專利名稱：鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種的分子檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis)(MAP)的分子檢測。更具體的是，該發(fā)明涉及使用數(shù)對寡核苷酸引物的PCR分析方法，所述的數(shù)對寡核苷酸引物靶向于MAP中特有的IS900元件的不同基因區(qū)，以用于MAP的分子檢測和鑒定。
背景技術(shù)：
從微生物鑒定的角度來看鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(MAP)是營養(yǎng)苛求菌，它會導(dǎo)致多種動物物種的嚴(yán)重并常常致命的疾病，即副結(jié)核病。進(jìn)一步的，越來越多的報告暗示這種AMP細(xì)菌是人類某些感染性腸道疾病的發(fā)病機(jī)理(Chiodini，1989)，(Chamberlin等，2001)。
迄今為止通過廣泛應(yīng)用分子技術(shù)促進(jìn)了對MAP的鑒定。然而，需要證實(shí)結(jié)果常常使得現(xiàn)有技術(shù)繁瑣，而且實(shí)際上僅僅在研究應(yīng)用中是可行的。
更具體的說，通過血清學(xué)獲得的MAP感染的診斷需要進(jìn)一步確證，從而避免出現(xiàn)常常在感染早期階段以及與自然界中發(fā)現(xiàn)的與遺傳性相關(guān)的分枝桿菌種屬的交叉反應(yīng)記錄下來的假陰性結(jié)果(Ridge等1991；Nielsen等2001)。細(xì)菌培養(yǎng)作為一種診斷和鑒定方法，其使用因?yàn)镸AP的生長所需要的培育期很長而被削弱。
因此，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)一直被認(rèn)為是對上述細(xì)菌進(jìn)行檢測和鑒定非常有用的工具(Hance等，1989)。然而，對分子技術(shù)來說，結(jié)果的鑒定是非常必要的，尤其當(dāng)分子技術(shù)被應(yīng)用于日常診斷時。這通常建議結(jié)合雜交分析方法，然而雜交分析方法會使整個過程繁瑣并且實(shí)際上僅僅對于科研應(yīng)用是可行的。
因此，可靠地結(jié)合到臨床物質(zhì)MAP的常規(guī)鑒定中的基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的低成本快速方法就有很重要的意義。低成本必須與高敏感性和特異性相結(jié)合。確保結(jié)果經(jīng)常能被重復(fù)也是非常重要的，特別是由于常常發(fā)現(xiàn)在實(shí)際中在一個實(shí)驗(yàn)室效果很令人滿意的方法，當(dāng)使用到另一個實(shí)驗(yàn)室得到的結(jié)果不能使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明已經(jīng)開發(fā)了一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的低成本快速方法，該方法能可靠地結(jié)合到臨床或任何其他材料的MAP的常規(guī)鑒定中。
為了確保所提出的分析方法的可靠性和不同實(shí)驗(yàn)室中結(jié)果的再現(xiàn)性，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)交叉檢驗(yàn)。
本發(fā)明使得開發(fā)一種用于對人體，動物，植物或其它源中的組織樣本的MAP的日常檢測和鑒定方法成為可能。所述方法不僅會被應(yīng)用到臨床材料中，而且也可應(yīng)用到人體，動物，植物源，塵土，常見的食品等其他材料上。
所提出的分析方法將最佳性能和成本與高再現(xiàn)性結(jié)合起來，無論在各種特殊的條件和實(shí)際的情況下，該分析方法在不同實(shí)驗(yàn)室中都是可行的。
本發(fā)明通過開發(fā)PCR分析法而實(shí)現(xiàn)的，其中所述的PCR分析法使用一種或多種如下所述的寡核苷酸引物P1N GCATGGCCCACAGGACGTTGAGP2N CTACAACAAGAGCCGTGCCGP3N GGGTGTGGCGTTTTCCTTCGP4N TCCTGGGCGCTGAGTTCCTC在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，為了形成寡核苷酸組，使用了組合的寡核苷酸引物。優(yōu)選的寡核苷酸組是P1N/P3N，PIN/P4N，P2N/P3N，P2N/P4N，P1N/P2N/P3N，P1N/P2N/P4N，PIN/P3N/P4N，P2N/P3N/P4N。特別優(yōu)選的是包括所有4個寡核苷酸引物的寡核苷酸組，即PIN/P2N/P3N/P4N。
這些引物靶向于MAP中特有的IS900元件的基因區(qū)并且使鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(MAP)的檢測有效、快速及可靠。在更多的引物中選用這些引物是因?yàn)樗麄兙哂懈玫慕Y(jié)果。
發(fā)明詳述為了可靠地檢測MAP，發(fā)現(xiàn)優(yōu)選在單管PCR分析中使用上述寡核苷酸引物-單獨(dú)或者結(jié)合。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，為了形成寡核苷酸組使用了組合的寡核苷酸引物。用于MAP檢測的寡核苷酸組是P1N/P2N，P3N/P4N，P1N/P3N，P1N/P4N，P2N/P3N，P2N/P4N，P1N/P2N/P3N，P1N/P2N/P4N，P1N/P3N/P4N，P2N/P3N/P4N。
在另一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用了包括所有4種寡核苷酸引物的寡核苷酸組，即PIN/P2N/P3N/P4N。另一個優(yōu)選的是使用了單管巢式PCR，使用了所有4種核苷酸引物，即PIN/P2N/P3N/P4N。
為了通過PCR獲得可靠檢測MAP的方法，在幾個實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行了測試，其中一些甚至在不同的國家進(jìn)行。為了檢測該方法的精確性和可靠性，通常組成PCR反應(yīng)的所有不同參數(shù)都未被協(xié)調(diào)，并且這個因素也被合并到對我們的方法的評估中。關(guān)于MAP上述方法以前從沒有被描述過。
不同的實(shí)驗(yàn)室承擔(dān)評價DNA提取步驟和用于MAP檢測的不同PCR分析方法的工作。對DNA的提取，使用了內(nèi)部(in-house)和商用兩種方法，而對PCR，評估了大量的不同的分析方法，首先使用擴(kuò)展的GenBank數(shù)據(jù)庫檢索來評價引物的特異性。
因此，我們對靶向于MAP中特有的IS900元件的不同基因區(qū)的單管巢式，雙管巢式，和單個，PCR分析法作出結(jié)論。這四種方法應(yīng)用于陽性和陰性對照樣本中，所述的樣本包括純細(xì)菌培養(yǎng)物和福爾馬林固定的石蠟包埋的組織樣本(FFPE)，其中所述的組織樣本取自患有副結(jié)核病的牛和鳥分支桿菌感染的雞。在所進(jìn)行的測試中，所有的樣本用編號數(shù)進(jìn)行識別，而且合作的實(shí)驗(yàn)室間互相交流得到的結(jié)果?；诳煽啃院统杀镜臉?biāo)準(zhǔn)，實(shí)施較好的方法是使用上述寡核苷酸引物的單管巢式PCR分析法，同時結(jié)合內(nèi)部DNA提取方法。該方法從所使用的陽性和陰性對照樣本中得到了預(yù)想的結(jié)果，甚至在遺傳相關(guān)的分枝桿菌菌屬之間具有差異性。通過進(jìn)行測試的不同實(shí)驗(yàn)室得到的一致性結(jié)果表明了甚至在不同的實(shí)驗(yàn)室條件下該方法的可靠性。


圖1表示B1，B2，B3和B4方法的PCR產(chǎn)品的電泳的代表性結(jié)果，所述方法用于檢測從牛和雞身上得到的FFPE樣品。
更具體的，帶1表示100bp(Biolabs)DNA梯帶，帶2～4表示在牛的小腸的樣本上實(shí)施PCR的DNA產(chǎn)品，帶5表示在牛腸淋巴結(jié)的樣本上實(shí)施PCR得到的DNA產(chǎn)品，
帶6～7表示在牛回腸的樣本上實(shí)施PCR分析法得到的DNA產(chǎn)品，帶8表示從雞脾樣品得到的PCR結(jié)果，帶9表示從雞肝樣品得到的PCR結(jié)果，帶T表示從陰性對照樣品(沒有DNA)得到的PCR結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)例材料DNA從培養(yǎng)物和臨床材料(福爾馬林固定的石蠟包埋的組織樣本(FFPE))中提取，將下面所述的分子技術(shù)在其上實(shí)施。
更具體的，使用了鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(MAP)的10個菌株和分枝桿菌亞種的各種其它成員的30個菌株的培養(yǎng)物(如表1中詳細(xì)描述的)。為了評估所述方法的特異性，使用了幾種遺傳相關(guān)的菌種(大腸桿菌(Escherichia coli)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，沙門氏菌(Salmonella spp.)，腸桿菌屬(Enterobacterspp.)的培養(yǎng)物。
在所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中包括的臨床材料(組織樣本)包括從牛和雞上采集的福爾馬林固定的石蠟包埋的(FFPE)樣本，使用了具有副結(jié)核病典型損害的牛的10個腸FFPE樣本。使用了具有分枝桿菌感染的典型損傷的雞的等數(shù)量肝和腸的FFPE樣本。分別通過MAP和鳥分枝桿菌亞種(Mycobacterium avium subsp.avium)(MAA)培養(yǎng)，來自于牛和雞的對應(yīng)的臨床材料是陽性。此外，檢測了30個新鮮的和FFPE的腸和淋巴結(jié)樣本，所述的樣本是從沒有分枝桿菌感染的臨床和其他指示的人和動物中采集的。這些材料被用作陰性對照(該書據(jù)沒有顯示本說明書中)。
方法A)從FFPE組織樣本和細(xì)菌培養(yǎng)物中提取DNA使用兩種方法從FFPE的樣本中提取DNA，均使用2到3個石蠟切片上，每個樣品10微米厚A1.為了提取DNA，使用如前述(內(nèi)部方法)(Ikonomopoulos等1999)，所述材料通過在60度的二甲苯，和100％乙醇，以及最后用75％乙醇重復(fù)培育進(jìn)行脫蠟。上述過程的產(chǎn)物在50度溫度中在SDS和蛋白酶K中培育約1小時，以使它隨后被消化。
通過依次加入苯酚、苯酚-氯仿-異戊醇溶液除去蛋白質(zhì)。隨后，DNA在乙醇和醋酸鈉中沉淀(Sambrook等1989)并以沉淀形式被收集，然后將其溶解在50ul的TE緩沖液中。
A2.另一種方法，使用微生物裂解試劑盒(MicroLysis kit)(Microzone)根據(jù)生產(chǎn)者的使用說明DNA從FFPE樣本中提取DNA。
從細(xì)菌中提取DNA是通過CTAB-蛋白酶K，然后使用苯酚和苯酚-氯仿-異戊醇的組合進(jìn)行的。DNA的提取如上述的通過乙醇和醋酸鈉沉淀。
對DNA提取物的質(zhì)量評估，其中包括數(shù)量，純度以及完整性，是通過光學(xué)密度計算和瓊脂糖凝膠電泳來進(jìn)行的。
B)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)評估了大量的的PCR分析方法，首先利用NCBI BLAST軟件通過擴(kuò)展的GenBank數(shù)據(jù)庫檢索來評價引物的特異性。因此，使用總數(shù)為7對的寡核苷酸引物進(jìn)行4個不同的PCR分析法進(jìn)行總結(jié)和評價，其中所述的寡核苷酸引物靶向于MAP中特有的IS900元件的不同基因區(qū)。這些不同的PCR分析法將在下述的B1、B2、B3、B4中更具體的描述。
B1.第一種對照PCR分析法是用寡核苷酸引物IS900-F和IS900-R(見表2)。這些引物對MAP的IS900元件的707bp DNA碎片進(jìn)行了擴(kuò)增(Green等1989)。
B2.另一種對照PCR分析法是巢式PCR分析法，使用引物s204和s749(表2)對MAP的IS900元件的563bpDNA碎片進(jìn)行了擴(kuò)增。該反應(yīng)的產(chǎn)物被1∶10稀釋，然后合并到第二步反應(yīng)中，用引物s345和s535(表2)對563bpDNA碎片中的210bpDNA碎片進(jìn)行了擴(kuò)增，其中所述的563bpDNA碎片通過s204-s749引物擴(kuò)增(Englund等1999)。
B3.另一種對照PCR分析法是巢式PCR分析法，使用引物IS01和IS04(表2)對IS900元件的302bp DNA碎片進(jìn)行擴(kuò)增。該反應(yīng)的產(chǎn)物被1∶10稀釋，然后合并到第二步反應(yīng)中用引物IS02和IS03(表2)擴(kuò)增302bp DNA碎片中的159bp DNA碎片，其中所述的302bp DNA碎片先前已被擴(kuò)增過。
B4.最后，根據(jù)本發(fā)明的一種PCR分析法是包括引物P1N、P2N、P3N和P4N的單管巢式PCR分析法(表2)。將所有的引物同時加入到擴(kuò)增S900元件的257bp DNA碎片的PCR反應(yīng)的混合物中。
用50mM KCl，10mM Tris-HCl(室溫，pH8.4)，1.5mM MgCl2，每一種寡核苷酸引物為0.25uM，200uM dNTPs，2.5單位Taq聚合酶(Promega)，0.05-0.1ug DNA，以及HPLC品質(zhì)的水使終體積對分析法B1和B4是50ul，對分析法B2和B3是25ul來制備上面提到的每一種PCR分析法中的反應(yīng)混合物。
用于分析法B1～B3中(表3)的溫度分布包括起始5分鐘在94度變性，隨后在94度保持1分鐘，在63度保持1分鐘(用于分析法B1和B2)或62度保持1分鐘(用于分析法B3)，和在72度保持1分鐘，循環(huán)35次。接下來是在72度的10分鐘的培育步驟以完成DNA產(chǎn)品(表3)的擴(kuò)增。巢式反應(yīng)B2和B3的兩個步驟都是在相同的溫度分布條件下進(jìn)行的，與B4分析法相反，分析法B4(表3)巢式反應(yīng)中的兩個步驟中的每一個步驟包括不同的溫度分布。第一步包括在開始的變性步驟，在94度保持1分鐘，然后是在94度保持1分鐘，在54度保持1分鐘，在72度保持1分鐘，循環(huán)16次以及在94度保持1分鐘，在67度維持1分鐘，在72度保持1分鐘，循環(huán)30次，接下來的最后擴(kuò)增步驟是在72度保持3分鐘(表3)。PCR產(chǎn)品的分析通過2％的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠著色，和照像進(jìn)行的。
上述每一種方法的敏感度評估是按照先前介紹的(Ikonomopoulos等1998)方法，用從MAP培養(yǎng)物里提取的DNA的十倍稀釋溶液來確定的。
再現(xiàn)性評估在每一個不同實(shí)驗(yàn)室的不同特定條件下(熱循環(huán)器種類，DNA聚合酶種類，緩沖液)，將DNA提取方法和PCR分析法應(yīng)用在上述參考例子和臨床材料上。樣本通過標(biāo)號進(jìn)行識別且實(shí)驗(yàn)結(jié)果在不同實(shí)驗(yàn)室之間互相交流和比較。
結(jié)果A.DNA提取方法A1和A2，從所使用的FFPE樣本得到品質(zhì)和數(shù)量都令人滿意的DNA。由2～3個10um厚的石蠟切片所產(chǎn)生的DNA的數(shù)量估計為1ug/ul，而其品質(zhì)，指純度和完整性是一樣的，與DNA提取所使用的方法無關(guān)。然而，內(nèi)部方法(A1)，被證明雖然較繁瑣但成本顯著降低。
正如所期望的，使用內(nèi)部方法(A1)從細(xì)菌培養(yǎng)物中提取的DNA產(chǎn)品的質(zhì)量從數(shù)量和完整性上都很令人滿意。
B.PCR將上述四種PCR分析法(B1，B2，B3和B4)應(yīng)用在所使用的細(xì)菌培養(yǎng)物中提取的DNA上(表1)，實(shí)現(xiàn)了對被使用的所有MAP菌株進(jìn)行特異的檢測和鑒定。另一方面，對于細(xì)菌培養(yǎng)物和FFPE樣本來說，使用被評價的任何一種引物對，沒有任何一種陰性對照產(chǎn)生了陽性結(jié)果。對從患有副結(jié)核性腸炎(Johne′s disease)的牛上得到的10例FFPE樣本用B1、B2、B3和B4方法處理所記載的陽性結(jié)果數(shù)目分別為6、9、6和10(表4)(圖1)。
被評估的所有PCR方法的敏感度都令人滿意，尤其是使用巢式分析法。從細(xì)菌培養(yǎng)物里得到陽性結(jié)果所需的DNA的最低量為8pg(方法B4)，這相當(dāng)于大約1500個菌細(xì)胞(Baess等1984)。
C.再現(xiàn)性評估應(yīng)用方法B1到B4檢測細(xì)菌培養(yǎng)物和FFPE組織樣本中MAP在所有參與的實(shí)驗(yàn)室里產(chǎn)生出完全的一致性的結(jié)果。
更具體的是，發(fā)現(xiàn)方法B2和B3只有在聯(lián)合使用時才可能涵蓋診斷上的MAP全部范圍，方法B1也存在類似的問題。方法B4對MAP的檢測與所使用的材料無關(guān)。
基于我們的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)方法B4，即單管巢式PCR，它具有在相同的時間最高敏感度，特異性及再現(xiàn)性，同時在相同的時間它能在最短可能的時間內(nèi)和最低必須的成本下直接檢測結(jié)果。在從培養(yǎng)物中提取的細(xì)菌中，發(fā)現(xiàn)方法B1和B4檢測具有MAP的特異性。然而，只有方法B2和B4能檢測出使用的所有陽性FFPE樣本。這樣，盡管事實(shí)上所有的引物都是設(shè)計來檢測MAP，并且引物的合成是基于相同基因區(qū)(IS900)確定的。這個事實(shí)表明本發(fā)明仍具有另一個重要參數(shù)，以判斷所設(shè)計的評估步驟是正確的，以便于使用本發(fā)明的引物的方法使可靠的常規(guī)應(yīng)用出現(xiàn)錯誤結(jié)果最小化，而且不僅僅用于研究。
通過實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部合作也被檢測的方法B1和B3記載的差異性的結(jié)果并不奇怪。希望方法B1的敏感度低于巢式反應(yīng)，而將方法B3設(shè)計成特異地實(shí)現(xiàn)并提高方法B2的診斷效率。確實(shí)這被證實(shí)是正確的，因?yàn)榉椒˙2和B3的組合未能全部正確地鑒定陽性對照的FFPE樣本(圖1)。
方法B1和B3記載的結(jié)果的差異性也歸于MAP菌株的基因差異性，至少對所評估的FFPE樣本是這樣的。能夠常常導(dǎo)致錯誤陰性結(jié)果的PCR抑制劑的存在，尤其使用FFPE樣品(Hermon-Taylor等2000)，不是產(chǎn)生這種差異的原因，因?yàn)閷τ谒械腜CR反應(yīng)來說(方法B2和B4也是一樣)，使用的是相同的DNA樣本。同樣的原因，這些結(jié)果不能歸于潛在的DNA斷裂，因?yàn)镈NA提取過程的產(chǎn)品總是通過電泳和光譜法進(jìn)行評估，并且產(chǎn)生低質(zhì)量DNA的樣品總是被丟棄。最終，選擇IS900元件作為上述所有PCR反應(yīng)的通用的靶物也應(yīng)當(dāng)從能導(dǎo)致方法B1和B3無效的因素中排除出去。對某個DNA目標(biāo)區(qū)的選擇是強(qiáng)制性的，因?yàn)樽C明IS900元件的存在迄今為止是MAP的分子鑒定的先決條件(Green等1998)。
方法B4相比方法B2顯示重要的優(yōu)勢，雖然兩種方法都被認(rèn)為有充足診斷能力。更具體的是，方法B2是包含兩個連續(xù)步驟的PCR分析法。為了從一個步驟進(jìn)行到另一個步驟，在第一步期間所使用的試管必須打開，并且這對于感染來說是危險的，因?yàn)閺那按侮栃苑治龇ㄖ械玫降腄NA產(chǎn)品進(jìn)入下一步反應(yīng)的混合物中的可能性非常高，在實(shí)驗(yàn)室中這種情況很多(殘留效應(yīng))。相反，常常導(dǎo)致錯誤的陽性結(jié)果增加的事實(shí)通過方法B4可以避免，因?yàn)槌彩椒治龇ǖ乃薪M分共同置入反應(yīng)試管中，而且在分析過程中該試管是不被打開。除此之外，方法B4不僅對B2優(yōu)勢明顯，對B3也是一樣，因?yàn)樗臅r更少，成本更低。畢竟B4只需要一次單獨(dú)反應(yīng)，所以消耗的更少是必然的。
方法B4的上述優(yōu)勢和如下事實(shí)構(gòu)成了方法B4明顯優(yōu)于被評估的所有其他方法，所述的事實(shí)是指，如前面所提到的其他PCR化驗(yàn)法，結(jié)果可以在不需要內(nèi)部對照的情況下得到控制，若使用內(nèi)部對照，將極大提高成本和分析法的復(fù)雜程度，而且B4不需要DNA雜交，在其他方法中DNA雜交也會增加整個過程所需的時間。
除此之外，方法B4表現(xiàn)出很高的敏感度，這使得錯誤陰性結(jié)果出現(xiàn)的百分率非常低成為可能。進(jìn)一步的，所提出的分析法(B4)從所有使用的材料中專一地僅僅檢測出MAP的事實(shí)表明它具有很高的特異性，這也使得錯誤陰性結(jié)果的百分率非常低成為可能。從這方面來看，說明所述的分析法不僅對從培養(yǎng)物中提取的細(xì)菌而且對從感染鳥分枝桿菌雞身上取出的FFPE樣品也具有絕對的特異性是非常重要的，其中所述的鳥分枝桿菌特別表現(xiàn)出MAP的高基因相關(guān)性。與被評估的其他一些方法所預(yù)期的無效性相反，方法B4在各個合作實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)中所記載的結(jié)果的完全再現(xiàn)性使其可靠性又得到了提高并支持了上面的內(nèi)容。
總而言之，可以確證巢式PCR分析法B4以快速和相當(dāng)?shù)偷某杀緸樘卣?，同時它也允許檢測由福爾馬林固定的石蠟包埋的組織樣本中的MAP。后者得到證實(shí)不僅使用了我們的細(xì)菌培養(yǎng)物，而且使用在從雞身上取下的MAA-陽性的FFPE樣本，盡管后者與MAP具有很高的基因相似性。最后，由合作實(shí)驗(yàn)室使用所述的方法(B4)所得到的一致的結(jié)果使得反應(yīng)B4是用于MAP的常規(guī)診斷的最有前景的方法。
考慮到PCR反應(yīng)的技術(shù)基礎(chǔ)，所提出的使用特異的寡核苷酸引物的方法對于非臨床的樣本能夠產(chǎn)生同樣的結(jié)果(敏感度-特異性)，只要DNA提取步驟中得到的DNA品質(zhì)和上述方法得到的品質(zhì)類似。所提出的使用特異寡核苷酸引物的分析法的最優(yōu)性能已經(jīng)由對從希臘和捷克共和國采集到的奶酪和牛奶樣品的MAP檢測中得到證實(shí)，那些樣品同時也使用了不同的PCR分析法通過培養(yǎng)進(jìn)行了評價。
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表1用于評價所提出的PCR方法所用到的分枝桿菌菌屬的菌株數(shù)目.

RIVM公共健康和環(huán)境國家研究院，尼德蘭VRI獸醫(yī)研究院，捷克共和國表2寡核苷酸引物的組成。

表3反應(yīng)B1，B2，B3和B4的溫度分布。
溫度分布

*反應(yīng)B1是在一步中進(jìn)行的 簡而言之，在轉(zhuǎn)移siRNA之前24小時，將適量(5×104個細(xì)胞)的293細(xì)胞接種到含有D-MEM培養(yǎng)基(SIGMA)并補(bǔ)充了10％FBS和1％青霉素/鏈霉素的24孔板上，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞培養(yǎng)至約80％匯合。將3μl TransIT 293轉(zhuǎn)染試劑(Takara Bio)加入到50μl無血清培養(yǎng)基中。將混合物劇烈攪拌，再讓其在室溫下靜置5分鐘。向其中加入0.3μg pQBI25(Wako Pure Chemical Industries)，將所得混合物輕輕混和并讓其在室溫下靜置5分鐘。向其中加入4μlTransIT-TKO試劑，將所得混合物輕輕混和并讓其在室溫下靜置5分鐘。向其中加入500ng siRNA，將所得混合物輕輕混和并讓其在室溫下靜置5分鐘，得到DNA/siRNA溶液。將該DNA/siRNA溶液滴加到每孔250μl補(bǔ)充了10％FBS的D-MEM培養(yǎng)基中，將所得混合物輕輕混合，使各孔溶液變得均勻。將0.3μg pQBI25(Wako PureChemical Industries)或無菌水單獨(dú)加入到對照中。將細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。用FACS Vantage(Becton-Dickinson)對細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，以測定與僅用載體(DNA)的對照相比，轉(zhuǎn)移的DNA/siRNA溶液對GFP表達(dá)的抑制效果。結(jié)果見表1。
表1
如表1所示，與對照(僅有載體)相比，平均熒光強(qiáng)度值越小，表明RNA干擾越大。這表明，用hDiR所得到的siRNA表現(xiàn)出RNA<p>序列表&lt;110&gt;瓊尼斯·伊科洛墨帕羅斯&lt;120&gt;鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種的分子檢測&lt;130&gt;pt/03/421&lt;150&gt;GR 20030100421&lt;151&gt;2003-10-16&lt;160&gt;4&lt;170&gt;Patentln version 3.1&lt;210&gt;1&lt;211&gt;20&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;1cgaatgaccg atggtttgag 20&lt;210&gt;2&lt;211&gt;20&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;2ctaagagtta ctgcaacagt 20&lt;210&gt;3&lt;211&gt;20&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;3gggtgtggcg ttttccttcg 20&lt;210&gt;4&lt;211&gt;20&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;4tcctgggcgc tgagttcctc 20
權(quán)利要求
1.用于鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(Mycobacterium avium subspeciesparatuberculosis)(MAP)的檢測的寡核苷酸，所述寡核苷酸選自于下列序列的寡核苷酸的組P1NGCA TGG CCC ACA GGA CGT TGA GP2NCTA CAA CAA GAG CCG TGC CGP3NGGG TGT GGC GTT TTC CTT CGP4NTCC TGG GCG CTG AGT TCC TC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一個寡核苷酸或一個或多個寡核苷酸的組合的寡核苷酸組，尤其是下列寡核苷酸的組合P1N/P2N，P3N/P4N，P1N/P3N，P1N/P4N，P2N/P3N，P2N/P4N，P1N/P2N/P3N，P1N/P2N/P4N，PIN/P3N/P4N，P2N/P3N/P4N和/或P1N/P2N/P3N/P4N。
3.用于檢測樣本中的MA和/或MAP的方法，包含如下步驟(a)從樣本中分離出DNA；(b)使用被分離的DNA與權(quán)利要求1中所述的至少一個寡核苷酸進(jìn)行單管PCR；(c)篩選陽性PCR擴(kuò)增結(jié)果；(d)鑒定含有MAP的樣本，其中所述方法的特征在于在PCR中使用權(quán)利要求1中所述的至少一種寡核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的方法，使用權(quán)利要求2中所述的一組或多組寡核苷酸，尤其是包含所有四個寡核苷酸的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，用于檢測來自活體動物的樣本中的MAP、從活體動物中得到的產(chǎn)物，和/或從無生命源中，特別是從灰塵或植物中所得到的樣本，其中所述的活體動物包括人類或者動物，特別是牛，家禽或雞。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4中所述的方法用于診斷活體動物中MAP感染，所述的活體動物包括人類，特別是牛，家禽或雞。
7.用于檢測樣品中MAP的試劑盒，所述試劑盒包括a)將DNA從樣品中分離出來的裝置；b)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸和/或權(quán)利要求2所述的寡核苷酸組；c)篩選陽性PCR擴(kuò)增的結(jié)果的裝置；d)鑒定含有MAP的樣品的裝置。
8.試劑盒包括權(quán)利要求1所述的一個或多個寡核苷酸，和/或權(quán)利要求2所述的一個或多個寡核苷酸組和一個容器。
9.試劑盒包含權(quán)利要求1所述的所有四個寡核苷酸和一個容器。
10.據(jù)權(quán)利要求7，8或9所述的試劑盒用于權(quán)利要求3和/或4所述的方法中。
全文摘要
本發(fā)明涉及鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(MAP)的分子檢測和鑒定。更具體的是，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了使用一個或多個靶向于MAP所特有的IS900元件的不同的基因區(qū)的寡核苷酸引物開發(fā)PCR分析法的目的。
文檔編號C12Q1/68GK1867682SQ200480030391
公開日2006年11月22日 申請日期2004年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月16日
發(fā)明者瓊尼斯·伊科洛墨帕羅斯, 瓦西利斯·哥高里斯, 瑪利亞·卡宙里, 伊沃·帕弗里克, 米蘭·巴托斯 申請人:瓊尼斯·伊科洛墨帕羅斯