Ser Leu Ala Ala Ala1 5 10 15tca cct att cca gtt gcc gat cct ggt gtg gtt tca gtt agc aag tca96Ser Pro Ile Pro Val Ala Asp Pro Gly Val Val Ser Val Ser Lys Ser20 25 30tat gct gat ttc ctt cgt gtt tac caa agt tgg aac act ttt get aat 144Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Val Tyr Gln Ser Trp Asn Thr Phe Ala Asn35 40 45cct gat aga ccc aac ttg aaa aag cgc 171Pro Asp Arg Pro Asn Leu Lys Lys Arg50 55<210>2<211>57<212>PRT<213>粟酒裂殖酵母<400>2Met Lys Ile Thr Ala Val Ile Ala Leu Leu Phe Ser Leu Ala Ala Ala1 5 10 15
Ser Pro Ile Pro Val Ala Asp Pro Gly Val Val Ser Val Ser Lys Ser20 25 30Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Val Tyr Gln Ser Trp Asn Thr Phe Ala Asn35 40 45Pro Asp Arg Pro Asn Leu Lys Lys Arg50 55<210>3<211>60<212>DNA<213>粟酒裂殖酵母<220>
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<220>
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<400>3atg aag atc acc gct gtc att gcc ctt tta ttc tca ctt gct gct gcc 48Met Lys Ile Thr Ala Val Ile Ala Leu Leu Phe Ser Leu Ala Ala Ala1 5 10 15tca cct att cea 60Ser Pro Ile Pro20<210>4<211>20
<212>PRT<213>粟酒裂殖酵母<400>4Met Lys Ile Thr Ala Val Ile Ala Leu Leu Phe Ser Leu Ala Ala Ala1 5 10 15Ser Pro Ile Pro20<210>5<211>81<212>DNA<213>粟酒裂殖酵母<220>
<221>CDS<222>(1)..(81)<223>
<400>5aag tca tat gct gat ttc ctt cgt gtt tac caa agt tgg aac act ttt48Lys Ser Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Val Tyr Gln Ser Trp Asn Thr Phe1 5 10 15gct aat cct gat aga ccc aac ttg aaa aag cgc81Ala Asn Pro Asp Arg Pro Asn Leu Lys Lys Arg20 25<210>6<211>27<212>PRT<213>粟酒裂殖酵母<400>6Lys Ser Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Val Tyr Gln Ser Trp Asn Thr Phe1 5 10 15
Ala Asn Pro Asp Arg Pro Asn Leu Lys Lys Arg20 25<210>7<211>78<212>DNA<213>粟酒裂殖酵母<220>
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<220>
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<400>7atg aag atc acc gct gtc att gcc ctt tta ttc tca ctt gct gct gcc 48Met Lys Ile Thr Ala Val Ile Ala Leu Leu Phe Ser Leu Ala Ala Ala1 5 10 15tca cct att cca gtt gcc gat cct ggt gtg 78Ser Pro Ile Pro Val Ala Asp Pro Gly Val20 25<210>8<211>26<212>PRT<213>粟酒裂殖酵母<400>8Met Lys Ile Thr Ala Val Ile Ala Leu Leu Phe Ser Leu Ala Ala Ala1 5 10 15Set Pro Ile Pro Val Ala Asp Pro Gly Val20 25
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<400>9atg aag atc acc gct gtc att gcc ctt tta ttc tca ctt gct gct gcc 48Met Lys Ile Thr Ala Val Ile Ala Leu Leu Phe Ser Leu Ala Ala Ala1 5 10 15tca cct att cca gtt gcc gat cct ggt gtg gtt tca gtt agc aag tca 96Ser Pro Ile Pro Val Ala Asp Pro Gly Val Val Ser Val Ser Lys Ser20 25 30tat gct gat ttc ctt cgt gtt tac caa agt tgg aac act ttt gct aat144Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Val Tyr Gln Ser Trp Asn Thr Phe Ala Asn35 40 45cct gat aga ccc aac ttg aaa aag cgc gaa ttc gaa gct gct ccc gca192Pro Asp Arg Pro Asn Leu Lys Lys Arg Glu Phe Glu Ala Ala Pro Ala50 55 60aaa act tat gct gat ttc ctt cgt gct tat caa agt tgg aac act ttt240Lys Thr Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Ala Tyr Gln Ser Trp Asn Thr Phe65 70 75 80gtt aat cct gac aga ccc aat ttg aaa aag cgt gag ttt gaa gct gcc288Val Asn Pro Asp Arg Pro Asn Leu Lys Lys Arg Glu Phe Glu Ala Ala85 90 95cca gag aag agt tat gct gat ttc ctt cgt gct tac cat agt tgg aac336Pro Glu Lys Ser Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Ala Tyr His Ser Trp Asn100 105 110act ttt gtt aat cct gac aga ccc aac ttg aaa aag cgc gaa ttc gaa384Thr Phe Val Asn Pro Asp Arg Pro Asn Leu Lys Lys Arg Glu Phe Glu
115 120 125gct gct ccc gca aaa act tat gct gat ttc ctt cgt gct tac caa agt432Ala Ala Pro Ala Lys Thr Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Ala Tyr Gln Ser130 135 140tgg aac act ttt gtt aat cct gac aga ccc aac ttg aaa aag cgc act480Trp Asn Thr Phe Val Asn Pro Asp Arg Pro Asn Leu Lys Lys Arg Thr145 150 155 160gaa gaa gat gaa gag aat gag gaa gag gat gaa gaa tac tat cgc ttt528Glu Glu Asp Glu Glu Asn Glu Glu Glu Asp Glu Glu Tyr Tyr Arg Phe165 170 175ctt cag ttt tat atc atg act gtc cea gag aat tcc act att aca gat576Leu Gln Phe Tyr Ile Met Thr Val Pro Glu Asn Ser Thr Ile Thr Asp180 185 190gtc aat att act gcc aaa ttt gag agc taa606Val Asn Ile Thr Ala Lys Phe Glu Ser195 200<210>10<211>201<212>PRT<213>粟酒裂殖酵母<400>10Met Lys Ile Thr Ala Val Ile Ala Leu Leu Phe Ser Leu Ala Ala Ala1 5 10 15Ser Pro Ile Pro Val Ala Asp Pro Gly Val Val Ser Val Ser Lys Ser20 25 30Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Val Tyr Gln Ser Trp Asn Thr Phe Ala Asn35 40 45Pro Asp Arg Pro Asn Leu Lys Lys Arg Glu Phe Glu Ala Ala Pro Ala50 55 60
Lys Thr Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Ala Tyr Gln Ser Trp Asn Thr Phe65 70 75 80Val Asn Pro Asp Arg Pro Asn Leu Lys Lys Arg Glu Phe Glu Ala Ala85 90 95Pro Glu Lys Ser Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Ala Tyr His Ser Trp Asn100 105 110Thr Phe Val Asn Pro Asp Arg Pro Asn Leu Lys Lys Arg Glu Phe Glu115 120 125Ala Ala Pro Ala Lys Thr Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Ala Tyr Gln Ser130 135 140Trp Asn Thr Phe Val Asn Pro Asp Arg Pro Asn Leu Lys Lys Arg Thr145 150 155 160Glu Glu Asp Glu Glu Asn Glu Glu Glu Asp Glu Glu Tyr Tyr Arg Phe165 170 175Leu Gln Phe Tyr Ile Met Thr Val Pro Glu Asn Ser Thr Ile Thr Asp180 185 190Val Asn Ile Thr Ala Lys Phe Glu Ser195 200<210>11<211>156<212>DNA<213>未知<220>
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<223>待完成<400>12Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Glu Gly Arg Gly Gly Arg Ile Phe Tyr1 5 10 15Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp20 25 30
Tyr Ala Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ala Gln Cys35 40 45Gly Arg50<210>13<211>354<212>DNA<213>構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)<220>
<221>CDS<222>(1)..(354)<223>
<400>13ctc ccg gcc tct gcc gca aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg gcg gcc48Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala1 5 10 15ttc gcc aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg atc gct96Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser Ile Ala20 25 30tgc tgc aac tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg agc ggt 144Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly35 40 45ctg ctc ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctc tcg ggc aac act ggc agc 192Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ser50 55 60gcc tgc gcc aag gcg agc ttg att gac cag ctg ggt ctg ctc gct ctc 240Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu Ala Leu65 70 75 80gtc gac cac act gag gaa ggc ccc gtc tgc aag aac atc gtc gct tgc 288Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val Ala Cys
85 90 95tgc cct gag gga acc acc aac tgt gtt gcc gtc gac aac gct ggc gcc336Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala100 105 110ggt acc aag gct gag taa354Gly Thr Lys Ala Glu115<210>14<211>117<212>PRT<213>構(gòu)巢曲霉<400>14Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala1 5 10 15Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser Ile Ala20 25 30Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly35 40 45Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ser50 55 60Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu lle Asp Gln Leu Gly Leu Leu Ala Leu65 70 75 80Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val Ala Cys85 90 95Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala100 105 110
Gly Thr Lys Ala Glu115<210>15<211>408<212>DNA<213>構(gòu)巢曲霉<220>
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100 105 110gct tgc tgc cct gag gga acc acc aac tgt gtt gcc gtc gac aac gct 384Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala115 120 125ggc gcc ggt acc aag gct gag taa 408Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu130 135<210>16<211>135<212>PRT<213>構(gòu)巢曲霉<400>16Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala1 5 10 15Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser20 25 30Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser35 40 45Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu50 55 60Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr65 70 75 80Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu85 90 95Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val100 105 110
Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala115 120 125Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu130 135<210>17<211>678<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>融合蛋白<220>
<221>CDS<222>(1)..(678)<223>
<400>17atg aag atc acc gct gtc att gcc ctt tta ttc tca ctt gct gct gcc 48Met Lys Ile Thr Ala Val Ile Ala Leu Leu Phe Ser Leu Ala Ala Ala1 5 10 15tca cct att cca gtt gcc gat cct ggt gtg gtt tca gtt agc aag tca 96Ser Pro Ile Pro Val Ala Asp Pro Gly Val Val Ser Val Ser Lys Ser20 25 30tat gct gat ttc ctt cgt gtt tac caa agt tgg aac act ttt gct aat 144Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Val Tyr Gln Ser Trp Asn Thr Phe Ala Asn35 40 45cct gat aga ccc aac ttg aaa aag cgc ctc ccg gcc tct gcc gca aag 192Pro Asp Arg Pro Asn Leu Lys Lys Arg Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys50 55 60aac gcg aag ctg gcc acc tcg gcg gcc ttc gcc aag cag gct gaa ggc 240Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly
65 70 75 80acc acc tgc aat gtc ggc tcg atc gct tgc tgc aac tcc ccc gct gag 288Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu85 90 95acc aac aac gac agt ctg ttg agc ggt ctg ctc ggt gct ggc ctt ctc 336Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu100 105 110aac ggg ctc tcg ggc aac act ggc agc gcc tgc gcc aag gcg agc ttg 384Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu115 120 125att gac cag ctg ggt ctg ctc gct ctc gtc gac cac act gag gaa ggc 432Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly130 135 140ccc gtc tgc aag aac atc gtc gct tgc tgc cct gag gga acc acc aac 480Pro Val Cys Lys Asn Ile Val Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn145 150 155 160tgt gtt gcc gtc gac aac gct ggc gcc ggt acc aag gct gag ctg gtt 528Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu Leu Val165 170 175ccg cgt gga tcc atc gaa ggt cgt ggc ggc cgc atc ttt tac cca tac 576Pro Arg Gly Ser Ile Glu Gly Arg Gly Gly Arg Ile Phe Tyr Pro Tyr180 185 190gat gtt cct gac tat gcg ggc tat ccc tat gac gtc ccg gac tat gca 624Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala195 200 205gga tcc tat cca tat gac gtt cca gat tac gct gct cag tgc ggc cgc 672Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ala Gln Cys Gly Arg210 215 220taa tag 678<210>18<211>224
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合蛋白<400>18Met Lys Ile Thr Ala Val Ile Ala Leu Leu Phe Ser Leu Ala Ala Ala1 5 10 15Ser Pro Ile Pro Val Ala Asp Pro Gly Val Val Ser Val Ser Lys Ser20 25 30Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Val Tyr Gln Ser Trp Asn Thr Phe Ala Asn35 40 45Pro Asp Arg Pro Asn Leu Lys Lys Arg Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys50 55 60Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly65 70 75 80Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu85 90 95Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu100 105 110Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu115 120 125Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly130 135 140
Pro Val Cys Lys Asn Ile Val Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn145 150 155 160Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu Leu Val165 170 175Pro Arg Gly Ser Ile Glu Gly Arg Gly Gly Arg Ile Phe Tyr Pro Tyr180 185 190Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala195 200 205Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ala Gln Cys Gly Arg210 215 220<210>19<211>131<212>PRT<213>天監(jiān)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)<400>19Met Leu Lys Lys Ala Met Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Val Ile1 5 10 15Gly Met Ser Ala Ala Ala Ala Pro Gln Ala Leu Ala Ile Gly Asp Asp20 25 30Asn Gly Pro Ala Val Ala Asn Gly Asn Gly Ala Glu Ser Ala Phe Gly35 40 45Asn Ser Ala Thr Lys Gly Asp Met Ser Pro Gln Leu Ser Leu Val Glu50 55 60Gly Thr Leu Asn Lys Pro Cys Leu Gly Val Glu Asp Val Asn Val Ala
65 70 75 80Val Ile Asn Leu Val Pro Ile Gln Asp Ile Asn Val Leu Ala Asp Asp85 90 95Leu Asn Gln Gln Cys Ala Asp Asn Ser Thr Gln Ala Lys Arg Asp Gly100 105 110Ala Leu Ser His Val Leu Glu Asp Leu Ser Val Leu Ser Ala Asn Gly115 120 125Glu Gly Arg130<210>20<211>133<212>PRT<213>天藍(lán)色鏈霉菌<400>20Met Ile Lys Lys Val Val Ala Tyr Ala Ala Ile Ala Ala Ser Val Met1 5 10 15Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Pro Gln Ala Met Ala Ile Gly Asp Asp20 25 30Ser Gly Pro Val Ser Ala Asn Gly Asn Gly Ala Ser Gln Tyr Phe Gly35 40 45Asn Ser Met Thr Thr Gly Asn Met Ser Pro Gln Met Ala Leu Ile Gln50 55 60Gly Ser Phe Asn Lys Pro Cys Ile Ala Val Ser Asp Ile Pro Val Ser65 70 75 80
Val Ile Gly Leu Val Pro Ile Gln Asp Leu Asn Val Leu Gly Asp Asp85 90 95Met Asn Gln Gln Cys Ala Glu Asn Ser Thr Gln Ala Lys Arg Asp Gly100 105 110Ala Leu Ala His Leu Leu Glu Asp Val Ser Ile Leu Ser Ser Asn Gly115 120 125Glu Gly Gly Lys Gly130<210>21<211>112<212>PRT<213>Agaricus bisporus<400>21Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu1 5 10 15Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys20 25 30Asp Val Gly Glu Ile His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His35 40 45Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro Ile Asn Leu Gly50 55 60Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly65 70 75 80
Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe85 90 95Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu100 105 110<210>22<211>119<212>PRT<213>Agaricus bisporus<400>22Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leul 5 l0 15Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys20 25 30His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser35 40 45Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu50 55 60Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro65 70 75 80Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr85 90 95Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys100 105 110
Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val115<210>23<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>23cagctgggtc tgctcgctct cgtcgaccac ac32<210>24<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>24gtgtggtcga cgagagcgag cagacccagc tg32<210>25<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>25gagggaacca ccaactgtgt tgccgtcgac 30
<210>26<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>26gtcgacggca acacagttgg tggttccctc 30<210>27<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>27taataactcg agatgcgctt catcgtctct ctcc 34<210>28<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>28taataaggat ccttactcag ccttggtacc ggc 33<210>29<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>29ggtaccaagg ctgagctggt tccgcgtgga 30<210>30<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>30tccacgcgga accagctcag ccttggtacc 30<210>31<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>31attattccat ggctattagc ggccgcactg agcagc36<210>32<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>32gcctcaccta ttccactccc ggcctctgcc 30
<210>33<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>33ggcagaggcc gggagtggaa taggtgaggc 30<210>34<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>34taatttctcg agatgaagat caccgctgtc attgcccttt tattctcac 49<210>35<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>35gttgccgatc ctggtgtgct cccggcctct gcc 33<210>36<211>33
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>36cacaccagga tcggcaactg gaataggtga ggc 33<210>37<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>37aacttgaaaa agcgcctccc ggcctctgcc 30<210>38<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>38ggcagaggcc gggaggcgct ttttcaagtt gggtc 35<210>39<211>552<212>DNA<213>構(gòu)巢曲霉<220>
<221>CDS<222>(1)..(288)
<223>
<220>
<221>CDS<222>(508)..(549)<223>
<220>
<221>內(nèi)含子<222>(456)..(507)<223>
<220>
<221>CDS<222>(381)..(455)<223>
<220>
<221>內(nèi)含子<222>(289)..(380)<223>
<400>39atg cgc ttc ate gtc tct ctc ctc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gca 48Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala1 5 10 15acc gcc ctc ecg gcc tct gcc gca aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg 96Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser20 25 30gcg gcc ttc gcc aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg 144Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser35 40 45atc gct tgc tgc aac tcc ccc get gag acc aac aac gac agt ctg ttg 192Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu50 55 60
agc ggt ctg crc ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctc tog ggc aac act240Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr65 70 75 80ggc agc gcc tgc gcc aag gcg agc ttg att gac cag ctg ggt ctg ctc288Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu85 90 95ggtacgtgat ccccactcag tcgctcccgg agaggctgag ggaagacgag cgacggtcta 348gaaatggtgt gctaatagat gcatgtgtgc ag ctc tcg tcg acc aca ctg agg401Leu Ser Ser Thr Thr Leu Arg100aag gcc ccg tct gca aga aca tcg tcg ctt gct gcc ctg agg gaa cca449Lys Ala Pro Ser Ala Arg Thr Ser Ser Leu Ala Ala Leu Arg Glu Pro105 110 115cca acg tacgtctttc agatctgcta caagtgaggc gatcaaaact aacatattcc ag 507Pro Thr120tgt gtt gcc gtc gac aac gct ggc gcc ggt acc aag gct gag taa552Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu125 130 135<210>40<211>135<212>PRT<213>構(gòu)巢曲霉<400>40Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala1 5 10 15Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser20 25 30Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser35 40 45
Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu50 55 60Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr65 70 75 80Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu85 90 95Leu Ser Ser Thr Thr Leu Arg Lys Ala Pro Ser Ala Arg Thr Ser Ser100 105 110Leu Ala Ala Leu Arg Glu Pro Pro Thr Cys Val Ala Val Asp Asn Ala115 120 125Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu130 135<210>41<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>41taataaggat ccatgcgctt catcgtctct ctcc 34<210>42<211>129<212>DNA<213>粟酒裂殖酵母
<220>
<221>CDS<222>(1)..(126)<223>
<400>42atg gac tca atg gct aac tcc gtt tct tcc tcc tct gtc gtc aac gct 48Met Asp Ser Met Ala Asn Ser Val Ser Ser Ser Ser Val Val Asn Ala1 5 10 15ggc aac aag cct gct gaa act ctt aac aag acc gtt aag aat tat acc 96Gly Asn Lys Pro Ala Glu Thr Leu Asn Lys Thr Val Lys Asn Tyr Thr20 25 30ccc aag gtt cct tac atg tgt gtc att gca taa 129Pro Lys Val Pro Tyr Met Cys Val Ile Ala35 40<210>43<211>42<212>PRT<213>粟酒裂殖酵母<400>43Met Asp Ser Met Ala Asn Ser Val Ser Ser Ser Ser Val Val Asn Ala1 5 10 15Gly Asn Lys Pro Ala Glu Thr Leu Asn Lys Thr Val Lys Asn Tyr Thr20 25 30Pro Lys Val Pro Tyr Met Cys Val Ile Ala35 40<210>44<211>27<212>DNA<213>粟酒裂殖酵母
<400>44tataccccca aggttcctta catgtgt 27<210>45<211>135<212>DNA<213>粟酒裂殖酵母<220>
<221>CDS<222>(1)..(132)<223>
<400>45atg gac tcc att gca act aac act cat tct tca tcc att gtc aat gcc 48Met Asp Ser Ile Ala Thr Asn Thr His Ser Ser Ser Ile Val Asn Ala1 5 10 15tac aac aac aat cct acc gat gtt gta aaa act caa aac att aaa aat 96Tyr Asn Asn Asn Pro Thr Asp Val Val Lys Thr Gln Asn Ile Lys Asn20 25 30tat act cca aag gtt cct tat atg tgt gta att gct taa 135Tyr Thr Pro Lys Val Pro Tyr Met Cys Val Ile Ala35 40<210>46<211>44<212>PRT<213>粟酒裂殖酵母<400>46Met Asp Ser Ile Ala Thr Asn Thr His Ser Ser Ser Ile Val Asn Ala1 5 10 15Tyr Asn Asn Asn Pro Thr Asp Val Val Lys Thr Gln Asn Ile Lys Asn20 25 30
Tyr Thr Pro Lys Val Pro Tyr Met Cys Val Ile Ala35 40<210>47<211>27<212>DNA<213>粟酒裂殖酵母<400>47tatactccaa aggttcctta tatgtgt 27<210>48<211>126<212>DNA<213>粟酒裂殖酵母<220>
<221>CDS<222>(1)..(123)<223>
<400>48atg gac tca atg gct aac act gtt tct tcc tcc gtc gtt aac act ggc 48Met Asp Ser Met Ala Asn Thr Val Ser Ser Ser Val Val Asn Thr Gly1 5 10 15aac aag cct tct gaa act ctt aac aag act gtt aag aat tat acc ccc 96Asn Lys Pro Ser Glu Thr Leu Asn Lys Thr Val Lys Asn Tyr Thr Pro20 25 30aag gtt cct tac atg tgt gtc att gca taa 126Lys Val Pro Tyr Met Cys Val Ile Ala35 40<210>49<211>41<212>PRT<213>粟酒裂殖酵母<400>49
Met Asp Ser Met Ala Asn Thr Val Ser Ser Ser Val Val Asn Thr Gly1 5 10 15Asn Lys Pro Ser Glu Thr Leu Asn Lys Thr Val Lys Asn Tyr Thr Pro20 25 30Lys Val Pro Tyr Met Cys Val Ile Ala35 40<210>50<211>27<212>DNA<213>粟酒裂殖酵母<400>50tataccccca aggttcctta catgtgt 27<210>51<211>9<212>PRT<213>粟酒裂殖酵母<400>51Tyr Thr Pro Lys Val Pro Tyr Met Cys1 5<210>52<211>586<212>DNA<213>構(gòu)巢曲霉<220>
<221>內(nèi)含子<222>(471)..(530)<223>
<220>
<221>內(nèi)含子<222>(338)..(389)<223>
<400>52atgaagttct ccattgctgc cgctgtcgtt gctttcgccg cctccgtcgc ggccctccct 60cctgcccatg attcccagtt cgctggcaat ggtgttggca acaagggcaa cagcaacgtc120aagttccctg tccccgaaaa cgtgaccgtc aagcaggcct ccgacaagtg cggtgaccag180gcccagctct cttgctgcaa caaggccacg tacgccggtg acaccacaac cgttgatgag240ggtcttctgt ctggtgccct cagcggcctc atcggcgccg ggtctggtgc cgaaggtctt300ggtctcttcg atcagtgctc caagcttgat gttgctggtc agttcttcga aaatcacttt360cgtgatgccc caatgctaac aattaccagt cctcattggc atccaagatc ttgtcaacca420gaagtgcaag caaaacattg cctgctgcca gaactccccc tccagcgcgg tatgttccct480tgttttacag cttattcact taaaccgatt aatctaacaa cgctcacagg atggcaacct540tattggtgtc ggtctccctt gcgttgccct tggctccatc ctctaa 586<210>53<211>474<212>DNA<213>構(gòu)巢曲霉<220>
<221>CDS<222>(1)..(471)<223>
<400>53atg aag ttc tcc att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc 48Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val1 5 10 15
gcg gcc ctc cct cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt96Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val20 25 30ggc aac aag ggc aac agc aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg144Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val35 40 45acc gtc aag cag gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tct192Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser50 55 60tgc tgc aac aag gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag240Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu65 70 75 80ggt ctt ctg tct ggt gcc ctc agc ggc ctc atc ggc gcc ggg tct ggt288Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly85 90 95gcc gaa ggt ctt ggt ctc ttc gat cag tgc tcc aag ctt gat gtt gct336Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala100 105 110gtc ctc att ggc atc caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac384Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn115 120 125att gcc tgc tgc cag aac tcc ccc tcc agc gcg gat ggc aac ctt att432Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile130 135 140ggt gtc ggt ctc cct tgc gtt gcc ctt ggc tcc atc ctc taa474Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu145 150 155<210>54<211>157<212>PRT<213>構(gòu)巢曲霉<400>54
Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val1 5 10 15Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val20 25 30Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val35 40 45Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser50 55 60Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu65 70 75 80Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly85 90 95Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala100 105 110Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn115 120 125Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile130 135 140Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu145 150 155<210>55<211>420<212>DNA
<213>構(gòu)巢曲霉<220>
<221>CDS<222>(1)..(417)<223>
<400>55ctc cct cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt ggc aac 48Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn1 5 10 15aag ggc aac agc aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg acc gtc 96Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val20 25 30aag cag gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tct tgc tgc 144Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys35 40 45aac aag gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag ggt ctt 192Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu50 55 60ctg tct ggt gcc ctc agc ggc ctc atc ggc gcc ggg tct ggt gcc gaa 240Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu65 70 75 80ggt ctt ggt ctc ttc gat cag tgc tcc aag ctt gat gtt gct gtc ctc 288Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu85 90 95att ggc atc caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac att gcc 336Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala100 105 110tgc tgc cag aac tcc ccc tcc agc gcg gat ggc aac ctt att ggt gtc 384Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val115 120 125ggt ctc cct tgc gtt gcc ctt ggc tcc atc ctc taa 420Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu130 135
<210>56<211>139<212>PRT<213>構(gòu)巢曲霉<400>56Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn1 5 10 15Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val20 25 30Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys35 40 45Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu50 55 60Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu65 70 75 80Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu85 90 95Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala100 105 110Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val115 120 125Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu130 13權(quán)利要求
1.表達(dá)構(gòu)建體，其包含編碼穿梭肽構(gòu)建體的核酸序列，所述穿梭肽構(gòu)建體是酵母細(xì)胞可加工的，具有式(Sig-SP)，并且所述表達(dá)構(gòu)建體在5’-3’方向包含核酸序列，其編碼a)信號肽(Sig)，其可加工地連接b)所述酵母細(xì)胞分泌的至少一種穿梭肽(SP)。
2.權(quán)利要求1中要求保護(hù)的表達(dá)構(gòu)建體，其中穿梭肽構(gòu)建體(Sig-SP)來自通過裂殖酵母屬，特別是粟酒裂殖酵母加工的多肽。
3.前面權(quán)利要求任意一項(xiàng)要求保護(hù)的表達(dá)構(gòu)建體，其中穿梭肽構(gòu)建體(Sig-SP)來自酵母的信息素前蛋白質(zhì)，所述信息素(Pher)來自該前蛋白質(zhì)并且可通過N-及C-末端加工分泌。
4.權(quán)利要求3中要求保護(hù)的表達(dá)構(gòu)建體，其中信號多肽(Sig)為信息素前蛋白質(zhì)的可蛋白酶解除去的天然信號多肽。
5.權(quán)利要求4中要求保護(hù)的表達(dá)構(gòu)建體，其中經(jīng)C末端加工的信息素(Pher)包含C末端蛋白酶切割位點(diǎn)。
6.前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)要求保護(hù)的表達(dá)構(gòu)建體，其還包含編碼與穿梭肽構(gòu)建體(Sig-SP)的C末端可加工地連接的同源或異源靶蛋白(Targ)的核酸序列。
7.前面權(quán)利要求任意一項(xiàng)中要求保護(hù)的表達(dá)構(gòu)建體，其包含編碼融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白可通過酵母細(xì)胞加工且具有式Sig-L1n-Pher-L2m-Targ其中Sig、Pher及Targ如以上定義，L1及L2為可加工的接頭并且n及m相互獨(dú)立地為0或1。
8.前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)要求保護(hù)的表達(dá)構(gòu)建體，其中編碼穿梭肽構(gòu)建體(Sig-SP)的核酸序列包含根據(jù)SEQ ID NO32的信號多肽編碼序列或其功能等同物，其有效連接編碼成熟信息素蛋白(P因子)的根據(jù)SEQ IDNO5的核酸序列或其功能等同物。
9.前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)要求保護(hù)的表達(dá)構(gòu)建體，其中編碼穿梭肽構(gòu)建體的核酸序列包含根據(jù)SEQ ID NO1的序列，其在適當(dāng)時(shí)在3’端由編碼靶蛋白(Targ)的序列延伸。
10.前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)要求保護(hù)的表達(dá)構(gòu)建體，其中靶蛋白為疏水蛋白，特別是I類疏水蛋白。
11.如權(quán)利要求10中要求保護(hù)的表達(dá)構(gòu)建體，其中疏水蛋白選自SEQID NO14(DewA)、SEQ ID NO19(RdIA)、SEQ ID NO20(RdIB)、SEQID NO21(HYP1)及SEQ ID NO22(HYP4)或通過根據(jù)SEQ ID NO13的核酸序列編碼。
12.表達(dá)載體，其包含前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)要求保護(hù)的表達(dá)構(gòu)建體，該表達(dá)構(gòu)建體與至少一種調(diào)節(jié)核酸序列有效連接。
13.重組微生物，其包含適當(dāng)時(shí)穩(wěn)定整合到宿主基因組的至少一個(gè)如權(quán)利要求12中要求保護(hù)的表達(dá)載體或如權(quán)利要求1至11中任意一項(xiàng)要求保護(hù)的表達(dá)構(gòu)建體。
14.如權(quán)利要求13中要求保護(hù)的微生物，其選自酵母。
15.如權(quán)利要求14中要求保護(hù)的微生物，其選自裂殖酵母屬，特別是粟酒裂殖酵母的酵母。
16.通過酵母細(xì)胞可加工且來自酵母的信息素前蛋白質(zhì)的穿梭肽構(gòu)建體(Sig-SP)，其中信息素來自所述前蛋白質(zhì)且可通過N-及C-末端加工分泌。
17.如權(quán)利要求16中要求保護(hù)的穿梭肽構(gòu)建體，其包含與C末端可加工的信息素多肽的N末端可加工地連接的信號多肽。
18.如權(quán)利要求17中要求保護(hù)的穿梭肽構(gòu)建體，其中信號多肽為信息素前蛋白質(zhì)的可蛋白酶解除去的天然信號多肽。
19.如權(quán)利要求17中要求保護(hù)的穿梭肽構(gòu)建體，其中C末端加工的信息素多肽包含C末端蛋白酶切割位點(diǎn)。
20.如在權(quán)利要求16至19中任意一項(xiàng)要求保護(hù)的穿梭肽構(gòu)建體，其包含如SEQ ID NO2中定義的氨基酸序列或其功能等同物。
21.重組制備靶蛋白的方法，其包括培養(yǎng)如權(quán)利要求13至15中任意一項(xiàng)的微生物、表達(dá)編碼所述靶蛋白的核酸序列及分離分泌到培養(yǎng)基中的靶蛋白。
22.如權(quán)利要求21中要求保護(hù)的方法，其中靶蛋白為如權(quán)利要求10或11中定義的疏水蛋白。
23.核酸，其編碼如權(quán)利要求16至20中任意一項(xiàng)要求保護(hù)的穿梭肽構(gòu)建體。
24.核酸，其如權(quán)利要求1至11中任意一項(xiàng)定義。
25.疏水蛋白，其可以通過如權(quán)利要求22中要求保護(hù)的方法獲得。
26.如權(quán)利要求25中要求保護(hù)的疏水蛋白用于表面處理的用途。
27.如權(quán)利要求26中要求保護(hù)的用途，其中處理選自玻璃、纖維、織物、皮革、上漆物品、膜及正面的物體的表面。
28.如權(quán)利要求10或11中定義的疏水蛋白的用途，用于纖維、織物及皮革的表面處理。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含核酸序列的表達(dá)構(gòu)建體，所述核酸序列編碼可通過酵母細(xì)胞加工的穿梭肽構(gòu)建體；涉及包含此類構(gòu)建體的對應(yīng)表達(dá)載體；涉及在其幫助下重組制備靶蛋白的方法；涉及用其轉(zhuǎn)化的宿主；涉及穿梭肽及編碼所述穿梭肽的核酸序列；涉及編碼與外源蛋白質(zhì)融合的此類穿梭肽的核酸序列；涉及用此種穿梭肽制備的疏水蛋白及涉及疏水蛋白用于涂布物體例如皮革的用途。
文檔編號C12N15/62GK1852983SQ200480026522
公開日2006年10月25日 申請日期2004年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月16日
發(fā)明者K·奧斯特曼, G·勒德爾 申請人:巴斯福股份公司