專利名稱：Il－21衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及白介素21(IL-21)或其類似物(包括作為IL-21拮抗劑發(fā)揮作用的IL-21變體)的衍生物的合成和純化。
背景技術(shù)：
IL-21在例如WO 00/53761中被描述成T細胞生長和NK活性的刺激物。以前沒有描述過IL-21的衍生物。其作為具有改良特征的有效制藥學(xué)衍生物，在許多應(yīng)用中引起關(guān)注。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了IL-21或其變體的衍生物。
一方面，本發(fā)明提供了包含聚合分子或親脂性衍生物的IL-21或其變體的衍生物。
在本發(fā)明的一個方面，IL-21或其變體的衍生物所包含的聚合分子是一個或多個PEG基團。
在本發(fā)明的一個方面，IL-21或其變體的衍生物在分子的N末端、C末端、或內(nèi)部包含衍生化。
在本發(fā)明的一個方面，衍生化位于IL-21序列中天然存在的氨基酸和/或添加入或替代入的氨基酸。
本發(fā)明提供了特定的Ser-hIL21變體、表達該特定變體的分離DNA、以及與聚合分子進行衍生化作用的用途。本發(fā)明還提供了IL-21或其變體的衍生物用于制造治療癌癥或感染性疾病的藥物的用途。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了IL-21肽的多種衍生物，包括包含IL-21肽或其變體的經(jīng)過化學(xué)修飾的肽。根據(jù)衍生用分子的特征，化學(xué)修飾可能改變分子的化學(xué)和生物學(xué)特征。修飾的后果可能是肽的生物學(xué)功能得到保持，或者肽的活性可能有所降低。例如，衍生化作用可能延長衍生化肽在體內(nèi)的功能半衰期，從而補償活性的降低。例如，可以通過將IL-21肽或其類似物與親水性部分(moiety)偶聯(lián)產(chǎn)生保持生物學(xué)活性的IL-21衍生物來實現(xiàn)IL-21衍生物的持久作用特性。衍生化作用可以提供例如半衰期延長的肽以便于持續(xù)維持治療有效量的IL-21或其具有相同生物學(xué)作用的衍生物。由此可以減少施用有效量的持久肽所需要的數(shù)量。衍生化可以保護分子免于酶的降解和由體內(nèi)清除出去。衍生化優(yōu)選是非免疫原性的。在本發(fā)明的一個方面，可以修改肽的溶解性。
IL-21活性的定義見Parrish-Novak，2000，Nature 40857-63；Brady，J.、Hayakawa，Y.、Smyth，M.J.、和Nutt，S.L.，2004，IL-21induces the functional maturation of murine NK cells，Journalof immunology(巴爾的摩，馬里蘭)1722048-2058；Collins，M.、Whitters，M.J.、和Young，D.A.，2003，IL-21 and IL-21 receptora new cytokine pathway modulates innate and adaptive immunity，Immunol.Res.28131-140；Habib，T.、Nelson，A.、和Kaushansky，K.，2003，IL-21a novel IL-2-family lymphokine thatmodulates B，T，and natural killer cell responses，J.AllergyClin.Immunol.1121033-1045；Sivakumar，P.V.，2004，Interleukin-21 is a T-helper cytokine that regulates humoralimmunity and cell-mediated anti-tumour responses，Immunology112177；Wang，G.、Tschoi，M.、Spolski，R.、Lou，Y.、Ozaki，K.、Feng，C.、Kim，G.、Leonard，W.J.、和Hwu，P.，2003，In vivo antitumoractivity of interleukin 21 mediated by natural killer cells，Cancer Res.639016-9022；以及Wang，G.，2003，In vivo antitumoractivity of interleukin 21 mediated by natural killercells.Cancer Res 639016。認為IL-21及其衍生物可用于治療腫瘤性疾病。腫瘤性疾病或癌應(yīng)當(dāng)理解為指所有形式的贅生性細胞生長，包括囊性瘤和實體瘤，骨和軟組織腫瘤，包括良性和惡性兩種性質(zhì)的腫瘤，包括肛門組織、膽管、膀胱、血細胞、骨、骨(繼發(fā))、腸(結(jié)腸和直腸)、腦、腦(繼發(fā))、乳房、乳房(繼發(fā))、類癌瘤、子宮頸、兒童癌、眼、食道(食管)、頭和頸、卡波西肉瘤、腎、喉、(急性成淋巴細胞性)白血病、(急性髓細胞樣)白血病、(慢性淋巴細胞性)白血病、(慢性髓細胞樣)白血病、(其它)白血病、肝、肝(繼發(fā))、肺、肺(繼發(fā))、淋巴結(jié)(繼發(fā))、(何杰金氏)淋巴瘤、(非何杰金氏)淋巴瘤、黑素瘤、間皮瘤、骨髓瘤、卵巢、胰腺、陰莖、前列腺、皮膚、軟組織肉瘤、胃、睪丸、甲狀腺、未知原發(fā)性腫瘤、陰道、外陰、子宮中的腫瘤。軟組織腫瘤包括良性單體性許旺氏細胞瘤(Benign Schwannoma Monosomy)、硬纖維瘤、成脂細胞瘤、脂肪瘤、子宮平滑肌瘤、明細胞肉瘤、皮膚纖維肉瘤、尤因肉瘤、骨骼外粘液樣軟骨肉瘤、粘液樣脂肪肉瘤、分化良好的脂肪肉瘤、小泡型橫紋肌肉瘤、和滑膜肉瘤。具體的骨腫瘤包括非骨化性纖維瘤、單房性骨囊腫、內(nèi)生軟骨瘤、動脈瘤樣骨囊腫、成骨細胞瘤、成軟骨細胞瘤、軟骨粘液纖維瘤、骨化性纖維瘤和釉質(zhì)瘤、巨細胞瘤、纖維性結(jié)構(gòu)不良、尤因肉瘤、嗜曙紅細胞肉芽腫、骨肉瘤、軟骨瘤、軟骨肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、和轉(zhuǎn)移癌。白血病指由骨髓生成的白細胞的癌，包括但不限于白血病的四種主要類型急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、急性成髓細胞性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、和慢性髓細胞樣白血病(CML)。
在討論本發(fā)明的詳細實施方案之前，提供與本發(fā)明主要方面有關(guān)的具體術(shù)語的定義。
在本發(fā)明的內(nèi)容中，“IL-21”定義為WO 00/53761中作為SEQ ID No2公布的序列或該序列的不含N端序列的序列。本申請還描述了IL-21的變體和衍生物。在本發(fā)明的內(nèi)容中，術(shù)語“IL-21”由此指WO 00/53761中描述的IL-21，任選不含N端序列。本發(fā)明涵蓋來自其它物種的相應(yīng)蛋白質(zhì)(“直向同源物(ortholog)”)。特別感興趣的是來自其它哺乳動物物種的IL-21多肽，包括嚙齒類、豬、羊、牛、狗、貓、馬、和其它靈長類。
“IL-21衍生物”包括衍生化或與另一種功能分子相連接。連接可以是與其它分子實體(諸如抗體、毒素、放射性同位素、毒害細胞的或抑制細胞的試劑、或聚合分子或親水性基團)化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價相連、諸如此類。非限制性實例包括聚合基團，諸如例如PCT/DK2004/000531中公布的樹狀分子(dendrimer)、聚環(huán)氧烷(PAO)、聚烷撐二醇(PAG)、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯共馬來酸酐、聚苯乙烯共馬來酸酐、葡聚糖、羧甲基葡聚糖；血清蛋白質(zhì)結(jié)合配體，諸如與清蛋白結(jié)合的化合物，像脂肪酸，C5-C24脂肪酸，脂肪族二酸，(例如C5-C24)。清蛋白結(jié)合物見丹麥專利申請PCT/DK04/000625。清蛋白結(jié)合物也可以是具有如下化學(xué)式的化合物 延長基團(protracting group)的其它實例包括所含部分(moiety)在生理條件下改變電荷特性的有機小分子，諸如羧酸或胺，或包含預(yù)防聚糖特異識別的中性取代基諸如小型烷基取代基(例如C1-C5烷基)的有機小分子。
IL-21肽的變體或類似物的特征是具有一處或多處氨基酸替代、刪除、或添加。這些變化本質(zhì)上通常是次要的，即保守氨基酸替代和不會顯著影響肽的受體結(jié)合、受體親和力、折疊、或生物學(xué)活性的其它替代；然而，如下所述，關(guān)鍵氨基酸的甚至輕微修改都會改變IL-21肽的作用；小段刪除，通常1-約30個氨基酸；以及小段氨基末端或羧基末端延伸，諸如氨基末端甲硫氨酸殘基、可多達約20-25個殘基的小接頭肽、或便于純化的小段延伸(親和標(biāo)簽)，諸如聚組氨酸片段、蛋白A(Nilsson等，1985，EMBO J.41075；Nilsson等，1991，MethodsEnzymol.1983)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(Smith和Johnson，1988，Gene6731)、或其它抗原性表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。通常見Ford等，1991，Protein Expression and Purification 295-107。編碼親和標(biāo)簽的DNA可以由供應(yīng)商處獲得(例如Pharmacia Biotech，Piscataway，新澤西)。
IL-21肽的變體還可以包含非天然存在氨基酸殘基。非天然存在氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2，4-亞甲基脯氨酸、順式-4-羥基脯氨酸、反式-4-羥基脯氨酸、N-甲基甘氨酸、addo-threonine、甲基蘇氨酸、羥乙基半胱氨酸、羥乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、同型谷氨酰胺(homoglutamine)、哌啶酸、噻唑烷羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、3，3-二甲基脯氨酸、叔-亮氨酸、正纈氨酸、2-氮雜苯丙氨酸、3-氮雜苯丙氨酸、4-氮雜苯丙氨酸、和4-氟苯丙氨酸。本領(lǐng)域知道用于將非天然存在氨基酸殘基摻入蛋白質(zhì)的數(shù)種方法。例如，可以采用其中使用化學(xué)氨基?；囊种菩蛅RNA抑制無義突變的體外系統(tǒng)。本領(lǐng)域知道用于合成氨基酸和氨酰化tRNA的方法?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域已知流程來鑒定本發(fā)明多肽中的關(guān)鍵氨基酸，諸如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells，1989，Science 2441081-1085；Bass等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 884498-4502。在后一種技術(shù)中，在分子的每一個殘基處導(dǎo)入一個丙氨酸突變，并對得到的突變分子檢測生物學(xué)活性(例如配體結(jié)合和信號轉(zhuǎn)導(dǎo))，從而鑒定對分子的活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。還可以通過分析通過諸如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、或光親和標(biāo)記等技術(shù)測定的晶體結(jié)構(gòu)來確定配體-蛋白質(zhì)相互作用的位點。還可以通過分析與相關(guān)蛋白質(zhì)的同源性來推斷關(guān)鍵氨基酸。
在一個實施方案中，變體與WO 00/53761的序列SEQ ID NO2具有70％或更多同一性。在一個實施方案中，變體與WO 00/53761的序列SEQID NO2具有80％或更多同一性。在另一個實施方案中，變體與WO00/53761的序列SEQ ID NO2具有90％或更多同一性。在另一個實施方案中，變體與WO 00/53761的序列SEQ ID NO2具有95％或更多同一性。
兩種氨基酸序列之間的序列同一性百分率是通過既可用于蛋白質(zhì)又可用于DNA比對的Needelman-Wunsch比對測定的。在用于蛋白質(zhì)比對時，所用默認評分矩陣是BLOSUM50，而缺口中第一個殘基的罰分是-12，缺口中的其余殘基的罰分是-2?？梢允褂胿20u6版FASTA軟件包的比對軟件進行比對(W.R.Pearson和D.J.Lipman，1988，“Improved Toolsfor Biological Sequence Analysis”，PNAS 852444-2448；以及W.R.Pearson，1990，“Rapid and Sensitive Sequence Comparisonwith FASTP and FASTA”，Methods in Enzymology 18363-98)。
相對于野生型IL-21具有實質(zhì)性改良生物學(xué)活性的IL-21變體的非限制性實例見WO 03/40313，其中對IL-21序列中單個氨基酸的替代拮抗IL-21的作用。
依照本發(fā)明，IL-21化合物的拮抗劑抑制在正常情況下對IL-21觀察到的活性。這些化合物還可以是與IL-21相互作用的小分子、肽、或可溶性受體。依照本發(fā)明，IL-21拮抗劑的衍生化是肽或可溶性受體。在本發(fā)明的一個方面，肽是具有拮抗作用的IL-21類似物或變體。
拮抗劑還可以是融合蛋白，包括與免疫球蛋白Fc區(qū)融合的IL-21R胞外結(jié)構(gòu)域。
拮抗性融合蛋白的實例見WO 03/28630的SEQ ID NO23、SEQ IDNO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、或SEQ ID NO39。
可以依照本發(fā)明使用的其它IL-21拮抗劑有WO 03/40313的SEQ IDNO4和6。WO 03/87320中提到了第114和119位之一或二者具有變異的IL-21肽。
對IL-21具有拮抗作用的可溶性IL-21受體見WO 04/07682。
可用于本發(fā)明方法的拮抗性融合蛋白的實例見WO 03/28630的SEQID NO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ IDNO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、和SEQ IDNO39。
可用于本發(fā)明方法的其它IL-21拮抗劑有WO 03/40313的SEQ IDNO4和6以及WO 03/87320中描述的在人IL-21第114和119位之一或二者具有變異的IL-21肽。WO 04/07682描述了具有針對IL-21的拮抗活性的可溶性受體。
在本發(fā)明的一個方面，采用IL-21抗體作為IL-21拮抗劑。可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適方法來生成這些抗體，而且WO 00/53761描述了這些抗體的實例。IL-21拮抗性抗體的特征是抑制IL-21的一種或多種生物學(xué)活性。對生物學(xué)活性的抑制可以通過例如Ba F3測定法來測量，其中將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了人IL-21R的Ba F3細胞(IL-21R-Ba F3)在添加了IL-21的培養(yǎng)基中進行增殖。向IL-21R-Ba F3細胞中加入IL-21拮抗劑將會如所需的部分或完全抑制IL-21R-Ba F3細胞的IL-21依賴性增殖。
術(shù)語“聚合分子”或“聚合基團”或“聚合部分(moiety)”或“聚合物分子”涵蓋通過兩個或多個單體的共價連接而形成的分子，其中沒有一個單體是氨基酸殘基。優(yōu)選的聚合物是選自下組的聚合物分子PCT/DK2004/000531中公布的樹狀分子、聚環(huán)氧烷(PAO)(包括聚烷撐二醇(PAG)，諸如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG))、分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯共馬來酸酐、聚苯乙烯共馬來酸酐、和葡聚糖(包括羧甲基葡聚糖)。特別優(yōu)選PEG。
術(shù)語“PEG化IL-21”指在人IL-21多肽上綴合了一個或多個PEG分子的IL-21。應(yīng)當(dāng)理解，PEG分子可以附著在IL-21多肽的任何部分，包括IL-21多肽的任何氨基酸殘基或碳水化合物部分(moiety)。術(shù)語“半胱氨酸-PEG化IL-21”指在導(dǎo)入IL-21中的半胱氨酸的巰基上綴合了PEG分子的IL-21。
術(shù)語“聚乙二醇”或“PEG”指聚乙二醇化合物或其衍生物，含有或不含偶聯(lián)劑、偶聯(lián)或活化部分(moiety)(例如含有硫醇、三氟甲基磺酸酯(鹽)、三氟乙基磺酸酯(鹽)(tresylate)、氮丙啶(azirdine)、環(huán)氧乙烷、或優(yōu)選的馬來酰亞胺部分(moiety))。本發(fā)明的活化PEG化合物的實例是諸如馬來酰亞胺單甲氧基PEG等化合物。術(shù)語“PEG”意圖指分子量500-150,000Da的聚乙二醇，包括其類似物，其中例如末端OH基團已用甲氧基替代(稱為mPEG)。
在本文中，詞語“肽”和“多肽”和“蛋白質(zhì)”可以互換使用，意圖指同一事物。
在本發(fā)明的內(nèi)容中，“治療”指預(yù)防、改善、控制、治愈、或減輕疾病(例如疾病的癥狀)、疾病下潛在的病癥、或二者。
術(shù)語“功能體內(nèi)半衰期”以其正常含義使用，即身體/靶器官中仍然存在50％的多肽或綴合物的生物學(xué)活性的時間，或者多肽或綴合物的活性是其初始數(shù)值的50％的時間。作為測定功能體內(nèi)半衰期的替換項，可以測定“血清半衰期”，即清除前50％的多肽或綴合物分子在血漿或血流中循環(huán)的時間。血清半衰期的測定常常比功能半衰期的測定要更加簡單，而且血清半衰期的量級通常是功能體內(nèi)半衰期的量級的很好指標(biāo)。血清半衰期的替換術(shù)語包括血漿半衰期、循環(huán)半衰期、血清清除、血漿清除、和清除半衰期。需要保持的功能性通常選自促凝、蛋白水解、輔助因子結(jié)合、受體結(jié)合活性，或者是與特定蛋白質(zhì)有關(guān)的其它類型的生物學(xué)活性。
術(shù)語“延長”在關(guān)于功能體內(nèi)半衰期或血漿半衰期時用于指示根據(jù)可比條件下的測定，多肽或綴合物的相關(guān)半衰期相對于參考分子(諸如未綴合糖蛋白)在統(tǒng)計學(xué)上顯著的有所延長。例如相關(guān)半衰期可能延長了至少約25％，諸如至少約50％，例如至少約100％、150％、200％、250％、或500％。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及IL-21衍生物用于制備治療對T細胞激發(fā)和NK細胞增殖有響應(yīng)的疾病的藥物的用途。
本發(fā)明還提供了多種其它多肽融合物(以及包含一個或多個多肽融合物的相關(guān)多聚蛋白質(zhì))。例如，可以如美國專利號5,155,027和5,567,584中所公布的將IL-21多肽制成與二聚化蛋白質(zhì)的融合物，并依照本發(fā)明進行衍生化。這方面優(yōu)選的二聚化蛋白質(zhì)包括免疫球蛋白恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域?？梢栽诮?jīng)過基因工程改造的細胞中表達免疫球蛋白-IL-21多肽融合物?？梢詫⑤o助性結(jié)構(gòu)域與IL-21多肽融合，從而將它們靶向特定細胞、組織、或大分子(例如膠原)。
可以依照常規(guī)技術(shù)在經(jīng)過基因工程改造的宿主細胞中生產(chǎn)本發(fā)明的肽，包括全長肽、肽片段(例如配體結(jié)合片段)、和融合多肽。合適的宿主細胞是可以用外源DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染并在培養(yǎng)基中生長的細胞類型，包括細菌、真菌細胞、和培養(yǎng)的高等真核細胞。優(yōu)選真核細胞，特別是多細胞生物體的培養(yǎng)細胞。用于操作克隆的DNA分子和將外源DNA導(dǎo)入多種宿主細胞的技術(shù)見Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989；以及Ausubel等，同上。
應(yīng)當(dāng)認識到，依照本發(fā)明在如上所述主張cDNA時，應(yīng)當(dāng)理解所主張的既有有義鏈、反義鏈，又有有義鏈和反義鏈通過它們各自的氫鍵一起退火得到的雙鏈DNA。還主張編碼本發(fā)明多肽且由上文所述cDNA編碼的信使RNA(mRNA)。信使RNA(mRNA)將使用與上文定義相同的密碼子編碼多肽，只是每個胸腺嘧啶核苷酸(T)用尿嘧啶核苷酸(U)取代。
為了引導(dǎo)IL-21多肽進入宿主細胞的分泌途徑，在表達載體中提供分泌信號序列(也稱為前導(dǎo)序列、前原序列(prepro sequence)、或前序列(pre sequence))。分泌信號序列可以是該蛋白質(zhì)的，或者可以衍生自(例如)另一種分泌性蛋白質(zhì)，或者是從頭合成的。按正確的讀碼框?qū)⒎置谛盘栃蛄信cIL-21 DNA序列相連。分泌信號序列通常位于編碼目的多肽的DNA的5′端，盡管某些信號序列可以位于目的DNA序列的其它位置(見例如Welch等，美國專利號5,037,743；Holland等，美國專利號5,143,830)。
可以如WO 04/55168中所述在大腸桿菌中表達IL-21及其變體。任選的是，可以通過重組DNA技術(shù)在其它生物體中生產(chǎn)IL-21變體。為此，可以如下分離編碼人IL-21相關(guān)多肽或IL-21變體的DNA序列，即依照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建基因組或cDNA文庫，并使用合成寡核苷酸探針通過雜交篩選編碼全長或部分蛋白質(zhì)的DNA序列(見Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989)。為本發(fā)明目的，編碼蛋白質(zhì)的DNA序列優(yōu)選源自人，即衍生自人基因組DNA或cDNA文庫。
還可以使用已經(jīng)建立的標(biāo)準(zhǔn)方法通過人工合成制備編碼IL-21變體的DNA序列，例如Beaucage和Caruthers，1981，Tetrahedron Letters221859-1869描述的磷亞酰胺法或Matthes等，1984，EMBO Journal3801-805描述的方法。依照磷亞酰胺法，(例如在自動DNA合成儀中)合成寡核苷酸，并將其純化，退火，連接，和克隆到合適的載體中。
本發(fā)明還包括對IL-21多肽或其變體或包含IL-21或其變體的融合蛋白的化學(xué)修飾?；瘜W(xué)修飾包括使用能夠與選定側(cè)鏈或末端殘基發(fā)生反應(yīng)的有機試劑進行的共價修飾。
這些修飾的實例有將親脂性取代基附著到一個或多個對應(yīng)于上文所述氨基酸序列SEQ ID NO1或2中位置的氨基酸殘基上。應(yīng)當(dāng)理解，對應(yīng)于氨基酸序列SEQ ID NO2中位置的氨基酸殘基可以是任何氨基酸殘基，而不僅僅是該位置天然存在的氨基酸殘基。在一個實施方案中，將親脂性取代基附著到賴氨酸上。
可以如申請中所述對IL-21中的一個或多個賴氨酸進行衍生化。
在其它優(yōu)選的實施方案中，將額外的賴氨酸替代入、插入序列或添加到N末端或C末端，然后任選進行衍生化。本發(fā)明的其它方面包括添加天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、或酪氨酸，它們的側(cè)鏈都攜帶可用于進行衍生化的官能團。
優(yōu)選在不會對蛋白質(zhì)的總體活性產(chǎn)生不利影響的區(qū)域進行插入。可以同時進行N端和C端截短，以及在末端添加適當(dāng)序列。
在本發(fā)明的幾個方面中，選擇下列任何位置(可以組合)用于進行取代Lys 22、Lys 53、Lys 57、Lys 76、Lys 78、Lys 89、Lys 102、Lys 103、Lys 106、Lys 113、或Lys 118。
在本發(fā)明的一個方面，可以對下列取代基(可以組合且任選在制備了相應(yīng)位置為賴氨酸的變體后)進行衍生化Arg66、Arg86、Arg87、Arg91、Arg111、或Arg127。所有上述位置是根據(jù)WO 00/53761中所描述的不含最初28個氨基酸的N端序列的IL-21肽的位置計算的。
術(shù)語“親脂性取代基”的特征是包含4-40個碳原子，而且20℃時在水中的溶解度是約0.1-約250mg/100ml水，諸如約0.3-約75mg/100ml水。例如，辛酸(C8)20℃時在水中的溶解度是68mg/100ml，癸酸(C10)20℃時在水中的溶解度是15mg/100ml，而十八酸(C18)20℃時在水中的溶解度是0.3mg/100ml。
為了獲得令人滿意的IL-21衍生物的持久作用特性，作為范例，附著到IL-21部分(moiety)上的親脂性取代基包含4-40個碳原子，諸如8-25個碳原子?？梢酝ㄟ^親脂性取代基的羧基將親脂性取代基附著到IL-21部分(moiety)的氨基上，所述羧基與它所附著的氨基酸的氨基形成酰胺鍵?；蛘?，可以以這樣的方式將親脂性取代基附著到所述氨基酸上，即親脂性取代基的氨基與氨基酸的羧基形成酰胺鍵。還有一種選擇是，可以經(jīng)由酯鍵將親脂性取代基與IL-21部分(moiety)相連接。通常，可以通過IL-21部分(moiety)的羧基與將來的取代基的羥基之間的反應(yīng)或者通過IL-21部分(moiety)的羥基與將來的取代基的羧基之間的反應(yīng)來形成酯。作為另一種選擇，親脂性取代基可以是導(dǎo)入IL-21部分(moiety)的伯氨基中的烷基。
在本發(fā)明的一個實施方案中，IL-21衍生物只含有一個附著到IL-21肽上的親脂性取代基。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂性取代基包含4-40個碳原子。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂性取代基包含8-25個碳原子。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂性取代基包含12-20個碳原子。
在本發(fā)明的一個實施方案中，以這樣的方式將親脂性取代基附著到氨基酸殘基上，即親脂性取代基的羧基與氨基酸殘基的氨基形成酰胺鍵。
在其它優(yōu)選的實施方案中，將額外的賴氨酸替代入、插入序列或添加到N末端或C末端，然后任選進行衍生化。
優(yōu)選在不會對蛋白質(zhì)的總體活性產(chǎn)生不利影響的區(qū)域進行插入。優(yōu)選的區(qū)域是上文所列位置。
在本發(fā)明的一個實施方案中，以這樣的方式將親脂性取代基附著到氨基酸殘基上，即親脂性取代基的氨基與氨基酸殘基的羧基形成酰胺鍵。
在本發(fā)明的一個實施方案中，通過間隔物將親脂性取代基附著到IL-21肽上。
在本發(fā)明的一個實施方案中，間隔物是具有1-7個亞甲基(諸如兩個亞甲基)的不分支鏈烷α，ω-二羧酸基團，且間隔物在IL-21肽的氨基與親脂性取代基的氨基之間形成橋。
在本發(fā)明的一個實施方案中，間隔物是除了半胱氨酸殘基以外的氨基酸殘基或二肽。合適的間隔物的實例包括β-丙氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、γ-谷氨酸、琥珀酸、賴氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸，或是諸如Gly-Lys等二肽。當(dāng)間隔物是琥珀酸時，它的一個羧基可以與氨基酸殘基的氨基形成酰胺鍵，而它的另一個羧基可以與親脂性取代基的氨基形成酰胺鍵。當(dāng)間隔物是賴氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸時，它們的羧基可以與氨基酸殘基的氨基形成酰胺鍵，而它們的氨基可以與親脂性取代基的羧基形成酰胺鍵。在使用賴氨酸作為間隔物時，在有些情況中可以在賴氨酸的ε-氨基與親脂性取代基之間插入另一個間隔物。在一個實施方案中，所述另一個間隔物是琥珀酸，它與賴氨酸的ε-氨基和親脂性取代基中存在的氨基形成酰胺鍵。在另一個實施方案中，所述另一個間隔物是谷氨酸或天冬氨酸，它與賴氨酸的ε-氨基形成酰胺鍵，且與親脂性取代基中存在的羧基形成另一個酰胺鍵，即親脂性取代基是Nε-?；嚢彼釟埢?。
在本發(fā)明的一個實施方案中，間隔物選自下組β-丙氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、γ-谷氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、含天冬氨酸的二肽、含谷氨酸的二肽、或含賴氨酸的二肽。在本發(fā)明的一個實施方案中，間隔物是β-丙氨酸。在本發(fā)明的一個實施方案中，間隔物是γ-氨基丁酸(GABA)。在本發(fā)明的一個實施方案中，間隔物是γ-谷氨酸。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親本IL-21肽的羧基與間隔物的氨基形成酰胺鍵，而氨基酸或二肽間隔物的羧基與親脂性取代基的氨基形成酰胺鍵。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親本IL-21肽的氨基與間隔物的羧基形成酰胺鍵，而間隔物的氨基與親脂性取代基的羧基形成酰胺鍵。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂性取代基包含部分或完全氫化的環(huán)戊烷菲(cyclopentanophenathrene)骨架。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂性取代基是直鏈或分支烷基。在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂性取代基是直鏈或分支脂肪酸的?；?。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂性取代基的?；x自下組CH3(CH2)nCO-，其中n是4-38，諸如CH3(CH2)6CO-、CH3(CH2)8CO-、CH3(CH2)10CO-、CH3(CH2)12CO-、CH3(CH2)14CO-、CH3(CH2)16CO-、CH3(CH2)18CO-、CH3(CH2)20CO-、和CH3(CH2)22CO-。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂性取代基是直鏈或分支鏈烷α，ω-二羧酸的?；?br> 在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂性取代基的酰基選自下組HOOC(CH2)mCO-，其中m是4-38，諸如HOOC(CH2)14CO-、HOOC(CH2)16CO-、HOOC(CH2)18CO-、HOOC(CH2)20CO-、和HOOC(CH2)22CO-。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂性取代基是化學(xué)式為CH3(CH2)p((CH2)qCOOH)CHNH-CO(CH2)2CO-的基團，其中p和q是整數(shù)且p+q是8-40的整數(shù)，諸如12-35的整數(shù)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂性取代基是化學(xué)式為CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO-的基團，其中r是10-24的整數(shù)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂性取代基是化學(xué)式為CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CO-的基團，其中s是8-24的整數(shù)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂性取代基是化學(xué)式為COOH(CH2)tCO-的基團，其中t是8-24的整數(shù)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂性取代基是化學(xué)式為-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)uCH3的基團，其中u是8-18的整數(shù)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂性取代基是化學(xué)式為-NHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)wCH3的基團，其中w是10-16的整數(shù)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂性取代基是化學(xué)式為-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)xCH3的基團，其中x是10-16的整數(shù)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂性取代基是化學(xué)式為-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NHCO(CH2)yCH3的基團，其中y是零或1-22的整數(shù)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂性取代基是N-石膽酰基(Lithocholoyl)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂性取代基是N-膽?；?Choloyl)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，IL-21衍生物具有一個親脂性取代基。在本發(fā)明的一個實施方案中，IL-21衍生物具有兩個親脂性取代基。在本發(fā)明的一個實施方案中，IL-21衍生物具有三個親脂性取代基。在本發(fā)明的一個實施方案中，IL-21衍生物具有四個親脂性取代基。
本發(fā)明的方法還設(shè)想使用經(jīng)過化學(xué)修飾的IL-21組合物，其中IL-21多肽與聚合分子相連。例示性的IL-21多肽是缺乏功能性跨膜結(jié)構(gòu)域的可溶性多肽，諸如成熟IL-21多肽。通常，聚合物是水溶性的，因而IL-21綴合物在水性環(huán)境中不會沉淀，諸如生理環(huán)境。合適聚合物的一個實例是經(jīng)過修飾具有單個反應(yīng)基團的聚合物，諸如用于酰化的活性酯或用于烷化的醛。這樣的話，可以控制聚合的程度。反應(yīng)性醛的實例是聚乙二醇丙醛或其單(C1-C10)烷氧基或芳氧基衍生物(見例如Harris等，美國專利號5,252,714)。聚合物可以是線性的或分支的。此外，可以使用聚合物混合物來生成IL-21綴合物。
用于治療的IL-21綴合物可以包含制藥學(xué)可接受水溶性聚合物部分(moiety)。合適的水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、單甲氧基-PEG、單(C1-C10)烷氧基-PEG、芳氧基-PEG、聚(N-乙烯吡咯烷酮)PEG、2，2，2-三氟乙磺酰基單甲氧基PEG、PEG丙醛、二琥珀酰亞胺基碳酸酯PEG、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、葡聚糖、纖維素、或其它基于碳水化合物的聚合物。上文描述了不同大小的PEG。
在本發(fā)明的一個方面，用N末端PEG基團對肽進行衍生化，即用高碘酸鈉將絲氨酸氧化，隨后與附著了羥胺的PEG衍生物進行反應(yīng)，產(chǎn)生肟。原則上，絲氨酸也可以是內(nèi)部絲氨酸殘基或如上所述外加的絲氨酸殘基。
用于附著PEG基團的其它方法見G.Pasut、A.Guiotto、F.M.Veronese，2004，Expert Opin.Ther.Patents 14859-894。可以如上所述獲得適于附著聚合基團的IL-21變體。
在本發(fā)明的一個方面，將IL-21附著于肽的C末端。這可以通過使用適于作為CPY(羧肽酶Y)底物的IL-21或其變體來實現(xiàn)，EP 243 929描述了它的部分反應(yīng)。然后可以對這種中間物用包含一個或多個反應(yīng)基X的化合物進行進一步取代，而后者又適于用包含反應(yīng)基Y的分子進行進一步取代。反應(yīng)基可以選自如下所述的組。
在一個實施方案中，官能團X和Y選自羰基，諸如酮基和醛基，以及諸如下列氨基衍生物肼衍生物 -NH-NH2、肼羧酸酯衍生物 -O-C(O)-NH-NH2、氨基脲衍生物 -NH-C(O)-NH-NH2、硫代氨基脲衍生物 -NH-C(S)-NH-NH2、碳酸二酰肼衍生物 -NHC(O)-NH-NH-C(O)-NH-NH2、均二氨基脲衍生物 -NH-NH-C(O)-NH-NH2、硫代均二氨基脲衍生物 -NH-NH-C(S)-NH-NH2、芳基肼衍生物 -NH-C(O)-C6H4-NH-NH2、和酰肼衍生物 -C(O)-NH-NH2；羥胺(oxylamine)衍生物，諸如-O-NH2、-C(O)-O-NH2、-NH-C(O)-O-NH2、和-NH-C(S)-O-NH2。
應(yīng)當(dāng)理解，如果X中包含的官能團是羰基，那么Y中包含的官能團是胺衍生物，反之亦然。由于大多數(shù)肽中存在-NH2基團，因此認為若X包含酮-或醛-官能團就會獲得更好的選擇性。
適于上文所述反應(yīng)的PEG衍生物的實例有 其中n是1、2、3、4、5、或6且mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中n是1、2、3、4、5、或6且mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中n是0、1、2、3、4、5、或6且m是1、2、3、4、5、或6且mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中n是1、2、3、4、5、或6且mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中Y是-O-NH2、NH-NH2，n、m、和s是0-20的任何數(shù)值，R′和R″獨立的代表例如甲基、苯基、聯(lián)苯基、苯氧苯基、苯基羧基苯基。
可以在上述任何通式的烷基鏈中的任何合適位置以任一方向插入化學(xué)式為-SO2-、-C(O)NH-、-C(O)NHSO2-、-SO2-苯基-、C(O)NHSO2-苯基-的基團。任選的是，可以用下面的基團取代上述化學(xué)式中的C(O)NH基團 在本發(fā)明的一個實施方案中，衍生物的導(dǎo)入是在一個步驟中完成的。因而，R-X包含將要導(dǎo)入IL-21的衍生物。親核體代表例如經(jīng)過修飾而攜帶衍生物的氨基酸。原則上，可以使用任何氨基酸序列。在本發(fā)明的一個方面，使用的親核體是諸如G(1-5)-PEG、G(1-5)-脂質(zhì)、G(1-4)-NH-CH2-CHO、G(1-4)-NH-CH2-C-O-NH2等。
PEG是合適的聚合物分子，因為與諸如葡聚糖等多糖相比它只具有少數(shù)能夠交聯(lián)的反應(yīng)基。具體而言，單官能的PEG，例如甲氧基聚乙二醇(mPEG)是令人感興趣的，因為它的偶聯(lián)化學(xué)相對簡單(只有一個反應(yīng)基能夠與多肽上的附著基團綴合)。從而消除了交聯(lián)的風(fēng)險，由此產(chǎn)生的多肽綴合物更加均一，而且聚合物分子與多肽的反應(yīng)更易于控制。
為了將聚合物分子共價附著到多肽上，需要以活化形式提供聚合物分子的羥基末端，即具有反應(yīng)性官能團。合適的活化聚合物分子可以通過商業(yè)途徑獲得，例如Shearwater公司(亨茨維爾，阿拉巴馬州，美國)或PolyMASC Pharmaceuticals上市公司(英國)。或者，可以通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法活化聚合物分子，例如WO 90/13540中所公開的。本發(fā)明中所使用的活化的線性或分支聚合物分子的具體實例見Shearwater公司1997年和2000年的產(chǎn)品目錄(FunctionalizedBiocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals，Polyethylene Glycol and Derivatives，收入本文作為參考)?；罨疨EG聚合物的具體實例包括下列線性PEGNHS-PEG(例如SPA-PEG、SSPA-PEG、SBA-PEG、SS-PEG、SSA-PEG、SC-PEG、SG-PEG、和SCM-PEG)、NOR-PEG、BTC-PEG、EPOX-PEG、NCO-PEG、NPC-PEG、CDI-PEG、ALD-PEG、TRES-PEG、VS-PEG、IODO-PEG、和MAL-PEG，以及分支PEG，諸如PEG2-NHS和美國專利號5,932,462和美國專利號5,643,575(都收入本文作為參考)中公布的那些。另外，下列發(fā)表物(收入本文作為參考)公布了有用的聚合物分子和/或PEG化化學(xué)美國專利號5,824,778、美國專利號5,476,653、WO 97/32607、EP 229,108、EP 402,378、美國專利號4,902,502、美國專利號5,281,698、美國專利號5,122,614、美國專利號5,219,564、WO 92/16555、WO 94/04193、WO 94/14758、WO94/17039、WO 94/18247、WO 94/28024、WO 95/00162、WO 95/11924、WO 95/13090、WO 95/33490、WO 96/00080、WO 97/18832、WO 98/41562、WO 98/48837、WO 99/32134、WO 99/32139、WO 99/32140、WO 96/40791、WO 98/32466、WO 95/06058、EP 439508、WO 97/03106、WO 96/21469、WO 95/13312、EP 921 131、美國專利號5,736,625、WO 98/05363、EP 809 996、美國專利號5,629,384、WO 96/41813、WO 96/07670、美國專利號5,473,034、美國專利號5,516,673、EP 605 963、美國專利號5,382,657、EP 510 356、EP 400 472、EP 183 503、和EP 154 316。
多肽與活化聚合物分子的綴合是通過任何常規(guī)方法進行的，例如下列參考文獻中所述(它們還描述了用于活化聚合物分子的合適方法)R.F.Taylor，1991，“Protein immobilisation.Fundamentaland applications”，Marcel Dekker，紐約；S.S.Wong，1992，“Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”，CRC出版社，Boca Raton；G.T.Hermanson等，1993，“Immobilized AffinityLigand Techniques”，Academic出版社，紐約。根據(jù)多肽上的附著基團(上文進一步給出了實例)以及聚合物的官能團(例如胺、羥基、羧基、醛、巰基、琥珀酰亞胺基、馬來酰亞胺、乙烯砜、或鹵代乙酸酯)，技術(shù)人員知道將要使用的活化方法和/或綴合化學(xué)。PEG化可以涉及多肽上所有可利用附著基團(即暴露在多肽表面的這些附著基團)的綴合，或者可以涉及一個或多個特定附著基團(例如N末端氨基)的綴合(美國專利號5,985,265)。另外，可以在一個步驟中或以逐步方式(例如WO 99/55377中所述)完成綴合。
可以理解，PEG化的設(shè)計是為了在附著的PEG分子的數(shù)目、這些分子的大小和形式(例如它們是線性的還是分支的)、以及這些分子附著在多肽中的什么地方這些方面產(chǎn)生最佳的分子。將要使用的聚合物的分子量的選擇需要考慮所要實現(xiàn)的期望效果。例如，如果綴合的主要目的是為了得到較高分子量和較大尺寸的綴合物(例如為了降低腎的清除)，那么可以選擇綴合一個或一些高分子量聚合物分子或許多較小分子量聚合物分子以獲得期望效果。然而，優(yōu)選的是，使用數(shù)個具有較小分子量的聚合物分子。如果希望獲得高度的表位屏蔽，那么也是如此。在這些情況中，例如可以使用2-8個例如分子量約5,000Da的聚合物，諸如3-6個這種聚合物。正如下文實施例所例示的，在提高多肽綴合物的功能體內(nèi)半衰期方面，與較小數(shù)目的較高分子量(例如1-3個分子量12,000-20,000Da)的聚合物分子相比，使用較大數(shù)目的較小分子量(例如4-6個分子量5000Da)的聚合物分子可能是有利的，即使在兩種情況中所附著聚合物分子的總分子量相同或相似的時候。認為，與例如單個較大聚合物分子相比，較大數(shù)目的較小聚合物分子的存在為多肽提供了更大的直徑或表觀大小，至少在聚合物分子較為均勻的分布在多肽表面上的時候。
還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)本發(fā)明綴合物的至少主要部分的表觀大小(也稱為“表觀分子量”或“表觀質(zhì)量”)是至少約50kDa，諸如至少約55kDa，諸如至少約60kDa，例如至少約66kDa時，獲得了有利的結(jié)果。認為這是由于腎對表觀大小足夠大的綴合物的清除基本上消除的事實。在本文中，IL-21綴合物或IL-21多肽的“表觀大小”是通過SDS-PAGE法測定的。
在本發(fā)明的一個實施方案中，依照本發(fā)明與肽綴合的PEG可以是任何分子量。具體而言，分子量可以是500-100,000Da，諸如500-60,000Da，諸如1000-40,000Da，諸如5,000-40,000Da。具體而言，可以在本發(fā)明中使用分子量10,000Da、20,000Da、或40,000kDa的PEG。在所有情況中，PEG可以是線性的或分支的。在本發(fā)明的一個實施方案中，PEG基團的分子量是5kDa、10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、或60kDa。
在本發(fā)明的一個實施方案中，向肽中添加了一個或多個聚合分子。
本發(fā)明提供了適于附著聚合基團的化合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，衍生物由此提供了體內(nèi)半衰期得到改進的肽。這可以通過保護化合物免于化學(xué)降解、蛋白水解、或抗體識別-或任何其它機制來實現(xiàn)。
在一個實施方案中，提供的化合物毒性更低。
在一個實施方案中，提供的化合物水溶性更高。
在一個實施方案中，提供的化合物具有改變的生物分布。
上文是關(guān)于非衍生化類似物或hIL-21。
藥物組合物在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的另一個目的是提供包含以0.1至100mg/ml濃度存在的IL-21或其類似物或衍生物的藥物制劑，或者該藥物制劑任選含有以0.1至100mg/ml濃度存在的本申請中提及的任何其它化合物，而且其中所述制劑的pH是2.0至10.0。制劑還可以包含緩沖系統(tǒng)、防腐劑、等滲劑(tonicity agent)、螯合劑、穩(wěn)定劑、和表面活性劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，藥物制劑是水性制劑，即含有水的制劑。這種制劑典型的是溶液或懸浮液。在本發(fā)明的另一個實施方案中，藥物制劑是水性溶液。術(shù)語“水性制劑”定義為至少含有50％w/w水的制劑。同樣，術(shù)語“水性溶液”定義為至少含有50％w/w水的溶液，而術(shù)語“水性懸浮液”定義為至少含有50％w/w水的懸浮液。
在另一個實施方案中，藥物制劑是使用前需要醫(yī)師或患者向其中加入溶劑和/或稀釋劑的凍干制劑。
在另一個實施方案中，藥物制劑是無需預(yù)先溶解的即用型干制劑(例如凍干或噴霧干燥的)。
另一方面，本發(fā)明涉及包含IL-21或上文所述任何其它化合物的水溶液以及緩沖劑的藥物制劑，其中所述化合物以自0.1mg/ml以上或上文所述濃度存在，優(yōu)選0.5至50mg/ml，而且其中所述制劑的pH是約2.0至約10.0，優(yōu)選3.0至約8.0，特別優(yōu)選4.0至6.0，諸如例如4.0-4.5、4.5-5.0、5.0-5.5、和5.5-6.0。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，制劑的pH選自下組2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、和10.0。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，緩沖劑選自下組乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘氨酰甘氨酸、組氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉、三(羥甲基)-氨基甲烷、N-二(羥乙基)甘氨酸、兩性離子緩沖劑(tricine)、蘋果酸、琥珀酸鹽、馬來酸、富馬酸、酒石酸、天冬氨酸、或其混合物。這些具體緩沖劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明的一個替換實施方案。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，制劑還包含制藥學(xué)可接受抗微生物防腐劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，防腐劑選自下組苯酚、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、對羥基苯甲酸丁酯、2-苯乙醇、芐醇、氯丁醇、硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲、氯己定(chlorohexidine)、脫氫乙酸鈉、氯甲酚、對羥基苯甲酸乙酯、苯索氯銨、氯苯甘醚(3-對氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)、或其混合物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，防腐劑的濃度是0.1mg/ml至20mg/ml。在本發(fā)明的另一個實施方案中，防腐劑的濃度是0.1mg/ml至5mg/ml。在本發(fā)明的另一個實施方案中，防腐劑的濃度是5mg/ml至10mg/ml。在本發(fā)明的另一個實施方案中，防腐劑的濃度是10mg/ml至20mg/ml。這些具體防腐劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明的一個替換實施方案。技術(shù)人員熟知防腐劑在藥物組合物中的用途。有用的參考書是RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，制劑還包含等滲劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，等滲劑選自下組鹽(例如氯化鈉)、糖或糖醇、氨基酸(例如L-甘氨酸、L-組氨酸、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸)、醛醇(例如甘油、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)、或其混合物?？梢允褂萌魏翁?，諸如單糖、二糖、或多糖，或者是水溶性聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支鏈淀粉、糊精、環(huán)糊精、可溶淀粉、羥乙基淀粉、和羧甲基纖維素鈉。在一個實施方案中，糖添加劑是蔗糖。糖醇定義為具有至少一個-OH基團的C4-C8碳氫化合物，包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、衛(wèi)矛醇、木糖醇、和阿拉伯糖醇。在一個實施方案中，糖醇添加劑是甘露醇。可以單獨或聯(lián)合使用上文所述糖或糖醇。對于用量沒有固定的限制，只要糖或糖醇在液體制劑中可溶解，而且對使用本發(fā)明方法實現(xiàn)的穩(wěn)定作用沒有不利影響。在一個實施方案中，糖或糖醇的濃度是約1mg/ml至約150mg/ml。在本發(fā)明的另一個實施方案中，等滲劑的濃度是1mg/ml至50mg/ml。在本發(fā)明的另一個實施方案中，等滲劑的濃度是1mg/ml至7mg/ml。在本發(fā)明的另一個實施方案中，等滲劑的濃度是8mg/ml至24mg/ml。在本發(fā)明的另一個實施方案中，等滲劑的濃度是25mg/ml至50mg/ml。這些具體等滲劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明的一個替換實施方案。技術(shù)人員熟知等滲劑在藥物組合物中的用途。有用的參考書是RemingtonThe Science and Practice ofPharmacy，第19版，1995。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，制劑還包含螯合劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸、和天冬氨酸的鹽及其混合物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，螯合劑的濃度是0.1mg/ml至5mg/ml。在本發(fā)明的另一個實施方案中，螯合劑的濃度是0.1mg/ml至2mg/ml。在本發(fā)明的另一個實施方案中，螯合劑的濃度是2mg/ml至5mg/ml。這些具體螯合劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明的一個替換實施方案。技術(shù)人員熟知螯合劑在藥物組合物中的用途。有用的參考書是RemingtonThe Science and Practice of pharmacy，第19版，1995。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，制劑還包含穩(wěn)定劑。技術(shù)人員熟知穩(wěn)定劑在藥物組合物中的用途。有用的參考書是RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
更具體的說，本發(fā)明的組合物是穩(wěn)定的液體藥物組合物，其治療活性成分包括在以液體藥物制劑的形式貯藏的過程中可能形成聚集體的多肽?！靶纬删奂w”意指多肽分子之間導(dǎo)致寡聚體(可能保持可溶性)或大型可見聚集體(由溶液中沉淀出來)形成的物理相互作用。“貯藏過程中”意指液體藥物組合物或制劑在配制后沒有立即施用于受試者。相反，配制后，將其包裝以便貯藏，采取液體形式、凍結(jié)狀態(tài)、或干燥形式(稍后重構(gòu)成液體形式或適于施用于受試者的其它形式)?！案稍镄问健币庵竿ㄟ^冷凍干燥(即凍干法見例如Williams和Polli，1984，J.Parenteral Sci.Technol.3848-59)、噴霧干燥(見Masters，1991，在Spray-Drying Handbook一書中，第5版，Longman Scientific and Technical，Essez，英國，第491-676頁；Broadhead等，1992，Drug Devel.Ind.Pharm.181169-1206；以及Mumenthaler等，1994，Pharm.Res.1112-20)、或空氣干燥(Carpenter和Crowe，1988，Cryobiology 25459-470；以及Roser，1991，Biopharm.447-53)將液體藥物組合物或制劑干燥。在液體藥物組合物的貯藏過程中由多肽形成聚集體可能對該多肽的生物學(xué)活性產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致藥物組合物的治療功效損失。另外，聚集體的形成可能引起其它問題，諸如在使用輸注系統(tǒng)施用含有多肽的藥物組合物時阻塞管道、膜、或泵。
本發(fā)明的藥物組合物還可以包含其數(shù)量足以減少組合物的貯藏過程中由多肽形成聚集體的氨基酸堿?！鞍被釅A”意指氨基酸或其組合，其中任何給定氨基酸以其游離堿的形式或以其鹽的形式存在。在使用氨基酸組合時，可以是所有氨基酸都以它們游離堿的形式存在，可以是所有氨基酸都以它們鹽的形式存在，或者一些以它們游離堿的形式存在而另一些以它們鹽的形式存在。在一個實施方案中，制備本發(fā)明組合物時使用的氨基酸是攜帶帶電荷側(cè)鏈的氨基酸，諸如精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、和谷氨酸。本發(fā)明的藥物組合物中可以存在特定氨基酸(例如甘氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、咪唑、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸、及其混合物)的任何立體異構(gòu)體(即L、D、或DL異構(gòu)體)或其組合，只要特定氨基酸以其游離堿的形式或其鹽的形式存在。在一個實施方案中，使用L-立體異構(gòu)體。還可以用這些氨基酸的類似物來配制本發(fā)明的組合物?！鞍被犷愃莆铩币庵柑烊淮嬖诎被岬难苌?，它帶來了減少本發(fā)明液體藥物組合物的貯藏過程中由多肽形成聚集體的期望效果。合適的精氨酸類似物包括例如氨基胍、鳥氨酸、和N-單乙基L-精氨酸，合適的甲硫氨酸類似物包括乙硫氨酸和丁硫氨酸(buthionine)，而合適的半胱氨酸類似物包括S-甲基-L-半胱氨酸。對于其它氨基酸，以其游離堿的形式或其鹽的形式在所述組合物中摻入氨基酸類似物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，以足以預(yù)防或延遲蛋白質(zhì)聚集的濃度使用氨基酸或其類似物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，當(dāng)擔(dān)當(dāng)治療劑的多肽是包含至少一個易被氧化的甲硫氨酸殘基的多肽時，可以添加甲硫氨酸(或其它含硫氨基酸或其類似物)來抑制甲硫氨酸殘基氧化變成甲硫氨酸亞砜?！耙种啤币庵讣琢虬彼嵫趸a(chǎn)物隨時間的最小積累。抑制甲硫氨酸氧化導(dǎo)致多肽更持久的保持其正確的分子形式。可以使用甲硫氨酸的任何立體異構(gòu)體(L、D、或DL異構(gòu)體)或其組合。添加的數(shù)量應(yīng)當(dāng)足以抑制甲硫氨酸殘基的氧化，使得甲硫氨酸亞砜的數(shù)量是管理機構(gòu)可以接受的。通常，這意味著組合物包含不超過約10％至約30％的甲硫氨酸亞砜。通常，這可以通過以約1∶1至約1000∶1諸如約10∶1至約100∶1的外加甲硫氨酸對甲硫氨酸殘基的比率添加甲硫氨酸來實現(xiàn)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，制劑還包含選自下組的穩(wěn)定劑高分子量聚合物和低分子化合物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，穩(wěn)定劑選自聚乙二醇(例如PEG3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羥基纖維素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L、和HPMC)、環(huán)糊精、含硫物質(zhì)(如單硫甘油、硫代乙醇酸、和2-甲基硫代乙醇)、和不同的鹽(例如氯化鈉)。這些具體穩(wěn)定劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明的一個替換實施方案。
藥物組合物還可以包含進一步增強其中治療活性多肽的穩(wěn)定性的額外穩(wěn)定劑。本發(fā)明特別感興趣的穩(wěn)定劑包括但不限于保護多肽免于甲硫氨酸氧化的甲硫氨酸和EDTA，以及保護多肽免于凍融或機械剪切相關(guān)的聚集的非離子表面活性劑。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，制劑還包含表面活性劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，表面活性劑選自去污劑、乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇化(polyglycolyzed)甘油酯、乙?；视蛦熙ァ⑸嚼婢厶侵舅狨?、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(例如泊洛沙姆，諸如P1uronicF68、泊洛沙姆188和407、Triton X-100)、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧乙烯和聚乙烯衍生物諸如烷基化和烷氧基化衍生物(吐溫，例如吐溫-20、吐溫-40、吐溫-80、和Brij-35)、甘油單酯或其乙氧基化衍生物、甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物、醇、甘油、凝集素、磷脂(例如磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、二磷脂酰甘油、和鞘磷脂)、磷脂的衍生物(例如二棕櫚酰磷脂酸)和溶血磷脂的衍生物(例如棕櫚酰溶血磷脂酰-L-絲氨酸和乙醇胺、膽堿、絲氨酸、或蘇氨酸的1-?；?sn-甘油-3-磷酸酯)、溶血磷脂酰和磷脂酰膽堿的烷基、烷氧基(烷酯)、烷氧(烷醚)衍生物(例如溶血磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿的月桂酰和肉豆蔻酰衍生物)、極性首基(即膽堿、乙醇胺、磷脂酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘油、肌醇)和帶正電荷的DODAC、DOTMA、DCP、BISHOP的修飾、溶血磷脂酰絲氨酸、溶血磷脂酰蘇氨酸、甘油磷脂(例如腦磷脂)、甘油糖脂(例如吡喃型半乳糖苷)、鞘糖脂(例如神經(jīng)酰胺、神經(jīng)節(jié)苷脂)、十二烷基磷酸膽堿、雞蛋溶血卵磷脂、梭鏈孢酸衍生物(例如牛磺-二氫梭鏈孢酸鈉等)、長鏈脂肪酸及其鹽C6-C12(例如油酸和辛酸)、酰基肉堿及其衍生物、賴氨酸、精氨酸、或組氨酸的Nα-酰化衍生物、賴氨酸或精氨酸的側(cè)鏈?；苌?、包含賴氨酸、精氨酸、或組氨酸與中性或酸性氨基酸的任意組合的二肽的Nα-?；苌?、包含中性氨基酸與兩個帶電荷氨基酸的任意組合的三肽的Nα-?；苌?、DSS(多庫酯鈉，CAS注冊號[577-11-7]；多庫酯鈣，CAS注冊號[128-49-4]；多庫酯鉀，CAS注冊號[7491-09-0])、SDS(十二烷基硫酸鈉或月桂基硫酸鈉)、辛酸鈉、膽酸或其衍生物、膽汁酸及其鹽、甘氨酸或牛磺酸綴合物、烏索脫氧膽酸、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、N-十六烷基-N，N-二甲基-3-銨-1-丙烷磺酸鹽、陰離子單價表面活性劑(烷基-芳基-磺酸鹽)、兩性離子表面活性劑(例如N-烷基-N，N-二甲基銨-1-丙烷磺酸鹽、3-膽酰胺基-1-丙基二甲基銨-1-丙烷磺酸鹽)、陽離子表面活性劑(季銨堿)(例如鯨蠟基-三甲基溴化銨、鯨蠟基吡啶氯化物)、非離子表面活性劑(例如十二烷基β-D-吡喃型葡萄糖苷)、poloxamine(即通過向乙二胺順次添加氧化丙烯和氧化乙烯衍生的四功能嵌段共聚物)(例如Tetronic)，或者表面活性劑可以選自咪唑啉衍生物、或其混合物。這些具體表面活性劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明的一個替換實施方案。
技術(shù)人員熟知表面活性劑在藥物組合物中的用途。有用的參考書是RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
可能的是，本發(fā)明的肽藥物制劑中還存在其它成分。這些其它成分可以包括潤濕劑、乳化劑、抗氧化劑、填充劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、螯合劑、金屬離子、油質(zhì)媒介、蛋白質(zhì)(例如人血清清蛋白、明膠、或蛋白質(zhì))、和兩性離子(例如氨基酸，諸如甜菜堿、?；撬帷⒕彼?、甘氨酸、賴氨酸、和組氨酸)。這些額外成分當(dāng)然不應(yīng)當(dāng)對本發(fā)明藥物制劑的總體穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響。
可以在數(shù)個部位對需要這種治療的患者施用依照本發(fā)明含有IL-21或上文所述任何其它化合物的藥物組合物，例如局部部位(例如皮膚和粘膜部位)、不涉及吸收的部位(例如在動脈、靜脈、心臟中施用)、和涉及吸收的部位(例如在皮膚中、在皮膚下面、在肌肉中、或在腹部施用)。
可以通過數(shù)種施用路徑對需要這種治療的患者施用依照本發(fā)明的藥物組合物，例如舌、舌下、口腔、口中、口服、胃和腸中、鼻、肺(例如通過細支氣管和肺泡或其聯(lián)合)、表皮、皮、透皮、陰道、直腸、眼(例如通過結(jié)膜)、輸尿管、和腸胃外。
可以以數(shù)種劑型來施用本發(fā)明的組合物，例如作為溶液、懸浮液、乳液、微乳液、復(fù)合乳液、泡沫、軟膏、糊劑、膏藥、油膏、片劑、包衣片、洗液、膠囊(例如硬明膠膠囊和軟明膠膠囊)、栓劑、直腸膠囊、滴劑、凝膠、噴霧劑、粉劑、氣霧劑、吸入劑、滴眼液、眼膏、洗眼液、陰道栓、陰道環(huán)、陰道藥膏、注射液、原位轉(zhuǎn)化液(例如原位膠凝、原位安裝、原位沉淀、原位結(jié)晶)、輸液、和植入物。
還可以將本發(fā)明的組合物復(fù)合或附著(例如通過共價、疏水、和靜電相互作用)藥物載體、藥物投遞系統(tǒng)、和高級藥物投遞系統(tǒng)，從而進一步提高IL-21或上文所述任何其它化合物的穩(wěn)定性、提高生物利用度、提高溶解度、降低不利作用、實現(xiàn)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的計時療法、和提高患者依從性或其任何組合。載體、藥物投遞系統(tǒng)、和高級藥物投遞系統(tǒng)的實例包括但不限于聚合物(例如纖維素及其衍生物)、多糖(例如葡聚糖及其衍生物、淀粉及其衍生物)、聚乙烯醇、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、載體蛋白(例如清蛋白)、凝膠(例如熱膠凝系統(tǒng)，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的嵌段共聚合系統(tǒng))、膠束、脂質(zhì)體、微球體、納米顆粒、液晶及其分散體、L2相及其分散體(本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知它在脂-水體系中的相特性)、聚合膠束、復(fù)合乳液、自身乳化、自身微乳化、環(huán)糊精及其衍生物、以及樹狀分子。
本發(fā)明的組合物可用于配制用于肺部施用IL-21或上文所述任何其它化合物的固體、半固體、粉末、和溶液，例如使用計量藥劑吸入器、干粉吸入器、和噴霧器，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的裝置。
本發(fā)明的組合物具體可用于配制受控、持續(xù)、延長、延遲、和緩慢釋放藥物投遞系統(tǒng)。更具體的說，而非限制，組合物可用于配制本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的腸胃外受控釋放和持續(xù)釋放系統(tǒng)(這兩種系統(tǒng)都導(dǎo)致施用次數(shù)減少許多倍)。甚至更優(yōu)選的是皮下施用的受控釋放和持續(xù)釋放系統(tǒng)。并非限制本發(fā)明的范圍，有用的受控釋放系統(tǒng)和組合物的實例是水凝膠、油質(zhì)凝膠、液晶、聚合膠束、微球體、納米顆粒。
用于生產(chǎn)對本發(fā)明組合物有用的受控釋放系統(tǒng)的方法包括但不限于結(jié)晶、濃縮、共結(jié)晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高壓勻漿、封裝、噴霧干燥、微囊化、凝聚、相分離、溶劑蒸發(fā)以生成微球體、擠壓、和超臨界流體方法。一般參考書有Handbook of PharmaceuticalControlled Release，Wise，D.L.編，Marcel Dekker，紐約，2000；以及Drug and the Pharmaceutical Sciences，第99卷，ProteinFormulation and Delivery，MacNally，E.J.編，Marcel Dekker，紐約，2000。
可以借助注射器(任選筆樣注射器)的手段通過皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、或靜脈內(nèi)注射進行腸胃外施用?；蛘?，可以通過輸液泵的手段進行腸胃外施用。另一種選擇是這樣的組合物，它可以是以鼻或肺噴霧的形式施用IL-21或上文所述任何其它化合物的溶液或懸浮液。還有一種選擇是，可以使含有IL-21或上文所述任何其它化合物的藥物組合物適用于透皮施用(例如通過無針注射或貼劑，任選離子電滲貼劑)或經(jīng)粘膜施用(例如口含)。
術(shù)語“穩(wěn)定的制劑”指物理穩(wěn)定性提高、化學(xué)穩(wěn)定性提高、或物理和化學(xué)穩(wěn)定性提高的制劑。
術(shù)語“物理穩(wěn)定性”在本文中用于蛋白質(zhì)制劑時指作為蛋白質(zhì)暴露于熱-機械壓力和/或與去穩(wěn)定的界面和表面(諸如疏水表面和界面)相互作用的結(jié)果，蛋白質(zhì)形成生物學(xué)無活性和/或不溶性的蛋白質(zhì)聚集體的趨勢?？梢酝ㄟ^如下手段評估水性蛋白質(zhì)制劑的物理穩(wěn)定性將裝入合適的容器(例如藥筒或藥瓶)的制劑在不同溫度下暴露于機械/物理壓力(例如攪動)達不同時間段后進行視覺檢查和/或混濁度測量。對制劑的視覺檢查是在黑暗背景下在強烈聚焦燈光下進行的。制劑的混濁度表現(xiàn)為將混濁程度分級的視覺評分，例如由0至3的等級(不顯示混濁的制劑對應(yīng)于視覺評分0，而在日光中顯示可見混濁的制劑對應(yīng)于視覺評分3)。當(dāng)制劑在日光下顯示可見混濁時，將其歸類為在蛋白質(zhì)聚集方面是物理不穩(wěn)定的?；蛘撸梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的簡單的混濁度測量方法來評估制劑的混濁度。還可以使用蛋白質(zhì)構(gòu)象狀態(tài)的光譜試劑或探針來評估水性蛋白質(zhì)制劑的物理穩(wěn)定性。探針優(yōu)選優(yōu)先與蛋白質(zhì)的非天然構(gòu)象異構(gòu)體結(jié)合的小分子。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的小分子光譜探針的一個實例是硫磺素(Thioflavin)T。硫磺素T是廣泛用于檢測淀粉樣纖絲的熒光染料。在存在纖絲以及可能有其它蛋白質(zhì)構(gòu)型時，硫磺素T在與纖絲蛋白質(zhì)形式結(jié)合后在約450nm處產(chǎn)生新的最大激發(fā)并在約482nm處產(chǎn)生增強的發(fā)射。未結(jié)合的硫磺素T在這些波長基本沒有熒光。
其它小分子可以用作由天然狀態(tài)變成非天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的探針，例如優(yōu)先與蛋白質(zhì)暴露的疏水斑結(jié)合的“疏水斑”探針。疏水斑通常埋藏在處于其天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)之中，但是在蛋白質(zhì)開始去折疊或變性時成為暴露的。這些小分子光譜探針的實例是芳香族、疏水性染料，諸如antrhacene、吖啶、菲咯啉、諸如此類。其它光譜探針有金屬-氨基酸復(fù)合物，諸如疏水氨基酸(諸如苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、和纈氨酸等等)的鈷金屬復(fù)合物。
術(shù)語“化學(xué)穩(wěn)定性”在本文中用于蛋白質(zhì)制劑時指蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中導(dǎo)致化學(xué)降解產(chǎn)物形成的化學(xué)共價變化，與天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相比所述化學(xué)降解產(chǎn)物的生物學(xué)效力可能降低和/或免疫原性可能升高。根據(jù)天然蛋白質(zhì)的類型和本質(zhì)以及蛋白質(zhì)所暴露的環(huán)境，可能形成多種化學(xué)降解產(chǎn)物。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，幾乎不可能完全避免或消除化學(xué)降解，而且在蛋白質(zhì)制劑的貯藏和使用過程中常常看到化學(xué)降解產(chǎn)物的數(shù)量增加。大多數(shù)蛋白質(zhì)傾向于脫酰胺，在這個過程中谷氨酰胺?；蛱於０孵埢膫?cè)鏈酰胺基團水解而形成游離的羧酸。其它降解途徑涉及高分子量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的形成，其中兩個或多個蛋白質(zhì)分子通過轉(zhuǎn)酰胺基作用和/或二硫鍵作用彼此共價結(jié)合，導(dǎo)致共價結(jié)合二聚體、寡聚體、和多聚體降解產(chǎn)物的形成(Stability of ProteinPharmaceuticals，Ahern T.J.和Manning M.C.，Plenum出版社，紐約，1992)。(例如甲硫氨酸殘基的)氧化是化學(xué)降解的另一種變型?？梢酝ㄟ^在暴露于不同環(huán)境條件后的多個時間點測量化學(xué)降解產(chǎn)物的數(shù)量來評估蛋白質(zhì)制劑的化學(xué)穩(wěn)定性(常常可以通過例如提高溫度來加速降解產(chǎn)物的形成)。常常通過根據(jù)分子量和/或電荷使用多種層析技術(shù)(例如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)分離降解產(chǎn)物來測定每一種降解產(chǎn)物的數(shù)量。
因此，如上所述，“穩(wěn)定的制劑”指物理穩(wěn)定性提高、化學(xué)穩(wěn)定性提高、或物理和化學(xué)穩(wěn)定性提高的制劑。一般而言，制劑在使用和貯藏過程中必需是穩(wěn)定的(依照推薦的使用和貯藏條件)，直至有效期滿。
實施例如WO 04/55168中所述，在大腸桿菌中以包涵體的形式表達具有N端延伸的重組白介素21(IL21)(Met-Ser-hIL21)。通過大腸桿菌中存在的蛋白酶系統(tǒng)切除N末端Met殘基，剩下Ser-hIL21。可以含有或不含Glu-Ala-Glu氨基酸序列。
使蛋白質(zhì)重折疊，并使用傳統(tǒng)層析法將其純化至90-95％純度。
然后將純的蛋白質(zhì)N端PEG化，即通過與高碘酸鈉反應(yīng)將N末端絲氨酸氧化，隨后與附著了羥胺的PEG衍生物反應(yīng)產(chǎn)生肟。
使用凝膠過濾或大小排阻層析(SEC)進行后續(xù)純化。
在增殖測定法中，例如下文所述BAF3測定法，PEG化IL21與未PEG化標(biāo)準(zhǔn)物是等效的，指示PEG化并未干擾受體的結(jié)合，而且反應(yīng)流程對蛋白質(zhì)無害。
預(yù)備性實施例可以與上文所述將化學(xué)部分(moiety)附著到其它肽或蛋白質(zhì)上的方法類似的執(zhí)行將PEG部分(moiety)附著到IL-21衍生物C末端的方法。
可以通過兩步法將PEG部分(moiety)附著到IL-21或其衍生物(諸如例如hIL-21)的C末端。
第一步，在合適緩沖液(諸如HEPES/TMEDA緩沖液)中，在合適的pH(諸如例如pH7.5或pH8)，在合適的溫度(諸如例如室溫、30℃、或35℃)，在存在合適親核體(例如(S)-2-氨基-3-(4-(炔丙基氧)苯基)丙酸)的條件下，對合適的IL-21類似物(諸如例如(hIL-21基)丙氨酸)進行由羧肽酶Y(CPY)催化的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。
第二步，可以將合適的衍生化PEG試劑與(S)-2-((hIL-21基)氨基)-3-(4-(炔丙基氧)苯基)丙酰胺反應(yīng)。例如，可以在氧化條件(諸如例如次氯酸鈉溶液)下將過量的4-(mPEG20000基)-N-(3-(羥基亞氨基)芐基)丁酰胺反應(yīng)成為4-(mPEG20000基)-N-(3-(氧氰基)芐基丁酰胺?？梢詫?-(mPEG20000基)-N-(3-(氧氰基)芐基丁酰胺溶液加到(S)-2-((hIL-21基)氨基)-3-(4-(炔丙基氧)苯基)丙酰胺溶液中以產(chǎn)生(S)-2-((hIL-21基)氨基)-3-(4-((3-(3-((4-(mPEG20000基)丁?；被?甲基)苯基)異噁唑-5-基)甲氧基)苯基)丙酰胺。
4-(mPEG20000基)-N-(3-(羥基亞氨基)芐基)丁酰胺可以由商品化的3-((叔丁氧基羰基氨基)甲基)苯甲酸制備，可以例如在兩步流程中用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的合適的試劑或試劑組合將其還原，第一步包括在存在堿(諸如例如三乙胺)的條件下加入氯甲酸乙酯，通過過濾除去形成的氯化三乙基銨，并加入硼氫化鋰以產(chǎn)生叔丁基N-(3-(羥基甲基)芐基)氨基甲酸酯?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員知道的合適的試劑或試劑組合(例如使用Swern氧化)將叔丁基N-(3-(羥基甲基)芐基)氨基甲酸酯氧化，包括將醇在例如二氯甲烷中的-78℃溶液加到草酰氯與二甲亞砜在二氯甲烷中的-78℃混合液中，隨后加入合適的氨基堿(諸如例如三乙胺)并升溫至室溫?？梢詫⑿纬傻氖宥』鵑-(3-甲?；S基)氨基甲酸酯與羥胺的游離堿或其合適的鹽在例如氫氧化鈉的水溶液中反應(yīng)以產(chǎn)生叔丁基N-(3-((羥基亞氨基)甲基)芐基)?？梢酝ㄟ^文獻(例如T.W.Green、P.G.M.Wuts，Protective groups in organicsynthesis，第2版，Wiley，紐約，1991)中描述的方法由叔丁基N-(3-((羥基亞氨基)甲基)芐基)除去BOC保護基團，例如用三氟乙酸在二氯甲烷中的50％溶液進行處理以產(chǎn)生3-(氨基甲基)苯甲醛肟。最后，可以通過酰胺形成反應(yīng)來制備4-(mPEG20000基)-N-(3-(羥基亞氨基)芐基)丁酰胺，包括在存在過量的合適的堿(諸如例如乙基二異丙胺)的條件下將3-(氨基甲基)苯甲醛肟的游離堿或其合適的鹽與商業(yè)性2，5-二氧吡咯烷基4-(mPEG20000基)丁酸酯(Nektar，2M450P01)進行反應(yīng)。
在可供選擇的第二步中，可以在用2，6-盧剔啶緩沖的水中制備適當(dāng)量的五水合硫酸銅(例如5％或10％或相對于(S)-2-((hIL-21基)氨基)-3-(4-(炔丙基氧)苯基)丙酰胺的1個當(dāng)量或10個當(dāng)量)和適當(dāng)量的L-抗壞血酸(諸如相對于(S)-2-((hIL-21基)氨基)-3-(4-(炔丙基氧)苯基)丙酰胺的50當(dāng)量)的混合物。適當(dāng)時間(諸如5分鐘)后，可以將此溶液加到用2，6-盧剔啶緩沖的(S)-2-((hIL-21基)氨基)-3-(4-(炔丙基氧)苯基)丙酰胺和N-(2-(mPEG20000基)乙基)11-疊氮十一酰胺的溶液中?？梢詫⒎磻?yīng)混合液保持在適當(dāng)?shù)臏囟?諸如例如室溫)直至可能形成了選自(S)-((hIL-21)氨基)-3-(4-((1-(10-(N-(2-(mPEG20000基)乙基)氨基甲?；?癸基)-1，2，3-三唑-4-基)甲氧基)苯基)和(S)-((hIL-21)氨基)-3-(4-((1-(10-(N-(2-(mPEG20000基)乙基)氨基甲?；?癸基)-1，2，3-三唑-5-基)甲氧基)苯基)的單一化合物與？的混合物。
N-(2-(mPEG20000基)乙基)11-疊氮十一酰胺的合成可以通過商業(yè)性甲基11-溴十一酸酯與疊氮化鈉在適當(dāng)溶劑(諸如例如N，N-二甲基甲酰胺)中在適當(dāng)溫度(例如60℃)的反應(yīng)來進行?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的和文獻(例如T.W.Green、P.G.M.Wuts，Protectivegroups in organic synthesis，第2版，Wiley，紐約，1991)中描述的方法將形成的甲基11-疊氮十一酸酯皂化，諸如例如甲醇中的氫氧化鉀或四氫呋喃中的三乙基硅烷醇鉀?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法將由此產(chǎn)生的酸活化，例如與2-琥珀酰亞胺基-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽(TSTu)在合適的溶劑(諸如例如N，N-二甲基甲酰胺)中在合適的溫度(諸如例如室溫)反應(yīng)以產(chǎn)生11-疊氮-N-2，5-二氧吡咯烷-1-基十一酰胺?？梢詫?1-疊氮-N-2，5-二氧吡咯烷-1-基十一酰胺與商業(yè)性(2-(mPEG20000基)乙基)胺(Nektar，2M2U0P01)在合適的溶劑(諸如例如二氯甲烷)中在存在合適的堿(諸如例如三乙胺或乙基二異丙胺)的條件下反應(yīng)以產(chǎn)生N-(2-(mPEG20000基)乙基)11-疊氮十一酰胺。
實施例1-(((((4-((4-(mPEG-20000基)丁?；?氨基)丁氧亞氨基乙酰基)絲氨酰)谷氨酰)丙氨酰)谷氨酰)hIL-21第一步2-(4-(叔丁氧基羰基氨氧基)丁基)異吲哚-1，3-二酮
向商業(yè)性N-(4-溴丁基)苯鄰二甲酰亞胺(2.82g，10mmol)和N-Boc-羥胺(2.08g，15.6mmol)的混合物中加入乙腈(2ml)，接著加入1，8-二氮二環(huán)[5.4.0]十一-7-烯(2.25ml，15mmol)。將反應(yīng)混合物于室溫攪動30分鐘，然后于50℃攪動2天。用水(30ml)和1N鹽酸(20ml)的混合液進行稀釋。用乙酸乙酯(2×100ml)進行萃取。用鹽水(50ml)清洗有機相，并用硫酸鎂干燥。通過層析用二氧化硅(60g)純化粗制的產(chǎn)品，使用庚烷/乙酸乙酯1∶0至0∶1梯度作為洗脫液，得到2.08g2-(4-(叔丁氧基羰基氨氧基)丁基)異吲哚-1，3-二酮。
第二步N-(4-氨基丁氧基)氨基甲酸叔丁酯 將水合肼(1.0ml，20mmol)加到2-(4-(叔丁氧基羰基氨氧基)丁基)異吲哚-1，3-二酮(2.08g，6.22mmol)在乙醇(8.0ml)中的溶液中。將反應(yīng)混合物于80℃攪動65小時。真空除去溶劑。將殘余物溶于甲苯(10ml)，并真空除去溶劑。將殘余物懸浮于1N鹽酸(10ml)。通過過濾除去沉淀，并用水(2ml)清洗。將濾出液和清洗液合并，并用碳酸鉀調(diào)至堿性。用二氯甲烷(4×20ml)萃取該溶液。用硫酸鎂干燥有機相。真空除去溶劑，得到0.39g N-(4-氨基丁氧基)氨基甲酸叔丁酯。將碳酸鉀(3g)加到水相中，并用二氯甲烷(3×20ml)進行萃取。將有機層合并，并用硫酸鎂干燥。真空除去溶劑，又得到0.39gN-(4-氨基丁氧基)氨基甲酸叔丁酯。
第三步N-(4-(4-(mPEG20000基)丁?；被?丁氧基)氨基甲酸叔丁酯
將商業(yè)性mPEG2000基丁酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯(Nektar，“mPEG-SBA”，#2M450P01，3g，0.15mmol)溶于二氯甲烷(25ml)。添加N-(4-氨基丁氧基)氨基甲酸叔丁酯(0.12g，0.59mmol)。將反應(yīng)混合物于室溫搖動。添加乙醚直至得到沉淀。通過過濾分離沉淀。將該材料真空干燥，得到2.39g N-(4-(4-(mPEG20000基)丁?；被?丁氧基)氨基甲酸叔丁酯。
第四步N-(4-氨氧基丁基)-4-(mPEG20000基)丁酰胺 將三氟乙酸(20ml)加到N-(4-(4-(mPEG20000基)丁酰基氨基)丁氧基)氨基甲酸叔丁酯(2.39g，0.12mmol)在二氯甲烷(20ml)中的溶液中。將反應(yīng)混合物搖動30分鐘。添加乙醚(100ml)。通過過濾分離形成的沉淀。用乙醚(2×100ml)進行清洗，并真空干燥，得到1.96gN-(4-氨氧基丁基)-4-(mPEG20000基)丁酰胺。
第五步將1-((((絲氨酰)谷氨酰)丙氨酰)谷氨酰)hIL-21(4mg，在磷酸鹽緩沖液中凍干，252nmol)溶于0.400ml緩沖液，該緩沖液由三乙醇胺(0.008ml)和水(4ml)構(gòu)成。連續(xù)添加甲硫氨酸(3.15mg，21420nmol)的水溶液(0.12ml)和高碘酸鈉溶液(0.38mg，1890nmol)。將反應(yīng)混合物于室溫靜置30分鐘。添加N-(4-氨氧基丁基)-4-(mPEG20000基)丁酰胺(77mg，3780nmol)的水溶液(0.240ml)。用冰乙酸(0.004ml)將pH調(diào)至pH4-5。將反應(yīng)混合物于室溫靜置16小時。將反應(yīng)混合液用三乙醇胺(12mg)的水溶液(3.2ml)進行稀釋，并保存于-18℃直至純化。
蛋白質(zhì)化學(xué)在大腸桿菌中以包涵體的形式表達具有N端延伸的重組白介素21(IL21)(Met-Ser-Glu-Ala-Glu-hIL21)。通過大腸桿菌中存在的蛋白酶系統(tǒng)切除N末端Met殘基，剩下Ser-Glu-Ala-Glu-hIL21?？梢院谢虿缓珿lu-Ala-Glu氨基酸序列(我們用Met-Ser-hIL21開始實驗)。
使蛋白質(zhì)重折疊，并使用常規(guī)的層析法將其純化至90-95％純度。
然后通過步驟1-5中描述的反應(yīng)將純的蛋白質(zhì)N端PEG化。
使用凝膠過濾或大小排阻層析(SEC)進行后續(xù)純化。
在增殖測定法中，PEG化IL21顯示與未PEG化標(biāo)準(zhǔn)物相似的效力，指示PEG化并未干擾受體的結(jié)合，而且反應(yīng)流程對蛋白質(zhì)無害。
藥理學(xué)方法使用Baf-3(IL21R)細胞的增殖測定法在含IL-3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)鼠源或人源IL21R轉(zhuǎn)染的IL-3依賴性Baf-3細胞，直至進行增殖測定法(優(yōu)選3天)。
用不含IL-3的培養(yǎng)基清洗用于實驗的細胞，并在測定培養(yǎng)基(不含IL-3)中以50.000c/w分到96孔板中。以10-7M至10-13M的系列稀釋度添加IL-21，并將細胞于37℃、5％CO2進行孵育。培養(yǎng)66小時后向所有孔中加入alamarBlue(Biosource)，并將細胞繼續(xù)培養(yǎng)6小時。若細胞生長，則alamarBlue減少，培養(yǎng)基的顏色由藍變紅。然后在Fluostar(bmg)上讀取550nm(激發(fā))和590nm(發(fā)射)的值，并用Prism(GrafPad software)進行分析。
Baf-3細胞的參考文獻Palacios，R.和Steinmetz，M.，1985，Cell 41727-734。
在小鼠中進行的PEG-hIL-21 PK研究的描述這項實驗是對小鼠靜脈內(nèi)和皮下施用單個劑量的PEG20K-hIL-21、PEG40K-hIL-21、和hIL-21，以獲得PEG-hIL-21的生物利用度和藥動學(xué)特征。
材料和方法實驗中包括48只體重大約25g的雌性C57BL/6Jbom(來自Bomholtgrd，Ry，丹麥)。
研究過程中將依照動物單位中的標(biāo)準(zhǔn)程序(標(biāo)準(zhǔn)操作流程編號010364)飼養(yǎng)和操作動物，而且允許其自由獲取飼料和飲水。
測試制劑hIL-21、PEG20k-hIL-21、和PEG40k-hIL-21的濃度是200μg/ml。將測試物溶于pH7.4的PBS緩沖液。
給藥如下給藥測試物20μg/25g小鼠，對應(yīng)于0.8μg/g小鼠體重。
靜脈內(nèi)注射在尾靜脈進行，體積0.1ml。
皮下注射在頸后進行，體積0.1ml。
血樣如下采集血樣靜脈內(nèi)注射后服藥前以及服藥后5、10、20、30、45分鐘，1、1.5、2、4、和6小時。
皮下注射后服藥前以及服藥后10、30分鐘、1、1.5、2、3、4、6、8、和24小時。
由眼眶靜脈叢采集血樣。每個采樣時間采集大約0.1-0.2ml血液。每只動物采集三次血樣。每個時間點由兩只動物采集血樣。
將血樣收集在Micronic試管中，而且在離心(1200mxg，4℃，10分鐘)前在冰上保存最多20分鐘。
離心后立即將25μl血漿樣品轉(zhuǎn)移到Micronic管中，并保存于-20℃直至分析。
測定通過特定的免疫測定法(Immunochemistry，Novo Nordisk A/S)對血漿樣品分析hIL-21含量。
通過非房室和房室藥動學(xué)方法分析血漿濃度-時間曲線。
權(quán)利要求
1.包含聚合分子或親脂性衍生物的IL-21或其變體的衍生物。
2.權(quán)利要求1的衍生物，其中聚合分子是一個或多個PEG基團。
3.權(quán)利要求2的衍生物，其中聚合分子是一個或多個PEG基團，它們的分子量為5kDa、10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、或60kDa且可以是線性的或分支的。
4.依照任一上述權(quán)利要求的IL-21或其變體的衍生物，其在N末端包含衍生化。
5.依照權(quán)利要求1-3任一項的IL-21或其變體的衍生物，其在C末端包含衍生化。
6.依照權(quán)利要求1-3任一項的IL-21或其變體的衍生物，其在肽的內(nèi)部包含衍生化。
7.依照任一上述權(quán)利要求的IL-21的衍生物，其中衍生化位于天然存在的氨基酸。
8.依照權(quán)利要求1-6任一項的IL-21變體的衍生物，其中衍生化位于添加入或替代入天然IL-21序列中的氨基酸。
9.在N末端添加了含Ser、Tyr、Lys、或Cys且具有1-10個氨基酸的序列的IL-21變體。
10.變體Ser-hIL21。
11.表達變體Ser-hIL-21的分離的DNA。
12.變體Ser-hIL-21用于與聚合分子進行衍生化作用的用途。
13.IL-21或其變體的衍生物用于制造治療癌癥或感染的藥物的用途。
14.通過施用有效量的依照權(quán)利要求1-8任一項的IL-21或其變體的衍生物來治療癌癥或感染性疾病的方法。
全文摘要
本發(fā)明提供了IL－21或其變體的衍生物。
文檔編號C12P21/02GK1867581SQ200480029663
公開日2006年11月22日 申請日期2004年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月10日
發(fā)明者B·派施克, C·B·肖德特, H·沃爾迪克, F·Z·多沃爾德, A·沃索 申請人:諾沃挪第克公司