專利名稱：M－csf的抗體的制作方法
本申請(qǐng)要求2003年9月10日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/502,163的權(quán)益。
背景技術(shù)：
巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)是稱為集落刺激因子(CSFs)的蛋白質(zhì)家族的一員。M-CSF為一種分泌性或細(xì)胞表面糖蛋白，此種糖蛋白包括二個(gè)以二硫鍵連結(jié)的亞基，且其總分子量在40至90kD間變化(Stanley E.R.等人，Mol.Reprod.Dev.，464-10(1997))。如同其它CSFs，M-CSF是由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及人類關(guān)節(jié)組織細(xì)胞(如軟骨細(xì)胞及滑膜成纖維細(xì)胞)對(duì)蛋白質(zhì)(如白細(xì)胞介素-1或腫瘤壞死因子-α)反應(yīng)而產(chǎn)生的。M-CSF刺激多潛能造血祖干細(xì)胞形成巨噬細(xì)胞集落(Stanley E.R.等人，Mol.Reprod.Dev.，464-10(1997))。
M-CSF通常與其受體c-fms結(jié)合以發(fā)揮生物作用。c-fms包含五種細(xì)胞外Ig結(jié)構(gòu)域、一跨透膜結(jié)構(gòu)域及具有二個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。當(dāng)M-CSF與c-fms結(jié)合時(shí)，受體會(huì)同-二聚體化并啟始包含JAK/STAT、PI3K及ERK途徑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑級(jí)聯(lián)。
M-CSF為單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的功能、活化及存活的重要調(diào)節(jié)物。許多動(dòng)物模型已證實(shí)M-CSF于多種疾病(包含類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)及癌癥)中的作用。巨噬細(xì)胞包括RA中的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。在RA中滑膜巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)程度顯示出與潛在關(guān)節(jié)破壞程度有密切關(guān)系。于類風(fēng)濕病關(guān)節(jié)中，由單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞所內(nèi)源性產(chǎn)生的M-CSF可作用于單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系的細(xì)胞以促進(jìn)其存活并分化為可破壞骨質(zhì)的破骨細(xì)胞并增加前-炎性細(xì)胞功能，如細(xì)胞毒性、超氧化物產(chǎn)生、吞噬作用、驅(qū)化性及次級(jí)細(xì)胞因子產(chǎn)生。例如在大鼠無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)超聲處理-誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎模型中用M-CSF的處理導(dǎo)致病變?cè)鰪?qiáng)(Abd，A.H.等人，LymphokineCytokine Res.1043-50(1991))。同樣地，于膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎鼠模型(CIA)(其為一種RA模型)中以皮下注射M-CSF導(dǎo)致RA疾病的癥狀明顯惡化(Campbell I.K.等人，J.Leuk.Biol.68144-150(2000))。此外，對(duì)RA及其它自身免疫疾病有高易感性的MRL/1pr鼠具有高的基礎(chǔ)M-CSF血清濃度(Yui M.A.等人，Am.J.Pathol.139255-261(1991))。維持CIA需要內(nèi)源性M-CSF，此可由M-CSF中和鼠單克隆抗體能顯著減少已發(fā)生疾病的嚴(yán)重程度來(lái)證實(shí)(CampbellI.K.等人，J.Leuk.Biol.68144-150(2000))。
有關(guān)癌癥方面，以反義寡核苷酸抑制集落刺激因子可通過(guò)減緩巨噬細(xì)胞-介導(dǎo)的ECM破壞而抑制腫瘤小鼠中胚胎和結(jié)腸腫瘤異種移植物中的腫瘤生長(zhǎng)(Seyedhossein，A.等人，Cancer Research，625317-5324(2002))。
M-CSF與c-fms結(jié)合及其后續(xù)對(duì)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的活化作用對(duì)許多疾病狀態(tài)十分重要。除RA與癌癥外，其余M-CSF相關(guān)疾病狀態(tài)實(shí)例包含骨質(zhì)疏松癥、破壞性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化生成、腎小球腎炎、川崎病(Kawasaki disease)及HIV-1感染，其中單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞與相關(guān)細(xì)胞類型發(fā)揮了重要作用。如破骨細(xì)胞類似巨噬細(xì)胞并部分由M-CSF調(diào)節(jié)。破骨細(xì)胞成熟初期由M-CSF所誘導(dǎo)的生長(zhǎng)及分化信號(hào)對(duì)破骨細(xì)胞后續(xù)于骨中的活性為必要的。
病灶骨質(zhì)侵蝕及更具擴(kuò)散性的近-關(guān)節(jié)(juxta-articular)骨質(zhì)疏松癥二種形式的破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨丟失為RA主要未解決的問(wèn)題。此種骨丟失后果包括關(guān)節(jié)畸形、功能殘廢、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加及死亡率增高。對(duì)破骨細(xì)胞生成而言，M-CSF為非常必需的，且于關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型中實(shí)驗(yàn)性地阻斷此種細(xì)胞因子可成功地阻止關(guān)節(jié)破壞。已知其它形式的破壞性關(guān)節(jié)炎(如牛皮癬性關(guān)節(jié)炎)中也有類似的破壞性途徑運(yùn)作，并可呈現(xiàn)類似的干預(yù)作用。
絕經(jīng)后的骨丟失起因于缺陷性骨骼重塑，其繼發(fā)于失衡的(uncoupling)骨質(zhì)形成與因雌激素缺乏所導(dǎo)致的高度增生的破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨質(zhì)再吸收。于小鼠活體內(nèi)使用阻斷性抗體來(lái)中和M-CSF顯示完全預(yù)防破骨細(xì)胞數(shù)量增加、骨質(zhì)重吸收增加及由卵巢切除術(shù)誘發(fā)所產(chǎn)生的骨質(zhì)流失。
有多重證據(jù)顯示M-CSF于動(dòng)脈粥樣硬化生成及機(jī)械性傷害動(dòng)脈壁后的增殖性內(nèi)膜增生中的重要作用。動(dòng)脈粥樣硬化病變中所有主要的細(xì)胞類型皆顯示表達(dá)M-CSF，且其可通過(guò)暴露于氧化脂蛋白而進(jìn)一步被上調(diào)。以中和c-fms抗體阻斷M-CSF信號(hào)發(fā)生可減少以高脂肪食物喂食的載脂蛋白E缺陷性小鼠主動(dòng)脈根部的巨噬細(xì)胞-衍生泡沫細(xì)胞的堆積。
于實(shí)驗(yàn)性及人類腎小球腎炎中，腎小球M-CSF的表達(dá)發(fā)現(xiàn)會(huì)與局部巨噬細(xì)胞堆積、活化及增殖共同存在(co-localize)且與腎小球損傷及蛋白尿程度有關(guān)。通過(guò)針對(duì)其受體c-fms的抗體阻斷M-CSF信號(hào)發(fā)生可顯著地下調(diào)于實(shí)驗(yàn)性單側(cè)輸尿管阻塞所誘導(dǎo)的腎炎癥反應(yīng)期間小鼠的局部巨噬細(xì)胞堆積。
川崎病(KD)為一種未知原因的急性、熱性的兒科血管炎。其最常見及嚴(yán)重的并發(fā)癥包含動(dòng)脈瘤性擴(kuò)張形式的冠狀動(dòng)脈血管系統(tǒng)。血清M-CSF水平在急性期川崎病中呈顯著升高，而以靜脈內(nèi)免疫球蛋白治療后呈正?；?。巨細(xì)胞關(guān)節(jié)炎(GCA)為一種炎癥性血管病變，主要發(fā)生于年長(zhǎng)者，其中T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)中大型動(dòng)脈壁所導(dǎo)致的臨床后果包含失明及繼發(fā)于動(dòng)脈阻塞的中風(fēng)。巨噬細(xì)胞于GCA中的活性作用可由血管損害中源自炎性介體的巨噬細(xì)胞濃度升高而證實(shí)。
已報(bào)告M-CSF可使人類單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞體外更易受HIV-1感染。在近期的研究中，M-CSF增加單核細(xì)胞-衍生的巨噬細(xì)胞受感染的頻率、每個(gè)受感染細(xì)胞中所表達(dá)的HIV mRNA的量及每個(gè)受感染的培養(yǎng)物中所表達(dá)的前病毒DNA的濃度。
由于M-CSF在多種疾病中的重要作用，故需要可抑制M-CSF活性的方法。
目前強(qiáng)烈需求治療性抗M-CSF抗體。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供特異性結(jié)合人M-CSF并作為M-CSF拮抗劑的分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，以及包含所述抗體或部分的組合物。
本發(fā)明也提供組合物，其包含該治療中有效的本發(fā)明的抗M-CSF抗體的重鏈及/或輕鏈、其可變區(qū)或其抗原結(jié)合部分，或編碼該抗體、抗體鏈或其可變區(qū)的核酸分子，及藥物可接受載體。于某些實(shí)施方案中，該組合物可進(jìn)一步包含另一組分，如治療劑或診斷劑。本發(fā)明亦提供診斷及治療方法。于某些實(shí)施方案中，該組合物以治療或預(yù)防特定疾病或病況所需的治療有效量使用。
本發(fā)明亦提供以有效量的本發(fā)明抗M-CSF抗體或其抗原結(jié)合部分、編碼該抗體或其重鏈及/或輕鏈、可變區(qū)或其抗原結(jié)合部分的核酸來(lái)治療或預(yù)防各種疾病及病況的方法，如(但不限于)炎癥、癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化生成、神經(jīng)障礙及心臟疾患。
本發(fā)明提供分離的細(xì)胞系，如產(chǎn)生抗M-CSF抗體或其抗原結(jié)合部分的雜交瘤。
本發(fā)明還提供編碼抗M-CSF抗體的重鏈及/或輕鏈、其可變區(qū)或其抗原結(jié)合部分的核酸分子。
本發(fā)明提供包含核酸分子的載體及宿主細(xì)胞以及重組產(chǎn)生由該核酸分子所編碼的多肽的方法。
本發(fā)明還提供表達(dá)抗M-CSF抗體的重鏈及/或輕鏈或其抗原結(jié)合部分的非-人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A及1B說(shuō)明隨時(shí)間變化的抗M-CSF抗體導(dǎo)致的雄猴及雌猴體內(nèi)總單核細(xì)胞計(jì)數(shù)的劑量相關(guān)的下降情況。單核細(xì)胞計(jì)數(shù)通過(guò)使用Abbott Diagnostics Inc.Cell Dyn系統(tǒng)的光散射確定。單核細(xì)胞計(jì)數(shù)監(jiān)測(cè)時(shí)間自給藥后24小時(shí)直到3周，給藥內(nèi)容有載體或抗體8.10.3，0、0.1、1或5mg/kg，劑量體積為3.79mL/kg，給藥時(shí)間約5分鐘。
圖1A為雄猴。
圖1B為雌猴。
圖2A及2B說(shuō)明抗M-CSF治療在雄猴及雌猴中導(dǎo)致CD14+CD16+單核細(xì)胞百分比下降。監(jiān)測(cè)時(shí)間為給藥后0-21日，給藥內(nèi)容有載體或抗體8.10.3，0、0.1、1或5mg/kg，劑量體積為3.79mL/kg，給藥時(shí)間約5分鐘。于8.10.3注射后第1、3、7、14及21日，于每次抽血后測(cè)定每只受測(cè)猴子CD14+CD16+亞型中的單核細(xì)胞比例。
圖2A為雄猴。
圖2B為雌猴。
圖3A及3B說(shuō)明與受測(cè)前的單核細(xì)胞水平相比，所有劑量的抗體8.10.3F及抗體9.14.4I的抗M-CSF治療導(dǎo)致總單核細(xì)胞百分比變化減少。
圖3A顯示由使用抗體8.10.3F的實(shí)驗(yàn)所收集的數(shù)據(jù)。
圖3B顯示由使用抗體9.14.4I的實(shí)驗(yàn)所收集的數(shù)據(jù)。
圖4為來(lái)自26種抗M-CSF抗體的輕鏈及重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列的序列與相應(yīng)的可變區(qū)基因的種系氨基酸序列比較的序列比對(duì)。抗體序列與種系基因序列間的差異以粗體表示。虛線代表與種系無(wú)異。各比對(duì)中下劃線的序列由左至右表示為FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4序列。
圖4A顯示抗體252的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ ID NO4的殘基21-127)與種系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比對(duì)。
圖4B顯示抗體88的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ ID NO8的殘基21-127)與種系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比對(duì)。
圖4C顯示抗體100的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ ID NO12的殘基21-127)與種系VkL2，Jk3序列(SEQ ID NO107)的比對(duì)。
圖4D顯示抗體3.8.3的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ ID NO16的殘基23-130)與種系VkL5，Jk3序列(SEQ ID NO109)的比對(duì)。
圖4E顯示抗體2.7.3的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ ID NO20的殘基23-130)與種系VkL5，Jk4序列(SEQ ID NO117)的比對(duì)。
圖4F顯示抗體1.120.1的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ IDNO24的殘基21-134)與種系VkB3，Jk1序列(SEQ ID NO112)的比對(duì)。
圖4G顯示抗體252的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ ID NO2的殘基20-136)與種系VH3-11，DH7-27JH6序列(SEQ ID NO106)的比對(duì)。
圖4H顯示抗體88的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ ID NO6的殘基20-138)與種系VH3-7，DH6-13，JH4序列(SEQ ID NO105)的比對(duì)。
圖4I顯示抗體100的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ ID NO10的殘基20-141)與種系VH3-23，DH1-26，JH4序列(SEQ ID NO104)的比對(duì)。
圖4J顯示抗體3.8.3的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ ID NO14的殘基20-135)與種系VH3-11，DH7-27，JH4序列(SEQ ID NO108)的比對(duì)。
圖4K顯示抗體2.7.3的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ ID NO18的殘基20-137)與種系VH3-33，DH1-26，JH4序列(SEQ ID NO110)的比對(duì)。
圖4L顯示抗體1.120.1的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ IDNO22的殘基20-139)與種系VH1-18，DH4-23，JH4序列(SEQ ID NO111)的比對(duì)。
圖4M顯示抗體8.10.3的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ ID NO44的殘基21-129)與種系VkA27，JK4序列(SEQ ID NO114)的比對(duì)。
圖4N顯示抗體8.10.3的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ ID NO30的殘基20-141)與種系VH3-48，DH1-26，JH4b序列(SEQ ID NO113)的比對(duì)。
圖40顯示抗體9.14.4的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ ID NO28的殘基23-130)與種系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比對(duì)。
圖4P顯示抗體9.14.4的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ ID NO38的殘基20-135)與種系VH3-11，DH7-27，JH4b序列(SEQ ID NO116)的比對(duì)。
圖4Q顯示抗體9.7.2的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ ID NO48的殘基23-130)與種系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比對(duì)。
圖4R顯示抗體9.7.2的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ ID NO46的殘基20-136)與種系VH3-11，DH6-13，JH6b序列(SEQ ID NO115)的比對(duì)。
圖4S顯示抗體9.14.4I的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ IDNO28的殘基23-130)與種系VkO12Jk3序列(SEQ ID NO103)的比對(duì)。
圖4T顯示抗體9.14.4I的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ IDNO26的殘基20-135)與種系VH3-11，DH7-27，JH4b序列(SEQ ID NO116)的比對(duì)。
圖4U顯示抗體8.10.3F的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ IDNO32的殘基21-129)與種系VkA27，Jk4序列(SEQ ID NO114)的比對(duì)。
圖4V顯示抗體8.10.3F的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ IDNO30的殘基20-141)與種系VH3-48，DH1-26，JH4b序列(SEQ ID NO113)的比對(duì)。
圖4W顯示抗體9.7.2IF的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ IDNO36的殘基23-130)與種系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比對(duì)。
圖4X顯示抗體9.7.2I F的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ IDNO34的殘基20-136)與種系VH3-11，DH6-13，JH6b序列(SEQ ID NO115)的比對(duì)。
圖4Y顯示抗體9.7.2C-Ser的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO52的殘基23-130)與種系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比對(duì)。
圖4Z顯示抗體9.7.2C-Ser的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO50的殘基20-136)與種系VH3-11，DH6-13，JH6b序列(SEQ ID NO115)的比對(duì)。
圖4AA顯示抗體9.14.4C-Ser的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO56的殘基23-130)與種系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比對(duì)。
圖4BB顯示抗體9.14.4C-Ser的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO54的殘基20-135)與種系VH3-11，DH7-27，JH4b序列(SEQ ID NO116)的比對(duì)。
圖4CC顯示抗體8.10.3C-Ser的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO60的殘基21-129)與種系VkA27，Jk4序列(SEQ ID NO114)的比對(duì)。
圖4DD顯示抗體8.10.3C-Ser的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO58的殘基20-141)與種系VH3-48，DH1-26，JH4b序列(SEQ ID NO113)的比對(duì)。
圖4EE顯示抗體8.10.3-CG2的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO60的殘基21-129)與種系VkA27，Jk4序列(SEQ ID NO114)的比對(duì)。
圖4FF顯示抗體8.10.3-CG2的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO62的殘基20-141)與種系VH3-48，DH1-26，JH4b序列(SEQ ID NO113)的比對(duì)。
圖4GG顯示抗體9.7.2-CG2的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO52的殘基23-130)與種系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比對(duì)。
圖4HH顯示抗體9.7.2-CG2的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO66的殘基20-136)與種系VH3-11，DH6-13，JH6b序列(SEQ ID NO115)的比對(duì)。
圖4II顯示抗體9.7.2-CG4的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO52的殘基23-130)與種系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比對(duì)。
圖4JJ顯示抗體9.7.2-CG4的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO70的殘基20-135)與種系VH3-11，DH6-13，JH6b序列(SEQ ID NO115)的比對(duì)。
圖4KK顯示抗體9.14.4-CG2的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO56的殘基23-130)與種系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比對(duì)。
圖4LL顯示抗體9.14.4-CG2的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO74的殘基20-135)與種系VH3-11，DH7-27，JH4b序列(SEQ ID NO116)的比對(duì)。
圖4MM顯示抗體9.14.4-CG4的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO56的殘基23-130)與種系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比對(duì)。
圖4NN顯示抗體9.14.4-CG4的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO78的殘基20-135)與種系VH3-11，DH7-27，JH4b序列(SEQ ID NO116)的比對(duì)。
圖400顯示抗體9.14.4-Ser的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO28的殘基23-130)與種系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比對(duì)。
圖4PP顯示抗體9.14.4-Ser的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO82的殘基20-135)與種系VH3-11，DH7-27，JH4b序列(SEQ ID NO116)的比對(duì)。
圖4QQ顯示抗體9.7.2-Ser的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO48的殘基23-130)與種系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比對(duì)。
圖4RR顯示抗體9.7.2-Ser的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO86的殘基20-136)與種系VH3-11，DH6-13，JH6b序列(SEQ ID NO115)的比對(duì)。
圖4SS顯示抗體8.10.3-Ser的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO44的殘基21-129)與種系VkA27，Jk4序列(SEQ ID NO114)的比對(duì)。
圖4TT顯示抗體8.10.3-Ser的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO90的殘基20-141)與種系VH3-48，DH1-26，JH4b序列(SEQ ID NO113)的比對(duì)。
圖4UU顯示抗體8.10.3-CG4的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO60的殘基21-129)與種系VkA27，Jk4序列(SEQ ID NO114)的比對(duì)。
圖4VV顯示抗體8.10.3-CG4的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO94的殘基20-141)與種系VH3-48，DH1-26，JH4b序列(SEQ ID NO113)的比對(duì)。
圖4WW顯示抗體9.14.4G1的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ IDNO28的殘基23-130)與種系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比對(duì)。
圖4XX顯示抗體9.14.4G1的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQ IDNO102的殘基20-135)與種系VH3-11，DH7-27，JH4b序列(SEQ ID NO116)的比對(duì)。
圖4YY顯示抗體8.10.3FG1的輕鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO32的殘基21-129)與種系VkA27，Jk4序列(SEQ ID NO114)的比對(duì)。
圖4ZZ顯示抗體8.10.3FG1的重鏈可變區(qū)的預(yù)期氨基酸序列(SEQID NO98的殘基20-141)與種系VH3-48，DH1-26，JH4b序列(SEQ ID NO113)的比對(duì)。
發(fā)明詳述定義及一般技術(shù)除非在此另有定義，本發(fā)明所使用的科學(xué)及技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所共同理解的含義。此外，除非是上下文所需，否則單數(shù)術(shù)語(yǔ)可包含復(fù)數(shù)型且復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)可包含單數(shù)型。一般來(lái)說(shuō)，在此所使用與細(xì)胞及組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)及蛋白質(zhì)與核酸化學(xué)及雜交相關(guān)的命名和技術(shù)皆為本領(lǐng)域所熟知且常用于本領(lǐng)域中。
除非另有指定，否則本發(fā)明的方法及技術(shù)一般按照本領(lǐng)域中所熟知的常規(guī)方法進(jìn)行，并如本專利說(shuō)明書中所引用的和討論的各種一般及比較特定的文獻(xiàn)中所述。請(qǐng)見如Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)與Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992)及Harlow與Lane AntibodiesA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)，其是以引用的方式并入本文中。酶反應(yīng)與純化技術(shù)是依廠商說(shuō)明書進(jìn)行，以如本領(lǐng)域中通用方法或在此所述方法完成。在此所述的與分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)及醫(yī)藥與藥物化學(xué)相關(guān)的命名法和實(shí)驗(yàn)方法及技術(shù)是所熟知且常用于本領(lǐng)域的?；瘜W(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、調(diào)配及遞送與患者治療采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。
除非另外指定，下列名詞具有下列意義術(shù)語(yǔ)″多肽″包括天然或人工蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段及蛋白質(zhì)序列的多肽類似物。多肽可為單體或聚合物。
術(shù)語(yǔ)″分離的蛋白質(zhì)″、″分離的多肽″或″分離的抗體″是指這樣的蛋白質(zhì)、多肽或抗體，其依其起源或衍生來(lái)源具有下列一至四種狀況(1)不伴有在自然狀態(tài)中會(huì)伴隨其的天然相關(guān)組分，(2)不含其它源自相同物種的蛋白質(zhì)，(3)是由源自不同物種的細(xì)胞所表達(dá)，或(4)不會(huì)天然產(chǎn)生。因此，化學(xué)合成或于與其自然產(chǎn)生的細(xì)胞不同的細(xì)胞系統(tǒng)中所合成的多肽為自其天然相關(guān)組分中″分離″的。蛋白質(zhì)也可通過(guò)分離(使用本領(lǐng)域中所熟知的蛋白質(zhì)純化技術(shù))使其實(shí)質(zhì)上不含天然相伴隨的組分。
分離的抗體實(shí)例包括已經(jīng)使用M-CSF進(jìn)行親和純化的抗M-CSF抗體、于由雜交瘤或其它細(xì)胞系體外合成的抗M-CSF抗體及源自轉(zhuǎn)基因小鼠的人類抗M-CSF抗體。
當(dāng)至少約60-75％的樣本顯示為單一種類多肽時(shí)，蛋白質(zhì)或多肽為″實(shí)質(zhì)上純的″、″實(shí)質(zhì)上同質(zhì)的″或″實(shí)質(zhì)上純化的″。該多肽或蛋白質(zhì)可為單體或多聚體。實(shí)質(zhì)上純的多肽或蛋白質(zhì)典型地包含約50％、60％、70％、80％或90％W/W的蛋白質(zhì)樣品，更常為約95％且優(yōu)選為99％以上純的。蛋白質(zhì)純度或同質(zhì)性可通過(guò)許多本領(lǐng)域中所熟知的方法顯示，如蛋白質(zhì)樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳，再以本領(lǐng)域中所熟知的染色劑將凝膠染色以便顯現(xiàn)單一多肽帶。為某些目的，使用HPLC或其它本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的純化方法可得較高的分辨率。
在此所用的術(shù)語(yǔ)″多肽片段″意指具有氨基末端及/或羧基末端缺失的多肽，但其保留的氨基酸序列與自然產(chǎn)生序列中相應(yīng)位置相同。在某些實(shí)施方案中，片段長(zhǎng)度至少為5、6、8或10個(gè)氨基酸。于其它實(shí)施方案中，片段長(zhǎng)度至少為14、至少20、至少50或至少為70、80、90、100、150或200個(gè)氨基酸。
在此所用的術(shù)語(yǔ)″多肽類似物″意指包括含有實(shí)質(zhì)上與部分氨基酸序列相同的片段的多肽且其至少具有一種下列特性(1)于適當(dāng)結(jié)合條件下與M-CSF特異性結(jié)合，(2)抑制M-CSF能力。
典型地，多肽類似物相對(duì)于自然產(chǎn)生的序列包含保守性氨基酸替代(或插入或缺失)。類似物長(zhǎng)度典型為至少20或25個(gè)氨基酸，優(yōu)選為至少50、60、70、80、90、100、150或200個(gè)氨基酸或者更長(zhǎng)，且經(jīng)?？梢耘c全長(zhǎng)多肽一樣長(zhǎng)。
于某些實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分的氨基酸替代為(1)降低對(duì)蛋白水解的敏感性，(2)降低對(duì)氧化作用的敏感性，(3)改變形成蛋白復(fù)合物的結(jié)合親和力，或(4)可賦予或修飾此種類似物其它理化或機(jī)能特性。類似物可以包括正常產(chǎn)生的肽序列以外的各種突變蛋白序列。如可于正常產(chǎn)生的序列中產(chǎn)生單個(gè)或多個(gè)氨基酸替代(優(yōu)選為保守性氨基酸替代)，優(yōu)選于形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域以外的多肽部分。
保守性氨基酸替代應(yīng)不實(shí)質(zhì)上改變親本序列的結(jié)構(gòu)特征，如取代氨基酸不應(yīng)改變組成免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的反平行β-折疊(于親本序列中所產(chǎn)生)或中斷構(gòu)成親本序列特征的其它二級(jí)結(jié)構(gòu)形式。通常，甘氨酸及脯氨酸類似物不會(huì)用于反平行β-折疊中。本領(lǐng)域認(rèn)可的多肽二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)的實(shí)例描述于Proteins，Structures and MolecularPrinciples(Creighton編輯，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden及J.Tooze編輯，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；及Thornton等人，Nature 354105(1991)，各文以引用的方式并入本文中。
非肽類似物常用于醫(yī)藥工業(yè)作為與模板肽具有類似特性的藥物。這些非肽化合物類型稱為″肽模擬物(peptide mimetics)″或″peptidomimetics″Fauchere，J.Adv.Drug Res.1529(1986)；Veber及Freidinger，TINS 392頁(yè)(1985)；及Evans等人，J.Med.Chem.301229(1987)，其是以引用的方式并入本文中。此種化合物通常是借助計(jì)算機(jī)化分子模建而開發(fā)。結(jié)構(gòu)上類似治療可用的肽的肽模擬物可用于產(chǎn)生等同療效或預(yù)防作用。通常peptidomimetics結(jié)構(gòu)上類似于范例多肽(即具有所需的生化特性或醫(yī)藥活性的多肽)，如人類抗體，但具有一個(gè)或多個(gè)任選通過(guò)本領(lǐng)域所熟知的方法由選自下列的鍵取代的肽鍵--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH＝CH--(順式及反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--及-CH2SO--。以相同類型的D-氨基酸(如以D-賴氨酸代替L-賴氨酸)系統(tǒng)地替代共有序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸也可用于產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽。此外，包含共有序列或?qū)嵸|(zhì)上與共有序列變異相同的限制性肽可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法產(chǎn)生(Rizo及Gierasch，Ann.Rev.Biochem.61387(1992)，以引用的方式并入本文中)；如通過(guò)添加內(nèi)半胱氨酸殘基能形成環(huán)化肽的分子內(nèi)二硫橋。
″抗體″意指完整抗體或可與完整抗體競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合的抗原結(jié)合部分。一般請(qǐng)見Fundamental Immunology，第7章(Paul，W.編輯，第2版.Raven Press，N.Y.(1989))(以引用的方式將其針對(duì)所有目的的全部?jī)?nèi)容并入本文中)?？乖Y(jié)合部分可通過(guò)DNA重組技術(shù)或通過(guò)酶促或化學(xué)裂解完整的抗體來(lái)制備。在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb及互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、二體(diabody)與至少包含足以賦予該多肽特異性抗原結(jié)合的抗體部分的多肽。
由N-末端至C-末端，成熟的輕鏈及重鏈可變區(qū)都包含F(xiàn)R1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4區(qū)。將氨基酸分配至各區(qū)是依照Kabat的定義，Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1987及1991))，Chothia及Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987)或Chothia等人，Nature342878-883(1989)。
在此所用的以數(shù)字提及的抗體是與由相同數(shù)字的雜交瘤所獲得的單克隆抗體相同。如單克隆抗體3.8.3與由雜交瘤3.8.3所獲得的抗體相同。
在此所用的Fd片段意指由VH及CH1結(jié)構(gòu)域所組成的抗體片段；Fv片段是由抗體的單臂的VL與VH結(jié)構(gòu)域組成；而dAb片段(Ward等人，Nature341544-546(1989))是由VH結(jié)構(gòu)域組成。
于某些實(shí)施方案中，抗體為單鏈抗體(scFv)，其中的VL及VH結(jié)構(gòu)域通過(guò)能使其形成單一蛋白鏈的合成接頭配對(duì)而形成單價(jià)分子(Bird等人，Science 242423-426(1988)及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883(1988)。于某些實(shí)施方案中，抗體為二體(即二價(jià)抗體)，其中的VH及VL結(jié)構(gòu)域于單一多肽鏈上表達(dá)，但其所使用的接頭過(guò)短無(wú)法供相同鏈上該兩個(gè)結(jié)構(gòu)域間的配對(duì)，從而迫使所述結(jié)構(gòu)域與另一鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)并產(chǎn)生二個(gè)抗原結(jié)合部位(請(qǐng)見如Holliger P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448(1993)及Poljak R.J.等人，Structure 21121-1123(1994))。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)源自本發(fā)明抗體的CDR可共價(jià)或非共價(jià)并入一分子中形成可與M-CSF特異性結(jié)合的免疫粘附素(immunoadhesin)。在此類實(shí)施方案中，CDR(s)可合并為較大多肽鏈的一部分，其可共價(jià)連接至另一多肽鏈或其可為非共價(jià)性并入。
在具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)可彼此相同或不同。
在此所用的術(shù)語(yǔ)″人類抗體″意指任何抗體，其中的可變區(qū)及恒定區(qū)序列為人類序列。該術(shù)語(yǔ)包含具有源自人類基因的序列的抗體，但其已經(jīng)被改變，如以減少可能的免疫原性、增加親和力、排除可能引起不希望的折疊的半胱氨酸等。該術(shù)語(yǔ)包含在非人類細(xì)胞中重組產(chǎn)生的抗體，其可能帶來(lái)非典型人類細(xì)胞的蛋白質(zhì)糖基化作用。這些抗體可通過(guò)下述各種方法制備。
在此所用的術(shù)語(yǔ)″嵌合抗體″意指抗體包括源自兩個(gè)或多個(gè)不同抗體的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)CDR是源自人類抗M-CSF抗體。于另一實(shí)施方案中，所有CDR皆源自人類抗M-CSF抗體。于另一實(shí)施方案中，源自一個(gè)以上人類抗M-CSF抗體的CDR組合于嵌合抗體中。例如，嵌合抗體可包括源自第一人類抗M-CSF抗體輕鏈的CDR1、源自第二人類抗M-CSF抗體輕鏈的CDR2及源自第三人類抗M-CSF抗體輕鏈的CDR3與源自一個(gè)或多個(gè)其它抗M-CSF抗體重鏈的CDR。此外，構(gòu)架區(qū)可源自一種如下的抗M-CSF抗體，一個(gè)或多個(gè)CDR取自該抗體或取自一種或多種不同人類抗體。
抗體或免疫球蛋白分子的片段或類似物可容易地由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員依照本專利說(shuō)明書的指導(dǎo)來(lái)制備。優(yōu)選片段或類似物的氨基末端與羧基末端存在于接近功能性結(jié)構(gòu)域的邊緣。結(jié)構(gòu)性與功能性結(jié)構(gòu)域可通過(guò)比較核苷酸及/或氨基酸序列數(shù)據(jù)與公共或?qū)＠蛄袛?shù)據(jù)庫(kù)來(lái)鑒別。優(yōu)選采用計(jì)算機(jī)化比較方法來(lái)鑒別出現(xiàn)于其它已知結(jié)構(gòu)及/或功能的蛋白質(zhì)中的序列基序或預(yù)期的蛋白質(zhì)構(gòu)象結(jié)構(gòu)域。已知鑒別可折疊成為已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列的方法。請(qǐng)見Bowie等人，Science 253164(1991)。
在此所用的術(shù)語(yǔ)″表面胞質(zhì)共振(surface plasmon resonance)″意指一種光學(xué)現(xiàn)象，其可以通過(guò)檢測(cè)生物感應(yīng)基質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)濃度變化分析實(shí)時(shí)生物特異性交互作用，如使用BIACORETM系統(tǒng)(PharmaciaBiosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，N.J.)。進(jìn)一步描述請(qǐng)見Jonsson U.等人，Ann.Biol.Clin.5119-26(1993)；Jonsson U.等人，Biotechniques 11620-627(1991)；Jonsson B.等人，J.Mol.Recognit.8125-131(1995)；及Johnsson B.等人，Anal.Biochem.198268-277(1991)。
″KD″一詞意指特定抗體-抗原相互作用的平衡解離常數(shù)。
″表位″一詞包含任何可與免疫球蛋白或T-細(xì)胞受體特異性結(jié)合或與分子互相作用的蛋白質(zhì)決定簇。表位決定簇通常由化學(xué)活性的表面分子組(如氨基酸或糖類側(cè)鏈等分子)構(gòu)成且通常具有特異的三維結(jié)構(gòu)特征以及特異的電荷特征。表位可為″線性″或″構(gòu)象的(conformational)″。于線性表位中，所有蛋白質(zhì)與相互作用分子(如抗體)間的相互作用的位點(diǎn)是沿著該蛋白質(zhì)一級(jí)氨基酸序列線性地發(fā)生。于構(gòu)象表位中，相互作用的位點(diǎn)是穿過(guò)蛋白質(zhì)上互相分離的氨基酸殘基。當(dāng)解離常數(shù)≤1mM，優(yōu)選為≤100nM且最優(yōu)選為≤10nM時(shí)，可稱抗體能與抗原特異性結(jié)合。于某些實(shí)施方案中，KD為1pM至500pM。于其它實(shí)施方案中，KD是介于500pM至1μM間。于其它實(shí)施方案中，KD是介于1μM至100nM間。于其它實(shí)施方案中，KD是介于100mM至10nM。一旦測(cè)定出抗原上所需的表位，即可使用如本發(fā)明中所述的技術(shù)產(chǎn)生該表位的抗體?；蛘撸诎l(fā)現(xiàn)表位期間，抗體產(chǎn)生及表征可說(shuō)明所需的表位的信息。接著由該信息可競(jìng)爭(zhēng)性篩選與相同表位結(jié)合的抗體。一種可達(dá)到此目的的方法為進(jìn)行交叉競(jìng)爭(zhēng)性研究以尋找互相競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的抗體，如競(jìng)爭(zhēng)與抗原結(jié)合的抗體。一種根據(jù)交叉競(jìng)爭(zhēng)性進(jìn)行″binning″抗體的高通量方法描述于國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 03/48731。
在此所用的20種常見氨基酸及其縮寫遵循慣例使用。請(qǐng)見Immunology-A Synthesis(第2版，E.S.Golub及D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。
″多核苷酸″一詞在此是指長(zhǎng)度至少為10個(gè)堿基的核苷酸聚合物形式，無(wú)論是核糖核苷酸或脫氧核苷酸或任一類型核苷酸的經(jīng)修飾形式。該術(shù)語(yǔ)包含單鏈及雙鏈形式。
在此所用的″分離的多核苷酸″一詞意指基因組、cDNA或合成來(lái)源或其某些組合的多核苷酸，根據(jù)起源或衍生來(lái)源，該″分離的多核苷酸″包含有下列一至三項(xiàng)特征(1)與該″分離的多核苷酸″天然一起發(fā)現(xiàn)的全部或部分多核苷酸無(wú)關(guān)，(2)可操作地連接至在天然不會(huì)連接在一起的多核苷酸，或(3)天然情況下不會(huì)成為較大序列的一部分。
在此所用的″寡核苷酸″一詞包含自然產(chǎn)生，及經(jīng)修飾的核苷酸，其通過(guò)自然產(chǎn)生及非自然產(chǎn)生的寡核苷酸鍵連接在一起。寡核苷酸為多核苷酸的子集，其通常包括200個(gè)堿基或更少的長(zhǎng)度。優(yōu)選寡核苷酸長(zhǎng)度為10至60個(gè)堿基且最優(yōu)選長(zhǎng)度為為12、13、14、15、16、17、18、19或20至40個(gè)堿基。寡核苷酸通常為單鏈，如引物及探針；但寡核苷酸也可為雙鏈(如用于構(gòu)建基因突變子)。本發(fā)明的寡核苷酸可為有義或反義寡核苷酸。
在此所用的″自然產(chǎn)生的核苷酸″一詞包含脫氧核糖核苷酸及核糖核苷酸。在此所用的″經(jīng)修飾核苷酸″包含具有經(jīng)修飾或取代糖基等的核苷酸。在此所用的″寡核苷酸鍵″意指包含寡核苷酸鍵，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate、phosphoroamidate等。請(qǐng)見如LaPlanche等人，Nucl.Acids Res.149081(1986)；Stec等人，J.Am.Chem.Soc.1066077(1984)；Stein等人，Nucl.AcidsRes.163209(1988)；Zon等人，Anti-Cancer Drug Design6539(1991)；Zon等人，Oligonucleotides and AnaloguesAPractical Approach，87-108頁(yè)(F.Eckstein，Ed.，Oxford UniversityPress，Oxford England(1991))；美國(guó)專利第5,151,510號(hào)；Uhlmann及Peyman，Chemical Reviews 90543(1990)，其公開內(nèi)容以引用的方式并入本文中。若需要時(shí)寡核苷酸可包含標(biāo)記以供檢測(cè)。
″可操作地連接″的序列既包含鄰近目的基因的表達(dá)控制序列還包含以反式或遠(yuǎn)距離來(lái)控制目的基因的表達(dá)控制序列。在此所用的″表達(dá)控制序列″一詞意指實(shí)現(xiàn)其所連接的編碼序列表達(dá)和加工所必需的多核苷酸序列。表達(dá)控制序列包含適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄起始、終止、啟動(dòng)子及增強(qiáng)子序列；有效的RNA加工信號(hào)(如剪接及多腺核苷酸化信號(hào))；可穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)mRNA的序列、可提高翻譯效率的序列(即Kozak共有序列)、可增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列，且當(dāng)需要時(shí)可包含能增加蛋白質(zhì)分泌的序列。此種控制序列的性質(zhì)依宿主生物而不同；于原核生物中，此種控制序列通常包含啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄終止序列；于真核生物中，此種控制序列通常包含啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄終止序列?！蹇刂菩蛄小逡辉~意欲包含至少所有表達(dá)及加工所必須的組分，且亦可包含其它的有益組分，如前導(dǎo)序列及融合配偶體序列。
在此所用的″載體″一詞意指可運(yùn)送與其連接的另一核酸的核酸分子。于某些實(shí)施方案中，載體為質(zhì)粒，即另外DNA片段可連接至其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。于某些實(shí)施方案中，載體為病毒性載體，其中另外的DNA片段可連接至病毒基因組中。于某些實(shí)施方案中，載體可在其所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制(如具有細(xì)菌性復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體及游離型哺乳動(dòng)物載體)。于其它實(shí)施方案中，載體(如非游離型哺乳動(dòng)物載體)于導(dǎo)入宿主細(xì)胞后可整合入宿主細(xì)胞基因組，并因此可與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體可指導(dǎo)其操作性所連結(jié)的基因的表達(dá)。此種載體在此稱為″重組表達(dá)載體″(或簡(jiǎn)稱為″表達(dá)載體″)。
在此所用的″重組宿主細(xì)胞″(或簡(jiǎn)稱″宿主細(xì)胞″)一詞意指一已導(dǎo)入重組表達(dá)載體的細(xì)胞。應(yīng)了解″重組宿主細(xì)胞″及″宿主細(xì)胞″不僅指特定的受試細(xì)胞，且亦指該細(xì)胞的子代。由于突變或環(huán)境影響，因此某些修飾可能發(fā)生在子代，事實(shí)上此種子代可能不會(huì)與親代細(xì)胞完全相同，但仍包含于在此所用的″宿主細(xì)胞″一詞范圍內(nèi)。
在此所用的″選擇性雜交″一詞意指進(jìn)行可檢測(cè)地且特異性結(jié)合。本發(fā)明的多核苷酸、寡核苷酸及片段可于雜交并洗滌條件下與核酸鏈進(jìn)行選擇性雜交，所述條件盡量減少大量的與非特異核酸的可檢測(cè)結(jié)合?！甯邍?yán)格性″或″高度嚴(yán)格的″條件可用于達(dá)成本領(lǐng)域中已知且在在此討論的選擇性雜交條件。一″高嚴(yán)格性″或″高嚴(yán)格的″條件實(shí)例為將多核苷酸與另一種多核苷酸溫育(其中的一種多核苷酸可附著于固體表面(如膜))于雜交緩沖液6X SSPE或SSC、50％甲酰胺(formamide)、5X Denhardt′s試劑、0.5％SDS、100μg/ml變性片段化的鮭精DNA中，雜交溫度為42℃，12-16小時(shí)，隨后再于55℃、使用1X SSC、0.5％SDS的洗滌緩沖液兩次洗滌。亦見于Sambrook等人，前述，9.50-9.55頁(yè)。
″序列相同性百分比″在描述核酸序列時(shí)，意指比較及比對(duì)第一連續(xù)序列與第二連續(xù)序列時(shí)其最大相同殘基百分比。序列相同性比較的長(zhǎng)度可大于至少約9個(gè)核苷酸，通常至少約18個(gè)核苷酸，更通常為至少約24個(gè)核苷酸，典型地至少約28個(gè)核苷酸，更典型地為至少約32個(gè)核苷酸，且優(yōu)選為至少約36、48或更多個(gè)核苷酸。有一些本領(lǐng)域中已知的不同算法可用于測(cè)量核苷酸序列相同性。如多核苷酸序列的比對(duì)可使用FASTA、Gap或Bestfit，其為Wisconsin Package version 10.0的程序，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin。包含如FASTA2及FASTA3的FASTA程序可提供查詢及檢索序列間最佳重疊區(qū)的比對(duì)及序列相同性(Pearson，Methods Enzymol.18363-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132185-219(2000)；Pearson，Methods Enzymol.266227-258(1996)；Pearson，J.Mol.Biol.27671-84(1998)；以引用的方式并入本文中)。除非另外指定，否則使用特定程序或算法的缺省參數(shù)。例如，測(cè)定核酸序列間的序列相同性可使用FASTA及其缺省參數(shù)(字大小為6及供作評(píng)比基礎(chǔ)的NOPAM系數(shù))或使用Gap及其缺省參數(shù)(如GCG第6.1版所提供的)，其以引用的方式并入本文中。
除非另外指定，當(dāng)提及一核苷酸序列時(shí)包含其補(bǔ)序列。因此，當(dāng)提及具有特定序列核酸時(shí)應(yīng)了解其是包含其互補(bǔ)鏈，及其互補(bǔ)性序列。
″序列相同性百分比″一詞意指一種比例，其表示為相同殘基數(shù)與所比較的殘基數(shù)的百分比。
當(dāng)提及核酸或其片段時(shí)，″實(shí)質(zhì)上類似″或″實(shí)質(zhì)上序列類似″等詞意指當(dāng)將具有適當(dāng)核苷酸插入或缺失的核酸或片段與另一核酸(或其互補(bǔ)鏈)進(jìn)行最佳化比對(duì)時(shí)，其核苷酸序列相同性為至少約85％，優(yōu)選為至少約90％，且更優(yōu)選為至少約95％、96％、97％、98％或99％核苷酸堿基，以上可以任何所熟知的上述序列相同性算法(如FASTA、BLAST或Gap)來(lái)測(cè)量。
當(dāng)形容多肽時(shí)，″實(shí)質(zhì)上相同″一詞意指二個(gè)肽序列，當(dāng)進(jìn)行最佳化比對(duì)時(shí)(如以GAP或BESTFIT程序、依程序所提供使用的缺省gapweights)，共同擁有至少70％、75％或80％序列相同性，優(yōu)選為至少90％或95％序列相同性，且更優(yōu)選為至少97％、98％或99％的序列相同性。于某些實(shí)施方案中，不同的殘基位置因保守性氨基酸替換而不同?！灞Ｊ匦园被崽鎿Q″意指其中的氨基酸殘基以另一具有類似化學(xué)特性(如電荷或疏水性)的側(cè)鏈R基的氨基酸殘基所替換。保守性氨基酸替換通常并不會(huì)實(shí)質(zhì)上改變蛋白質(zhì)的功能特性。在二個(gè)或多個(gè)氨基酸序列因保守性替換而互異的情況下，其序列相同性可向上調(diào)整以修正替換的保守性本質(zhì)?？蛇M(jìn)行該調(diào)整的方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知。請(qǐng)見如Pearson，Methods Mol.Biol.243307-31(1994)。具有類似化學(xué)特性的側(cè)鏈的氨基酸組的實(shí)例包含1)脂族側(cè)鏈甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸；2)脂族-羥基側(cè)鏈絲氨酸及蘇氨酸；3)含酰胺的側(cè)鏈天冬酰胺及谷氨酰胺；4)芳族側(cè)鏈苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸；5)堿性側(cè)鏈賴氨酸、精氨酸及組氨酸；6)酸性側(cè)鏈天冬氨酸及谷氨酸；及7)含硫的側(cè)鏈半胱氨酸及甲硫氨酸。保守性氨基酸替換組為纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸及天冬酰胺-谷氨酰胺。
或者，保守性置換為PAM250對(duì)數(shù)相似矩陣(log-likelihoodmatrix)中任何具有正值的改變，其描述于Gonnet等人，Science 2561443-45(1992)，其以引用的方式并入本文中。″適度保守性″置換為PAM250對(duì)數(shù)相似矩陣中任何具有非負(fù)值的改變。
多肽的序列相同性典型是使用序列分析軟件來(lái)測(cè)量。蛋白質(zhì)分析軟件使用測(cè)量不同替換、缺失及其它修飾(包含保守性氨基酸替換)的相同性來(lái)匹配序列。例如包含如″Gap″及″Bestfit″等程序的GCG可采用程序特定的缺省參數(shù)來(lái)測(cè)定緊密相關(guān)的多肽間的序列同源性或序列相同性，如測(cè)定源自不同種生物的同源多肽或野生型蛋白質(zhì)及其突變蛋白間的相同性。請(qǐng)見如GCG 6.1版。比較多肽序列亦可使用FASTA并采用缺省的或建議的參數(shù)，請(qǐng)見GCG 6.1版(University of WisconsinWI)。FASTA(如FASTA2及FASTA3)提供查詢及檢索序列間的最佳重疊區(qū)的比對(duì)及序列相同性百分比(Pearson，Methods Enzymol.18363-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132185-219(2000))。當(dāng)比較本發(fā)明序列與包含大量源自各種生物的序列的數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，另一優(yōu)選算法為計(jì)算機(jī)程序BLAST，特別是blastp或tblastn，其使用該程序所提供的缺省參數(shù)。請(qǐng)見如Altschul等人，J.Mol.Biol.215403-410(1990)；Altschul等人，Nucleic Acids Res.253389-402(1997)。
比較多肽序列同源性所需的長(zhǎng)度通常至少約16個(gè)氨基酸殘基，通常為至少約20個(gè)殘基，更常為至少約24個(gè)殘基，典型為至少約28個(gè)殘基，且優(yōu)選為多于約35個(gè)殘基。當(dāng)檢索包含大量源自各種生物的序列的數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，最好比較氨基酸序列。
在此所用的″標(biāo)記″或″標(biāo)記的″是指將另一分子摻入抗體中。于一實(shí)施方案中，標(biāo)記為一種可檢測(cè)的標(biāo)記，如摻入放射標(biāo)記的氨基酸或附著至生物素化部分的多肽，其可通過(guò)標(biāo)記的抗生物素蛋白(如包含熒光標(biāo)記或酶促活性的鏈霉抗生物素蛋白，其可由光學(xué)或比色法檢測(cè))進(jìn)行檢測(cè)。于另一實(shí)施方案中，標(biāo)記或標(biāo)記可具治療性，如藥物綴合物(drug conjugate)或毒素。標(biāo)記多肽及糖蛋白的各種方法在本領(lǐng)域中已知且可運(yùn)用。多肽的標(biāo)記實(shí)例包含(但不限于)下列放射性同位素或放射性核素(如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、熒光標(biāo)記(如FITC、羅丹明(rhodamine)、鑭系元素磷光體(lanthanidephosphors))、酶促標(biāo)記(如辣根過(guò)氧化酶(horseradishperoxidase)、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物素化基團(tuán)、可由二級(jí)報(bào)告子(如亮氨酸拉鏈成對(duì)序列，二抗的結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)簽)識(shí)別的預(yù)先測(cè)定的多肽表位、磁性劑(如釓螯合物)、毒素，如百日咳毒素、紫杉醇、細(xì)胞松弛素B(cytochalasin B)、短桿菌肽D(gramicidin D)、溴化乙錠(ethidiumbromide)、吐根堿(emetine)、絲裂霉素(mitomycin)、鬼臼亞乙苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長(zhǎng)春花新堿、長(zhǎng)春花堿、秋水仙素、阿霉素、道諾紅霉素(daunorubicin)、dihydroxy anthracindione、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放線菌素D、1-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普羅卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤霉素(puromycin)與其類似物或同源物。于某些實(shí)施方案中，標(biāo)記通過(guò)不同長(zhǎng)度的間隔臂附著以降低可能的空間障礙。
縱觀本說(shuō)明書及權(quán)利要求，應(yīng)了解″包含(comprise)″等詞或如″包含(comprises)″或″包含(comprising)″等變形意味著包含指定的整體或整體群但不排除任何其它整體或整體群。人類抗M-CSF抗體及其特性于一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供人源化抗M-CSF抗體。于另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供人類抗M-CSF抗體。于某些實(shí)施方案中，人類抗M-CSF抗體的制備是通過(guò)免疫非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如嚙齒類動(dòng)物)，其基因組包括人類免疫球蛋白基因以便嚙齒類動(dòng)物可產(chǎn)生人類抗體。
本發(fā)明抗M-CSF抗體可包括人類κ或人類λ輕鏈或由此衍生的氨基酸序列。于某些包括κ輕鏈的實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)(VL)是部分由人類VkO12、VkL2、VkL5、VkA27或VkB3基因及Jk1、Jk2、Jk3或Jk4基因所編碼。于本發(fā)明特定實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)是由VkO12/JK3、VkL2/JK3、VkL5/JK3、VkL5/JK4、VkA27/JK4或VkB3/JK1基因編碼。
于某些實(shí)施方案中，M-CSF抗體的VL相對(duì)于種系氨基酸序列包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換。于某些實(shí)施方案中，抗M-CSF抗體的VL包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸替換(相對(duì)于種系氨基酸序列)。于某些具體實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)源自種系的替換位于輕鏈的CDR區(qū)。于某些具體實(shí)施方案中，相對(duì)于種系的氨基酸替換位于一個(gè)或多個(gè)與位于下列抗體中任一個(gè)或多個(gè)VL中的相對(duì)于種系的替換相同的位置上252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1。如抗M-CSF抗體的VL可包含一個(gè)或多個(gè)相對(duì)于種系的發(fā)現(xiàn)于抗體88的VL中的氨基酸替換，和相對(duì)于種系的見于抗體252的VL中的一個(gè)或多個(gè)其它氨基酸替換，其中抗體252使用與抗體88相同的VK基因。于某些具體實(shí)施方案中，其氨基酸改變位于參考抗體的一個(gè)或多個(gè)相同位置，但涉及不同于參考抗體的突變。
于某些具體實(shí)施方案中，相對(duì)于種系的氨基酸改變于一個(gè)或多個(gè)與抗體252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的任一VL上的相同位置產(chǎn)生，但所述改變可能反映了在相對(duì)于參考抗體中的氨基酸位置上的保守性氨基酸替換基。如，若于這些抗體之一中的特定位置已相對(duì)種系發(fā)生改變且為谷氨酸，則可于該位置替代天冬氨酸。同樣地，若相對(duì)于種系的氨基酸替換為絲氨酸，可于該位置以蘇氨酸取代絲氨酸。保守性氨基酸替換先前已有敘述。
于某些具體實(shí)施方案中，人類抗M-CSF抗體的輕鏈包括與抗體252(SEQ ID NO4)、88(SEQ ID NO8)、100(SEQ ID NO12)、3.8.3(SEQID NO16)、2.7.3(SEQ ID NO20)、1.120.1(SEQ ID NO24)、9.14.4I(SEQ ID NO28)、8.10.3F(SEQ ID NO32)、9.7.2IF(SEQID NO36)、9.14.4(SEQ ID NO28)、8.10.3(SEQ ID NO44)、9.7.2(SEQ ID NO48)、9.7.2C-Ser(SEQ ID NO52)、9.14.4C-Ser(SEQID NO56)、8.10.3C-Ser(SEQ ID NO60)、8.10.3-CG2(SEQ ID NO60)、9.7.2-CG2(SEQ ID NO52)、9.7.2-CG4(SEQ ID NO52)、9.14.4-CG2(SEQ ID NO56)、9.14.4-CG4(SEQ ID NO56)、9.14.4-Ser(SEQ ID NO28)、9.7.2-Ser(SEQ ID NO48)、8.10.3-Ser(SEQ ID NO44)、8.10.3-CG4(SEQ ID NO60)8.10.3FG1(SEQ ID NO32)或9.14.4G1(SEQ ID NO28)的VL的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者具有多達(dá)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)保守性氨基酸替換及/或總數(shù)多達(dá)3個(gè)的非-保守性氨基酸替換的該氨基酸序列。于某些具體實(shí)施方案中，輕鏈包括任何一種上述抗體的CDR1起點(diǎn)至CDR3末端的氨基酸序列。
于某些具體實(shí)施方案中，抗M-CSF抗體的輕鏈至少包括種系或在此所述的抗體序列的輕鏈CDR1、CDR2或CDR 3。于另一具體實(shí)施方案中，該輕鏈可包括獨(dú)立地選自抗體252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的CDR1、CDR2或CDR3區(qū)，或者各具有少于4個(gè)或少于3個(gè)保守性氨基酸替換及/或總計(jì)3個(gè)或更少非-保守性氨基酸替換的CDR區(qū)。于其它具體實(shí)施方案中，抗M-CSF抗體的輕鏈包括輕鏈CDR1、CDR2或CDR3，其各獨(dú)立地選自具有包括選自SEQ IDNOS4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的VL區(qū)氨基酸序列，或者由選自SEQ ID NOS3、7、11、27、31、35、43或47的編碼VL區(qū)的核酸分子編碼的輕鏈可變區(qū)的抗體的CDR1、CDR2及CDR3區(qū)?？筂-CSF抗體的輕鏈可包括抗體的CDR1、CDR2及CDR3區(qū)，該抗體包括選自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的VL區(qū)或SEQ ID NOS4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的氨基酸序列。
于某些具體實(shí)施方案中，輕鏈包括抗體252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的CDR1、CDR2及CDR3區(qū)，或者各自具有少于4個(gè)或少于3個(gè)保守性氨基酸替換及/或總數(shù)為3個(gè)或更少的非-保守性氨基酸替換的該CDR區(qū)。
關(guān)于重鏈，于某些具體實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)氨基酸序列是由人類VH3-11、VH3-23、VH3-7、VH1-18、VH3-33、VH3-48基因及JH4、JH6、JH4b或JH6b基因部分編碼。于本發(fā)明特定具體實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)是由VH3-11/DH7-27/JH6、VH3-7/DH6-13/JH4、VH3-23/DH1-26/JH4、VH3-11/DH7-27/JH4、VH3-33/DH1-26/JH4、VH1-18/DH4-23/JH4、VH3-11/DH7-27/JH4b、VH3-48/DH1-26/JH4b、VH3-11/DH6-13/JH6b、VH3-11/DH7-27/JH4b、VH3-48/DH1-6/JH4b或VH3-11/DH6-13/JH6b基因編碼。于某些具體實(shí)施方案中，抗M-CSF抗體的VH包含一個(gè)或多個(gè)相對(duì)于種系氨基酸序列的氨基酸替換、缺失或插入(添加)。于某些具體實(shí)施方案中，重鏈的可變區(qū)包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個(gè)相對(duì)于種系氨基酸序列的突變。于某些具體實(shí)施方案中，該突變?yōu)橄鄬?duì)于種系氨基酸序列的非-保守性替換。于某些具體實(shí)施方案中，突變位于重鏈的CDR區(qū)。于某些具體實(shí)施方案中，氨基酸改變于一個(gè)或多個(gè)與源自任一個(gè)或多個(gè)抗體252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的VH的種系的突變相同的位置上產(chǎn)生。于其它具體實(shí)施方案中，氨基酸改變是位于一個(gè)或多個(gè)參考抗體的相同位置，但包含不同的突變。
于某些具體實(shí)施方案中，重鏈包括抗體252(SEQ ID NO2)、88(SEQID NO6)、100(SEQ ID NO10)、3.8.3(SEQ ID NO14)、2.7.3(SEQID NO18)、1.120.1(SEQ.ID NO22)、9.14.4I(SEQ ID NO26)、8.10.3F(SEQ ID NO30)、9.7.2IF(SEQ ID NO34)、9.14.4(SEQ IDNO38)、8.10.3(SEQ ID NO30)、9.7.2(SEQ ID NO46)、9.7.2C-Ser(SEQ ID NO50)、9.14.4C-Ser(SEQ ID NO54)、8.10.3C-Ser(SEQ ID NO58)、8.10.3-CG2(SEQ ID NO62)、9.7.2-CG2(SEQ ID NO66)、9.7.2-CG4(SEQ ID NO70)、9.14.4-CG2(SEQ ID NO74)、9.14.4-CG4(SEQ ID NO78)、9.14.4-Ser(SEQ ID NO82)、9.7.2-Ser(SEQ ID NO86)、8.10.3-Ser(SEQ ID NO90)8.10.3-CG4(SEQ ID NO94)、8.10.3FG1(SEQ ID NO98)或9.14.4G1(SEQ ID NO102)的可變區(qū)(VH)的氨基酸序列，或者具有多達(dá)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)保守性氨基酸替換及/或總共3個(gè)的非-保守性氨基酸替換的該氨基酸序列。于某些具體實(shí)施方案中，該重鏈包括任一前述抗體中自CDR1起點(diǎn)至CDR3末端的氨基酸序列。
于某些具體實(shí)施方案中，該重鏈包括抗體252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG 1或9.14.4G1的重鏈CDR1、CDR2及CDR3區(qū)，或者各具有少于8個(gè)，少于6個(gè)，少于4個(gè)或少于3個(gè)保守性氨基酸替換及/或總共3個(gè)或更少的非-保守性氨基酸替換的該CDR區(qū)。
于某些具體實(shí)施方案中，重鏈如前所述包括了在此所述的抗體序列的種系或抗體CDR3，且亦可包括種系序列的CDR1及CDR2區(qū)，或者可包括抗體序列的CDR1及CDR2區(qū)，其各自獨(dú)立地選自包括選自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1抗體的重鏈的抗體。于另一具體實(shí)施方案中，重鏈包括在此所述的抗體序列的CDR3，且亦可包括CDR1及CDR2區(qū)，其各自獨(dú)立地選自重鏈可變區(qū)的CDR1及CDR2區(qū)，該重鏈可變區(qū)包括選自SEQ ID NOS2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的VH區(qū)氨基酸序列，或者其可由選自SEQ IDNOS1、5、9、25、29、33、37、45、97或101的編碼VH區(qū)的核酸序列編碼。于另一具體實(shí)施方案中，該抗體包括如上所述的輕鏈及如上所述的重鏈。
一種可產(chǎn)生的氨基酸替換類型為將一個(gè)或多個(gè)抗體中的半胱氨酸(其可能為化學(xué)活性的)改變?yōu)榱硪环N殘基，如(不限于)丙氨酸或絲氨酸。于一具體實(shí)施方案中，存在非典型半胱氨酸的替換。該替換可位于可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)或抗體恒定區(qū)中。于另一具體實(shí)施方案中，該半胱氨酸是位于抗體的非典型(non-canonical)區(qū)。
另一種可產(chǎn)生的氨基酸替換類型為移除抗體中任何可能的蛋白質(zhì)水解位點(diǎn)，特別是位于抗體中可變區(qū)的CDR或構(gòu)架區(qū)或恒定區(qū)中的。替換半胱氨酸殘基及移除蛋白質(zhì)水解位點(diǎn)可減少抗體產(chǎn)物中任何異質(zhì)性的風(fēng)險(xiǎn)并從而增強(qiáng)其同質(zhì)性。另一類的氨基酸替換是移除可能形成脫胺作用位點(diǎn)的天冬酰胺-甘氨酸對(duì)，其是通過(guò)改變?cè)摎埢囊换蚨€(gè)殘基同時(shí)改變來(lái)完成。
于某些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明抗M-CSF抗體重鏈的C-末端賴氨酸并不存在(Lewis D.A.等人，Anal.Chem，66(5)585-95(1994))。于本發(fā)明多個(gè)具體實(shí)施方案中，抗M-CSF抗體的重鏈及輕鏈任選包含信號(hào)序列。
一方面，本發(fā)明涉及抑制人類抗-M-CSF單克隆抗體及制備該抗體的改造的細(xì)胞系。表1列舉編碼下列單克隆抗體的重鏈及輕鏈的可變區(qū)的核酸及相對(duì)應(yīng)的預(yù)期的氨基酸序列的序列識(shí)別碼(SEQ ID NOS)252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3及9.7.2。另外的變異抗體9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG48.10.3FG1或9.14.4G1可通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知方法來(lái)制備。
表1
抗M-CSF抗體的種類及亞類抗M-CSF抗體的種類及亞類可通過(guò)任何本領(lǐng)域中已知的方法測(cè)定。通常，抗體的種類及亞類可使用對(duì)特定抗體的種類及亞類具特異性的抗體進(jìn)行測(cè)定。此種抗體已商品化。種類及亞類可通過(guò)ELISA或Western印跡法(Western Blot)以及其它技術(shù)來(lái)測(cè)定?；蛘?，種類及亞類可如下進(jìn)行測(cè)定對(duì)所有或部分的抗體重鏈及/或輕鏈的恒定區(qū)進(jìn)行測(cè)序，比較其氨基酸序列與已知的各種免疫球蛋白的種類及亞類的氨基酸序列，并確定抗體的種類及亞類。
于某些具體實(shí)施方案中，抗M-CSF抗體為單克隆抗體?？筂-CSF抗體可為IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。于優(yōu)選具體實(shí)施方案中，抗M-CSF抗體為IgG且為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞類。于另一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，該抗體為亞類IgG2或IgG4。于另一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，該抗體為亞類IgG1。
物種及分子選擇性于本發(fā)明另一方面中，抗M-CSF抗體同時(shí)顯示出物種及分子選擇性。于某些具體實(shí)施方案中，抗M-CSF抗體可與人類、cynomologus猴及小鼠M-CSF結(jié)合。遵照說(shuō)明書的教導(dǎo)，可使用本領(lǐng)域中所熟知的方法測(cè)定抗M-CSF抗體的物種選擇性。例如可使用Western印跡法、FACS、ELISA、RIA、細(xì)胞增殖試驗(yàn)或M-CSF受體結(jié)合分析測(cè)定物種選擇性。于一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，可使用細(xì)胞增殖試驗(yàn)或ELISA測(cè)定物種選擇性。
于另一具體實(shí)施方案中，抗M-CSF抗體對(duì)M-CSF具有比其對(duì)GM-/G-CSF選擇性至少大100倍的選擇性。于某些具體實(shí)施方案中，抗M-CSF抗體并不會(huì)與除M-CSF外的任何其它蛋白質(zhì)顯示任何適宜的特異性結(jié)合?？梢勒照f(shuō)明書指示使用本領(lǐng)域中所熟知方法測(cè)定抗M-CSF抗體對(duì)M-CSF的選擇性。例如可使用Western印跡法、FACS、ELISA或RIA測(cè)定選擇性。
確認(rèn)由抗M-CSF抗體識(shí)別的M-CSF表位本發(fā)明提供一種人類抗M-CSF單克隆抗體，其可與M-CSF結(jié)合并與同一表位競(jìng)爭(zhēng)、交叉競(jìng)爭(zhēng)及/或結(jié)合，及/或以與下列抗體相同的KD與M-CSF結(jié)合，(a)選自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的抗體；(b)抗體，其包括具有SEQ ID NO2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；(c)抗體，其包括具有SEQ ID NO4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；(d)抗體，其包括(b)中定義的重鏈可變區(qū)及(c)中定義的輕鏈可變區(qū)。
可通過(guò)使用本領(lǐng)域中已知的方法測(cè)定抗體是否可與相同表位進(jìn)行結(jié)合、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合、交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，或具有與一抗M-CSF抗體相同的KD。于一具體實(shí)施方案中，可使本發(fā)明的抗M-CSF抗體于飽和條件下與M-CSF結(jié)合，然后測(cè)量受試抗體與M-CSF結(jié)合的能力。若受試抗體與抗M-CSF抗體可于同一時(shí)間與M-CSF結(jié)合，則受試抗體與所述的抗M-CSF抗體結(jié)合不同表位。然而，若受試抗體不能同時(shí)與M-CSF結(jié)合，則受試抗體結(jié)合相同表位、重疊表位或位于人類抗M-CSF抗體所結(jié)合的表位鄰近的表位。此實(shí)驗(yàn)可使用ELISA、RIA或FACS來(lái)進(jìn)行。于一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，實(shí)驗(yàn)是使用BIACORETM進(jìn)行。
抗M-CSF抗體對(duì)M-CSF的結(jié)合親和力于本發(fā)明某些具體實(shí)施方案中，抗M-CSF抗體以高親和力與M-CSF結(jié)合。于某些具體實(shí)施方案中，抗M-CSF抗體與M-CSF結(jié)合的KD為1×10-7M或以下。于其它優(yōu)選具體實(shí)施方案中，抗體與M-CSF結(jié)合的KD為1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、1×10-12M或以下。于某些具體實(shí)施方案中，KD為1pM至500pM。于其它具體實(shí)施方案中，KD為500pM至1μM。于其它具體實(shí)施方案中，KD為1μM至100nM。于其它具體實(shí)施方案中，KD為100mM至10nM。于一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，抗體以與選自下列的抗體實(shí)質(zhì)相同的KD與M-CSF結(jié)合252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1。于另一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，抗體以與包括選自下列抗體的輕鏈CDR2和/或重鏈CDR3的抗體實(shí)質(zhì)上相同的KD與M-CSF結(jié)合252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1。于另一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，抗體以與一種抗體實(shí)質(zhì)上相同的KD與M-CSF結(jié)合，后者抗體包括具有SEQ ID NO2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，或者該抗體包括具有SEQ ID NO4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。于另一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，抗體以與一種抗體實(shí)質(zhì)上相同的KD與M-CSF結(jié)合，后者抗體包括具有SEQ ID NO4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的VL區(qū)氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的CDR2，且任選包括其CDR1及/或CDR3，或者該抗體包括具有SEQ ID NO2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的VH區(qū)氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的CDR3，且任選包括其CDR1及/或CDR2。
于某些具體實(shí)施方案中，抗M-CSF抗體具有低解離速率。于某些具體實(shí)施方案中，抗M-CSF抗體的koff為2.0×10-4s-1或更低。于其它優(yōu)選具體實(shí)施方案中，抗體以2.0×10-5或者2.0×10-6s-1或更低的Koff與M-CSF結(jié)合。于某些具體實(shí)施方案中，koff實(shí)質(zhì)上與在此所述的抗體相同，如選自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的抗體。于某些具體實(shí)施方案中，抗體以與一種抗體實(shí)質(zhì)上相同的koff與M-CSF結(jié)合，后一抗體包括(a)選自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的抗體的重鏈的CDR3，及任選包括其CDR1及/或CDR2；或(b)選自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的抗體輕鏈的CDR2，及任選包括其CDR1及/或CDR3。于某些具體實(shí)施方案中，抗體以與一種抗體實(shí)質(zhì)上相同的koff與M-CSF結(jié)合，后一抗體包括具有SEQ ID NO2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；或者該抗體包括具有SEQ ID NO4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。于另一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，抗體以實(shí)質(zhì)上與一種抗體相同的koff與M-CSF結(jié)合，后一抗體包括具有SEQ ID NO4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的CDR2，并任選包括其CDR1及/或CDR3；或者該抗體包括具有SEQ ID NO2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的CDR3，并任選包括其CDR1及/或CDR2。
抗M-CSF抗體對(duì)M-CSF的結(jié)合親和力及解離速率可由本領(lǐng)域中已知的方法來(lái)測(cè)定。結(jié)合親和力可由競(jìng)爭(zhēng)性ELISAs、RLAs、表面胞質(zhì)共振(如使用BIACORETM技術(shù))來(lái)測(cè)量。解離速率可由表面胞質(zhì)共振來(lái)測(cè)量。優(yōu)選地，結(jié)合親和力及解離速率可由表面胞質(zhì)共振測(cè)量。更優(yōu)選地，結(jié)合親和力及解離速率可使用BIACORETM技術(shù)來(lái)測(cè)量。實(shí)施例VI中舉例說(shuō)明了通過(guò)BIACORETM技術(shù)測(cè)定抗M-CSF單克隆抗體的親和力常數(shù)的方法?？筂-CSF抗體抑制M-CSF活性M-CSF與c-fms結(jié)合的抑制于另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種抗M-CSF抗體，其可抑制M-CSF與c-fms受體結(jié)合并阻斷或防止c-fms的活化作用。于另一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，M-CSF屬于人類。于另一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，抗M-CSF抗體為人類抗體。IC50可經(jīng)由ELISA、RIA及基于細(xì)胞的分析如細(xì)胞增殖試驗(yàn)、全血單核細(xì)胞形狀變化分析或受體結(jié)合抑制分析進(jìn)行測(cè)量。于一具體實(shí)施方案中，抗體或其部分抑制細(xì)胞增殖，通過(guò)細(xì)胞增殖試驗(yàn)測(cè)量的IC50為不超過(guò)8.0×10-7M，優(yōu)選為不超過(guò)3×10-7M，或者優(yōu)選為不超過(guò)8×10-8M。于另一具體實(shí)施方案中，由單核細(xì)胞形狀變化分析測(cè)量的IC50不超過(guò)2×10-6M，優(yōu)選為不超過(guò)9.0×10-7M，或者更優(yōu)選為不超過(guò)9×10-8M。于另一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，由受體結(jié)合分析測(cè)量的IC50不超過(guò)2×10-6M，優(yōu)選為不超過(guò)8.0×10-7M，或者更優(yōu)選為不超過(guò)7.0×10-8M。實(shí)施例III、IV及V舉例了不同類型的分析。
另一方面，與無(wú)抗體的細(xì)胞增殖相比，本發(fā)明的抗M-CSF抗體抑制單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞響應(yīng)M-CSF的增殖達(dá)至少20％，優(yōu)選為40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或100％。
制備抗體及可產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系的方法免疫于某些具體實(shí)施方案中，人類抗體如下制備用M-CSF抗原對(duì)非人類動(dòng)物進(jìn)行免疫，其基因組中包括某些或完整的人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座。于一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，非人類動(dòng)物為XENOMOUSETM動(dòng)物(Abgenix Inc.，F(xiàn)remont，CA)。另一種可利用的非-人類動(dòng)物為Medarex制備的轉(zhuǎn)基因小鼠(Medarex公司，Princeton，NJ)。
XENOMOUSETM為改造的小鼠品系，其包括大片段的人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座且小鼠抗體產(chǎn)生缺陷。請(qǐng)見如Green等人，NatureGenetics 713-21(1994)及美國(guó)專利號(hào)5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598、6,130,364、6,162,963及6,150,584。亦見于WO 91/10741、WO94/02602、WO 96/34096、WO 96/33735、WO 98/16654、WO 98/24893、WO 98/50433、WO 99/45031、WO 99/53049、WO 00/09560及WO 00/037504中。
另一方面，本發(fā)明提供一種由非-人類、非-小鼠動(dòng)物制備抗M-CSF抗體的方法，其是以M-CSF抗原對(duì)包括人類免疫球蛋白基因座的非-人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行免疫?？墒褂蒙鲜鲆玫奈募械姆椒ㄖ圃齑朔N動(dòng)物。敘述于這些文件中的方法可如美國(guó)專利5,994,619所述的方法加以修改。美國(guó)專利5,994,619描述了新穎的源自豬及牛的培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(CICM)細(xì)胞及細(xì)胞系，及已插入異源DNA的轉(zhuǎn)基因CICM細(xì)胞的制備方法。CICM轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可用于制造克隆的轉(zhuǎn)基因胚胎、胎兒及后代?！?19專利中亦描述制造轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，其可傳遞異源DNA至其子代。于優(yōu)選具體實(shí)施方案中，非-人類動(dòng)物為大鼠、綿羊、豬、山羊、?；蝰R。
XENOMOUSETM小鼠可產(chǎn)生完整人類抗體的類成人所有組成成分(adult-like human repertoire)并可產(chǎn)生抗原特異性人類抗體。于某些具體實(shí)施方案中，XENOMOUSETM小鼠通過(guò)導(dǎo)入兆堿基大小的人類重鏈基因座及κ輕鏈基因座的種系表形酵母人工染色體(YAC)片段后可包含近80％的人類抗體V基因所有組成成分。于其它具體實(shí)施方案中，XENOMOUSETM小鼠進(jìn)一步包含近乎所有λ輕鏈基因座。請(qǐng)見Mendez等人，Nature Genetics 15146-156(1997)，Green和Jakobovits，J.Exp.Med.188483-495(1998)及WO 98/24893，其公開內(nèi)容以引用的方式并入本文中。
于某些具體實(shí)施方案中，包括人類免疫球蛋白基因的非-人類動(dòng)物為具有人類免疫球蛋白″微小基因座(minilocus)″的動(dòng)物。于微小基因座研究中，藉由內(nèi)含源自Ig基因座的單獨(dú)基因來(lái)模擬外源性Ig基因座。依此，可將一種或多種VH基因、一種或多種DH基因、一種或多種JH基因、mu恒定區(qū)及第二恒定區(qū)(優(yōu)選為γ恒定區(qū))形成用以插入動(dòng)物體中的構(gòu)建體。該研究特別描述于美國(guó)專利號(hào)5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,591,669、5,612,205、5,721,367、5,789,215及5,643,763，其以引用的方式并入本文中。
另一方面，本發(fā)明提供一種制備人源化抗M-CSF抗體的方法。于某些具體實(shí)施方案中，非-人類動(dòng)物于可允許抗體產(chǎn)生的條件下，如下所述用M-CSF抗原免疫。從動(dòng)物分離產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，與骨髓瘤融合以產(chǎn)生雜交瘤，并分離出可編碼目的抗M-CSF抗體的重鏈及輕鏈的核酸。隨后使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知及如下進(jìn)一步所述的技術(shù)改造這些核酸以降低非-人類序列含量，即，將抗體人源化以減少人體中的免疫反應(yīng)。
于某些具體實(shí)施方案中，M-CSF抗原為分離及/或純化的M-CSF。于優(yōu)選具體實(shí)施方案中，M-CSF抗原為人類M-CSF。于某些具體實(shí)施方案中，M-CSF抗原為M-CSF的片段。于某些具體實(shí)施方案中，M-CSF片段為M-CSF的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。于某些具體實(shí)施方案中，M-CSF片段包括至少一種M-CSF的表位。于其它具體實(shí)施方案中，M-CSF抗原為一種細(xì)胞，其可于表面表達(dá)或過(guò)表達(dá)M-CSF或其免疫原性片段。于某些具體實(shí)施方案中，M-CSF抗原為一種M-CSF融合蛋白。M-CSF可使用已知技術(shù)由天然來(lái)源純化。重組M-CSF是商業(yè)可獲得的。
動(dòng)物的免疫可由本領(lǐng)域中已知的任何方法進(jìn)行。請(qǐng)見如Harlow和Lane，AntibodyA Laboratory Manual，New YorkCold Spring HarborPress，1990。免疫非-人類動(dòng)物(如小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬、牛及馬)的方法于本領(lǐng)域中所熟知。請(qǐng)見如前述的Harlow和Lane，及美國(guó)專利5,994,619號(hào)。于一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，M-CSF抗原是與佐劑一同給藥以促進(jìn)免疫應(yīng)答。示范性佐劑包含弗氏(Freund′s)完全或不完全佐劑、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激復(fù)合物)。此種佐劑可通過(guò)將多肽隔離于局部沉積中以保護(hù)多肽免于快速消失，或者其可包含能刺激宿主分泌對(duì)巨噬細(xì)胞有趨化性的因子及其它免疫系統(tǒng)組分的物質(zhì)。優(yōu)選地，若給予多肽時(shí)，免疫方案中可包含給予一或多次多肽，延續(xù)至數(shù)周以上的時(shí)間。實(shí)施例I例示一種可于XENOMOUSETM小鼠中制備抗M-CSF單克隆抗體的方法。
抗體及抗體產(chǎn)生細(xì)胞系的制備以M-CSF抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫后，可由動(dòng)物獲得抗體及/或抗體產(chǎn)生細(xì)胞。于某些具體實(shí)施方案中，包含抗M-CSF抗體的血清是通過(guò)放血或處死動(dòng)物由動(dòng)物獲得。血清可以其取自動(dòng)物時(shí)的原樣直接使用，可由血清獲得免疫球蛋白部分，或者可由血清純化出抗M-CSF抗體。
于某些具體實(shí)施方案中，產(chǎn)生抗體的無(wú)限增殖化細(xì)胞系是由免疫動(dòng)物所分離的細(xì)胞所制造。免疫后，處死動(dòng)物并將淋巴結(jié)及/或脾臟B細(xì)胞永生化。永生化細(xì)胞的方法包含(但不限于)以致癌基因?qū)ζ溥M(jìn)行轉(zhuǎn)染、以致癌基因病毒對(duì)其進(jìn)行感染、于可選擇永生化細(xì)胞的條件下進(jìn)行培養(yǎng)、以致癌性或致突變化合物處理、將其與已永生化的細(xì)胞(如骨髓瘤細(xì)胞)融合以及失活腫瘤抑制基因。請(qǐng)見如前述Harlow和Lane。若采用與骨髓瘤細(xì)胞融合的方法，骨髓瘤細(xì)胞優(yōu)選為不分泌免疫球蛋白多肽(非-分泌性細(xì)胞系)的。永生化細(xì)胞是使用M-CSF、其部分或表達(dá)M-CSF的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行篩選。于一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，最初的篩選是使用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)或放射免疫分析法進(jìn)行。ELISA篩選的實(shí)例見于WO 00/37504，以引用的方式并入本文中。
將可產(chǎn)生抗M-CSF抗體的細(xì)胞(如雜交瘤)加以選擇、克隆并進(jìn)一步篩選其所需的特性，包含強(qiáng)勁生長(zhǎng)力、高抗體產(chǎn)量及所需的抗體特性，如下進(jìn)一步討論的。雜交瘤可于同系的(syngeneic)動(dòng)物、缺乏免疫系統(tǒng)的動(dòng)物(如裸鼠)的體內(nèi)或于體外細(xì)胞培養(yǎng)中來(lái)進(jìn)行擴(kuò)展。選擇、克隆及擴(kuò)展雜交瘤的方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知。
于一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，該免疫動(dòng)物為非-人類動(dòng)物，其可表達(dá)人類免疫球蛋白基因且脾臟B細(xì)胞可與源自該非-人類動(dòng)物相同物種的骨髓瘤細(xì)胞系融合。于一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，該免疫動(dòng)物是XENOMOUSETM動(dòng)物且該骨髓瘤細(xì)胞系為一種非-分泌性小鼠骨髓瘤。于一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，骨髓瘤細(xì)胞株為P3-X63-AG8-653。請(qǐng)見實(shí)施例I。
因此于一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備能產(chǎn)生針對(duì)M-CSF的人類單克隆抗體或其片段的細(xì)胞系的方法，其包括(a)以M-CSF、M-CSF部分或可表達(dá)M-CSF的細(xì)胞或組織對(duì)在此所述的非-人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行免疫；(b)使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生對(duì)M-CSF的免疫應(yīng)答；(c)由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分離B淋巴細(xì)胞；(d)永生化B淋巴細(xì)胞；(e)產(chǎn)生永生化B淋巴細(xì)胞的單獨(dú)單克隆細(xì)胞群；及(f)篩選永生化的B淋巴細(xì)胞以確認(rèn)針對(duì)M-CSF的抗體。
另一方面，本發(fā)明提供可產(chǎn)生人類抗M-CSF抗體的雜交瘤。于一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，該雜交瘤為如上述的鼠雜交瘤。于其它具體實(shí)施方案中，該雜交瘤可于非-人類，非-小鼠物種中制備，如大鼠、綿羊、豬、山羊、?；蝰R。于另一具體實(shí)施方案中，該雜交瘤為人類雜交瘤。
于另一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物以M-CSF進(jìn)行免疫，初級(jí)細(xì)胞(如脾臟或外周血細(xì)胞)由免疫轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分離出并確認(rèn)能產(chǎn)生特異于目的抗原的單獨(dú)細(xì)胞。將源自各獨(dú)立細(xì)胞的聚腺苷酸化mRNA分離并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，使用有義引物，其與可變區(qū)序列退火，如可識(shí)別大部分或全部人類重鏈與輕鏈可變區(qū)基因的FR1區(qū)的簡(jiǎn)并引物，及反義引物，其可與恒定區(qū)或接合區(qū)序列退火。隨后將重鏈與輕鏈可變區(qū)的cDNA克隆并表達(dá)于任何適當(dāng)宿主細(xì)胞中(如骨髓瘤細(xì)胞)，所表達(dá)的嵌合抗體擁有分別的免疫球蛋白恒定區(qū)，如重鏈及κ或λ恒定區(qū)。請(qǐng)見Babcook，J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA937843-48，1996，其以引用的方式并入本文中。然后以在此所述方法確任并分離抗M-CSF抗體。
于另一具體實(shí)施方案中，噬菌體展示技術(shù)可用于提供包含具有對(duì)M-CSF不同親和力的抗體的所有組成成分的文庫(kù)。為制備該所有組成成分，不需將源自免疫動(dòng)物的B細(xì)胞永生化。反之，初級(jí)B細(xì)胞可直接做為DNA來(lái)源。得自B細(xì)胞(如源自脾臟)的cDNA混合物可用于制備表達(dá)文庫(kù)，如轉(zhuǎn)染至大腸桿菌(E.coli)的噬菌體展示文庫(kù)。測(cè)試所產(chǎn)生細(xì)胞對(duì)M-CSF的免疫活性?？勺栽撐膸?kù)鑒別出高親和力人類抗體的技術(shù)描述于Griffiths等人，EMBO J.，133245-3260(1994)；Nissim等人，出處同上，692-698頁(yè)及Griffiths等人，出處同上，12725-734。最后，自該文庫(kù)中確認(rèn)出可產(chǎn)生對(duì)抗原產(chǎn)生所需的結(jié)合親和力的克隆，并將可編碼負(fù)責(zé)該結(jié)合的產(chǎn)物的DNA回收及用于標(biāo)準(zhǔn)重組表達(dá)操作。噬菌體展示文庫(kù)亦可使用先前操作的核苷酸序列來(lái)構(gòu)建并以類似方式進(jìn)行篩選。可編碼重鏈及輕鏈的cDNA通常是獨(dú)立提供或連接形成Fv類似物以產(chǎn)生噬菌體文庫(kù)。
隨后于噬菌體文庫(kù)中篩選對(duì)M-CSF具有最高親和力的抗體并由適當(dāng)克隆收集遺傳物質(zhì)。更多輪的篩選可增加所分離原始抗體的親和力。
另一方面，本發(fā)明提供可產(chǎn)生人類抗M-CSF抗體的雜交瘤。于一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，該雜交瘤為如上所述的小鼠雜交瘤。于其它具體實(shí)施方案中，該雜交瘤可于非-人類、非-小鼠物種(如大鼠、綿羊、豬、山羊、?；蝰R)中產(chǎn)生。于另一具體實(shí)施方案中，該雜交瘤為人類雜交瘤。
制作抗體的核酸、載體、宿主細(xì)胞及重組方法核酸本發(fā)明亦包含編碼抗M-CSF抗體的核酸分子。于某些具體實(shí)施方案中，由不同核酸分子編碼抗M-CSF免疫球蛋白的重鏈及輕鏈。于其它具體實(shí)施方案中，同一核酸分子編碼抗M-CSF免疫球蛋白的重鏈及輕鏈。于一具體實(shí)施方案中，核酸編碼本發(fā)明的M-CSF抗體。
于某些具體實(shí)施方案中，編碼輕鏈的可變區(qū)的核酸分子包括人類VKL5、O12、L2、B3、A27基因及JK1、JK2、JK3或JK4基因。
于某些具體實(shí)施方案中，編碼輕鏈的核酸分子編碼在種系氨基酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)突變的氨基酸序列。于某些具體實(shí)施方案中，核酸分子所包括的核苷酸序列編碼與種系序列相比包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)非-保守性氨基酸替換及/或1、2或3非一保守性替換的VL氨基酸序列。替換可位于CDR區(qū)、構(gòu)架區(qū)，或于恒定區(qū)中。
于某些具體實(shí)施方案中，核酸分子編碼與種系序列相比包括一個(gè)或多個(gè)變異的VL氨基酸序列，其與見于抗體252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2I F、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1之一的VL中的變異相同。
于某些具體實(shí)施方案中，與種系序列相比，核酸分子編碼至少三種見于抗體252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4、8.10.3或9.7.2之一的VL中的氨基酸突變。
于某些具體實(shí)施方案中，該核酸分子包括一種核苷酸序列，其可編碼單克隆抗體252(SEQ ID NO4)、88(SEQ ID NO8)、100(SEQ IDNO12)、3.8.3(SEQ ID NO16)、2.7.3(SEQ ID NO20)、1.120.1(SEQID NO24)、9.14.4I(SEQ ID NO28)、8.10.3F(SEQ ID NO32)、9.7.2IF(SEQ ID NO36)、9.14.4(SEQ ID NO28)、8.10.3(SEQ IDNO44)、9.7.2(SEQ ID NO48)、9.7.2C-Ser(SEQ ID NO52)、9.14.4C-Ser(SEQ ID NO56)、8.10.3C-Ser(SEQ ID NO60)、8.10.3-CG2(SEQ ID NO60)、9.7.2-CG2(SEQ ID NO52)、9.7.2-CG4(SEQ ID NO52)、9.14.4-CG2(SEQ ID NO56)、9.14.4-CG4(SEQ ID NO56)、9.14.4-Ser(SEQ ID NO28)、9.7.2-Ser(SEQ ID NO48)、8.10.3-Ser(SEQ ID NO44)、8.10.3-CG4(SEQ ID NO60)、8.10.3FG1(SEQ ID NO32)或9.14.4G1(SEQ ID NO28)的VL氨基酸序列或其部分。于某些具體實(shí)施方案中，該部分至少包括CDR2區(qū)。于某些具體實(shí)施方案中，核酸可編碼該抗體的輕鏈CDR的氨基酸序列。于某些具體實(shí)施方案中，該部分為包括CDR1-CDR3的連續(xù)部分。
于某些具體實(shí)施方案中的核酸分子包括一種核苷酸序列，其可編碼SEQ ID NOS4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60之一的輕鏈氨基酸序列。于某些優(yōu)選具體實(shí)施方案中，核酸分子包括SEQ ID NOS3、7、11、27、31、35、43或47的輕鏈核苷酸序列或其部分。
某些具體實(shí)施方案中，核酸分子所編碼的VL氨基酸序列與下列序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同顯示于圖1的VL氨基酸序列或抗體252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1中任一種抗體的VL氨基酸序列，或任一SEQ ID NOS4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的氨基酸序列。本發(fā)明核酸分子包含核酸，其可于高度嚴(yán)格條件(如上所述)與下列核酸序列雜交編碼SEQ ID NOS4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的輕鏈氨基酸序列的核酸序列或具有SEQ ID NOS3、7、11、27、31、35、43或47的輕鏈核酸序列的核酸序列。
于另一具體實(shí)施方案中，該核酸編碼選自下列抗體的全長(zhǎng)輕鏈252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1或編碼包括SEQ ID NOS4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的氨基酸序列的輕鏈及輕鏈恒定區(qū)，或者包括突變的輕鏈。此外，該核酸可包括SEQ ID NOS3、7、11、27、31、35、43或47的輕鏈核苷酸序列及編碼輕鏈恒定區(qū)的核苷酸序列，或編碼包括突變的輕鏈的核酸分子。
于另一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，該核酸分子編碼重鏈的可變區(qū)(VH)，其包括人類VH1-18、3-33、3-11、3-23、3-48或3-7基因序列或由其所衍生的序列。于不同具體實(shí)施方案中，核酸分子包括人類VH1-18基因、DH4-23基因及人類JH4基因；人類VH3-33基因、人類DH1-26基因及人類JH4基因；人類VH3-11基因、人類DH7-27基因及人類JH4基因；人類VH3-11基因、人類DH7-27基因及人類JH6基因；人類VH3-23基因、人類DH1-26基因及人類JH4基因；人類VH3-7基因、人類DH6-13基因及人類JH4基因；人類VH3-11基因、人類DH7-27基因及人類JH4b基因；人類VH3-48基因、人類DH1-26基因5及人類JH4b基因；人類VH3-11基因、人類DH6-13基因及人類JH6b基因或源自該人類基因的序列。
于某些具體實(shí)施方案中，與人類V、D或J基因的種系氨基酸序列比較，該核酸分子所編碼的氨基酸序列包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個(gè)突變。于某些具體實(shí)施方案中，該突變位于VH區(qū)。于某些具體實(shí)施方案中，該突變位于CDR區(qū)。
于某些具體實(shí)施方案中，相較于種系序列，該核酸分子編碼一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變，其與見于單克隆抗體252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG 2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G 1的VH的氨基酸突變相同。于某些具體實(shí)施方案中，相較于種系序列，該核酸編碼至少三個(gè)氨基酸突變，其與見于上列單克隆抗體中的至少三個(gè)氨基酸突變相同。
于某些具體實(shí)施方案中，核酸分子包括核苷酸序列，其可編碼下列抗體中至少部分的VH氨基酸序列252(SEQ ID NO4)、88(SEQ ID NO8)、100(SEQ ID NO12)、3.8.3(SEQ ID NO16)、2.7.3(SEQ ID NO20)、1.120.1(SEQ ID NO24)、9.14.4I(SEQ ID NO28)、8.10.3F(SEQID NO32)、9.7.2IF(SEQ ID NO36)、9.14.4(SEQ ID NO28)、8.10.3(SEQ ID NO44)、9.7.2(SEQ ID NO48)、9.7.2C-Ser(SEQ IDNO52)、9.14.4C-Ser(SEQ ID NO56)、8.10.3C-Ser(SEQ ID NO60)、8.10.3-CG2(SEQ ID NO60)、9.7.2-CG2(SEQ ID NO52)、9.7.2-CG4(SEQ ID NO52)、9.14.4-CG2(SEQ ID NO56)、9.14.4-CG4(SEQ ID NO56)、9.14.4-Ser(SEQ ID NO28)、9.7.2-Ser(SEQ ID NO48)、8.10.3-Ser(SEQ ID NO44)、8.10.3-CG4(SEQ ID NO60)8.10.3FG1(SEQ ID NO32)或9.14.4G1(SEQ ID NO28)，或者該序列具有保守性氨基酸突變及/或總計(jì)3個(gè)或更少的非保守性氨基酸替換。于不同具體實(shí)施方案中，該序列編碼一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)，優(yōu)選為CDR3區(qū)、全部3個(gè)CDR區(qū)、包含CDR1-CDR3的連續(xù)部分或整個(gè)VH區(qū)。
于某些具體實(shí)施方案中，核酸分子包括重鏈核苷酸序列，其編碼SEQ ID NOS2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102之一的氨基酸序列。于某些優(yōu)選具體實(shí)施方案中，核酸分子至少包括SEQ ID NO1、5、9、25、29、33、37、45、97或101的重鏈核苷酸序列的一部分。于某些具體實(shí)施方案中，該部分編碼VH區(qū)、CDR3區(qū)、全部3個(gè)CDR區(qū)或包含CDR1-CDR3的連續(xù)區(qū)。
于某些具體實(shí)施方案中，核酸分子編碼VH氨基酸序列，其與顯示于圖4中的VH氨基酸序列或與SEQ ID NOS2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102中任何一種VH氨基酸序列至少有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。本發(fā)明核酸分子包含在高度嚴(yán)格條件下(如前所述)可與下列核苷酸序列進(jìn)行雜交的核酸編碼SEQ ID NOS2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的重鏈氨基酸序列的核苷酸序列，或?yàn)榫哂蠸EQ ID NOS1、5、9、25、29、33、37、45、97或101的核苷酸序列。
于另一具體實(shí)施方案中，該核酸編碼選自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2I F、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的抗體的完整重鏈，或具有SEQ ID NOS2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的氨基酸序列的重鏈及重鏈的恒定區(qū)，或包括突變的重鏈。此外，該核酸可包括SEQ ID NOS1、5、9、25、29、33、37、45、97或101的重鏈核苷酸序列及編碼輕鏈恒定區(qū)的核苷酸序列或編碼包括突變的重鏈的核酸分子。
編碼抗M-CSF抗體的重鏈或完整輕鏈的核酸分子或其部分可由任何能產(chǎn)生此種抗體的來(lái)源分離。于各種具體實(shí)施方案中，核酸分子是由以M-CSF免疫的動(dòng)物所分離的B細(xì)胞分離或由源自此種表達(dá)抗M-CSF抗體的B細(xì)胞的無(wú)限增殖化細(xì)胞所分離。分離編碼抗體的mRNA的方法于本領(lǐng)域中所熟知。請(qǐng)見如Sambrook等人。mRNA可用于產(chǎn)生cDNA以用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或抗體基因的cDNA克隆。于一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，該核酸分子分離自雜交瘤，該雜交瘤具有來(lái)自非-人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)生人類免疫球蛋白的細(xì)胞作為其融合配偶體之一。于一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，可產(chǎn)生人類免疫球蛋白的細(xì)胞由XENOMOUSETM動(dòng)物分離。于另一具體實(shí)施方案中，可產(chǎn)生人類免疫球蛋白的細(xì)胞是源自如上述的非-人類、非-小鼠轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。于另一具體實(shí)施方案中，核酸是分離自非-人類、非-轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。也可采用分離自非-人類、非-轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的核酸分子，用于例如人源化抗體。
于某些具體實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明抗M-CSF抗體重鏈的核酸可以包括編碼本發(fā)明VH區(qū)的核苷酸序列，其符合讀框的與得自任何來(lái)源的編碼重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列相連接。同樣地，編碼本發(fā)明抗M-CSF抗體輕鏈的核酸分子可以包括編碼本發(fā)明VL區(qū)的核苷酸序列，其符合讀框的與得自任何來(lái)源的編碼輕鏈恒定區(qū)的核苷酸序列連接。
于本發(fā)明更進(jìn)一步的方面，編碼重鏈(VH)及輕鏈(VL)可變區(qū)的核酸分子轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)的抗體基因。于一具體實(shí)施方案中，編碼VH或VL區(qū)的核酸分子通過(guò)插入表達(dá)載體轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)抗體基因，其中該表達(dá)載體已可分別編碼重鏈(CH)或輕鏈(CL)的恒定區(qū)，以便VH部分可操作連接至載體中的CH部分，而VL部分可操作連接至載體中的CL部分。于另一具體實(shí)施方案中，可編碼VH及/或VL區(qū)的核酸分子能通過(guò)連接轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)抗體基因，如使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)連接編碼VH及/或VL區(qū)的核酸分子及編碼CH及/或CL區(qū)的核酸分子。人類重鏈及輕鏈免疫球蛋白恒定區(qū)基因的核酸序列已為本領(lǐng)域中所知。請(qǐng)見如Kabat等人，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版，NIH Publ.No.91-3242，1991。編碼全長(zhǎng)重鏈及/或輕鏈的核酸分子接著可導(dǎo)入細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)并分離抗M-CSF抗體。
該核酸分子可用于重組表達(dá)大量的抗M-CSF抗體。該核酸分子亦可用于制備嵌合抗體、雙特異性抗體、單鏈抗體、免疫粘附素、二體、突變的抗體及抗體衍生物，請(qǐng)見以下進(jìn)一步敘述。若核酸分子是源自非人類、非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，該核酸分子可用于進(jìn)行抗體人源化，其亦如下所述。
于另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明核酸分子可做為特異抗體序列的探針或PCR引物。例如，該核酸可于診斷方法中做為探針或做為PCR引物以擴(kuò)增可使用的DNA區(qū)，特別是，用以分離編碼抗M-CSF抗體的可變區(qū)的另外核酸分子。于某些具體實(shí)施方案中，該核酸分子為寡核苷酸。于某些具體實(shí)施方案中，寡核苷酸來(lái)自目的抗體的重鏈與輕鏈的高度可變區(qū)。于某些具體實(shí)施方案中，寡核苷酸編碼下列抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR的全部或部分抗體252、88、100、3.8.3、2.7.3或1.120.1或其在此所述的變體。
載體本發(fā)明提供包括核酸分子的載體，該核酸分子可編碼本發(fā)明的抗M-CSF抗體的重鏈或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明亦提供包括核酸分子的載體，該核酸分子可編碼該抗體的輕鏈或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明還提供包括核酸分子的載體，該核酸分子可編碼融合蛋白、經(jīng)修飾抗體、抗體片段及其探針。
于某些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明抗M-CSF抗體或其抗原結(jié)合部分通過(guò)將編碼部分或全長(zhǎng)輕鏈及重鏈的DNA(如前述方法取得)插入至表達(dá)載體中以便該基因可操作地連接至必需的表達(dá)控制序列(如轉(zhuǎn)錄及翻譯控制序列)而表達(dá)。表達(dá)載體包含質(zhì)體、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)、植物病毒如花椰菜花葉病毒、煙草花葉病毒、粘粒、YACs、EBV衍生的游離基因等。該抗體基因可連接至載體以便載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄及翻譯控制序列提供其所需的調(diào)節(jié)抗體基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的功能。所選擇的表達(dá)載體及表達(dá)控制序列應(yīng)能與所采用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容。該抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因可插入不同的載體中。于一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，兩種基因可以插入同一表達(dá)載體中。該抗體基因可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(如連接抗體基因片段及載體上的互補(bǔ)限制性部位，或者若無(wú)限制性部位則采平端連接反應(yīng))插入表達(dá)載體中。
一種便利的載體為編碼功能性的完整人類CH或CL免疫球蛋白序列的載體，并具有適當(dāng)改造的限制位點(diǎn)以便任何VH或VL序列可容易地插入及表達(dá)，如前所述。于此種載體中，剪接通常發(fā)生于插入的J區(qū)中剪接供體部位以及為于人類C區(qū)前的剪接受體部位之間，且亦發(fā)生在人類CH外顯子中所產(chǎn)生的剪接區(qū)。聚腺苷酸化作用及轉(zhuǎn)錄終止發(fā)生于編碼區(qū)下游的天然染色體部位。重組表達(dá)載體亦可編碼一種信號(hào)肽，其可促進(jìn)抗體鏈由宿主細(xì)胞分泌。該抗體鏈基因可克隆入載體中以便信號(hào)肽可符合讀框地連接至該免疫球蛋白鏈的氨基端。信號(hào)肽可為免疫球蛋白信號(hào)肽或異源的信號(hào)肽(即源自非-免疫球蛋白蛋白質(zhì)的信號(hào)肽)。
除抗體鏈基因外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體攜帶可控制宿主細(xì)胞中抗體鏈基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)了解表達(dá)載體的設(shè)計(jì)(包含選擇調(diào)節(jié)序列)應(yīng)依據(jù)如下因素選擇用以轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、所需的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等。對(duì)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)而言，優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列包含可指揮哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平蛋白質(zhì)表達(dá)的病毒性元件，如來(lái)自反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs、巨細(xì)胞病毒(CMV)(如CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)、猿病毒40(SV40)(如SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)、腺病毒(如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP))、多形瘤及強(qiáng)哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子(如天然免疫球蛋白及肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)的啟動(dòng)子及/或增強(qiáng)子。有關(guān)病毒調(diào)節(jié)元件及其序列的進(jìn)一步描述，請(qǐng)見如美國(guó)專利號(hào)5,168,062、美國(guó)專利號(hào)4,510,245及美國(guó)專利號(hào)4,968,615?？捎谥参镏斜磉_(dá)抗體的方法，包含啟動(dòng)子及載體的描述，以及植物的轉(zhuǎn)化已為本領(lǐng)域所知。請(qǐng)見如美國(guó)專利第6,517,529號(hào)，其以引用的方式并入本文中?？捎诩?xì)菌細(xì)胞或真菌細(xì)胞(如酵母細(xì)胞)中表達(dá)多肽的方法亦于本領(lǐng)域中所熟知。
除抗體鏈基因及調(diào)節(jié)序列外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可帶有另外的序列，如能調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中載體復(fù)制的序列(如復(fù)制起點(diǎn))及可選擇的標(biāo)記基因?？蛇x擇的標(biāo)記基因可幫助選擇已導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞(請(qǐng)見如美國(guó)專利號(hào)4,399,216、4,634,665及5,179,017)。如典型的選擇性標(biāo)記基因會(huì)對(duì)導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞賦予對(duì)藥物(如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記基因包含二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于具有氨甲蝶呤選擇性/放大作用的dhfr-宿主細(xì)胞)、新霉素抗性基因(用于G418選擇)及谷氨酸合成酶基因。
重組生產(chǎn)蛋白質(zhì)的非-雜交瘤宿主細(xì)胞及方法編碼抗M-CSF抗體的核酸分子及包括這些核酸分子的載體可用來(lái)轉(zhuǎn)移感染適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物、植物、細(xì)菌或酵母宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化可藉任何已知方法將多核苷酸導(dǎo)入至宿主細(xì)胞中。將異源多核苷酸導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的方法于本領(lǐng)域中所熟知，且其包含葡聚醣-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、polybrene-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔法、將多核苷酸封裝于脂質(zhì)體中及直接顯微注射DNA至核中。此外，核酸分子可通過(guò)病毒載體導(dǎo)入至哺乳動(dòng)物細(xì)胞種。轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法于本領(lǐng)域中所熟知。請(qǐng)見如美國(guó)專利號(hào)4,399,216、4,912,040、4,740,461及4,959,455(這些專利是以引用的方式并入本文中)。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法于本領(lǐng)域中所熟知，包含如土壤桿菌屬(Agrobacterium)-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、biolistic轉(zhuǎn)化、直接注射、電穿孔法及病毒轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化細(xì)菌及酵母細(xì)胞的方法也是本領(lǐng)域中所熟知。
可用于表達(dá)宿主的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系于本領(lǐng)域中所熟知，且包含許多來(lái)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心((American Type CultureCollection)ATCC)的無(wú)限增殖細(xì)胞系。這些包含，特別是，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)細(xì)胞、NSO、SP2細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人類肝細(xì)胞癌細(xì)胞(如Hep G2)、A549細(xì)胞及許多其它的細(xì)胞系。特別優(yōu)選細(xì)胞系的選擇是根據(jù)測(cè)定那一種細(xì)胞系具有高表達(dá)水平。其它可使用的細(xì)胞系為昆蟲細(xì)胞系，如Sf9細(xì)胞。如下產(chǎn)生抗體，將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞后，培養(yǎng)宿主細(xì)胞一段時(shí)間使其足以在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體，或者優(yōu)選地，抗體可分泌至宿主細(xì)胞所生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中?？贵w可使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法由培養(yǎng)基中回收。植物宿主細(xì)胞包含如煙草屬(Nicotiana)、鼠耳芥屬(Arabidopsis)、浮萍、玉米、小麥、馬鈴薯等。細(xì)菌性宿主細(xì)胞包含大腸桿菌(E.coli)及鏈霉菌屬種(streptomyces species)。酵母宿主細(xì)胞包含粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)及巴斯德畢赤氏酵母(Pichiapastoris)。
此外，源自制備細(xì)胞系的本發(fā)明抗體(或其它所屬部分)的表達(dá)可使用許多已知技術(shù)來(lái)提高。如谷氨酰胺合成酶基因表達(dá)系統(tǒng)(GS系統(tǒng))為一種于某些條件下常見的加強(qiáng)表達(dá)的方法。有關(guān)GS系統(tǒng)全部或部分討論于歐洲專利號(hào)0 216 846、0 256 055及0 323 997與歐洲專利申請(qǐng)89303964.4。
由不同細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)的抗體可能會(huì)具有彼此不同的糖基化。然而，所有由在此所提供的核酸分子所編碼的抗體或包括在此所提供的氨基酸序列皆為本發(fā)明的部分，無(wú)論抗體的糖基化狀態(tài)或模式或修飾。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及植物本發(fā)明的抗M-CSF抗體也可以通過(guò)如下方式轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生產(chǎn)生目的免疫球蛋白重鏈及輕鏈序列的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物或植物并由此制備可恢復(fù)的抗體。涉及哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生，抗M-CSF抗體可在山羊奶、牛奶或其它哺乳動(dòng)物的乳汁中產(chǎn)生及回收。請(qǐng)見如美國(guó)專利號(hào)5,827,690、5,756,687、5,750,172及5,741,957。于某些具體實(shí)施方案中，如上所述，用M-CSF或其免疫原性部分對(duì)包括人類免疫球蛋白基因座的非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行免疫。于植物、酵母或真菌/藻類中制備抗體的方法描述于如美國(guó)專利號(hào)6,046,037及5,959,177中。
于某些具體實(shí)施方案中，非-人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物的制備是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入一種或多種編碼本發(fā)明抗M-CSF抗體的核酸分子至動(dòng)物或植物中。請(qǐng)見Hogan及美國(guó)專利號(hào)6,417,429，如前所述。用于制造轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可為胚胎干細(xì)胞或體細(xì)胞細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因的非-人類生物可為嵌合、非嵌合雜合子及非嵌合型純合子。請(qǐng)見如Hogan等人，Manipulating the Mouse EmbryoA Laboratory Manual2ed.，Cold Spring Harbor Press(1999)；Jackson等人，MouseGenetics and TransgenicsA Practical Approach，OxfordUniversity Press(2000)；及Pinkert，Transgenic AnimalTechnologyA Laboratory Handbook，Academic Press(1999)。于某些具體實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因的非-人類動(dòng)物含有被靶向的分裂處(targeted disruption)并由編碼目的重鏈及/或輕鏈的靶向構(gòu)建體來(lái)置換。于一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括并表達(dá)編碼可與M-CSF優(yōu)選為人類M-CSF特異性結(jié)合的重鏈及輕鏈的核酸分子。于某些具體實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括編碼經(jīng)修飾的抗體(如單鏈抗體、嵌合抗體或人源化抗體)的核酸分子?？筂-CSF抗體可于任何轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中制造。于一優(yōu)選具體實(shí)施方案中，非-人類動(dòng)物為小鼠、大鼠、綿羊、豬、山羊、?；蝰R。非-人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物于血液、乳汁、尿液、唾液、淚液、粘液及其它體液中表達(dá)該編碼的多肽。
噬菌體展示文庫(kù)本發(fā)明提供一種制備抗M-CSF抗體或其抗原結(jié)合部分的方法，其包括如下步驟在噬菌體上合成人類抗體文庫(kù)，篩選含有M-CSF或其部分的文庫(kù)，分離可與M-CSF結(jié)合的噬菌體，并由該噬菌體取得抗體。例如，一種制備抗體文庫(kù)用于噬菌體展示技術(shù)的方法包括如下步驟以M-CSF或其抗原部分免疫包括人類免疫球蛋白基因座的非-人類動(dòng)物以便引起免疫應(yīng)答，由經(jīng)免疫的動(dòng)物提取可產(chǎn)生抗體的細(xì)胞；由該提取的細(xì)胞分離RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生cDNA，使用引物擴(kuò)增cDNA，并將cDNA插入噬菌體展示載體以便抗體可于噬菌體上表達(dá)。本發(fā)明的重組抗M-CSF抗體可以此方式獲得。
本發(fā)明的重組抗M-CSF人類抗體可通過(guò)篩選重組的組合抗體文庫(kù)來(lái)分離。該抗體文庫(kù)優(yōu)選為scFv噬菌體展示文庫(kù)，其是使用由B細(xì)胞所分離的mRNA所制備的人類VL及VHcDNA所產(chǎn)生?？芍苽浼昂Y選此種文庫(kù)的方法為本領(lǐng)域中已知。已有可供產(chǎn)生噬菌體展示文庫(kù)的商品化試劑盒(如Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，目錄號(hào)27-9400-01；及Stratagene SurfZAPTM噬菌體展示試劑盒，目錄號(hào)240612)。亦有其它可用于產(chǎn)生及篩選抗體展示文庫(kù)的方法及試劑(請(qǐng)見于如美國(guó)專利號(hào)5,223,409、PCT
發(fā)明者瓦?！ぐ莸鄱? 梅德亥·那拉辛亥·黛維拉雷杰, 約瑟·艾德文·羅, 詹姆斯·雷司里·摩伯雷, 西瑞德-艾咪·凱勒曼, 岸恩·福爾茨, 瑪麗·哈克-福倫德丘 申請(qǐng)人:沃尼爾·朗伯有限責(zé)任公司, 安進(jìn)弗里蒙特公司