專利名稱：β－聯(lián)蛋白/TCF激活轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)由β-聯(lián)蛋白/TCF激活的轉(zhuǎn)錄的化合物和方法，例如，選擇性抑制Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑靶向的基因。
背景技術(shù)：
Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑引發(fā)在正常發(fā)育和癌癥的起始和發(fā)展中均至關(guān)重要的信號級聯(lián)(Wodarz等人，“Mechanisms of Wnt signaling indevelopment，”Annu.Rev.Cell Dev.Biol.1459-88(1998)；Morin，P.J.，“Beta-catenin signaling and cancer”，Bioessays 211021-30(1999)；Moon等人，“The promise and perils of Wnt signaling throughbeta-catenin，”Science 2961644-46(2002)；Oving等人，“Molecularcauses of colon cancer，”Eur.J.Clin.Invest.32448-57(2002))。該途徑的特點是它激活了多功能蛋白β-聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)錄作用。在正常細(xì)胞中，大多數(shù)β-聯(lián)蛋白發(fā)現(xiàn)于連在鈣黏著蛋白上的細(xì)胞膜上，它在這里在細(xì)胞黏著中發(fā)揮重要的作用。另一β-聯(lián)蛋白庫發(fā)現(xiàn)于胞質(zhì)和核中，它在這里調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄(Gottardi等人，“Adhesion signalinghow beta-catenininteracts with its partners，”Curr.Biol.11R792-4(2001))。在其作為質(zhì)膜處細(xì)胞黏著介體及作為轉(zhuǎn)錄激活劑的不同作用中，β-聯(lián)蛋白與蛋白宿主相互作用，大部分蛋白宿主盡管缺少顯著的序列同源性，卻競爭相同的β-聯(lián)蛋白犰狳蛋白重復(fù)單元。晶體結(jié)構(gòu)與突變研究已經(jīng)描繪出幾種蛋白的β-聯(lián)蛋白對不同的犰狳蛋白重復(fù)單元的結(jié)合部位(Gottardi等人，“Adhesion signalinghow beta-catenin interacts with its partners”，Curr.Biol.11R792-4(2001)；Huber等人，“The structure of thebeta-catenin/E-cadherin complex and the molecular basis of diverse ligandrecognition by beta-catenin”，Cell 105391-402(2001))。
β-聯(lián)蛋白的胞質(zhì)庫通過被其中包括糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)、酪蛋白激酶-1α(CK-1α)、支架蛋白、軸蛋白和腫瘤抑制物、腺瘤性結(jié)腸息肉(APC)的“破壞復(fù)合體”磷酸化而得以調(diào)節(jié)(Behrens J.，“Controlof beta-catenin signaling in tumor development”，Ann.N.Y.Acad.Sci.91021-33(2000)；討論33-5)。在不存在Wnt信號傳導(dǎo)的情況下，磷酸化標(biāo)記胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白以進(jìn)行Skp1-滯蛋白-F box(SCF)定向的遍在蛋白化和蛋白體降解。激活Wnt途徑使GSK-3β的功能失活，防止β-聯(lián)蛋白磷酸化，從而使β-聯(lián)蛋白在胞質(zhì)中積聚，并隨后易位至核中，在這里形成轉(zhuǎn)錄活性復(fù)合體并驅(qū)動其靶基因的表達(dá)。靶基因激活中的關(guān)鍵步驟是β-聯(lián)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的T細(xì)胞因子(TCF)/淋巴樣細(xì)胞增強(qiáng)因子(LEF-1)家族成員之間復(fù)合體的形成(Brantjes等人，“TCFLadyJustice casting the final verdict on the outcome of Wnt signaling”，Biol.Chem.383255-61(2002))。為了生成轉(zhuǎn)錄活性復(fù)合體，β-聯(lián)蛋白募集轉(zhuǎn)錄輔激活物CREB-結(jié)合蛋白(CBP)或其緊密關(guān)聯(lián)的同源物p300(Hecht等人，“The p300/CBP acetyltransferases function astranscriptional coactivators of beta-catenin in vertebrates”，EMBO J.191839-50(2000)；Takemaru等人，“The transcriptional coactivator CBPinteracts with beta-catenin to activate gene expression”，J.Cell Biol.149249-54(2000))以及基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄機(jī)制的其它組分。
β-聯(lián)蛋白/TCF復(fù)合體激活Wnt響應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄的精確機(jī)制尚不明確，但是β-聯(lián)蛋白有關(guān)轉(zhuǎn)錄激活的結(jié)構(gòu)域已經(jīng)描繪為NH2-和COOH-端(Staal等人，“Wnt signals are transmitted through N-terminallydephosphorylated beta-catenin，”EMBO 363-68(2002))。β-聯(lián)蛋白的COOH-端區(qū)由大約100個氨基酸組成，已經(jīng)顯示它與TATA結(jié)合蛋白(TBP)相互作用(Hecht等人，“Functional characterization of multipletransactivating elements in beta-catenin，some of which interact with theTATA-binding protein in vitro”，J.Biol.Chem.27418017-25(1999))。當(dāng)與LEF-1融合時，COOH-端便足以促進(jìn)反式激活作用(Vleminckx等人，“The C-terminal transactivation domain of beta-catenin is necessaryand sufficient for signaling by the LEF-1/beta-catenin complex in Xenopuslaevis，”Mech.Dev.8165-74(1999))。β-聯(lián)蛋白的NH2-端部分由大約130個氨基酸組成，其含有蛋白體降解所需的GSK-3β磷酸化位點。
正常情況下Wnt/β-聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)一系列與促進(jìn)增殖和分化有關(guān)的基因的表達(dá)。但是，＞85％的結(jié)腸癌中，破壞復(fù)合體的組分之一APC、和/或β-聯(lián)蛋白本身是變異的，這導(dǎo)致核β-聯(lián)蛋白的增加和靶基因的組成型激活(constitutive activation)(Fearnhead等人，“Genetics of colorectalcancerhereditary aspects and overview of colorectal tumorigenesis”，Br.Med.Bull.6427-43(2002))。許多這些在細(xì)胞的生長、增殖和分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因，包括細(xì)胞周期蛋白D1(Shtutman等人，“The細(xì)胞周期蛋白D1 gene is a target of the beta-catenin/LEF-1 pathway”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 965522-27(1999)；Tetsu等人，“Beta-cateninregulates expression of細(xì)胞周期蛋白D1 in colon carcinoma cells，”Nature 398422-26(1999))和c-myc(He等人，“Identification of c-MYCas a target of the APC pathway”，Science 2811509-12(1998))，以及穿入性生長所必需的基因如基質(zhì)裂解蛋白(matrilysin)(Crawford等人，“The metalloproteinase matrilysin is a target of beta-catenintransactivation in intestinal tumors”，Oncogene 182883-91(1999))、纖連蛋白(Gradl等人，“The Wnt/Wg signal transducer beta-catenin controls纖連蛋白expression”，Mol.Cell.Biol.195576-87(1999))、CD44(Wielenga等人，“Expression of CD44 in Apc and Tcf mutant miceimplies regulation by the WNT pathway”，Am.J.Pathol.154515-23(1999))、和μPAR(Mann等人，“Target genes of beta-catenin-Tcell-factor/lymphoid-enhancer-factor signaling in human colorectalcarcinomas”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 961603-08(1999))均被不適當(dāng)?shù)丶せ睢?br> 根據(jù)大多數(shù)結(jié)直腸癌與β-聯(lián)蛋白信號傳導(dǎo)途徑的激活有關(guān)，并且根據(jù)多種突變導(dǎo)致該激活這一事實，明確需要有削弱β-聯(lián)蛋白核功能的藥物。本發(fā)明提供對抗β-聯(lián)蛋白/TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的試劑，并進(jìn)一步提供相關(guān)優(yōu)勢，如下文所詳細(xì)說明。

發(fā)明內(nèi)容
簡言之，本發(fā)明提供對抗β-聯(lián)蛋白/TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的試劑，以及它們的使用方法。一方面，本發(fā)明提供使β-聯(lián)蛋白/TCF響應(yīng)基因的亞型被特異性減量調(diào)節(jié)的方法，同時在相關(guān)方面，本發(fā)明提供用于該方法的化合物。另一方面，本發(fā)明提供使CBP和β-聯(lián)蛋白之間的結(jié)合被破壞，但是結(jié)構(gòu)相關(guān)的輔激活物p300和β-聯(lián)蛋白之間的結(jié)合不被破壞的方法，同時在相關(guān)方面，本發(fā)明提供用于該方法的化合物。另一方面，本發(fā)明提供使由CBP而非由p300啟動的基因被選擇性激活的方法，同時在相關(guān)方面，本發(fā)明提供用于該方法的化合物。此外，本發(fā)明提供使由p300而非由CBP啟動的基因被選擇性激活的方法，同時在相關(guān)方面，本發(fā)明提供用于該方法的化合物。另一方面，本發(fā)明提供用化學(xué)試劑處理癌細(xì)胞以使細(xì)胞周期G1階段的發(fā)育停滯的方法，其中延長用化學(xué)試劑進(jìn)行處理誘發(fā)正常結(jié)腸細(xì)胞(colonocyte)中檢測不到的細(xì)胞凋亡。例如，癌細(xì)胞可以是結(jié)腸、乳腺、前列腺等等。
例如，一方面，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白誘發(fā)的基因表達(dá)的方法。該方法包括使組合物與試劑接觸，這里的組合物包含β-聯(lián)蛋白、CBP和p300，而且β-聯(lián)蛋白具有結(jié)合到CBP與p300的可能性。所述試劑以有效改變β-聯(lián)蛋白結(jié)合到CBP與p300的可能性的量存在。換句話說，在不存在該試劑的情況下，β-聯(lián)蛋白與CBP和p300結(jié)合的程度與存在試劑的情況下觀察到的不同。例如，取決于其化學(xué)結(jié)構(gòu)，試劑可以增加CBP在β-聯(lián)蛋白上的結(jié)合，同時任選地降低p300在β-聯(lián)蛋白上的結(jié)合；或者增加p300在β-聯(lián)蛋白上的結(jié)合，同時任選地降低CBP在β-聯(lián)蛋白上的結(jié)合。該方法可以在體內(nèi)或先體外后體內(nèi)進(jìn)行。一方面，該方法先體外后體內(nèi)進(jìn)行，組合物包括干細(xì)胞。另一方面，該方法在體內(nèi)進(jìn)行，組合物在哺乳動物內(nèi)。本發(fā)明的方法可以用于治療多種醫(yī)學(xué)病癥。例如，在本發(fā)明的各個方面哺乳動物可以罹患癌癥，而用量對于治療癌癥是有效的；組合物在細(xì)胞內(nèi)，而試劑增加細(xì)胞分化的可能性；組合物在細(xì)胞內(nèi)，而試劑增加細(xì)胞增殖的可能性。
另一方面，本發(fā)明提供包含β-聯(lián)蛋白、CBP、p300和試劑的組合物。β-聯(lián)蛋白具有結(jié)合到CBP與p300的可能性，而且試劑以有效改變β-聯(lián)蛋白結(jié)合到CBP與p300的可能性的量存在于組合物中。換句話說，在不存在試劑的情況下，β-聯(lián)蛋白與CBP和p300結(jié)合的程度與存在試劑的情況下觀察到的不同。例如，取決于其化學(xué)結(jié)構(gòu)，試劑可以增加CBP在β-聯(lián)蛋白上的結(jié)合，同時任選地降低p300在β-聯(lián)蛋白上的結(jié)合；或者增加p300在β-聯(lián)蛋白上的結(jié)合，同時任選地降低CBP在β-聯(lián)蛋白上的結(jié)合。該組合物可以在體內(nèi)或先體外后體內(nèi)。一方面，該組合物先體外后體內(nèi)，并且組合物進(jìn)一步包含干細(xì)胞。另一方面，該組合物在體內(nèi)，并且組合物在哺乳動物如小鼠內(nèi)。
另一方面，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)Wnt途徑活性的方法，其包括(a)使Wnt途徑的組分與激活Wnt途徑的化合物相接觸，以提供激活的Wnt途徑；以及(b)使激活的Wnt途徑與完全或基本上干擾p300與聯(lián)蛋白之間結(jié)合但是極少或者不干擾CBP與聯(lián)蛋白之間結(jié)合的化學(xué)試劑相接觸。任選地，Wnt途徑在細(xì)胞內(nèi)。任選地，該方法先體外后體內(nèi)進(jìn)行。任選地，激活Wnt途徑的化合物選自LiCl和GSK抑制劑。
另一方面，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的方法，其包括(a)在使一定比例的群體增殖且一定比例的群體分化的條件下提供細(xì)胞群體；以及(b)向群體中加入化學(xué)試劑，在此所述試劑導(dǎo)致增殖細(xì)胞的比例相對于分化細(xì)胞的比例增加。在該方法的各種最佳實施方式中化合物干擾p300與聯(lián)蛋白之間的結(jié)合；該方法進(jìn)一步包括向群體中加入激活Wnt途徑的試劑；所述的細(xì)胞群體是干細(xì)胞群體；該方法先體外后體內(nèi)進(jìn)行；該方法進(jìn)一步包括加入導(dǎo)致細(xì)胞群體分化的試劑，例如，群體中的細(xì)胞分化形成血細(xì)胞或者群體中的細(xì)胞分化形成神經(jīng)元細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明提供將干細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)下的方法，其包括使干細(xì)胞與抑制細(xì)胞分化或促進(jìn)細(xì)胞增殖的試劑相接觸，所述試劑的量對于將干細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)下是有效的。在某些實施方式中，用于該方法的試劑相對于β-聯(lián)蛋白/CBP相互作用而選擇性地抑制β-聯(lián)蛋白/p300相互作用。
簡言之，在其它方面，本發(fā)明提供相對于β-聯(lián)蛋白/p300相互作用而選擇性地抑制β-聯(lián)蛋白/CBP相互作用的方法，該方法包括向組合物中加入化合物，所述組合物含有β-聯(lián)蛋白、CBP和p300，所述化合物相對于β-聯(lián)蛋白/p300相互作用而選擇性地抑制β-聯(lián)蛋白/CBP相互作用；相對于β-聯(lián)蛋白/CBP相互作用而選擇性地抑制β-聯(lián)蛋白/p300相互作用的方法，該方法包括向組合物中加入化合物，所述組合物含有β-聯(lián)蛋白、CBP和p300，所述化合物相對于β-聯(lián)蛋白/CBP相互作用而選擇性地抑制β-聯(lián)蛋白/p300相互作用；促進(jìn)β-聯(lián)蛋白從核易位至胞液的方法，該方法包括向細(xì)胞中加入化合物，所述細(xì)胞包括核和胞液，核含有β-聯(lián)蛋白，所述化合物導(dǎo)致β-聯(lián)蛋白從核易位至胞液；選擇性地抑制由WNT/β-聯(lián)蛋白途徑靶向的基因的表達(dá)的方法，該方法包括向組合物中加入化合物，所述組合物含有由WNT/β-聯(lián)蛋白途徑靶向的基因，所述化合物導(dǎo)致由WNT/β-聯(lián)蛋白途徑靶向的基因表達(dá)的變化。
在本發(fā)明的方法和組合物中，化學(xué)試劑任選地選自結(jié)構(gòu)式(I)的化合物 其中A為-(CHR3)-或-(C＝O)-，B為-(CHR4)-或-(C＝O)-，D為-(CHR5)-或-(C＝O)-，E為-(ZR6)-或-(C＝O)-，G為-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W為-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y為氧或硫，X和Z獨立地為氮或CH，n＝0或1；而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自獨立地選自氨基酸側(cè)鏈部分、氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物、或者分子的殘余部分、及其立體異構(gòu)體。
在某些實施方式中，結(jié)構(gòu)式(I)的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9獨立地選自氨基C2-5烷基、胍基C2-5烷基、C1-4烷基胍基C2-5烷基、二C1-4烷基胍基-C2-5烷基、脒基C2-5烷基、C1-4烷基脒基C2-5烷基、二C1-4烷基脒基C2-5烷基、C1-3烷氧基、苯基、取代苯基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、芐基、取代芐基(其中芐基上的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、萘基、取代萘基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、雙苯基甲基、取代雙苯基甲基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、吡啶基、取代吡啶基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、吡啶基C1-4烷基、取代吡啶基C1-4烷基(其中吡啶的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、嘧啶基C1-4烷基、取代嘧啶基C1-4烷基(其中嘧啶的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基或硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、三嗪-2-基-C1-4烷基、取代三嗪-2-基-C1-4烷基(其中三嗪的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、咪唑并C1-4烷基、取代咪唑并C1-4烷基(其中咪唑的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、咪唑啉基C1-4烷基、N-脒基哌嗪基-N-C0-4烷基、羥基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、羥基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、C1-5二烷基氨基C2-5烷基、N-脒基哌啶基C1-4烷基和4-氨基環(huán)己基C0-2烷基。
在某些實施方式中，A為-(CHR3)-，B為-(C＝O)-，D為-(CHR5)-，E為-(C＝O)-，G為-(XR7)n-，并且化合物具有如下通式(II)
其中，R1、R2、R3、R5、R7、W、X和n如結(jié)構(gòu)式(I)中所定義。
在某些實施方式中，A為-(C＝O)-，B為-(CHR4)-，D為-(C＝O)-，E為-(ZR6)-，G為-(C＝O)-(XR9)-，并且化合物具有如下通式(III) 其中，R1、R2、R4、R6、R9、W和X如結(jié)構(gòu)式(I)中所定義，Z為氮或CH(當(dāng)Z為CH時，X為氮)。
在某些實施方式中，A為-(C＝O)-，B為-(CHR4)-，D為-(C＝O)-，E為-(ZR6)-，G為-(XR7)n-，并且化合物具有如下通式(IV) 其中，R1、R2、R4、R6、R7、W、X和n如結(jié)構(gòu)式(I)中所定義，Z為氮或CH，附帶條件為當(dāng)Z為氮時，n為0，當(dāng)Z為CH時，X為氮并且n不是0。
在某些實施方式中，化合物具有如下通式(VI) 其中，Ra為具有8至11個環(huán)成員的二環(huán)芳基，其可以具有1至3個選自氮、氧或硫的雜原子，R6為5至7元單環(huán)芳基，其可以具有1至2個選自氮、氧或硫的雜原子，而且化合物中的芳環(huán)可以具有一個或多個選自鹵素、羥基、氰基、低級烷基和低級烷氧基的取代基。任選地，Ra為萘基、喹啉基或異喹啉基，Rb為苯基、吡啶基或哌啶基，所有這些基團(tuán)均可被一個或多個選自鹵素、羥基、氰基、低級烷基和低級烷氧基的取代基所取代。在某些實施方式中，Ra為萘基，Rb為苯基，其可被一個或多個選自鹵素、羥基、氰基、低級烷基和低級烷氧基的取代基所取代。
在某些實施方式中，化合物選自化合物1、3、4和5。
在其它方面，本發(fā)明提供篩選方法，即可以鑒別生物活性化合物和/或評價其效力的方法。例如，本發(fā)明提供鑒別β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯(lián)蛋白CBP小分子抑制劑與含CBP1-111的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含β-聯(lián)蛋白的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制含步驟(b)的β-聯(lián)蛋白的部分與含步驟(a)的CBP1-111的部分相結(jié)合；以及(d)當(dāng)確定步驟(a)的所述小分子抑制含CBP1-111的所述部分與含β-聯(lián)蛋白的部分相結(jié)合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的抑制劑。
任選地，上述方法可以進(jìn)一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑與含(1)含p300 1-111的部分和(2)β-聯(lián)蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制含p300 1-111的所述部分與β-聯(lián)蛋白的結(jié)合；以及(g)當(dāng)確定步驟(e)的所述小分子并不抑制含p300 1-111的所述部分與所述β-聯(lián)蛋白相結(jié)合時，確認(rèn)所述的小分子是β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的選擇性抑制劑。
本發(fā)明還提供鑒別β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯(lián)蛋白CBP小分子抑制劑與含β-聯(lián)蛋白的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含CBP 1-111的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制含步驟(b)的CBP 1-111的部分與含步驟(a)的β-聯(lián)蛋白的部分相結(jié)合；(d)當(dāng)確定步驟(a)的所述小分子抑制含β-聯(lián)蛋白的所述部分與含CBP 1-111的部分相結(jié)合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的抑制劑。
任選地，上述方法可以進(jìn)一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑與含(1)含p300 1-111的部分和(2)β-聯(lián)蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制含p300 1-111的所述部分與β-聯(lián)蛋白相結(jié)合；以及(g)當(dāng)確定步驟(e)的所述小分子并不抑制含p300 1-111的所述部分與所述β-聯(lián)蛋白相結(jié)合時，確認(rèn)所述的小分子是β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的選擇性抑制劑。
本發(fā)明還提供鑒別β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯(lián)蛋白CBP小分子抑制劑與含有(1)與CBP 1-111相結(jié)合的β-聯(lián)蛋白的部分相接觸；(b)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否使CBP 1-111從β-聯(lián)蛋白上分離；以及(c)當(dāng)確定步驟(a)的所述小分子使β-聯(lián)蛋白與CBP 1-110的結(jié)合分離時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的抑制劑。
任選地，上述方法可以進(jìn)一步包括以下步驟(d)使步驟(c)鑒別的β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含p300 1-111的部分和(2)β-聯(lián)蛋白的混合物相接觸；(e)通過化驗手段確定步驟(d)的所述分子是否并不抑制含p300 1-111的所述部分與β-聯(lián)蛋白相結(jié)合；以及(f)當(dāng)確定步驟(d)的所述小分子并不抑制含p300 1-111的所述部分與所述β-聯(lián)蛋白相結(jié)合時，確認(rèn)所述的小分子是β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的選擇性抑制劑。
本發(fā)明還提供鑒別β-聯(lián)蛋白p300相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯(lián)蛋白CBP小分子抑制劑與含p300 1-111的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含β-聯(lián)蛋白的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制步驟(b)的含β-聯(lián)蛋白的部分與步驟(a)的含p300 1-111的部分相結(jié)合；以及(d)當(dāng)確定所述步驟(a)的小分子抑制含p300 1-111的所述部分與含β-聯(lián)蛋白的部分相結(jié)合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯(lián)蛋白p300相互作用的抑制劑。
任選地，上述方法可以進(jìn)一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯(lián)蛋白p300相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-聯(lián)蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制含CBP 1-111的所述部分與β-聯(lián)蛋白相結(jié)合；以及(g)當(dāng)確定步驟(e)的所述小分子并不抑制含CBP 1-111的所述部分與所述β-聯(lián)蛋白相結(jié)合時，確認(rèn)所述的小分子是β-聯(lián)蛋白p300相互作用的選擇性抑制劑。
本發(fā)明還提供鑒別β-聯(lián)蛋白p300相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯(lián)蛋白p300小分子抑制劑與含β-聯(lián)蛋白的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含p300 1-111的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制步驟(b)的含p300 1-111的部分與步驟(a)的含β-聯(lián)蛋白的部分相結(jié)合；(d)當(dāng)確定步驟(a)的所述小分子抑制含β-聯(lián)蛋白的所述部分與含p300 1-111部分相結(jié)合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯(lián)蛋白p300相互作用的抑制劑。
任選地，上述方法可以進(jìn)一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯(lián)蛋白p300相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-聯(lián)蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制含CBP 1-111的所述部分與β-聯(lián)蛋白相結(jié)合；以及(g)當(dāng)確定步驟(e)的所述小分子并不抑制含CBP 1-111的所述部分與所述β-聯(lián)蛋白相結(jié)合時，確認(rèn)所述的小分子是β-聯(lián)蛋白p300相互作用的選擇性抑制劑。
本發(fā)明還提供鑒別β-聯(lián)蛋白p300相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯(lián)蛋白p300小分子抑制劑與含有(1)與p300 1-111結(jié)合的β-聯(lián)蛋白的部分相接觸；(b)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否使p300 1-111從β-聯(lián)蛋白上分離；以及(c)當(dāng)確定步驟(a)的所述小分子使β-聯(lián)蛋白與p300 1-111的結(jié)合分離時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯(lián)蛋白p300相互作用的抑制劑。
任選地，上述方法可以進(jìn)一步包括以下步驟(d)使步驟(c)鑒別的β-聯(lián)蛋白p300相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-聯(lián)蛋白的混合物相接觸；(e)通過化驗手段確定步驟(d)的所述分子是否并不抑制含CBP 1-111的所述部分與β-聯(lián)蛋白相結(jié)合；以及(f)當(dāng)確定步驟(c)的所述小分子并不抑制含CBP 1-111的所述部分與所述β-聯(lián)蛋白相結(jié)合時，確認(rèn)所述的小分子是β-聯(lián)蛋白p300相互作用的選擇性抑制劑。
在其它方面，本發(fā)明提供核酸和肽序列，這些序列可以用作例如治療劑，或者用于例如篩選方法。因此，在不同的示范性方面，本發(fā)明提供基本上提純和分離的核酸序列，其含有SEQ ID NO1或者與SEQID NO1的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼CBP蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其含有SEQ ID NO1的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼CBP蛋白；基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO2或者與SEQ ID NO2的同源性至少為80％的肽，附帶條件為所述的肽不是CBP蛋白；基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO2的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的肽不是CBP蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其基本由SEQ ID NO1或者與SEQ ID NO1的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的序列不編碼CBP蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其基本由SEQ ID NO1的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的序列不編碼CBP蛋白；基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO2或者與SEQ IDNO2的同源性至少為80％的肽組成，附帶條件為所述的肽不是CBP蛋白；基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO2的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的肽不是CBP蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其由SEQ ID NO1或者與SEQ IDNO1的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的序列不編碼CBP蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其由SEQ ID NO1的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的序列不編碼CBP蛋白；基本上提純和分離的肽，其由SEQ ID NO2或者與SEQ ID NO2的同源性至少為80％的肽組成，附帶條件為所述的肽不是CBP蛋白；基本上提純和分離的肽，其由SEQ ID NO2的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的肽不是CBP蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其含有SEQ ID NO3或者與SEQID NO1的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼p300蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其含有SEQ ID NO3的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼p300蛋白；基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO4或者與SEQ ID NO4的同源性至少為80％的肽，附帶條件為所述的肽不是p300蛋白；基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO4的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的肽不是p300蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其基本由SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的序列不編碼p300蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其基本由SEQ ID NO3的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的序列不編碼p300蛋白；基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO4或者與SEQ IDNO2的同源性至少為80％的肽組成，附帶條件為所述的肽不是p300蛋白；基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO4的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的肽不是p300蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其由SEQ ID NO3或者與SEQ IDNO3的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的序列不編碼p300蛋白；基本上提純和分離的核酸序列，其由SEQ ID NO3的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的序列不編碼p300蛋白；基本上提純和分離的肽，其由SEQ ID NO4或者與SEQ ID NO2的同源性至少為80％的肽組成，附帶條件為所述的肽不是p300蛋白；以及基本上提純和分離的肽，其由SEQ ID NO4的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的肽不是p300蛋白。
以下進(jìn)一步詳細(xì)說明了本發(fā)明的這些及相關(guān)方面。


圖1.化合物1抑制β-聯(lián)蛋白/TCF轉(zhuǎn)錄。
A(i)和A(ii).化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5的結(jié)構(gòu)。
B(i)和B(ii).化合物1選擇性地抑制β-聯(lián)蛋白/TCF報道基因構(gòu)成物(construct)，IC50為5μM。用β-聯(lián)蛋白/TCF熒光素酶構(gòu)成物轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞(105)(圖1B(i))。用化合物1處理細(xì)胞(1-64μM)。處理后24小時后制備溶胞產(chǎn)物，并對其進(jìn)行雙熒光素酶化驗。數(shù)據(jù)以不同形式示于圖1B(ii)。
C.化合物1對NFAT受體構(gòu)成物沒有影響。將用NFAT受體構(gòu)成物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞，右圖(right panel)，用PMA(10ng/ml)/洛諾霉素(1μg/ml)刺激，并用化合物1(0.781-50μM)處理。處理后24小時后制備溶胞產(chǎn)物，并對其進(jìn)行雙熒光素酶化驗。所有實驗進(jìn)行兩份，數(shù)值以平均+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差作圖。
D.CBP是化合物1的分子標(biāo)靶。將SW480細(xì)胞的核抽提物與覆有化合物2(25μM)的鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖小珠一起培育。將小珠洗滌3次，對洗脫物進(jìn)行凝膠電泳，并用抗CBP抗體進(jìn)行免疫印跡。箭頭指向在大小上和對CBP的免疫反應(yīng)性相應(yīng)的條帶。
E.14C標(biāo)記的化合物1與CBP結(jié)合。通過引入14C標(biāo)記的酪氨酸制備化合物1。將SW480細(xì)胞用表達(dá)全長爪蟾(Xenopus laevis)β-聯(lián)蛋白(2.2μg)或全長小鼠CBP(1.1μg)的載體轉(zhuǎn)染。將50μg核溶解產(chǎn)物(NE-PER kit，Pierce)用20μM14C標(biāo)記的化合物1(7.16×104CPM)、及DMSO(0.5％)或100μM和200μM的冷化合物1處理。使用G-25 1cc柱(Pharmacia)將溶解產(chǎn)物脫鹽，以除去未結(jié)合的14C標(biāo)記的化合物1，并測量14C標(biāo)記的化合物1的結(jié)合。
圖2.CBP而并非p300的前111個氨基酸特異性地結(jié)合化合物1。
A.野生型和CBP缺失構(gòu)成物的示意圖。
B.CBP(1-111)含有化合物1的最小結(jié)合結(jié)構(gòu)域。SW480細(xì)胞中CBP缺失構(gòu)成物的表達(dá)水平如圖所示(上圖)。10μg的總蛋白進(jìn)行凝膠電泳，并使用抗His抗體進(jìn)行免疫印跡。將表達(dá)CBP缺失構(gòu)成物的SW480細(xì)胞的全細(xì)胞溶解產(chǎn)物結(jié)合到覆有100μM化合物2的鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖小珠上。結(jié)合部分進(jìn)行凝膠電泳，并使用抗His抗體進(jìn)行免疫印跡(下圖)。箭頭指向與覆有化合物2的小珠保持結(jié)合的構(gòu)成物。
C.過量的化合物1與CBP(1-111)而非p300(1-111)競爭。將CBP缺失構(gòu)成物、CBP(1-111)、CBP(1-211)和CBP(1-351)和p300缺失構(gòu)成物、p300(1-111)、p300(1-211)和p300(1-351)轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞中。將全部細(xì)胞溶解產(chǎn)物與鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖小珠或者覆有100μM化合物2的鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖小珠一起培育(下圖)。CBP構(gòu)成物(1-111、1-211和1-351)和p300構(gòu)成物(1-111、1-211和1-351)在小珠上的結(jié)合受到過量化合物1(150μM)的攻擊。
D.CBP(1-111)以不依賴于磷酸化的方式與化合物1結(jié)合。CBP(1-111)或p300(1-111)在大腸桿菌中表達(dá)，并通過Ni-NTA-瓊脂糖(考馬斯亮藍(lán)(Commassie blue)染色的凝膠)提純。CBP(1-111)如圖所示(右上)。使用抗His抗體對1和3μl的提純蛋白進(jìn)行免疫印跡。箭頭指向通過其適當(dāng)抗體識別的重組蛋白。增量的提純CBP(1-111)(0.5、1和3μl)和p300(1-111)(1、3和5μl)與覆有100μM化合物2的鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖小珠一起培育。洗滌小珠，對洗脫蛋白進(jìn)行凝膠電泳，之后用抗His抗體進(jìn)行免疫印跡。箭頭指向PVDF膜上的蛋白。使用過量化合物1(300μM)攻擊特異結(jié)合的相互作用。
E.CBP的Δ1-111+NLS構(gòu)成物不能拯救被化合物1抑制的β-聯(lián)蛋白/TCF轉(zhuǎn)錄。將SW480細(xì)胞用(0.1-1)μg表達(dá)全長或CBP(Δ1-111+NLS)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過后24小時用化合物1(25μM)或?qū)φ瘴?0.5％DMSO)處理細(xì)胞。處理過后24小時制備溶解產(chǎn)物，并對其進(jìn)行雙熒光素酶化驗。
圖3.化合物1破壞β-聯(lián)蛋白/CBP復(fù)合體但不破壞p300/β-聯(lián)蛋白復(fù)合體。
A.將全長爪蟾β-聯(lián)蛋白(1.1、2.2和3.3μg)或者鼠CBP(0.14、0.28、0.55、1.1和2.2μg)質(zhì)粒在SW480細(xì)胞內(nèi)與β-聯(lián)蛋白/TCF(1.1μg)報道基因構(gòu)成物一起共轉(zhuǎn)染。使用空pcDNA3載體使各反應(yīng)中所用DNA的量均等?；衔?處理過后24小時進(jìn)行雙熒光素酶化驗。所有實驗進(jìn)行兩份，數(shù)值以平均+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差作圖。
B.化合物1與β-聯(lián)蛋白競爭CBP。將SW480細(xì)胞用5或10μM化合物1或?qū)φ瘴?0.5％DMSO)處理。處理過后24小時，將溶解產(chǎn)物與覆有對照抗體或者抗CBP抗體或抗p300抗體的小珠一起培育。對共免疫沉淀的蛋白進(jìn)行凝膠電泳，并用抗β-聯(lián)蛋白抗體進(jìn)行免疫印跡。箭頭指向免疫沉淀的β-聯(lián)蛋白(成對)。
C.CBP(1-111)是與β-聯(lián)蛋白相互作用的最小區(qū)。用覆在蛋白A-瓊脂糖小珠上的抗β-聯(lián)蛋白抗體對用CBP缺失系列轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞進(jìn)行免疫沉淀。將免疫復(fù)合體洗滌并進(jìn)行凝膠電泳，之后使用抗His抗體進(jìn)行免疫印跡。箭頭指向與小珠保持結(jié)合的構(gòu)成物。
D.化合物1與β-聯(lián)蛋白競爭CBP而非p300構(gòu)成物。將CBP(1-111、1-211和1-351)和p300(1-111、1-211和1-351)構(gòu)成物均轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞中(下圖)。轉(zhuǎn)染過后48小時制備全部細(xì)胞溶解產(chǎn)物，并使用上述的蛋白A-瓊脂糖-抗β-聯(lián)蛋白抗體進(jìn)行免疫沉淀(中圖)。將免疫復(fù)合體洗滌并進(jìn)行凝膠電泳，使用抗His抗體進(jìn)行免疫印跡。箭頭指向結(jié)合的蛋白(上圖)。為了進(jìn)行競爭化驗，將小珠上的免疫復(fù)合體用50μM化合物1攻擊。
E.CBP和p300與公認(rèn)的β-聯(lián)蛋白結(jié)合基序(SEQ ID NOS47-55)的序列排比。公認(rèn)的序列是加框的。使用程序BLAST進(jìn)行NCBI數(shù)據(jù)庫中蛋白序列的排比。
F.CBP 1-111(CBP M1，SEQ ID NO2)與p300 1-111(p300M1，SEQ ID NO4)的序列排比。
圖4.化合物1降低核的β-聯(lián)蛋白A.β-聯(lián)蛋白免疫熒光顯微法。將對數(shù)期的SW480(左)和HCT116(右)細(xì)胞固定并用抗β-聯(lián)蛋白紅(上圖，A)或者抗CBP(上圖，B)綠染色。中圖顯示了SW480(左)和HCT116(右)細(xì)胞中重疊的β-聯(lián)蛋白和CBP。下圖顯示用化合物1(25μM)處理24小時后β-聯(lián)蛋白在SW480胞質(zhì)(左)和HCT116細(xì)胞胞質(zhì)膜(右)上的重新分布。
B.β-聯(lián)蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析。使用25μg來自SW480細(xì)胞抽提物的總蛋白在用化合物1處理24小時或不進(jìn)行處理的情況下進(jìn)行胞質(zhì)和核β-聯(lián)蛋白的檢測。
圖5.化合物1抑制細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)。
A.細(xì)胞周期蛋白D1水平隨化合物1處理而降低。對經(jīng)25μM化合物1或?qū)φ瘴?0.5％DMSO)處理4、8或24小時的25μg SW480全細(xì)胞溶解產(chǎn)物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。使用抗細(xì)胞周期蛋白D1抗體(Santa Cruz Biotechnology Inc.)進(jìn)行免疫印跡。
B.細(xì)胞周期蛋白D1和c-myc啟動子被CBP和p300在體內(nèi)占有。ChIP(見材料和方法)說明化合物1處理后發(fā)生c-myc啟動子的CBP和p300占有。對來自化合物1(25μM)或?qū)φ瘴?0.5％DMSO)處理8小時的SW480細(xì)胞的c-myc啟動子進(jìn)行ChIP化驗。使用CBP(AC-26，由Harvard University，Boston，MA的Dr.David Livingston慷慨贈送)或p300(C-20，Santa Cruz Biotechnology Inc.)特異性抗體在進(jìn)行化合物1或?qū)φ瘴?DMSO)處理的情況下，評價啟動子被CBP或p300占有。
圖6.
A.化合物1使G1中的細(xì)胞停滯。對經(jīng)化合物1(25μM)(右)或?qū)φ瘴?0.5％DMSO)(左)處理24小時的SW480(下圖)和HCT116(上圖)細(xì)胞進(jìn)行FACS分析。將5.5×106細(xì)胞固定并用碘化丙錠(PI)染色。箭頭標(biāo)出G0/G1、S和G2/M。
B.化合物1選擇性地激活結(jié)腸癌細(xì)胞系中的胱天蛋白酶。將SW480和HCT116(左圖)細(xì)胞(105)連同正常結(jié)腸細(xì)胞CCD18Co(右圖)用對照物(0.5％DMSO)或化合物1(25μM)處理。處理過后24小時，將細(xì)胞溶解，并測量胱天蛋白酶-3/7的酶活性。通過從經(jīng)處理的樣品(化合物1或?qū)φ瘴?減去空白(對照物，無細(xì)胞)的單位值計算相對熒光單位(RFU)，并作圖。
圖7.化合物1以依賴劑量的方式降低軟瓊脂中的集落生長。
A.向三孔SW480(5000細(xì)胞/孔)中加入濃度漸增的5-氟尿嘧啶(5-FU)(0.5-32μM)和化合物1(0.25-5lμM)。將細(xì)胞洗滌并懸浮在軟瓊脂生長培養(yǎng)基中。8天后對集落數(shù)目(直徑大于60lμM的集落)進(jìn)行計數(shù)，并針對化合物濃度作圖。標(biāo)出三次測量的平均值±SE。在不存在化合物的情況下，對照的集落數(shù)為1,637±71。
B.化合物1的作用示意圖。不想受其理論束縛，申請人提出β-聯(lián)蛋白/TCF復(fù)合體以依賴輔激活物的方式調(diào)節(jié)其下游靶基因的表達(dá)。更具體地說，提出核的β-聯(lián)蛋白/TCF有差異地與CBP或p300結(jié)合，三元復(fù)合體驅(qū)動β-聯(lián)蛋白/TCF響應(yīng)基因亞型的表達(dá)?；衔?特異性并選擇性地靶向β-聯(lián)蛋白/TCF/CBP復(fù)合體，但不靶向β-聯(lián)蛋白/TCF/p300復(fù)合體，并對依賴CBP的基因，如細(xì)胞周期蛋白D1、軸蛋白2和hnkd的表達(dá)進(jìn)行減量調(diào)節(jié)。盡管化合物1處理阻斷了β-聯(lián)蛋白/CBP的相互作用，卻增加了可用于表達(dá)如下基因的β-聯(lián)蛋白/TCF復(fù)合體，所述基因的啟動子可以利用輔激活物(c-myc)或優(yōu)選地利用p300作為輔激活物(c-jun和fra-1)。
圖8提供制備用于實施本發(fā)明的化學(xué)試劑的一般合成示意圖。
圖9提供制備用于實施本發(fā)明的化學(xué)試劑的一般合成示意圖。
圖10.化合物3的代謝分析A.大鼠體內(nèi)化合物3及其代謝產(chǎn)物的二極管陣列示蹤圖(上圖)和總離子電流(下圖)。
B.人體內(nèi)化合物3及其代謝產(chǎn)物的二極管陣列示蹤圖(上圖)和總離子電流(下圖)。
具體實施例方式
本發(fā)明提供對抗β-聯(lián)蛋白/TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的試劑，及其相關(guān)的方法。一方面，本發(fā)明提供使β-聯(lián)蛋白/TCF響應(yīng)基因的亞型被特異性減量調(diào)節(jié)的方法，同時在相關(guān)方面，本發(fā)明提供用于該方法的化合物。另一方面，本發(fā)明提供使CBP和β-聯(lián)蛋白之間的結(jié)合被破壞，但是結(jié)構(gòu)相關(guān)的輔激活物p300和β-聯(lián)蛋白之間的結(jié)合不被破壞的方法，同時在相關(guān)方面，本發(fā)明提供用于該方法的化合物。另一方面，本發(fā)明提供使由CBP而非由p300啟動的基因被選擇性激活的方法，同時在相關(guān)方面，本發(fā)明提供用于該方法的化合物。此外，本發(fā)明提供使由p300而非由CBP啟動的基因被選擇性激活的方法，同時在相關(guān)方面，本發(fā)明提供用于該方法的化合物。另一方面，本發(fā)明提供用化學(xué)試劑處理結(jié)腸癌細(xì)胞以使細(xì)胞周期G1階段的發(fā)育停滯的方法，其中延長用化學(xué)試劑進(jìn)行處理誘發(fā)正常結(jié)腸細(xì)胞中檢測不到的細(xì)胞凋亡。
以下提供這些方法和試劑更為具體的細(xì)節(jié)。但是，在提供這些細(xì)節(jié)之前，提供以下定義以幫助讀者理解本發(fā)明的公開內(nèi)容。
定義SEQ ID NO1是核酸序列tgaggaatca acagccgcca tcttgtcgcggacccgaccg gggcttcgag cgcgatctac tcggccccgc cggtcccggg ccccacaaccgcccgcgctc gctcctctcc ctcgcagccg gcagggcccc cgacccccgt ccgggccctcgccggcccgg ccgcccgtgc ccggggctgt tttcgcgagc aggtgaaaat ggctgagaacttgctggacg gaccgcccaa ccccaaaaga gccaaactca gctcgcccgg tttctcggcgaatgacagca cagattttgg atcattgttt gacttggaaa atgatcttcc tgatgagctg。
SEQ ID NO2是氨基酸序列MAENLLDGPPNPKRAKLSSPGFSANDSTDFGSLFDLENDLPDELIPNGGELGLLNSGNLVPDAASKHKQLSELLRGGSGSSINPGIGNVSASSPVQQGLGGQAQGQPNSAN。
SEQ ID NO3是核酸序列ccttgtttgt gtgctaggct gggggggagagagggcgaga gagagcgggc gagagtgggc aagcaggacg ccgggctgag tgctaactgcgggacgcaga gagtgcggag gggagtcggg tcggagagag gcggcagggg ccagaacagtggcagggggc ccggggcgca cgggctgagg cgacccccag ccccctcccg tccgcacacacccccaccgc ggtccagcag ccgggccggc gtcgacgcta ggggggacca ttacataacccgcgccccgg ccgtcttctc ccgccgccgc ggcgcccgaa ctgagcccgg ggcgggcgctccagcactgg。
SEQ ID NO4是氨基酸序列MAENVVEPGPPSAKRPKLSSPALSASASDGTDFGSLFDLEHDLPDELINSTELGLTNGGDINQLQTSLGMVQDAASKHKQLSELLRSGSSPNLNMGVGGPGQVMASQAQQSSPGLGL。
小分子抑制劑術(shù)語“小分子”是指分子量低于約5,000g/mol的化學(xué)化合物?；衔锟梢允怯袡C(jī)或無機(jī)的，可以是合成或天然的，例如，可以分類為肽、寡核苷酸、肽模擬物、寡核苷酸模擬物、寡糖、寡糖模擬物、天然產(chǎn)物類似物或衍生物，或者純合成的化合物，其可以包括例如一個或多個無環(huán)基、環(huán)狀基、碳環(huán)基、雜環(huán)基、多環(huán)基和/或芳香基。術(shù)語“抑制劑”是指將本文所公開的兩種多肽，例如β-聯(lián)蛋白與CBP或者β-聯(lián)蛋白與p300之間的結(jié)合抑制到統(tǒng)計學(xué)上顯著的程度的化合物。換句話說，與不存在抑制劑時發(fā)生的結(jié)合相比，在存在抑制劑的情況下將兩種多肽之間的結(jié)合降低到統(tǒng)計學(xué)上顯著的程度。優(yōu)選地，該抑制足以實現(xiàn)對細(xì)胞性質(zhì)的影響，例如接受小分子抑制劑的受試者內(nèi)的治療反應(yīng)。
β-聯(lián)蛋白CBP相互作用β-聯(lián)蛋白和CBP均為公知的多肽。例如，參見Morin，P.J.，Bioessays 211021-30(1999)和Hecht等人，EMBO J.191839-50(2000)。β-聯(lián)蛋白與CBP之間的相互作用已經(jīng)過證明和測量。例如，參見Takemaru等人，J.Cell.Biol.149249-54(2000)。術(shù)語β-聯(lián)蛋白CBP相互作用是指這兩種蛋白之間發(fā)生的結(jié)合。
假定的在小分子已經(jīng)被驗證具有例如β-聯(lián)蛋白/TCF激活轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)物的活性之前，將小分子視為假定的調(diào)節(jié)物。當(dāng)小分子表現(xiàn)出調(diào)節(jié)物活性時，那么可以將其稱為β-聯(lián)蛋白/TCF激活轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)物。類似地，在小分子已經(jīng)被驗證為如β-聯(lián)蛋白CBP相互作用之類的蛋白-蛋白相互作用的抑制劑之前，小分子可以被稱為β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的假定抑制劑。
接觸當(dāng)將兩種物質(zhì)，如化學(xué)化合物、蛋白、寡核苷酸等均置于液體培養(yǎng)基，如水或緩沖液中，并且不限制它們在該培養(yǎng)基中的活動，則這兩種物質(zhì)已經(jīng)彼此相接觸。此外，當(dāng)將兩種物質(zhì)放置得彼此接近，使得兩種物質(zhì)彼此觸及時，則這兩種物質(zhì)彼此相接觸。進(jìn)行化驗時，當(dāng)例如將它們均置于化驗培養(yǎng)基中時，兩種物質(zhì)彼此相接觸。
β-聯(lián)蛋白是指一種本領(lǐng)域公知得蛋白，例如參見Morin，P.J.，Bioessays 211021-30(1999)；Gottardi等人，Curr.Biol.11R792-4(2001)；Huber等人，Cell 105391-402(2001)。β-聯(lián)蛋白已經(jīng)鑒定為胞質(zhì)膜中細(xì)胞黏著的介體和轉(zhuǎn)錄激活物。
術(shù)語“化驗”是指在選定的條件下將各種物質(zhì)(如化學(xué)品、酶等)彼此相接觸，并且將會引起或者將不引起可檢測現(xiàn)象的過程或方法。是否檢測到該現(xiàn)象則揭示關(guān)于各種物質(zhì)和/或選定條件的信息。
術(shù)語“抑制結(jié)合”、“抑制相互作用”、“抑制復(fù)合體形成”和類似的術(shù)語均是指將兩種蛋白之間結(jié)合的強(qiáng)度、等級或程度降低到統(tǒng)計學(xué)上顯著的程度的作用。例如，當(dāng)與兩種蛋白的未復(fù)合形式相比它們在復(fù)合形式中顯著更穩(wěn)定時，可以發(fā)生強(qiáng)的結(jié)合。在定量和定性方面蛋白-蛋白結(jié)合研究在本領(lǐng)域是公知的。與β-聯(lián)蛋白結(jié)合有關(guān)的例子如下說明Brantjes等人，Biol.Chem.383255-61(2002，β-聯(lián)蛋白與T細(xì)胞因子(TCF)成員的結(jié)合)；Gottardi等人，Curr.Biol.11R792-4(2001)，說明了與結(jié)合配偶體相互作用的β-聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)元件)；和Takemaru等人，J.Cell Biol.149249-54(2000，說明了β-聯(lián)蛋白與CBP的相互作用)。
術(shù)語“CBP蛋白”是指也稱為CREB結(jié)合蛋白的蛋白，這里的CREB是“cAMP-應(yīng)答元件結(jié)合”的縮寫。該蛋白在本領(lǐng)域是公知的，例如參見Takemaru等人，J.Cell Biol.149249-54(2000)和美國專利第6,063,583號。
CBP 1-111是指從蛋白CBP的N-端識別的CBP的前111個氨基酸。從人體中分離的CBD氨基酸1-111如上文陳述為SEQ ID NO2。相應(yīng)的核酸序列如上文陳述為SEQ ID NO1。從小鼠分離的CBP氨基酸1-111為SEQ ID NO5，其如下MAENLLDGPPNPKRAKLSSPGFSANDNTDFGSLFDLENDLPDELIPNGELSLLNSGNLVPDAASKHKQLSELLRGGSGSSINPGIGNVSASSPVQQGLGGQAQGQPNSTN。來自小鼠的相應(yīng)核酸序列為SEQ ID NO6，其如下atggccgaga acttgctggacggaccgccc aaccccaaac gagccaaact cagctcgccc ggcttctccg cgaatgacaacacagatttt ggatcattgt ttgacttgga aaatgacctt cctgatgagc tgatccccaa tggagaattaagccttttaa acagtgggaa ccttgttcca gatgctgcgt ccaaacataa acaactgtca gagcttcttagaggaggcag cggctctagc atcaacccag ggataggcaa tgtgagtgcc agcagccctgtgcaacaggg ccttggtggc caggctcagg ggcagccgaa cagtacaaac。
p3001-111是指從蛋白p300的N-端識別的p300的前111個氨基酸。從人體中分離的p300氨基酸1-111如上文陳述為SEQ ID NO4。編碼該肽的相應(yīng)的核酸序列如上文陳述為SEQ ID NO3。
已知β-聯(lián)蛋白天然地與包括p300和CBP在內(nèi)的許多種不同的蛋白相互作用，即形成復(fù)合體(例如，參見Hecht等人，EMBO J.191839-50(2000)。當(dāng)存在多種不同的潛在結(jié)合配偶體時，β-聯(lián)蛋白將會與那些潛在的配偶體結(jié)合到不同的程度，其取決于β-聯(lián)蛋白與潛在結(jié)合配偶體之間的結(jié)合強(qiáng)度。當(dāng)β-聯(lián)蛋白與那些結(jié)合配偶體中至少一種(第一結(jié)合配偶體)之間的結(jié)合程度相對于β-聯(lián)蛋白與那些結(jié)合配偶體至少另一種(第二結(jié)合配偶體)之間的結(jié)合程度減少時，發(fā)生β-聯(lián)蛋白結(jié)合的選擇性抑制。這一結(jié)合的相對降低可以看作β-聯(lián)蛋白與第一結(jié)合配偶體之間的結(jié)合降低，而不影響β-聯(lián)蛋白與第二結(jié)合配偶體之間的結(jié)合；或者它可以看作β-聯(lián)蛋白與第一結(jié)合配偶體之間的結(jié)合降低，而β-聯(lián)蛋白與第二結(jié)合配偶體之間的結(jié)合增加；或者它可以看作β-聯(lián)蛋白與第一結(jié)合配偶體之間的結(jié)合降低，同時β-聯(lián)蛋白與第二結(jié)合配偶體之間的結(jié)合降低，只要β-聯(lián)蛋白與第一結(jié)合配偶體之間結(jié)合的降低大于β-聯(lián)蛋白與第二結(jié)合配偶體之間結(jié)合的降低。
術(shù)語“p300蛋白”是指本領(lǐng)域公知的蛋白。例如，參見Gusterson，R.J.等人，J.Biol.Chem.2003Feb 28；278(9)6838-47；An和Roeder，J.Biol.Chem.2003 Jan 17；278(3)1504-10；Rebel，V.I.等人，Proc NatlAcad Sci USA.2002 Nov 12；99(23)14789-94；和美國專利第5,658,784號，以及其中所引用的參考文獻(xiàn)。
基本上提純是指核酸或多肽是分離的，并且基本不含其它核酸或多肽，即所述的核酸或多肽是主要活性成分。本文所用的術(shù)語“分離的”是指從在其天然態(tài)下與其正常結(jié)合的基本上所有其它分子中分離出的分子?；旧咸峒兒头蛛x的分子是制備中存在的主要物種?；旧咸峒兊姆肿涌梢远嘤?0％，優(yōu)選75％，更優(yōu)選90％，最優(yōu)選95％不含其它天然混合物中存在的分子(排除溶劑)。術(shù)語“分離的”不是要包括在其天然態(tài)中存在的分子。
短語“結(jié)合CBP與p300的可能性”是指β-聯(lián)蛋白分子結(jié)合CBP與p300的概率。通過指定條件下結(jié)合CBP的β-聯(lián)蛋白分子的數(shù)目與結(jié)合p300的β-聯(lián)蛋白分子數(shù)目的比例，可以表達(dá)和/或測量這種概率。類似地，“改變β-聯(lián)蛋白結(jié)合CBP與p300可能性”的試劑是指與反應(yīng)混合物中不存在化合物時的比例相比，當(dāng)反應(yīng)混合物中存在該化合物時改變上述比例的化合物。
術(shù)語“細(xì)胞分化而不是增殖的可能性”是指細(xì)胞分化而不是增殖的概率。通過指定條件下分化細(xì)胞數(shù)目與增殖細(xì)胞數(shù)目的比例，可以表達(dá)和/或測量這種概率?！霸黾蛹?xì)胞分化而不是增殖的可能性”的試劑是指與不存在化合物時的分化細(xì)胞數(shù)目與增殖細(xì)胞數(shù)目的比例相比，當(dāng)存在該化合物時增加該同樣比例的化合物。類似地，“增加細(xì)胞增殖而不是分化的可能性”的試劑是指與不存在化合物時的增殖細(xì)胞數(shù)目與分化細(xì)胞數(shù)目的比例相比，當(dāng)存在該化合物時增加該同樣比例的化合物。
短語“Wnt途徑”是指可以通過Wnt蛋白(分泌的糖蛋白)與卷曲的七跨膜跨度(seven-transmembrane-span)受體結(jié)合引發(fā)的信號級聯(lián)。這一途徑在本領(lǐng)域中是已知的，并且進(jìn)行了表征，它是大量文章和綜述的主題(例如，參見Huelsken和Behrens，J.Cell Sci.1153977-8，2002；Wodarz等人，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.1459-88(1998)；Morin，PJ.，Bioessays 211021-30(1999)；Moon等人，Science 2961644-46(2002)；Oving等人，Eur.J.Clin.Invest.32448-57(2002)；Sakanaka等人，Recent Prog.Horm.Res.55225-36，2000)。
短語“Wnt途徑的活性”是指該途徑至少一個組分的活性。例如，在某些實施方式中，Wnt途徑的活性可以指β-聯(lián)蛋白在誘發(fā)靶基因表達(dá)中的活性。Wnt途徑的許多成分在本領(lǐng)域中是已知的，其包括但不限于Cerberus(Cer)、FrzB、Dickkopf(DKK)、LRP、異源三聚G蛋白、Dsh、酪蛋白激酶Iα(CKIα)、GSK3β、βTrCP、ACP、軸蛋白、CBP、p300、β-聯(lián)蛋白、TCF、Froucho等。
“激活Wnt途徑”的化合物是指當(dāng)存在于具有Wnt途徑的系統(tǒng)中時，導(dǎo)致β-聯(lián)蛋白誘發(fā)靶基因表達(dá)的化合物。許多β-聯(lián)蛋白誘發(fā)其表達(dá)的靶基因在本領(lǐng)域中是已知的，其包括但不限于Conductin、Myc、Twin、細(xì)胞周期蛋白D1、Nkd、Ubx、En-2、PPARδ、Xbra、ID2、Siamois、Xnr3、MMP7、TCF-1、存活蛋白等。這些基因也可以稱為“Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑靶向的基因”。
短語“選擇性抑制Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑靶向基因的表達(dá)”是指抑制Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑靶向基因的亞型的表達(dá)，但是不抑制其它Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑靶向的基因的表達(dá)。盡管不想受任何特定機(jī)理的束縛，本發(fā)明的發(fā)明人推測可以通過破壞β-聯(lián)蛋白與其某些但并非全部潛在的結(jié)合配偶體之間的結(jié)合，來實現(xiàn)基因表達(dá)的選擇性抑制。
試劑一方面，本發(fā)明提供可用于上述方法的試劑。除化合物1之外，其它可用于本發(fā)明方法的試劑可以通過對通式(I)的化合物進(jìn)行篩選來鑒別 其中A為-(CHR3)-或-(C＝O)-，B為-(CHR4)-或-(C＝O)-，D為-(CHR5)-或-(C＝O)-，E為-(ZR6)-或-(C＝O)-，G為-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W為-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y為氧或硫，X和Z獨立地為氮或CH，n＝0或1；而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自獨立地選自氨基酸側(cè)鏈部分、氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物、或者分子的殘余部分、及其立體異構(gòu)體。
在一個實施方式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9獨立地選自氨基C2-5烷基、胍C2-5烷基、C1-4烷基胍基C2-5烷基、二C1-4烷基胍基-C2-5烷基、脒基C2-5烷基、C1-4烷基脒基C2-5烷基、二C1-4烷基脒基C2-5烷基、C1-3烷氧基、苯基、取代苯基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、芐基、取代芐基(其中芐基上的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、萘基、取代萘基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、雙苯基甲基、取代雙苯基甲基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、吡啶基、取代吡啶基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、吡啶基C1-4烷基、取代吡啶基C1-4烷基(其中吡啶的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、嘧啶基C1-4烷基、取代嘧啶基C1-4烷基(其中嘧啶的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、三嗪-2-基-C1-4烷基、取代三嗪-2-基-C1-4烷基(其中三嗪的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、咪唑并C1-4烷基、取代咪唑并C1-4烷基(其中咪唑的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、咪唑啉基C1-4烷基、N-脒基哌嗪基-N-C0-4烷基、羥基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、羥基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、C1-5二烷基氨基C2-5烷基、N-脒基哌啶基C1-4烷基和4-氨基環(huán)己基C0-2烷基。
在一個實施方式中，E的R1、R2、R6和G的R7、R8和R9可以相同或不同，并且表示化合物的殘余部分，而A的R3、B的R4或D的R5選自氨基酸側(cè)鏈部分或其衍生物。
在另一個實施方式中，A的R3、D的R5、E的R6和G的R7、R8和R9可以相同或不同，并且表示化合物的殘余部分，而在B的R1、R2和R4中的一個或多個，并且在一個方面其全部表示氨基酸側(cè)鏈。在這種情況下，術(shù)語“化合物的殘余部分”表示共價結(jié)合到回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)的R3、R5、R6、R7、R8和/或R9位置的任何分子部分、試劑、化合物、載體、分子、連接基團(tuán)、氨基酸、肽或蛋白質(zhì)。該術(shù)語也包括氨基酸側(cè)鏈部分及其衍生物。
這里所使用的術(shù)語“化合物的殘余部分”表示共價結(jié)合到回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)的任何分子部分、試劑、化合物、載體、分子、原子、連接基團(tuán)、氨基酸、肽或蛋白質(zhì)。該術(shù)語也包括氨基酸側(cè)鏈部分及其衍生物。在本發(fā)明的一個方面，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和/或R9中的任意一個或多個位置可以表示化合物的殘余部分。在本發(fā)明的一個方面，R1、R2和R4中的一個或多個表示氨基酸側(cè)鏈部分或其衍生物。
這里所使用的術(shù)語“氨基酸側(cè)鏈部分”表示任何天然蛋白質(zhì)中所存在的氨基酸側(cè)鏈部分，包括(但是不限于)表1中載明的天然氨基酸的側(cè)鏈部分。本發(fā)明的其它天然氨基酸側(cè)鏈部分包括(但是不限于)3，5-二溴酪氨酸、3，5-二碘酪氨酸、羥賴氨酸、γ-羧基谷氨酸鹽、磷酸酪氨酸和磷酸絲氨酸。此外，在本發(fā)明的實際應(yīng)用中也可以使用糖基化的氨基酸側(cè)鏈，包括(但是不限于)糖基化的蘇氨酸、絲氨酸和天門冬酰胺。
表A氨基酸側(cè)鏈部分氨基酸-H甘氨酸-CH3丙氨酸-CH(CH3)2纈氨酸-CH2CH(CH3)2亮氨酸-CH(CH3)CH2CH3異亮氨酸-(CH2)4NH3+賴氨酸-(CH2)3NHC(NH2)NH2+精氨酸
組氨酸-CH2COO-天門冬氨酸-CH2CH2COO-谷氨酸-CH2CONH2天門冬酰胺-CH2CH2CONH2谷酰胺 苯丙氨酸酪氨酸 色氨酸-CH2SH半胱氨酸-CH2CH2SCH3甲硫氨酸-CH2OH絲氨酸-CH(OH)CH3蘇氨酸脯氨酸羥基脯氨酸除天然氨基酸側(cè)鏈部分外，本發(fā)明的氨基酸側(cè)鏈部分還包括它們的各種衍生物。這里所使用的氨基酸側(cè)鏈部分的“衍生物”包括天然氨基酸側(cè)鏈部分的變體和/或變異。例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸的氨基酸側(cè)鏈部分通常可以被歸類為低鏈烷基、低鏈芳基或低鏈芳烷基部分。氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物包括其它直鏈或支鏈的、環(huán)狀或非環(huán)狀的、取代或非取代的、飽和的或非飽和的低鏈烷基、低鏈芳基或低鏈芳烷基部分。
這里所使用的“低鏈烷基部分”含有1-12個碳原子，“低鏈芳基部分”含有6-12個碳原子，而“低鏈芳烷基部分”含有7-12個碳原子。因此，在一個實施方式中，氨基酸側(cè)鏈衍生物選自C1-12烷基、C6-12芳基和C7-12芳烷基，并且在一個更優(yōu)選的實施方式中，其選自C1-7烷基、C6-10芳基和C7-11芳烷基。
本發(fā)明的氨基酸側(cè)鏈衍生物進(jìn)一步包括低鏈烷基、低鏈芳基和低鏈芳烷基部分的取代衍生物，其中取代基選自(但是不限于)以下化學(xué)部分的一個或多個-OH、-OR、-COOH、-COOR、-CONH2、-NH2、-NHR、-NRR、-SH、-SR、-SO2R、-SO2H、-SOR和鹵素(包括F、Cl、Br和I)，其中各個R的存在獨立地選自直鏈或支鏈的、環(huán)狀或非環(huán)狀的、取代或非取代的、飽和或不飽和的低鏈烷基、低鏈芳基和低鏈芳烷基部分。此外，本發(fā)明的環(huán)狀低鏈烷基、低鏈芳基和低鏈芳烷基部分包括萘，以及雜環(huán)化合物，例如噻吩、吡咯、呋喃、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、3-吡咯啉、吡咯烷、吡啶、嘧啶、嘌呤、喹啉、異喹啉和咔唑。氨基酸側(cè)鏈衍生物進(jìn)一步包括低鏈烷基和低鏈芳烷基部分的烷基部分的雜烷基衍生物，包括(但是不限于)烷基和芳烷基的磷酸酯和硅烷。
代表性的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9部分具體包括(但是不限于)-OH、-OR、-COR、-COOR、-CONH2、-CONR、-CONRR、-NH2、-NHR、-NRR、-SO2R和-COSR，其中各個R的存在如上所述。
在另一個實施方式中，除了可以是氨基酸側(cè)鏈部分或其衍生物(或者R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是化合物的殘余部分)，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8或R9可以是促進(jìn)化合物與另一個部分或化合物連接的連接基團(tuán)。例如，本發(fā)明的化合物可以連接到一種或多種用于診斷或篩選化驗的公知化合物上，例如生物素。此外，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8或R9可以是將化合物連接到固體載體(例如在固相肽合成中所使用的載體)上的連接基團(tuán)。在此實施方式中，連接到另一個部分或化合物上、或者到固體載體上，優(yōu)選在R1、R2、R7或R8、或者R9位置上，更優(yōu)選在R1或R2位置上。
在A是-(CHR3)-、B是-(C＝O)-、D是-(CHR5)-、E是-(C＝O)-并且G是-(XR7)n-的實施方式中，本發(fā)明的回折擬態(tài)化合物具有下式(II)
其中R1、R2、R3、R5、R7、W、X和n如上所述。在優(yōu)選實施方式中，R1、R2和R7表示化合物的殘余部分，并且R3或R5選自氨基酸側(cè)鏈部分。
在A是-(C＝O)-、B是-(CHR4)-、D是-(C＝O)-、E是-(ZR6)-、G是-(C＝O)-(XR9)-的實施方式中，本發(fā)明的回折擬態(tài)化合物具有下式(III) 其中R1、R2、R4、R6、R9、W和X如上所述，Z是氮或CH(當(dāng)Z是CH時，則X是氮)。在優(yōu)選實施方式中，R1、R2、R6和R9代表化合物的殘余部分，并且R4選自氨基酸側(cè)鏈部分。
在更具體的實施方式中，其中A是-(C＝O)-、B是-(CHR4)-、D是-(C＝O)-、E是-(ZR6)-并且G是(XR7)n-，本發(fā)明的回折化合物具有下式(IV) 其中R1、R2、R4、R6、R7、W、X和n如上所述，并且Z是氮或CH(當(dāng)Z是氮時，則n是0，當(dāng)Z是CH時，則X是氮并且n不是0)。在優(yōu)選實施方式中，R1、R2、R6和R7代表化合物的殘余部分，并且R4選自氨基酸側(cè)鏈部分。在一個方面，當(dāng)Z和X都是CH時，R6或R7選自氨基酸側(cè)鏈部分。
這些化合物可以通過使用合適的起始組分分子(下文中稱為“組分片段”)而制備。簡單的說，在具有式(I)的回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)的合成中，使第一和第二組分片段偶聯(lián)以形成結(jié)合的第一-第二中間體，如果必要，使第三和/或第四組分片段偶聯(lián)以形成結(jié)合的第三-第四中間體(或者，如果商品化，可以使用單獨的第三中間體)，然后使結(jié)合的第一-第二中間體與第三-第四中間體偶聯(lián)以提供第一-第二-第三-第四中間體(或者第一-第二-第三中間體)，將該中間體環(huán)化從而生成本發(fā)明的回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)?；蛘撸?I)的回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)可以通過單獨的組分片段在溶液中逐步地，或者如固相肽合成中所常用的一樣通過固相合成，進(jìn)行連續(xù)偶聯(lián)而制備。
制備本發(fā)明的化合物的具體組分片段及其組裝如圖8所示。例如，“第一組分片段”可以具有下式S1 其中R2如上所述，并且R是適用于肽合成的保護(hù)基，其中該保護(hù)基可以連接到聚合載體上以使固相合成能夠進(jìn)行。合適的R基團(tuán)包括烷基，并且在優(yōu)選實施方式中，R是甲基。在圖8中，R基團(tuán)之一是聚合(固體)載體，在該圖中顯示為“Pol”。這種第一組分片段可以通過H2N-R2和CH(OR)2-CHO的還原性胺化作用，或者通過H2N-R2與CH(OR)2-CH2-LG(其中LG代表離去基團(tuán)，例如鹵素(Hal)基團(tuán))之間的取代反應(yīng)而容易地合成。
“第二組分片段”可以具有下式S2 其中P是適用于肽合成的氨基保護(hù)基團(tuán)，L1是羥基或羧基-活化基團(tuán)，并且R4如上所述。優(yōu)選的保護(hù)基團(tuán)包括叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)，叔丁氧基羰基(BOC)、甲氧基羰基(MOC)、9H-芴甲氧羰基(FMOC)，和丙烯氧基羰基(Alloc)。N-保護(hù)的氨基酸是商品化的；例如可從各種來源得到FMOC氨基酸。為使第二組分片段與第一組分片段反應(yīng)，L1是羧基-活化基團(tuán)，并且通過本領(lǐng)域中公知的羧基活化方法可以容易地完成羧基到活化羧基的轉(zhuǎn)換。合適的活化羧酸基團(tuán)包括酸鹵，其中L1是例如氯或溴的鹵素；酸酐，其中L1是例如乙?；孽；换钚怎?，例如N-羥基琥珀酰亞胺酯和五氟苯基酯；以及其它活性中間體，例如使用例如二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的碳二亞胺在偶聯(lián)反應(yīng)中形成的活性中間體。因此，市售的N-保護(hù)氨基酸可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的手段轉(zhuǎn)化為羧酸活性形式。
在氨基酸的疊氮衍生物充當(dāng)?shù)诙M分片段的情況下，這種化合物可以通過Zaloom等人所公開的反應(yīng)(J.Org.Chem.465173-76，1981)，由相應(yīng)的氨基酸制備。
或者，本發(fā)明的第一組分片段可以具有下式S1’ 其中R如上所定義，并且L2是離去基團(tuán)，例如鹵原子或甲苯磺?；?，并且本發(fā)明的第二組分片段可以具有下式S2’ 其中R2、R4和P如上所定義。
本發(fā)明的“第三組分片段”可以具有下式S3 其中G、E、L1和L2如上所定義。合適的第三組分片段可以是各種來源的市售產(chǎn)品，或者可以通過有機(jī)化學(xué)中公知的方法制備。
在圖8中，式(1)的化合物的A是-(C＝O)-、B是-(CHR4)-、D是-(C＝O)-并且E是-(CR6)-。如圖9所示，其中的羧基在B位并且R基團(tuán)在B位的式(1)的化合物，即，其中A是-(CHR3)-并且B是-(C＝O)-的化合物，可以用與圖8所示方法類似的方法制備。圖9也說明了向第一-第二-第三組分中間體中加入第四組分片段，而不是在與第一-第二中間體片段反應(yīng)之前將第四組分片段附在第三組分片段上。此外，圖9說明了其中D是-(CHR5)-(而不是圖8所示的-(C＝O)-)并且E是-(C＝O)-(而不是圖8所示的-(CHR6)-)的本發(fā)明的化合物的制備過程。最后，圖9說明了其中G是NR7的化合物的制備過程。
因此，如上所述，式(I)的回折擬態(tài)化合物可以通過以下方法合成，使第一組分片段與第二組分片段反應(yīng)從而生成結(jié)合的第一-第二中間體，然后繼續(xù)使結(jié)合的第一-第二中間體與第三組分片段反應(yīng)以提供結(jié)合的第一-第二-第三-第四中間體，然后使該中間體環(huán)化以生成回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)。
式(III)和(IV)的回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)可以通過與以上公開的模塊化組分合成相類似的技術(shù)而制備，但是對組分片段進(jìn)行適當(dāng)?shù)母摹?br> 例如，可以通過以下通式說明用于本發(fā)明的化合物 其中，R1為具有8至11個環(huán)成員的二環(huán)芳基，其可以具有1至3個選自氮、氧或硫的雜原子，R2為5至7元單環(huán)芳香環(huán)，其可以具有1至2個選自氮、氧或硫的雜原子，而且化合物中的芳環(huán)可以具有一個或多個選自鹵素、羥基、氰基、低級烷基和低級烷氧基的取代基。
優(yōu)選地，R1為萘基、喹啉基或異喹啉基，R2為苯基、吡啶基或哌啶基。更優(yōu)選地，R1為萘基，R2為苯基。
在另一優(yōu)選的實施方式中，化合物具有如下的(6S，10R)-構(gòu)型 其中R1和R2與前述具有相同的含義。在另一優(yōu)選的實施方式中，通式(I)的化合物具有如圖1A所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)，該化合物在本文中稱為化合物1。可以根據(jù)授予Molecumetics Ltd.的美國專利第6,184,223號的公開內(nèi)容制備具有通式(I)的化合物。前述討論是在化合物1的活性方面進(jìn)行的，但是，在本方法中可以對結(jié)構(gòu)式(I)的其它化合物進(jìn)行活性篩選。
以下文獻(xiàn)中可以找到其它用于本發(fā)明的示范性試劑PCT申請公開第WO03/031448號、美國專利公開第US20040072831號、美國申請第10/803,179和10/826,972號，其標(biāo)題均為“回折擬態(tài)及其相關(guān)方法”(“Reverse-Turn Mimetics and Method Relating Thereto”)。
核酸分子一方面，本發(fā)明提供各種核酸分子，其編碼可用于篩選試劑的多肽，與β-聯(lián)蛋白和p300之間的相互作用相比，該試劑選擇性地抑制β-聯(lián)蛋白和CBP之間的相互作用。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的核酸分子，其含有SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)或者與SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的同源性至少為80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼全長人(或小鼠)CBP蛋白。如本文所使用，兩種核酸的百分比同源性使用Altschul等人(J.Mol.Biol.215403-10，1990)的BLAST程序以默認(rèn)參數(shù)確定。這些程序運行Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-7，1993)修改的Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-8，1990)中的算法。例如，BLAST程序可以自網(wǎng)址http://www.ncbi.nlm.nih.gov獲得。在優(yōu)選的實施方式中，核酸序列編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
在某些實施方式中，核酸分子編碼含有天然CBP序列(如人CBP或小鼠CBP)中存在的不多于100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250或300個連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列。在某些實施方式中，核酸分子含SEQ ID NO1或SEQ ID NO6。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的核酸分子，其含有SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼CBP蛋白。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少30個，或者至少60個，或者至少90個，或者至少120個，或者至少150個，或者至少180個，或者至少210個，或者至少240個，或者至少270個，或者至少300個核酸，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為300個，或270個，或240個，或210個，或180個，或150個，或120個，或90個，或60個核酸。獨立地，同時也是最佳地，核酸序列內(nèi)的片段與SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優(yōu)選的實施方式中，核酸序列編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的核酸序列，其基本由SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)或者與SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述序列與SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者最少為95％。在優(yōu)選的實施方式中，核酸序列編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的核酸序列，其基本由SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少30個，或者至少60個，或者至少90個，或者至少120個，或者至少150個，或者至少180個，或者至少210個，或者至少240個，或者至少270個，或者至少300個核酸，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為300個，或270個，或240個，或210個，或180個，或150個，或120個，或90個，或60個核酸。獨立地，同時也是最佳地，核酸序列內(nèi)的片段與SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優(yōu)選的實施方式中，核酸序列編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的核酸序列，其由SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)或者與SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述序列與SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者最少為95％。在優(yōu)選的實施方式中，核酸序列編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的核酸序列，其由SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少30個，或者至少60個，或者至少90個，或者至少120個，或者至少150個，或者至少180個，或者至少210個，或者至少240個，或者至少270個，或者至少300個核酸，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為300個，或270個，或240個，或210個，或180個，或150個，或120個，或90個，或60個核酸。獨立地，同時也是最佳地，核酸序列內(nèi)的片段與SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優(yōu)選的實施方式中，核酸序列編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的核酸分子，其含有SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的同源性至少為80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼全長人p300蛋白。在某些實施方式中，核酸序列編碼含有天然p300序列(如人p300或小鼠p300)中存在的不多于100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250或300個連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列。在某些實施方式中，核酸分子含SEQ ID NO3。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的核酸序列，其含有SEQ ID NO3的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼全長p300蛋白。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少30個，或者至少60個，或者至少90個，或者至少120個，或者至少150個，或者至少180個，或者至少210個，或者至少240個，或者至少270個，或者至少300個核酸，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為300個，或270個，或240個，或210個，或180個，或150個，或120個，或90個，或60個核酸。獨立地，同時也是最佳地，核酸序列內(nèi)的片段與SEQ ID NO3片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優(yōu)選的實施方式中，核酸序列編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的核酸序列，其基本由SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述序列與SEQ ID NO3的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者最少為95％。在優(yōu)選的實施方式中，核酸序列編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的核酸序列，其基本由SEQ ID NO3的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少30個，或者至少60個，或者至少90個，或者至少120個，或者至少150個，或者至少180個，或者至少210個，或者至少240個，或者至少270個，或者至少300個核酸，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為300個，或270個，或240個，或210個，或180個，或150個，或120個，或90個，或60個核酸。獨立地，同時也是最佳地，核酸序列內(nèi)的片段與SEQ ID NO3片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優(yōu)選的實施方式中，核酸分子編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的核酸序列，其由SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述序列與SEQ ID NO3的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者最少為95％。在優(yōu)選的實施方式中，核酸序列編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的核酸序列，其由SEQ ID NO3的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少30個，或者至少60個，或者至少90個，或者至少120個，或者至少150個，或者至少180個，或者至少210個，或者至少240個，或者至少270個，或者至少300個核酸，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為300個，或270個，或240個，或210個，或180個，或150個，或120個，或90個，或60個核酸。獨立地，同時也是最佳地，核酸序列內(nèi)的片段與SEQ ID NO3片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優(yōu)選的實施方式中，核酸序列編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可以通過用限制性內(nèi)切酶或其它核酸酶來消化對全長CBP和p300蛋白編碼的核酸分子而得到。編碼全長CBP和p300蛋白的核酸分子可以從基因組DNA或cDNA中通過本領(lǐng)域已知的作法分離(參見Sambrook和Russell，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，2001)?？梢允褂脤?yīng)于SEQ ID NO1、3或6區(qū)域的核酸探針篩選基因組或cDNA庫。適于篩選基因組或cDNA庫的核苷酸通常長度為20-40個堿基，并可以用多種有助于檢測的分子進(jìn)行標(biāo)記(如放射性核素、酶標(biāo)記、蛋白標(biāo)記、熒光標(biāo)記或生物素)。基因組和cDNA庫可以在多種適當(dāng)?shù)妮d體中構(gòu)建，其包括質(zhì)粒、噬菌體、酵母人工染色體和黏端質(zhì)粒載體。另外，庫可以從市場上購買(如Clontech，Palo Alto，CA)。
也可以使用其它方法獲得根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。一種優(yōu)選的方法是進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以擴(kuò)增期望的編碼CBP和p300蛋白的核酸分子區(qū)域(例如編碼含CBP或p300前111個氨基酸殘基的多肽的區(qū)域)。例如，PCR擴(kuò)增的具體方法見于Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Associates andWiley-Interscience，NY 1995。
另一種獲得核酸分子的方法是通過使用能夠結(jié)合CBP 1-111或p300 1-111的多肽探針的表達(dá)克隆。所述探針可以包括針對CBP 1-111、p300 1-111或其片段的抗體。表達(dá)克隆方法描述于Sambrook和Russell，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，2001；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Associates and Wiley-Interscience，NY 1995；和Blackwood和Eisenman，Methods in Enzymology 254229-40，1995。
還可以使用合成化學(xué)技術(shù)制造本發(fā)明的多聚核苷酸，得到本文所公開的序列。遺傳密碼的簡并使得可以存在另外的編碼SEQ ID NO1、3或6中所列的氨基酸序列的核苷酸序列。所有這些核苷酸序列均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
編碼CBP或p300片段的核酸序列可以與多種異源序列融合，例如編碼親和性標(biāo)記(如GST和His-tag)的序列和編碼分泌信號的序列。與編碼親和性標(biāo)記的序列融合使人們可以通過融合標(biāo)記進(jìn)行親和性提純，有助于所編碼多肽的提純。與編碼分泌信號的序列融合使人們可以從細(xì)胞溶解產(chǎn)物、壁膜間隙、韌皮部，或者從生長或發(fā)酵培養(yǎng)基中回收多肽，也有助于所編碼多肽的提純。適用的分泌信號是廣泛存在的，并且在本領(lǐng)域中是公知的(例如von Heijne，J.Mol.Biol.18499-105，1985)。
如上文所述，本發(fā)明的核酸分子還可以包括SEQ ID NO1、3或6中列出的天然核酸分子的變異體(包括等位基因)。這種變異體包括天然變異體(例如簡并形式、多態(tài)性、剪接變異體或突變體)和本領(lǐng)域中已知的基因工程產(chǎn)生的變異體。
多肽序列一方面，本發(fā)明提供多種用于篩選試劑的多肽分子，與β-聯(lián)蛋白和p300之間的相互作用相比，該試劑選擇性地抑制β-聯(lián)蛋白和CBP之間的相互作用。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO2(或SEQ ID NO5)或者與SEQ ID NO2(或SEQ IDNO5)的同源性至少為80％、85％、90％、95％、98％或99％的肽，附帶條件為所述的肽不是全長CBP蛋白(如人或小鼠CBP)。如本文所使用，兩種肽的百分比同源性使用Altschul等人(J.Mol.Biol.215403-10，1990)的BLAST程序以默認(rèn)參數(shù)確定。這些程序運行Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad Sci.USA 905873-7，1993)中修改的Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-8，1990)的算法。例如，BLAST程序可以自網(wǎng)址http://www.ncbi.nlm.nih.gov獲得。在優(yōu)選的實施方式中，所述的肽結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
在某些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的多肽包括含有天然CBP序列(如人CBP或小鼠CBP)中存在的不多于100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250或300個連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列。在某些實施方式中，多肽分子含SEQ ID NO2或SEQ ID NO5。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO2的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的肽不是全長CBP蛋白。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少10個，或者至少20個，或者至少30個，或者至少40個，或者至少50個，或者至少60個，或者至少70個，或者至少80個，或者至少90個氨基酸(殘基)，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為100個，或90個，或80個，或70個，或60個，或50個，或40個，或30個，或20個氨基酸(殘基)。獨立地，同時也是最佳地，肽內(nèi)的片段與SEQ ID NO2片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優(yōu)選的實施方式中，所述的肽結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO2或者與SEQ ID NO2的同源性至少為80％的肽組成。在不同的最佳實施方式中，所述肽與SEQ ID NO2的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者最少為95％。在優(yōu)選的實施方式中，所述的肽結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO2的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少10個，或者至少20個，或者至少30個，或者至少40個，或者至少50個，或者至少60個，或者至少70個，或者至少80個，或者至少90個氨基酸(殘基)，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為100個，或90個，或80個，或70個，或60個，或50個，或40個，或30個，或20個氨基酸(殘基)。獨立地，同時也是最佳地，肽內(nèi)的片段與SEQ ID NO2片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優(yōu)選的實施方式中，所述的肽結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的肽，其由SEQID NO2或者與SEQ ID NO2的同源性至少為80％的肽組成，附帶條件為所述的肽不是CBP蛋白。在不同的最佳實施方式中，所述的肽與SEQ ID NO2的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優(yōu)選的實施方式中，所述的肽結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的肽，其由SEQID NO2的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少10個，或者至少20個，或者至少30個，或者至少40個，或者至少50個，或者至少60個，或者至少70個，或者至少80個，或者至少90個氨基酸(殘基)，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為100個，或90個，或80個，或70個，或60個，或50個，或40個，或30個，或20個氨基酸(殘基)。獨立地，同時也是最佳地，肽內(nèi)的片段與SEQ ID NO2片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優(yōu)選的實施方式中，所述的肽結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的核酸分子，其含有SEQ ID NO4或者與SEQ ID NO3的同源性至少為80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼全長人p300蛋白。在某些實施方式中，多肽包括含有天然p300序列(如人p300或小鼠p300)中存在的不多于100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250或300個連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述的多肽含SEQ ID NO4。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO4的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的肽不是全長p300蛋白。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少10個，或者至少20個，或者至少30個，或者至少40個，或者至少50個，或者至少60個，或者至少70個，或者至少80個，或者至少90個氨基酸(殘基)，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為100個，或90個，或80個，或70個，或60個，或50個，或40個，或30個，或20個氨基酸(殘基)。獨立地，同時也是最佳地，肽內(nèi)的片段與SEQ ID NO4片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優(yōu)選的實施方式中，所述的肽結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO4或者與SEQ ID NO4的同源性至少為80％的肽組成。在不同的最佳實施方式中，所述的肽與SEQ ID NO4的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優(yōu)選的實施方式中，所述的肽結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO4的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少10個，或者至少20個，或者至少30個，或者至少40個，或者至少50個，或者至少60個，或者至少70個，或者至少80個，或者至少90個氨基酸(殘基)，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為100個，或90個，或80個，或70個，或60個，或50個，或40個，或30個，或20個氨基酸(殘基)。獨立地，同時也是最佳地，肽內(nèi)的片段與SEQ ID NO4片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優(yōu)選的實施方式中，所述的肽結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的肽，其由SEQID NO4或者與SEQ ID NO4的同源性至少為80％的肽組成，附帶條件為所述的肽不是CBP蛋白。在不同的最佳實施方式中，所述的肽與SEQ ID NO4的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優(yōu)選的實施方式中，所述的肽結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供基本上提純和分離的肽，其由SEQID NO4的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成的。在不同的最佳實施方式中，所述片段具有至少10個，或者至少20個，或者至少30個，或者至少40個，或者至少50個，或者至少60個，或者至少70個，或者至少80個，或者至少90個氨基酸(殘基)，同時獨立地，所述片段的長度(可能時，基于片段的最小長度)為100個，或90個，或80個，或70個，或60個，或50個，或40個，或30個，或20個氨基酸(殘基)。獨立地，同時也是最佳地，肽內(nèi)的片段與SEQ ID NO4片段的同源性至少為85％，或者至少為90％，或者至少為95％。在優(yōu)選的實施方式中，所述的肽結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
在某些實施方式中，本發(fā)明的多肽包含保守氨基酸變換，即，替換SEQ ID NO2或4中帶相似電荷或不帶電荷的氨基酸。保守氨基酸變換涉及將一種氨基酸替換成側(cè)鏈結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸類別中的另一種氨基酸。天然氨基酸通常分為四類酸性(天冬氨酸、谷氨酸)、堿性(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、非極性(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、和不帶電荷的極性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時也歸類為芳香氨基酸。非天然氨基酸也可用于形成本發(fā)明的多肽。
本發(fā)明還提供CBP或P300融合蛋白，其包括融合到含有一種或多種異源多肽的氨基酸序列上的CBP或P300片段或其同源物。這種異源多肽可以對應(yīng)于任何來源的天然多肽，或者可以是重組工程產(chǎn)生的氨基酸序列。融合蛋白可用于提純、產(chǎn)生針對氨基酸序列的抗體，并用于多種化驗系統(tǒng)。常用于融合蛋白構(gòu)建的蛋白包括β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、綠色熒光蛋白(GFP)、自身熒光蛋白，包括藍(lán)色熒光蛋白(BFP)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、熒光素酶、辣根過氧化物酶(HRP)和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)。此外，融合蛋白的構(gòu)建中可以使用附加表位，其包括組氨酸(His)標(biāo)記、FLAG標(biāo)記、流感血凝素(HA)標(biāo)記、Myc標(biāo)記、VSV-G標(biāo)記和硫氧還蛋白(Trx)標(biāo)記。其它的融合結(jié)構(gòu)可以包括麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、S-標(biāo)記物、Lex aDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)融合、GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合、和單純皰疹病毒(HSV)BP 16蛋白融合。
本發(fā)明的多肽可以通過各種本領(lǐng)域已知的方法得到。例如，可以通過例如親和力色譜的生化方法分離含SEQ ID NO2(或SEQ ID NO4)的CBP(或p300)片段?？捎糜贑BP或p300多肽的親和基質(zhì)可以是其上連有針對SEQ ID NO2或4或其片段制得的抗CBP或抗p300單克隆或多克隆抗體的固相?；蛘?，可以將已知的結(jié)合CBP或p300(如β-聯(lián)蛋白)的多肽用作分離CBP或p300多肽或其片段的親和基質(zhì)。
其它分離CBP、p300或其片段的生化方法包括制備性凝膠電泳、凝膠過濾、親和力色譜、離子交換和反相色譜、層析聚焦、等電聚焦和蔗糖或甘油密度梯度(Deutscher，Methods in EnzymologyGuide toProtein Purification，第182卷，Academic Press，Inc.，San Diego，Chapter38，1990；Balch等人，Methods in Enzymology，第257卷，Academic Press，Inc.，San Diego，Chapter 8，1995)。
根據(jù)本發(fā)明的多肽也可以通過化學(xué)合成，如固相肽合成法產(chǎn)生(Merrifield等人，J.Am.Chem.Soc.852149，1964)。也可以使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)液相法來合成含SEQ ID NO2或4或其同源物的多肽(Bodanszky，Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Berlin，1984；Bodanszky，Peptide Chemistry，Springer-Verlag，Berlin，1993)。可以分離新合成的多肽，例如通過高效液相色譜，并且可以使用質(zhì)譜或氨基酸序列分析對其進(jìn)行表征。
根據(jù)本發(fā)明的多肽也可以通過重組DNA法產(chǎn)生。可以將本發(fā)明提供的編碼SEQ ID NO2或4或其同源物的核酸克隆到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。這種載體有市售，或者可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員構(gòu)建，并含有轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的表達(dá)元件。如果適當(dāng)?shù)脑?，所選的載體也可以用于原核或真核宿主體系中，只要表達(dá)和調(diào)控元件的來源是相容的。例如，可以使用具有針對SEQ ID NO2或4或其片段的抗體的親和力色譜、離子交換色譜、HPLC、尺寸排阻色譜、硫酸銨結(jié)晶、電共焦、或制備性凝膠電泳來分離宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的或者由細(xì)胞分泌的重組多肽(主要參見Ausubel等人，見上文；Sambrook等人，見上文)。通常，分離提純的蛋白在考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠上證實為單條帶。
本發(fā)明還提供含SEQ ID NO2或4或其同源物和異源多肽的融合蛋白。這種融合蛋白可以通過將兩個蛋白片段共價連接，或者通過分子生物學(xué)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法制得。例如，如本領(lǐng)域已知，可以使用重組DNA法制備融合蛋白，這通過生成含編碼序列的DNA結(jié)構(gòu)，該編碼序列選自SEQ ID NO2或4，并在合適的閱讀框架中使核苷酸編碼第二個蛋白片段并在宿主細(xì)胞中表達(dá)DNA結(jié)構(gòu)。許多構(gòu)建融合蛋白的試劑盒可以獲自為研究實驗室提供實驗工具的公司，例如，其包括Promega Corporation(Madison，WI)、Stratagene(La Jolla，CA)、Clontech(Mountain View，CA)、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)、MBL International Corporation(MIC；Watertown，MA)、和QuantumBiotechnologies(Montreal，Canada；1-888-DNA-KITS)。
使用方法本發(fā)明提供結(jié)構(gòu)式(I)的化合物，其抑制β-聯(lián)蛋白/TCF誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄亞型。例如，如實施例中所詳述，化合物1選擇性地阻斷β-聯(lián)蛋白和CBP的相互作用，卻不干擾β-聯(lián)蛋白和p300的相互作用，其中p300與CBP密切相關(guān)?；衔?處理導(dǎo)致β-聯(lián)蛋白從核到胞質(zhì)的重新分布，選擇性地抑制CBP與某些靶基因(如c-myc和細(xì)胞周期蛋白D1)的啟動子的結(jié)合，從而抑制這些基因的表達(dá)。此外，化合物1選擇性地激活轉(zhuǎn)化中，但是不正常的結(jié)腸細(xì)胞中的凋亡胱天蛋白酶，導(dǎo)致癌細(xì)胞的G1/S期停滯，并降低轉(zhuǎn)化的結(jié)直腸細(xì)胞的增殖。因此，本發(fā)明的化合物可以具有多種用途，例如治療癌癥、降低腫瘤生長、增加細(xì)胞凋亡、調(diào)控β-聯(lián)蛋白誘發(fā)的基因表達(dá)和類似用途。
一方面，本發(fā)明提供相對于β-聯(lián)蛋白/p300的相互作用，選擇性地抑制β-聯(lián)蛋白/CBP相互作用的方法，該方法包括向組合物中加入化合物，其中所述的組合物包括β-聯(lián)蛋白、CBP和p300，所述化合物相對于β-聯(lián)蛋白/p300的相互作用，選擇性地抑制β-聯(lián)蛋白/CBP的相互作用。
另一方面，本發(fā)明提供相對于β-聯(lián)蛋白/CBP的相互作用，選擇性地抑制β-聯(lián)蛋白/p300相互作用的方法，該方法包括向組合物中加入化合物，其中所述組合物包括β-聯(lián)蛋白、CBP和p300，所述化合物相對于β-聯(lián)蛋白/CBP的相互作用，選擇性地抑制β-聯(lián)蛋白/p300的相互作用。某些化合物1的類似物對于β-聯(lián)蛋白/p300復(fù)合體是選擇性的。
蛋白-蛋白相互作用(如β-聯(lián)蛋白與p300之間的相互作用、和β-聯(lián)蛋白與CBP之間的相互作用)、以及試劑對蛋白-蛋白相互作用的影響，可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適方法表征和/或測量。這些方法可以包括使用親和力提純的重組β-聯(lián)蛋白、CBP和p300蛋白或其片段的體外結(jié)合化驗。在某些實施方式中，可以將一種蛋白組分首先固定在固體載體(如ELISA板)，以便于蛋白-蛋白相互作用的檢測和測量。蛋白-蛋白相互作用還可以使用體內(nèi)結(jié)合化驗表征，例如免疫沉淀法和蛋白質(zhì)印記分析，如實施例中所述。
另一方面，本發(fā)明提供促進(jìn)β-聯(lián)蛋白從核易位至胞液的方法，該方法包括向細(xì)胞中加入化合物，所述細(xì)胞包括核和胞液，所述的核含有β-聯(lián)蛋白，而且所述化合物導(dǎo)致β-聯(lián)蛋白從核易位至胞液。β-聯(lián)蛋白從核易位至胞液可以通過免疫熒光分析檢測，如實施例中所述。
另一方面，本發(fā)明提供選擇性地抑制WNT/β-聯(lián)蛋白途徑靶向基因的表達(dá)的方法，該方法包括向組合物中加入化合物，所述組合物含有WNT/β-聯(lián)蛋白途徑靶向的基因，所述化合物導(dǎo)致WNT/β-聯(lián)蛋白途徑靶向基因表達(dá)的變化。
如上文所述，本發(fā)明提供影響CBP啟動的基因表達(dá)的方法，并在優(yōu)選的實施方式中提供優(yōu)先于影響p300啟動的基因表達(dá)而影響CBP啟動的基因表達(dá)的方法。本發(fā)明還提供影響p300啟動的基因表達(dá)的方法，并在優(yōu)選的實施方式中提供優(yōu)先于影響CBP啟動的基因表達(dá)而影響p300啟動的基因表達(dá)的方法?？紤]到CBP與p300之間的結(jié)構(gòu)相似性，和許多本領(lǐng)域技術(shù)人員將CBP和p300視為生物功能基本相同這一事實，本發(fā)明尤其值得注意。該效力可以應(yīng)用于諸如存活蛋白表達(dá)的影響。
一方面，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白誘發(fā)的基因表達(dá)的方法，該方法包括使組合物與試劑接觸，這里的組合物包含β-聯(lián)蛋白、CBP和p300，β-聯(lián)蛋白具有結(jié)合CBP與p300的可能性，而且所述試劑以有效改變β-聯(lián)蛋白結(jié)合CBP與p300的可能性的量存在。在示范性方面，調(diào)節(jié)的形式可以是增加CBP與β-聯(lián)蛋白的結(jié)合，并任選地同時降低p300與β-聯(lián)蛋白的結(jié)合?；蛘撸{(diào)節(jié)的形式可以是增加p300與β-聯(lián)蛋白的結(jié)合，并任選地同時降低CBP與β-聯(lián)蛋白的結(jié)合。所述的組合物可以是細(xì)胞。
所關(guān)注的基因表達(dá)和試劑對這些基因表達(dá)的影響可以通過本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方法進(jìn)行。這些方法包括使用cDNA微點陣、具有擴(kuò)增所關(guān)注基因用的引物的RT-PCR、和測量所關(guān)注基因的啟動子驅(qū)動的報道基因活性和ChIP化驗。
另一方面，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)Wnt途徑活性的方法，其包括(a)使(i)含Wnt途徑組分的組合物與(ii)激活Wnt途徑的化合物相接觸，以提供激活的Wnt途徑；和(b)用完全或基本上干擾p300與β-聯(lián)蛋白之間結(jié)合，但是極少或者不干擾CBP與β-聯(lián)蛋白之間結(jié)合的化學(xué)試劑調(diào)節(jié)Wnt途徑的活性。
另一方面，本發(fā)明提供促進(jìn)細(xì)胞增殖的方法，其包括(a)在一定比例的群體增殖且一定比例的群體分化的條件下提供細(xì)胞群體；和(b)向群體中加入化學(xué)試劑，在此所述試劑導(dǎo)致增殖細(xì)胞的比例相對于分化細(xì)胞的比例增加。
細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化可以通過本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方法進(jìn)行表征。這些方法包括流式細(xì)胞分析和軟瓊脂化驗，如實施例中所述。
另一方面，本發(fā)明提供將干細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)下的方法，其包括使干細(xì)胞與抑制細(xì)胞分化或促進(jìn)細(xì)胞增殖的試劑相接觸，所述試劑的量對于將干細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)下是有效的。在某些實施方式中，所述試劑能夠降低β-聯(lián)蛋白與p300之間的相互作用，而不干擾β-聯(lián)蛋白與CBP之間的相互作用。
干細(xì)胞療法為治療多種變形疾病提供了可能，這些變形疾病是由特定細(xì)胞類型過早死亡或功能失常且機(jī)體不能將其替換或恢復(fù)所導(dǎo)致的。干細(xì)胞的可能治療用途包括器官移植患者的免疫調(diào)節(jié)、如肌肉營養(yǎng)不良、多發(fā)性硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎之類的自身免疫病的治療、如中風(fēng)、骨髓損傷和燒傷之類的受損組織的修復(fù)、如Lou Gehrig氏病之類的神經(jīng)變形疾病和如帕金森氏病、亨廷頓氏病、阿爾茨海默氏病之類的神經(jīng)系統(tǒng)病癥的治療、白血病、鐮形細(xì)胞貧血、心臟病和糖尿病的治療。對于大多數(shù)干細(xì)胞療法來說，可以在體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞或成熟干細(xì)胞，誘導(dǎo)其分化成期望的細(xì)胞類型并移值到患者體內(nèi)。對了干細(xì)胞的成功培養(yǎng)來說，干細(xì)胞需要保持未分化狀態(tài)。
為了將干細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)下，可以在不同的干細(xì)胞培養(yǎng)階段使用根據(jù)本發(fā)明的化合物，例如促進(jìn)細(xì)胞增殖或抑制細(xì)胞分化的化合物。例如，這種化合物可以在從其來源組織中分離干細(xì)胞時使用?；蛘?，可以在一定的培養(yǎng)期之后將其加入到培養(yǎng)基中。它還可以持續(xù)存在于培養(yǎng)基中，將干細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)下。通過將化合物的量調(diào)節(jié)到使干細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)，或者與不存在化合物時培養(yǎng)的干細(xì)胞相比干細(xì)胞的分化得以降低，并且細(xì)胞培養(yǎng)的其它方面(例如細(xì)胞生存率和細(xì)胞增值率)不受有害影響的水平，可以對化合物的濃度進(jìn)行優(yōu)化。
本發(fā)明的這些和其它方法可以用化學(xué)試劑實施，例如本文識別為化合物1的化學(xué)試劑以及它的類似物。
篩選化驗可以根據(jù)以下方法對結(jié)構(gòu)式(I)的化合物以及其它試劑進(jìn)行本文所述的活性的篩選。
例如，一方面，本發(fā)明提供鑒別β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯(lián)蛋白CBP小分子抑制劑與含CBP 1-111的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含β-聯(lián)蛋白的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制步驟(b)的含β-聯(lián)蛋白的部分與步驟(a)的含CBP 1-111的部分相結(jié)合；以及(d)當(dāng)確定步驟(a)的所述小分子抑制所述含CBP 1-111的部分與含β-聯(lián)蛋白的部分相結(jié)合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的抑制劑。任選地，該方法可以進(jìn)一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑與含(1)含p300 1-111的部分和(2)β-聯(lián)蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制所述含p3001-111的部分與β-聯(lián)蛋白相結(jié)合；以及(g)當(dāng)確定步驟(e)的所述小分子并不抑制所述含p300 1-111的部分與所述β-聯(lián)蛋白相結(jié)合時，確認(rèn)所述的小分子是β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的選擇性抑制劑。
另一方面，本發(fā)明提供鑒別β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯(lián)蛋白CBP小分子抑制劑與含β-聯(lián)蛋白的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含CBP 1-111的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制步驟(b)的含CBP 1-111的部分與步驟(a)的含β-聯(lián)蛋白的部分相結(jié)合；以及(d)當(dāng)確定步驟(a)的所述小分子抑制所述含β-聯(lián)蛋白的部分與含CBP 1-111的部分相結(jié)合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯(lián)蛋CBP相互作用的抑制劑。任選地，該方法可以進(jìn)一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑與含(1)含p300 1-111的部分和(2)β-聯(lián)蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制所述含p3001-111的部分與β-聯(lián)蛋白相結(jié)合；以及(g)當(dāng)確定步驟(e)的所述小分子并不抑制所述含p300 1-111的部分與所述β-聯(lián)蛋白相結(jié)合時，確認(rèn)所述的小分子是β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的選擇性抑制劑。
另一方面，本發(fā)明提供鑒別β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯(lián)蛋白CBP小分子抑制劑與含有(1)與CBP 1-111結(jié)合的β-聯(lián)蛋白的部分相接觸；(b)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否使CBP 1-111從β-聯(lián)蛋白上分離；以及(c)當(dāng)確定步驟(a)的所述小分子使β-聯(lián)蛋白與CBP 1-111的結(jié)合分離時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的抑制劑。任選地，該方法可以進(jìn)一步包括以下步驟(d)使步驟(c)鑒別的β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含p3001-111的部分和(2)β-聯(lián)蛋白的混合物相接觸；(e)通過化驗手段確定步驟(d)的所述分子是否并不抑制所述含p300 1-111的部分與β-聯(lián)蛋白相結(jié)合；以及(f)當(dāng)確定步驟(e)的所述小分子并不抑制所述含p300 1-111的部分與所述β-聯(lián)蛋白相結(jié)合時，確認(rèn)所述的小分子是β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的選擇性抑制劑。
一方面，本發(fā)明提供鑒別β-聯(lián)蛋白p300相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯(lián)蛋白p300小分子抑制劑與含p300 1-111的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含β-聯(lián)蛋白的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制步驟(b)的含β-聯(lián)蛋白的部分與步驟(a)的含p300 1-111的部分相結(jié)合；以及(d)當(dāng)確定步驟(a)的所述小分子抑制所述的含p300 1-111的部分與含β-聯(lián)蛋白的部分相結(jié)合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的抑制劑。任選地，該方法可以進(jìn)一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯(lián)蛋白p300相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-聯(lián)蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制所述含CBP1-111的部分與β-聯(lián)蛋白相結(jié)合；以及(g)當(dāng)確定步驟(e)的所述小分子并不抑制所述含CBP 1-111的部分與所述β-聯(lián)蛋白相結(jié)合時，確認(rèn)所述的小分子是β-聯(lián)蛋白p300相互作用的選擇性抑制劑。
另一方面，本發(fā)明提供鑒別β-聯(lián)蛋白p300相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯(lián)蛋白p300小分子抑制劑與含β-聯(lián)蛋白的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含p300 1-111的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制步驟(b)的含p300 1-111的部分與步驟(a)的含β-聯(lián)蛋白的部分相結(jié)合；以及(d)當(dāng)確定步驟(a)的所述小分子抑制所述的含β-聯(lián)蛋白的部分與含p300 1-111的部分相結(jié)合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯(lián)蛋白p300相互作用的抑制劑。任選地，該方法可以進(jìn)一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯(lián)蛋白p300相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-聯(lián)蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制所述含CBP 1-111的部分與β-聯(lián)蛋白相結(jié)合；以及(g)當(dāng)確定步驟(e)的所述小分子并不抑制所述含CBP 1-111的部分與所述β-聯(lián)蛋白相結(jié)合時，確認(rèn)所述的小分子是β-聯(lián)蛋白p300相互作用的選擇性抑制劑。
另一方面，本發(fā)明提供鑒別β-聯(lián)蛋白p300相互作用的小分子抑制劑的方法，其包括如下步驟(a)使假定的β-聯(lián)蛋白p300小分子抑制劑與含有(1)與p300 1-111相結(jié)合的β-聯(lián)蛋白的部分相接觸；(b)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否使p300 1-111從β-聯(lián)蛋白上分離；以及(c)當(dāng)確定步驟(a)的所述小分子使β-聯(lián)蛋白與p300 1-111的結(jié)合分離時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯(lián)蛋白p300相互作用的抑制劑。任選地，該方法可以進(jìn)一步包括以下步驟(d)使步驟(c)鑒別的β-聯(lián)蛋白p300相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-聯(lián)蛋白的混合物相接觸；(e)通過化驗手段確定步驟(d)的所述分子是否并不抑制所述含CBP 1-111的部分與β-聯(lián)蛋白相結(jié)合；以及(f)當(dāng)確定步驟(d)的所述小分子并不抑制所述含CBP 1-111的部分與所述β-聯(lián)蛋白相結(jié)合時，確認(rèn)所述的小分子是β-聯(lián)蛋白p300相互作用的選擇性抑制劑。
蛋白-蛋白相互作用(如β-聯(lián)蛋白與p300之間的相互作用、和β-聯(lián)蛋白與CBP之間的相互作用)、以及試劑對蛋白-蛋白相互作用的影響，可以通過本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方法表征和/或測量。例如，用于本發(fā)明的方法的適當(dāng)化驗手段為等溫滴定量熱法(ITC)。ITC實驗可以使用MicroCal MCS等溫滴定量熱儀(MicroCal，Northampton MA)基本上按照制造商所建議進(jìn)行。簡言之，將CBP C1片段針對含50mMPIPES(pH7.5)和0.1mM EDTA的透析緩沖液進(jìn)行廣泛透析。向蛋白樣品中加入DMSO至0.05％的最終濃度，以對應(yīng)于稀釋的藥物樣品。使用Bradford蛋白化驗(Bio-Rad laboratories，Hercules CA)測定蛋白濃度，其使用牛血漿γ球蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物(Bio-Rad)。由于溶解性的限制，通過將5-15ul CBP C1[223uM]注入到充有23.3uM假定的小分子抑制劑的樣品細(xì)胞中進(jìn)行ITC實驗。假定的小分子抑制劑在樣品細(xì)胞中飽和之后評估稀釋熱，并且使用Origin 5.0軟件包(MicroCal)計算熱力學(xué)參數(shù)。稀釋熱越高表明假定的小分子抑制劑與CBP片段之間的結(jié)合越強(qiáng)。假定的小分子抑制劑與CBP片段之間的較強(qiáng)結(jié)合鑒別出可以更有效地破壞CBP結(jié)合，例如CBP與β-聯(lián)蛋白結(jié)合的小分子。
藥物組合物和給藥可以將根據(jù)本發(fā)明的核酸分子、肽和化合物加入到適于給藥的藥物組合物中。這種組合物典型地含核酸分子、肽或化合物和藥學(xué)可接受的載體?！八帉W(xué)可接受的載體”是指與藥物給藥相容的溶劑、分散介質(zhì)、覆層、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。藥物活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域公知的。也可以將輔助活性化合物加入到組合物中。
可以將本發(fā)明的藥物組合物腸胃外、局部、口服或定位給藥以進(jìn)行治療處理?？梢允褂枚喾N水相載體，例如水、緩沖水、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸和類似物，也可以包括其它提高穩(wěn)定性的蛋白，例如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。生成的組合物可以通過傳統(tǒng)的公知滅菌技術(shù)進(jìn)行滅菌。可以將溶液包裝備用，或者在無菌條件下過濾并凍干，給藥之前將凍干的制劑與無菌溶液混合。
口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載體?？梢詫⑺鼈儼庠诿髂z膠囊中，或者壓入到藥片中。為了口服治療給藥，可以將活性化合物與賦形劑結(jié)合，并以片劑、錠劑或膠囊的形式使用。組合物可以包括藥物相容的粘合劑和/或佐劑材料作為其一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑和類似物可以含有任意的下列成分或性質(zhì)相似的化合物粘合劑(如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠)；賦形劑(如淀粉或乳糖)、分裂劑(如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉)；潤滑劑(如硬脂酸鎂或Sterotes)；助流劑(如膠狀二氧化硅)；甜味劑(如蔗糖或糖精)；或調(diào)味劑(如薄荷、水楊酸甲酯或橙味調(diào)味劑)。
對于吸入式給藥，可以將化合物從加壓容器或分配器中以氣溶膠噴霧的形式輸送，該加壓容器或分配器含有適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑，例如二氧化碳之類的氣體，或者噴霧器。
可以通過經(jīng)粘膜或經(jīng)皮方式進(jìn)行系統(tǒng)給藥。對于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮給藥，制劑中使用適于待滲透載體的滲透劑。這些滲透劑通常是本領(lǐng)域已知的，例如，對于經(jīng)粘膜給藥，其包括去污劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。經(jīng)粘膜給藥可以通過使用鼻用噴霧或栓劑完成。對于經(jīng)皮給藥，如本領(lǐng)域通常己知，可以將活性化合物配制到油膏、軟膏、凝膠或乳劑中。
在一個實施方式中，活性化合物與保護(hù)化合物在機(jī)體內(nèi)不被迅速排泄的載體一起制備，例如可控釋放制劑，其包括植入物和微膠囊輸送系統(tǒng)?？梢允褂每缮锝到獠⑶疑锵嗳莸木酆衔?，例如乙烯乙酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。這些制劑的制備方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。材料也可以購自Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.。
尤其有利的是以便于給藥的劑量單位形式配制劑量均勻的口服或腸胃外組合瓦。本文所用的劑量單位形式是指物理上分散的、適合作為待治療受試者單一劑量的單位；每單位含有預(yù)定量的活性化合物，該預(yù)定的量計算成與需要的藥物載體結(jié)合產(chǎn)生期望的治療效果。對本發(fā)明的劑量單位形式的具體要求直接依賴于以下幾個方面并由其指示活性化合物的獨特性質(zhì)和待實現(xiàn)的具體治療效果，以及配制這種個體治療用活性化合物的技術(shù)本身的限制。
這些化合物的毒性和治療效力可以通過細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏械臉?biāo)準(zhǔn)藥物方法測定，例如測定LD50(50％的群體致死的劑量)和ED50(50％的群體治療有效的劑量)。毒性與治療效果之間的劑量比即為治療指數(shù)，其可以表達(dá)為比值LD50/ED50。表現(xiàn)出大的治療指數(shù)的化合物是優(yōu)選的。盡管可以使用表現(xiàn)出有毒副作用的化合物，應(yīng)當(dāng)小心地設(shè)計將這種化合物靶向受侵襲組織處的輸送系統(tǒng)，以便將對未受染細(xì)胞的潛在損害降至最低，從而減輕副作用。
細(xì)胞培養(yǎng)物化驗和動物研究中得到的數(shù)據(jù)可以用于配制用于人的劑量范圍。這種化合物的劑量優(yōu)選地處于包括ED50而毒性很小或無毒的循環(huán)濃度范圍以內(nèi)。劑量可以取決于所采用的劑量形式和所利用的給藥途徑在該范圍內(nèi)變化。對于任何用于本發(fā)明方法的化合物來說，治療有效劑量可以最初從細(xì)胞培養(yǎng)物化驗來評估。可以在動物模型中配制劑量以達(dá)到包括細(xì)胞培養(yǎng)物中測定的IC50(即實現(xiàn)半數(shù)癥狀最大抑制的測試化合物的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。這種信息可以用于更精確地測定可用于人的劑量。血漿中的水平可以通過例如高效液相色譜測量。
以下實施例用來對本發(fā)明進(jìn)行說明，其不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限定。
制備實施例制備實施例1(N-Fmoc-N’-R3-肼基)-乙酸的制備(1)N-Fmoc-N’-甲基肼的制備 為2L的雙頸圓底燒瓶配上玻璃塞和鈣管。加入硫酸甲基肼(20g，139mmol，其中R3是甲基)的THF(300mL)溶液，并且加入DiBoc(33g，153mmol)的THF溶液。經(jīng)2小時，用加料漏斗滴加入飽和碳酸氫鈉水溶液(500mL)，同時劇烈攪拌。6小時后，緩慢加入Fmoc-C1(39g，153mmol)的THF溶液。所得到的懸浮液在0℃下攪拌6小時。用乙酸乙酯(EA，500mL)萃取該混合物，并且保留有機(jī)層。用硫酸鈉干燥該溶液并且真空蒸發(fā)。無需純化進(jìn)行下一步。
為1L的雙頸圓底燒瓶配上玻璃塞和鈣管。加入由前步得到的產(chǎn)物在MeOH(300mL)中的溶液，并且用加料漏斗緩慢加入濃鹽酸(30mL，12N)，同時在冰水浴中用磁力進(jìn)行攪拌，并且攪拌過夜。用EA(1000mL)萃取該混合物并且保留有機(jī)層。用硫酸鈉干燥該溶液并且真空蒸發(fā)。通過用正己烷和EA重結(jié)晶來對殘余物進(jìn)行純化，從而得到N-Fmoc-N’-甲基肼(32.2g，83％)。1HNMR(DMSO-D6)δ7.90～7.88(d，J＝6Hz，2H)，δ7.73～7.70(d，J＝9Hz，2H)，7.44～7.31(m，4H)，4.52～4.50(d，J＝6Hz，2H)，4.31～4.26(t，J＝6Hz，1H)，2.69(s，1H)。
(2)(N-Fmoc-N’-甲基-肼基)-乙酸叔丁基酯的制備
為1L的雙頸圓底燒瓶配上玻璃塞和連接到鈣管的回流冷凝器。加入N-Fmoc-N’-甲基肼(20g，75mmol)的甲苯(300mL)溶液。緩慢加入溴乙酸叔丁酯(t-butylbromo acetate，22g，111mmol)的甲苯(50mL)溶液。緩慢加入Cs2CO3(49g，149mmol)。緩慢加入NaI(11g，74mmol)同時劇烈攪拌。在回流溫度下將反應(yīng)混合物攪拌1天。過濾產(chǎn)品混合物并且用EA(500mL)萃取。用硫酸鈉干燥該溶液并且真空蒸發(fā)。用己烷∶EA＝2∶1的溶液通過色譜對產(chǎn)品進(jìn)行純化以得到(N-Fmoc-N’-甲基-肼基)-乙酸叔丁酯(19.8g，70％)。
1H-NMR(CDCl3-d)δ7.78～7.75(d，J＝9Hz，2H)，δ7.61～7.59(d，J＝6Hz，2H)，7.43～7.26(m，4H)，4.42～4.40(d，J＝6Hz，2H)，4.23(b，1H)，3.57(s，2H)，2.78(s，3H)，1.50(s，9H)。
(3)(N-Fmoc-N’-甲基-肼基)-乙酸的制備 為1L的雙頸圓底燒瓶配上玻璃塞和連接到鈣管的回流冷凝管。加入(N-Fmoc-N’-甲基-肼基)-乙酸叔丁酯(20g，52mmol)。緩慢加入鹽酸溶液(150mL，在二氧己環(huán)中的4M溶液)，同時在冰水浴中劇烈攪拌。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1天。在減壓下于40℃下將該溶液完全濃縮。加入飽和NaHCO3水溶液(100mL)，并且用乙醚(100mL)洗滌水層。在0℃下緩慢滴加濃鹽酸(pH2-3)。萃取該混合物并且保留有機(jī)層(500mL，MC)。用硫酸鈉干燥該溶液并且真空蒸發(fā)。用正己烷和乙酸乙酯通過重結(jié)晶對殘余物進(jìn)行純化，從而得到(N-Fmoc-N’-甲基-肼基)乙酸(12g，72％)。1H-NMR(DMSO-d6)δ12.38(s，1H)，8.56(b，1H)，7.89～7.86(d，J＝9Hz，2H)，7.70～7.67(d，J＝9Hz，2H)，7.43～7.29(m，4H)，4.29～4.27(d，J＝6Hz，2H)，4.25～4.20(t，J＝6Hz，1H)，3.47(s，2H)，2.56(s，3H)。
制備實施例2(N-Moc-N’-R7-肼基)-乙酸的制備(1)(N’-甲氧基羰基-肼基)乙酸乙基酯的制備
將MOC-NH-NH2(50g，0.55mol)溶解在DMF(300ml)中，然后向反應(yīng)容器中加入溴乙酸乙酯(68ml，0.555mol)和碳酸鉀(77g，0.555mol)。將該混合物加熱到50℃并保持5小時。反應(yīng)完成后，將該混合物過濾，并且用EtOAc稀釋，然后用鹽水洗滌(3次)。粗產(chǎn)品用柱純化(洗脫液Hex/EtOAc＝4/1)，從而得到72克無色的油。
(2)[N-R7-N’-甲氧基羰基-肼基]-乙酸乙基酯 將乙基酯(10g，0.05mol)、碳酸鉀(6.9g，0.05mol)和R7-溴(14.1g，0.06mol)溶解在DMF(200ml)中，并且將該混合物加熱到50℃并保持5小時。反應(yīng)完成后，將該混合物過濾，并且用EA稀釋，然后用鹽水洗滌(3次)。用色譜純化粗產(chǎn)品(洗脫液Hex/EtOAc＝4/1)。
(3)[N-R7-N’-甲氧基羰基-肼基]-乙酸 將烷基化的乙基酯(9.5g，0.03mol)溶解在THF/水(1/1，ml)中，并且在0℃下加入2N的NaOH(28.3ml)溶液。在室溫將該混合物攪拌2小時。當(dāng)在紫外下檢測不到起始的酯時，用EA稀釋該溶液，然后分離。用1N的鹽酸將水層酸化到pH3～4，并且用DCM萃取化合物(3次)。合并的有機(jī)層經(jīng)MgSO4干燥后進(jìn)行蒸發(fā)，得到黃色固體。
制備實施例3
(1)Nβ-Moc-Nα-芐基-肼基甘氨酸的制備 該化合物是根據(jù)文獻(xiàn)的程序而制備的。(Cheguillaume等，Synlett2000，3，331)。
(2)1-甲氧基羰基-2，8-二芐基-6-甲基-4，7-二氧-六氫-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪的制備將溴乙縮醛樹脂(60mg，0.98mmol/g)和芐胺的DMSO溶液(2.5ml，2M)放置在配有螺帽的管形瓶中。在60℃下使用轉(zhuǎn)爐[RobbinsScientific]將該反應(yīng)混合物振蕩12小時。過濾收集樹脂，并且用DMF，然后用DCM清洗該樹脂，從而得到第一組分片段。
將Fmoc-丙氨酸(4當(dāng)量，市售，第二組分片段)，HATU(PerSeptiveBiosystems，4當(dāng)量)和DIEA(4當(dāng)量)的NMP(Advanced ChemTech)溶液加入到樹脂中。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩4小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶。在室溫下將該反應(yīng)混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
將Nβ-Moc-Nα芐基-肼基甘氨酸(4當(dāng)量，制備實施例2中的化合物(3)，其中R7是芐基，第三組分片段)、HOBT[Advanved ChemTech](4當(dāng)量)和DIC(4當(dāng)量)的DMF溶液加入到以上制備的樹脂中。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩3小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用MeOH清洗該樹脂。在室溫下真空干燥該樹脂。
在室溫下用甲酸(2.5ml)將該樹脂處理18小時。過濾除去樹脂后，在減壓下濃縮濾液，從而得到作為油的產(chǎn)品。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；1.51(d，3H)，2.99(m，1H)，3.39(d，1H)，3.69(m，1H)，3.75(m，1H)，3.82(s，3H)，4.02(d，1H)，4.24(d，1H)，4.39(d，1H)，4.75(d，1H)，5.14(q，1H)，5.58(dd，1H)，7.10-7.38(m，10H)。
制備實施例4 實施例2R2＝-Bn，R4＝-CH3實施例3R2＝-CH3，R4＝-CH3(1)N’-Fmoc-N-甲基-肼基碳酰氯的制備 迅速地攪拌在15ml的CH2Cl2中的N-甲基肼羧酸9H-芴-9-基甲基酯(107mg，0.4mmol)和15ml的飽和NaHCO3水溶液的冰冷卻的兩相混合物，同時加入在甲苯中的1.93M光氣(1.03ml，2mmol)作為單獨的部分。將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘，收集有機(jī)相，并且用CH2Cl2萃取水相。合并的有機(jī)相經(jīng)MgSO4干燥后，過濾，真空濃縮以得到作為泡沫狀固體的128mg(97％)氨基甲酰氯。[警告光氣蒸汽劇毒。
在通風(fēng)櫥中使用]。該產(chǎn)品無需進(jìn)一步純化即用于以下的固相合成。
(2)2，5-二甲基-7-芐基-3，6-二氧-六氫-[1，2，4]三嗪并[4，5-a]吡嗪-1-羧酸芐酰胺的制備將溴乙縮醛樹脂(30mg，0.98mmol/g)和芐胺的DMSO溶液(1.5ml，2M)放置在帶有螺帽的管形瓶中。在60℃下使用轉(zhuǎn)爐[RobbinsScientific]將反應(yīng)混合物振蕩12小時。過濾收集樹脂，并且用DMF，然后用DCM清洗該樹脂，以得到第一組分片段。
將Fmoc-丙氨酸(3當(dāng)量，第二組分片段，市售)、HATU(PerSeptiveBiosystems，3當(dāng)量)和DIEA(3當(dāng)量)的NMP(Advanced ChemTech)溶液加入到樹脂中。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩4小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂，從而將第二組分片段加入到第一組分片段上。
向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
將上述步驟(1)中所獲的N’-Fmoc-N-甲基-肼基碳酰氯(結(jié)合的第三和第四組分片段，5當(dāng)量)、DIEA(5當(dāng)量)的DCM溶液加入到上述制備的樹脂中。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩4小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶(1g樹脂加入10ml)。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
在室溫下用異氰酸芐酯(4當(dāng)量)和DIEA(4當(dāng)量)在DCM中的混合物對該樹脂進(jìn)行4小時的處理。然后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用MeOH清洗該樹脂。在室溫下真空干燥該樹脂。
在室溫下用甲酸將該樹脂處理14小時。過濾除去樹脂后，在減壓下濃縮濾液，從而得到作為油的產(chǎn)品。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；1.48(d，3H)，2.98(s，3H)，3.18(m，1H)，3.46(m，1H)，4.37-4.74(m，5H)，5.66(dd，1H)，6.18(m，1H)，7.10-7.40(m，10H)。
制備實施例52，5，7-三甲基-3，6-二氧-六氫-[1，2，4]三嗪并[4，5-a]吡嗪-1-羧酸芐酰胺的制備根據(jù)制備實施例4所述的相同程序制備題述化合物，但是使溴乙縮醛樹脂與甲基胺溶液進(jìn)行反應(yīng)而非芐胺。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；1.48(d，3H)，2.99(s，3H)，3.03(s，3H)，3.38(m，1H)，3.53(dd，1H)，4.36(dd，1H)，4.52(q，1H)，4.59(dd，1H)，5.72(dd，1H)，6.19(br.t，1H)，7.10-7.38(m，5H)。
制備實施例62-甲基-5-(對羥基苯甲基)-7-萘甲基-3，6-二氧-六氫-[1，2，4]三嗪并[4，5-a]吡嗪-1-羧酸芐酰胺的制備將溴乙縮醛樹脂(30mg，0.98mmol/g)和萘甲胺的DMSO溶液(1.5ml，2M)放置在帶有螺帽的管形瓶中。使用轉(zhuǎn)爐[RobbinsScientific]將反應(yīng)混合物在60℃下振蕩12小時。過濾收集樹脂，并且用DMF、然后用DCM清洗該樹脂，從而得到第一組分片段。
向該樹脂中加入Fmoc-Tyr(OBut)-OH(3當(dāng)量)、HATU(PerSeptiveBiosystems，3當(dāng)量)和DIEA(3當(dāng)量)的NMP(Advanced ChemTech)溶液。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩4小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂，從而將第二組分片段加入到第一組分片段上。
向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
向以上制備的樹脂中加入N’-Fmoc-N-肼基碳酰氯(5當(dāng)量)、DIEA(5當(dāng)量)的DCM溶液。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩4小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM、和DMF清洗該樹脂。
向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶(1g樹脂中加入10ml)。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
在室溫下用異氰酸芐酯(4當(dāng)量)和DIEA(4當(dāng)量)在DCM中的混合物將該樹脂處理4小時。然后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用MeOH清洗該樹脂。在室溫下真空干燥該樹脂。
在室溫下用甲酸將該樹脂處理14小時。過濾除去樹脂后，在減壓下濃縮濾液，從而得到作為油的產(chǎn)品。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；2.80-2.98(m，5H)，3.21-3.37(m，2H)，4.22-4.52(m，2H)，4.59(t，1H)，4.71(d，1H)，5.02(dd，1H)，5.35(d，1H)，5.51(d，1H)，6.66(t，2H)，6.94(dd，2H)，7.21-8.21(m，12H)。
制備實施例72-甲基-6-(對羥基苯甲基)-8-萘基-4，7-二氧-六氫-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1-羧酸芐酰胺的制備將溴乙縮醛樹脂(60mg，0.98mmol/g)和萘胺的DMSO溶液(2.5ml，2M)放置在帶有螺帽的管形瓶中。使用轉(zhuǎn)爐[Robbins Scientific]將反應(yīng)混合物在60℃下振蕩12小時。過濾收集樹脂，并且用DMF，然后用DCM清洗該樹脂。
將Fmoc-Tyr(OBut)-OH(4當(dāng)量)、HATU[PerSeptive Biosystems](4當(dāng)量)和DIEA(4當(dāng)量)的NMP(Advanced ChemTech)溶液加入到該樹脂中。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩4小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
將Nβ-Fmoc-Nα-芐基-肼基甘氨酸(4當(dāng)量)、HOBT[AdvancedChemTech](4當(dāng)量)和DIC(4當(dāng)量)的DMF溶液加入到以上制備的樹脂中。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩3小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF，然后用DCM清洗該樹脂。向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶(1g樹脂中10ml)。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
在室溫下用異氰酸芐酯(4當(dāng)量)和DIEA(4當(dāng)量)在DCM中的混合物將該樹脂處理4小時。然后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用MeOH清洗該樹脂。在室溫下真空干燥該樹脂后，在室溫下用甲酸(2.5ml)將該樹脂處理18小時。過濾除去樹脂后，在減壓下濃縮濾液，從而得到作為油的產(chǎn)品。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；2.73(s，3H)，3.13(d，1H)，3.21-3.38(m，3H)，3.55(d，1H)，3.75(t，1H)，4.22(dd，1H)，4.36(dd，1H)，4.79(d，1H)，5.22(t，1H)，5.47(m，2H)，6.68(d，2H)，6.99(d，2H)，7.21-8.21(m，12H)；MS(m/z，ESI)564.1(MH+)586.3(MNa+)。
實施例質(zhì)粒CBP和p300的缺失構(gòu)造在市售的pTriEx-3載體(Novagen，Madison，WI)中表達(dá)。鼠CBP的缺失系列通過PCR從Vollum Institute，Portland，OR的Dr.Richard Goodman慷慨贈送的全長小鼠CBP質(zhì)粒產(chǎn)生。擴(kuò)增的區(qū)域在5’-端具有BamH I部位，在3’-端具有Not I部位，使人們可以用表達(dá)載體pTriEx-3的ATG進(jìn)行框內(nèi)克隆。為了進(jìn)行識別和提純，也可以對質(zhì)粒在COOH-端用6X-組氨酸和單純皰疹病毒(HSV)標(biāo)記物進(jìn)行框內(nèi)克隆。用于克隆CBP C-端切除構(gòu)造的正向引物為5′-GATATCTGAGCTCGTGGATCCGATGGCCGAGAACTTGCTG-3′(SEQ IDNO7)。用于CBP-C1(1-334)、-C2(1-634)、-C3(1-1594)、-C4(1-2062)、-C5(1-2623)、-C6(1-3094)、-C7(1-3694)的反向引物為C15′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCC-GCGTTTGTACTGTTCGGCTG-3′(SEQ IDNO8)，C25′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGCTCC-ATTCATGACTTGAGC-3′(SEQ ID NO9)，C35′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGCGCGTTTTT-CAGGGTCTGC-3′(SEQ ID NO10)，C45′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGC AGCTGGTAAAGC-TGGCTG-3′(SEQ IDNO11)，C55′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGCATGTTGGAGAGAGGGC-AT-3′(SEQ ID NO12)，C65′-CGTGTATA CAGCTGTGCGGCCGCAGAACCTTGTAAATCCTC-3′(SEQ ID NO13)，C75′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGCGCTGTAGTAGGCTGCATC-3′(SEQ IDNO14)。CBP的N-端切除構(gòu)造用以下反向引物生成5′-GTATACAGCTGTGCGGCCGCCAAACCCTCCACAAACTTTTC-3′(SEQ ID NO15)。CBP-C8(4081-7324)、-C9(4534-7324)、-C10(5074-7324)、-C11(5674-7324)、C12(6282-7324)、-C13(6754-7324)的正向引物為C85′-GATATCTGAGCTCG-TGGATCCGGAAGCTGGGGAGGTTTTT-3′(SEQ ID NO16)，C95′-GATATCTGAGCTCGTGGAT-CCGAAGAAGATGCTGGACAAG-3′(SEQ ID NO17)，C105′-GATATCTGAGCTCGTGGATCCGTCC AAATGGTCCACTCTG-3′(SEQ ID NO18)，C115′-GATATCTGAGCTCGTGGAT CCGTCTCCTACCTCAGCACCA-3′(SEQ ID NO19)，C125′-GATATCTGAGCTC GTGGATCCGAACATCCTTAA-ATCAAAC-3′(SEQ ID NO20)，C135′-GATATCTGAGCCGTGGATCCGCAGCAGCAACGCATG-CAA-3′(SEQ ID NO21)。使用C-端切除構(gòu)造的正向引物和N-端切除構(gòu)造的反向引物，將全長小鼠CBP擴(kuò)增并克隆到pTriEx-3載體中。通過使用以下經(jīng)PAGE提純的正向引物，由全長CBP的PCR生成CBP(Δ1-111+NLS)，所述引物在CBP的NLS序列(劃線部分)上游含有BamH I部位5′-ATCTGAGCTCGTGGATCCGGGACCGCCCAACCCCAAACGAGCCAAACTCCAGCCGAACAGTACAAACATGGCCAGCTTA-3′(SEQ ID NO22)，其使用的反向引物是上文所述用于生成CBP N-端切除構(gòu)造的引物。將插入片段克隆到pTriEx-3質(zhì)粒的BamH I-Not I部位中。
p300的缺失構(gòu)造通過PCR從Dr.David Livingston(Harvad，MA)慷慨贈送的人p300質(zhì)粒(CMVβ-p300-CHA)生成。將PCR產(chǎn)物克隆到pTriEx-3載體的Hind III-Not I部位中。C-端切除的p300構(gòu)造的正向引物為5′-GACGGTACCGGTTCGAAGCTTA-TGGCCGAGAATGTGGT-G-3′(SEQ ID NO23)。p300-P1(1-334)、p300-P2(1-634)和p300-P3(1-1054)的反向引物如下P15′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGC-CAAACCTAATC CAGGACT-3′(SEQ ID NO24)，P2CGTG-TATACAGCTGTGCGGCCGCGTTGCCAGCACTTCCCAT-3′(SEQ IDNO25)，P3CGTGTATACA-GCTGTGCGGCCG CGGCCTGTTCCCGGCGCTG-3′(SEQ ID NO26)。
通過將4個串聯(lián)的TCF4結(jié)合部位(CCAACCTTTGATCTTACCCCCTTTGATCTTACCCCCTTTGATCAG-GAATTCGGTTGGAAACTAGAATGGGGGAAACTAGAATGGGGGAAACTAGTCCTTAAG)(SEQID NO27)插入到pGL3質(zhì)粒(Promega)的SV40啟動子上游的XhoI-Kpn I部位中，生成β-聯(lián)蛋白/TCF報道基因質(zhì)粒，該SV40啟動子驅(qū)動下游熒光素酶基因的表達(dá)。
所有引物均購自Integrated DNA Technologies，Inc.(Coralville，IA)?？寺∮玫南拗菩詢?nèi)切酶加了下劃線，其購自New England Biolabs，Beverly，MA。
細(xì)胞培養(yǎng)于37℃下，將人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480和HCT116以及正常結(jié)腸細(xì)胞CCD18Co(ATCC，Manassas，VA)在5％CO2的氣氛中補充有10％胎牛血清的DMEM(Invitrogen Gibco-BRL，Baltimore，MD)中生長。
轉(zhuǎn)染將指數(shù)生長的SW480和HCT116細(xì)胞(105)在24孔平板或100-mm的圓盤中培養(yǎng)，并分別用0.5μgβ-聯(lián)蛋白/TCF報道基因和濃度漸增的效應(yīng)物質(zhì)?；?0μg表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞按照說明用FuGENE6(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)或Superfect(Qiagen，Valencia，CA)轉(zhuǎn)染。根據(jù)NE-PER試劑盒(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)所述的方法制得核抽提物。
熒光素酶化驗使用雙熒光素酶化驗系統(tǒng)(Promega)按照說明在轉(zhuǎn)染過后16-24小時在20μl細(xì)胞溶解產(chǎn)物上進(jìn)行各組的熒光素酶化驗。使用濃度漸增的空白表達(dá)載體pTriEx-3進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
軟瓊脂化驗通過對之前所述方法(Moody等人，“A vasoactive intestinal peptideantagonist inhibits non-small cell lung cancer growth，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA.904345-49(1993))進(jìn)行修改，對SW480細(xì)胞進(jìn)行軟瓊脂集落形成化驗。
向6孔平板(Nalge Nunc International，Roskide，Denmark)的每個孔(35mm)上覆蓋1ml含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中的0.8％底層瓊脂。固化之后，向每孔中加入1ml含0.4％頂層瓊脂、10％胎牛血清、雙倍濃度化合物的DMEM培養(yǎng)基和5,000個存活細(xì)胞。將培養(yǎng)物于37℃下在5％CO2增濕培養(yǎng)箱中培育。每天檢測軟瓊脂上的集落，培育8天后進(jìn)行拍照。對直徑＞60μm的集落進(jìn)行計數(shù)。
免疫沉淀將細(xì)胞用含20mM Hepes pH7.9、100mM NaCl、0.5mM EDTA、0.5％Nonidet P-40、6mM MgCl2、5mM 2-巰基乙醇和1片CompleteTM蛋白酶抑制劑混合物(Roche Molecular Biochemicals)的溶胞緩沖液在冰上溶解30分鐘，并通過離心澄清。將全細(xì)胞溶解產(chǎn)物在室溫下與特定的抗體一起培育，對于CBP-C1，使用獲自Santa Cruz Biotechnology，Inc.的A-22抗體；對于p300-P1，使用N-15抗體(Santa CruzBiothchnology，Inc.Santa Cruz，CA)；對于全長內(nèi)源β-聯(lián)蛋白，使用預(yù)先結(jié)合在蛋白A-瓊脂糖小珠(Pierce，Rockford，IL)上的單克隆抗體(Transduction Laboratories，Lexington，KY)。將免疫復(fù)合體在HB S(100-150mM NaCl，如所指出，10mM Hepes pH7.9、5mM 2-巰基乙醇和1片CompleteTM蛋白酶抑制劑混合物)中洗滌數(shù)次，然后進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡，見下文。然后用含(20mM Hepes pH7.9、500mM NaCl、和5mM含1片CompleteTM蛋白酶抑制劑混合物的2-巰基乙醇)的緩沖液將小珠洗滌7次。
Pull-down化驗在室溫下，將25-100μM生物素化的化合物2在含50％DMSO和50％蛋白結(jié)合緩沖液PBB(20mM Hepes pH7.9、20％甘油、0.5mMEDTA、60mM NaCl、6mM MgCl2、0.1％Nonidet P-40、5mM 2-巰基乙醇、和1片CompleteTM蛋白酶抑制劑混合物)的緩沖液中與100μl50％的鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖小珠漿(Amersham Pharmacia Biotech，Arlington Heights，IL)結(jié)合過夜。將小珠用PBB洗滌3次，除去未結(jié)合的化合物2。將100-200μl含過量表達(dá)的質(zhì)粒的全細(xì)胞溶解產(chǎn)物(見免疫沉淀部分)與小珠一起在室溫下培養(yǎng)3-4小時，或者在4℃下培養(yǎng)過夜。然后將小珠在PBB緩沖液中洗滌3次，然后對洗脫的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)免疫印跡，見下文。在競爭化驗中，如每次實驗中所指出，將過量的化合物1與溶解產(chǎn)物在室溫下預(yù)培養(yǎng)1小時。
ChIP化驗SW480細(xì)胞的甲醛交聯(lián)和染色質(zhì)免疫沉淀化驗如之前所述進(jìn)行(Barley等人，“Acetylation of p53 activates transcription throughrecruitment of coactivators/histone acetyltransferases”，Mol.Cell 81243-54(2001)；E1-Osta等人，“Analysis of chromatin-immunopurifiedMeCP2-associated fragments”，Biochem.Biophys.Res.Commun.289733-37(2001)；Shang等人，“Formation of the androgen receptortranscription Complex”，Mol.Cell 9601-10(2002))。用于c-myc和細(xì)胞周期蛋白D1啟動子PCR的引物如下c-myc正向引物5′-TGGTAGGCGCGCGTAGTTA-3′(SEQ ID NO28)和反向引物5′-GGGCGGAGATTAGCGAGAG-3′(SEQ ID NO29)。細(xì)胞周期蛋白D1正向引物5′-TGCTTAACAACA-GTAACGT-3′(SEQ ID NO30)和反向引物5′-GGGGCTCTTCCTGGGCAGC-3′(SEQ ID NO31)。這些ChIP引物在靠近轉(zhuǎn)錄起始部位的啟動子區(qū)內(nèi)，設(shè)計成TCF4結(jié)合結(jié)構(gòu)域下游的大約20至30個堿基對。PCR產(chǎn)物的大小為大約200個堿基對?？笴BP抗體，AC-26，由Dr.David Livingston慷慨贈送。
蛋白質(zhì)印跡化驗將上述免疫復(fù)合體在SDS-PAGE上分離，之后將其轉(zhuǎn)移到immobilon-P膜(PVDF)(獲自Millipore，Bedford，MA)。將膜用TBST(15mM Tris/HCl，pH7.4、0.9％NaCl和0.05％吐溫20)中5％的脫脂奶粉阻斷，之后用特定抗體進(jìn)行印跡。使用獲自Qiagen Inc.的抗His抗體進(jìn)行pTriEx-3中制成的蛋白的檢測。使用綴合在辣根過氧化物(Santa Cruz Biotechnology Inc.)上的第二抗體進(jìn)行檢測。使用ECL檢測試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)對免疫印跡進(jìn)行分析。
免疫熒光使用免疫熒光法研究CBP和β-聯(lián)蛋白在經(jīng)化合物1(25μM)或?qū)φ瘴?0.5％DMSO)處理的SW480和HCT116細(xì)胞中的定位。對對數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行接種，24小時后將細(xì)胞用化合物1或?qū)φ瘴锾幚?。處理過后24小時，對細(xì)胞進(jìn)行固定。將蓋玻片與分別針對CBP(A-22)(Santa Cruz Biotechnology)和β-聯(lián)蛋白(Transduction Laboratories)培養(yǎng)的抗體一起培養(yǎng)。涂上綴合在FITC或TRITC(JacksonImmunoResearch，Westgrove，PA)上的第二抗體之后，使用Nikon PCM2000激光掃描共焦顯微鏡對薄片進(jìn)行檢測。
流式細(xì)胞分析(FACS)對于FACS分析，將約5×106出自PNRI處理或載體處理的細(xì)胞用70％的冷乙醇固定，并在-20℃下保存至少30分鐘。將細(xì)胞用1×PBS洗滌一次，在室溫下用碘化丙錠(PI)溶液(85μg/ml碘化丙錠、0.1％Nonidet P-40、10mg/ml RNAse)培養(yǎng)30分鐘。使用BeckmanCoulter EPICS XL-MCL流式細(xì)胞儀對每個樣品獲取10,000染色細(xì)胞，通過Expo32ADC軟件(Coulter Corporation，Miami，F(xiàn)lorida，33196)測定處于細(xì)胞周期不同階段的細(xì)胞的百分比。
蛋白提純將CBP(1-111)和p300(1-111)表達(dá)為具有6X-His標(biāo)記物的融合蛋白，并使用它們的6X-His標(biāo)記物從細(xì)菌溶解產(chǎn)物中親和提純。將轉(zhuǎn)移的細(xì)菌沉淀(1L培養(yǎng)物)重新懸浮在5-10ml溶胞緩沖液(20mMHepes pH7.9、150mM NaCl、0.1％Nonidet P-40、5mM 2-巰基乙醇和1片CompleteTM蛋白酶抑制劑混合物)中。將細(xì)胞通過超聲處理溶解。將澄清的溶解產(chǎn)物與500μl Ni-NTA-瓊脂糖小珠(Qiagen)在4℃下培養(yǎng)1小時。將結(jié)合的蛋白用500μl洗脫緩沖液(20mM Hepes pH7.9和150mM NaCl、1片CompleteTM蛋白酶抑制劑混合物、5mM 2-巰基乙醇和250mM咪唑)洗脫。將洗脫出的蛋白分成等分試樣冷凍。
實時反向轉(zhuǎn)染-PCR分析使用RNeasy Midi試劑盒(Qiagen)進(jìn)行RNA提取，并根據(jù)SYBRGreen PCR Master Mix試劑盒(Perkin Elmer Biosystems，Shelton，CT)提供的方案進(jìn)行實時RT-PCR。用于細(xì)胞周期蛋白D1、軸蛋白2、hnkd、c-myc、c-jun和fra-1擴(kuò)增的引物為細(xì)胞周期蛋白D1正向引物5′-AGATCGAAGC-CCTGCTG-3′(SEQ ID NO32)反向引物5′-AGGGGGAAAGAGCAAAGG-3′(SEQ ID NO33)生成大小約300bp的產(chǎn)物；軸蛋白2正向引物5′-GTGTGAGGTCCAC GGAAA-CT-3′(SEQ IDNO34)和反向引物5′-CTCGGGAAATGAGGTA-GAGA-3′(SEQ IDNO35)；hnkd正向引物5′-CTGGCTGCTGCTACCACCA TTGCGT-3′(SEQ ID NO36)和反向引物5′-CCAGGCCCAAATTGGG ACGT-3′(SEQ ID NO37)；c-myc正向引物5′-GAA-GAAATTCGAGCTGCTGC-3′(SEQ ID NO38)和反向引物5′-CACATACAGTCCTGGATGAT-G-3′(SEQ ID NO39)；c-jun正向引物5′-AGATGCCCGGCGAGACACCG-3′(SEQ ID NO40)和反向引物5′-AGCCCCCGACGGTCTCTTT-3′(SEQ ID NO41)；fra-1正向引物5′-ACC-CCGGCCAGGAG-TCATCCGGGCCC-3′(SEQ ID NO42)和反向引物5′-AGGCGCCTCACAAAGCGAGGAGGG-TT-3′(SEQ ID NO43)。使用β-肌動蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。β-肌動蛋白的引物為正向引物5′-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3′(SEQ ID NO44)和反向引物5′-CGTCATACTCCTCCTTGCYGATCCACA TCTGC-3′(SEQ ID NO45)。各組引物在95℃下擴(kuò)增10分鐘，進(jìn)行40個95℃下15秒和60℃下1分鐘的循環(huán)。
胱天蛋白酶-3活性化驗將SW480、HCT116和CCD18Co細(xì)胞在處理之前以每孔(96孔平板)105細(xì)胞放置24小時。向每孔中加入25μM化合物1或?qū)φ瘴?0.5％DMSO)。處理過后24小時，將細(xì)胞溶解，并使用胱天蛋白酶-3/7活性試劑盒(Apo-One同源胱天蛋白酶-3/7化驗，#G77905，Promega)測量胱天蛋白酶活性。通過從實驗測得的數(shù)值減去空白(對照物，無細(xì)胞)的單位值得到相對熒光單位(RFU)。
表1顯示了對用化合物1(25μ)或?qū)φ瘴?0.5％DMSO)處理4、8或24小時的SW480細(xì)胞進(jìn)行實時反向轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)分析的定量結(jié)果。在每個時間點，對1μg mRNA進(jìn)行實時RT-PCR。測量內(nèi)源細(xì)胞周期蛋白D1、c-myc、纖連蛋白、hnkd、軸蛋白2、c-jun和BMP-4相對于β-肌動蛋白的表達(dá)水平。通過各組平均值減去相應(yīng)的獲白β-肌動蛋白的平均值，測定Δ閾值周期(Cycle of Threshold，CT)值的量。所有實驗均進(jìn)行兩份。
化合物1通過靶向CBP來對抗β-聯(lián)蛋白/TCF轉(zhuǎn)錄由于APC突變，SW480結(jié)腸癌細(xì)胞表現(xiàn)出β-聯(lián)蛋白到核的組成性易位，并因此表現(xiàn)出高的基部(basal)β-聯(lián)蛋白/TCF轉(zhuǎn)錄，如通過TOPFLASH報道基因系統(tǒng)所評估(Korinek等人，“Constitutivetranscriptional activation by a beta-catenin-Tcf complex in APC-/-coloncarcinoma”，Science 2751784-87(1997))。相關(guān)的報道基因用于對二級結(jié)構(gòu)模板小分子庫(Ogbu等人，“Highly efficient and versatilesynthesis of libraries of constrained b-stranrd mimetics”，Bioorg.Med.Chem.Lett.82321-26(1998)；Eguchi等人，“Solid-phage synthesis andstructural analysis of Bicyclic β-Turn mimetics incorporating functionalityat the i to i+3positions”，Amer.Chem.Soci.10222031-32(1999))進(jìn)行β-聯(lián)蛋白/TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制劑的篩選。對于最初的篩選，我們選擇IC50為5μM(圖1B)的化合物1(圖1A)，并且其相對于許多其它的包括NFAT(圖1C)、CRE和AP-1(數(shù)據(jù)未顯示)在內(nèi)的依賴CBP的報道基因具有極好的選擇性。化合物1在β-聯(lián)蛋白磷酸化位點有缺陷、但是表達(dá)野生型APC的HCT116細(xì)胞中表現(xiàn)出類似活性(數(shù)據(jù)未顯示)。
為了確定化合物1的分子靶底，我們對其進(jìn)行衍生化以用作親和試劑，得到化合物2(圖1A)。用化合物1或載體進(jìn)行預(yù)處理之后，從SW480細(xì)胞中制備核抽提物，然后與化合物2一起培養(yǎng)。然后將復(fù)合體在鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖小珠上進(jìn)行分離，并進(jìn)行凝膠電泳。SW480細(xì)胞的核抽提物在化合物2親和柱上保留的主要條帶表觀分子量為225KDa，并通過免疫印跡法鑒別為CREB結(jié)合蛋白(CBP)(圖1D)。化合物1特異性地洗脫結(jié)合到化合物2的CBP(圖1D，比較條帶7與8)，而且在親和力色譜之前將核抽提物與化合物1(20μM)一起預(yù)培養(yǎng)阻斷了CBP的結(jié)合(圖1D，條帶9)。所用的抗體對CBP是特異性的，不會與p300交叉反應(yīng)。因此，這些數(shù)據(jù)表明化合物1結(jié)合CBP。
進(jìn)一步進(jìn)行一系列研究以進(jìn)一步確認(rèn)化合物1結(jié)合CBP。通過在合成中加入14C-標(biāo)記的酪氨酸，合成化合物1的14C-標(biāo)記型。將未經(jīng)β-聯(lián)蛋白或CBP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或者經(jīng)其轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞的核溶解產(chǎn)物，用14C-標(biāo)記化合物1、以及DMSO或冷化合物1一起處理過夜。然后使用G-25柱對細(xì)胞溶解產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽處理，除去未結(jié)合的14C-標(biāo)記化合物1，并測量放射性的結(jié)合。如圖1E所示，與對照物相比(圖1E，比較條帶2與6)，用CBP轉(zhuǎn)染的核溶解產(chǎn)物結(jié)合的14C-標(biāo)記化合物增加了大約4-6倍，其以依賴劑量的方式被冷化合物1競爭掉(圖1E，比較條帶6與7&8)。
基于這一證據(jù)，推斷出化合物1結(jié)合CBP。因此，本發(fā)明一方面提供一種方法，其包括將含CBP的組合物與試劑混合，其中該試劑結(jié)合CBP。對CBP的結(jié)合干擾了CBP另外可能發(fā)生的任何其它結(jié)合反應(yīng)。因此，本發(fā)明提供通過與CBP結(jié)合處理受試者的方法，其包括用有效量的試劑為對其有需要的受試者給藥。
化合物1特異性地與CBP的前111個氨基酸相互作用使用生物素化的類似物化合物2(圖1A)描繪CBP與化合物1結(jié)合所必需的最小區(qū)。將含過量表達(dá)的CBP片段(圖2B，上圖)的細(xì)胞溶解產(chǎn)物與預(yù)先與化合物2結(jié)合的鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖小珠一起培養(yǎng)數(shù)小時。然后從小珠上洗脫結(jié)合的蛋白，對其進(jìn)行凝膠電泳并使用抗His抗體進(jìn)行免疫印跡，以檢測結(jié)合的CBP片段。如圖所示(圖2B，下圖)，與化合物2特異性結(jié)合的最小區(qū)是CBP的NH2-端氨基酸1-111(比較條帶2、3和4與其它條帶)。如共免疫沉淀實驗所預(yù)計，檢測不到與SW480細(xì)胞中過量表達(dá)的任何p300片段的結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示，見下文)。當(dāng)在SW480細(xì)胞中過量表達(dá)CBP(1-111)、CBP(1-211)和CBP(1-351)連同p300(1-111)、p300(1-211)和p300(1-351)時(圖2C，下圖)，過量的化合物1強(qiáng)烈競爭掉CBP片段的結(jié)合(圖2C，上圖，比較條帶4-6與7-9)，但是對p300片斷的結(jié)合沒有任何影響(圖2C，比較條帶10-12與13-15)。因此，可以看出化合物1結(jié)合CBP的前111個氨基酸而不是相關(guān)蛋白p300。
為了排除CBP與化合物1之間由其它細(xì)胞組分介導(dǎo)的直接聯(lián)合的可能性，并對直接結(jié)合進(jìn)行測驗，我們使用6X-His標(biāo)記大腸桿菌(E.coli)表達(dá)的蛋白(圖2D，右)對CBP(1-111)和p300(1-111)進(jìn)行親和力提純。使用結(jié)合在鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖小珠上的化合物2，我們闡明了CBP(1-111)而不是p300(1-111)對化合物2的特異性結(jié)合，其可以被過量的化合物1競爭掉(圖2D，右，比較條帶3-5和6-8)。該數(shù)據(jù)證實了CBP(1-111)與化合物1之間在體外的直接結(jié)合。由于化合物1與大腸桿菌中表達(dá)的CBP結(jié)合，這便降低了CBP為結(jié)合化合物1需要被哺乳動物激酶磷酸化的可能性。
利用構(gòu)造物CBP(Δ1-111+NLS)進(jìn)一步證實了CBP氨端所發(fā)揮的關(guān)鍵作用。盡管全長CBP的表達(dá)以依賴劑量的方式恢復(fù)了化合物1(25μM)對β-聯(lián)蛋白/TCF啟動子活性的抑制，CBP(Δ1-111+NLS)的表達(dá)則沒有影響(圖2E)。
因此，本發(fā)明一方面提供調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白誘發(fā)的基因表達(dá)的方法，該方法包括使組合物與試劑接觸，其中該組合物包含β-聯(lián)蛋白、CBP和p300，并且試劑以有效降低β-聯(lián)蛋白與CBP的結(jié)合而對β-聯(lián)蛋白與p300的結(jié)合影響極小或沒有影響的量與組合物接觸。
化合物1與β-聯(lián)蛋白競爭CBPCBP是許多轉(zhuǎn)錄進(jìn)程中的限速因素。如圖3A所示，濃度漸增的CBP而非β-聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)染，以依賴劑量的方式提高化合物1(12.5μM)的IC50。進(jìn)行SW480細(xì)胞中的免疫沉淀化驗，以確定化合物1破壞β-聯(lián)蛋白與CBP的結(jié)合。β-聯(lián)蛋白與CBP的免疫沉淀被化合物1以依賴濃度的方式抑制(圖3B，比較條帶2、3和4，條帶1是對照物，未加抗體)?；衔?與CBP的結(jié)合是非常特異性的，因為盡管CBP與p300高度同源，該化合物并未干擾β-聯(lián)蛋白與p300的結(jié)合(圖3B，下圖，比較條帶2-4)。
為了進(jìn)一步確認(rèn)上述的β-聯(lián)蛋白/CBP相互作用，用上述的CBP和p300缺失構(gòu)造(圖2A)對SW480細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。隨后洗滌小珠之后，CBP(1-111)、CBP(1-211)和CBP(1-351)以及p300(1-111)、p300(1-211)和p300(1-351)保持特異性結(jié)合在免疫沉淀的β-聯(lián)蛋白上(圖3C，比較條帶2-4與5-15)。這些結(jié)合研究強(qiáng)調(diào)CBP與p300的NH2-端的前111個氨基酸均與β-聯(lián)蛋白結(jié)合。為了確認(rèn)這一區(qū)域與化合物1的CBP結(jié)合部位重疊，我們在存在過量化合物1的情況下評估CBP(1-111)、CBP(1-211)和CBP(1-351)以及p300(1-111)、p300(1-211)和p300(1-351)與β-聯(lián)蛋白的結(jié)合。圖3D的下圖顯示這些片段在SW480細(xì)胞中的表達(dá)水平是可比的。暴露于過量的化合物1大大地競爭去結(jié)合在β-聯(lián)蛋白上的片段，而對結(jié)合在β-聯(lián)蛋白上的p300片段則沒有影響(圖3D，上圖，比較條帶4-9與10-15)。從顯示的數(shù)據(jù)可以看出，化合物1特異性地結(jié)合在區(qū)分兩種高度同源的輔激活物CBP與p300的CBP氨基端(1-111氨基酸)上，并且競爭掉β-聯(lián)蛋白與CBP的相互作用。
這些結(jié)合研究突出了作為與β-聯(lián)蛋白相互作用的最小區(qū)的CBP和p300前111個氨基酸。對這些區(qū)域的序列排比顯示出與之前發(fā)表的發(fā)現(xiàn)于TCF、APC和E-鈣黏著蛋白中的β-聯(lián)蛋白結(jié)合基序的驚人相似性(圖3E和3F)。序列排比數(shù)據(jù)強(qiáng)烈顯示CBP像其它β-聯(lián)蛋白相互作用蛋白那樣，包埋了β-聯(lián)蛋白結(jié)合所需的帶負(fù)電氨基酸的保守序列端。
化合物1降低核β-聯(lián)蛋白檢測β-聯(lián)蛋白和CBP的亞細(xì)胞分布，以確定其定位是否受化合物1的影響。SW480細(xì)胞中的大多數(shù)內(nèi)源β-聯(lián)蛋白在核內(nèi)發(fā)現(xiàn)為CBP(圖4A)。用化合物1處理導(dǎo)致β-聯(lián)蛋白易位至SW480細(xì)胞中其中內(nèi)源E-鈣黏著蛋白的表達(dá)受限的胞質(zhì)(圖4A，比較上圖的對照物與下圖的經(jīng)處理的細(xì)胞)(de Vries等人，“In vivo and in vitro invasion in relation tophenotypic characteristics of human colorectal carcinoma cells”，Br.JCancer 71271-77(1995))。用核轉(zhuǎn)運抑制劑細(xì)霉素B的處理消除了化合物1誘導(dǎo)的β-聯(lián)蛋白的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運，這表明圖4A中觀察到的β-聯(lián)蛋白的核輸出是由于化合物1對β-聯(lián)蛋白/CBP復(fù)合體的破壞(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，我們推斷破壞β-聯(lián)蛋白與CBP的結(jié)合導(dǎo)致β-聯(lián)蛋白的核水平降低。通過蛋白質(zhì)免疫印記分析觀察了化合物1誘導(dǎo)的β-聯(lián)蛋白從SW480細(xì)胞的核易位至胞質(zhì)(圖4B)。
通過β-聯(lián)蛋白靶基因調(diào)節(jié)分化并利用輔激活物細(xì)胞周期蛋白D1基因在許多不同腫瘤類型中不適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)，已知它是Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑的直接靶底(Shtutman等人，“The cyclin D1gene is a target of the beta-catenin/LEF-1 pathway”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 965522-27(1999)；Tetsu等人，“Beta-catenin regulates expressionofcyclin D1in colon caminoma cells”，Nature 398422-26(1999))。為了測定化合物1對這一β-聯(lián)蛋白/TCF途徑的直接靶底的表達(dá)的影響，在處理過后4、8和24小時的時間點，對提取自經(jīng)化合物1(25μM)或?qū)φ瘴锾幚淼募?xì)胞的mRNA進(jìn)行實時反向轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)(表1)。表1顯示了對用化合物1(25μ)或?qū)φ瘴?0.5％DMSO)處理4、8或24小時的SW480細(xì)胞進(jìn)行定量實時反向轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)分析的結(jié)果。在每個時間點，對1μg mRNA進(jìn)行實時RT-PCR。測量內(nèi)源細(xì)胞周期蛋白D1、c-myc、纖連蛋白、hnkd、軸蛋白2、c-jun和BMP-4相對于β-肌動蛋白的表達(dá)水平。通過將各組平均值減去獲自β-肌動蛋白的相應(yīng)平均值，測定Δ閾值周期(CT)的量。所有實驗均進(jìn)行兩份。
表1實時RT-PCR

使用β-肌動蛋白基因?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。通過將各組平均值減去獲自β-肌動蛋白基因的相應(yīng)平均值測定Δ閾值周期(CT)值。細(xì)胞中mRNA的量越低，相應(yīng)的ACT值越高。如表1所總結(jié)，與對照細(xì)胞相比，經(jīng)化合物1處理的細(xì)胞中觀察到細(xì)胞周期蛋白D1信息的ΔCT值以依賴于時間的方式增加。另外還評估了細(xì)胞中的細(xì)胞周期蛋白D1的蛋白水平。對經(jīng)處理的SW480細(xì)胞的全細(xì)胞溶解產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳和蛋白質(zhì)免疫印跡分析。如圖5A所示，用化合物1(25μM)處理時，細(xì)胞周期蛋白D1的水平有明顯的降低，處理過后4小時開始降低，處理后24小時增加(比較條帶1與2、3與4、以及5與6)。
此外，選擇先前已經(jīng)在文獻(xiàn)中報道為β-聯(lián)蛋白/TCF轉(zhuǎn)錄的直接靶底的基因亞型，進(jìn)行實時RT PCR分析。在這些型當(dāng)中，軸蛋白2和人類裸表皮(human naked cuticle，hnkd)的信息水平(Yan等人，“Elevatedexpression of axin2 and hnkd mRNA provides evidence that Wnt/beta-catenin signaling is activated in human colon tumors”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9814973-78(2001))如預(yù)計那樣被減量調(diào)節(jié)(表1)。但是，對于幾種β-聯(lián)蛋白/TCF調(diào)節(jié)的基因來說，信息水平則顯著增加，例如c-myc(He等人，“Identification of c-MYC as a target of the APCpathway”，Science 2811509-12(1998))、c-jun和fra-1(表1)(Mann等人，“Target genes of beta-catenin-T cell-factor/lymphoid-enhancer-factorsignaling in human colorectal carcinomas”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 961603-08(1999))。因此，化合物1僅僅抑制β-聯(lián)蛋白靶基因亞型的表達(dá)。
化合物1抑制細(xì)胞周期蛋白D1而不抑制c-myc(二種已知的β-聯(lián)蛋白信號傳導(dǎo)的靶基因)的表達(dá)這一結(jié)果，結(jié)合化合物1對CBP而不是p300的特異性，說明p300被c-myc啟動子選擇性利用可以使它避免被化合物1阻抑。為了評價內(nèi)源c-myc啟動子上的輔激活物的使用，對經(jīng)化合物1(25μM)或?qū)φ瘴?0.5％DMSO)處理的SW480細(xì)胞進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)化驗。如圖5B所示，c-myc啟動子在經(jīng)對照物處理的細(xì)胞中被輔激活物CBP和p300占有，大多數(shù)被CBP占有。用化合物1處理則完全并且選擇性地阻斷CBP與c-myc啟動子的聯(lián)合，并伴隨著p300聯(lián)合水平的增加。與c-myc啟動子相似，用化合物1處理完全并且選擇性地阻斷CBP與細(xì)胞周期蛋白D1啟動子的聯(lián)合(圖5B，下圖)。與之形成鮮明的對比，p300不能夠代替CBP結(jié)合細(xì)胞周期蛋白D1基因的啟動子。這一結(jié)果與實時RT-PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡分析獲得的數(shù)據(jù)相一致(表1和圖5A)。因此，化合物1選擇性地降低CBP而不是p300與β-聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)的啟動子的亞型的結(jié)合。
為了進(jìn)一步研究化合物1的選擇性，使用Clontech Atlas HumanCancer1.2Array(#7851-1)進(jìn)行cDNA微點陣分析。數(shù)據(jù)表明化合物1對總體基因轉(zhuǎn)錄具有良好的選擇性效應(yīng)(表2-5)。用25μM化合物1處理8小時之后的SW480細(xì)胞，分析得到～2％的基因被增量調(diào)節(jié)大于2倍，而～0.3％的基因被減量調(diào)節(jié)大于50％(表2-3)。
表2SW480細(xì)胞中通過用25μM化合物1處理8小時增量調(diào)節(jié)的基因


表3SW480細(xì)胞中通過用25μM化合物1處理8小時減量調(diào)節(jié)的基因

表4SW480細(xì)胞中通過用25μM化合物1處理24小時增量調(diào)節(jié)的基因


表5SW480細(xì)胞中通過用25μM化合物1處理24小時減量調(diào)節(jié)的基因

化合物1導(dǎo)致G1/S階段停滯并激活胱天蛋白酶活性已經(jīng)顯示對細(xì)胞周期蛋白D1基因表達(dá)的抑制導(dǎo)致細(xì)胞周期G1/S階段的停滯(Shintani等人，“Infrequent altemations of RB pathway(Pb-p16INK4A-cyclin D1)in adenoid cystic carcinoma of salivaryglands”，Anticancer Res.202169-75(2000))。將HCT116(圖6A，上圖)和SW480(圖6A，下圖)細(xì)胞用化合物1(25μM)(圖6A，右)或?qū)φ瘴?0.5％DMSO)(圖6A，左)處理24小時。隨后將細(xì)胞用碘化丙錠(PI)染色，并通過FACS細(xì)胞熒光測定法分析DNA含量。如預(yù)期的那樣，對照細(xì)胞(圖6A，左)經(jīng)歷正常的細(xì)胞周期，而經(jīng)化合物1處理的細(xì)胞(圖6A，右)在細(xì)胞周期G1/S階段顯示出積聚增加。因此，可以看出化合物1導(dǎo)致G1階段細(xì)胞的停滯。
胱天蛋白酶是通常在指定的細(xì)胞群體中通過凋亡刺激觸發(fā)而激活的半胱氨酸蛋白酶。為了評價SW480、HCT116和野生型結(jié)腸細(xì)胞(CCD18Co細(xì)胞)中的凋亡誘導(dǎo)，將細(xì)胞用化合物1(25μM)或?qū)φ瘴?0.5％DMSO)處理24小時，然后進(jìn)行胱天蛋白酶-3/7活性化驗。如圖6B所示，與CCD18Co細(xì)胞相比，化合物1在SW480和HCT116細(xì)胞中特異性地顯著激活胱天蛋白酶-3/7途徑。
化合物1降低轉(zhuǎn)化的結(jié)腸直腸細(xì)胞的增殖使用經(jīng)化合物1(0.25-5μM)和5-氟尿嘧啶(5-FU)(0.5-32μM)處理的SW480細(xì)胞進(jìn)行軟瓊脂集落形成化驗。如圖7A所示，化合物1在集落形成的數(shù)目上顯示出依賴劑量的降低。化合物1和5-FU的IC50值分別為0.87±0.11μM和1.98±0.17μM。因此，化合物1增加胱天蛋白酶活性，并降低通過激活β-聯(lián)蛋白信號傳導(dǎo)的突變而轉(zhuǎn)化的結(jié)腸直腸細(xì)胞的體外生長。
化合物4和化合物5在Min小鼠模型中降低腫瘤生長化合物4、化合物5或運載體在野生型和Min小鼠中給藥。化合物4同樣是化合物1的類似物(圖1A)。各種處理之后測量這些小鼠的小腸和結(jié)腸中息肉形成的數(shù)目(表6)。數(shù)據(jù)顯示當(dāng)以大約300mpk給藥時，與僅用運載體處理的對照小鼠相比，化合物4和化合物5均降低min小鼠中的息肉數(shù)目。
表6化合物4和化合物5對Min小鼠模型中息肉數(shù)目的影響


化合物3的細(xì)胞毒性使用不同來源的癌細(xì)胞測量化合物3(化合物1的類似物，圖1A)和其它抗癌治療劑的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示濃度低于或類似于其它抗癌治療劑(即順氯氨鉑、5-FU、ADR(阿霉素))的濃度時，化合物3導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡(表7)。
表7細(xì)胞毒性

表7中的數(shù)值單位為μg/ml。
化合物3在大鼠和人體內(nèi)的代謝通過將該化合物與大鼠或人肝臟微粒體一起培養(yǎng)5分鐘至1小時，通過HPLC分出經(jīng)處理的微粒體提取物，并對分出的部分進(jìn)行MS分析，分析化合物3的代謝。結(jié)果如圖10A和10B所示。兩種體系中均觀察到幾種代謝產(chǎn)物(如M1、M2、M3)。
化合物3、化合物4和化合物5的生物利用率研究在小鼠和大鼠體內(nèi)研究化合物3、化合物4和化合物5的生物利用率。這些化合物的結(jié)構(gòu)如圖1A所示。使用相同的運載體(即20％吐溫80)將所有化合物給藥(靜脈內(nèi)和口服，10mg/kg)?；衔?、4和5在小鼠體內(nèi)的生物利用率分別為低于2％、低于2％和幾乎為0％?；衔?在大鼠體內(nèi)的生物利用率為大約24％。
討論大量有力的證據(jù)表明對β-聯(lián)蛋白途徑的誤調(diào)節(jié)與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)(Morin，PJ.，“Beta-catenin signaling and cancer”，Bioessays 211021-30(1999)；Moon等人，“The promise and perils of Wnt signalingthrough beta-catenin”，Science 2961644-46(2002)；Oving等人，“Molecular causes of colon cancer”，Eur.J.Clin.Invest.32448-57(2002))。在本文中，我們說明了結(jié)構(gòu)式(I)的化合物抑制β-聯(lián)蛋白/TCF轉(zhuǎn)錄亞型這一發(fā)現(xiàn)。利用二級結(jié)構(gòu)模板化合物庫篩選SW480結(jié)腸癌細(xì)胞中的報道基因，對這些低分子量抑制劑的生物活性進(jìn)行表征，所述結(jié)腸癌細(xì)胞在APC基因中具有導(dǎo)致β-聯(lián)蛋白/TCF轉(zhuǎn)錄組成性提高的突變。利用生物素化類似物(化合物2)的親和力色譜，使人們將輔激活物蛋白CBP鑒別為化合物1的分子靶底。
已經(jīng)顯示CBP而不是β-聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)染顯著增加14C-標(biāo)記的化合物1與SW480核溶解產(chǎn)物的結(jié)合。為了確認(rèn)CBP為化合物1的分子靶底，已經(jīng)顯示CBP表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染能夠超控β-聯(lián)蛋白/TCF報道基因構(gòu)造被化合物1抑制。而且，化合物1在不干擾β-聯(lián)蛋白與緊密相關(guān)的輔激活物p300的相互作用的情況下，選擇性地阻斷β-聯(lián)蛋白與CBP的相互作用。而且，化合物1導(dǎo)致SW480細(xì)胞中β-聯(lián)蛋白從核到胞質(zhì)的重新分布。最后，化合物1介導(dǎo)的對細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)的抑制，導(dǎo)致G1/S細(xì)胞周期停滯，延長處理導(dǎo)致SW480(或HCT116)細(xì)胞中而不是正常結(jié)腸細(xì)胞中胱天蛋白酶的激活，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌細(xì)胞系的凋亡。因此，化合物1是β-聯(lián)蛋白途徑的抑制劑，CBP是它的分子靶底。
為了進(jìn)一步研究化合物1的選擇性，使用Clontech Atlas HumanCancer 1.2Array(#7851-1)進(jìn)行cDNA微點陣分析。數(shù)據(jù)表明化合物1對總體基因轉(zhuǎn)錄具有良好的選擇性效應(yīng)(表2-5)。用25μM化合物1對SW480細(xì)胞處理8小時之后，分析得到～2％的基因被增量調(diào)節(jié)大于2倍，而～0.3％的基因被減量調(diào)節(jié)大于50％(表2-3)。
依賴啟動子的輔激活物選擇性地增加β-聯(lián)蛋白/TCF途徑的復(fù)雜性。如預(yù)期的那樣，化合物1抑制細(xì)胞周期蛋白D1、hnkd和軸蛋白2基因的表達(dá)(Yan等人，“Elevated expression of axin2 and hnkd mRNAprovides evidence that Wnt/beta-catenin signaling is activated in humancolon tumors”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9814973-78(2001))。與之相反，c-myc(He等人，“Identification of c-MYC as a target of the APCpathway”，Science 2811509-12(1998))和c-jun(Mann等人，“Targetgenes of beta-catenin-T cell-factor/lymphoid-enhancer-factor signaling inhuman colorectal carcinomas”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 961603-08(1999))的表達(dá)由于分化輔激活物在β-聯(lián)蛋白/TCF途徑中的應(yīng)用而得以增加(表1和圖7B)。利用ChIP化驗，表明化合物1選擇性地抑制CBP與內(nèi)源c-myc和細(xì)胞周期蛋白D1啟動子的聯(lián)合，而且在處理過的細(xì)胞中，對于c-myc啟動子而不是細(xì)胞周期蛋白D1啟動子，啟動子被p300占有得以增加。這一結(jié)果與β-聯(lián)蛋白co-IP實驗和細(xì)胞周期蛋白D1的實時RT-PCR中得到的數(shù)據(jù)非常一致。選擇性抑制β-聯(lián)蛋白/CBP相互作用的化合物1、和對β-聯(lián)蛋白/p300有選擇性的相關(guān)類似物(Kahn等人，未發(fā)表數(shù)據(jù))，提供新型化學(xué)基因組工具，以提出β-聯(lián)蛋白/TCF復(fù)合體以依賴啟動子并具有輔激活物特異性的方式激活基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制(圖7B)。
關(guān)于在β-聯(lián)蛋白與輔激活物蛋白CBP和p300之間相互作用的特異性接觸部位的文獻(xiàn)中存在顯著的差異。這一點可能涉及CBP和p300與β-聯(lián)蛋白到多種靶蛋白之間混雜的、通常低到中度的結(jié)合親和力。我們預(yù)計我們可以使用化合物1對CBP的結(jié)合特異性來澄清這一局面?；衔?與CBP片段的結(jié)合研究導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)了CBPNH2-端處的最小相互作用區(qū)(氨基酸1-111)。而且，化合物1不結(jié)合p300中的同源序列。化合物1在不干擾p300(1-111)/β-聯(lián)蛋白相互作用的情況下，選擇性地阻斷細(xì)胞中CBP(1-111)與β-聯(lián)蛋白的相互作用。該區(qū)域的序列排比顯示出與先前發(fā)表的發(fā)現(xiàn)于TCF、APC和E-鈣黏著蛋白中的β-聯(lián)蛋白結(jié)合基序的驚人相似性(圖5A)(Huber等人，“The structure ofthe beta-catenin/E-cadherin complex and the molecular basis of diverseligand recognition by beta-catenin”，Cell 105391-402(2001))。CBP(1-111)和p300(1-111)二者均含有對與β-聯(lián)蛋白的相互作用至關(guān)重要的帶負(fù)電荷的扣狀體(DELIXXXXE)(Graham等人，“Tcf4 canspecifically recognize beta-catenin using alternative conformations，”Nat.Struct.Biol.81048-52(2001))。發(fā)現(xiàn)于APC和E-鈣黏著蛋白中的SXSSXS基序(其中X是具有非極性脂肪族R基團(tuán)的氨基酸)同樣存在于CBP、SASSP(氨基酸89-93)中，但是未見于p300中。盡管SW480細(xì)胞中化合物1與CBP(1-111)和p300(1-111)的不同結(jié)合可以主要歸因于磷酸化不同，使用已知的GSK-3β(Nikoulina等人，“Inhibitionof glycogen synthase kinase 3 imporves insulin action and glucosemetabolism in human skeletal muscle”，Diabetes 512190-98(2002))或PKC(Bollag等人，“Effects of the selective protein kinase C inhibitor，Ro31-7549，on the proliferation of cultured mouse epidermal keratinocytes”，J.Invest.Dermatol.100240-46(1993))抑制劑對化合物1的結(jié)合沒有明顯的效果(數(shù)據(jù)未顯示)。而且，大腸桿菌中表達(dá)的純化重組CBP(1-111)能夠與化合物1結(jié)合，進(jìn)一步反駁了依賴輔激活物的磷酸化是區(qū)分因素這一觀點。因此，使用化合物1作為工具，我們具體將CBP與β-聯(lián)蛋白相互作用的最小區(qū)定位于CBP的前111個氨基酸。
對我們的定位研究的進(jìn)一步支持源白CBP上存在視黃酸(RA)受體RXR/RAR的結(jié)合位點，其與CBP上的β-聯(lián)蛋白結(jié)合基序非常接近(圖3F)。之前，已經(jīng)顯示RA處理抑制β-聯(lián)蛋白/TCF信號傳導(dǎo)(Earswaran等人，“Cross-regulation of beta-catenin-LEF/TCF andretionoid signaling pathways”，Curr.Biol.91415-18(1999))。共有區(qū)(LXXLL)(SEQ ID NO46)RXR/RAR結(jié)合部位(LSELL)位于氨基酸殘基70-74，其在我們提出的CBP和p300上的β-聯(lián)蛋白結(jié)合位點以內(nèi)(Minucci等人，“Retinoid receptors in health and diseaseco-regulators and the chromatin connection.Semin”，Cell Dev.Biol.10215-25(1999))。
化合物1也使我們可以解決β-聯(lián)蛋白信號傳到途徑依賴于啟動子的輔激活物選擇性問題。化合物1處理并不抑制p300與β-聯(lián)蛋白的相互作用(圖3D)，實際上它增加了β-聯(lián)蛋白/p300復(fù)合體在處理過的細(xì)胞中的形成(圖3B)。如序列排比中所示，盡管定位出的β-聯(lián)蛋白結(jié)合基序相似，這兩種輔激活物之間存在的差異能夠解釋觀察到的化合物1對CBP而不是p300的特異性?；谶@些研究，看起來β-聯(lián)蛋白/TCF轉(zhuǎn)錄的激活需要CBP/p300的N-端111個氨基酸與β-聯(lián)蛋白之間的相互作用。
盡管對于β-聯(lián)蛋白/TCF轉(zhuǎn)錄的選擇性小分子抑制劑有著強(qiáng)烈的興趣，據(jù)我們所知，化合物1代表著對這一途徑的直接小分子抑制劑的第一個例子。盡管對β-聯(lián)蛋白和TCF之間的相互作用進(jìn)行了精細(xì)的結(jié)構(gòu)研究(Graham等人，“Crystal structure of a beta-catenin/Tcfcomplex”，Cell 103885-96(2000)；Graham等人，“Tcf4 can specificallyrecognize beta-catenin using alternative conformations”，Nat.Struct.Biol.81048-52(2001)；Poy等人，“Structure of a human Tcf4-beta-catenincomplex”，Nat.Struct.Biol.81053-57(2001))，抑制這一途徑的吸引人的先驗?zāi)Ｊ?，由于TCF以外(如APC和E-鈣黏著蛋白)同樣結(jié)合在β-聯(lián)蛋白中央臂重復(fù)單元(central Arm repeat)上的不同配對物，關(guān)于特異性抑制劑開發(fā)的興趣增加(Huber等人，“The structure of thebeta-catenin/E-cadherin complex and the molecular basis of diverse ligandrecognition by beta-catenin”，Cell 105391-402(2001))?；衔?精致選擇性，通過相對于高度同源的輔激活物p300(其在氨基酸水平上與CBP享有多達(dá)96％的一致性)而對β-聯(lián)蛋白/CBP相互作用的特異性抑制，為研究β-聯(lián)蛋白/TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄提供了獨特的化學(xué)基因組工具?；衔?的特異性、其在轉(zhuǎn)移的而不是正常的結(jié)腸細(xì)胞中選擇性地激活凋亡的胱天蛋白酶的能力、以及其在軟瓊脂集落形成化驗中的效力，對于其在結(jié)腸癌中的潛在治療應(yīng)用來說均為非常有希望的跡象。而且，化合物1的類似物已經(jīng)在鼠癌癥模型中顯示出體內(nèi)效力且毒性有限(注射有SW480細(xì)胞的裸小鼠和Min小鼠模型；Moser等人，“ApcMina mouse model for intestinal and mammary tumorigenesis”，Eur.J.Cancer A1061-64(1995)；Kahn等人，未發(fā)表數(shù)據(jù))，進(jìn)一步確認(rèn)了使用β-聯(lián)蛋白/TCF/CBP轉(zhuǎn)錄的選擇性抑制劑，從而潛在地應(yīng)用于癌癥的化學(xué)治療及其它過度增殖性疾病。
在此結(jié)合上文中所有本說明書引用的和/或申請數(shù)據(jù)頁中所列的美國專利、美國專利申請公開物、美國專利申請、他國專利、他國專利公開物和非專利出版物的全部內(nèi)容作為參考。
從上文中應(yīng)當(dāng)理解到，盡管本文為了闡述起見描述了本發(fā)明具體的實施方式，但可以在不偏離本發(fā)明主旨和范圍的前體下進(jìn)行各種修改。因此，除所附權(quán)利要求外，本發(fā)明不受限制。
序列表<110>(株)中外制藥M.卡恩吳世雄金大訓(xùn)河鐘烈<120>β-聯(lián)蛋白/TCF激活轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)<130>200146.404PC<140>PCT<141>2004-08-27<150>60/498,451<151>2003-08-28<160>55<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>330<212>DNA<213>智人<400>1tgaggaatca acagccgcca tcttgtcgcg gacccgaccg gggcttcgag cgcgatctac 60tcggccccgc cggtcccggg ccccacaacc gcccgcgctc gctcctctcc ctcgcagccg 120gcagggcccc cgacccccgt ccgggccctc gccggcccgg ccgcccgtgc ccggggctgt 180tttcgcgagc aggtgaaaat ggctgagaac ttgctggacg gaccgcccaa ccccaaaaga 240gccaaactca gctcgcccgg tttctcggcg aatgacagca cagattttgg atcattgttt 300gacttggaaa atgatcttcc tgatgagctg 330<210>2<211>111<212>PRT<213>智人<400>2Met Ala Glu Asn Leu Leu Asp Gly Pro Pro Asn Pro Lys Arg Ala Lys1 5 10 15Leu Ser Ser Pro Gly Phe Ser Ala Asn Asp Ser Thr Asp Phe Gly Ser20 25 30Leu Phe Asp Leu Glu Asn Asp Leu Pro Asp Glu Leu Ile Pro Asn Gly35 40 45Gly Glu Leu Gly Leu Leu Asn Ser Gly Asn Leu Val Pro Asp Ala Ala50 55 60Ser Lys His Lys Gln Leu Ser Glu Leu Leu Arg Gly Gly Ser Gly Ser65 70 75 80Ser Ile Asn Pro Gly Ile Gly Asn Val Ser Ala Ser Ser Pro Val Gln85 90 95Gln Gly Leu Gly Gly Gln Ala Gln Gly Gln Pro Asn Ser Ala Asn100 105 110
<210>3<211>340<212>DNA<213>智人<400>3ccttgtttgt gtgctaggct gggggggaga gagggcgaga gagagcgggc gagagtgggc 60aagcaggacg ccgggctgag tgctaactgc gggacgcaga gagtgcggag gggagtcggg 120tcggagagag gcggcagggg ccagaacagt ggcagggggc ccggggcgca cgggctgagg 180cgacccccag ccccctcccg tccgcacaca cccccaccgc ggtccagcag ccgggccggc 240gtcgacgcta ggggggacca ttacataacc cgcgccccgg ccgtcttctc ccgccgccgc 300ggcgcccgaa ctgagcccgg ggcgggcgct ccagcactgg340<210>4<211>117<212>PRT<213>智人<400>4Met Ala Glu Asn Val Val Glu Pro Gly Pro Pro Ser Ala Lys Arg Pro1 5 10 15Lys Leu Ser Ser Pro Ala Leu Ser Ala Ser Ala Ser Asp Gly Thr Asp20 25 30Phe Gly Ser Leu Phe Asp Leu Glu His Asp Leu Pro Asp Glu Leu Ile35 40 45Asn Ser Thr Glu Leu Gly Leu Thr Asn Gly Gly Asp Ile Asn Gln Leu50 55 60Gln Thr Ser Leu Gly Met Val Gln Asp Ala Ala Ser Lys His Lys Gln65 70 75 80Leu Ser Glu Leu Leu Arg Ser Gly Ser Ser Pro Asn Leu Asn Met Gly85 90 95Val Gly Gly Pro Gly Gln Val Met Ala Ser Gln Ala Gln Gln Ser Ser100 105 110Pro Gly Leu Gly Leu115<210>5<211>108<212>PRT<213>小家鼠<400>5Met Ala Glu Asn Leu Leu Asp Gly Pro Pro Asn Pro Lys Arg Ala Lys1 5 10 15Leu Ser Ser Pro Gly Phe Ser Ala Asn Asp Asn Thr Asp Phe Gly Ser20 25 30Leu Phe Asp Leu Glu Asn Asp Leu Pro Asp Glu Leu Ile Pro Asn Gly35 40 45Glu Leu Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Leu Val Pro Asp Ala Ala Ser50 55 60Lys His Lys Gln Leu Ser Glu Leu Leu Arg Gly Gly Ser Gly Ser Ser65 70 75 80Ile Asn Pro Gly Ile Gly Asn Val Ser Ala Ser Ser Pro Val Gln Gln85 90 95Gly Leu Gly Gly Gln Ala Gln Gly Gln Pro Asn Ser100 105
<210>6<211>330<212>DNA<213>小家鼠<400>6atggccgaga acttgctgga cggaccgccc aaccccaaac gagccaaact cagctcgccc 60ggcttctccg cgaatgacaa cacagatttt ggatcattgt ttgacttgga aaatgacctt 120cctgatgagc tgatccccaa tggagaatta agccttttaa acagtgggaa ccttgttcca 180gatgctgcgt ccaaacataa acaactgtca gagcttctta gaggaggcag cggctctagc 240atcaacccag ggataggcaa tgtgagtgcc agcagccctg tgcaacaggg ccttggtggc 300caggctcagg ggcagccgaa cagtacaaac 330<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于克隆CBP的C-端切除構(gòu)造的正向引物<400>7gatatctgag ctcgtggatc cgatggccga gaacttgctg40<210>8<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于克隆CBP的C-端切除構(gòu)造的反向引物<400>8cgtgtataca gctgtgcggc cgcgtttgta ctgttcggct g 41<210>9<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于克隆CBP的C-端切除構(gòu)造的反向引物<400>9cgtgtataca gctgtgcggc cgctccattc atgacttgag c 41<210>10<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于克隆CBP的C-端切除構(gòu)造的反向引物<400>10cgtgtataca gctgtgcggc cgcgcgtttt tcagggtctg c 41<210>11<211>41
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于克隆CBP的C-端切除構(gòu)造的反向引物<400>11cgtgtataca gctgtgcggc cgcagctggt aaagctggct g 41<210>12<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于克隆CBP的C-端切除構(gòu)造的反向引物<400>12cgtgtataca gctgtgcggc cgcatgttgg agagagggca t 41<210>13<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于克隆CBP的C-端切除構(gòu)造的反向引物<400>13cgtgtataca gctgtgcggc cgcagaacct tgtaaatcct c 41<210>14<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于克隆CBP的C-端切除構(gòu)造的反向引物<400>14cgtgtataca gctgtgcggc cgcgctgtag taggctgcat c 41<210>15<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于產(chǎn)生CBP的N-端切除構(gòu)造的反向引物<400>15gtatacagct gtgcgcgccgc caaaccctcc acaaactttt c41<210>16<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBP-C8的正向引物<400>16gatatctgag ctcgtggatc cggaagctgg ggaggttttt 40<210>17<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBP-C9的正向引物<400>17gatatctgag ctcgtggatc cgaagaagat gctggacaag 40<210>18<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBP-C10的正向引物<400>18gatatctgag ctcgtggatc cgtccaaatg gtccactctg 40<210>19<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBP-C11的正向引物<400>19gatatctgag ctcgtggatc cgtctcctac ctcagcacca 40<210>20<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBP-C12的正向引物<400>20gatatctgag ctcgtggatc cgaacatcct taaatcaaac 40<210>21<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBP-C13的正向引物<400>21gatatctgag ctcgtggatc cgcagcagca acgcatgcaa 40
<210>22<211>79<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于產(chǎn)生CBP的正向引物<400>22atctgagctc gtggatccgg gaccgcccaa ccccaaacga gccaaactcc agccgaacag60tacaaacatg gccagctta 79<210>23<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>C-端切除的p-300構(gòu)造的正向引物<400>23gacggtaccg gttcgaagct tatggccgag aatgtggtg 39<210>24<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>C-端切除的p-300構(gòu)造的反向引物<400>24cgtgtataca gctgtgcggc cgccaaacct aatccaggac t41<210>25<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>C-端切除的p-300構(gòu)造的反向引物<400>25cgtgtataca gctgtgcggc cgcgttgcca gcacttccca t41<210>26<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>C-端切除的p-300構(gòu)造的反向引物<400>26cgtgtataca gctgtgcggc cgcggcctgt tcccggcgct g41<210>27<211>102
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于產(chǎn)生β-聯(lián)蛋白/TCF報道質(zhì)粒的四個串聯(lián)TCF4結(jié)合位點<400>27ccaacctttg atcttacccc ctttgatctt accccctttg atcaggaatt cggttggaaa 60ctagaatggg ggaaactaga atgggggaaa ctagtcctta ag 102<210>28<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于c-myc啟動子PCR的正向引物<400>28tggtaggcgc gcgtagtta 19<210>29<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于c-myc啟動子PCR的反向引物<400>29gggcggagat tagcgagag 19<210>30<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于細(xì)胞周期蛋白D1啟動子PCR的正向引物<400>30tgcttaacaa cagtaacgt 19<210>31<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于細(xì)胞周期蛋白D1啟動子PCR的反向引物<400>31ggggctcttc ctgggcagc19<210>32<211>17<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>細(xì)胞周期蛋白D1正向引物<400>32agatcgaagc cctgctg 17<210>33<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>細(xì)胞周期蛋白D1反向引物<400>33agggggaaag agcaaagg18<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>軸蛋白2正向引物<400>34gtgtgaggtc cacggaaact 20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>軸蛋白2反向引物<400>35ctcgggaaat gaggtagaga 20<210>36<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hnkd正向引物<400>36ctggctgctg ctaccaccat tgcgt25<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hnkd反向引物
<400>37ccaggcccaa attgggacgt 20<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>c-myc正向引物<400>38gaagaaattc gagctgctgc 20<210>39<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>c-myc反向引物<400>39cacatacagt cctggatgat g21<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>c-jun正向引物<400>40agatgcccgg cgagacaccg 20<210>41<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>c-jun反向引物<400>41agcccccgac ggtctcttt 19<210>42<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>fra-1正向引物<400>42accccggcca ggagtcatcc gggccc 26
<210>43<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>fra-1反向引物<400>43aggcgcctca caaagcgagg agggtt 26<210>44<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>β-肌動蛋白正向引物<400>44atctggcacc acaccttcta caatgagctg cg 32<210>45<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>β-肌動蛋白反向引物<400>45cgtcatactc ctccttgcyg atccacatct gc 32<210>46<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>一致RXR/RAR結(jié)合位點<221>變量<222>2，3<223>Xaa＝任何氨基酸<400>46Leu Xaa Xaa Leu Leu1 5<210>47<211>15<212>PRT<213>智人<400>47Asn Asp Glu Leu Ile Arg Phe Lys Asp Glu Gly Glu Gln Glu Glu1 5 10 15
<210>48<211>21<212>PRT<213>智人<400>48Tyr Asp Ser Leu Leu Val Phe Asp Tyr Glu Gly Ser Gly Ser Ala Alal 5 10 15Ser Leu Ser Ser Leu20<210>49<211>20<212>PRT<213>智人<400>49Ala Asp Thr Leu Leu His Phe Ala Thr Glu Ser Ser Cys Ser Ser Serl 5 10 15Leu Ser Ala Leu20<210>50<211>15<212>PRT<213>智人<400>50Leu Asp Thr Pro Ile Asn Tyr Ser Leu Lys Tyr Ser Asp Glu Gln1 5 10 15<210>51<211>16<212>PRT<213>智人<400>51Glu Asp Thr Pro Ile Cys Phe Ser Arg Cys Ser Ser Leu Ser Ser Leu1 5 10 15<210>52<211>15<212>PRT<213>智人<400>52Glu Asp Val Val Met Ala Phe Ser Arg Ser Glu Thr Glu Asp Arg1 5 10 15<210>53<211>24<212>PRT<213>智人
<400>53Pro Asp Glu Leu Ile Pro Asn Gly Gly Glu Leu Gly Leu Leu Asn Ser1 5 10 15Ser Gly Ser Ser Ala Ser Ser Pro20<210>54<211>23<212>PRT<213>小家鼠<400>54Pro Asp Glu Leu Ile Pro Asn Gly Glu Leu Ser Leu Leu Asn Ser Ser1 5 10 15Gly Ser Ser Ala Ser Ser Pro20<210>55<211>23<212>PRT<213>智人<400>55Pro Asp Glu Leu Ile Asn Ser Thr Glu Leu Gly Leu Thr Asn Ser Ser1 5 10 15Gly Ser Gly Gly Pro Gly Gln20
權(quán)利要求
1.一種調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白誘發(fā)的靶基因表達(dá)的方法，所述方法包括使組合物與試劑接觸，其中所述的組合物包含β-聯(lián)蛋白、CBP和p300，所述的β-聯(lián)蛋白具有結(jié)合到CBP與p300的可能性，而且將所述試劑以有效改變β-聯(lián)蛋白結(jié)合到CBP與p300的可能性的量與所述組合物接觸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的試劑增加CBP與β-聯(lián)蛋白的結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的試劑降低p300與β-聯(lián)蛋白的結(jié)合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的試劑增加p300與β-聯(lián)蛋白的結(jié)合。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的試劑降低CBP與β-聯(lián)蛋白的結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的組合物是先體外后體內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述的組合物包含干細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的組合物是細(xì)胞或哺乳動物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述的哺乳動物罹患癌癥，并且所述的量對于治療癌癥有效。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述的癌癥是結(jié)腸癌。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述的癌癥選自前列腺癌和乳腺癌。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的組合物是細(xì)胞，所述的試劑增加細(xì)胞分化而不是增殖的可能性。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的組合物是細(xì)胞，所述的試劑增加細(xì)胞增殖而不是分化的可能性。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的試劑具有選自結(jié)構(gòu)式(I)的結(jié)構(gòu) 其中A為-(CHR3)-或-(C＝O)-，B為-(CHR4)-或-(C＝O)-，D為-(CHR5)-或-(C＝O)-，E為-(ZR6)-或-(C＝O)-，G為-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W為-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y為氧或硫，X和Z獨立地為氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自獨立地選自氨基酸側(cè)鏈部分、氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物、或者分子的殘余部分、及其立體異構(gòu)體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9獨立地選自氨基C2-5烷基、胍基C2-5烷基、C1-4烷基胍基C2-5烷基、二C1-4烷基胍基-C2-5烷基、脒基C2-5烷基、C1-4烷基脒基C2-5烷基、二C1-4烷基脒基C2-5烷基、C1-3烷氧基、苯基、取代苯基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、芐基、取代芐基(其中芐基上的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、萘基、取代萘基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、雙苯基甲基、取代雙苯基甲基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、吡啶基、取代吡啶基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、吡啶基C1-4烷基、取代吡啶基C1-4烷基(其中吡啶的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、嘧啶基C1-4烷基、取代嘧啶基C1-4烷基(其中嘧啶的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基或硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、三嗪-2-基-C1-4烷基、取代三嗪-2-基-C1-4烷基(其中三嗪的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、咪唑并C1-4烷基、取代咪唑并C1-4烷基(其中咪唑的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、咪唑啉基C1-4烷基、N-脒基哌嗪基-N-C0-4烷基、羥基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、羥基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、C1-5二烷基氨基C2-5烷基、N-脒基哌啶基C1-4烷基和4-氨基環(huán)己基C0-2烷基。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中A為-(CHR3)-，B為-(C＝O)-，D為-(CHR5)-，E為-(C＝O)-，G為-(XR7)n-，并且化合物具有如下通式(II) 其中，R1、R2、R3、R5、R7、W、X和n如權(quán)利要求1中所定義。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中A為-(C＝O)-，B為-(CHR4)-，D為-(C＝O)-，E為-(ZR6)-，G為-(C＝O)-(XR9)-，并且化合物具有如下通式(III) 其中，R1、R2、R4、R6、R9、W和X如權(quán)利要求1中所定義，Z為氮或CH(當(dāng)Z為CH時，X為氮)。
18.根據(jù)權(quán)利要求14的化合物，其中A為-(C＝O)-，B為-(CHR4)-，D為-(C＝O)-，E為-(ZR6)-，G為-(XR7)n-，并且化合物具有如下通式(IV) 其中，R1、R2、R4、R6、R7、W、X和n如權(quán)利要求1中所定義，Z為氮或CH，附帶條件為當(dāng)Z為氮時，n為0，當(dāng)Z為CH時，X為氮并且n不是0。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述的化合物具有如下通式(VI) 其中，Ra為具有8至11個環(huán)成員的二環(huán)芳基，其可以具有1至3個選自氮、氧或硫的雜原子，Rb為5至7元單環(huán)芳基，其可以具有1至2個選自氮、氧或硫的雜原子，而且化合物中的芳環(huán)可以具有一個或多個選自鹵素、羥基、氰基、低級烷基和低級烷氧基的取代基。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中Ra為萘基、喹啉基或異喹啉基，Rb為苯基、吡啶基或哌啶基，所有這些基團(tuán)均可被一個或多個選自鹵素、羥基、氰基、低級烷基和低級烷氧基的取代基所取代。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中Ra為萘基，Rb為苯基，其可被一個或多個選自鹵素、羥基、氰基、低級烷基和低級烷氧基的取代基所取代。
22.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述的試劑是化合物1。
23.一種組合物，其包含試劑、β-聯(lián)蛋白、CBP和p300，其中β-聯(lián)蛋白具有結(jié)合到CBP與p300的可能性，而且所述試劑以有效改變β-聯(lián)蛋白結(jié)合到CBP與p300的可能性的量存在于所述組合物中。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的組合物，其中所述的試劑增加CBP與β-聯(lián)蛋白的結(jié)合。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的組合物，其中所述的試劑降低p300與β-聯(lián)蛋白的結(jié)合。
26.根據(jù)權(quán)利要求23的組合物，其中所述的試劑增加p300與β-聯(lián)蛋白的結(jié)合。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的組合物，其中所述的試劑降低CBP與β-聯(lián)蛋白的結(jié)合。
28.根據(jù)權(quán)利要求23的組合物，其處于先體外后體內(nèi)的狀態(tài)下。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的組合物，其進(jìn)一步包含干細(xì)胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的組合物，其中所述的試劑增加細(xì)胞分化而不是增殖的可能性。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的組合物，其中所述的試劑增加細(xì)胞增殖而不是分化的可能性。
32.根據(jù)權(quán)利要求23的組合物，其中所述的試劑具有選自結(jié)構(gòu)式(I)的結(jié)構(gòu) 其中A為-(CHR3)-或-(C＝O)-，B為-(CHR4)-或-(C＝O)-，D為-(CHR5)-或-(C＝O)-，E為-(ZR6)-或-(C＝O)-，G為-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W為-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y為氧或硫，X和Z獨立地為氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自獨立地選自氨基酸側(cè)鏈部分、氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物、或者分子的殘余部分、及其立體異構(gòu)體。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的化合物，其中所述的試劑是化合物1。
34.一種調(diào)節(jié)Wnt途徑活性的方法，所述的方法包括(a)使(i)含有Wnt途徑組分的組合物與(ii)激活Wnt途徑的化合物相接觸，以提供激活的Wnt途徑；以及(b)用完全或基本上干擾p300與β-聯(lián)蛋白之間結(jié)合但是極少或者不干擾CBP與β-聯(lián)蛋白之間結(jié)合的化學(xué)試劑調(diào)節(jié)Wnt途徑的活性。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述的組合物是細(xì)胞。
36.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其先體外后體內(nèi)進(jìn)行。
37.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述的化合物是LiCl或GSK3抑制劑。
38.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述的化學(xué)試劑具有選自結(jié)構(gòu)式(I)的結(jié)構(gòu) 其中A為-(CHR3)-或-(C＝O)-，B為-(CHR4)-或-(C＝O)-，D為-(CHR5)-或-(C＝O)-，E為-(ZR6)-或-(C＝O)-，G為-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W為-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y為氧或硫，X和Z獨立地為氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自獨立地選自氨基酸側(cè)鏈部分、氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物、或者分子的殘余部分、及其立體異構(gòu)體。
39.一種調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的方法，所述的方法包括(a)在一定比例的群體增殖且一定比例的群體分化的條件下提供細(xì)胞群體；以及(b)向所述的群體中加入化學(xué)試劑，其中所述的試劑導(dǎo)致增殖細(xì)胞的比例相對于分化細(xì)胞的比例增加。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述的化合物干擾p300與β-聯(lián)蛋白之間的結(jié)合。
41.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其進(jìn)一步包括向所述群體中加入激活Wnt途徑的試劑。
42.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述的細(xì)胞群體是干細(xì)胞群體。
43.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其先體外后體內(nèi)進(jìn)行。
44.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其進(jìn)一步包括加入導(dǎo)致細(xì)胞群體分化的試劑。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中群體中的細(xì)胞分化形成血細(xì)胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中群體中的細(xì)胞分化形成神經(jīng)元細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、骨細(xì)胞、或胰β-細(xì)胞。
47.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中所述的化學(xué)試劑具有選自結(jié)構(gòu)式(I)的結(jié)構(gòu) 其中A為-(CHR3)-或-(C＝O)-，B為-(CHR4)-或-(C＝O)-，D為-(CHR5)-或-(C＝O)-，E為-(ZR6)-或-(C＝O)-，G為-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W為-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y為氧或硫，X和Z獨立地為氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自獨立地選自氨基酸側(cè)鏈部分、氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物、或者分子的殘余部分、及其立體異構(gòu)體。
48.一種相對于β-聯(lián)蛋白/p300相互作用而選擇性地抑制β-聯(lián)蛋白/CBP相互作用的方法，所述方法包括向組合物中加入化合物，其中所述的組合物包括β-聯(lián)蛋白、CBP和p300，并且所述化合物相對于β-聯(lián)蛋白/p300相互作用而選擇性地抑制β-聯(lián)蛋白/CBP相互作用。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述的化合物具有選自結(jié)構(gòu)式(I)的結(jié)構(gòu) 其中A為-(CHR3)-或-(C＝O)-，B為-(CHR4)-或-(C＝O)-，D為-(CHR5)-或-(C＝O)-，E為-(ZR6)-或-(C＝O)-，G為-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W為-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y為氧或硫，X和Z獨立地為氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自獨立地選自氨基酸側(cè)鏈部分、氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物、或者分子的剩余部分、及其立體異構(gòu)體。
50.一種相對于β-聯(lián)蛋白/CBP相互作用而選擇性地抑制β-聯(lián)蛋白/p300相互作用的方法，所述方法包括向組合物中加入化合物，其中所述的組合物包括β-聯(lián)蛋白、CBP和p300，并且所述化合物相對于β-聯(lián)蛋白/CBP相互作用而選擇性地抑制β-聯(lián)蛋白/p300相互作用。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述的化合物具有選自結(jié)構(gòu)式(I)的結(jié)構(gòu) 其中A為-(CHR3)-或-(C＝O)-，B為-(CHR4)-或-(C＝O)-，D為-(CHR5)-或-(C＝O)-，E為-(ZR6)-或-(C＝O)-，G為-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W為-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y為氧或硫，X和Z獨立地為氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自獨立地選自氨基酸側(cè)鏈部分、氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物、或者分子的殘余部分、及其立體異構(gòu)體。
52.一種促進(jìn)β-聯(lián)蛋白從核易位至胞液的方法，所述方法包括向細(xì)胞中加入化合物，其中所述的細(xì)胞包括核和胞液，所述的核含有β-聯(lián)蛋白，并且所述化合物導(dǎo)致β-聯(lián)蛋白從核易位至胞液。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中所述的化合物具有選自結(jié)構(gòu)式(I)的結(jié)構(gòu) 其中A為-(CHR3)-或-(C＝O)-，B為-(CHR4)-或-(C＝O)-，D為-(CHR5)-或-(C＝O)-，E為-(ZR6)-或-(C＝O)-，G為-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W為-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y為氧或硫，X和Z獨立地為氮或CH，n＝O或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自獨立地選自氨基酸側(cè)鏈部分、氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物、或者分子的殘余部分、及其立體異構(gòu)體。
54.一種選擇性地抑制WNT/β-聯(lián)蛋白途徑靶向基因的表達(dá)的方法，所述方法包括向組合物中加入化合物，所述的組合物含有WNT/β-聯(lián)蛋白途徑靶向的基因，所述化合物導(dǎo)致WNT/β-聯(lián)蛋白途徑靶向基因的表達(dá)的變化。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中所述的化合物具有選自結(jié)構(gòu)式(I)的結(jié)構(gòu) 其中A為-(CHR3)-或-(C＝O)-，B為-(CHR4)-或-(C＝O)-，D為-(CHR5)-或-(C＝O)-，E為-(ZR6)-或-(C＝O)-，G為-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W為-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y為氧或硫，X和Z獨立地為氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自獨立地選自氨基酸側(cè)鏈部分、氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物、或者分子的殘余部分、及其立體異構(gòu)體。
56.一種將干細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)下的方法，所述方法包括使干細(xì)胞與抑制細(xì)胞分化或促進(jìn)細(xì)胞增殖的試劑相接觸，所述試劑的量對于將干細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)下是有效的。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中所述的試劑相對于β-聯(lián)蛋白/CBP相互作用而選擇性地抑制β-聯(lián)蛋白/p300相互作用。
58.一種鑒別β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑的方法，所述方法包括如下步驟(a)使假定的β-聯(lián)蛋白CBP小分子抑制劑與含CBP 1-111的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含β-聯(lián)蛋白的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制含步驟(b)的β-聯(lián)蛋白的部分與含步驟(a)的CBP 1-111的部分相結(jié)合；以及(d)當(dāng)確定步驟(a)的所述小分子抑制含CBP 1-111的所述部分與含β-聯(lián)蛋白的部分相結(jié)合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的抑制劑。
59.根據(jù)權(quán)利要求58的方法，其進(jìn)一步包括如下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑與含(1)含p300 1-111的部分和(2)β-聯(lián)蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制含p3001-111的所述部分與β-聯(lián)蛋白的結(jié)合；以及(g)當(dāng)確定步驟(e)的所述小分子并不抑制含p300 1-111的所述部分與所述β-聯(lián)蛋白相結(jié)合時，確認(rèn)所述的小分子是β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的選擇性抑制劑。
60.一種鑒別β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑的方法，所述方法包括如下步驟(a)使假定的β-聯(lián)蛋白CBP小分子抑制劑與含β-聯(lián)蛋白的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含CBP 1-111的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制含步驟(b)的CBP 1-111的部分與含步驟(a)的β-聯(lián)蛋白的部分相結(jié)合；(d)當(dāng)確定步驟(a)的所述小分子抑制含β-聯(lián)蛋白的所述部分與含CBP 1-111的部分相結(jié)合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的抑制劑。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑與含(1)含p300 1-111的部分和(2)β-聯(lián)蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制含p3001-111的所述部分與β-聯(lián)蛋白相結(jié)合；以及(g)當(dāng)確定步驟(e)的所述小分子并不抑制含p300 1-111的所述部分與所述β-聯(lián)蛋白相結(jié)合時，確認(rèn)所述的小分子是β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的選擇性抑制劑。
62.一種鑒別β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑的方法，所述方法包括如下步驟(a)使假定的β-聯(lián)蛋白CBP小分子抑制劑與含有(1)與CBP 1-111相結(jié)合的β-聯(lián)蛋白的部分相接觸；(b)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否使CBP 1-110從β-聯(lián)蛋白上分離；以及(c)當(dāng)確定步驟(a)的所述小分子使β-聯(lián)蛋白與CBP 1-111的結(jié)合分離時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的抑制劑。
63.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟(d)使步驟(c)鑒別的β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含p300 1-111的部分和(2)β-聯(lián)蛋白的混合物相接觸；(e)通過化驗手段確定步驟(d)的所述分子是否并不抑制含p3001-111的所述部分與β-聯(lián)蛋白相結(jié)合；以及(f)當(dāng)確定步驟(d)的所述小分子并不抑制含p300 1-111的所述部分與所述β-聯(lián)蛋白相結(jié)合時，確認(rèn)所述的小分子是β-聯(lián)蛋白CBP相互作用的選擇性抑制劑。
64.一種鑒別β-聯(lián)蛋白p300相互作用的小分子抑制劑的方法，所述方法包括如下步驟(a)使假定的β-聯(lián)蛋白CBP小分子抑制劑與含p300 1-111的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含β-聯(lián)蛋白的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制步驟(b)的含β-聯(lián)蛋白的部分與步驟(a)的含p300 1-111的部分相結(jié)合；以及(d)當(dāng)確定所述步驟(a)的小分子抑制含p300 1-111的所述部分與含β-聯(lián)蛋白的部分相結(jié)合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯(lián)蛋白p300相互作用的抑制劑。
65.根據(jù)權(quán)利要求64的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯(lián)蛋白p300相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-聯(lián)蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制含CBP1-111的所述部分與β-聯(lián)蛋白相結(jié)合；以及(g)當(dāng)確定步驟(e)的所述小分子并不抑制含CBP 1-111的所述部分與所述β-聯(lián)蛋白相結(jié)合時，確認(rèn)所述的小分子是β-聯(lián)蛋白p300相互作用的選擇性抑制劑。
66.一種鑒別β-聯(lián)蛋白p300相互作用的小分子抑制劑的方法，所述方法包括如下步驟(a)使假定的β-聯(lián)蛋白p300小分子抑制劑與含β-聯(lián)蛋白的部分相接觸；(b)使步驟(a)的混合物與含p300 1-111的部分相接觸；(c)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否抑制步驟(b)的含p300 1-111的部分與步驟(a)的含β-聯(lián)蛋白的部分相結(jié)合；(d)當(dāng)確定步驟(a)的所述小分子抑制含β-聯(lián)蛋白的所述部分與含p300 1-111部分相結(jié)合時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯(lián)蛋白p300相互作用的抑制劑。
67.根據(jù)權(quán)利要求66的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟(e)使步驟(d)鑒別的β-聯(lián)蛋白p300相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-聯(lián)蛋白的混合物相接觸；(f)通過化驗手段確定步驟(e)的所述分子是否并不抑制含CBP1-111的所述部分與β-聯(lián)蛋白相結(jié)合；以及(g)當(dāng)確定步驟(e)的所述小分子并不抑制含CBP 1-111的所述部分與所述β-聯(lián)蛋白相結(jié)合時，確認(rèn)所述的小分子是β-聯(lián)蛋白p300相互作用的選擇性抑制劑。
68.一種鑒別β-聯(lián)蛋白p300相互作用的小分子抑制劑的方法，所述方法包括如下步驟(a)使假定的β-聯(lián)蛋白p300小分子抑制劑與含有(1)與p3001-111結(jié)合的β-聯(lián)蛋白的部分相接觸；(b)通過化驗手段確定步驟(a)的所述分子是否使p300 1-111從β-聯(lián)蛋白上分離；以及(c)當(dāng)確定步驟(a)的所述小分子使β-聯(lián)蛋白與p300 1-111的結(jié)合分離時，將步驟(a)的小分子鑒別為β-聯(lián)蛋白p300相互作用的抑制劑。
69-根據(jù)權(quán)利要求68的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟(d)使步驟(c)鑒別的β-聯(lián)蛋白p300相互作用的小分子抑制劑與含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-聯(lián)蛋白的混合物相接觸；(e)通過化驗手段確定步驟(d)的所述分子是否并不抑制含CBP1-111的所述部分與β-聯(lián)蛋白相結(jié)合；以及(f)當(dāng)確定步驟(c)的所述小分子并不抑制含CBP 1-111的所述部分與所述β-聯(lián)蛋白相結(jié)合時，確認(rèn)所述的小分子是β-聯(lián)蛋白p300相互作用的選擇性抑制劑。
70.一種基本上提純和分離的核酸分子，其含有SEQ ID NO1或者與SEQ ID NO1的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼全長CBP蛋白。
71.根據(jù)權(quán)利要求70的核酸分子，其包含與SEQ ID NO1的同源性至少為90％的核苷酸序列。
72.根據(jù)權(quán)利要求70的核酸分子，其編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
73.根據(jù)權(quán)利要求70的核酸分子，其編碼含有CBP蛋白內(nèi)存在的不多于200個連續(xù)氨基酸殘基的肽。
74.根據(jù)權(quán)利要求70的核酸分子，其編碼含有CBP蛋白內(nèi)存在的不多于150個連續(xù)氨基酸殘基的肽。
75.根據(jù)權(quán)利要求74的核酸分子，其中所述的肽含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO5。
76.一種基本上提純和分離的核酸分子，其含有SEQ ID NO1的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼全長CBP蛋白。
77.根據(jù)權(quán)利要求76的核酸分子，其中所述的片段具有90-300個核酸。
78.根據(jù)權(quán)利要求76的核酸分子，其與所述片段的同源性至少為90％。
79.根據(jù)權(quán)利要求76的核酸分子，其中所述的片段編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
80.一種基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO2或者與SEQ ID NO2的同源性至少為80％的肽，附帶條件為所述的肽不是全長CBP蛋白。
81.根據(jù)權(quán)利要求80的肽，其與SEQ ID NO2的同源性至少為90％。
82.根據(jù)權(quán)利要求80的肽，其結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
83.根據(jù)權(quán)利要求80的肽，其含有CBP蛋白內(nèi)存在的不多于200個連續(xù)氨基酸殘基。
84.根據(jù)權(quán)利要求80的肽，其含有CBP蛋白內(nèi)存在的不多于150個連續(xù)氨基酸殘基。
85.根據(jù)權(quán)利要求84的肽，其含有SEQ ID NO2或4。
86.一種基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO2的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的肽不是全長CBP蛋白。
87.根據(jù)權(quán)利要求86的肽，其中所述的片段具有30-100個氨基酸。
88.根據(jù)權(quán)利要求86的肽，其與所述片段的同源性至少為90％。
89.根據(jù)權(quán)利要求86的肽，其中所述的肽結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
90.一種基本上提純和分離的核酸分子，其基本由SEQ ID NO1或者與SEQ ID NO1的同源性至少為80％的序列組成，附帶條件為所述的序列不編碼全長CBP蛋白。
91.根據(jù)權(quán)利要求90的核酸分子，其與SEQ ID NO1的同源性至少為90％。
92.根據(jù)權(quán)利要求90的核酸分子，其編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
93.一種基本上提純和分離的核酸分子，其基本由SEQ ID NO1的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。
94.根據(jù)權(quán)利要求93的核酸分子，其中所述的片段具有90-300個核苷酸。
95.根據(jù)權(quán)利要求93的核酸分子，其與所述片段的同源性至少為90％。
96.根據(jù)權(quán)利要求93的核酸分子，其中所述的片段編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
97.一種基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO2或者與SEQ ID NO2的同源性至少為80％的肽組成。
98.根據(jù)權(quán)利要求97的肽，其與SEQ ID NO2的同源性至少為90％。
99.根據(jù)權(quán)利要求97的肽，其結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
100.一種基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO2的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。
101.根據(jù)權(quán)利要求100的肽，其中所述的片段具有30-100個氨基酸。
102.根據(jù)權(quán)利要求100的肽，其與所述片段的同源性至少為90％。
103.根據(jù)權(quán)利要求100的肽，其中所述的肽結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
104.一種基本上提純和分離的核酸分子，其由SEQ ID NO1或者與SEQ ID NO1的同源性至少為80％的序列組成。
105.根據(jù)權(quán)利要求104的核酸分子，其與SEQ ID NO1的同源性至少為90％。
106.根據(jù)權(quán)利要求104的核酸分子，其編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
107.一種基本上提純和分離的核酸分子，其由SEQ ID NO1的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。
108.根據(jù)權(quán)利要求107的核酸分子，其中所述的片段具有90-300個核苷酸。
109.根據(jù)權(quán)利要求107的核酸分子，其與所述片段的同源性至少為90％。
110.根據(jù)權(quán)利要求107的核酸分子，其中所述的片段編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
111.一種基本上提純和分離的肽，其由SEQ ID NO2或者與SEQID NO2的同源性至少為80％的肽組成。
112.根據(jù)權(quán)利要求111的肽，其與SEQ ID NO2的同源性至少為90％。
113.根據(jù)權(quán)利要求111的肽，其結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
114.一種基本上提純和分離的肽，其由SEQ ID NO2的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。
115.根據(jù)權(quán)利要求114的肽，其中所述的片段具有30-100個氨基酸。
116.根據(jù)權(quán)利要求114的肽，其與所述片段的同源性至少為90％。
117.根據(jù)權(quán)利要求114的肽，其中所述的肽結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
118.一種基本上提純和分離的核酸分子，其含有SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼全長p300蛋白。
119.根據(jù)權(quán)利要求118的核酸分子，其與SEQ ID NO3的同源性至少為90％。
120.根據(jù)權(quán)利要求118的核酸分子，其編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
121.根據(jù)權(quán)利要求118的核酸分子，其編碼含有p300蛋白內(nèi)存在的不多于200個連續(xù)氨基酸殘基的肽。
122.根據(jù)權(quán)利要求118的核酸分子，其編碼含有p300蛋白內(nèi)存在的不多于150個連續(xù)氨基酸殘基的肽。
123.根據(jù)權(quán)利要求122的核酸分子，其中所述的肽含有SEQ IDNO4。
124.一種基本上提純和分離的核酸分子，其含有SEQ ID NO3的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的序列不編碼全長p300蛋白。
125.根據(jù)權(quán)利要求124的核酸分子，其中所述的片段具有90-300個核酸。
126.根據(jù)權(quán)利要求124的核酸分子，其與所述片段的同源性至少為90％。
127.根據(jù)權(quán)利要求124的核酸分子，其中所述的片段編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
128.一種基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO4或者與SEQ ID NO4的同源性至少為80％的肽，附帶條件為所述的肽不是全長p300蛋白。
129.根據(jù)權(quán)利要求128的肽，其與SEQ ID NO4的同源性至少為90％。
130.根據(jù)權(quán)利要求128的肽，其結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
131.根據(jù)權(quán)利要求128的肽，其含有p300蛋白內(nèi)存在的不多于200個連續(xù)氨基酸殘基。
132.根據(jù)權(quán)利要求128的肽，其含有p300蛋白內(nèi)存在的不多于150個連續(xù)氨基酸殘基。
133.根據(jù)權(quán)利要求132的肽，其含有SEQ ID NO4。
134.一種基本上提純和分離的肽，其含有SEQ ID NO4的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列，附帶條件為所述的肽不是全長p300蛋白。
135.根據(jù)權(quán)利要求134的肽，其中所述的片段具有30-100個氨基酸。
136.根據(jù)權(quán)利要求134的肽，其與所述片段的同源性至少為90％。
137.根據(jù)權(quán)利要求134的肽，其中所述的肽結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
138.一種基本上提純和分離的核酸分子，其基本由SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的同源性至少為80％的序列組成。
139.根據(jù)權(quán)利要求138的核酸分子，其與SEQ ID NO3的同源性至少為90％。
140.根據(jù)權(quán)利要求138的核酸分子，其編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
141.一種基本上提純和分離的核酸分子，其基本由SEQ ID NO3的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。
142.根據(jù)權(quán)利要求141的核酸分子，其中所述的片段具有90-300個核苷酸。
143.根據(jù)權(quán)利要求141的核酸分子，其與所述片段的同源性至少為90％。
144.根據(jù)權(quán)利要求141的核酸分子，其中所述的片段編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
145.一種基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO4或者與SEQ ID NO4的同源性至少為80％的肽組成。
146.根據(jù)權(quán)利要求145的肽，其與SEQ ID NO4的同源性至少為90％。
147.根據(jù)權(quán)利要求145的肽，其結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
148.一種基本上提純和分離的肽，其基本由SEQ ID NO4的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。
149.根據(jù)權(quán)利要求148的肽，其中所述的片段具有30-100個氨基酸。
150.根據(jù)權(quán)利要求148的肽，其與所述片段的同源性至少為90％。
151.根據(jù)權(quán)利要求148的肽，其中所述的肽結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
152.一種基本上提純和分離的核酸分子，其由SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的同源性至少為80％的序列組成。
153.根據(jù)權(quán)利要求152的核酸分子，其與SEQ ID NO3的同源性至少為90％。
154.根據(jù)權(quán)利要求152的核酸分子，其編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
155.一種基本上提純和分離的核酸分子，其由SEQ ID NO3的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。
156.根據(jù)權(quán)利要求155的核酸分子，其中所述的片段具有90-300個核苷酸。
157.根據(jù)權(quán)利要求155的核酸分子，其與所述片段的同源性至少為90％。
158.根據(jù)權(quán)利要求155的核酸分子，其中所述的片段編碼結(jié)合β-聯(lián)蛋白的肽。
159.一種基本上提純和分離的肽，其由SEQ ID NO4或者與SEQID NO4的同源性至少為80％的肽組成。
160.根據(jù)權(quán)利要求159的肽，其與SEQ ID NO4的同源性至少為90％。
161.根據(jù)權(quán)利要求159的肽，其結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
162.一種基本上提純和分離的肽，其由SEQ ID NO4的片段或者與所述片段的同源性至少為80％的序列組成。
163.根據(jù)權(quán)利要求162的肽，其中所述的片段具有30-100個氨基酸。
164.根據(jù)權(quán)利要求162的肽，其與所述片段的同源性至少為90％。
165.根據(jù)權(quán)利要求162的肽，其中所述的肽結(jié)合β-聯(lián)蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供調(diào)節(jié)由β－聯(lián)蛋白/TCF激活的轉(zhuǎn)錄的化合物和方法，例如，選擇性抑制Wnt/β－聯(lián)蛋白途徑靶向的基因。
文檔編號C12N5/08GK1871239SQ200480030688
公開日2006年11月29日 申請日期2004年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月28日
發(fā)明者M·卡恩, 吳世雄, 金大訓(xùn), 河鐘烈, K·霍賈特－埃馬米 申請人:(株)中外制藥