專利名稱：Hpv 45 l1在酵母中的優(yōu)化表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及人乳頭狀瘤病毒(HPV)的治療。更具體地說，本發(fā)明涉及編碼HPV45 L1蛋白質(zhì)的合成多核苷酸，和包括所述多核苷酸的重組載體和宿主。本發(fā)明也涉及HPV45病毒-樣顆粒(VLPs)，其中通過在酵母細(xì)胞中表達(dá)重組HPV 45 L1或L1+L2產(chǎn)生VLPs，也涉及其在疫苗和用于預(yù)防和治療HPV的藥物組合物中的用途。
背景技術(shù)：
存在80種以上類型的人乳頭狀瘤病毒(HPV)，其中許多與從良性增生性疣到惡性腫瘤的多種生物表型相關(guān)(關(guān)于綜述，參見McMurray等人，Int.J.Exp.Pathol.82(1)15-33(2001))。HPV 6和HPV 11是最通常與生殖器或呼吸道粘膜的良性疣和/或非惡性的尖銳濕疣相關(guān)的類型。HPV 16和HPV 18是最經(jīng)常與宮頸、陰道、外陰和肛管的原位和侵襲性惡性腫瘤相關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn)類型。90％以上的宮頸癌與HPV16、HPV18或較少流行的致癌型HPV31、-33、-45、-52和-58感染相關(guān)(Schiffman等，J.Natl.Cancer Inst.85(12)958-64(1993))。關(guān)于在90％以上的子宮頸癌中檢測(cè)到HPV DNA的觀察提供了HPVs導(dǎo)致宮頸癌的流行病學(xué)的有力證據(jù)(參見Bosch等，J.Natl.Cancer Inst.87(11)796-802(1995))。
乳頭狀瘤病毒是編碼最多8個(gè)早期和2個(gè)晚期基因的小的(50-60nm)、無包膜的、二十面體DNA病毒。病毒基因組的開放閱讀框(ORFs)被稱為E1至E7，以及L1和L2，其中″E″表示早期而″L″表示晚期。L1和L2編碼病毒殼體蛋白質(zhì)，而E基因與例如病毒復(fù)制和細(xì)胞轉(zhuǎn)化的功能相關(guān)。
L1蛋白質(zhì)是主要的衣殼蛋白并且具有55-60kDa的分子量。L2蛋白質(zhì)是次要的衣殼蛋白質(zhì)。免疫數(shù)據(jù)表明大多數(shù)L2蛋白質(zhì)是在病毒衣殼中的L1蛋白質(zhì)內(nèi)部。L1和L2蛋白質(zhì)在不同的乳頭狀瘤病毒當(dāng)中都是非常保守的。
L1蛋白質(zhì)或L1和L2蛋白質(zhì)組合在酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌中的表達(dá)導(dǎo)致病毒-樣顆粒(VLPs)的自動(dòng)組裝(參見綜述，參見Schiller和Roden，in Papillomavirus Reviews；Current Research onPapillomaviruses；Lacey，ed.Leeds，UKLeeds Medical Information，pp101-12(1996))。VLPs與真正的病毒體在形態(tài)上相似，并且當(dāng)施用于動(dòng)物時(shí)能夠誘導(dǎo)高滴定度的中和抗體。因?yàn)閂LPs不包含可能致癌的病毒基因組，因此它們?cè)贖PV疫苗開發(fā)中為使用活病毒提供安全備選(參見綜述，參見Schiller和Hidesheim，J.Clin.Virol.1967-74(2000))。因此，已經(jīng)確定L1和L2基因?yàn)殚_發(fā)用于HPV感染和疾病的預(yù)防性和治療性疫苗的免疫靶。
與在成功轉(zhuǎn)化的宿主生物體中獲得外源基因的高表達(dá)水平相關(guān)的困難已經(jīng)防礙了HPV疫苗的開發(fā)和商品化，限制了純化蛋白的生產(chǎn)。因此，盡管鑒定了編碼HPV L1蛋白質(zhì)，例如HPV45 L1蛋白質(zhì)的野生型核苷酸序列，開發(fā)粗制HPV L1蛋白質(zhì)的易可再生來源可能是非常合乎需要的，所述來源利用為在預(yù)定的宿主細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的編碼HPV45 L1的核苷酸序列。另外，生產(chǎn)具有天然蛋白質(zhì)的免疫性-賦予特性的大量HPV45 L1 VLPs對(duì)疫苗開發(fā)是有用的。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及對(duì)由已經(jīng)與宮頸癌相關(guān)的HPV45 L1基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物引發(fā)或增加免疫性的組合物和方法。具體地，本發(fā)明提供編碼HPV45 L1蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中已經(jīng)使該多核苷酸的密碼子被優(yōu)化來用于在酵母細(xì)胞中高水平表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步提供HPV45病毒-樣顆粒(VLPs)，其中通過在酵母細(xì)胞中表達(dá)重組HPV45 L1或L1+L2生產(chǎn)所述的VLPs，并且公開了HPV45 VLPs在用于預(yù)防和/或治療HPV-相關(guān)癌的藥物組合物和疫苗中的用途。
本發(fā)明涉及編碼HPV45 L1蛋白質(zhì)的合成DNA分子。合成分子的密碼子被設(shè)計(jì)以使用由酵母細(xì)胞偏好的密碼子。合成的分子可用作HPV45 L1蛋白質(zhì)的來源，其可自我組裝成為VLPs。所述的VLPs可用于以VLP為基礎(chǔ)的疫苗。
本發(fā)明的例證性實(shí)施方案包括編碼如SEQ ID NO2所示的HPV45 L1蛋白質(zhì)的合成核酸分子，所述的核酸分子包括如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
也提供原核和真核的重組載體和重組宿主細(xì)胞，其包含本說明書公開的核酸分子。
本發(fā)明也涉及用于在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)HPV45 L1蛋白質(zhì)的方法，包括(a)將包括編碼HPV45 L1蛋白質(zhì)的核酸的載體導(dǎo)入酵母宿主細(xì)胞；和(b)在容許表達(dá)所述的HPV45 L1蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)該酵母宿主細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)HPV45 L1蛋白質(zhì)的方法，包括(a)將包括編碼HPV45 L1蛋白質(zhì)的核酸的載體導(dǎo)入酵母宿主細(xì)胞；其中使該核酸分子的密碼子優(yōu)化以在酵母宿主細(xì)胞中最優(yōu)表達(dá)；以及(b)在容許表達(dá)所述的HPV45 L1蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)該酵母宿主細(xì)胞。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸包括如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列(45 L1 R序列)。
本發(fā)明也涉及在酵母細(xì)胞中生產(chǎn)的HPV45病毒-樣顆粒(VLPs)、生產(chǎn)HPV45 VLPs的方法、和使用HPV45 VLPs的方法。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母選自啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形漢遜氏酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)、脆壁克魯維氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)、和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是HPV45 VLP，其中通過在酵母細(xì)胞中重組表達(dá)HPV45 L1或HPV45 L1+L2來生產(chǎn)VLP。
本發(fā)明的另一方面是包括由密碼子-優(yōu)化的HPV45 L1基因編碼的HPV45 L1蛋白質(zhì)的HPV45 VLP。在本發(fā)明這方面的例證性實(shí)施方案中，密碼子優(yōu)化的HPV45 L1基因包括如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
本發(fā)明也提供用于在動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括將HPV45病毒樣顆粒施用于所述動(dòng)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，由密碼子優(yōu)化的基因生產(chǎn)HPV45 VLPs。
本發(fā)明的另一方面是預(yù)防或治療HPV-相關(guān)的宮頸癌的方法，包括將包括HPV45 VLPs的疫苗施用于哺乳動(dòng)物。在本發(fā)明這方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，在酵母中生產(chǎn)該HPV45 VLPs。
本發(fā)明也涉及包括HPV45病毒一樣顆粒(VLPs)的疫苗。
在本發(fā)明這方面?zhèn)溥x的實(shí)施方案中，疫苗進(jìn)一步包括至少一個(gè)另外的HPV類型的VLPs。所述至少一個(gè)另外的HPV類型可以是感興趣的任何HPV類型，包括本領(lǐng)域中描述的或隨后鑒定的任何HPV類型。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，HPV類型是與例如疣或?qū)m頸癌的臨床表型相關(guān)的類型。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)另外的HPV類型選自HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59、和HPV68。
本發(fā)明也涉及包括HPV 45病毒樣顆粒的藥物組合物。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及包括HPV45 VLPs和至少一個(gè)另外的HPV類型的VLPs的約物紐含物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)另外的HPV類型選自HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59、和HPV68。
如本說明書和所附的權(quán)利要求書自始至終所使用的，單數(shù)形式″a″，″an″，和″該″包括復(fù)數(shù)引用，除非上下文清楚地另外加以規(guī)定。
如本說明書和所附的權(quán)利要求書自始至終所使用的，應(yīng)用下列定義和縮寫術(shù)語″啟動(dòng)子″是指RNA聚合酶結(jié)合的DNA鏈上的識(shí)別位點(diǎn)。該啟動(dòng)子與RNA聚合酶形成起始復(fù)合物以啟動(dòng)和驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄活性?？赏ㄟ^稱為″增強(qiáng)子″或″上游活化序列″的活化序列或稱為″沉默子″的抑制序列修飾該復(fù)合物。
術(shù)語″載體″是指可將DNA片段導(dǎo)入宿主生物體或宿主組織的一些方式。存在各種型式的載體，包括質(zhì)粒、病毒(包括腺病毒)、細(xì)菌噬茵體和粘粒。
名稱″45 L1野生型序列″是指作為SEQ ID No3(45 L1 wt)在此公開的HPV45 L1 DNA)序列。盡管先前已經(jīng)描述了HPV 45 L1野生型的DNA序列，發(fā)現(xiàn)獲得自臨床分離物的DNAs之間微小的序列的變化是很平常的。因此，從先前顯示包含HPV 45 DNA的臨床樣品分離到代表性的45 L1野生型DNA序列(參見實(shí)施例1)。該45 L1野生型序列用作與在此公開的密碼子-優(yōu)化的45 L1序列進(jìn)行比較的參照序列(參見

圖1)。
名稱HPV 45 L1 R″或″45 L1 R″是指在此公開的例證性的合成HPV45 L1核苷酸序列(SEQ ID NO1)，其中改造該序列以使得其包括為酵母細(xì)胞所偏好用于高水平表達(dá)的密碼子。
術(shù)語″有效量″是指導(dǎo)入足夠的疫苗組合物以生產(chǎn)足夠水平的多肽，因而產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到這個(gè)水平可以變化。
″保守的氨基酸取代″是指一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)化學(xué)上相似的氨基酸殘基替換。這種保守取代的實(shí)例是一個(gè)疏水的殘基(異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、或甲硫氨酸)取代另一個(gè)；一個(gè)極性殘基取代另一個(gè)相同電荷的極性殘基(例如，精氨酸取代賴氨酸；谷氨酸取代天冬氨酸)。
術(shù)語″哺乳動(dòng)物″是指任何哺乳動(dòng)物，包括人。
″VLP″或″VLPs″是指病毒-樣顆粒。
″合成的″是指產(chǎn)生HPV45 L1基因以使得其包含與存在于指定的天然存在的野生型HPV45 L1基因中的核苷酸序列(45 L1 wt、SEQ IDNO3)不相同的核苷酸序列的方式被產(chǎn)生。如上所述，在此提供的合成分子包括包含為酵母細(xì)胞表達(dá)所優(yōu)選的密碼子的核苷酸序列。在此提供的合成分子編碼與野生型HPV45 L1基因(SEQ ID NO2)相同的氨基酸序列。
附圖簡述圖1是顯示在本發(fā)明的合成HPV45 L1基因中發(fā)生改變的核苷酸的DNA序列的序列對(duì)比(SEQ ID NO1，標(biāo)明為″45 L1 R″)(參見實(shí)施例2)。參照序列是45 L1野生型序列(SEQ ID NO3，標(biāo)明為″45 L1 wt；參見實(shí)施例1)。在其相應(yīng)位置標(biāo)明改變的核苷酸。括號(hào)內(nèi)包含有核苷酸編號(hào)。用點(diǎn)表示45 L1改造序列中的相同核苷酸。
圖2顯示改造的合成HPV 45 L1核苷酸和單代碼的氨基酸序列。在左側(cè)標(biāo)明核苷酸編號(hào)。
圖3顯示在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下特異于HPV 45 L1 RNA的Northern印跡探測(cè)(參見實(shí)施例4)。泳道(1)包含5μg的HPV45 L1 R RNA而泳道(2)包含10μg的HPV 45 L1 R RNA。在印跡上可見單個(gè)的全長RNA轉(zhuǎn)錄物。左側(cè)箭頭標(biāo)明全長HPV 45 L1轉(zhuǎn)錄物的預(yù)測(cè)位置。
圖4顯示HPV 45 L1 wt和3個(gè)HPV 45 L1 R分離物的Western印跡。泳道的內(nèi)容物是45 L1 wt(泳道1)、45 L1 R#4(泳道2)、45L1 R#7(泳道3)、45 L1 R#11(泳道4)、HPV 16 L1對(duì)照(泳道5)。將15微克的總酵母蛋白提取物加樣入10％SDS PAGE凝膠的各個(gè)泳道。使用針對(duì)TrpE-HPV45 L1融合蛋白的山羊多克隆抗-血清特異鑒定HPV 45 L1蛋白質(zhì)。左側(cè)箭頭標(biāo)明55kDa的位置。
圖5顯示來自ng VLP/μg總蛋白的2個(gè)ELISA實(shí)驗(yàn)的部分?jǐn)?shù)據(jù)(參見實(shí)施例7)。顯示了45 L1 wt和45 L1 R的2個(gè)單獨(dú)克隆之間的比較。改造的HPV 45 L1 VLP表達(dá)是45 L1 wt的大約2倍高。
圖6顯示由在此所描述的、如通過透射電子顯微術(shù)顯現(xiàn)的HPV 45L1 R蛋白質(zhì)分子組成的HPV 45 VLPs的代表樣本(參見實(shí)施例8)。橫條代表大約100nm。
發(fā)明詳述大部分宮頸癌與感染人乳頭狀瘤病毒(HPV)的特定致癌類型相關(guān)。本發(fā)明涉及對(duì)由致癌的HPV類型的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物引發(fā)或增強(qiáng)免疫性的組合物和方法。具體地，本發(fā)明提供編碼自我組裝成為HPV45病毒-樣顆粒(VLPs)的HPV45 L1蛋白質(zhì)的多核苷酸，并且公開了所述的多核苷酸和VLPs在用于預(yù)防和/或治療HPV-相關(guān)癌的藥物組合物中的用途。
已經(jīng)報(bào)道了野生型HPV45 L1核苷酸序列(Genbank登記號(hào)#NC_001590；也參見Delius和Hofmann，Curr.Top.Microbiol.Immunol.18613-31(1994))。本發(fā)明提供編碼HPV45 L1蛋白質(zhì)的合成DNA分子。本發(fā)明的合成分子包括密碼子序列，其中已經(jīng)改變至少部分密碼子以使用酵母細(xì)胞偏好的用于高水平表達(dá)的密碼子。合成的分子可用作可自我組裝成為VLPs的HPV45 L1蛋白質(zhì)的編碼序列。所述的VLPs可用于基于VLP的疫苗以通過中和抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫提供針對(duì)乳頭狀瘤病毒感染的有效免疫預(yù)防。
酵母細(xì)胞中HPV VLPs的表達(dá)提供了成本經(jīng)濟(jì)的和易適合于發(fā)酵罐中大規(guī)模生長的優(yōu)點(diǎn)。然而，在酵母細(xì)胞中表達(dá)的許多HPV L1蛋白質(zhì)，包括HPV45 L1，的水平比商業(yè)規(guī)模所需要的低。
因此，本發(fā)明涉及被″優(yōu)化″用于在酵母細(xì)胞環(huán)境中高水平表達(dá)的HPV45 L1基因序列。
4種可能的核苷酸堿基的″三聯(lián)體″密碼子可以超過60種變體的形式存在。因?yàn)檫@些密碼子僅提供20種不同氨基酸的信息(以及轉(zhuǎn)錄起始和終止)，一些氨基酸可由一個(gè)以上的密碼子編碼，這個(gè)現(xiàn)象被稱為密碼子冗余。出于尚未完全了解的原因，備選的密碼子不均勻地存在于不同類型細(xì)胞的內(nèi)源DNA中。實(shí)際上，在某些類型的細(xì)胞中似乎存在某些密碼子的可變天然等級(jí)或″偏愛″。如一個(gè)實(shí)例，由6個(gè)DNA密碼子，包括CTA、CTC、CTG、CTT、TTA、和TTG中的任何一個(gè)表示氨基酸亮氨酸。微生物的基因組密碼子使用頻率的完全分析已經(jīng)顯示大腸桿菌的內(nèi)源DNA最通常包含表示亮氨酸的CTG密碼子，而酵母和粘菌類的DNA最通常包括表示亮氨酸的TTA密碼子。鑒于這種等級(jí)，普遍認(rèn)為通過大腸桿菌宿主獲得高水平表達(dá)的富含亮氨酸的多肽的可能性在某種程度上依賴于密碼子使用的頻率。例如，很可能富含TTA密碼子的基因可能在大腸桿菌中表達(dá)很差，而富含CTG的基因可能在這個(gè)宿主中高表達(dá)。類似地，在酵母宿主細(xì)胞中表達(dá)富含亮氨酸的多肽的優(yōu)選密碼子是TTA。
重組DNA技術(shù)中密碼子偏好現(xiàn)象的意義是明顯的，并且該現(xiàn)象可用來解釋許多先前在成功轉(zhuǎn)化的宿主生物體中獲得高表達(dá)水平的外源基因方面的失敗——在插入的基因中可能重復(fù)存在″偏好″程度更低的密碼子而宿主細(xì)胞的表達(dá)體系不能有效地運(yùn)轉(zhuǎn)。這個(gè)現(xiàn)象表明已經(jīng)被設(shè)計(jì)成包括計(jì)劃的宿主細(xì)胞偏好密碼子的合成基因?yàn)閷?shí)現(xiàn)重組蛋白質(zhì)表達(dá)提供了最佳形式的外來遺傳物質(zhì)。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是為在酵母細(xì)胞中高水平表達(dá)而使密碼子優(yōu)化的HPV45 L1基因。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用編碼相同的蛋白質(zhì)序列的備選密碼子可移除對(duì)酵母細(xì)胞表達(dá)HPV45 L1蛋白質(zhì)的限制。
根據(jù)本發(fā)明，將HPV45 L1基因節(jié)段轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂邢嗤g序列但具有備選(alternative)密碼子使用的序列，如Sharp和Cowe所描述的(Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae.Yeast 7657-678(1991))，其在此引入作為參考。方法學(xué)一般包括鑒定通常不與高表達(dá)酵母基因相關(guān)的野生型序列中的密碼子，并且用在酵母細(xì)胞中高表達(dá)的最優(yōu)密碼子替換它們。然后檢驗(yàn)新的基因序列中由這些密碼子替換所產(chǎn)生的不想要的序列(例如，″ATTTA″序列，內(nèi)含子拼接識(shí)別位點(diǎn)的偶然產(chǎn)生，不需要的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、高GC含量、由酵母識(shí)別的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的存在，等等)。通過用編碼相同氨基酸的不同密碼子取代現(xiàn)有的密碼子來淘汰不合需要的序列。然后檢驗(yàn)合成基因片段的改進(jìn)表達(dá)。
使用如上所述的方法產(chǎn)生HPV45 L1的合成基因節(jié)段，結(jié)果形成包括用于在酵母細(xì)胞環(huán)境中高水平表達(dá)的優(yōu)化密碼子的基因。雖然上述操作提供了我們用于設(shè)計(jì)密碼子優(yōu)化基因供HPV疫苗之用的方法學(xué)總結(jié)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解可通過方法中的較少變化或通過序列中的較少變化獲得相似的疫苗效果或增加表達(dá)的基因。
因此，本發(fā)明涉及包括編碼HPV45 L1蛋白質(zhì)、或HPV45 L1蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性片段或突變形式的核苷酸序列的合成多核苷酸，該多核苷酸序列包括用于在酵母宿主細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子。所述突變形式的HPV45 L1蛋白質(zhì)包括但不限于保守的氨基酸取代、氨基末端截短、羧基末端截短、缺失、或添加。任何這種生物學(xué)活性片段和/或突變體將編碼基本上模擬如SEQ ID NO2所示的HPV45 L1蛋白質(zhì)的免疫特性的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。本發(fā)明的合成多核苷酸編碼表達(dá)功能性的HPV45 L1蛋白質(zhì)的mRNA分子，以便用于治療性或預(yù)防性HPV疫苗的開發(fā)。
本發(fā)明的一個(gè)方面是編碼如SEQ ID NO2所示的HPV45 L1蛋白質(zhì)的密碼子-優(yōu)化核酸分子，所述的核酸分子包括如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
本發(fā)明也涉及原核和真核的重組載體和重組宿主細(xì)胞，其包含本說明書公開的核酸分子。
通過在此所描述的方法構(gòu)建的合成的HPV45 DNA或其片段可通過分子克隆到包含合適啟動(dòng)子和其他合適轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的表達(dá)載體中，并且將其轉(zhuǎn)移到原核或真核的宿主細(xì)胞中以生產(chǎn)重組HPV45 L1而重組表達(dá)。用于這種操作的技術(shù)由Sambrook等人充分描述(Molecular CloningA Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，紐約，(1989)；Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等人，Green Pub.Associates and Wiley-Interscience，紐約(1988)；Yeast GeneticsA Laboratory Course Manual，Rose等人，Cold Spring Harbor laboratory Cold Spring Harbor，NewYork，(1990))，其在此全部引入作為參考。
因此，本發(fā)明涉及在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)HPV 45 L1蛋白質(zhì)的方法，包括(a)將包括編碼HPV45 L1蛋白質(zhì)的核酸的載體導(dǎo)入酵母宿主細(xì)胞；和(b)在容許表達(dá)所述HPV45 L1蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述酵母宿主細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)HPV 45 L1蛋白質(zhì)的方法，包括(a)將包括編碼HPV45 L1蛋白質(zhì)的核酸的載體導(dǎo)入酵母宿主細(xì)胞，其中使核酸分子密碼子優(yōu)化用于在酵母宿主細(xì)胞中最佳表達(dá)；和(b)在容許表達(dá)所述HPV45 L1蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述酵母宿主細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)HPV 45 L1蛋白質(zhì)的方法，包括(a)將包括如SEQ ID NO1所示的核酸的載體導(dǎo)入酵母宿主細(xì)胞；和(b)在容許表達(dá)所述HPV45 L1蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述酵母宿主細(xì)胞。
可將本發(fā)明的合成基因組裝成為包括被設(shè)計(jì)以提供在宿主細(xì)胞中有效表達(dá)HPV45 L1蛋白質(zhì)的序列的表達(dá)盒。該盒優(yōu)選含有合成基因，具有與其可操作連接的相關(guān)轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列，例如啟動(dòng)子和終止序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是啤酒酵母GAL1啟動(dòng)子，盡管本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到其它已知的許多酵母啟動(dòng)子中的任何一種，例如GAL10、GAL7、ADH1、TDH3或PGK啟動(dòng)子，或其它真核的基因啟動(dòng)子都是可使用的。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄終止子是啤酒酵母ADH1終止子，盡管也可使用其它已知的轉(zhuǎn)錄終止子。GAL1啟動(dòng)子-ADH1終止子的組合是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是由在酵母細(xì)胞中重組表達(dá)HPV45 L1或L1+L2基因生產(chǎn)的HPV45病毒-樣顆粒(VLP)、生產(chǎn)HPV45 VLPs的方法、以及使用HPV45 VLPs的方法。當(dāng)L1，人和動(dòng)物乳頭狀瘤病毒的主要衣殼蛋白質(zhì)在酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌中表達(dá)時(shí)，VLPs可自我組裝(參見綜述，Schiller和Roden，in PapillomavirusReviews；Current Research on Papillomaviruses；Lacey，ed.Leeds，UKLeeds Medical Information，pp 101-12(1996))。也可通過表達(dá)L1和L2衣殼蛋白質(zhì)的組合生產(chǎn)形態(tài)上沒有差別的(indistinct)HPV VLPs。VLPs由T＝7的二十面體結(jié)構(gòu)中的72個(gè)L1的五聚物組成(Baker等人，Biophys.J.60(6)1445-56(1991))。
VLPs與真正的病毒體在形態(tài)上相似，并且當(dāng)施用于動(dòng)物時(shí)能夠誘導(dǎo)高滴定度的中和抗體。用VLPs免疫的兔子(Breitburd等，J.Virol.69(6)3959-63(1995))和狗(Suzich等人，Proc.Natl.Acad. Sci. USA 92(25)11553-57(1995))顯示誘導(dǎo)中和抗體并防止實(shí)驗(yàn)性的乳頭狀瘤病毒感染。然而，因?yàn)閂LPs不包含潛在致癌的病毒基因組，并且當(dāng)從單個(gè)基因表達(dá)時(shí)可自我組裝，它們?cè)贖PV疫苗開發(fā)中提供采用活病毒的安全備選(參見綜述，Schiller和Hidesheim，J.Clin.Virol.1967-74(2000))。
Marais和同事(J.Med.Virol.60331-336(2000))公開了在昆蟲細(xì)胞中從桿狀病毒表達(dá)的HPV45 L1基因生產(chǎn)的HPV 45 VLPs。由于附帶費(fèi)用高，昆蟲細(xì)胞中VLPs的表達(dá)對(duì)于疫苗開發(fā)并不有利。另外，經(jīng)常難以將HPV L1基因在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物中的表達(dá)擴(kuò)大至商品開發(fā)所需的大體積。還沒有描述在酵母細(xì)胞中生產(chǎn)的HPV 45 VLPs。酵母細(xì)胞中HPV VLPs的表達(dá)提供了成本經(jīng)濟(jì)的和易適合于發(fā)酵罐中大規(guī)模生長的優(yōu)勢(shì)。此外，可容易地改變酵母基因組以保證選擇具有生長增加和表達(dá)潛力的重組轉(zhuǎn)化的酵母。
因此，本發(fā)明涉及包含HPV45的重組L1蛋白質(zhì)或重組L1+L2蛋白質(zhì)的病毒樣顆粒，其中在酵母細(xì)胞中表達(dá)該重組蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過在酵母中表達(dá)HPV 45 L1或HPV45 L1+L2生產(chǎn)HPV45 VLPs，酵母選自啤酒酵母、多形漢遜氏酵母，巴斯德畢赤氏酵母、脆壁克魯維氏酵母、乳酸克魯維氏酵母、和粟酒裂殖酵母。
本發(fā)明的另一方面是包括通過表達(dá)密碼子-優(yōu)化的HPV45 L1基因生產(chǎn)的HPV45 L1蛋白質(zhì)的HPV45 VLP。在本發(fā)明這方面優(yōu)選的實(shí)施方案中，密碼子優(yōu)化的HPV45 L1基因包括SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一方面是生產(chǎn)HPV45 VLPs的方法，包括(a)用編碼HPV45 L1蛋白質(zhì)或HPV45 L1+L2蛋白質(zhì)的重組DNA分子轉(zhuǎn)化酵母；(b)在容許表達(dá)該重組DNA分子的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的酵母以生產(chǎn)重組的HPV45蛋白質(zhì)；和(c)分離重組的HPV45蛋白質(zhì)以生產(chǎn)HPV45 VLPs。
在本發(fā)明這方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，用密碼子優(yōu)化的HPV45 L1基因轉(zhuǎn)化酵母以生產(chǎn)HPV45 VLPs。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，密碼子優(yōu)化的HPV45 L1基因包括SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
本發(fā)明也提供用于在動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括將HPV45病毒樣顆粒施用于該動(dòng)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，由密碼子優(yōu)化的基因生產(chǎn)HPV45 VLPs。
本發(fā)明的另一方面是預(yù)防或治療HPV-相關(guān)的宮頸癌的方法，包括將包括HPV45 VLPs的疫苗施用于哺乳動(dòng)物。在本發(fā)明這方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，在酵母中生產(chǎn)HPV45 VLPs。
本發(fā)明也涉及包括HPV45病毒-樣顆粒(VLPs)的疫苗。
在本發(fā)明這方面?zhèn)溥x的實(shí)施方案中，該疫苗進(jìn)一步包括至少一個(gè)另外的HPV類型的VLPs。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)另外的HPV類型選自HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59、和HPV68。
在本發(fā)明這方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，該疫苗進(jìn)一步包括HPV16VLPs。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該疫苗進(jìn)一步包括HPV16 VLPs和HPV 18 VLPs。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該疫苗進(jìn)一步包括HPV6VLPs、HPV11 VLPs、HPV16 VLPs和HPV18 VLPs。
本發(fā)明也涉及包括HPV 45病毒樣顆粒的藥物組合物。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及包括HPV45 VLPs和至少一個(gè)另外的HPV類型的VLPs的藥物組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)另外的HPV類型選自HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59、和HPV68。
本發(fā)明的疫苗組合物可以由常規(guī)測(cè)試限定的合適劑量單獨(dú)使用以便獲得HPV45感染的最優(yōu)抑制同時(shí)使任何潛在毒性最小化。此外，其它試劑的共同給藥或順序給藥可能是合乎需要的。
被導(dǎo)入疫苗受體的病毒樣顆粒的數(shù)量取決于所表達(dá)的基因產(chǎn)物的免疫原性。通常，將免疫或預(yù)防有效劑量的大約10μg至100μg，優(yōu)選大約20μg至60μg的VLPs直接施用到肌肉組織中。也預(yù)期皮下注射、皮內(nèi)導(dǎo)入、通過皮膚壓入、和其他模式的給藥，例如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、或吸入遞送。也預(yù)期可提供增效疫苗接種。與本發(fā)明疫苗的胃腸外給藥同時(shí)或之后，進(jìn)行腸胃外給藥，例如伴隨有佐劑，例如明礬或Merck鋁佐劑的靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或其它方式的給藥也是有利的。
為了描述和公開可與本發(fā)明聯(lián)系使用的方法和物質(zhì)，引入在此記載的所有出版物作為參考。在此沒有文獻(xiàn)被解釋為承認(rèn)本發(fā)明不能借助于在先發(fā)明而早于該公開的內(nèi)容。
參考伴有的附圖已經(jīng)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，可理解本發(fā)明不限于那些精確的實(shí)施方案，而且本領(lǐng)域的技術(shù)人員可實(shí)行各種改變和修飾而不背離如所附的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍或精神。
下列實(shí)施例說明但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1代表性的HPV 45 L1序列的確定先前已經(jīng)描述了HPV 45 L1序列(Genbank登記號(hào)#NC_001590；參見Delius和Hofmann Curr.Top.Microbiol.Immunol.18613-31(1994))。然而發(fā)現(xiàn)獲得自臨床分離物的DNAs之間有微小序列變化是很平常的。為了確定代表性的HPV45 L1野生型序列，從4個(gè)先前顯示包含HPV 45 DNA的臨床樣品分離DNA。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中利用Taq DNA聚合酶和下列引物擴(kuò)增HPV 45 L1序列HPV 45 L1 F5’-CCACCACCACCTATATAGGTATTC-3’(SEQ ID NO4)和HPV 45 L1 B5’-CAAACATACATATATGTGCTAACA-3’(SEQ ID NO5)。使擴(kuò)增的產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳并通過溴化乙啶染色顯現(xiàn)。切下～1500bp的L1條帶并利用QIA quick PCR純化試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)純化DNA。然后將DNA連接至TA克隆載體(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)，用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. Coli)并且接種在具有氨芐青霉素加IPTG和用于藍(lán)/白色菌落篩選的X-gal的LB瓊脂上。反轉(zhuǎn)平板并且在37℃培養(yǎng)16小時(shí)。
在來源于已經(jīng)PCR擴(kuò)增的4個(gè)臨床分離物中的每一個(gè)的8個(gè)白色集落上進(jìn)行集落PCR。利用引物HPV 45 L1 F和HPV 45 L1 B PCR-擴(kuò)增HPV 45 L1 DNA。具體的PCR方法包括25個(gè)循環(huán)的98℃15秒(變性)，50℃30秒(退火)和68℃2分鐘(延伸)。瓊脂糖凝膠電泳后通過溴化乙啶染色顯現(xiàn)PCR產(chǎn)物。來自每個(gè)分離物的幾個(gè)集落包含L1條帶。在具有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃搖動(dòng)16小時(shí)培養(yǎng)來自各個(gè)分離物的第二集落。進(jìn)行小提以從集落提取質(zhì)粒DNA。
對(duì)包含來自4個(gè)臨床分離物的擴(kuò)增的和克隆的HPV 45 L1 DNA的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序。相互比較DNA和翻譯的氨基酸序列以及GenbankHPV 45 L1序列。4個(gè)臨床分離物的序列分析顯示沒有序列與Genbank序列相同。選擇來自33#分離物的HPV 45 L1質(zhì)粒代表45 L1野生型(wt)序列并且在此稱為″45 L1野生型序列″(SEQ ID NO3，參見圖1)。這個(gè)序列包含9個(gè)核苷酸、3個(gè)氨基酸缺失，其保持隨后序列的閱讀框，5個(gè)點(diǎn)突變，其導(dǎo)致5個(gè)氨基酸變化，和8個(gè)另外的沉默點(diǎn)突變。在45L1wt中缺失了Genbank序列中的第495-497位氨基酸。Genbank氨基酸編號(hào)23(S->N)、55(N->S)、303(I->T)、357(S->N)、和356(Q->H)代表5個(gè)氨基酸變化(Genbank aa->45 L1 wt aa)。8個(gè)沉默突變分布于整個(gè)序列。參見圖1。
利用引物L(fēng)S-1125’-CTCAGATCTCACAAAACAAAATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTGAC-3’(SEQ ID NO6)和HPV 45 L1 EAS5’-GACAGATCTTATTTTTTACTACGTATACGTACACG-3’(SEQ ID NO7)擴(kuò)增45L1野生型序列以加入BglII延伸。利用Vent聚合酶進(jìn)行PCR。通過瓊脂糖凝膠的溴化乙啶染色顯現(xiàn)PCR產(chǎn)物。切下～1500bp條帶并利用QIAEXII凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化DNA。然后用BglII在37℃消化PCR產(chǎn)物2小時(shí)并利用QIA quick PCR純化試劑盒純化。將BglII-消化的HPV 45 L1 PCR產(chǎn)物與BamHI-消化的pGAL110連接(在Hofmann等人，Virology 209506-18(1995)中描述)并且用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5。
通過PCR篩選以正確方向插入HPV 45 L1的集落。通過DNA測(cè)序證實(shí)序列和方向。將所選擇的克隆命名為pGAL110-HPV 45 L1 #6。用PstI、EcoRI和HindIII消化這個(gè)克隆以確定pGAL110載體內(nèi)HPV 45L1基因的限制性內(nèi)切酶酶切片段圖譜。DNA片段在瓊脂糖凝膠上電泳。通過溴化乙啶染色顯現(xiàn)所得到的限制性內(nèi)切酶酶切片段圖譜并用UV光觀察。
制備大提的DNA。通過用蝸牛酶形成原生質(zhì)球狀體制備啤酒酵母細(xì)胞感受態(tài)并且用pGAL110-HPV 45L1#6轉(zhuǎn)化。將酵母轉(zhuǎn)化混合物接種到在Leu(-)山梨糖醇平板上的Leu(-)山梨糖醇頂層-瓊脂中并且在30℃反轉(zhuǎn)培養(yǎng)5-7天。挑取集落并且在Leu(-)山梨糖醇平板上劃線用于克隆分離。隨后使分離的集落生長在具有1.6％葡萄糖和4％半乳糖的5ml 5×Leu(-)Ade(-)山梨糖醇中，于30℃在旋轉(zhuǎn)試管中培養(yǎng)以誘導(dǎo)L1轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)。
實(shí)施例2酵母密碼子優(yōu)化已經(jīng)描述了酵母-偏好的密碼子(Sharp，Paul M和Cowe，Elizabeth1991 Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae YEAST 7657-678)。HPV 45 L1 wt蛋白質(zhì)的表達(dá)是可以檢測(cè)到的；然而，為了獲得為商品開發(fā)所需的表達(dá)增加，利用酵母-偏好的密碼子改造HPV 45L1基因。所述的改造序列將提供增加的HPV45 L1表達(dá)，其比野生型在疫苗開發(fā)的使用中具有顯著的進(jìn)步。當(dāng)利用酵母-優(yōu)化的密碼子序列改造序列時(shí)，在392位改變45 L1 wt的核苷酸序列以產(chǎn)生45 L1 R(R＝改造)。然而不改變氨基酸序列。HPV 45 L1 R的核苷酸(SEQ ID NO1)和氨基酸(SEQ ID NO2)序列顯示在圖2中。
所采用的基因改造的策略是，設(shè)計(jì)跨越該基因的長的重疊的正義和反義低聚物，用酵母-偏好的密碼子序列取代核苷酸同時(shí)保持初始氨基酸序列。這些低聚物用于取代PCR反應(yīng)中的模板DNA。設(shè)計(jì)另外的擴(kuò)增引物并用于從模板低聚物擴(kuò)增改造序列。將Pfu DNA聚合酶用于25個(gè)循環(huán)的PCR。
用于擴(kuò)增的最適條件是部分特異的(section-specific)，然而大多數(shù)使用與下面的相似的程序94℃5分鐘(變性)，然后是25個(gè)循環(huán)的95℃30秒(變性)，55-50℃30秒(退火)，以及72℃1.5分鐘(延伸)，然后是72℃7分鐘的最終延伸并且保持在4℃。通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物。切下合適大小的條帶并凝膠純化DNA。然后將擴(kuò)增片段用作模板以組裝1533nt的改造的HPV 45 L1基因。
改造后，凝膠純化1533nt的條帶，連接至pCR4 Blunt(Invitrogen)并且用該連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10細(xì)胞。集落生長在具有氨芐青霉素的4ml LB中并且通過標(biāo)準(zhǔn)的小提技術(shù)提取質(zhì)粒DNA。測(cè)序質(zhì)粒DNA以證實(shí)存在45LI改造的所需要的變化。從pCR4Blunt-45 L1 R再擴(kuò)增45 L1 R(改造)以向兩頭加入BamHI延伸加ATG起始密碼子上游的酵母5′-非翻譯前導(dǎo)序列。如同上述克隆擴(kuò)增片段并且測(cè)序質(zhì)粒DNA。用BamHI消化質(zhì)粒，pCR4Blunt-45 L1 R(Bam)，并在瓊脂糖凝膠上電泳DNA片段。凝膠純化-1550bp的45 L1 R(Bam)片段，連接至BamHI-消化的pGAL110并轉(zhuǎn)化入TOP10F′大腸桿菌(Invitrogen)。
通過PCR篩選以正確方向插入pGAL110的HPV 45 L1的集落。通過DNA測(cè)序證實(shí)序列和方向。制備大提質(zhì)粒DNA并用于轉(zhuǎn)化已經(jīng)通過原生質(zhì)球狀體形成感受態(tài)的啤酒酵母細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的酵母接種到在Leu(-)山梨糖醇平板上的Leu(-)山梨糖醇頂層-瓊脂中，其反轉(zhuǎn)培養(yǎng)7天。將集落在Leu(-)山梨糖醇平板上劃線用于克隆分離。隨后使分離集落生長在具有1.6％葡萄糖和4％半乳糖的5ml 5×Leu(-)Ade(-)山梨糖醇中，于30℃在旋轉(zhuǎn)試管中培養(yǎng)以誘導(dǎo)L1轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)。48小時(shí)后，使相當(dāng)于OD600＝10的培養(yǎng)體積沉淀，移出上清液，冷凍沉淀顆粒并保存在-70℃。
實(shí)施例3RNA制備在冰上融化通過半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)HPV 45 L1的轉(zhuǎn)化酵母的細(xì)胞沉淀顆粒，懸浮在0.8ml的Trizol試劑(Life Technologies，Gibco BRL)中并在室溫下培養(yǎng)5分鐘。向小瓶加入五分之一體積的氯仿。然后用力搖動(dòng)15秒以混合并在室溫下孵育3分鐘。以13krpms離心5分鐘后，收集上層相并轉(zhuǎn)入新的小瓶。加入0.4ml異丙醇并在室溫下孵育10分鐘。以13krpms離心10分鐘沉淀RNA。輕輕倒出上清液，用75％EtOH洗滌RNA沉淀顆粒并重復(fù)離心。倒出上清液，容許RNA沉淀顆?？諝飧稍?5分鐘，然后懸浮在無RNase的水中。進(jìn)行分光光度法以確定樣品中RNA的濃度，其中當(dāng)A260/280是1.7-2.0時(shí)，假定A260讀數(shù)的1＝40μg/ml RNA。
實(shí)施例4Northern印跡分析澆制1.1％的瓊脂糖甲醛凝膠。使5和10微克的RNA與變性緩沖液(終濃度6％甲醛，50％甲酰胺和0.1×MOPS)結(jié)合，并且加熱至65℃10分鐘。加入十分之一體積的凝膠加樣緩沖液并且將樣品加載到凝膠上。以75伏在1×MOPS緩沖液中電泳～3小時(shí)。在10×SSC中洗滌凝膠60分鐘。
通過在10×SSC中毛細(xì)管作用超過16小時(shí)將RNA轉(zhuǎn)移至Hybond-N+尼龍膜(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。然后利用Stratagene UV Stratalinker(Stratagene，La Jolla，CA)自交聯(lián)功能通過交聯(lián)將RNA固定到尼龍膜上。固定后，容許尼龍膜空氣干燥。
使用Roche DIG High Prime DNA標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒I(F.Hoffmann-La RocheLtd.，Basel，瑞士)標(biāo)記45 L1 R DNA序列，其中將DIG用作探針來檢測(cè)Northern印跡上的45 L1 R RNA。利用抗-DIG堿性磷酸酶的共軛抗體按制造商的建議進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和免疫顯影。簡而言之，伴隨有溫和的搖動(dòng)在37℃預(yù)雜交印跡30分鐘。通過加熱至95℃5分鐘并在冰上淬火使探針變性。將探針加入雜交溶液并在44.6℃伴隨有溫和的搖動(dòng)施加到膜上4小時(shí)。然后移出雜交溶液并在具有0.1％SDS的2×SSC中在室溫下洗滌印跡兩次5分鐘，然后再用0.5×SSC和0.1％SDS 65℃另外洗滌。然后封閉印跡30分鐘，應(yīng)用1∶5000稀釋度的抗-DIG堿性磷酸酶的共軛抗體30分鐘。洗滌印跡并且通過堿性磷酸酶共軛的抗-DIG結(jié)合抗體的NBT/BCIP底物檢測(cè)來確定結(jié)合探針的RNA的存在。
表達(dá)45 L1 wt的酵母的初始分析表明存在功能性的HPV 45 L1轉(zhuǎn)錄和翻譯；然而，用酵母-偏好的密碼子序列改造序列獲得增加的表達(dá)水平，以用于疫苗開發(fā)。設(shè)計(jì)改造的45 L1序列使任何可能的轉(zhuǎn)錄提前終止位點(diǎn)缺失以保證強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄。45 L1 R轉(zhuǎn)錄物的Northern印跡分析顯示產(chǎn)生了全長的轉(zhuǎn)錄物(圖3)。
實(shí)施例5HPV 45 L1蛋白質(zhì)表達(dá)使半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)的相當(dāng)于OD600＝10的冷凍酵母細(xì)胞沉淀顆粒在冰上融化，懸浮在具有2mM PMSF的300μl的PC緩沖液(100mMNa2HPO4和0.5M NaCl，pH7.0)中。加入酸洗的0.5mm玻璃珠，～0.5g/試管。渦旋試管3個(gè)循環(huán)的4℃5分鐘，間斷1分鐘。加入7.5μl的20％ TritonX100并在4℃重復(fù)渦旋5分鐘。將試管置于冰上15分鐘，然后在4℃離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)入無菌的微離心試管，標(biāo)記為總的酵母蛋白質(zhì)提取物，記錄時(shí)間并保存在-70℃。
實(shí)施例6Western印跡分析通過Western印跡分析來自各個(gè)45 L1構(gòu)建體的20個(gè)分離酵母集落的總酵母蛋白質(zhì)提取物以證實(shí)半乳糖誘導(dǎo)后45 L1蛋白質(zhì)的表達(dá)。
使10微克的總酵母蛋白質(zhì)提取物與SDS-PAGE加樣緩沖液結(jié)合并且加熱至95℃10分鐘。將蛋白質(zhì)加載到10％ SDS PAGE凝膠上并且在Tris-甘氨酸緩沖液中電泳。蛋白質(zhì)分離后，將蛋白質(zhì)從凝膠Western轉(zhuǎn)移到硝化纖維素，并且于室溫下在1×稀釋緩沖液(Kirkegaard和Perry Laboratories)中搖動(dòng)封閉印跡1小時(shí)。洗滌印跡3次，然后用1∶2500稀釋度的山羊抗-trpE-HPV 45 L1血清在室溫下孵育16小時(shí)。然后洗滌印跡3次并且用1∶2500稀釋度的抗-山羊-HRP共軛抗體孵育1hr。再次洗滌印跡3次并且施加NBT/BCIP檢測(cè)底物(Kirkegaard andPerry Laboratories)。檢測(cè)免疫活性的蛋白質(zhì)為印跡上的紫色條帶。
結(jié)果表明在所有情況中，45 L1蛋白質(zhì)檢測(cè)為硝化纖維素上相應(yīng)于大約57kDa的清晰的免疫活性條帶(圖4)。包括大約55kDa的16 L1蛋白質(zhì)作為陽性對(duì)照，連同無HPV L1的總酵母蛋白質(zhì)提取物作為陰性對(duì)照(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例7ELISA測(cè)定通過多種方法使表達(dá)HPV 45 L1的酵母細(xì)胞生長，包括旋轉(zhuǎn)試管培養(yǎng)、搖瓶和發(fā)酵罐。裂解酵母，制備蛋白質(zhì)提取物以確定每微克總蛋白生產(chǎn)的HPV 45 L1病毒-樣顆粒(VLPs)的數(shù)量。設(shè)計(jì)夾層ELISA以證明HPV 45 L1 VLP的表達(dá)。
使用識(shí)別HPV類型18和45 L1 VLPs的H18R.5單克隆抗體(mAb)來結(jié)合酵母蛋白質(zhì)提取物中發(fā)現(xiàn)的45 L1 VLPs。洗滌除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，使用H45.10B 11.A5，一種HPV 45 L1 VLP類型和構(gòu)象特異的mAb作為檢測(cè)抗體。真正的、構(gòu)象正確的45 L1 VLPs被結(jié)合，通過利用抗-小鼠IgG1 HRP-共軛抗體和TMB底物幫助檢測(cè)。
具體地，使用H18R.5涂覆Immulon 4 HBX 96孔平板的底部，在4℃過夜。用PBS和0.05％Tween 20洗滌平板3次，然后用封閉溶液(PBS+0.05％Tween 20+1％BSA)封閉。洗滌平板3次，將抗原(在封閉溶液中稀釋至100μg/ml的總酵母細(xì)胞裂解物)，一式二份施加到第A行。將純化的HPV 45 L1 VLPs的參照標(biāo)準(zhǔn)以100μg/ml總酵母蛋白質(zhì)中3300ng/ml施加到第1和2列的第A行。然后沿各列依次稀釋對(duì)照和試驗(yàn)樣品兩倍。室溫下3小時(shí)后，通過抽吸除去多余的抗原，洗滌平板3次。將包含HPV 45 L1 VLP構(gòu)象特異的mAb H45.10B 11.A5的細(xì)胞上清液在封閉溶液中稀釋1∶80，并在室溫下施加到各個(gè)孔1小時(shí)。洗滌平板3次，將在封閉溶液中稀釋1∶8000的抗-小鼠IgG1 HRP共軛抗體在室溫下施用1小時(shí)。洗滌平板，施加TMB(Pierce)5分鐘以檢測(cè)HRP共軛抗體復(fù)合物。加入2M H2SO4終止檢測(cè)反應(yīng)。在450nm波長讀取平板，與參照標(biāo)準(zhǔn)相比以ng VLP/μg總蛋白確定HPV 45L1 VLP的濃度。
圖5顯示了45 L1 wt和45 L1 R的2個(gè)單獨(dú)克隆之間的比較，所有的測(cè)定一式二份。改造的HPV 45 L1 VLP的表達(dá)是45 L1 wt觀察到的結(jié)果的大約2倍(圖6)。
實(shí)施例8透射電子顯微術(shù)為了表明45 L1蛋白質(zhì)實(shí)際上自我組裝形成隨后又自我組裝成為病毒-樣顆粒的五聚-L1衣殼體，通過透射式電子顯微鏡分析部分純化的45 L1 R蛋白質(zhì)提取物。
在小規(guī)模發(fā)酵條件下生長酵母細(xì)胞，沉淀，使沉淀顆粒經(jīng)受純化處理。通過免疫印跡分析沉淀和澄清的酵母提取物以通過純化方法證明L1蛋白質(zhì)表達(dá)和存留。然后使澄清的酵母提取物經(jīng)受45％-蔗糖緩沖層(cushion)離心，通過透射電子顯微術(shù)(EM)分析懸浮在緩沖液中的所得到沉淀顆粒。
生產(chǎn)的45 L1 R VLPs的代表樣品顯示在圖6中。這些粗制樣品中球狀顆粒的直徑在40和60nm范圍之間，其中一些顆粒顯示規(guī)則排列的衣殼體。
序列表<110>Merck & Co.，Inc.
Bryan，Janine T.
Brownlow，Michelle K.
Schultz，Loren D.
Jansen，Kathrin U.
<120>HPV 45 L1在酵母中的優(yōu)化表達(dá)<130>21500-PCT<150>60/506,812<151>2003-09-29<160>8<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1533<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV45L1R<400>1atggctttgt ggagaccatc tgactctact gtctacttgc caccaccatc tgtcgctaga 60gtcgtcaaca ctgacgacta cgtctccaga acctccatct tctaccacgc tggttcttcc 120agattgttga ctgtcggtaa cccatacttc agagtcgtcc catccggtgc tggtaacaag 180caagctgttc caaaggtctc tgcttaccaa tacagagtct tcagagtcgc tttgccagac 240ccaaacaagt tcggtttgcc agactctact atctacaacc cagaaactca aagattggtc 300tgggcatgcg tcggtatgga aatcggtaga ggtcaaccat tgggtatcgg tttgtctggt 360cacccattct acaacaagtt ggacgacacc gaatccgctc acgctgctac tgctgtcatc 420actcaagacg tcagagacaa cgtctctgtc gactacaagc aaacccaatt gtgtatcttg 480ggttgtgtcc cagctatcgg tgaacactgg gctaagggta ccttgtgtaa gccagctcaa 540ttgcaaccag gtgactgtcc accattggaa ttgaagaaca ctatcatcga agacggtgac 600atggttgaca ctggttacgg tgctatggac ttctccaccc tgcaggacac taagtgtgaa 660gttccattgg acatctgtca atctatctgt aagtacccag actacttgca aatgtccgct 720gacccatacg gtgactctat gttcttctgt ttgagaagag aacaattgtt cgctagacac 780ttctggaaca gagctggtgt catgggtgac actgttccaa ctgacttgta catcaagggt 840acctctgcta acatgagaga aactccaggt tcctgtgtct actctccatc tccatctggt 900
tctatcacta cttccgactc tcaattgttc aacaagccat actggttgca caaggctcaa 960ggtcacaaca acggtatctg ttggcacaac caattgttcg tcaccgtcgt tgacactacc 1020agatctacta acttgacctt gtgtgcttct actcaaaacc cagttccaaa cacttacgac 1080ccaaccaagt tcaagcacta ctccagacac gtcgaggaat acgacttgca attcatcttc 1140caattgtgta ctatcacctt gaccgctgaa gtcatgtcct acattcactc tatgaactcc 1200tctatcttgg aaaactggaa cttcggtgtt ccaccaccac caaccacctc cttggttgac 1260acttacagat tcgtccaatc tgtcgctgtc acttgtcaaa aggacaccac tccaccagaa 1320aagcaagacc catacgacaa gttgaagttc tggactgttg acttgaagga aaagttctct 1380tccgacttgg accaataccc attgggtaga aagttcttgg ttcaagctgg tttgagacgt 1440agaccaacta tcggtccacg taagagacca gctgcttcca cttccactgc ttctagacca 1500gctaagcgtg tcagaatcag atccaagaag taa 1533<210>2<211>510<212>PRT<213>人乳頭狀瘤病毒45型<400>2Met Ala Leu Trp Arg Pro Ser Asp Ser Thr Val Tyr Leu Pro Pro Pro1 5 10 15Ser Val Ala Arg Val Val Asn Thr Asp Asp Tyr Val Ser Arg Thr Ser20 25 30Ile Phe Tyr His Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly Asn Pro35 40 45Tyr Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Ala Gly Asn Lys Gln Ala Val Pro50 55 60Lys Val Ser Ala Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Ala Leu Pro Asp65 70 75 80Pro Asn Lys Phe Gly Leu Pro Asp Ser Thr Ile Tyr Asn Pro Glu Thr85 90 95Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Met Glu Ile Gly Arg Gly Gln100 105 110Pro Leu Gly Ile Gly Leu Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys Leu Asp115 120 125Asp Thr Glu Ser Ala His Ala Ala Thr Ala Val Ile Thr Gln Asp Val130 135 140Arg Asp Asn Val Ser Val Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu145 150 155 160Gly Cys Val Pro Ala Ile Gly Glu His Trp Ala Lys Gly Thr Leu Cys165 170 175Lys Pro Ala Gln Leu Gln Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys180 185 190Asn Thr Ile Ile Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala195 200 205
Met Asp Phe Ser Thr Leu Gln Asp Thr Lys Cys Glu Val Pro Leu Asp210 215 220Ile Cys Gln Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala225 230 235 240Asp Pro Tyr Gly Asp Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln Leu245 250 255Phe Ala Arg His Phe Trp Asn Arg Ala Gly Val Met Gly Asp Thr Val260 265 270Pro Thr Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Thr Ser Ala Asn Met Arg Glu Thr275 280 285Pro Gly Ser Cys Val Tyr Ser Pro Ser Pro Ser Gly Ser Ile Thr Thr290 295 300Ser Asp Ser Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu His Lys Ala Gln305 310 315 320Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp His Asn Gln Leu Phe Val Thr Val325 330 335Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Leu Thr Leu Cys Ala Ser Thr Gln340 345 350Asn Pro Val Pro Asn Thr Tyr Asp Pro Thr Lys Phe Lys His Tyr Ser355 360 365Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr370 375 380Ile Thr Leu Thr Ala Glu Val Met Ser Tyr Ile His Ser Met Asn Ser385 390 395 400Ser Ile Leu Glu Asn Trp Asn Phe Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Thr405 410 415Ser Leu Val Asp Thr Tyr Arg Phe Val Gln Ser Val Ala Val Thr Cys420 425 430Gln Lys Asp Thr Thr Pro Pro Glu Lys Gln Asp Pro Tyr Asp Lys Leu435 440 445Lys Phe Trp Thr Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ser Asp Leu Asp450 455 460Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Val Gln Ala Gly Leu Arg Arg465 470 475 480Arg Pro Thr lle Gly Pro Arg Lys Arg Pro Ala Ala Ser Thr Ser Thr485 490 495Ala Ser Arg Pro Ala Lys Arg Val Arg Ile Arg Ser Lys Lys500 505 510<210>3<211>1533<212>DNA<213>人乳頭狀瘤病毒45型
<400>3atggctttgt ggcggcctag tgacagtacg gtatatcttc caccaccttc tgtggccaga 60gttgtcaaca ctgatgatta tgtgtctcgc acaagcatat tttaccatgc aggcagttcc 120cgattattaa ctgtaggcaa tccatatttt agggttgtac ctagtggtgc aggtaataaa 180caggctgttc ctaaggtatc cgcatatcag tatagggtgt ttagagtagc tttgcccgat 240cctaataaat ttggattacc tgattctact atatataatc ctgaaacaca acgtttggtt 300tgggcatgtg taggtatgga aattggtcgt gggcagcctt taggtattgg cctaagtggc 360catccatttt ataataaatt ggatgataca gaaagtgctc atgcagctac agctgttatt 420acgcaggatg ttagggataa tgtgtcagtt gattataagc aaacacagct gtgtatttta 480ggttgtgtac ctgctattgg tgagcactgg gccaagggca cactttgtaa acctgcacaa 540ttgcaacctg gtgactgtcc tcctttggaa cttaaaaaca ccattattga ggatggtgat 600atggtggata caggttatgg ggcaatggat tttagtacat tgcaggatac aaagtgcgag 660gttccattag acatttgtca atccatctgt aaatatccag attatttgca aatgtctgct 720gatccctatg gggattctat gtttttttgc ctacgccgtg aacaactgtt tgcaagacat 780ttttggaata gggcaggtgt tatgggtgac acagtaccta cagacctata tattaaaggc 840actagcgcta atatgcgtga aacccctggc agttgtgtgt attccccttc tcccagtggc 900tctattacta cttctgattc tcaattattt aataagccat attggttaca taaggcccag 960ggccataaca atggtatttg ttggcataat cagttgtttg ttactgtagt ggacactacc 1020cgcagtacta atttaacatt atgtgcctct acacaaaatc ctgtgccaaa tacatatgat 1080cctactaagt ttaagcacta tagtagacat gtggaggaat atgatttaca gtttattttt 1140cagttgtgca ctattacttt aactgcagag gttatgtcat atatccatag tatgaatagt 1200agtatattgg aaaattggaa ttttggtgta cctccaccac ctactacaag tttagtggat 1260acatatcgtt ttgtgcaatc agttgctgtt acctgtcaaa aggatactac acctccagaa 1320aagcaggatc catatgataa attaaagttt tggactgttg acctaaagga aaaattttcc 1380tccgatttgg atcaatatcc ccttggtcga aagtttttag ttcaggctgg gttacgtcgt 1440aggcctacca taggacctcg taagcgtcct gctgcttcca cgtctactgc atctaggcct 1500gccaaacgtg tacgtatacg tagtaaaaaa taa 1533<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>4ccaccaccac ctatataggt attc 24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物<400>5caaacataca tatatgtgct aaca24<210>6<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>6ctcagatctc acaaaacaaa atggctttgt ggcggcctag tgac 44<210>7<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>7gacagatctt attttttact acgtatacgt acacg35<210>8<211>1533<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV45 L1R-反義<400>8taccgaaaca cctctggtag actgagatga cagatgaacg gtggtggtag acagcgatct 60cagcagttgt gactgctgat gcagaggtct tggaggtaga agatggtgcg accaagaagg 120tctaacaact gacagccatt gggtatgaag tctcagcagg gtaggccacg accattgttc 180gttcgacaag gtttccagag acgaatggtt atgtctcaga agtctcagcg aaacggtctg 240ggtttgttca agccaaacgg tctgagatga tagatgttgg gtctttgagt ttctaaccag 300acccgtacgc agccatacct ttagccatct ccagttggta acccatagcc aaacagacca 360
gtgggtaaga tgttgttcaa cctgctgtgg cttaggcgag tgcgacgatg acgacagtag 420tgagttctgc agtctctgtt gcagagacag ctgatgttcg tttgggttaa cacatagaac 480ccaacacagg gtcgatagcc acttgtgacc cgattcccat ggaacacatt cggtcgagtt 540aacgttggtc cactgacagg tggtaacctt aacttcttgt gatagtagct tctgccactg 600taccaactgt gaccaatgcc acgatacctg aagaggtggg acgtcctgtg attcacactt 660caaggtaacc tgtagacagt tagatagaca ttcatgggtc tgatgaacgt ttacaggcga 720ctgggtatgc cactgagata caagaagaca aactcttctc ttgttaacaa gcgatctgtg 780aagaccttgt ctcgaccaca gtacccactg tgacaaggtt gactgaacat gtagttccca 840tggagacgat tgtactctct ttgaggtcca aggacacaga tgagaggtag aggtagacca 900agatagtgat gaaggctgag agttaacaag ttgttcggta tgaccaacgt gttccgagtt 960ccagtgttgt tgccatagac aaccgtgttg gttaacaagc agtggcagca actgtgatgg 1020tctagatgat tgaactggaa cacacgaaga tgagttttgg gtcaaggttt gtgaatgctg 1080ggttggttca agttcgtgat gaggtctgtg cagctcctta tgctgaacgt taagtagaag 1140gttaacacat gatagtggaa ctggcgactt cagtacagga tgtaagtgag atacttgagg 1200agatagaacc ttttgacctt gaagccacaa ggtggtggtg gttggtggag gaaccaactg 1260tgaatgtcta agcaggttag acagcgacag tgaacagttt tcctgtggtg aggtggtctt 1320ttcgttctgg gtatgctgtt caacttcaag acctgacaac tgaacttcct tttcaagaga 1380aggctgaacc tggttatggg taacccatct ttcaagaacc aagttcgacc aaactctgca 1440tctggttgat agccaggtgc attctctggt cgacgaaggt gaaggtgacg aagatctggt 1500cgattcgcac agtcttagtc taggttcttc att 153權(quán)利要求
1.一種包括編碼如SEQ ID NO2所示的HPV45 L1蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸分子，其中該核酸序列被密碼子優(yōu)化以用于在酵母細(xì)胞中高水平表達(dá)。
2.包括權(quán)利要求1的核酸分子的載體。
3.包括權(quán)利要求3的載體的宿主細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3的宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞選自啤酒酵母、多形漢遜氏酵母、巴斯德畢赤氏酵母、脆壁克魯維氏酵母、乳酸克魯維氏酵母、和粟酒裂殖酵母。
5.權(quán)利要求4的宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞是啤酒酵母。
6.權(quán)利要求1的核酸分子，其中該核苷酸序列包括SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
7.包括權(quán)利要求6的核酸分子的載體。
8.包括權(quán)利要求7的載體的宿主細(xì)胞。
9.包含HPV45的重組L1蛋白質(zhì)或重組L1+L2蛋白質(zhì)的病毒-樣顆粒(VLPs)，其中在酵母中生產(chǎn)該重組L1蛋白質(zhì)或該重組L1+L2蛋白質(zhì)。
10.權(quán)利要求9的VLPs，其中由密碼子-優(yōu)化的HPV45 L1核酸分子編碼所述重組L1蛋白質(zhì)或重組L1+L2蛋白質(zhì)。
11.權(quán)利要求10的VLPs，其中所述密碼子-優(yōu)化的核酸分子基本上由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列組成。
12.一種生產(chǎn)權(quán)利要求10的VLPs的方法，包括(a)用編碼HPV45 L1蛋白質(zhì)或HPV45 L1+L2蛋白質(zhì)的密碼子-優(yōu)化的DNA分子轉(zhuǎn)化酵母；(b)在容許所述密碼子-優(yōu)化的DNA分子表達(dá)產(chǎn)生重組乳頭狀瘤病毒蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的酵母；以及(c)分離所述重組的乳頭狀瘤病毒蛋白質(zhì)以產(chǎn)生權(quán)利要求10的VLPs。
13.包括權(quán)利要求10的VLPs的疫苗。
14.包括權(quán)利要求10的VLPs的藥物組合物。
15.一種預(yù)防HPV感染的方法，包括將權(quán)利要求13的疫苗施用于哺乳動(dòng)物。
16.一種用于在動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括將權(quán)利要求10的VLPs施用于動(dòng)物。
17.權(quán)利要求10的病毒-樣顆粒，其中所述酵母選自啤酒酵母、多形漢遜氏酵母、巴斯德畢赤氏酵母、脆壁克魯維氏酵母、乳酸克魯維氏酵母、和粟酒裂殖酵母。
18.權(quán)利要求17的病毒-樣顆粒，其中所述酵母是啤酒酵母。
19.權(quán)利要求13的疫苗，進(jìn)一步包括至少一個(gè)另外的HPV類型的VLPs。
20.權(quán)利要求19的疫苗，其中所述至少一個(gè)另外的HPV類型選自HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59、和HPV68。
21.權(quán)利要求20的疫苗，其中所述至少一個(gè)HPV類型包括HPV16。
22.權(quán)利要求21的疫苗，進(jìn)一步包括HPV18 VLPs。
23.權(quán)利要求22的疫苗，進(jìn)一步包括HPV6 VLPs和HPV 11VLPs。
24.權(quán)利要求23的疫苗，進(jìn)一步包括HPV31 VLPs。
25.權(quán)利要求22的疫苗，進(jìn)一步包括HPV31 VLPs。
全文摘要
提供編碼HPV45 L1蛋白質(zhì)的合成DNA分子。具體地，本發(fā)明提供編碼HPV45 L1蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中已經(jīng)使所述多核苷酸的密碼子優(yōu)化來用于在酵母細(xì)胞中高水平表達(dá)。合成的分子可用來產(chǎn)生HPV45病毒－樣顆粒(VLPs)，以及生產(chǎn)包括HPV45 VLPs的疫苗和藥物組合物。本發(fā)明的疫苗通過中和抗體和細(xì)胞免疫提供針對(duì)乳頭狀瘤病毒感染的有效免疫預(yù)防。
文檔編號(hào)C12N15/37GK1859923SQ200480028106
公開日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2004年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月29日
發(fā)明者J·T·布賴恩, M·K·布朗羅, L·D·舒爾茨, K·U·揚(yáng)森 申請(qǐng)人:默克公司