欧美在线观看视频网站,亚洲熟妇色自偷自拍另类,啪啪伊人网,中文字幕第13亚洲另类,中文成人久久久久影院免费观看 ,精品人妻人人做人人爽,亚洲a视频

不含運(yùn)鐵蛋白的低鐵培養(yǎng)基中的骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)的制作方法

文檔序號(hào):426638閱讀:948來源:國知局
專利名稱:不含運(yùn)鐵蛋白的低鐵培養(yǎng)基中的骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及在含鐵但不含運(yùn)鐵蛋白或親脂性或合成的含氮螯合劑的培養(yǎng)基中生長某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)
細(xì)胞培養(yǎng)基必須提供使細(xì)胞在一種可控的人造的體外環(huán)境中維持并生長的必要營養(yǎng)物。細(xì)胞培養(yǎng)基的特性很大程度上取決于被培養(yǎng)的細(xì)胞類型而較少程度上取決于培養(yǎng)的方法。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長絕對(duì)需要鐵,在體外,鐵是由細(xì)胞培養(yǎng)基提供的。Bertheussen(Cytotechnology 11219-231,1993)提出向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加簡單鐵鹽不能有效的向哺乳動(dòng)物細(xì)胞提供鐵,主要是因?yàn)殍F的快速氧化和沉淀降低了細(xì)胞對(duì)鐵的利用率。
此外,游離態(tài)的鐵具有很高的氧化勢(shì)能,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)基中的成分氧化。經(jīng)證明,這有利于使鐵形成復(fù)合物從而降低或消除這種氧化勢(shì)能。
在體內(nèi),鐵通過鐵結(jié)合蛋白運(yùn)鐵蛋白而呈遞到哺乳動(dòng)物細(xì)胞。運(yùn)鐵蛋白可以通過結(jié)合鐵并與細(xì)胞表面的運(yùn)鐵蛋白受體相互作用來起作用。然后運(yùn)鐵蛋白-鐵復(fù)合物通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞以后,運(yùn)鐵蛋白-鐵復(fù)合物就發(fā)生解離,釋放出來的鐵又與鐵運(yùn)輸?shù)鞍?鐵蛋白)復(fù)合。運(yùn)鐵蛋白再次循環(huán)。Thorstensen和Romslo,Biochem.J.,2711-10(1990)對(duì)這種體內(nèi)的轉(zhuǎn)鐵機(jī)制進(jìn)行過很好的綜述。運(yùn)鐵蛋白的這種介導(dǎo)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞的能力已經(jīng)被應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng),即向細(xì)胞培養(yǎng)基中簡單的加入運(yùn)鐵蛋白和鐵鹽。
然而,通常用于細(xì)胞培養(yǎng)基的運(yùn)鐵蛋白是動(dòng)物來源的,而近年來在細(xì)胞培養(yǎng)方法中除去動(dòng)物來源的蛋白的調(diào)節(jié)壓力(regulatory pressure)已經(jīng)增加。使用動(dòng)物來源的蛋白無疑存在引入污染物和外來的病原體的危險(xiǎn),例如克雅病(Creutzfeld-Jakob disease(CJD))或是海綿狀腦病(瘋牛病)。因此,尋找并應(yīng)用替代運(yùn)鐵蛋白的其他鐵運(yùn)輸物取得了不同程度的成功。其他替代的鐵運(yùn)輸物的種類和使用濃度通常取決于所培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型。
Kovar和Franek(Biotechnology Letters 9259-264(1987))證明了多種可溶性的鐵化合物(ferric compound)例如檸檬酸鐵可以代替運(yùn)鐵蛋白用于雜交瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)。Kovar和Franek實(shí)驗(yàn)了5μM(1.25mg/L)到5mM(1225mg/L)的濃度范圍的檸檬酸鐵支持兩種雜交瘤細(xì)胞系生長的能力。雖然以前的現(xiàn)有技術(shù)提到較低濃度的鐵化合物適用于幾種不同細(xì)胞系的培養(yǎng)基(特別是人的白血病或上皮來源的細(xì)胞系),但是Kovar和Franek報(bào)道如果使用檸檬酸鐵要與運(yùn)鐵蛋白同樣地來支持雜交瘤細(xì)胞生長,需要檸檬酸鐵濃度為500μM(122.5mg/L)。Kovar和Franek發(fā)現(xiàn)含有500μM檸檬酸鐵的培養(yǎng)基適合于培養(yǎng)其他的雜交瘤細(xì)胞系并且同樣適合于培養(yǎng)幾種類型的骨髓瘤細(xì)胞。
Eto等(Agric.Biol.Chem.55(3)863-865(1991))報(bào)道了與Kovar和Franek相似的發(fā)現(xiàn)。這些研究者實(shí)驗(yàn)了10mg/L到600mg/L的濃度范圍的檸檬酸鐵對(duì)雜交瘤細(xì)胞系的生長刺激作用。他們報(bào)道說在進(jìn)一步的研究中可以用300mg/L濃度的檸檬酸鐵。在含有300mg/L的檸檬酸鐵的培養(yǎng)基中加入濃度10μM的乙醇胺(脂質(zhì)前體)可以達(dá)到和使用運(yùn)鐵蛋白同樣的生長效果。
在一個(gè)相似的研究中,Toyoda和Inouye(Agric.Biol.Chem.55(6)1631-1633(1991))試驗(yàn)了三種雜交瘤細(xì)胞系在含有0到500μM的濃度范圍的檸檬酸鐵的培養(yǎng)基中的生長。他們報(bào)道,對(duì)于被試三種雜交瘤細(xì)胞系中的兩種,50μM(12.5mg/L)的檸檬酸鐵是最佳的。這個(gè)結(jié)果和Eto等人,以及Kovar和Franek的發(fā)現(xiàn)相反,雖然濃度500μM對(duì)于第三種細(xì)胞系是最佳的。
但是,值得注意的是Kovar和Franek,Toyoda和Inouye,Eto等人的研究都是在靜置培養(yǎng)中進(jìn)行的。WO 94/02592報(bào)道說雖然10mg/L的檸檬酸鐵銨(FAC)能夠支持雜交瘤在靜置培養(yǎng)中生長,但是對(duì)于攪拌型懸浮培養(yǎng)則不能。因此,顯然在攪拌型懸浮培養(yǎng)和在靜止培養(yǎng)中生長的雜交瘤細(xì)胞最佳利用鐵的能力是不同的。
WO 93/00423描述了一種培養(yǎng)基添加劑,它額外包含可溶性鐵鹽和堿金屬或堿土金屬的檸檬酸鹽的鐵螯合物,這是對(duì)于不含蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基的不含血清的合適鐵源。該申請(qǐng)的實(shí)施例主要是針對(duì)如BHK和CHO細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長。雖然實(shí)施例5證明了雜交瘤細(xì)胞的生長,但是值得注意的是所用到的SP2/0細(xì)胞實(shí)際上是一種非分泌型的小鼠/小鼠雜交瘤細(xì)胞。整個(gè)培養(yǎng)條件指明是靜置懸浮培養(yǎng)。
Kovar和Franek聲稱他們的含有500μM檸檬酸鐵的培養(yǎng)基適合于攪拌型懸浮培養(yǎng),但卻沒有提供支持該主張的證據(jù)。然而,Qi等(Cytotechnology2195-109(1996))報(bào)道,Kovar和Franek所描述的含有500μM(122.5mg/L)檸檬酸鐵的培養(yǎng)基適合于在攪拌型懸浮培養(yǎng)物中培養(yǎng)三種雜交瘤細(xì)胞系。但是Qi等發(fā)現(xiàn)為了使用含有這些高濃度的檸檬酸鐵(500μM)的培養(yǎng)基,必須使得在這種培養(yǎng)基上細(xì)胞戒斷(wean);對(duì)于一種細(xì)胞系這個(gè)戒斷過程會(huì)拖得非常的長。Qi等指出在這種情況下細(xì)胞經(jīng)歷了很艱難的適應(yīng)過程,并且可以通過使用更高效的呈遞鐵的化合物例如金精三羧酸(aurin tricarboxlic acid)替代檸檬酸鐵來改進(jìn)培養(yǎng)基的配方。
與Kovar和Franek(1987)引用的現(xiàn)有技術(shù)相一致,一些研究者報(bào)道已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些種類的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在使用較低濃度的鐵化合物的培養(yǎng)中是穩(wěn)定的。
Ramos等在WO92/05246中報(bào)道,在上皮細(xì)胞株和特別在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系的培養(yǎng)中,可以用10-100mg/L的檸檬酸鐵(提供約0.6-16mg/L的鐵)來替代運(yùn)鐵蛋白。但是這項(xiàng)專利申請(qǐng)清楚地指出這種培養(yǎng)基不適合于培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞系。Keen等在US 5,633,162中報(bào)道,在培養(yǎng)CHO細(xì)胞時(shí),可以用濃度0.25-5mg/L的檸檬酸鐵、硫酸亞鐵、和檸檬酸鐵銨(FAC)(相當(dāng)于0.04到0.8mg/L的鐵)來替代運(yùn)鐵蛋白。
WO 98/08934限定了一種替代培養(yǎng)基,其中所有的動(dòng)物蛋白,即運(yùn)鐵蛋白和胰島素都被替代了。運(yùn)鐵蛋白被與含氮螯合化合物螯合的硫酸亞鐵替代,所述硫酸亞鐵的濃度按照鐵是在0.28到11mg/L之間,其中1.1mg/L為最優(yōu)的。適合的所述含氮螯合化合物包括乙二胺四乙酸(EDTA),乙二醇-雙(β-氨基乙醚)-N,N,N’,N’四乙酸(EGTA),甲磺酰排鐵劑(desferoxaminemesylate),二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)和反式-1,2-二胺環(huán)己烷-N,N,N’,N’四乙酸(CDTA)。其中EDTA是最優(yōu)選的。檸檬酸鐵也以FeCl3-檸檬酸鈉的形式使用,但是需要比硫酸亞鐵·7H2O-EDTA螯化物更高的濃度。
這項(xiàng)申請(qǐng)認(rèn)為不含運(yùn)鐵蛋白的培養(yǎng)基適合用于生長哺乳動(dòng)物細(xì)胞,特別是上皮或是成纖維細(xì)胞。已經(jīng)提供了CHO和人胚胎腎細(xì)胞系293的生長實(shí)例。
Neumannoca等(In vitro Cell Dev.Biol.,31625-632(1995))同樣實(shí)驗(yàn)了一定范圍的細(xì)胞種類在含有呈低濃度1.25mg/L的檸檬酸鐵形式的鐵(約0.2mg/L鐵)的培養(yǎng)基中的長期培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)的19種細(xì)胞系中,只有5種能夠在這種低鐵培養(yǎng)基中長期生長。這5種細(xì)胞系是Jurkat、J111、和THP-1(人白血病細(xì)胞系)、HeLa(人的上皮細(xì)胞系)和XC(大鼠肉瘤)。雖然在被試的那些中包括雜交瘤和骨髓瘤細(xì)胞系,但發(fā)現(xiàn)它們均不能在低鐵的培養(yǎng)基中生長。
根據(jù)上面的討論,較低濃度的鐵化合物適合用于某些類型細(xì)胞的培養(yǎng)基(特別是那些上皮和人白血病來源的細(xì)胞)。但是,本領(lǐng)域通常認(rèn)同,為了在用不含運(yùn)鐵蛋白的培養(yǎng)基的攪拌型懸浮培養(yǎng)中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞,需要高濃度的(例如在122.5mg/L范圍)的鐵化合物。
但是現(xiàn)有技術(shù)也表明高濃度的鐵是不利的。Bertheusse在Cytotechnology 11219-231(1993)中指出不宜使用高濃度的鐵,例如Kovar和Franek建議的500μM的檸檬酸鐵,因?yàn)檫@種高濃度會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基中氫氧化鐵的快速沉淀。新形成的氫氧化鐵能夠有效地吸收其他金屬和各種有機(jī)分子,從而使得這種含高濃度鐵的培養(yǎng)基的組成和穩(wěn)定性受到嚴(yán)重影響。
考慮到將鐵傳送到所培養(yǎng)的某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞(具體到雜交瘤細(xì)胞)中遇到的困難,發(fā)展出了螯合鐵(例如螯合到親脂性化合物)的概念。
鐵的螯合物通常是雜環(huán)化合物,其通過共軛鍵將金屬鐵與螯合劑中至少兩個(gè)非金屬離子連接,這些螯合劑的分類有很多標(biāo)準(zhǔn),例如通過它們的來源(合成的或生物產(chǎn)生的分子),它們與溶劑如水的相互作用(疏水或親水),或者它們的化學(xué)計(jì)量相互作用(二齒的或六齒的)。
親脂性螯合劑是具有以下兩種獨(dú)特特性的化合物(1)所述化合物是疏水性的并且通常是芳香族的,因此表現(xiàn)出在有機(jī)溶劑(例如酒精)中具有溶解性,但在水中具有有限的溶解性;(2)所述化合物也通常具有負(fù)電荷區(qū)域,從而能夠通過與帶有正電荷的鐵離子的靜電相互作用與鐵“結(jié)合”。在細(xì)胞培養(yǎng)中,人們認(rèn)為這樣的化合物會(huì)被吸引到細(xì)胞富含脂質(zhì)的細(xì)胞膜上,由此將“結(jié)合”的鐵運(yùn)輸?shù)交蛘哂锌赡艽┻^細(xì)胞膜,從而利于給細(xì)胞供鐵(US5,045,468)。所述親脂性螯合劑相對(duì)于伴隨的鐵鹽通常是加入過量的。
使用親脂性螯合劑的最早報(bào)道之一是由Brock和Stevensen發(fā)表的,他們使用吡哆醛異煙肼(pyridoxal isonicotinoyl hydrazone,PIH)聯(lián)合次氮基三乙酸鐵酯(ferric nitrilotriacetate)(Immunology Letters 1523-25,(1987))。他們發(fā)現(xiàn),為了培養(yǎng)小鼠淋巴細(xì)胞系,PIH和次氮基三乙酸鐵酯以2∶1的比例和40μM(基于PIH)的濃度,可以替代運(yùn)鐵蛋白。
Darfler(US 5,045,468/in Vitro Cell.Dev.Biol.26769-778,1990)報(bào)道了適合于雜交瘤細(xì)胞系培養(yǎng)的不含蛋白的培養(yǎng)基。該作者發(fā)現(xiàn)通過使用有機(jī)鐵化合物能夠替代運(yùn)鐵蛋白,硝普酸鈉(SNP)和EDTA的濃度分別是5.7和5.5mg/L。作者把這種培養(yǎng)基取名為“ABC培養(yǎng)基”。
Bertheussen(US 5045467/Cytotechnology 11219-231(1993))報(bào)道細(xì)胞培養(yǎng)基中的運(yùn)鐵蛋白可以被金精三羧酸(親脂性鐵螯合劑)和3μM鐵離子(以FeCl3形式加入)替代。Bertheussen用多種細(xì)胞類型開發(fā)了這種培養(yǎng)基,發(fā)現(xiàn)這種培養(yǎng)基特別適用于快速生長的雜交瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)。
WO 94/02592提出環(huán)庚三烯酚酮(tropolone)在攪拌型懸浮培養(yǎng)時(shí)能用于替代運(yùn)鐵蛋白向細(xì)胞呈遞鐵的功能。其作者指出環(huán)庚三烯酚酮相對(duì)于伴隨加入的鐵應(yīng)該過量。鐵可以鐵離子或者亞鐵離子的形式通過多種鐵化合物,最優(yōu)選FAC呈遞。用雜交瘤細(xì)胞系來說明環(huán)庚三烯酚酮和FAC的最優(yōu)濃度分別是5μM和0.2mg/L。這種培養(yǎng)基也適合NSO骨髓瘤細(xì)胞的生長。用不含運(yùn)鐵蛋白和環(huán)庚三烯酚酮但是含有FAC的培養(yǎng)基進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn),這僅僅是作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。據(jù)發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的FAC,在0.1至10mg/L時(shí),不能夠支持雜交瘤細(xì)胞在攪拌型懸浮培養(yǎng)中的生長。單獨(dú)的FAC在濃度0.2mg/L時(shí)不能夠支持NSO骨髓瘤細(xì)胞系的生長。單獨(dú)的FAC的其它濃度沒有用骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試過前提是作者假定NSO和雜交瘤細(xì)胞系的行為相似,并且不期望其它FAC濃度能夠支持細(xì)胞生長。
Keen(Cytotechnology 17193-202,1995)報(bào)道開發(fā)出了用于培養(yǎng)大鼠骨髓瘤和大鼠雜交瘤細(xì)胞的不含蛋白的培養(yǎng)基。這種稱為W38的培養(yǎng)基是基于DMEM、RPMI和Darfler開發(fā)的ABC培養(yǎng)基的1∶1∶1的混合物。因而這種培養(yǎng)基含有作為親脂性鐵源的SNP和作為含氮螯合劑的EDTA。然而,SNP和EDTA為在ABC培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的濃度的1/3,Keen認(rèn)為通過向培養(yǎng)基中加入檸檬酸鐵提高鐵的濃度是有利的。只要能夠提供所需的膽固醇,W38培養(yǎng)基同樣適用于培養(yǎng)膽固醇營養(yǎng)缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞系NS0(Keen和Steward,Cytotechnology 17203-211,1995)。
Epstein等人最近的WO 01/16294專利申請(qǐng)指出在很多情況下,簡單的鐵載體如檸檬酸鹽不能為所培養(yǎng)的細(xì)胞提供足夠的鐵利用度或攝入。這項(xiàng)專利同時(shí)報(bào)道說一定范圍的親脂性鐵螯合化合物能夠用于多種細(xì)胞類型并且得到了不同程度的成功。然而,只有用與FeCl3和2-羥基吡啶-N-氧化物螯合的山梨醇才能達(dá)到至少和運(yùn)鐵蛋白一樣好的效果。
使用親脂性化合物螯合鐵并向不含運(yùn)鐵蛋白的雜交瘤和骨髓瘤細(xì)胞類型培養(yǎng)物呈遞鐵已經(jīng)成為現(xiàn)有技術(shù)。然而,細(xì)胞培養(yǎng)基中含有親脂性螯合劑存在一些缺點(diǎn)。親脂性螯合劑通常是有毒的,例如SNP被劃分為高毒性物質(zhì),其對(duì)于大鼠的LD50<1mg/kg。在用于工業(yè)化生產(chǎn)生物治療性產(chǎn)品的細(xì)胞系中,這對(duì)于生產(chǎn)的操作者和最終產(chǎn)品都有影響。事實(shí)上,可能必須開發(fā)和確認(rèn)可證明最終的純化生物治療性產(chǎn)品不含任何污染性的親脂性螯合劑的試驗(yàn)方法。另外,螯合劑和鐵化合物的兩成份系統(tǒng)會(huì)使任何具體方法中的鐵濃度優(yōu)化變得復(fù)雜。
總之,現(xiàn)有技術(shù)表明1.在不存在運(yùn)鐵蛋白的情況下,雜交瘤和骨髓瘤細(xì)胞能夠在高鐵濃度(122.5mg/L檸檬酸鐵)下生長(Kovar & Franek)。
2.高鐵濃度(例如122.5mg/L檸檬酸鐵)導(dǎo)致沉淀,這將會(huì)破壞培養(yǎng)基(Bertheussen)。
3.在不存在運(yùn)鐵蛋白或者親脂性螯合劑時(shí),雜交瘤細(xì)胞不能在攪拌型培養(yǎng)中生長并且骨髓瘤細(xì)胞根本不能在低鐵濃度(分別為0.1-10mg/L和0.2mg/L)下生長(WO 94/02592)。
4.要使得雜交瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在低鐵濃度的攪拌型培養(yǎng)中生長,培養(yǎng)基需要親脂性螯合劑(WO 94/02592)。
5.低鐵濃度能夠用于某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長,但是只能使用含氮螯合劑例如EDTA(WO 98/08934)。
在細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域,某些細(xì)胞類型具有相似的營養(yǎng)屬性。應(yīng)該注意到骨髓瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞共同具有顯著屬性,并且這種屬性是其他的細(xì)胞并不通常所具有的,例如谷氨酰胺營養(yǎng)缺陷型(Bebbington等,Biotechnology10169-175,1992)。雜交瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在很多方面反應(yīng)相類似,這在某種程度上并不令人吃驚,因?yàn)殡s交瘤細(xì)胞系是由骨髓瘤細(xì)胞和產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞融合產(chǎn)生的(Kohler和Milstein,Nature 256495-497,1975)。
如上所述,現(xiàn)有技術(shù)表明在不含運(yùn)鐵蛋白或親脂性或含氮螯合劑時(shí),雜交瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞利用在培養(yǎng)基中由簡單的鐵載體(例如檸檬酸鹽)存在的鐵的能力是不同于諸如CHO細(xì)胞的相應(yīng)能力的。現(xiàn)有技術(shù)總體上教導(dǎo)雜交瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在不含運(yùn)鐵蛋白的培養(yǎng)基中利用鐵的能力相同。
如前所述,從文獻(xiàn)中可以明顯看出,在開發(fā)用于生長雜交瘤細(xì)胞種類(尤其是處于靜置培養(yǎng))的不含運(yùn)鐵蛋白的培養(yǎng)基上花費(fèi)了時(shí)間和精力。由于在本領(lǐng)域內(nèi)隱含的假設(shè)是骨髓瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞在這方面具有相同的需求,尚未用骨髓瘤細(xì)胞作同樣的實(shí)驗(yàn)。
這些年來,雜交瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)明顯從使用可溶性鐵化合物形式的鐵來替代運(yùn)鐵蛋白,轉(zhuǎn)向使用低鐵濃度、及在培養(yǎng)基中包含親脂性或者是含氮螯合劑的好處。當(dāng)然,在用于生長目的為經(jīng)改造細(xì)胞來產(chǎn)生產(chǎn)品的細(xì)胞的培養(yǎng)基中使用所述螯合劑,同樣需要進(jìn)一步處理所述產(chǎn)品來確保沒有螯合劑的污染。由于必須開發(fā)特定的試驗(yàn)方法來證明“有毒的”鐵螯合劑沒污染純的產(chǎn)品,在培養(yǎng)基中包括所述螯合劑不僅延長了證明產(chǎn)品是純的所花的時(shí)間,也增加了生產(chǎn)費(fèi)用。
因此,明顯仍需要向培養(yǎng)的某些細(xì)胞以提供足夠鐵的濃度來提供簡單形式的鐵,來繼續(xù)細(xì)胞生長,但是不會(huì)造成上面討論的沉淀損害。另一個(gè)好處是得到不含運(yùn)鐵蛋白和親脂性或含氮螯合劑的培養(yǎng)基。其目的是要獲得在不含運(yùn)鐵蛋白和親脂性或含氮螯合劑的培養(yǎng)基中,與含有運(yùn)鐵蛋白的培養(yǎng)基中同樣的細(xì)胞培養(yǎng)。
發(fā)明概述為了滿足提供支持某些細(xì)胞生長的不含運(yùn)鐵蛋白的培養(yǎng)基需求,本發(fā)明在其它方法之外還提供了在含鐵但缺乏運(yùn)鐵蛋白、或親脂性或合成的含氮螯合劑的培養(yǎng)基中、攪拌型懸浮培養(yǎng)(agitated suspension culture)中培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞的方法。與現(xiàn)有技術(shù)的公開相反,本發(fā)明驚訝地發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞對(duì)鐵的需求與雜交瘤細(xì)胞不同,骨髓瘤細(xì)胞的意外結(jié)果顯示骨髓瘤細(xì)胞在比雜交瘤細(xì)胞所需濃度最多低100倍的培養(yǎng)基中的鐵濃度中連續(xù)生長。本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在,在低鐵濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞得到了更高滴度的骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)物。
附圖簡述

圖1圖1a顯示了骨髓瘤細(xì)胞在不同濃度的檸檬酸鐵銨中、在攪拌型懸浮培養(yǎng)條件生長的能力;圖1b顯示了在不同濃度的檸檬酸鐵銨中生長的骨髓瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的抗體量;圖1c顯示了重復(fù)此實(shí)驗(yàn)的生長數(shù)據(jù)。
圖2圖2a顯示了骨髓瘤細(xì)胞系在不同濃度的檸檬酸鐵中、在攪拌型懸浮培養(yǎng)條件的生長;圖2b顯示了如此生長的細(xì)胞系的細(xì)胞計(jì)數(shù)和抗體滴度。
圖3圖3a顯示了雜交瘤細(xì)胞系在不同濃度的檸檬酸鐵銨中、在攪拌型懸浮培養(yǎng)條件的生長;圖3b顯示了細(xì)胞計(jì)數(shù);圖3c顯示了如此生長的細(xì)胞系的生長的數(shù)學(xué)導(dǎo)出的比較。
圖4圖4a顯示了骨髓瘤細(xì)胞系在不含富集血清(rich-serum free)和運(yùn)鐵蛋白的培養(yǎng)基中、于不同濃度的檸檬酸鐵銨中在攪拌型懸浮培養(yǎng)條件下的生長。
圖5圖示了檸檬酸鐵銨為在攪拌型懸浮發(fā)酵生長條件下的骨髓瘤細(xì)胞系的生長提供所有需要的鐵的能力。
圖6圖示了檸檬酸鐵銨為在不含蛋白的培養(yǎng)基和不含血清的培養(yǎng)基中的骨髓瘤細(xì)胞系在攪拌型懸浮發(fā)酵條件下的生長提供所有需要的鐵的能力。
圖7圖示了骨髓瘤細(xì)胞系以檸檬酸鐵銨作為唯一鐵源來生長的能力不是因?yàn)橛肎S選擇體系來轉(zhuǎn)染。
圖8A圖示了在小試規(guī)模(bench scale)發(fā)酵中、在補(bǔ)充了檸檬酸鐵銨的不含蛋白培養(yǎng)基中的另一種骨髓瘤細(xì)胞系的生長。
圖8B圖示了在100L中試規(guī)模分批(fed-batch)的發(fā)酵中、骨髓瘤細(xì)胞系在補(bǔ)充檸檬酸鐵銨的不含蛋白培養(yǎng)基中的生長。
圖9圖示了另一種骨髓瘤細(xì)胞系在補(bǔ)充檸檬酸鐵銨的不含蛋白培養(yǎng)基中小試規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)的生長。
圖10圖示了在100L中試規(guī)模分批的發(fā)酵中、另一種骨髓瘤細(xì)胞系在補(bǔ)充檸檬酸鐵銨的不含蛋白培養(yǎng)基中的生長。
在圖8A、8B、9和10中,和其他圖中一樣,X軸定義了以天為單位的時(shí)間,Y軸定義了活細(xì)胞數(shù)(×105細(xì)胞/mL)。

發(fā)明內(nèi)容
與上述一致,本發(fā)明第一方面提供了在體外培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞系的方法。其包含(a)將骨髓瘤細(xì)胞系接種于培養(yǎng)基中,所述培養(yǎng)基能夠支持上述骨髓瘤細(xì)胞系的生長并且含有培養(yǎng)基中的濃度從約0.03mg/L到約3.2mg/L的鐵,其中所述培養(yǎng)基不含運(yùn)鐵蛋白、親脂性螯合劑、合成的含氮螯合劑或親脂性合成的含氮螯合劑;和(b)在恰當(dāng)?shù)臈l件下用攪拌型懸浮培養(yǎng)來生長所接種的培養(yǎng)基。
在此方面的具體實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了在體外培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞系的方法,其包含(a)將骨髓瘤細(xì)胞系接種于培養(yǎng)基中,所述培養(yǎng)基能夠支持上述骨髓瘤細(xì)胞系的生長并且含有培養(yǎng)基中的濃度從約0.2mg/L到約20mg/L的檸檬酸鐵銨,其中所述培養(yǎng)基不含運(yùn)鐵蛋白、親脂性螯合劑、合成的含氮螯合劑或親脂性合成的含氮螯合劑;和(b)在恰當(dāng)?shù)臈l件下用攪拌型懸浮培養(yǎng)來生長所接種的培養(yǎng)基。
另一方面,本發(fā)明提供了獲得哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)物的方法,其包含將能夠產(chǎn)生所述產(chǎn)物的骨髓瘤細(xì)胞在能夠支持所述骨髓瘤細(xì)胞系生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng),所述培養(yǎng)基含有培養(yǎng)基中的濃度從約0.03mg/L到約3.2mg/L的鐵,其中所述培養(yǎng)基不含運(yùn)鐵蛋白、親脂性螯合劑、合成的含氮螯合劑或親脂性合成的含氮螯合劑;和回收所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)物。
再一方面,本發(fā)明提供了支持骨髓瘤細(xì)胞系體外生長的培養(yǎng)基的用途,其中所述培養(yǎng)基含有培養(yǎng)基中的濃度從約0.03mg/L到約3.2mg/L的鐵,其中所述培養(yǎng)基不含運(yùn)鐵蛋白、親脂性螯合劑、合成的含氮螯合劑或親脂性合成的含氮螯合劑。
在本發(fā)明這些方面的具體實(shí)施方案中,培養(yǎng)基含有培養(yǎng)基中的濃度從約0.2mg/L到約20mg/L的檸檬酸鐵銨。
在本發(fā)明中,培養(yǎng)基可以支持骨髓瘤細(xì)胞系的生長。“支持生長”指的是所述細(xì)胞經(jīng)多次傳代培養(yǎng)的連續(xù)生長,在每次傳代即從一次傳代培養(yǎng)到下一次傳代培養(yǎng),細(xì)胞數(shù)變?yōu)橹辽匐p倍并優(yōu)選三倍。傳代培養(yǎng)的數(shù)目對(duì)本發(fā)明不是必需的,它取決于例如所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)長度或是產(chǎn)生的產(chǎn)物。本發(fā)明中,通常優(yōu)選所述細(xì)胞經(jīng)至少兩次傳代培養(yǎng),并優(yōu)選至少三代傳代培養(yǎng)顯示連續(xù)生長。
也稱為淋巴樣細(xì)胞的骨髓瘤細(xì)胞是癌性的淋巴細(xì)胞,它在正常的培養(yǎng)條件通常是永生的。骨髓瘤細(xì)胞種類是有用的,因?yàn)樗侵苽洚a(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤的非常好的融合伙伴(partner)。近幾年來,骨髓瘤細(xì)胞類型作為重組基因技術(shù)中的宿主細(xì)胞的重要性變得很突出。使用谷氨酰胺合酶選擇性標(biāo)記物時(shí)尢其是這樣,該標(biāo)記物與NS0骨髓瘤宿主一起使用來制備穩(wěn)定高產(chǎn)的重組細(xì)胞系(Barnes等,Cytotechnology 32109-123,2000)。
在本發(fā)明中,預(yù)期在所述培養(yǎng)基中可以使用任何骨髓瘤細(xì)胞系。通常優(yōu)選所述骨髓瘤細(xì)胞系是小鼠來源的,并且如果如此的話,更優(yōu)選所述骨髓瘤是NS0細(xì)胞系或P3系列的細(xì)胞系,最優(yōu)選是NSO細(xì)胞系(如ECACC85110503)。其他小鼠骨髓瘤包括MOPC系列、MPC-11、J558L、K6H6/B5、和45.6.TG1.7。本發(fā)明方法也可用于培養(yǎng)大鼠的和人的骨髓瘤細(xì)胞種類。本發(fā)明方法適用的大鼠骨髓瘤細(xì)胞系包括Y0和Y,合適的人骨髓瘤細(xì)胞系包括HTK、RPMI 8226和U266B1。
當(dāng)骨髓瘤細(xì)胞系是NSO細(xì)胞時(shí),優(yōu)選的細(xì)胞株用谷氨酰胺合酶表達(dá)體系轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明中所說的細(xì)胞培養(yǎng)基不含運(yùn)鐵蛋白、親脂性螯合劑、合成的含氮螯合劑或親脂性合成的含氮螯合劑。親脂性螯合劑可被定義為為了本發(fā)明目的的螯合劑,該螯合劑具有如下兩種區(qū)別性特征(1)它們是疏水的,即難溶或不溶于水或細(xì)胞培養(yǎng)基,通常是芳香族的;(2)它們有荷負(fù)電的區(qū)域,該區(qū)域可以通過與荷正電的鐵離子的靜電相互作用而“結(jié)合”鐵。親脂性螯合劑的例子有環(huán)庚三烯酚酮(tropolone)和硝普酸鈉(sodiumnitroprusside)。為本發(fā)明目的,合成的含氮螯合劑被定義為在其結(jié)構(gòu)中含有至少一個(gè)氮原子的結(jié)合鐵的化合物。這類化合物可以是疏水的或是親水的。這方面術(shù)語“合成的”指的是這種含氮螯合物不是天然存在的,即正常時(shí)不能在自然界中找到。由人工合成的天然存在的含氮螯合物不包括在此定義內(nèi),但在本發(fā)明的方法和用途中并不排除。這種合成的含氮螯合物包括但不限于化合物如乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)(EDTA)、乙二醇-雙(β-氨基乙醚)N,N,N’,N’四乙酸(ethyleneglycol-bis(β-aminoethylether))(EGTA)、甲磺酰排鐵劑(desferoxamine mesylate)、二亞乙基三胺五乙酸(diethylenetriamine pentaacetic acid)(DTPA)和反式-1,2-二胺環(huán)己烷-N,N,N’,N’四乙酸(trans-1,2-diaminocyclohexane-N,N,N’,N’-tetraaceticacid)(CDTA)。也排除在本發(fā)明的方法和用途之外的是可以是親脂性并且是合成的含氮螯合物的化合物。
培養(yǎng)基的確切組成在本發(fā)明中并不重要,只要該培養(yǎng)基不含運(yùn)鐵蛋白、親脂性螯合劑、合成的含氮螯合劑或親脂性合成的含氮螯合劑,但是含有上述提到的濃度的鐵,并且該培養(yǎng)基能夠支持之前限定的骨髓瘤細(xì)胞系的生長就行。
通常所述細(xì)胞培養(yǎng)基含有氨基酸、維生素、有機(jī)的和無機(jī)的鹽類和糖類的來源?;诒绢I(lǐng)域現(xiàn)有信息,能夠提供這些生長必要要件的化合物通常都能獲得,并且將它們摻入細(xì)胞生長的培養(yǎng)基也是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以實(shí)現(xiàn)的。
通常優(yōu)選所述細(xì)胞培養(yǎng)基以已知的能支持哺乳動(dòng)物細(xì)胞連續(xù)生長的基礎(chǔ)培養(yǎng)基或它們的衍生物為基礎(chǔ)。這種基礎(chǔ)培養(yǎng)基通常能得到。可被補(bǔ)充來提供本發(fā)明培養(yǎng)基的合適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的例子包括Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagles Medium,DMEM)、Hams F12培養(yǎng)基、Iscove改進(jìn)的Dulbecco培養(yǎng)基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)和Roswell Park Memorial Institute(RPMI)。
本發(fā)明中的培養(yǎng)基可以不含血清、不含蛋白、不含動(dòng)物來源或化學(xué)限定的組分。
一種選擇是,所述細(xì)胞培養(yǎng)基可以通過將連續(xù)生長所需的具體組分組合從首要元素(first principles)來制備。
當(dāng)在制備針對(duì)具體細(xì)胞種類或細(xì)胞系的培養(yǎng)基時(shí),通??梢园凑站唧w細(xì)胞種類/系的需要來改良或補(bǔ)充基礎(chǔ)培養(yǎng)基。補(bǔ)充物的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù),并不構(gòu)成本發(fā)明的必要方面。通常這種補(bǔ)充物可以包括脂類(例如膽固醇和脂肪酸)、脂質(zhì)前體(例如乙醇胺)、生長促進(jìn)劑或調(diào)節(jié)劑(例如胰島素)、微量元素(例如硒)、聚合物(例如,Pluronic F-68)和對(duì)于谷氨酰胺依賴性細(xì)胞的谷氨酰胺。
可加入鐵源來向培養(yǎng)基提供上面提到的濃度的鐵從而使其適合用于本發(fā)明的培養(yǎng)基的一個(gè)例子,是基于Qi等在Cytotechnology 2195-109(1996)中描述的CDSS的細(xì)胞培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基,稱為改進(jìn)的CDSS,是基于DMEM/F12(1∶1)(Gibco BRL.1x liquid cat.no.21331)以及如下添加物GS補(bǔ)充物(JRH cat.no.58672)40ml/L;Clevelands微量元素I(Cellgro 99-175)0.5ml/L;Clevelands微量元素II(Cellgro 99-176)1ml/L;硫酸鋅2μM;亞硒酸鈉50nM;乙醇胺20μM;Pluronic F681g/L;碳酸氫鈉1.3g/L和2M鹽酸3.6ml/L。對(duì)于無法進(jìn)行谷氨酰胺非依賴性生長的細(xì)胞系,所述培養(yǎng)基含有6mM谷氨酰胺;對(duì)于NSO細(xì)胞系,所述培養(yǎng)基含有2ml/L的膽固醇脂濃縮物(Gibco cat.no.00-0061)。
本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基含有培養(yǎng)基中的濃度從約0.03mg/L到約3.2mg/L的鐵。在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中,培養(yǎng)基中的鐵源是可溶性鐵化合物。所用的可溶性鐵化合物的量應(yīng)當(dāng)足夠向培養(yǎng)基提供在該濃度的鐵,只要培養(yǎng)基中的鐵的量在這個(gè)范圍內(nèi)就應(yīng)當(dāng)足夠支持所述細(xì)胞的生長。培養(yǎng)基中可溶性鐵化合物的精確濃度可以根據(jù)使用的具體可溶性鐵化合物、所用的細(xì)胞系和/或存在的其它培養(yǎng)基組分而改變。合適的濃度可以通過直接的方式來確定,例如通過進(jìn)行根據(jù)常規(guī)操作的小規(guī)模試驗(yàn),如具體細(xì)胞系對(duì)于具體培養(yǎng)基中可溶性鐵化合物的劑量反應(yīng)。
在本發(fā)明中,培養(yǎng)基中的鐵的濃度(優(yōu)選用可溶性鐵化合物來提供)從約0.03mg/L到約3.2mg/L,優(yōu)選從約0.03mg/L到約2.4mg/L,更優(yōu)選從約0.064mg/L到約1.6mg/L,最優(yōu)選從約0.16mg/L到約0.32mg/L。
在本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方案中,培養(yǎng)基中的鐵源是可溶性鐵化合物。適合的可溶性鐵化合物可溶于水或細(xì)胞培養(yǎng)基,但是在有機(jī)溶劑中顯示出有限的溶解度。這種化合物對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是通常可得的,確定其溶解度是直接的。
本發(fā)明也包括任何可選的鐵源的用途,只要所述鐵源能向細(xì)胞提供足夠的鐵來使其在運(yùn)鐵蛋白或親脂性或合成的含氮螯合物缺無時(shí)能連續(xù)生長。
提供鐵從而用于本發(fā)明的合適的可溶性鐵化合物包括鐵鹽,亞鐵鹽或它們的簡單螯合物。需要注意的是這里所用的“簡單螯合物”不包括上面討論過的親脂性或合成的含氮螯合物。術(shù)語“簡單螯合”是相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)各個(gè)方面中的術(shù)語“簡單鐵載體”以比較的方式在本文中使用的。
可以是用于本發(fā)明方法和用途中的培養(yǎng)基中的鐵源的鐵鹽、或亞鐵鹽或它們的簡單螯合物的例子包括硫酸亞鐵、檸檬酸亞鐵、檸檬酸鐵、和鐵銨離子化合物。優(yōu)選用于本發(fā)明的是鐵銨離子化合物。具體的本發(fā)明所用的鐵銨離子化合物包括檸檬酸鐵銨、草酸鐵銨、延胡索酸鐵銨、蘋果酸鐵銨、琥珀酸鐵銨。本發(fā)明中最優(yōu)選使用檸檬酸鐵銨。
雖然本發(fā)明的培養(yǎng)基可以含有不只是一種鐵源,例如合適的含鐵化合物的混合物,當(dāng)鐵源是可溶性鐵化合物時(shí),通常優(yōu)選在培養(yǎng)基中只存在一種這樣的化合物。
在本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方案中,所述可溶性鐵化合物是檸檬酸鐵銨。通常在此具體實(shí)施方案中并為了給培養(yǎng)基提供范圍在約0.03mg/L到約3.2mg/L的鐵,將使用濃度從約0.2mg/L到約20mg/L,優(yōu)選從約0.2mg/L到約15mg/L,更優(yōu)選從約0.4mg/L到約10mg/L并最優(yōu)選從約1mg/L到約2mg/L的檸檬酸鐵銨。
在本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方案中,所述培養(yǎng)基包含鐵銨離子化合物。本發(fā)明結(jié)果證明這些鐵銨離子化合物,具體是檸檬酸鐵銨,比例如檸檬酸鐵更有效地為細(xì)胞使用。具體地,如果使用檸檬酸鐵,它必須以在相當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中的鐵銨離子化合物的濃度的10倍來存在。本發(fā)明的圖1和2圖示了這一點(diǎn),從所述的圖可以明顯可見經(jīng)至少3次傳代的連續(xù)細(xì)胞生長,檸檬酸鐵必須以至少10mg/L的濃度存在,而檸檬酸鐵銨在0.2mg/L的濃度提供了相同水平的生長。也值得注意抗體滴度在較低的離子濃度是最好的。
本發(fā)明的培養(yǎng)基可以通過用標(biāo)準(zhǔn)操作地將各種組分適當(dāng)混合來制備。所述培養(yǎng)基也可以制備成不同的形式如液體形式或是在使用前重建的干粉狀培養(yǎng)基。本發(fā)明的培養(yǎng)基在合適的條件下保存時(shí)是穩(wěn)定的。
因此,本發(fā)明也提供了制備可以支持骨髓瘤細(xì)胞系的體外生長的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法,所述培養(yǎng)基含有培養(yǎng)基中的濃度從約0.03mg/L到約3.2mg/L的鐵,其中所述培養(yǎng)基不含運(yùn)鐵蛋白、親脂性螯合劑、合成的含氮螯合劑或親脂性合成的含氮螯合劑,該培養(yǎng)基包含其各自組分的混合物。
本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基適用于許多培養(yǎng)條件。所以,所述培養(yǎng)基可維持骨髓瘤細(xì)胞系在單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng),具體是攪拌型懸浮培養(yǎng)中的生長。攪拌型懸浮培養(yǎng)可以被定義為培養(yǎng)基中的細(xì)胞的均質(zhì)懸液是借助于攪拌力的細(xì)胞培養(yǎng)。使用攪拌力的手段在本領(lǐng)域公知的,并且包括例如機(jī)械的攪拌機(jī)(stired impeller)和/或生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中的噴氣,和將細(xì)胞培養(yǎng)瓶保持在往復(fù)式搖床(reciprocal shaking platform)上。本發(fā)明的培養(yǎng)基特別適合攪拌型懸浮培養(yǎng)中的細(xì)胞培養(yǎng),也就是使用已知的培養(yǎng)技術(shù)用合適的攪拌型培養(yǎng)容器,例如攪拌釜(stirred tank)或氣升式發(fā)酵罐的懸浮培養(yǎng)。
因此,本發(fā)明同時(shí)也提供了培養(yǎng)基,它能支持骨髓瘤細(xì)胞系的攪拌型懸浮培養(yǎng)的生長,培養(yǎng)基含有培養(yǎng)基中濃度為大約0.03mg/L到3.2mg/L的鐵,而培養(yǎng)基不含運(yùn)鐵蛋白、親脂性螯合劑、合成的含氮螯合劑或親脂性含氮螯合劑。
現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)指出骨髓瘤和雜交瘤細(xì)胞類型對(duì)于培養(yǎng)基中的鐵具有相同的需求。我們的結(jié)果顯示并非如此。圖3顯示了雜交瘤細(xì)胞系在含有檸檬酸鐵銨的培養(yǎng)基中的生長。從此圖中可以看出,雜交瘤細(xì)胞的生長和本領(lǐng)域的預(yù)測(cè)是一致的,也就是說,在檸檬酸鐵銨濃度高(50mg/L和100mg/L)而不是這一可溶性鐵化合物濃度較低(低于10mg/L)時(shí),細(xì)胞生長很好。和圖1(顯示了骨髓瘤細(xì)胞在相當(dāng)濃度的可溶性鐵化合物的培養(yǎng)基中的生長)相比較,顯然,雜交瘤細(xì)胞比長勢(shì)相當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞在培養(yǎng)基中需要高大約100倍的鐵。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于當(dāng)細(xì)胞在低鐵培養(yǎng)基中培養(yǎng),即當(dāng)所述細(xì)胞系按照本發(fā)明的方法進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)物的滴度提高。下面的實(shí)施例證明在培養(yǎng)基中的鐵濃度低時(shí),例如在0.03mg/L到3.2mg/L之間,優(yōu)選在0.16mg/L到0.32mg/L之間,骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)物的滴度出乎意料的較高。
可由本發(fā)明得到的細(xì)胞產(chǎn)物包括由所培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的任何產(chǎn)物。通常的產(chǎn)物包括,例如多肽和蛋白,例如免疫球蛋白如單克隆抗體和重組抗體及其片段、激素如促紅細(xì)胞生成素和生長激素例如人生長激素、淋巴因子如干擾素、白介素如白介素2、4、5和6,和工業(yè)用和治療用的酶,如組織纖溶酶原激活物。利用基因重組技術(shù)對(duì)骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行操作以使所述細(xì)胞產(chǎn)出所述細(xì)胞產(chǎn)物的方法是本領(lǐng)域廣泛應(yīng)用并通??傻玫?。
為了得到細(xì)胞產(chǎn)物,能夠產(chǎn)生所述產(chǎn)物的骨髓瘤細(xì)胞是在本發(fā)明的培養(yǎng)基中生長的。生長條件取決于,例如所使用的細(xì)胞系和所產(chǎn)生的產(chǎn)物,但是根據(jù)本領(lǐng)域現(xiàn)有知識(shí)很容易確定。
為此,本發(fā)明也提供了含培養(yǎng)基中濃度從約0.03mg/L到約3.2mg/L的鐵的培養(yǎng)基的用途,其中制備哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)物的所述培養(yǎng)基不含運(yùn)鐵蛋白、親脂性螯合劑、合成的含氮螯合劑或親脂性合成的含氮螯合劑。
分離骨髓瘤細(xì)胞和/或培養(yǎng)基產(chǎn)生的細(xì)胞產(chǎn)物的方法是公知的并且是本領(lǐng)域的常規(guī)操作。
這里提到的所有的文獻(xiàn)都全文引入作為參考。應(yīng)理解本發(fā)明是結(jié)合上述具體實(shí)施方案來描述的,前面的描述和下面的實(shí)施例只是為了說明本發(fā)明而沒有對(duì)本發(fā)明的范圍作任何限定。另一方面,本發(fā)明包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的優(yōu)點(diǎn)和改進(jìn)。
實(shí)施例實(shí)施例10.2mg/L檸檬酸鐵銨(FAC)能夠支持GS-NS0細(xì)胞系的連續(xù)生長方法將用谷氨酰胺合酶(GS)表達(dá)體系(歐洲專利說明書2560550)表達(dá)人lgG抗體的重組GS-NS0小鼠骨髓瘤細(xì)胞系(細(xì)胞系A(chǔ))預(yù)先在完全不含血清、含鐵螯合源的培養(yǎng)基(GSF培養(yǎng)基)中傳代培養(yǎng),然后離心并在不含螯合劑的培養(yǎng)基中重懸。將在此培養(yǎng)基中重懸的細(xì)胞接種于實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)瓶中,接種濃度為2×105細(xì)胞/ml。
此實(shí)驗(yàn)通過使用250ml的有通風(fēng)蓋(vented cap)的錐形瓶(Erlenmeyerflask)(工作容量在20到50ml之間)、在5%二氧化碳/95%空氣和濕度75%的條件、在36.5℃和125rpm于往復(fù)式搖床上溫育來進(jìn)行。
在含有改進(jìn)的CDSS培養(yǎng)基的各個(gè)培養(yǎng)瓶中分別補(bǔ)充FAC貯存液使得培養(yǎng)瓶含有最終濃度為0.2、0.4、1、2、10、50和100mg/L的FAC。FAC的貯存液用水配制到濃度為0.5mg/L(對(duì)于含有0.2-2mg/L FAC的培養(yǎng)瓶)和25mg/L(對(duì)于含有10-100mg/L FAC的培養(yǎng)瓶)。貯存液在加入培養(yǎng)瓶之前需要過濾除菌。
將包含了補(bǔ)充了1mg/L人運(yùn)鐵蛋白和0.1mg/L FAC的改進(jìn)CDSS培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶作為陽性對(duì)照。將包含了不含任何運(yùn)鐵蛋白或FAC的改進(jìn)的CDSS培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶作為陰性對(duì)照。所有的培養(yǎng)瓶都補(bǔ)充了2ml/L膽固醇脂質(zhì)濃縮物(Gibco)作為膽固醇來源。膽固醇脂質(zhì)濃縮物是膽固醇和脂肪酸與環(huán)糊精復(fù)合而成的乳狀液。
將培養(yǎng)瓶傳代培養(yǎng)三次以便使來自接種物的螯合的/貯存的鐵所產(chǎn)生的影響最小化。每隔3天通過用新鮮的培養(yǎng)基稀釋到2×105細(xì)胞/ml來傳代培養(yǎng)培養(yǎng)瓶。在第三次傳代培養(yǎng)時(shí),讓培養(yǎng)瓶按照完全生長循環(huán)直到生存能力變得很低(這通常被叫做過度生長)。使用Innovatis Cedex細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。對(duì)照著相應(yīng)的lgG標(biāo)準(zhǔn)物,用夾心ELISA法測(cè)定抗體滴度。
結(jié)果圖1a說明在實(shí)驗(yàn)的FAC濃度范圍內(nèi),在傳代培養(yǎng)和最終過度生長中的細(xì)胞濃度。此圖清楚地表明了陰性對(duì)照培養(yǎng)物在第一次傳代培養(yǎng)后就不能增殖。含有0.2mg/L FAC的培養(yǎng)物在第一次分裂后可以增殖,但是不能繼續(xù)生長。這些培養(yǎng)物在初始接種之后能夠生長的事實(shí)可能是由于需要通過細(xì)胞分裂來消耗的細(xì)胞鐵儲(chǔ)備造成的。
圖1a也清楚地表明0.4mg/L或以上的濃度能夠支持經(jīng)多次傳代培養(yǎng)和過度生長培養(yǎng)的連續(xù)的細(xì)胞生長。圖1c表明在此實(shí)驗(yàn)的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中,0.2mg/L的FAC濃度能夠支持連續(xù)的細(xì)胞生長。
圖1b表明了來自第一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)(the first of the duplicates)的過度生長培養(yǎng)物的細(xì)胞計(jì)數(shù)和抗體產(chǎn)生數(shù)據(jù)。此圖根據(jù)最大活細(xì)胞數(shù)和生長曲線下的面積表明,用1mg/L或者更高的FAC濃度可得到與含有運(yùn)鐵蛋白的對(duì)照相當(dāng)?shù)纳L。這表明在達(dá)到閾值水平(1mg/L)以后,在FAC濃度的一個(gè)大范圍內(nèi)的生長是差不多相當(dāng)?shù)?。但是,?0mg/L的FAC濃度,可以觀察到少量的鐵銹色沉淀。在50和100mg/L時(shí),能夠觀察到量更多的此種沉淀。就像Bertheussen所提醒的一樣,這種沉淀被推測(cè)為氫氧化鐵(Cytotechnology11219-231,1993)。
圖1b也表明了用夾心ELISA法測(cè)定的抗體滴度。與含有運(yùn)鐵蛋白的對(duì)照相比較,含有FAC的培養(yǎng)物能產(chǎn)生至少相等的,并且在大多數(shù)情況顯著更多的抗體。在含F(xiàn)AC的培養(yǎng)物中獲得的抗體滴度也表現(xiàn)出與FAC濃度的反比關(guān)系,例如含有0.4mg/L FAC的培養(yǎng)物比含有100mg/L FAC的培養(yǎng)物多產(chǎn)生超過30%的抗體。
實(shí)施例2檸檬酸鐵(FC)需要濃度比支持GS-NS0細(xì)胞系連續(xù)生長的FAC高出一個(gè)數(shù)量級(jí)方法實(shí)施例2的方法和實(shí)施例1相同,不同點(diǎn)在于螯合鐵的來源。在本實(shí)施例中,使用檸檬酸鐵(FC)來替代FAC。
在冷水中FC只能緩慢地溶解。為配制FC的貯存液,必須將FC溶解于保持在80℃的水中并攪拌長達(dá)2小時(shí)。配制貯存液的濃度為0.5mg/L(對(duì)于含有0.2-2mg/L FAC的培養(yǎng)瓶)和10mg/L(含有10-100mg/L FAC的培養(yǎng)瓶)。
結(jié)果圖2a說明在實(shí)驗(yàn)的FC濃度范圍內(nèi),在傳代培養(yǎng)和最終過度生長中的細(xì)胞濃度。此圖表明陰性對(duì)照培養(yǎng)物和含有0.2mg/L FC的培養(yǎng)物不能在第一次傳代培養(yǎng)后繁殖。含有0.4、1和2mg/L FC的培養(yǎng)物不能在第二次傳代培養(yǎng)后繁殖。因此,對(duì)于所實(shí)驗(yàn)的濃度,需要FC的濃度為10mg/或者更高來支持經(jīng)多次傳代培養(yǎng)和在過度生長培養(yǎng)時(shí)的連續(xù)的細(xì)胞生長。
圖2b顯示了過度生長培養(yǎng)物的細(xì)胞計(jì)數(shù)和抗體產(chǎn)生數(shù)據(jù)。此圖根據(jù)最大活細(xì)胞數(shù)和生長曲線下的面積表明,10mg/L或者更高的FC濃度可得到與含有運(yùn)鐵蛋白的對(duì)照相當(dāng)?shù)纳L。對(duì)于FC,在含有10mg/L或更多的FC的培養(yǎng)基中能觀察到鐵銹色沉淀。
圖2b也顯示了用夾心ELISA法測(cè)定的抗體滴度。與含有運(yùn)鐵蛋白的對(duì)照相比,含F(xiàn)C的培養(yǎng)物能產(chǎn)生至少相等的,并在FC為10mg/L時(shí)顯著更多的抗體。和用FAC的觀察結(jié)果類似,最低濃度的FC產(chǎn)生最高的滴度。
此結(jié)果表明,為了支持與用運(yùn)鐵蛋白觀察到的生長相當(dāng)?shù)募?xì)胞生長,需要FC的濃度比FAC高10倍。
實(shí)施例3為得到在攪拌型懸浮培養(yǎng)中的連續(xù)細(xì)胞生長,雜交瘤細(xì)胞系需要高于GS-NS0細(xì)胞系超過兩個(gè)數(shù)量級(jí)的FAC濃度方法實(shí)施例3的方法除了以下的內(nèi)容以外和實(shí)施例1是一樣的產(chǎn)生抗Myc抗體的小鼠雜交瘤細(xì)胞系(9E10)預(yù)先在補(bǔ)充了1mg/L人運(yùn)鐵蛋白和6mM谷氨酰胺的改進(jìn)的CDSS中傳代培養(yǎng),然后以1×105細(xì)胞/ml的接種密度接種于實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)瓶中。
此實(shí)驗(yàn)通過使用250ml的有密封蓋的錐形瓶、在36.5℃和125rpm于往復(fù)式搖床上溫育來進(jìn)行。所述培養(yǎng)瓶一開始并且每隔兩天充入5%二氧化碳/95%空氣。
由于此雜交瘤細(xì)胞系不需要膽固醇,所以培養(yǎng)瓶中沒有補(bǔ)充膽固醇脂質(zhì)濃縮物。
每隔三天通過用新鮮培養(yǎng)基稀釋到1×105細(xì)胞/ml來傳代培養(yǎng)培養(yǎng)瓶內(nèi)容物。第三次傳代培養(yǎng)時(shí),讓培養(yǎng)瓶內(nèi)容物過度生長。使用臺(tái)盼蘭排斥法來進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
結(jié)果圖3a顯示在所實(shí)驗(yàn)的FAC濃度范圍內(nèi),在傳代培養(yǎng)和最終過度生長中的細(xì)胞濃度。此圖顯示陰性對(duì)照培養(yǎng)物和含有0.2和0.4mg/L FAC的培養(yǎng)物在第一次傳代培養(yǎng)后不能增殖。含有1、2和10mg/L FAC的培養(yǎng)物在第二次傳代培養(yǎng)后不能增殖。因此,對(duì)于所實(shí)驗(yàn)的濃度,需要FAC濃度為50mg/L或者更高來支持生長。
圖3b顯示了過度生長培養(yǎng)物的細(xì)胞計(jì)數(shù)。此圖根據(jù)活細(xì)胞數(shù)最大值顯示,需要100mg/L FAC來得到與含有運(yùn)鐵蛋白的對(duì)照相當(dāng)?shù)纳L。但是,如果以生長曲線下面積的積分(通過接近直角梯形面積的總和來計(jì)算,或是累計(jì)細(xì)胞小時(shí)(cumulative cell hours,CCH)來考慮生長,50mg/L FAC可以得到和含運(yùn)鐵蛋白的對(duì)照相當(dāng)?shù)纳L。柱狀圖清楚地顯示了最大的CCH(圖3c)。正如以前所觀察到的,在含有50mg/L和100mg/L FAC的培養(yǎng)物中能觀察到鐵銹色的沉淀。
此結(jié)果顯示對(duì)于攪拌型懸浮培養(yǎng)中的連續(xù)細(xì)胞生長,雜交瘤細(xì)胞系需要的FAC濃度比GS-NS0細(xì)胞高100倍以上。
實(shí)施例4FAC是用在能支持細(xì)胞生長并產(chǎn)生高水平抗體滴度的豐富培養(yǎng)基中的有效鐵源實(shí)施例4進(jìn)一步顯示了FAC作為鐵源的效用。在這個(gè)實(shí)施例中,F(xiàn)AC被用作稱為GSF的完全不含血清的培養(yǎng)基(含牛血清白蛋白[BSA]作為唯一沒有定義的組分)中的唯一鐵源,本實(shí)施例使用了第二種產(chǎn)生抗體的重組GS-BS0細(xì)胞系(田胞系B)。
方法將細(xì)胞預(yù)先培養(yǎng)在完全不含血清的培養(yǎng)基中,該培養(yǎng)基含有10μM環(huán)庚三烯酚酮(親脂性的鐵螯合劑[參考WO94/02592])和0.4mg/L FAC作為鐵源,離心所述細(xì)胞并且重懸于不含環(huán)庚三烯酚酮和鐵的GSF不含血清培養(yǎng)基中。用在此培養(yǎng)基中重懸的細(xì)胞接種實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)瓶,接種密度為2×105細(xì)胞/ml。
此實(shí)驗(yàn)通過使用250ml的有密閉蓋的錐形瓶(工作容量50ml)、在36.5℃和125rpm于往復(fù)式搖床上溫育來進(jìn)行。給培養(yǎng)瓶一開始并且每隔兩天充入5%CO2/95%至氣。
用1mg/ml的FAC貯存液向含有GSF(不含環(huán)庚三烯酚酮和鐵)培養(yǎng)基的各個(gè)培養(yǎng)瓶補(bǔ)充至培養(yǎng)瓶含有的FAC終濃度為0.2、0.4、0.8、1.2、1.6和2mg/L。將所述貯存液在加入培養(yǎng)瓶之前過濾除菌。用含有補(bǔ)充了5μM環(huán)庚三烯酚酮和0.4mg/L FAC(之前顯示與運(yùn)鐵蛋白相當(dāng))的培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶作為陽性對(duì)照。
所有的培養(yǎng)瓶都補(bǔ)充1ml/L的1000倍濃縮的膽固醇和脂肪酸補(bǔ)充物(CLOC)。
每隔五天通過用新鮮的培養(yǎng)基稀釋到2×105細(xì)胞/ml來傳代培養(yǎng)培養(yǎng)瓶。第二次傳代培養(yǎng)時(shí),讓培養(yǎng)瓶過度生長至飽和。用臺(tái)盼蘭排斥法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。對(duì)比相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品,用分析型蛋白A高效液相層析(hplc)來作抗體滴度分析。
結(jié)果圖4顯示了在實(shí)驗(yàn)的FAC濃度范圍內(nèi),傳代培養(yǎng)和最終過度生長時(shí)的細(xì)胞濃度。此圖顯示含有0.8mg/L及更高濃度的FAC的培養(yǎng)基能夠支持與用陽性對(duì)照培養(yǎng)物觀察的生長相當(dāng)?shù)纳L。圖4也顯示了過度生長培養(yǎng)時(shí)的抗體產(chǎn)生。數(shù)據(jù)顯示0.8mg/L及更高的FAC能支持至少和對(duì)照相當(dāng)?shù)目贵w產(chǎn)生??贵w產(chǎn)生的趨勢(shì)也和實(shí)施例1和2的結(jié)果非常類似。
此結(jié)果顯示FAC用在能夠支持細(xì)胞生長并產(chǎn)生高水平抗體滴度的豐富培養(yǎng)基中是有效的。
實(shí)施例5含F(xiàn)AC作為鐵源的培養(yǎng)基可以在一個(gè)縮小規(guī)模的生產(chǎn)體系中支持生長并產(chǎn)生抗體。
方法細(xì)胞系B的發(fā)酵用含有5μM環(huán)庚三烯酚酮和0.4mg/L FAC(對(duì)照)、或含有1.0mg/L FAC的GSF不含血清培養(yǎng)基來進(jìn)行。在7L(工作容量4.5L)的Applikon發(fā)酵罐中進(jìn)行所述發(fā)酵,該發(fā)酵罐配有半球形的底部并用船用攪拌機(jī)(marine impeller)以150rpm攪拌。在36.5℃,pH 7.1進(jìn)行所述發(fā)酵,并通空氣/氧氣使得溶解氧張力(dissolved oxygen tension)保持在15%。
這些發(fā)酵的接種物由與發(fā)酵所用的相同的培養(yǎng)基中細(xì)胞的傳代培養(yǎng)來提供。
結(jié)果圖5顯示在攪拌型通氣的發(fā)酵容器中,使用補(bǔ)充了5μM環(huán)庚三烯酚酮/0.4mg/L FAC(對(duì)照)或1mg/L FAC的培養(yǎng)基會(huì)觀察到相似的細(xì)胞生長和產(chǎn)生特性。
此結(jié)果證明了在一個(gè)縮小規(guī)模的生產(chǎn)體系中FAC作為鐵源的有效性。
實(shí)施例6FAC在不含蛋白的培養(yǎng)基中可以支持生長至高細(xì)胞密度并產(chǎn)生高滴度。
方法用細(xì)胞系A(chǔ)的攪拌型通氣分批發(fā)酵物(參考實(shí)施例1),作GSF不含血清培養(yǎng)基(含有蛋白(BSA))和不含蛋白的GSF培養(yǎng)基的對(duì)比,這兩種培養(yǎng)基中均含有1mg/ml FAC。向不含蛋白的發(fā)酵物補(bǔ)充2ml/L的膽固醇脂質(zhì)濃縮物(參考實(shí)施例1),向不含血清的發(fā)酵物補(bǔ)充1ml/L的CLOC補(bǔ)充物(參考實(shí)施例4)。發(fā)酵條件如實(shí)施例5所描述。這些發(fā)酵的接種物由與發(fā)酵所用的相同的培養(yǎng)基中細(xì)胞的傳代培養(yǎng)來提供。
結(jié)果圖6顯示了兩種發(fā)酵中的生長和抗體產(chǎn)生。此圖清楚地顯示了FAC可以在這兩種培養(yǎng)基中支持良好生長和抗體產(chǎn)生。
此結(jié)果說明了FAC在含蛋白(即不含血清)和不含蛋白的培養(yǎng)基中支持生長至高細(xì)胞密度和產(chǎn)生高滴度的能力。
實(shí)施例7FAC在不含蛋白的培養(yǎng)基中能夠支持生長至高細(xì)胞密度和產(chǎn)生高滴度下面的例子說明了FAC可以用作實(shí)施例6的不含蛋白的培養(yǎng)基中的唯一鐵源,并且這種補(bǔ)充了FAC的培養(yǎng)基針對(duì)一系列的GS-NSO細(xì)胞系在生產(chǎn)規(guī)模上可以支持生長至高細(xì)胞密度和產(chǎn)生高滴度。
方法三種表達(dá)不同抗體的GS-NSO細(xì)胞系(細(xì)胞系C,D和E)在從液氮貯藏中復(fù)蘇后直接轉(zhuǎn)到實(shí)施例6的不含蛋白含F(xiàn)AC的培養(yǎng)基中。經(jīng)過幾次在不含蛋白含F(xiàn)AC的培養(yǎng)基中的傳代培養(yǎng)后,這些培養(yǎng)物被用于接種小試(4.5L)或中試規(guī)模的分批發(fā)酵。這些分批發(fā)酵中使用的培養(yǎng)基和補(bǔ)料(feed)被最優(yōu)化來提供高抗體滴度。
細(xì)胞系C在4.5和100L的規(guī)模中生長,細(xì)胞系D在4.5L的規(guī)模中生長,細(xì)胞系E在100L的規(guī)模中生長。
結(jié)果圖8顯示了細(xì)胞系C在4.5L發(fā)酵中的生長和抗體產(chǎn)生。圖8B顯示了細(xì)胞系C在100L發(fā)酵中的生長和抗體產(chǎn)生。圖9和10分別顯示了細(xì)胞系D在4.5L和細(xì)胞系E在100L發(fā)酵中的生長和抗體產(chǎn)生。
這些圖清楚顯示了不含蛋白的FAC培養(yǎng)基支持寬范圍的細(xì)胞系在生產(chǎn)規(guī)模的良好生長和抗體產(chǎn)生率。
這些結(jié)果證明了FAC在不含化學(xué)限定的蛋白和動(dòng)物組分的培養(yǎng)基中支持寬范圍的細(xì)胞系生長并產(chǎn)生抗體的能力。這對(duì)于抗體在人治療用途中的應(yīng)用很重要,因?yàn)樗鼤?huì)消除引入來自于動(dòng)物來源的化合物的外來感染因子的風(fēng)險(xiǎn)。
實(shí)施例8使用FAC作為唯一的鐵源時(shí),NS0的生長能力不是因?yàn)楸籊S選擇體系轉(zhuǎn)染。
用表達(dá)人抗體并用G418選擇體系選出的重組NS0小鼠骨髓瘤細(xì)胞系來評(píng)價(jià)FAC支持用GS選擇體系替代物轉(zhuǎn)染的NS0細(xì)胞生長的能力。
方法在含有1mg/L運(yùn)鐵蛋白、0.1mg/L FAC和6mM谷氨酰胺的GSF不含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞,通過用含有1mg/L FAC、或1mg/L運(yùn)鐵蛋白和0.1mg/L FAC的新鮮的GSF不含血清培養(yǎng)基稀釋到2×105來進(jìn)行傳代培養(yǎng)。5天以后,將培養(yǎng)瓶傳代培養(yǎng)然后使其進(jìn)入完全生長循環(huán)。所述實(shí)驗(yàn)通過用有密閉蓋的搖瓶在往復(fù)式搖床上于36.5℃和125rpm溫育來進(jìn)行。所述培養(yǎng)瓶一開始并且每隔2天充入5%二氧化碳/95%空氣。
結(jié)果在兩種培養(yǎng)基中觀察到相當(dāng)?shù)纳L,這表明FAC可以支持用替代選擇體系轉(zhuǎn)染的NS0細(xì)胞生長。
此結(jié)果顯示使用FAC作為唯一鐵源時(shí),NS0的生長能力不是因?yàn)楸籊S選擇體系轉(zhuǎn)染。
實(shí)施例9改進(jìn)的CDSS培養(yǎng)基的制備改進(jìn)的CDSS培養(yǎng)基的制備如下對(duì)于1L的DMEM/F12(1∶1)(Gibco BRL.1x liquid cat.no.21331),用磁力攪拌器來攪拌,下面的組分按照以下的順序加入,小心保證每一種組分都在下一種組分加入前完全溶解。
○1g的Pluronic F-68(Sigma P-1300)○50nM無水亞硒酸鈉(Sigma S-5261)(來自25μM貯存液)○2μM七水硫酸鋅(Sigma Z-0251)(來自2mM貯存液)○0.5ml Clevelands微量元素I(Cellgro 99-175)○1ml Clevelands微量元素II(Cellgro 99-176)○20μM乙醇胺(Sigma E-0135)○40ml GS補(bǔ)充物(JRHBiosciences 58672)○1.3g碳酸氫鈉(BDH 102475W)○3.6ml 2M鹽酸(BDH 190675T)僅對(duì)于谷氨酰胺依賴性的細(xì)胞系○0.88g谷氨酰胺(Sigma G-5763)對(duì)于僅含運(yùn)鐵蛋白的對(duì)照培養(yǎng)基○0.1mg檸檬酸鐵銨(BDH 271634K)(來自1M貯存液)○1mg人運(yùn)鐵蛋白(Serologicals Proteins 82-349)使所述培養(yǎng)基混合然后用0.2μm的膜過濾。
在培養(yǎng)基制備中(即伴隨其他組分)或在所述培養(yǎng)基已經(jīng)配制后,將可溶性的鐵化合物如檸檬酸鐵銨加入來自貯存液的上述培養(yǎng)基。
權(quán)利要求
1.體外培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞系的方法,包含(a)將骨髓瘤細(xì)胞系接種于培養(yǎng)基中,所述的培養(yǎng)基能夠支持所述的骨髓瘤細(xì)胞系生長并且含有培養(yǎng)基中的濃度從約0.03mg/L到約3.2mg/L的鐵,其中所述的培養(yǎng)基不含有運(yùn)鐵蛋白、親脂性螯合劑、合成的含氮螯合劑或親脂性合成的含氮螯合劑;和(b)在恰當(dāng)?shù)臈l件下并使用攪拌型懸浮培養(yǎng)來使所述接種的培養(yǎng)基生長。
2.權(quán)利要求1的方法,其中培養(yǎng)基中的鐵濃度從約0.03mg/L到約2.4mg/L。
3.權(quán)利要求1的方法,其中培養(yǎng)基中的鐵濃度從約0.064mg/L到約1.6mg/L。
4.權(quán)利要求1的方法,其中培養(yǎng)基中的鐵濃度從約0.16mg/L到約0.32mg/L。
5.權(quán)利要求1的方法,其中所述鐵的來源是可溶性鐵化合物。
6.權(quán)利要求5的方法,其中所述可溶性鐵化合物選自亞鐵鹽或鐵鹽或它們的簡單螯合物。
7.權(quán)利要求6的方法,其中所述可溶性鐵化合物選自硫酸亞鐵、檸檬酸亞鐵、檸檬酸鐵或鐵銨離子化合物。
8.權(quán)利要求7的方法,其中所述鐵銨離子化合物選自檸檬酸鐵銨、草酸鐵銨、延胡索酸鐵銨、蘋果酸鐵銨或琥珀酸鐵銨。
9.權(quán)利要求7的方法,其中所述鐵銨離子化合物是檸檬酸鐵銨。
10.體外培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞系的方法,包含(a)將骨髓瘤細(xì)胞系接種于培養(yǎng)基中,所述的培養(yǎng)基能夠支持所述骨髓瘤細(xì)胞系的生長并且含有培養(yǎng)基中的濃度從約0.2mg/L到約20mg/L的檸檬酸鐵銨,其中所述的培養(yǎng)基不含有運(yùn)鐵蛋白、親脂性螯合劑、合成的含氮螯合劑或親脂性合成的含氮螯合劑;和(b)在恰當(dāng)?shù)臈l件下并使用攪拌型懸浮培養(yǎng)來使所述接種的培養(yǎng)基生長。
11.權(quán)利要求10的方法,其中所述檸檬酸鐵銨在培養(yǎng)基中存在的濃度從約0.2mg/L到約15mg/L。
12.權(quán)利要求10的方法,其中所述檸檬酸鐵銨在培養(yǎng)基中存在的濃度從約0.4mg/L到約10mg/L。
13.權(quán)利要求10的方法,其中所述檸檬酸鐵銨在培養(yǎng)基中存在的濃度從約1mg/L到約2mg/L。
14.權(quán)利要求1或10的方法,其中所述培養(yǎng)基不含血清、不含蛋白、不含動(dòng)物來源的或化學(xué)限定的組分。
15.權(quán)利要求1或10的方法,其中所述骨髓瘤細(xì)胞系選自NSO系列,P3系列,MOPC系列,MPC-11,J558L,K6H6/B5,45.6.TG1.7,Y0,Y3 HTK,RPMI8226或U266B1。
16.權(quán)利要求1或10的方法,其中所述骨髓瘤細(xì)胞系是NSO細(xì)胞系。
17.培養(yǎng)基用于支持骨髓瘤細(xì)胞系在攪拌型懸浮培養(yǎng)條件的體外生長的用途,其中所述培養(yǎng)基含有培養(yǎng)基中的濃度從約0.03mg/L到約3.2mg/L的鐵,其中所述培養(yǎng)基不含運(yùn)鐵蛋白、親脂性螯合劑、合成的含氮螯合劑或親脂性合成的含氮螯合劑。
18.權(quán)利要求17的用途,其中培養(yǎng)基中的鐵濃度從約0.03mg/L到約2.4mg/L。
19.權(quán)利要求17的用途,其中培養(yǎng)基中的鐵濃度從約0.064mg/L到約1.6mg/L。
20.權(quán)利要求17的用途,其中培養(yǎng)基中的鐵濃度從約0.16mg/L到約0.32mg/L。
21.權(quán)利要求17的用途,其中所述鐵的來源是可溶性鐵化合物。
22.權(quán)利要求21的用途,其中所述可溶性鐵化合物選自亞鐵鹽或鐵鹽或它們的簡單螯合物。
23.權(quán)利要求21所述的用途,其中所述可溶性鐵化合物選自硫酸亞鐵、檸檬酸亞鐵、檸檬酸鐵、或鐵銨離子化合物。
24.權(quán)利要求21所述的用途,其中所述鐵銨離子化合物選自檸檬酸鐵銨、草酸鐵銨、延胡索酸鐵銨、蘋果酸鐵銨或琥珀酸鐵銨。
25.權(quán)利要求24所述的用途,其中所述鐵銨離子化合物是檸檬酸鐵銨。
26.培養(yǎng)基用于支持骨髓瘤細(xì)胞系在攪拌型懸浮培養(yǎng)條件下的體外生長的用途,其中所述培養(yǎng)基含有培養(yǎng)基中的濃度從約0.2mg/L到約20mg/L的檸檬酸鐵銨,其中所述的培養(yǎng)基不含運(yùn)鐵蛋白、親脂性螯合劑、合成的含氮螯合劑或親脂性合成的含氮螯合劑。
27.權(quán)利要求26的用途,其中所述檸檬酸鐵銨在培養(yǎng)基中存在的濃度從約0.2mg/L到約15mg/L。
28.權(quán)利要求26的用途,其中所述檸檬酸鐵銨在培養(yǎng)基中存在的濃度從約0.4mg/L到約10mg/L。
29.權(quán)利要求26的用途,其中所述檸檬酸鐵銨在培養(yǎng)基中存在的濃度從約1mg/L到約2mg/L。
30.權(quán)利要求17或26的用途,其中所述培養(yǎng)基不含血清、不含蛋白、不含動(dòng)物來源的或化學(xué)限定的組分。
31.權(quán)利要求17或26的用途,其中所述骨髓瘤細(xì)胞系選自NSO系列,P3系列,MOPC系列,MPC-11,J558L,K6H6/B5,45.6.TG1.7,Y0,Y3 HTK,RPMI8226或U266B1。
32.權(quán)利要求17或26的用途,其中所述骨髓瘤細(xì)胞系是NSO細(xì)胞系。
33.得到哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)物的方法,其包含在攪拌型懸浮培養(yǎng)和能夠支持所述骨髓瘤細(xì)胞系生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能生產(chǎn)所述產(chǎn)物的骨髓瘤細(xì)胞,所述培養(yǎng)基含有培養(yǎng)基中的濃度從約0.03mg/L到約3.2mg/L的鐵,其中所述的培養(yǎng)基不含運(yùn)鐵蛋白、親脂性螯合劑、合成的含氮螯合劑或親脂性合成的含氮螯合劑;和回收所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)物。
34.權(quán)利要求33的方法,其中所述培養(yǎng)基中的鐵的濃度從約0.03mg/L到約2.4mg/L。
35.權(quán)利要求33的方法,其中所述培養(yǎng)基中的鐵的濃度從約0.064mg/L到約1.6mg/L。
36.權(quán)利要求33的方法,其中所述培養(yǎng)基中的鐵的濃度從約0.16mg/L到約0.32mg/L。
37.權(quán)利要求33的方法,其中所述鐵的來源是可溶性鐵化合物。
38.權(quán)利要求37的方法,其中所述可溶性鐵化合物選自亞鐵鹽或鐵鹽或它們的簡單螯合物。
39.權(quán)利要求37的方法,其中所述可溶性鐵化合物選自硫酸亞鐵、檸檬酸亞鐵、檸檬酸鐵、或鐵銨離子化合物。
40.權(quán)利要求39的方法,其中所述鐵銨離子化合物選自檸檬酸鐵銨、草酸鐵銨、延胡索酸鐵銨、蘋果酸鐵銨或琥珀酸鐵銨。
41.權(quán)利要求40的方法,其中所述鐵銨離子化合物是檸檬酸鐵銨。
42.得到哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)物的方法,其包含在攪拌型懸浮培養(yǎng)和能夠支持所述骨髓瘤細(xì)胞系的生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生所述產(chǎn)物的骨髓瘤細(xì)胞,所述培養(yǎng)基含有培養(yǎng)基中的濃度從約0.2mg/L到約20mg/L的檸檬酸鐵銨,其中所述培養(yǎng)基不含運(yùn)鐵蛋白、親脂性螯合劑、合成的含氮螯合劑或親脂性合成的含氮螯合劑;和回收所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)物。
43.權(quán)利要求42的方法,其中所述檸檬酸鐵銨在培養(yǎng)基中存在的濃度從約0.2mg/L到約15mg/L。
44.權(quán)利要求42的方法,其中所述檸檬酸鐵銨在培養(yǎng)基中存在的濃度從約0.4mg/L到約10mg/L。
45.權(quán)利要求42的方法,其中所述檸檬酸鐵銨在培養(yǎng)基中存在的濃度從約1mg/L到約2mg/L。
46.權(quán)利要求33或42的方法,其中所述培養(yǎng)基不含血清、不含蛋白、不含動(dòng)物來源的或化學(xué)限定的組分。
47.權(quán)利要求33或42的方法,其中所述骨髓瘤細(xì)胞系選自NSO系列,P3系列,MOPC系列,MPC-11,J558L,K6H6/B5,45.6.TG1.7,Y0,Y3 HTK,RPMI8226或U266B1。
48.權(quán)利要求33或42的方法,其中所述骨髓瘤細(xì)胞系是NSO細(xì)胞系。
49.權(quán)利要求33或42的方法,其中所述細(xì)胞產(chǎn)物選自多肽、蛋白、激素、淋巴因子、白介素、或工業(yè)上和治療上有用的酶。
50.權(quán)利要求49的方法,其中所述細(xì)胞產(chǎn)物是抗體或其片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及在培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法,所述培養(yǎng)基不含運(yùn)鐵蛋白并且不含親脂性或合成的含氮螯合劑。本發(fā)明也提供這種培養(yǎng)基的用途,和通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生產(chǎn)物的哺乳動(dòng)物細(xì)胞從而提供哺乳動(dòng)物產(chǎn)物的方法。
文檔編號(hào)C12N5/09GK1867665SQ200480029709
公開日2006年11月22日 申請(qǐng)日期2004年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月8日
發(fā)明者馬修·D·奧斯本, 喬納森·H·登普西 申請(qǐng)人:劍橋抗體技術(shù)有限公司
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1
九江市| 吴桥县| 建昌县| 武夷山市| 十堰市| 温州市| 个旧市| 平陆县| 石门县| 邹城市| 哈密市| 双柏县| 文成县| 安陆市| 延安市| 讷河市| 海丰县| 丰宁| 五常市| 寿宁县| 谷城县| 漳浦县| 金坛市| 崇州市| 靖宇县| 平阳县| 府谷县| 延津县| 望奎县| 乌苏市| 珠海市| 黄山市| 阿合奇县| 花莲县| 湖北省| 伊金霍洛旗| 宕昌县| 林周县| 日照市| 涿鹿县| 晋宁县|