專利名稱：改良的siRNA分子和應(yīng)用該改良的siRNA分子的抑制基因表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及RNAi現(xiàn)象引起的基因沉默，更具體而言，涉及經(jīng)過改良的siRNA和使用其的基因表達(dá)抑制方法。
背景技術(shù)：
RNAi(RNA干擾)是由雙鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后抑制機(jī)制。該現(xiàn)象已在蒼蠅、昆蟲、原生動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、高等植物等多種物種觀察到。有關(guān)RNAi在分子水平上的作用機(jī)制，根據(jù)對(duì)果蠅(Drosophila)和線蟲(Caenorhabditis elegans)的多項(xiàng)研究表明，被稱為siRNA(短鏈干擾RNA)的21-25個(gè)核苷酸長(zhǎng)的RNA片段是RNAi所必須的序列特異性中介體(Hammond，S.M.等人，Nature404，293-296，2000；Parrish，S.等人，Mol.Cell.6，1077-1087，2000；Zamore，P.D.等人，Cell 101，25-33，2000)，并且該siRNA是由長(zhǎng)的雙鏈RNA在RNase III樣核酸酶Dicer的作用下生成(Brenstein，E.等人，Nature 409，363-366，2001；Elbashir，S.M.等人，Genes Dev.15，188-200，2001)。
起初認(rèn)為，對(duì)于哺乳動(dòng)物而言，RNAi現(xiàn)象僅存在于卵母細(xì)胞和著床前的胚。哺乳動(dòng)物細(xì)胞一般具有作為序列非特異性RNase的Rnase L介導(dǎo)的快速且非特異性RNA分解途徑、干擾素誘導(dǎo)的雙鏈RNA依賴性蛋白激酶(PKR)介導(dǎo)的快速翻譯阻斷途徑，這些都是由30個(gè)核苷酸以上的雙鏈RNA激活。因而，在除未分化細(xì)胞和PKR缺失的分化細(xì)胞以外的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，常常存在序列特異性RNAi活性因上述對(duì)30個(gè)核苷酸以上的雙鏈RNA的應(yīng)答而被掩蓋的現(xiàn)象。最近，據(jù)報(bào)道，合成的具有21個(gè)核苷酸的siRNA的二聚體可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中特異性阻斷內(nèi)源性基因的表達(dá)(Elbashir，S.M.等人，Nature 411，494-498，2001)。
RNAi介導(dǎo)的基因表達(dá)抑制的原理一般認(rèn)為如下。首先，當(dāng)siRNA被導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，其和多蛋白復(fù)合體結(jié)合，形成RISC(RNA誘導(dǎo)型沉默復(fù)合體)。接著，該RISC結(jié)合于靶基因的mRNA，再在其核酸酶的作用下，切斷mRNA中與siRNA結(jié)合的部分。由此，靶基因的蛋白質(zhì)表達(dá)被阻斷。
最近，利用將合成的siRNA導(dǎo)入細(xì)胞產(chǎn)生的RNAi現(xiàn)象的方法，作為基因表達(dá)的抑制方法，被廣泛關(guān)注和應(yīng)用。siRNA的構(gòu)成和基因表達(dá)抑制效果之間的關(guān)系也作為研究的對(duì)象。
例如，Hohjoh H.在報(bào)告(Hohjoh H.，F(xiàn)EBS Letters 521，195-199，2002)中，針對(duì)對(duì)應(yīng)于螢火蟲熒光素酶(Photinus luciferase)基因的各種雙鏈寡核苷酸，研究了它們對(duì)該基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)抑制效果。據(jù)該報(bào)告所記載正義鏈和反義鏈3’末端的2個(gè)核糖核苷酸突出端，反義鏈的結(jié)構(gòu)很重要，并且，基因表達(dá)的抑制效果會(huì)因?qū)ο蠡虻陌行蛄械牟煌兴町悺?br> Hamada M.等人的報(bào)告(Hamada M.等人，Antisense Nucleic AcidDrug Dev.12，301-309，2002)中，采用在正義鏈和/或反義鏈各自3’末端以外的部分中一個(gè)以上不連續(xù)位點(diǎn)引入了與靶序列錯(cuò)配的核苷酸的siRNA，研究其對(duì)靶基因的表達(dá)抑制效果。據(jù)該報(bào)告記載，基因表達(dá)抑制效果因反義鏈中存在的與靶序列的錯(cuò)配而降低，然而另一方面，正義鏈中的錯(cuò)配對(duì)基因表達(dá)抑制效果沒有影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，針對(duì)siRNA，通過在其正義鏈的雙鏈部分的3’末端的幾個(gè)核苷酸位點(diǎn)，導(dǎo)入與反義鏈的錯(cuò)配，該siRNA對(duì)基因表達(dá)抑制效果得到增強(qiáng)。進(jìn)而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，siRNA中通過在其正義鏈的雙鏈部分的5’末端的幾個(gè)核苷酸位點(diǎn)，導(dǎo)入與反義鏈的錯(cuò)配，該siRNA的基因表達(dá)抑制效果被降低。本發(fā)明是基于這些發(fā)現(xiàn)而完成的。
因而，本發(fā)明的目的在于，提供為調(diào)控siRNA對(duì)基因表達(dá)的抑制效果而對(duì)其改良所得的雙鏈RNA分子，以及使用該改良后的siRNA的基因表達(dá)抑制方法。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的雙鏈RNA分子是能夠通過RNAi作用抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因的表達(dá)的雙鏈RNA分子，其雙鏈部分中正義鏈的3’末端依次有1個(gè)以上的核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸，且其雙鏈部分的正義鏈中與反義鏈互補(bǔ)的核苷酸的數(shù)目是能夠使雙鏈在上述細(xì)胞內(nèi)雜交的數(shù)目。
進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的雙鏈RNA分子是能夠通過RNAi作用抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因的表達(dá)的雙鏈RNA分子，其該雙鏈部分的正義鏈的5’末端依次有1個(gè)以上的核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸，且該雙鏈部分的正義鏈中與反義鏈互補(bǔ)的核苷酸的數(shù)目是能夠使雙鏈在上述細(xì)胞內(nèi)雜交的數(shù)目。
進(jìn)而，本發(fā)明的基因表達(dá)抑制方法是包含將本發(fā)明的雙鏈RNA分子導(dǎo)入細(xì)胞的步驟的抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因的表達(dá)的方法。
在利用RNAi現(xiàn)象抑制靶基因表達(dá)的方法中，基于本發(fā)明，可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)抑制效率的調(diào)控。


圖1表示的是各種siRNA對(duì)HeLa細(xì)胞中的螢火蟲熒光素酶基因的表達(dá)的抑制效果的雙熒光素酶基因檢測(cè)結(jié)果的示意圖。
圖2是各種siRNA基因?qū)eLa細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性基因的表達(dá)抑制效果的示意圖。
圖3是在正義鏈3’末端含有錯(cuò)配的siRNA分子(La21-3’m2)和不含錯(cuò)配的siRNA分子(La21-conv.)對(duì)兩種質(zhì)粒的報(bào)告基因的表達(dá)水平的影響的棒狀示意圖。
具體實(shí)施例方式
本說明書中，“雙鏈RNA”指的是兩條單RNA分子全部或部分雜交所得的RNA分子。構(gòu)成各單鏈RNA的核苷酸數(shù)目可以不同。此外，構(gòu)成雙鏈RNA的一條或者兩條核苷酸鏈也可包含單鏈部分(突出端)。
本說明書中，“雙鏈部分”指的是，在雙鏈RNA中，兩條鏈中核苷酸配對(duì)的部分，即，除雙鏈RNA的單鏈部分以外的部分。
本說明書中，“正義鏈”指的是，具有和基因編碼鏈相同的序列的核苷酸鏈，“反義鏈”指的是，具有與基因編碼鏈互補(bǔ)的序列的核苷酸鏈。
本說明書中，“互補(bǔ)”指的是，兩個(gè)核苷酸在雜交條件下能夠配對(duì)，例如，腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)之間的關(guān)系，以及胞嘧啶(C)和鳥嘌呤(G)之間的關(guān)系。
能夠通過RNAi抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因表達(dá)的雙鏈RNA分子，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可基于有關(guān)RNAi的現(xiàn)有知識(shí)很容易地設(shè)計(jì)。一般來說，首先，在靶基因中選擇其基因特異性區(qū)域，將在細(xì)胞內(nèi)能夠和該區(qū)域特異性雜交的核糖核苷酸鏈作為上述雙鏈RNA分子的反義鏈。此處，“特異性區(qū)域”指的是，在能夠?qū)嵤┌谢虻谋磉_(dá)抑制的細(xì)胞內(nèi)，具有其它核酸分子所不具有的序列的區(qū)域。此外，“能夠特異性雜交”指的是，該反義鏈在能夠?qū)嵤┌谢虻谋磉_(dá)抑制的細(xì)胞內(nèi)，和除靶基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以外的核酸分子不能雜交。上述反義鏈含有與上述特異性區(qū)域相對(duì)應(yīng)的序列，但并不需要具有上述特異性區(qū)域的完全互補(bǔ)序列，只要是能夠和該特異性區(qū)域特異性雜交，即使含有非互補(bǔ)核苷酸也可以。然而，上述反義鏈優(yōu)選具有完全互補(bǔ)序列。雙鏈RNA分子的正義鏈含有與反義鏈完全互補(bǔ)的序列。
從靶基因中選出的上述特異區(qū)域，優(yōu)選僅選自靶基因的外顯子。此外，上述特異性區(qū)域一般優(yōu)選選自除5’末端和3’末端非翻譯區(qū)(UTR)和翻譯起始密碼子周圍以外的部分，例如，在包含外顯子和內(nèi)含子兩者的序列中，優(yōu)選距離翻譯起始密碼子3’側(cè)50個(gè)核苷酸以上的區(qū)域，更優(yōu)選距翻譯起始密碼子3’側(cè)75個(gè)核苷酸以上的區(qū)域，尤其優(yōu)選距離100個(gè)核苷酸以上的區(qū)域。上述特異性區(qū)域的長(zhǎng)度沒有特殊限制，但優(yōu)選是15個(gè)核苷酸以上，更優(yōu)選是17個(gè)核苷酸以上，進(jìn)而優(yōu)選是19個(gè)核苷酸以上，尤其優(yōu)選是19-23個(gè)核苷酸，更加優(yōu)選是19-21個(gè)核苷酸。
上述雙鏈RNA分子的反義鏈，可以在與正義鏈的核苷酸互補(bǔ)配對(duì)而成的雙鏈部分的3’末端側(cè)含有單鏈部分(突出端)。該單鏈部分的核苷酸序列，可以是靶基因的關(guān)聯(lián)序列，也可以是與靶基因不相關(guān)的序列，其長(zhǎng)度也沒有特殊限制，優(yōu)選2個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的序列，更優(yōu)選是2個(gè)尿殘基(UU)。正義鏈也可以具有類似突出端。
根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的雙鏈RNA分子是在上述那樣的雙鏈RNA分子中，其自雙鏈部分中的正義鏈3’末端依次有1個(gè)以上核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸的雙鏈RNA分子。即，根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的雙鏈RNA分子的正義鏈在自其雙鏈部分的3’末端依次有1個(gè)以上與反義鏈錯(cuò)配的核苷酸。由此，靶基因的表達(dá)抑制效果得到增強(qiáng)。但是，由于該正義鏈和反義鏈須在細(xì)胞內(nèi)保持雙鏈狀態(tài)，因而錯(cuò)配的核苷酸數(shù)目取決于為保持雙鏈狀態(tài)所必需的與反義鏈互補(bǔ)的核苷酸數(shù)目。因而，在根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的雙鏈RNA分子中，其雙鏈部分的正義鏈中與反義鏈互補(bǔ)的核苷酸數(shù)是可在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行雙鏈雜交的數(shù)目。
雙鏈核糖核苷酸鏈在細(xì)胞內(nèi)雜交與否，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠很容易研究。例如，可以將目的細(xì)胞內(nèi)的雜交條件在體外(in vitro)再現(xiàn)，在其中添加兩條核糖核苷酸鏈，觀察它們是否雜交。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，在根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的雙鏈RNA分子中，自雙鏈部分的正義鏈的3’末端依次與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸的數(shù)目為1-4個(gè)，更優(yōu)選為2個(gè)。
為更好地抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因的表達(dá)，除上述正義鏈的3’末端的錯(cuò)配外，在位于其3’末端的第11-13個(gè)核苷酸位點(diǎn)再引入一個(gè)核苷酸錯(cuò)配是有好處的。因而，基于本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的雙鏈RNA分子優(yōu)選在位于雙鏈部分的正義鏈3’末端第11-13位，更加優(yōu)選第12位有一個(gè)核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸。
經(jīng)應(yīng)用下述DNA分子的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)，在雙鏈部分的正義鏈的3’末端第11-13位有一個(gè)錯(cuò)配核苷酸的雙鏈RNA分子在增強(qiáng)基因表達(dá)抑制效果方面是有利的，上述實(shí)驗(yàn)使用的雙鏈RNA分子是在19-20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的正義鏈的3’末端的2個(gè)核苷酸位點(diǎn)以及其3’末端起的第12位核苷酸引入錯(cuò)配的RNA分子。于是，該錯(cuò)配位點(diǎn)鄰近RISC對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的切斷位點(diǎn)。因而，在根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的雙鏈RNA分子中，除正義鏈的雙鏈部分3’末端的錯(cuò)配外，也可以在正義鏈上其它特定位點(diǎn)的5’側(cè)或3’側(cè)第1-3個(gè)核苷酸位點(diǎn)處導(dǎo)入其它的錯(cuò)配，上述特定位點(diǎn)指的是對(duì)應(yīng)于RISC對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的切斷位點(diǎn)的位點(diǎn)。RISC對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的切斷位點(diǎn)，依據(jù)雙鏈RNA分子中所含的靶基因特異性區(qū)域的序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠很容易地確定，其典型地位于前述特異性區(qū)域的中心部分。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，在根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的雙鏈RNA分子中，除正義鏈的雙鏈部分3’末端的錯(cuò)配外引入的其它錯(cuò)配，當(dāng)正義鏈的雙鏈部分由奇數(shù)個(gè)核苷酸構(gòu)成時(shí)，在位于中心的核苷酸5’側(cè)第1-3個(gè)核苷酸的位置，優(yōu)選第2個(gè)核苷酸處引入；當(dāng)正義鏈的雙鏈部分由偶數(shù)個(gè)核苷酸構(gòu)成時(shí)，其在中心3’側(cè)核苷酸的5’側(cè)的第1-3個(gè)核苷酸，優(yōu)選第2個(gè)核苷酸處引入。
根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的雙鏈RNA分子是通過RNAi作用能夠抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因表達(dá)的雙鏈RNA分子，自其雙鏈部分的正義鏈的5’末端依次有一個(gè)以上的核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸。即，根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的雙鏈RNA分子的正義鏈，自其雙鏈部分的5’末端依次有一個(gè)以上與反義鏈的錯(cuò)配。由此，靶基因表達(dá)的抑制效果被降低。然而，由于需保持該正義鏈和反義鏈在細(xì)胞內(nèi)的雙鏈狀態(tài)，因而錯(cuò)配的核苷酸數(shù)取決于保持雙鏈狀態(tài)所必需的與反義鏈互補(bǔ)的核苷酸數(shù)。因此，在根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的雙鏈RNA分子中，其雙鏈部分的正義鏈中與反義鏈互補(bǔ)的核苷酸數(shù)是可在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行雙鏈雜交反應(yīng)的數(shù)目。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，在根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的雙鏈RNA分子中，自雙鏈部分的正義鏈的5’末端依次與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸的數(shù)目?jī)?yōu)選為1-4個(gè)，更優(yōu)選為2個(gè)。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的雙鏈RNA分子，也可含有根據(jù)第一個(gè)方面的雙鏈RNA分子的正義鏈上的一部分或全部錯(cuò)配。由此，可對(duì)靶基因的表達(dá)抑制效果進(jìn)行更為精細(xì)的調(diào)控。
已經(jīng)知道，當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入長(zhǎng)的雙鏈RNA分子時(shí)，雙鏈RNA依賴性蛋白酶、2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶被誘導(dǎo)，進(jìn)而和細(xì)胞死亡相關(guān)。因而，根據(jù)本發(fā)明的雙鏈RNA分子，優(yōu)選為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)不誘導(dǎo)雙鏈RNA依賴性蛋白酶和2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶的雙鏈RNA分子。滿足該條件的雙鏈RNA分子的鏈長(zhǎng)，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，是很容易知道的。已知上述細(xì)胞死亡一般是由30個(gè)核苷酸以上的雙鏈RNA分子引起的，因而，由本發(fā)明的雙鏈RNA分子優(yōu)選具有29個(gè)或以下，更優(yōu)選25個(gè)或以下核苷酸鏈長(zhǎng)的RNA分子。此處使用的“鏈長(zhǎng)”指的是不僅包括雙鏈RNA分子的雙鏈部分，還包括單鏈部分在內(nèi)的核苷酸長(zhǎng)。
本發(fā)明的雙鏈RNA分子，是能夠依據(jù)RNAi作用調(diào)控基因表達(dá)的抑制效果的分子，這可由本說明書記載的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到驗(yàn)證。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)，siRNA中，當(dāng)在正義鏈3’末端引入錯(cuò)配時(shí)，RNAi的基因表達(dá)抑制效果得到增強(qiáng)，反過來當(dāng)在5’末端引入錯(cuò)配時(shí)，其效果被減弱。因此，這樣的基因表達(dá)抑制效果的調(diào)控是通過調(diào)控siRNA整合入RNA誘導(dǎo)型沉默復(fù)合體(RISC)時(shí)的方向性來實(shí)現(xiàn)的。即，當(dāng)引入到siRNA的任意末端的錯(cuò)配將該端部的雜交解除時(shí)，siRNA就從該端部開始整合到RISC中，此時(shí)，構(gòu)成siRNA的兩條鏈中，從5’末端整合的鏈就作為RNAi的中介體(真正的反義鏈)發(fā)揮作用。因而，在針對(duì)作為表達(dá)抑制對(duì)象的靶基因設(shè)計(jì)的siRNA中，通過對(duì)該siRNA進(jìn)行改造使得從其反義鏈5’末端整合入RISC，能夠增強(qiáng)靶基因的表達(dá)抑制效果，另一方面，通過對(duì)該siRNA進(jìn)行改造使得從其正義鏈5’末端整合入RISC，能夠降低靶基因的表達(dá)抑制效果。
因而，根據(jù)本發(fā)明，提供通過RNAi作用能夠抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因表達(dá)的雙鏈RNA分子，所述RNA分子經(jīng)改造使其從反義鏈5’末端側(cè)整合到RNA誘導(dǎo)型沉默復(fù)合體中。這種改造的具體例子與上述針對(duì)根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的RNA分子所述一致。通過這種改造，靶基因的表達(dá)抑制效果得到增強(qiáng)。
進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明，提供通過RNAi作用能夠抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因表達(dá)的雙鏈RNA分子，所述RNA分子經(jīng)改造使其從正義鏈5’末端側(cè)整合到RNA誘導(dǎo)型沉默復(fù)合體中。這種改造的具體例子與上述針對(duì)根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的RNA分子所述一致。通過這種改造，靶基因的表達(dá)抑制效果被減弱。
根據(jù)本發(fā)明的雙鏈RNA分子，可在細(xì)胞內(nèi)抑制靶基因的表達(dá)。因而，根據(jù)本發(fā)明，提供包含將本發(fā)明的雙鏈RNA分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的步驟的抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因表達(dá)的方法。
細(xì)胞只要是可通過siRNA誘導(dǎo)的RNAi現(xiàn)象的細(xì)胞就可以，例如可以舉出來自于昆蟲、線蟲、植物、哺乳動(dòng)物等的細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞。作為植物來源的細(xì)胞，例如可以舉出，西紅柿、煙草、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、稻等植物來源的細(xì)胞。作為動(dòng)物來源的細(xì)胞，例如可舉出，HeLa細(xì)胞、NIH/3T3細(xì)胞、COS-7細(xì)胞、293細(xì)胞等。
將本發(fā)明的雙鏈RNA分子導(dǎo)入細(xì)胞的方法，只要是能將雙鏈RNA分子導(dǎo)入細(xì)胞中的方法就可以，沒有特殊限制。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，尤其優(yōu)選的將雙鏈RNA分子向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入的方法是，使用脂質(zhì)體，優(yōu)選陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染法，可使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司生產(chǎn))、Oligofectamin轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司生產(chǎn))、jetSI轉(zhuǎn)染試劑(Polyplus-transfection公司生產(chǎn))、TransMessenger(Qiagen公司生產(chǎn))等市售轉(zhuǎn)染試劑，容易地進(jìn)行。
或者，在利用本發(fā)明的雙鏈RNA分子抑制靶基因表達(dá)時(shí)，也可通過將在細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的雙鏈RNA分子的載體導(dǎo)入目的細(xì)胞中來實(shí)施。在該方法中，可以使用分別表達(dá)本發(fā)明的雙鏈RNA分子的正義鏈和反義鏈的2種載體，也可使用同時(shí)含有編碼本發(fā)明的雙鏈RNA分子的正義鏈和反義鏈的DNA的載體。因而，根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方式，提供抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因表達(dá)的方法，該方法包括將含有下述DNA的載體導(dǎo)入細(xì)胞的步驟，所述載體是含有編碼本發(fā)明的雙鏈RNA分子的正義鏈的DNA的載體和含有編碼本發(fā)明雙鏈RNA分子的反義鏈的DNA的載體的混合物，或者是同時(shí)含有編碼本發(fā)明的雙鏈RNA分子的正義鏈和反義鏈的DNA的載體。
上述載體只要能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的雙鏈RNA分子的一條鏈或兩條鏈就可以。因而，上述載體中編碼雙鏈RNA分子的鏈的DNA是以該DNA能夠在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的形式存在。這種載體，本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易就能構(gòu)建，例如，根據(jù)需要，可將啟動(dòng)子、終止子等要素以能夠發(fā)揮作用的形式進(jìn)行連接。作為啟動(dòng)子，只要是能夠在目的細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用即可，例如可使用組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子等。此外，也可使用和控制靶基因表達(dá)的啟動(dòng)子一樣的啟動(dòng)子。由此，在靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物生成的同時(shí)，可產(chǎn)生用于分解該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的本發(fā)明的RNA分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本領(lǐng)域已知方法，就能夠很好地將構(gòu)建的載體導(dǎo)入目的細(xì)胞中。
尤其優(yōu)選使用一種能夠表達(dá)本發(fā)明的雙鏈RNA分子的兩條鏈的載體。這種載體可以是分別表達(dá)雙鏈RNA分子的兩條鏈的載體，也可以是表達(dá)兩條鏈通過連接序列連接的發(fā)夾型雙鏈RNA的載體。將本發(fā)明的雙鏈RNA分子以發(fā)夾型雙鏈RNA的形式表達(dá)的載體，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，是能夠適當(dāng)構(gòu)建的，例如可依據(jù)文獻(xiàn)記載(Bass，B.L.，Cell 101，235-238，2000；Tavernarakis，N.等人，Nat.Genet.24，180-183，2000；Malagon，E.等人，Mol.Gen.Genet.259，639-644，1998；Parrish，S.等人，Mol.Cell 6，1077-1087，2000)。
本發(fā)明的雙鏈RNA分子，以及利用所述雙鏈RNA分子的基因表達(dá)抑制方法，可將各種基因作為靶標(biāo)，例如，可將在細(xì)胞內(nèi)的功能有待解析的基因作為靶標(biāo)。此外，通過將癌基因、病毒基因等作為表達(dá)抑制的靶基因，可闡明這些基因的功能，進(jìn)而，通過抑制這些基因在生物活體內(nèi)存活細(xì)胞中的表達(dá)，也有可能治療疾病或紊亂。
實(shí)施例例1各種siRNA在HeLa細(xì)胞中對(duì)螢火蟲熒光素酶基因表達(dá)的抑制作用設(shè)計(jì)針對(duì)螢火蟲熒光素酶基因的常規(guī)的siRNA，和在正義鏈多個(gè)位點(diǎn)引入了與反義鏈的錯(cuò)配的siRNA，考察它們對(duì)螢火蟲熒光素酶基因的表達(dá)抑制效果。
設(shè)計(jì)的各種siRNA的核苷酸序列示于下表1。表1中，以各siRNA的正義鏈在上，反義鏈在下進(jìn)行排列，互補(bǔ)核苷酸在雙鏈間用星號(hào)“*”表示。此外，就各siRNA的名稱而言，“La2”和“La21”表示螢火蟲熒光素酶基因中的靶序列，根據(jù)該基因?qū)爰?xì)胞時(shí)使用的表達(dá)載體pGL3-control(Promega公司生產(chǎn))的編號(hào)體系，“La2”是以第282-300個(gè)核苷酸為靶標(biāo)的序列，“La21”是以第340-358個(gè)核苷酸為靶標(biāo)的序列。此外，“conv.”表示基于常規(guī)設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)的siRNA，因而，它不含錯(cuò)配?！?’BL”表示其siRNA的正義鏈的3’末端不含突出部分(突出端)。
表1針對(duì)螢火蟲熒光素酶基因設(shè)計(jì)的siRNA

合成上述各寡核糖核苷酸對(duì)，分別添加到退火緩沖液(30mMHEPES，pH7.0，100mM醋酸鉀，和10mM醋酸鎂)中，終濃度為20μM，90℃、3分鐘熱變性后，37℃退火一天一夜。由此，得到各siRNA。
HeLa細(xì)胞，在補(bǔ)充有10％胎牛血清(Life Technologies公司生產(chǎn))、100U/ml青霉素(Life Technologies公司生產(chǎn))和100μg/ml鏈霉素(LifeTechnologies公司生產(chǎn))的Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基(Sigma公司生產(chǎn))中，于37℃、5％CO2環(huán)境中增殖。
轉(zhuǎn)染前一天，以胰蛋白酶處理增殖后的HeLa細(xì)胞，再用不含抗生素的新鮮培養(yǎng)基稀釋，接種于24孔培養(yǎng)板(0.5ml培養(yǎng)基中約有0.5×105個(gè)細(xì)胞/孔)。接著，以0.5ml OPT-MEMI(Life Technologies公司生產(chǎn))替換培養(yǎng)基，并在各孔中添加0.25μg表達(dá)螢火蟲熒光素酶的pGL3-control質(zhì)粒(Promega公司生產(chǎn))、表達(dá)海腎螢光素酶(Renillaluciferase)的對(duì)照用phRL-TK質(zhì)粒(Promega公司生產(chǎn))0.05μg、以及0.24μg各siRNA。采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司生產(chǎn))進(jìn)行2種報(bào)告質(zhì)粒和各siRNA的共轉(zhuǎn)染。
然后，將細(xì)胞于37℃孵育4小時(shí)，再添加不含抗生素的新鮮培養(yǎng)基0.5ml，再于37℃孵育。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后配制細(xì)胞裂解物，以Dual-Luciferase報(bào)告分析系統(tǒng)(Promega公司生產(chǎn))進(jìn)行熒光酶表達(dá)分析。
圖1表示雙熒光酶測(cè)試結(jié)果。圖1顯示了使用各siRNA時(shí)，靶(螢火蟲)熒光酶活性與對(duì)照(海腎)熒光酶活性的比。該雙熒光酶活性比，以使用不引起基因表達(dá)抑制的雙鏈RNA(Mock)(Qiagen公司生產(chǎn))的對(duì)照樣品時(shí)得到的比值為1.0，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。各數(shù)據(jù)是至少4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，各數(shù)據(jù)所帶的誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差。
根據(jù)圖1a表明，La2-conv.表現(xiàn)出非常強(qiáng)的基因表達(dá)抑制作用，約為98％；而La21-conv.表現(xiàn)出的基因表達(dá)抑制作用為中等程度，約為50％。該La2-conv.和La21-conv.之間的基因表達(dá)抑制效果的差異被認(rèn)為是因螢火蟲熒光素酶基因中的靶序列上的差異所致。
圖1b表示的是使用各種siRNA，以螢火蟲熒光素酶基因中的La2為靶標(biāo)時(shí)的基因表達(dá)抑制效果。將La2-conv.和La2-3’m1、La2-3’m2、La2-3’m3以及La2-3’m4比較后表明，通過在siRNA的正義鏈3’末端引入1-4個(gè)核苷酸錯(cuò)配，其對(duì)靶基因的表達(dá)抑制效果達(dá)到2-3倍。其中，在正義鏈3’末端有2個(gè)核苷酸錯(cuò)配的siRNA表現(xiàn)出很強(qiáng)的基因表達(dá)抑制，而除正義鏈3’末端的2個(gè)核苷酸錯(cuò)配外，還在正義鏈3’末端第12位核苷酸位點(diǎn)有錯(cuò)配的siRNA(La2-3’m2m12)表現(xiàn)出更為強(qiáng)的基因表達(dá)抑制效果。與此相反，在正義鏈5’末端具有2個(gè)核苷酸錯(cuò)配的siRNA(La2-5’m2)表現(xiàn)出比常規(guī)siRNA(La2-conv.)還要弱的基因表達(dá)抑制效果，這表明，在siRNA正義鏈5’末端引入錯(cuò)配會(huì)降低該siRNA對(duì)基因表達(dá)的抑制效果。
圖1c表示的是使用各種siRNA，以螢火蟲熒光素酶基因中的La21為靶標(biāo)時(shí)的基因表達(dá)抑制效果。將La21-conv.和La21-3’m1、La21-3’m2、La21-3’m3以及La21-3’m4比較后表明，通過在siRNA的正義鏈3’末端引入1-4個(gè)核苷酸錯(cuò)配，其對(duì)靶基因的表達(dá)抑制效果達(dá)到2-3倍。其中，在正義鏈3’末端有2個(gè)核苷酸錯(cuò)配的siRNA表現(xiàn)出很強(qiáng)的基因表達(dá)抑制效果。除正義鏈3’末端的2個(gè)核苷酸錯(cuò)配外，還在正義鏈3’末端第12位核苷酸位點(diǎn)有錯(cuò)配的siRNA(La21-3’m2m12)表現(xiàn)出更強(qiáng)的基因表達(dá)抑制效果。與此相反，在正義鏈5’末端具有2個(gè)核苷酸錯(cuò)配的siRNA(La21-5’m2)表現(xiàn)出比常規(guī)siRNA(La21-conv.)還要弱的基因表達(dá)抑制效果，這表明，在siRNA正義鏈5’末端引入錯(cuò)配會(huì)降低該siRNA對(duì)基因表達(dá)的抑制效果。這些結(jié)果和上述使用以La2為靶標(biāo)的各種siRNA的情況一致，因而表明，通過在siRNA的正義鏈的3’末端引入錯(cuò)配，和進(jìn)而在3’末端第12位核苷酸引入錯(cuò)配所產(chǎn)生的基因表達(dá)抑制增強(qiáng)的效果并非依賴于基因中的靶序列位置、靶序列的核苷酸序列、針對(duì)該靶序列設(shè)計(jì)的不含錯(cuò)配的常規(guī)siRNA所產(chǎn)生的基因表達(dá)抑制效率等。
例2各種siRNA對(duì)HeLa細(xì)胞中的LaminA/C基因和Dnmt1基因的表達(dá)抑制作用分別針對(duì)HeLa細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的內(nèi)源性LaminA/C基因和Dnmt1基因，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于這些基因的常規(guī)的siRNA，和在正義鏈的各處引入了與反義鏈的錯(cuò)配的siRNA，考察這些siRNA對(duì)上述基因的表達(dá)抑制效果。
設(shè)計(jì)的各種siRNA的核苷酸序列示于表2。表2中，以各siRNA的正義鏈在上，反義鏈在下進(jìn)行排列，互補(bǔ)核苷酸在雙鏈間用星號(hào)“*”表示。此外，就各siRNA的名稱而言，“Lam”和“Dn1”分別表示靶基因，即，LaminA/C基因和Dnmt1基因。根據(jù)以各基因的mRNA序列中翻譯起始密碼子的“A”為1的編號(hào)體系，“Lam”表示以LaminA/C基因的mRNA中的第829-851個(gè)核苷酸為靶標(biāo)的基因，“Dn1(#1)”表示Dnmt1基因的mRNA中的第70-89個(gè)核苷酸為靶標(biāo)的基因，“Dn1(#2)”表示Dnmt1基因的mRNA中的第185-203個(gè)核苷酸為靶標(biāo)的基因。進(jìn)而，“Nat.Lam”表示以LaminA/C基因?yàn)榘袠?biāo)的siRNA，其靶序列在文獻(xiàn)中有記載(Elbrashir，S.M.等人，Nature 411494-498，2001)。此外，“conv.”表示基于常規(guī)設(shè)計(jì)基準(zhǔn)設(shè)計(jì)的siRNA，因而，它不含錯(cuò)配。
表2針對(duì)LaminA/C基因和Dnmt1基因設(shè)計(jì)的siRNA。

合成上述各寡核糖核苷酸對(duì)，分別添加到退火緩沖液(30mMHEPES，pH7.0，100mM醋酸鉀，和10mM醋酸鎂)中，終濃度為20μM，90℃、3分鐘熱變性后，37℃退火一天一夜。由此，得到各siRNA。
HeLa細(xì)胞，在補(bǔ)充有10％胎牛血清(Life Technologies公司生產(chǎn))、100U/ml青霉素(Life Technologies公司生產(chǎn))和100μg/ml鏈霉素(LifeTechnologies公司生產(chǎn))的Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基(Sigma公司生產(chǎn))中，于37℃、5％CO2環(huán)境中增殖。
以各種siRNA(100nM)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞時(shí)，使用的是jetSI轉(zhuǎn)染試劑(Polyplus-transfection公司生產(chǎn))。
轉(zhuǎn)染48小時(shí)后分離出總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。以該cDNA為模板，通過實(shí)時(shí)PCR，測(cè)定靶基因的表達(dá)水平。采用SYBR green PCR試劑盒(Molecular Probe公司生產(chǎn))對(duì)這一系列表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。
圖2表示的是各種siRNA對(duì)HeLa細(xì)胞中的內(nèi)源性基因的表達(dá)抑制效果。圖2顯示了使用各siRNA時(shí)，靶基因(LaminA/C基因或Dnmt1基因)的表達(dá)水平與對(duì)照基因(G3PDH基因)的表達(dá)水平的比。該表達(dá)水平的比，以使用不引起基因表達(dá)抑制的雙鏈RNA(Mock)(Qiagen公司生產(chǎn))的對(duì)照樣品時(shí)得到的比值為1.0，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。各數(shù)據(jù)是至少4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，各數(shù)據(jù)所帶的誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差。
根據(jù)圖2a和圖2b表明，正義鏈3’末端具有2個(gè)錯(cuò)配，進(jìn)而在正義鏈3’末端第12位核苷酸具有錯(cuò)配的siRNA，表現(xiàn)出比常規(guī)siRNA更強(qiáng)的基因表達(dá)抑制效果。
例3構(gòu)成siRNA的正義鏈3’末端的錯(cuò)配對(duì)RISC形成的影響將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，其正義鏈和反義鏈的任意一方整合入RISC。據(jù)認(rèn)為如此形成的RISC會(huì)切斷與整合于其中的鏈所雜交的mRNA。因而認(rèn)為，靶基因的表達(dá)抑制效果，因siRNA的正義鏈還是反義鏈易于整合到RISC中而不同。
本例中，通過在siRNA分子的正義鏈3’末端引入錯(cuò)配，考察整合到RISC內(nèi)的鏈的選擇性是否發(fā)生變化為目的，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。
首先，在海腎熒光酶基因的3’非翻譯區(qū)分別插入螢火蟲熒光酶基因的靶序列“La21”的正義鏈和反義鏈的對(duì)應(yīng)序列，制備兩種報(bào)告質(zhì)粒。對(duì)照質(zhì)粒采用表達(dá)β-半乳糖酶基因的質(zhì)粒。siRNA分子(2聚體)使用上述表1所示La21-conv.(正義鏈3’末端沒有錯(cuò)配)和La-3’m2(正義鏈3’末端含有兩個(gè)錯(cuò)配)。
HeLa細(xì)胞，在補(bǔ)充有10％胎牛血清(Life Technologies公司生產(chǎn))、100U/ml青霉素(Life Technologies公司生產(chǎn))和100μg/ml鏈霉素(LifeTechnologies公司生產(chǎn))的Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基(Sigma公司生產(chǎn))中，于37℃、5％CO2環(huán)境中，生長(zhǎng)增殖。
將任何一種上述報(bào)告質(zhì)粒、任何一種上述siRNA分子和對(duì)照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。24小時(shí)后，測(cè)定熒光酶活性和β-半乳糖酶活性，將熒光酶活性測(cè)定值除以β-半乳糖酶活性測(cè)定值后的值，作為標(biāo)準(zhǔn)化后的報(bào)告基因的表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)估。
圖3是表示在正義鏈3’末端含有錯(cuò)配的siRNA分子(La21-3’m2)或不含錯(cuò)配的siRNA分子(La21-conv.)作用下，2種質(zhì)粒的報(bào)告基因的表達(dá)水平的棒圖。圖3中，“反義siRNA”的圖表示的是靶序列的正義鏈重組到3’非翻譯區(qū)的報(bào)告質(zhì)粒的表達(dá)水平，因而，該表達(dá)水平受到以各siRNA分子的反義鏈為中介體的RNAi的抑制。另一方面，“正義siRNA”的圖表示的是靶序列的反義鏈重組到3’非翻譯區(qū)的報(bào)告質(zhì)粒的表達(dá)水平，因而，該表達(dá)水平受到以各siRNA分子的正義鏈為中介體的RNAi的抑制。
根據(jù)圖3可知，在使用正義鏈3’末端不含錯(cuò)配的常規(guī)類型的siRNA分子(La21-conv.)時(shí)，其正義鏈和反義鏈以幾乎相同程度的比例作為RNAi的中介體發(fā)揮作用。另一方面可知，在使用正義鏈3’末端含有錯(cuò)配的siRNA分子(La21-3’m2)時(shí)，以其正義鏈作為中介體的RNAi活性幾乎不被誘導(dǎo)，而以反義鏈為中介體的RNAi活性顯著增強(qiáng)。該結(jié)果表明，通過在siRNA分子正義鏈3’末端引入錯(cuò)配，其反義鏈將優(yōu)先作為RNAi中介體整合到RISC內(nèi)。這提示，通過正義鏈3’末端的錯(cuò)配，siRNA分子將從其反義鏈5’末端側(cè)整合到RISC內(nèi)，其結(jié)果是，該反義鏈作為RNAi中介體發(fā)揮作用。
序列表<110>Japan Health Sciences Foundation<120>改良的siRNA分子和應(yīng)用該siRNA分子的抑制基因表達(dá)的方法<130>149555<150>JP 2003-294504<151>2003-08-18<150>JP 2003-427970<151>2003-12-24<160>30<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述單鏈siRNA<400>1ggaagacgcc aaaaacauau u21<210>2<211>21<212>RNA<213>人工序列
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<223>人工序列描述單鏈siRNA<400>2uauguuuuuug gcgucuuccu u 21<210>3<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述單鏈siRNA<400>30accgcuggag agcaacugc 19
權(quán)利要求
1.一種可通過RNAi抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因表達(dá)的雙鏈RNA分子，其自雙鏈部分的正義鏈3’末端依次有一個(gè)以上的核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸，并且其雙鏈部分的正義鏈中與反義鏈互補(bǔ)的核苷酸的數(shù)目是能夠使雙鏈在上述細(xì)胞內(nèi)雜交的數(shù)目。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述雙鏈RNA分子，其中，自雙鏈部分的正義鏈3’末端依次與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸的數(shù)目為1-4個(gè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述雙鏈RNA分子，其中，自雙鏈部分的正義鏈3’末端依次與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸的數(shù)目為2個(gè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述雙鏈RNA分子，其中，在雙鏈部分的正義鏈3’末端第11-13位的核苷酸中還有一個(gè)核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述雙鏈RNA分子，其中，位于雙鏈部分的正義鏈3’末端第12位的核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述雙鏈RNA分子，其中，在雙鏈部分的正義鏈上對(duì)應(yīng)于RISC對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的切斷位點(diǎn)的位點(diǎn)的5’或3’側(cè)1-3個(gè)核苷酸的位置還有一個(gè)核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述雙鏈RNA分子，其中，當(dāng)正義鏈的雙鏈部分由奇數(shù)個(gè)核苷酸構(gòu)成時(shí)，在位于雙鏈部分的正義鏈的中心的核苷酸的5’側(cè)第1-3個(gè)核苷酸位點(diǎn)還有一個(gè)核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸；當(dāng)正義鏈的雙鏈部分由偶數(shù)個(gè)核苷酸構(gòu)成時(shí)，在雙鏈部分的正義鏈的中心3’側(cè)核苷酸的5’側(cè)第1-3個(gè)核苷酸位點(diǎn)中還有一個(gè)核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述雙鏈RNA分子，其中，當(dāng)正義鏈的雙鏈部分由奇數(shù)個(gè)核苷酸構(gòu)成時(shí)，在位于雙鏈部分的正義鏈的中心的核苷酸的5’側(cè)第2個(gè)核苷酸位點(diǎn)還有一個(gè)核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸；當(dāng)正義鏈的雙鏈部分由偶數(shù)個(gè)核苷酸構(gòu)成時(shí)，在雙鏈部分的正義鏈的中心3’側(cè)核苷酸的5’側(cè)第2個(gè)核苷酸位點(diǎn)還有一個(gè)核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述雙鏈RNA分子，該雙鏈RNA分子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)不誘導(dǎo)雙鏈RNA依賴性蛋白激酶或2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述雙鏈RNA分子，其中，該雙鏈RNA分子具有29個(gè)核苷酸或以下的鏈長(zhǎng)。
11.一種可通過RNAi抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因表達(dá)的雙鏈RNA分子，其自雙鏈部分的正義鏈5’末端依次有一個(gè)以上的核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸，并且其雙鏈部分的正義鏈中與反義鏈互補(bǔ)的核苷酸的數(shù)目是能夠使雙鏈在上述細(xì)胞內(nèi)雜交的數(shù)目。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述雙鏈RNA分子，其中，自雙鏈部分的正義鏈5’末端依次與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸的數(shù)目為1-4個(gè)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述雙鏈RNA分子，其中，自雙鏈部分的正義鏈5’末端依次與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸的數(shù)目為2個(gè)。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述雙鏈RNA分子，其中，自雙鏈部分的正義鏈3’末端依次有一個(gè)以上與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述雙鏈RNA分子，其中，自雙鏈部分的正義鏈3’末端依次與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸的數(shù)目為1-4個(gè)。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述雙鏈RNA分子，其中，自雙鏈部分的正義鏈3’末端依次與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸的數(shù)目為2個(gè)。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述雙鏈RNA分子，其中，在雙鏈部分的正義鏈3’末端第11-13位的核苷酸中還有一個(gè)核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述雙鏈RNA分子，其中，位于雙鏈部分的正義鏈3’末端第12位的核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求11所述雙鏈RNA分子，其中，在雙鏈部分的正義鏈上對(duì)應(yīng)于RISC對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的切斷位點(diǎn)的位點(diǎn)的5’或3’側(cè)1-3個(gè)核苷酸的位置還有一個(gè)核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求11所述雙鏈RNA分子，其中，當(dāng)正義鏈的雙鏈部分由奇數(shù)個(gè)核苷酸構(gòu)成時(shí)，在位于雙鏈部分的正義鏈的中心的核苷酸的5’側(cè)第1-3個(gè)核苷酸位點(diǎn)還有一個(gè)核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸；當(dāng)正義鏈的雙鏈部分由偶數(shù)個(gè)核苷酸構(gòu)成時(shí)，在雙鏈部分的正義鏈的中心3’側(cè)核苷酸的5’側(cè)第1-3個(gè)核苷酸位點(diǎn)還有一個(gè)核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求11所述雙鏈RNA分子，其中，當(dāng)正義鏈的雙鏈部分由奇數(shù)個(gè)核苷酸構(gòu)成時(shí)，在位于雙鏈部分的正義鏈的中心的核苷酸的5’側(cè)的第2個(gè)核苷酸位點(diǎn)還有一個(gè)核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸；當(dāng)正義鏈的雙鏈部分由偶數(shù)個(gè)核苷酸構(gòu)成時(shí)，在雙鏈部分的正義鏈的中心3’側(cè)核苷酸的5’側(cè)第2個(gè)核苷酸位點(diǎn)還有一個(gè)核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求11所述雙鏈RNA分子，其中，該雙鏈RNA分子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)不誘導(dǎo)雙鏈RNA依賴性蛋白激酶或2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述雙鏈RNA分子，其中，該雙鏈RNA分子具有29個(gè)核苷酸或以下的鏈長(zhǎng)。
24.一種抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因表達(dá)的方法，其包含將權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)所述雙鏈RNA分子導(dǎo)入細(xì)胞的步驟。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述方法，其中，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
26.一種載體，其同時(shí)含有編碼權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)所述雙鏈RNA分子的正義鏈的DNA和編碼反義鏈的DNA。
27.一種抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因表達(dá)的方法，其包含將含有編碼權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)所述雙鏈RNA分子的正義鏈的DNA的載體和含有編碼該雙鏈RNA分子的反義鏈的DNA的載體的組合，或權(quán)利要求26所述載體導(dǎo)入細(xì)胞的步驟。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述方法，其中，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
29.一種可通過RNAi抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因表達(dá)的雙鏈RNA分子，該RNA分子經(jīng)過改造使其自反義鏈5’末端側(cè)整合入RNA誘導(dǎo)型沉默復(fù)合體。
30.一種可通過RNAi抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因表達(dá)的雙鏈RNA分子，該RNA分子經(jīng)過改造使其自正義鏈5’末端側(cè)整合入RNA誘導(dǎo)型沉默復(fù)合體。
全文摘要
本發(fā)明涉及為調(diào)控siRNA對(duì)基因表達(dá)的抑制效果而對(duì)其進(jìn)行改造所得的雙鏈RNA分子。本發(fā)明的雙鏈RNA分子是可通過RNAi抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因表達(dá)的雙鏈RNA分子，自其雙鏈RNA部分的正鏈3’末端或5’末端依次有一個(gè)以上核苷酸是與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸。在本發(fā)明的雙鏈RNA分子中，其雙鏈部分的正義鏈中與反義鏈不互補(bǔ)的核苷酸的數(shù)目是能夠使雙鏈在上述細(xì)胞內(nèi)雜交的數(shù)目。
文檔編號(hào)C12N15/113GK1867672SQ200480030638
公開日2006年11月22日 申請(qǐng)日期2004年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月18日
發(fā)明者北條浩彥 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人日本健康科學(xué)振興財(cái)團(tuán)