專利名稱：從脂肪組織制備干細(xì)胞的方法和系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從吸脂所得抽取物制備干細(xì)胞的方法或系統(tǒng)，以及用該方法或系統(tǒng)制備的干細(xì)胞和所述干細(xì)胞的用途。
背景技術(shù)：
主要利用干細(xì)胞的再生藥物近年來取得了可觀的進(jìn)步。以前認(rèn)為不存在的各種組織干細(xì)胞已被發(fā)現(xiàn)并在各種組織中得以鑒定。因而使用再生療法治療疾病已受到關(guān)注。
但是，再生療法還無法達(dá)到常規(guī)應(yīng)用于大量患有器官或組織功能障礙的患者的程度。到目前為止，只有非常有限數(shù)目的這類患者曾通過器官移植或使用輔助醫(yī)療系統(tǒng)或裝置治療。考慮到供應(yīng)者缺乏、排斥、感染、耐久性等方面，這些療法存在問題。具體而言，供應(yīng)者缺乏引發(fā)了嚴(yán)重的問題。就骨髓移植來說，盡管仍然難以為需要的許多患者提供有限數(shù)量的樣本，骨髓及臍帶血庫在國內(nèi)外已經(jīng)逐步變得更廣泛應(yīng)用。因此，為克服上述的問題，對使用干細(xì)胞的療法及再生藥物的需求持續(xù)上升。使用外來組織進(jìn)行器官移植(如心臟、血管等)的主要障礙在于免疫排斥反應(yīng)。同種異體移植物(或異體移植物)及異種移植物中發(fā)生的變化是公知的。
原腸胚形成后受精卵分裂成三個(gè)胚層，即內(nèi)胚層、中胚層和外胚層。來源于外胚層的細(xì)胞主要存在于腦內(nèi)，包括神經(jīng)干細(xì)胞等。來源于中胚層的細(xì)胞主要存在于骨髓內(nèi)，包括血管干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等。來源于內(nèi)胚層的細(xì)胞主要存在于器官中，包括肝臟干細(xì)胞、胰臟干細(xì)胞等。
間充質(zhì)細(xì)胞如脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、韌帶細(xì)胞、心肌細(xì)胞等具有形成身體形體或骨骼的重要功能。因此，日益期望將成組的這些細(xì)胞或此類細(xì)胞的組織應(yīng)用于再生藥物及移植藥物。具體而言，已有報(bào)道表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化成中胚層器官，而且此類干細(xì)胞已經(jīng)主要在再生藥物領(lǐng)域引起關(guān)注。但是，此類細(xì)胞的分化需要特殊的條件，需要含分化誘導(dǎo)劑(如地塞米松等)的特殊培養(yǎng)基(Nakatsuji，ed.，“Kansaibo·Kuron Kenkyu Purotokoru[Stem cell/Clone Research Protocol]”，Yodosha(2001))。
間充質(zhì)干細(xì)胞是一種組織干細(xì)胞。只有小量間充質(zhì)干細(xì)胞天然存在(占人類新生兒骨髓中所有細(xì)胞的萬分之一，之后迅速減少，在老年人中占所有細(xì)胞的二百萬分之一)。因此難以分離間充質(zhì)干細(xì)胞。由于已有報(bào)道表明間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化成除中胚層之外的胚層，其應(yīng)用范圍更寬了。但是，此類分化的條件比上述的條件更特殊。間充質(zhì)干細(xì)胞的已知表面抗原是CD105(+)、CD73(+)、CD29(+)、CD44(+)、CD14(-)、CD34(-)和CD45(-)。
分離間充質(zhì)干細(xì)胞需要很高的成本。另外，獲取骨髓細(xì)胞通常會使供應(yīng)者痛苦。而且，如果沒有必須使用的特別選定批次的誘導(dǎo)分化血清，這些細(xì)胞很難培養(yǎng)，從而增加使用此類干細(xì)胞的額外成本和勞動(dòng)。
另一方面，已發(fā)現(xiàn)脂肪含有干細(xì)胞(WO00/53795、WO03/022988、WO01/62901；Zuk，P.A.，et al.，Tissue Engineering，Vol.7，211-228，2001；Zuk，P.A.，et al.，MolecularBiology of the Cell，Vol.13，4279-4295，2002)。與其他組織(如骨髓等)相比，從脂肪可以獲得大量干細(xì)胞，而且干細(xì)胞的密度看起來也更高。因此，脂肪已受到關(guān)注。用于從脂肪組織制備干細(xì)胞的現(xiàn)有方法(日本PCT國家階段公開No.2003-523267及日本PCT國家階段公開No.2002-537849)在可用性方面比使用骨髓作為細(xì)胞來源時(shí)有優(yōu)勢，可以獲得更多的量。但是，所述方法需要用膠原酶之類的酶對作為細(xì)胞來源的脂肪組織進(jìn)行處理，因而不可能簡單而大量地制備干細(xì)胞。考慮到干細(xì)胞及前體細(xì)胞在再生藥物中的應(yīng)用，現(xiàn)在仍然需要一種簡單而大量地制備同種干細(xì)胞及前體細(xì)胞的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供以簡單而高效的方式從人(特別是受試者本身)大量制備同種干細(xì)胞和/或前體細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供使用本發(fā)明干細(xì)胞和/或前體細(xì)胞大量制備組織植入物或移植物的方法。
本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)吸脂所得抽取物中含有大量干細(xì)胞，并且建立了從此類吸脂所得抽取物制備干細(xì)胞的方法，從而實(shí)現(xiàn)了上述目的。
因此，本發(fā)明提供了下述內(nèi)容1.一種制備干細(xì)胞的方法，包括A)獲得吸脂所得抽取物；B)將吸脂所得抽取物離心以獲得細(xì)胞級分；C)將細(xì)胞級分進(jìn)行比重離心；以及D)收集比重小于紅細(xì)胞的細(xì)胞層。
2.根據(jù)第1項(xiàng)的方法，其中所述吸脂所得抽取物用鹽水或林格氏溶液制備。
3.根據(jù)第1項(xiàng)的方法，其中所述離心以等于或小于800×g的速度進(jìn)行。
4.根據(jù)第1項(xiàng)的方法，其中所述離心以等于或小于400×g的速度進(jìn)行。
5.根據(jù)第1項(xiàng)的方法，其中所述比重離心以370×g-1,100×g范圍的速度進(jìn)行。
6.根據(jù)第1項(xiàng)的方法，其中所述比重離心在20攝氏度下使用比重為1.076～1.078g/ml的介質(zhì)進(jìn)行。
7.根據(jù)第1項(xiàng)的方法，其中所述比重離心的所述介質(zhì)選自Ficoll、Percoll和蔗糖。
8.根據(jù)第7項(xiàng)的方法，其中所述比重離心介質(zhì)為Ficoll。
9.根據(jù)第1項(xiàng)的方法，其中所收集細(xì)胞層的比重在1.050～1.075之間。
10.根據(jù)第1項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞層的收集用移液器進(jìn)行。
11.根據(jù)第1項(xiàng)的方法，還包括將所述細(xì)胞層在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟，該培養(yǎng)基含有選自DMEM、M199、MEM、HBSS、Ham’s F12、BME、RPMI1640、MCDB104、MCDB153(KGM)及其混合物的組分。
12.根據(jù)第1項(xiàng)的方法，其中所述比重離心包括密度梯度離心。
13.根據(jù)第1項(xiàng)的方法，還包括除去血細(xì)胞的步驟。
14.一種制備干細(xì)胞的方法，包括A)獲得吸脂所得材料；和B)將吸脂所得材料離心以獲得細(xì)胞級分，而不分離脂肪組織。
15.根據(jù)第14項(xiàng)的方法，還包括將所述材料置于至少一部分細(xì)胞脫離所述材料的條件下。
16.根據(jù)第15項(xiàng)的方法，其中所述條件用于細(xì)胞外基質(zhì)的降解。
17.根據(jù)第15項(xiàng)的方法，所述細(xì)胞外基質(zhì)降解通過膠原酶實(shí)現(xiàn)。
18.根據(jù)第14項(xiàng)的方法，還包括除去步驟B)中上清液的步驟。
19.根據(jù)第14項(xiàng)的方法，還包括過濾步驟B)所得材料的步驟。
20.根據(jù)第14項(xiàng)的方法，還包括除去血細(xì)胞的步驟。
21.根據(jù)第14項(xiàng)的方法，其中除去血細(xì)胞的步驟包括加入降解血細(xì)胞的組分。
22.一種制備干細(xì)胞的方法，包括i)獲得吸脂所得材料；ii)將所述材料置于至少一部分細(xì)胞脫離所述材料的條件下，而不分離脂肪組織；iii)將所述材料進(jìn)行離心；iv)向所述材料加入降解血細(xì)胞的組分并攪拌所述材料；v)將所述材料進(jìn)行離心以獲得沉淀；以及vi)從所述沉淀抽取材料的上清液。
23.根據(jù)第22項(xiàng)的方法，其中將材料置于所述條件的步驟包括維持吸脂所得抽取物。
24.根據(jù)第22項(xiàng)的方法，其中所述吸脂所得材料包含吸脂所得抽取物和脂肪。
25.根據(jù)第22項(xiàng)的方法，其中所述步驟ii)中所述條件包括加入膠原酶。
26.根據(jù)第22項(xiàng)的方法，其中所述步驟iii)的離心以400～1200×g進(jìn)行。
27.根據(jù)第22項(xiàng)的方法，其中所述降解血細(xì)胞的組分包含氯化銨和碳酸氫鉀。
28.根據(jù)第27項(xiàng)的方法，其中所述氯化銨在組分中的含量為155mM。
29.根據(jù)第27項(xiàng)的方法，其中所述碳酸氫鉀在組分中的含量為10mM。
30.根據(jù)第22項(xiàng)的方法，其中所述步驟v)的所述離心以400～1200×g進(jìn)行。
31.根據(jù)第22項(xiàng)的方法，其中所述沉淀含有干細(xì)胞。
32.根據(jù)第1～31項(xiàng)中任一項(xiàng)所述方法制備的干細(xì)胞。
33.根據(jù)第32項(xiàng)的干細(xì)胞，其表達(dá)選自CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和SH3的至少一種蛋白質(zhì)。
34.根據(jù)第33項(xiàng)的干細(xì)胞，其表達(dá)CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和SH3。
35.根據(jù)第33項(xiàng)的干細(xì)胞，還表達(dá)選自CD31、CD45、CD117和CD146的至少一種蛋白質(zhì)。
36.根據(jù)第32項(xiàng)的干細(xì)胞，不表達(dá)CD56。
37.根據(jù)第32項(xiàng)的干細(xì)胞，不表達(dá)選自CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144的至少一種蛋白質(zhì)。
38.根據(jù)第37項(xiàng)的干細(xì)胞，不表達(dá)CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144。
39.根據(jù)第32項(xiàng)的干細(xì)胞，表達(dá)CD49d，而不表達(dá)CD56。
40.一種制備干細(xì)胞的系統(tǒng)，包含A)獲得吸脂所得抽取物的裝置；B)將吸脂所得抽取物進(jìn)行離心以獲得細(xì)胞級分的裝置；以及C)將所述細(xì)胞級分進(jìn)行比重離心的裝置。
41.根據(jù)第40項(xiàng)的系統(tǒng)，其中該系統(tǒng)還包含D)收集比重小于紅細(xì)胞的細(xì)胞層的裝置。
42.一種制備干細(xì)胞的系統(tǒng)，包含A)獲得吸脂所得材料的裝置；以及B)將所述吸脂所得材料進(jìn)行離心以獲得細(xì)胞級分而不分離脂肪組織的裝置。
43.一種制備干細(xì)胞的系統(tǒng)，包含i)獲得吸脂所得材料的裝置；ii)將所述材料置于不分離脂肪組織而使至少一部分細(xì)胞脫離所述材料的條件下的裝置；iii)將所述材料進(jìn)行離心的裝置；
iv)向所述材料加入降解血細(xì)胞的組分并攪拌所述材料；v)將所述材料進(jìn)行離心以獲得沉淀的裝置；以及vi)從所述沉淀抽取材料上清液的裝置。
44.一種獲取外植體的方法，包括A)獲得吸脂所得抽取物；B)將所述吸脂所得抽取物進(jìn)行離心以獲得細(xì)胞級分；C)將所述細(xì)胞級分進(jìn)行比重離心；D)收集比重小于紅細(xì)胞的細(xì)胞層；E)培養(yǎng)所收集的細(xì)胞層以獲得外植體。
45.一種制備組織移植物的方法，包括A)獲得吸脂所得抽取物；B)將所述吸脂所得抽取物進(jìn)行離心以獲得細(xì)胞級分；以及C)培養(yǎng)所收集的細(xì)胞層以獲得組織移植物。
46.一種制備組織移植物的方法，包括A)獲得吸脂所得抽取物；B)將所述吸脂所得抽取物進(jìn)行離心以獲得細(xì)胞級分；C)將所述細(xì)胞級分進(jìn)行比重離心；D)收集比重小于紅細(xì)胞的細(xì)胞層；E)培養(yǎng)所收集的細(xì)胞層以獲得組織移植物。
47.一種移植組織移植物的方法，包括A)獲得吸脂所得抽取物；B)將所述吸脂所得抽取物進(jìn)行離心以獲得細(xì)胞級分；C)將所述細(xì)胞級分進(jìn)行比重離心；D)收集比重小于紅細(xì)胞的細(xì)胞層；E)培養(yǎng)所收集的細(xì)胞層以獲得組織移植物；以及F)移植所述組織移植物。
48.吸脂所得抽取物在制備干細(xì)胞中的用途。
49.一種制備細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞選自血管內(nèi)皮前體細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和肌細(xì)胞，該方法包括培養(yǎng)根據(jù)第1～31項(xiàng)中任一項(xiàng)所述方法所得干細(xì)胞的步驟。
50.一種制備分化細(xì)胞的方法，包括A)將下列a)和b)混合得到混合物a)根據(jù)第1～31項(xiàng)中任一項(xiàng)所得的干細(xì)胞，b)對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞；以及B)將所述混合物在使得脂肪組織來源的前體細(xì)胞分化的充分條件下培養(yǎng)。
51.根據(jù)第50項(xiàng)的方法，其中所述分化細(xì)胞為間充質(zhì)細(xì)胞。
52.根據(jù)第50項(xiàng)的方法，其中所述分化細(xì)胞選自脂肪細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞和胰細(xì)胞。
53.根據(jù)第50項(xiàng)的方法，還包括向所述分化細(xì)胞提供促進(jìn)分化的因子的步驟。
54.根據(jù)第50項(xiàng)的方法，其中所述混合物在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有選自下列的至少一種成分腎上腺皮質(zhì)類固醇、胰島素、葡萄糖、吲哚美辛、異丁基-甲基黃嘌呤(IBMX)、抗壞血酸及其衍生物、甘油磷酸、雌激素及其衍生物、孕酮及其衍生物、雄激素及其衍生物、生長因子、垂體腺提取物、松果體提取物、視黃酸、維生素D、甲狀腺激素、胎牛血清、馬血清、人血清、肝素、碳酸氫鈉、HEPES、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒酸鹽、亞油酸、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、去甲基試劑、組蛋白去乙?；噭⒒罨?、細(xì)胞因子、六亞甲基雙乙酰胺(HMBA)、二甲基乙酰胺(DMA)、二丁基cAMP(dbcAMP)、二甲基亞砜(DMSO)、碘脫氧尿苷(IdU)、羥基脲(hyroxyurea，HU)、阿糖胞苷(AraC)、絲裂霉素C(MMC)、丁酸鈉(NaBu)、凝聚胺(polybrene)及硒。
55.一種細(xì)胞混合物，包括根據(jù)第1～31項(xiàng)中任一項(xiàng)所得的干細(xì)胞和對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞。
56.根據(jù)第55項(xiàng)的細(xì)胞混合物，其中所述細(xì)胞混合物置于足以誘導(dǎo)所述干細(xì)胞分化的條件下。
57.一種用于細(xì)胞移植的組合物，包含a)根據(jù)第1～31項(xiàng)中任一項(xiàng)所得的干細(xì)胞；和b)對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞。
58.根據(jù)第57項(xiàng)的組合物，其中所述移植在期望部位進(jìn)行。
59.根據(jù)第57項(xiàng)的組合物，其中所述干細(xì)胞和所述分化細(xì)胞的比例為約1∶10～約10∶1。
60.根據(jù)第57項(xiàng)的組合物，其中所述干細(xì)胞和所述分化細(xì)胞的比例為約1∶2～約2∶1。
61.根據(jù)第57項(xiàng)的組合物，其中所述干細(xì)胞和所述分化細(xì)胞的比例基本相同。
62.根據(jù)第57項(xiàng)的組合物，其中所述分化細(xì)胞包括間充質(zhì)細(xì)胞。
63.根據(jù)第57項(xiàng)的組合物，其中所述分化細(xì)胞選自脂肪細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞和胰細(xì)胞。
64.根據(jù)第57項(xiàng)的組合物，還包含選自下列成分的至少一種成分腎上腺皮質(zhì)類固醇、胰島素、葡萄糖、吲哚美辛、異丁基-甲基黃嘌呤(IBMX)、抗壞血酸及其衍生物、甘油磷酸、雌激素及其衍生物、孕酮及其衍生物、雄激素及其衍生物、生長因子、垂體腺提取物、松果體提取物、視黃酸、維生素D、甲狀腺激素、胎牛血清、馬血清、人血清、肝素、碳酸氫鈉、HEPES、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒酸鹽、亞油酸、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、去甲基試劑、組蛋白去乙酰基試劑、活化素、細(xì)胞因子、六亞甲基雙乙酰胺(HMBA)、二甲基乙酰胺(DMA)、二丁基cAMP(dbcAMP)、二甲基亞砜(DMSO)、碘脫氧尿苷(IdU)、羥基脲(HU)、阿糖胞苷(AraC)、絲裂霉素C(MMC)、丁酸鈉(NaBu)、凝聚胺及硒。
65.根據(jù)第57項(xiàng)的組合物，其中所述干細(xì)胞和分化細(xì)胞是同種異體的。
66.根據(jù)第57項(xiàng)的組合物，其中所述干細(xì)胞和分化細(xì)胞是同基因的。
67.一種治療或預(yù)防與分化細(xì)胞衰竭相關(guān)的疾病、障礙或異常狀況的方法，包括A)提供一種組合物，其包含a)根據(jù)第1～31項(xiàng)中任一項(xiàng)所得的干細(xì)胞；和b)對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞；以及
B)將該組合物施用于受試者。
68.一種治療或預(yù)防因分化細(xì)胞缺陷所致疾病、障礙或異常狀況的藥物，其包含a)根據(jù)第1～31項(xiàng)中任一項(xiàng)所得的干細(xì)胞；b)對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞；和c)藥學(xué)上可接受的載體。
69.由a)根據(jù)第1～31項(xiàng)中任一項(xiàng)所得的干細(xì)胞和b)對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞所組成的混合物用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療或預(yù)防因分化細(xì)胞缺陷所致的疾病、障礙或異常狀況。
70.一種治療或改善美容狀況的方法，包括A)提供一種組合物，其包含a)根據(jù)第1～26項(xiàng)中任一項(xiàng)所得的干細(xì)胞；和b)對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞；以及B)將該組合物施用于受試者。
71.一種治療或改善美容狀況的藥物，其包含a)根據(jù)第1～31項(xiàng)中任一項(xiàng)所得的干細(xì)胞；b)對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞；和c)藥學(xué)上可接受的載體。
72.由a)根據(jù)第1～31項(xiàng)中任一項(xiàng)所得的干細(xì)胞和b)對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞所組成的混合物用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療或改善美容狀況。
發(fā)明效果本發(fā)明提供了以簡單而高效的方式從人(特別是受試者本身)大量制備同種干細(xì)胞和/或前體細(xì)胞的方法。
本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明干細(xì)胞和/或前體細(xì)胞大量制備組織植入物或移植物的方法。
本發(fā)明還提供了干細(xì)胞、前體細(xì)胞、使用所述細(xì)胞制備的組織、器官。
本發(fā)明提供了以比常規(guī)方法更簡單而高效的方式從脂肪制備干細(xì)胞的新方法。本發(fā)明的方法通過利用來自脂肪組織的抽取物而獲得了提供大體積/量干細(xì)胞的顯著效果。
下文中本發(fā)明將以優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將可以理解，根據(jù)本說明書的說明及本領(lǐng)域內(nèi)的常用技術(shù)，本發(fā)明的實(shí)施例可以適當(dāng)進(jìn)行或?qū)嵤１绢I(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地認(rèn)識到本發(fā)明的作用和效果。


圖1為顯示根據(jù)本發(fā)明制備、來源于吸脂所得抽取物液體部分的干細(xì)胞的照片。
圖2為顯示通過培養(yǎng)干細(xì)胞而誘導(dǎo)的分化細(xì)胞的照片，所述干細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明制備并在脂肪形成DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
圖3為顯示通過培養(yǎng)干細(xì)胞而誘導(dǎo)的分化細(xì)胞經(jīng)油紅-O(OilRed-O)染色后的照片，所述干細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明制備并在脂肪形成DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
圖4為顯示通過培養(yǎng)干細(xì)胞而誘導(dǎo)的分化細(xì)胞的照片，所述干細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明制備并在軟骨形成DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
圖5為顯示通過培養(yǎng)干細(xì)胞而誘導(dǎo)的分化細(xì)胞經(jīng)阿辛藍(lán)(Alcian blue)染色后的照片，所述干細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明制備并在軟骨形成DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
圖6顯示干細(xì)胞的生長曲線，所述干細(xì)胞由吸脂所得材料未經(jīng)除去紅細(xì)胞而制備。
圖7～圖10為顯示干細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基(圖7＝第一輪，第6、8、10和第12天；圖8＝第二輪，第3、5、7和第9天)和M199培養(yǎng)基(圖9＝第一輪，第6、8、10和第12天；圖10＝第二輪，第3、5、7和第9天)中生長的照片，所述干細(xì)胞由吸脂所得材料不經(jīng)除去紅細(xì)胞而制備。
圖11～圖26顯示不同培養(yǎng)條件下的照片。下表列出了培養(yǎng)條件、培養(yǎng)天數(shù)、放大倍數(shù)、誘導(dǎo)/對照和培養(yǎng)/種植。最右一欄中，術(shù)語“誘導(dǎo)”指細(xì)胞置于分化條件下，術(shù)語“對照”指細(xì)胞置于非分化條件下。在第5欄中，術(shù)語“培養(yǎng)”指種植后培養(yǎng)10天才開始誘導(dǎo)的條件，而術(shù)語“種植”指開始誘導(dǎo)前不進(jìn)行培養(yǎng)的條件。
表附例

根據(jù)本發(fā)明制備的細(xì)胞種植于60mm培養(yǎng)皿上，種植密度為1.8×107細(xì)胞/皿。在兩組中進(jìn)行誘導(dǎo)。其中一組在培養(yǎng)10天后用各分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(脂肪細(xì)胞分化、軟骨細(xì)胞分化及骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基)替換掉原始培養(yǎng)基(此處也稱“培養(yǎng)”)。另外一組在開始誘導(dǎo)前不進(jìn)行培養(yǎng)(此處也稱“種植”)。誘導(dǎo)后用油紅O評估脂肪細(xì)胞，用阿辛藍(lán)評估軟骨細(xì)胞，用馮科薩(von Kossa)染色劑評估骨細(xì)胞。
從這些附圖及閱讀其詳細(xì)說明將使本發(fā)明的這些優(yōu)勢及其他優(yōu)勢顯而易見。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式本發(fā)明將在下文加以說明。應(yīng)該理解，除非明確地特別指出，單數(shù)形式的冠詞(如英文“a”、“an”、“the”等等)包括其復(fù)數(shù)含義。也應(yīng)該理解，除非另外特指，本文所用術(shù)語具有本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)使用的定義。同樣地，本文中術(shù)語“一個(gè)”、“一個(gè)或多個(gè)”及“至少一個(gè)”可以互換使用。同樣應(yīng)注意的是術(shù)語“包含”、“包括”及“具有”可以互換使用。而且，“選自...”的化合物指隨后列舉的一種或多種化合物，包括兩種或多種這些化合物的混合物(即組合)。同樣也應(yīng)該理解，除非另外特指，本文所用術(shù)語具有本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)使用的定義。因此，本文所用的技術(shù)及科學(xué)術(shù)語具有與相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)所理解相同的含義。否則，以本申請(包括定義)為準(zhǔn)。
(術(shù)語定義)本文所用具體術(shù)語定義如下。
本文中術(shù)語“細(xì)胞”采用本領(lǐng)域內(nèi)的最寬的含義，指多細(xì)胞生物的組織的結(jié)構(gòu)單位，其可以自我復(fù)制，含有遺傳信息及表達(dá)該信息的機(jī)構(gòu)，而且外面包有一層膜結(jié)構(gòu)將活體如細(xì)胞與外界隔離開來。本發(fā)明的方法中任意細(xì)胞均可用作受試物。本發(fā)明所用的細(xì)胞數(shù)量可以用光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)。使用光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)時(shí)，計(jì)數(shù)細(xì)胞核的個(gè)數(shù)。將組織切成組織切片，然后用蘇木精-伊紅(HE)染色，以區(qū)分核與細(xì)胞外基質(zhì)(如彈性蛋白或膠原)。將這些組織切片置光學(xué)顯微鏡下觀察，可以用一特定區(qū)域(如200μm×200μm)內(nèi)的胞核數(shù)來估計(jì)細(xì)胞的數(shù)量。本文所用的細(xì)胞可以是天然存在的細(xì)胞或是人工修飾的細(xì)胞(如融合細(xì)胞、遺傳修飾細(xì)胞等)。細(xì)胞來源的實(shí)例包括但不限于單細(xì)胞培養(yǎng)物；正常生長轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胚胎、血液或身體組織(如脂肪或脂肪組織)；來源于正常生長細(xì)胞系的細(xì)胞的細(xì)胞混合物，等等。此類供應(yīng)來源本身可用作細(xì)胞。
本發(fā)明中所用的脂肪細(xì)胞及其相應(yīng)材料可來源于任意生物(如盲鰻目、Petronyzoniformes、軟骨魚綱、硬骨魚綱、兩棲綱、爬行綱、鳥綱、哺乳綱等)，更優(yōu)選哺乳動(dòng)物(如單孔目、有袋目、貧齒目、皮翼目、翼手目、食肉目、食蟲目、長鼻目、奇蹄目、偶蹄目、管齒目、鱗甲目、海牛目、鯨目、靈長目、嚙齒目、兔形目等)，只要該生物含有脂肪細(xì)胞或與其相應(yīng)細(xì)胞即可。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用來源于靈長類(如猩猩、日本猴、人類等)的細(xì)胞。最優(yōu)選使用來源于人的細(xì)胞，但本發(fā)明不局限于此。
本文中術(shù)語“干細(xì)胞”指分化細(xì)胞的前體(或祖先)，其具有單潛能性、多潛能性或全能性。干細(xì)胞可對特定刺激進(jìn)行應(yīng)答而分化。典型地，干細(xì)胞可以再生受損傷的組織。本文中所用干細(xì)胞可以是但不限于胚胎干細(xì)胞(ES)、組織干細(xì)胞(也稱為組織的干細(xì)胞、組織特異性干細(xì)胞或軀體干細(xì)胞)或其他前體細(xì)胞。干細(xì)胞可以是人工產(chǎn)生的細(xì)胞(如本文所使用的融合細(xì)胞、重編程的細(xì)胞(reprogrammed cell)等)，只要其具有上述的能力即可。胚胎干細(xì)胞是來源于早期胚胎的多潛能干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞最早于1981年建立，自1989年以來已應(yīng)用于敲除小鼠的制備。1998年建立了人胚胎干細(xì)胞，目前正變得可用于再生藥物。與胚胎干細(xì)胞不同，組織干細(xì)胞的分化水平相對有限。組織干細(xì)胞存在于組織中，具有未分化的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。組織干細(xì)胞具有更高的核/胞漿比率和更少的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器。大部分組織干細(xì)胞具有多潛能性、長細(xì)胞周期及超過個(gè)體生命期的增殖能力。本文中干細(xì)胞可優(yōu)選為胚胎干細(xì)胞，但根據(jù)具體情況也可以使用組織干細(xì)胞。
組織干細(xì)胞根據(jù)其來源的部位如皮膚系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、骨髓系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等可以分成不同類別。皮膚系統(tǒng)中的組織干細(xì)胞包括表皮干細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞等。消化系統(tǒng)中的組織干細(xì)胞包括胰臟(普通)干細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞等。骨髓系統(tǒng)中的組織干細(xì)胞包括造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等。神經(jīng)系統(tǒng)中的組織干細(xì)胞包括神經(jīng)干細(xì)胞、視網(wǎng)膜干細(xì)胞等。
本文中“前體細(xì)胞”指對應(yīng)于不具有分化特性的未分化親代細(xì)胞的細(xì)胞，其后代細(xì)胞已知具有特定的分化特性，不僅包括多潛能未分化細(xì)胞，也包括單潛能未分化細(xì)胞。例如，當(dāng)后代細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，前體細(xì)胞為血管內(nèi)皮前體細(xì)胞。本文中術(shù)語“干細(xì)胞”包括前體細(xì)胞。但是，干細(xì)胞分化得到的前體細(xì)胞對于所述干細(xì)胞來說對應(yīng)于“分化細(xì)胞”。術(shù)語“PLA(處理后的脂肪抽取物細(xì)胞(processed lipoaspiratecell))”指從吸脂所得抽取物脂肪部分(脂肪抽取物)所得到的前體細(xì)胞。來源于吸脂所得抽取物液體部分的前體細(xì)胞可稱為“液體抽取物細(xì)胞”或“LAF”。脂肪來源的前體細(xì)胞包括PLA細(xì)胞和液體抽取物細(xì)胞。
本文中術(shù)語“脂肪來源前體細(xì)胞”指通過吸脂獲得的干細(xì)胞及其他前體細(xì)胞，如來源于外周血的干細(xì)胞或血管基質(zhì)細(xì)胞(前脂肪細(xì)胞)。脂肪來源前體細(xì)胞指來源于脂肪組織或通過吸脂過程獲得的任意多潛能或單潛能細(xì)胞群。這樣的細(xì)胞包括脂肪來源血管基質(zhì)細(xì)胞(＝前脂肪細(xì)胞、脂肪來源間質(zhì)細(xì)胞)、脂肪來源干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、造血干細(xì)胞，等等。分離此類干細(xì)胞的一些技術(shù)是已知的，例如可見Nakatsuji，ed.，“Kansaibo Kuron Kenkyu Purotokoru[Stem cell/Clone researchProtocol]”，Yodosha(2001)；WO00/53795；WO03/022988和WO01/62901所述。在此將這些文獻(xiàn)相關(guān)部分引入作為參考。本文中術(shù)語“脂肪來源前體細(xì)胞”指所有脂肪來源的干細(xì)胞，包括用已知分離方法得到的脂肪組織來源干細(xì)胞。本文中術(shù)語“前體細(xì)胞”不僅包括多潛能未分化細(xì)胞，也包括單潛能未分化細(xì)胞。本文中術(shù)語“干細(xì)胞”包括前體細(xì)胞。術(shù)語“PLA(處理后的脂肪抽取物細(xì)胞)”指從吸脂所得抽取物脂肪部分(脂肪抽取物)所得到的前體細(xì)胞。來源于吸脂所得抽取物液體部分的前體細(xì)胞可稱為“液體抽取物細(xì)胞”或“LAF”。脂肪來源的前體細(xì)胞包括PLA細(xì)胞和液體抽取物細(xì)胞。
本文中術(shù)語“體細(xì)胞”指除生殖細(xì)胞如卵細(xì)胞、精子等以外的任意細(xì)胞，其不將DNA傳給下一代。典型地，體細(xì)胞沒有多潛能性或潛能性有限。本文所用體細(xì)胞可以是天然存在或遺傳修飾的細(xì)胞，只要其能達(dá)到預(yù)期治療目的即可。
本文中術(shù)語“分化細(xì)胞”指具有特化功能和形態(tài)的細(xì)胞(如肌細(xì)胞、神經(jīng)元等)。與干細(xì)胞不同，分化細(xì)胞沒有或只有很少多潛能性。分化細(xì)胞的實(shí)例包括表皮細(xì)胞、胰腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞、胰管細(xì)胞、肝細(xì)胞、血細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨骼肌成肌細(xì)胞、神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞、色素細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞，等等。本發(fā)明中所用的分化細(xì)胞可以是細(xì)胞群或組織的形式。
細(xì)胞的起源分為外胚層、內(nèi)胚層或中胚層。外胚層起源的干細(xì)胞大部分存在于腦內(nèi)，包括神經(jīng)干細(xì)胞。內(nèi)胚層起源的干細(xì)胞大部分存在于骨髓內(nèi)，包括血管干細(xì)胞及其分化細(xì)胞、造血干細(xì)胞及其分化細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞及其分化細(xì)胞等。中胚層起源的干細(xì)胞大部分存在于器官內(nèi)，包括肝臟干細(xì)胞及其分化細(xì)胞、胰臟干細(xì)胞及其分化細(xì)胞等。本文中體細(xì)胞可來源于任意胚層。優(yōu)選的是采用間充質(zhì)體細(xì)胞。
本文中術(shù)語“間充質(zhì)干細(xì)胞”指在間充質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞。術(shù)語“間充質(zhì)干細(xì)胞”在本文可縮寫成“MSC”。間充質(zhì)指一群游離細(xì)胞，其呈星形或具有不規(guī)則突起，橋接上皮組織間的間隙，在多細(xì)胞動(dòng)物的每一發(fā)育階段均可以看到。間充質(zhì)也指與所述細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合物(cement)一起形成的組織。間充質(zhì)干細(xì)胞具有增殖能力，并有分化成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、腱細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的能力。間充質(zhì)干細(xì)胞用于培養(yǎng)或生長從患者收集的骨髓細(xì)胞等，或是分化為軟骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞也用作重構(gòu)材料如牙槽骨，用于關(guān)節(jié)病等的骨骼、軟骨或關(guān)節(jié)，等等。間充質(zhì)干細(xì)胞有著大量的需求。同樣間充質(zhì)干細(xì)胞可分化成血細(xì)胞及淋巴樣細(xì)胞。因此，對間充質(zhì)干細(xì)胞的需求仍在上升。
短語“吸脂所得材料”指進(jìn)行吸脂時(shí)所產(chǎn)生的任意材料。典型地，此類吸脂所得材料包含脂肪組織和吸脂所得抽取物。
短語“吸脂所得抽取物”指進(jìn)行吸脂時(shí)所產(chǎn)生的液體。此類吸脂所得抽取物可以是但不限于(1)進(jìn)行吸脂時(shí)抽吸出來的液體(如包括Tumecent溶液和血液)或(2)用溶液如鹽水洗滌抽吸出的脂肪時(shí)產(chǎn)生的液體。
本文中術(shù)語“體細(xì)胞”指除生殖細(xì)胞如卵細(xì)胞、精子等以外的任意細(xì)胞，其不將DNA傳給下一代。典型地，體細(xì)胞沒有多潛能性或潛能性有限。本文所用體細(xì)胞可以是天然存在或遺傳修飾的細(xì)胞，只要其能達(dá)到預(yù)期治療目的即可。
本文中術(shù)語“分化細(xì)胞”指具有特化功能和形態(tài)的細(xì)胞(如肌細(xì)胞、神經(jīng)元等)。與干細(xì)胞不同，分化細(xì)胞沒有或只有很少多潛能性。分化細(xì)胞的實(shí)例包括表皮細(xì)胞、胰腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞、胰管細(xì)胞、肝細(xì)胞、血細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨骼肌成肌細(xì)胞、神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞、色素細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞，等等。本發(fā)明中所用的分化細(xì)胞可以是細(xì)胞群或組織的形式。
干細(xì)胞的起源分為外胚層、內(nèi)胚層或中胚層。外胚層起源的干細(xì)胞大部分存在于腦內(nèi)，包括神經(jīng)干細(xì)胞。內(nèi)胚層起源的干細(xì)胞大部分存在于骨髓內(nèi)，包括血管干細(xì)胞及其分化細(xì)胞、造血干細(xì)胞及其分化細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞及其分化細(xì)胞等。中胚層起源的干細(xì)胞大部分存在于器官內(nèi)，包括肝臟干細(xì)胞及其分化細(xì)胞、胰臟干細(xì)胞及其分化細(xì)胞等。本文中體細(xì)胞可來源于任意胚層。優(yōu)選的是采用間充質(zhì)體細(xì)胞。
本文中術(shù)語“脂肪細(xì)胞”指位于組織之間或形成脂肪組織作為蜂窩組織或一群沿毛細(xì)血管的細(xì)胞，脂肪細(xì)胞含有大量脂質(zhì)。脂肪細(xì)胞包括黃脂肪細(xì)胞和褐脂肪細(xì)胞。這些細(xì)胞在此處可以同等地使用。細(xì)胞內(nèi)脂肪可以容易地用蘇丹III(Sudan III)或四氧化鋨檢測。
本文中術(shù)語“期望部位”指受試者期望進(jìn)行治療的任意部分。本發(fā)明中，可以理解的是此類目標(biāo)部位可選自受試者的任意器官或組織。
本文中術(shù)語“組織”指多細(xì)胞生物中具有基本相同的功能和/或形態(tài)的細(xì)胞聚集體?！敖M織”通常是相同起源細(xì)胞的聚集體，但也可以是不同起源細(xì)胞的聚集體，只要其具有相同的功能和/或形態(tài)即可。因此本發(fā)明的干細(xì)胞用于再生組織時(shí)，組織可以由兩種或多種不同起源的細(xì)胞聚集體組成。典型地，組織構(gòu)成器官的一部分。動(dòng)物組織從形態(tài)、功能或發(fā)育方面分成上皮組織、結(jié)締組織、肌肉組織、神經(jīng)組織等。植物組織根據(jù)構(gòu)成組織的細(xì)胞的發(fā)育階段大致分成分生組織和永久組織。另外，根據(jù)構(gòu)成組織的細(xì)胞類型可以將組織分成簡單組織和復(fù)合組織。這樣組織就分成不同的類別。任意組織均可作為本文所要治療的靶點(diǎn)。
本發(fā)明可以任意器官作為靶點(diǎn)。本發(fā)明的靶組織或細(xì)胞可來源于任意器官。本文中術(shù)語“器官”指生物個(gè)體中形態(tài)學(xué)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)，其位于生物體的特定部分，行使某種功能。多細(xì)胞生物(如動(dòng)物、植物)中器官通常由數(shù)種組織以特定的空間排列形式構(gòu)成，每一組織由許多細(xì)胞組成。這樣的器官實(shí)例包括與血管系統(tǒng)相關(guān)的器官。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的靶器官包括但不限于皮膚、血管、角膜、腎、心臟、肝臟、臍帶、腸、神經(jīng)、肺、胎盤、胰臟、腦、外周肢體、視網(wǎng)膜等。本文中任意器官均可作為靶點(diǎn)。優(yōu)選的是，可靶向間充質(zhì)組織(如脂肪、骨骼韌帶等)，但不限于此。
本文中術(shù)語“分化的充分條件”指引起分化的時(shí)間、介質(zhì)、溫度、濕度等。從來源于吸脂所得抽取物的干細(xì)胞制備分化細(xì)胞的方法包括(1)向培養(yǎng)基中加入分化誘導(dǎo)劑的方法；及(2)將本發(fā)明細(xì)胞與對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞一起培養(yǎng)的方法。
向培養(yǎng)基中加入分化誘導(dǎo)劑(如地塞米松)的方法包括向干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入常規(guī)公知的分化誘導(dǎo)劑的方法，所述分化誘導(dǎo)劑如腎上腺皮質(zhì)類固醇如地塞米松，胰島素，葡萄糖，吲哚美辛，異丁基-甲基黃嘌呤(IBMX)，抗壞血酸2-磷酸，抗壞血酸及其衍生物，甘油磷酸，雌激素及其衍生物，孕酮及其衍生物，雄激素及其衍生物，生長因子如αFGF、βFGF、EGF、IGF、TGF-β、ECGF、BMP、PDGF，垂體腺提取物，松果體提取物，視黃酸，維生素D，甲狀腺激素，胎牛血清，馬血清，人血清，肝素，碳酸氫鈉，HEPES，白蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白，硒酸鹽(如亞硒酸鈉)，亞油酸，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，去甲基試劑如5-氮雜胞苷，組蛋白去乙酰基試劑如制滴菌素(trichostatin)，活化素，細(xì)胞因子如LIF、IL-2、IL-6，六亞甲基二乙酰胺(HMBA)，二甲基乙酰胺(DMA)，二丁基cAMP(dbcAMP)，二甲基亞砜(DMSO)，碘脫氧尿苷(IdU)，羥基脲(HU)，阿糖胞苷(AraC)，絲裂霉素C(MMC)，丁酸鈉(NaBu)，凝聚胺及硒。
在與對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞一起培養(yǎng)干細(xì)胞的方法(2)中，根據(jù)本文公開內(nèi)容，使脂肪來源前體細(xì)胞與分化細(xì)胞混合，從而使脂肪來源前體細(xì)胞注定變成所述分化細(xì)胞。根據(jù)本說明書，可以理解的是這樣的條件與單獨(dú)維持脂肪來源前體細(xì)胞或分化細(xì)胞的條件是重疊的。因此，可以將條件適當(dāng)?shù)募右愿淖儭?yōu)選的是所述條件可以根據(jù)本發(fā)明脂肪來源前體細(xì)胞和待與之組合的分化細(xì)胞及其混合物的組成來加以改變。這樣的優(yōu)選條件一旦建立，該條件即可隨后用于類似混合物處理。本發(fā)明中，此類分化的條件可在體外、體內(nèi)或離體環(huán)境中使用。在體內(nèi)環(huán)境的情況時(shí)，使用身體植入部位本身所提供的條件。本發(fā)明中，干細(xì)胞與分化細(xì)胞混合后，混合物可立即植入體內(nèi)環(huán)境中，或可在體外進(jìn)行共培養(yǎng)。自體移植可稱為離體移植。
本文中術(shù)語“體內(nèi)”指在生物體內(nèi)。在特定情況下，“體內(nèi)”指受試組織或器官放置的位置(如本文中所用的期望部位)。
本文中術(shù)語“體外”表示出于各種研究目的將生物體的一部分從生物體取出來或釋放出來(如在試管內(nèi))。術(shù)語體外與術(shù)語體內(nèi)相對。
本文中術(shù)語“離體”指下列一系列操作將要導(dǎo)入基因的靶細(xì)胞從受試者中取出來，將治療基因在體外導(dǎo)入所述細(xì)胞，然后將所述細(xì)胞重新回到同一受試者中。
分化條件的實(shí)例可獨(dú)立選自下述條件培養(yǎng)5小時(shí)或更長時(shí)間，pH5～10，溫度為20℃～45℃(如37℃)，濕度80％或更高(如100％)，使用M199培養(yǎng)基，添加5mg/500ml的肝素，添加2μg/500ml的酸性FGF，添加FBS(15％)，添加NaHCO3，氧濃度為10～30％(如20％)，CO2濃度為2～10％(如5％)，使用明膠包被的培養(yǎng)皿，有飼養(yǎng)細(xì)胞存在，等等。作為實(shí)例之一，條件如下培養(yǎng)5小時(shí)，使用M199培養(yǎng)基(每500ml添加2.2g NaHCO3、FBS(15％)、2μg酸性FGF及5mg肝素)，于37℃、20％氧氣、5％碳酸氣及100％濕度下在明膠包被的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。本發(fā)明并不局限于此。
上述條件可用于分化細(xì)胞(如脂肪細(xì)胞)及脂肪來源前體細(xì)胞的維持。本發(fā)明并不局限于此。
對于脂肪來源前體細(xì)胞的分化來說，可以使用含有細(xì)胞分化促進(jìn)劑的任意培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。例如這樣的培養(yǎng)基可以是但不限于添加10％FBS、0.5mM異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)、1μM地塞米松、10μM胰島素和200μM吲哚美辛的DMEM。該培養(yǎng)基可在37℃、20％氧氣、5％碳酸氣及100％濕度下使用。
本文中所用術(shù)語“促進(jìn)分化成分化細(xì)胞的因子”或“分化促進(jìn)劑”指已知可促進(jìn)分化成分化細(xì)胞的任意因子(如化學(xué)物質(zhì)、溫度等)。此類因子的實(shí)例包括但不限于各種環(huán)境因素如溫度、濕度、pH、鹽濃度、養(yǎng)分、金屬、氣體、有機(jī)溶劑、壓力、化學(xué)物質(zhì)(如類固醇、抗生素等)等等，或其任意組合。此類因子的代表性實(shí)例包括但不限于DNA去甲基試劑(如5-氮雜胞苷等)、組蛋白去乙?；噭?如制滴菌素等)、核內(nèi)受體配體(如視黃酸(ATRA)、維生素D3、T3等)、細(xì)胞生長因子(如活化素、IGF-1、FGF、PDGF、TGF-β、BMP2/4等)、細(xì)胞因子(如LIF、IL-2、IL-6等)、六亞甲基二乙酰胺、二甲乙酰胺、二丁基cAMPs、二甲基亞砜、碘脫氧尿苷、羥基脲、阿糖胞苷、絲裂霉素C、丁酸鈉、芽棲菌素(aphidicholine)、氟脫氧尿苷、凝聚胺、硒，等等。但是分化細(xì)胞通常并不考慮用作分化促進(jìn)劑。這是因?yàn)榉只?xì)胞會釋放抑制分化的因子。
對于根據(jù)本發(fā)明將要用于移植或再生的細(xì)胞、組織、器官等來說，文中術(shù)語“對應(yīng)于期望部位”表示所述細(xì)胞等從所述期望部位獲得(如心臟來源的細(xì)胞等)，或者所述細(xì)胞等具有與期望部位處存在細(xì)胞相同的性質(zhì)(如分化成心臟細(xì)胞的細(xì)胞等)。因此，如果細(xì)胞具有與期望部位處細(xì)胞基本相同的特性(如細(xì)胞表面標(biāo)記等)，則可以證實(shí)對應(yīng)于期望部位。
用于確定對應(yīng)于期望部位的此類細(xì)胞的標(biāo)志實(shí)例包括但不限于(1)脂肪胞漿內(nèi)有甘油三酯存在，油紅O染色，甘油磷酸脫氫酶(GPDH)活性，胞漿內(nèi)GLUT4，Ap2(脂肪酸結(jié)合蛋白)，LPL(脂蛋白脂酶)，PPARγ1，2(過氧化物酶體生長活化受體γ1，2)和瘦素的表達(dá)；(2)骨細(xì)胞、骨組織堿性磷酸酶的存在，骨鈣化(鈣沉淀)程度確定，以及骨鈣蛋白、骨橋蛋白(osteopontin)或骨粘連蛋白(osteonectin)的表達(dá)；(3)軟骨細(xì)胞、軟骨組織粘多糖的存在，II型膠原和4-硫酸軟骨素的表達(dá)和存在；(4)骨骼肌細(xì)胞胞漿內(nèi)存在大量肌球蛋白；等等。
本文中術(shù)語“植入”和“移植”可以互換使用，指將本發(fā)明的細(xì)胞、組合物、藥物等單獨(dú)置入或與其他治療劑一起置入體內(nèi)。本發(fā)明中下列方法、形式和用量可用于導(dǎo)入治療部位(如骨等)將本發(fā)明的藥物直接注射入受傷部位、粘附并縫合到受傷部位、插入受傷部位，等等。本發(fā)明的脂肪來源前體細(xì)胞與分化細(xì)胞的組合可以相伴施用，如以混合物施用，也可分別但同時(shí)或先后施用。這包括組合因子作為治療混合物一起施用的情況，也包括組合的試劑(如分化促進(jìn)劑等)分開但同時(shí)施用的方法?！敖M合”施用還包括分別地先施用第一種化合物或因子，然后施用第二種。
對于實(shí)體來說，本文中術(shù)語“自體”或“自身”指同一實(shí)體的整體或一部分(如細(xì)胞、組織、器官等)。本文中術(shù)語“自體”或“自身”廣義上可包括來自遺傳相同個(gè)體(如同卵雙胞胎)的移植物。
本文中術(shù)語“同種異體的”指被移植的實(shí)體的整體或一部分(如細(xì)胞、組織、器官等)來自物種相同、但遺傳上不同的另一個(gè)實(shí)體。由于同種異體的實(shí)體遺傳上不同，同種異體的實(shí)體可在實(shí)體(接受者)中激發(fā)針對植入的異體實(shí)體(allo-entity)的免疫反應(yīng)。例如，此類細(xì)胞包括但不限于來源于其親代的細(xì)胞。
本文中術(shù)語“異種”指被移植的材料如細(xì)胞或組織來自另一不同物種實(shí)體。因此，例如人作為接受者時(shí)，豬來源移植物稱為異種移植物。
本文中“接受者”(受體)指接受植入細(xì)胞等的實(shí)體，也稱為“宿主”。與此相對，提供植入細(xì)胞等的實(shí)體稱為“供應(yīng)者”(供體)。供應(yīng)者可與接受者相同或不同。
本發(fā)明中使用的細(xì)胞可以來源于自體來源(同基因起源)、同種異體起源(非自身起源)或異種起源。從排斥反應(yīng)的角度看，優(yōu)選同基因起源的細(xì)胞。如果排斥反應(yīng)不引發(fā)問題，可采用同種異體細(xì)胞。
本文中術(shù)語“分化細(xì)胞缺陷所致疾病、障礙或異常狀況”指涉及分化細(xì)胞的任意疾病、障礙或異常狀況。此類分化細(xì)胞可以優(yōu)選但不限于間充質(zhì)細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明針對的疾病及障礙可以是循環(huán)系統(tǒng)(血細(xì)胞等)的。所述疾病及障礙的實(shí)例包括但不限于貧血(如再生障礙性貧血(特別是重度再生障礙性貧血)、腎性貧血、癌性貧血、繼發(fā)性貧血、頑固性貧血等)，癌癥或腫瘤(如白血病)、化療后的造血不能、血小板減少、急性髓細(xì)胞性白血病(特別是首次緩解期(高危群體)、第二次緩解及以后)、急性淋巴細(xì)胞性白血病(特別是首次緩解期、第二次緩解及以后)、慢性髓細(xì)胞性白血病(特別是慢性期、轉(zhuǎn)移期(transmigrationperiod))、惡性淋巴瘤(特別是首次緩解期(高危群體)、第二次緩解及以后)、多發(fā)性骨髓瘤(特別是發(fā)病后早期)等，心力衰竭、心絞痛、心肌梗塞、心律失常、心瓣炎、心肌/心包膜疾病、先天性心臟病(如房間隔缺損、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉、法洛氏(Fallot)四聯(lián)癥等)、動(dòng)脈疾病(如動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈瘤)、靜脈疾病(如phlebeurysm等)、淋巴管疾病(如淋巴水腫等)，等等。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明針對的疾病及障礙可以是神經(jīng)系統(tǒng)的。所述疾病及障礙的實(shí)例包括但不限于癡呆、腦卒中及其后遺癥、腦腫瘤、脊髓損傷等。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明針對的疾病及障礙可以是免疫系統(tǒng)的。所述疾病及障礙的實(shí)例包括但不限于T細(xì)胞缺陷綜合癥、白血病等。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明針對的疾病及障礙可以是運(yùn)動(dòng)器官及骨骼系統(tǒng)的。所述疾病及障礙的實(shí)例包括但不限于骨折、骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)脫臼、不全脫位、扭傷、韌帶損傷、骨關(guān)節(jié)炎、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、肌營養(yǎng)不良、成骨不全、骨軟骨發(fā)育不良，等等。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明針對的疾病及障礙可以是皮膚系統(tǒng)的。所述疾病及障礙的實(shí)例包括但不限于無毛癥、黑素瘤、皮膚惡性淋巴瘤、血管肉瘤、組織細(xì)胞增多癥、水皰病、膿皰病、皮炎、濕疹，等等。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明針對的疾病及障礙可以是內(nèi)分泌系統(tǒng)的。所述疾病及障礙的實(shí)例包括但不限于下丘腦/下垂體疾病、甲狀腺疾病、副甲狀腺(甲狀旁腺)疾病、腎上腺皮質(zhì)/髓質(zhì)疾病、糖代謝異常、脂代謝異常、蛋白質(zhì)代謝異常、核酸代謝異常、先天性代謝缺陷(苯酮尿癥、半乳糖血癥、高胱氨酸尿癥、楓糖尿癥)、無白蛋白血癥、抗壞血酸合成能力不足、高膽紅素血癥、高膽紅素尿癥、激肽釋放酶缺陷、肥大細(xì)胞缺陷、尿崩癥、血管加壓素分泌異常、侏儒癥、沃耳曼氏(Wolman′s)病(酸性脂酶缺陷))、VI型粘多糖增多癥，等等。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明針對的疾病及障礙可以是呼吸系統(tǒng)的。所述疾病及障礙的實(shí)例包括但不限于肺部疾病(如肺炎、肺癌等)、支氣管疾病等。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明針對的疾病及障礙可以是消化系統(tǒng)的。所述疾病及障礙的實(shí)例包括但不限于食管疾病(如食管癌等)、胃/十二指腸疾病(如胃癌、十二指腸癌等)、小腸疾病/大腸疾病(如結(jié)腸息肉、結(jié)腸癌、直腸癌等)、膽管疾病、肝臟疾病(如肝硬化、肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型等)、暴發(fā)性肝炎、慢性肝炎、原發(fā)性肝癌、酒精性肝病、藥源性肝病等)、胰臟疾病(急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰癌、囊性胰臟疾病等)、腹膜/腹壁/隔膜疾病(疝氣等)、赫希施普龍氏(Hisrschsprung′s)病，等等。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明針對的疾病及障礙可以是泌尿系統(tǒng)的。所述疾病及障礙的實(shí)例包括但不限于腎臟疾病(如腎衰竭、原發(fā)性腎小球疾病、腎血管障礙、腎小管功能異常、間質(zhì)性腎病、全身性疾病導(dǎo)致的腎障礙、腎癌等)、膀胱疾病(如膀胱炎、膀胱癌等)，等等。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明針對的疾病及障礙可以是生殖系統(tǒng)的。所述疾病及障礙的實(shí)例包括但不限于雄性生殖器官疾病(如雄性不育、前列腺肥大、前列腺癌、睪丸癌等)、雌性生殖器官疾病(如雌性不育、卵巢功能障礙、子宮肌瘤、子宮腺肌病、子宮癌、子宮內(nèi)膜異位、卵巢癌、絨毛疾病等)，等等。
本文中術(shù)語“診斷、預(yù)防、治療或預(yù)后的有效量”指診斷、預(yù)防、之后或預(yù)后的公認(rèn)的治療有效用量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用公知技術(shù)參考各種參數(shù)來確定此類用量。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明可在美容用途的治療、處理或改善中使用。此類美容用途包括手術(shù)后或創(chuàng)傷后變形及先天性畸形的美容治療，以及健康狀態(tài)下的純美容目的。例如，本發(fā)明可應(yīng)用于但不限于增加乳房組織(隆乳)的技術(shù)，增加頰部或上眼瞼及下眼瞼以補(bǔ)償凹陷的技術(shù)，以及增加組織以補(bǔ)充單側(cè)顏面萎縮或面癱后組織萎縮或漏斗胸的技術(shù)。而且，例如，本發(fā)明可應(yīng)用于但不限于諸如鼻成形術(shù)、鼻縮小造型術(shù)(reduction rhinoplasty)、頦成形術(shù)(組織擴(kuò)增)、額成形手術(shù)(組織擴(kuò)增)、外耳變形/畸形如小耳畸形的外耳軟骨成形術(shù)，等等。
當(dāng)本發(fā)明用作藥物時(shí)，所述藥物可進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的藥物可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的藥學(xué)上可接受的任意載體。
藥學(xué)上可接受的載體或適當(dāng)制劑材料的實(shí)例包括但不限于抗氧化劑、防腐劑、著色劑、香味劑、稀釋劑、乳化劑、助懸劑、溶劑、填充劑、膨化劑、緩沖劑、遞送載體以和/或藥用佐劑。代表性的是本發(fā)明的藥物以組合物的形式施用，所述組合物包括本發(fā)明的細(xì)胞和其他活性成分，以及至少一種生理學(xué)可接受載體、賦形劑或稀釋劑。例如合適的載體可以是注射溶液、生理溶液或人工腦脊液，其可以添加常用于胃腸外遞送組合物的其他物質(zhì)。
本文中所用可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑優(yōu)選對接受者無毒，并且優(yōu)選在采用的劑量及濃度下為惰性，優(yōu)選包括磷酸鹽、檸檬酸鹽或其他有機(jī)酸；抗壞血酸、α-生育酚；低分子量多肽，蛋白質(zhì)(如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；親水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)，氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸)，單糖、二糖及其他碳水化合物(葡萄糖、甘露糖或糊精)，螯合劑(如EDTA)，糖醇(如甘露糖醇或山梨糖醇)，成鹽反離子(如鈉)，和/或非離子型表面活性劑(如吐溫、普郎尼克(pluronics)或聚乙二醇(PEG))。
適當(dāng)載體的實(shí)例包括中性緩沖鹽水或混有血清白蛋白的鹽水。優(yōu)選的是將產(chǎn)品用適當(dāng)賦形劑(如蔗糖)配制成凍干劑。也可根據(jù)期望包括其他標(biāo)準(zhǔn)載體、稀釋劑及賦形劑。其他示范性組合物包括pH約7.0-8.5的Tris緩沖劑或pH約4.0～5.5的乙酸緩沖劑，還可進(jìn)一步包括山梨糖醇或其適當(dāng)?shù)奶娲贰?br> 下面將說明制備本發(fā)明藥物組合物的通用技術(shù)。應(yīng)注意可用已知技術(shù)生產(chǎn)動(dòng)物藥物組合物、準(zhǔn)藥物組合物、海洋藥物組合物、食品組合物、美容組合物等。
本發(fā)明的細(xì)胞等可任選地與藥學(xué)上可接受的載體混合，并可以液體制劑(如注射劑、混懸劑、溶液、噴霧劑等)經(jīng)腸胃外途徑施用。藥學(xué)上可接受的載體的實(shí)例包括賦形劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、崩解抑制劑、吸收促進(jìn)劑、吸附劑、濕潤劑、溶劑、助溶劑、助懸劑、等滲劑、緩沖劑、舒緩劑等。可任選地使用制劑添加劑，如防腐劑、抗氧化劑、著色劑、甜味劑等。本發(fā)明的組合物可任選地與除本發(fā)明的多聚核苷酸及多肽等之外的其他物質(zhì)混合。腸胃外施用途徑的實(shí)例包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、粘膜內(nèi)、直腸內(nèi)、陰道內(nèi)、局部及透皮途徑等。全身施用時(shí)，本發(fā)明所用藥物可以是無熱原、藥學(xué)可接受的水性溶液形式。根據(jù)pH、等滲性、穩(wěn)定性等等制備此類藥學(xué)可接受組合物屬于本領(lǐng)域的技術(shù)。
液體制劑所用溶劑的優(yōu)選實(shí)例包括注射溶液、醇類、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油，等等。
液體制劑所用助溶劑的優(yōu)選實(shí)例包括但不限于聚乙二醇、丙二醇、D-甘露糖醇、苯甲酸芐酯、乙醇、三氨基甲烷、膽固醇、三乙醇胺、碳酸鈉、檸檬酸鈉等。
液體制劑所用助懸劑的優(yōu)選實(shí)例包括表面活性劑(如硬脂酰三乙醇胺、十二烷基硫酸鈉、十二烷基氨基丙酸、卵磷脂、苯扎氯銨、氯化芐乙氧銨、單硬脂酸甘油酯等)，親水大分子(如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素等)，等等。
液體制劑所用等滲劑的優(yōu)選實(shí)例包括但不限于氯化鈉、甘油、D-甘露糖醇等。
液體制劑所用緩沖劑的優(yōu)選實(shí)例包括但不限于磷酸鹽、醋酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽等。
液體制劑所用舒緩劑(soothing agent)的優(yōu)選實(shí)例包括但不限于苯甲醇、苯扎氯銨、鹽酸普魯卡因，等等。
液體制劑所用防腐劑的優(yōu)選實(shí)例包括但不限于對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯甲醇、2-苯乙醇、脫氫醋酸、山梨酸，等等。
液體制劑所用抗氧化劑的優(yōu)選實(shí)例包括但不限于亞硫酸鹽、抗壞血酸、α-生育酚、半胱氨酸，等等。
當(dāng)液體制劑和懸浮液制備成注射劑時(shí)，將其滅菌，并優(yōu)選與血液等滲或與注射部位其他用途的介質(zhì)等滲。通常這些試劑經(jīng)過細(xì)菌截留濾器等的過濾、與殺菌劑混合或輻射等而變得無菌。這樣處理后，可通過凍干等將這些試劑制成固體。在臨用前可加入無菌水或無菌注射稀釋劑(鹽酸利多卡因水溶液、生理鹽水、葡萄糖水溶液、乙醇或其混合物等)。
本發(fā)明的藥物組合物還可包括著色劑、防腐劑、芳香化學(xué)品、香料、調(diào)味劑、甜味劑或其他藥物。
參考使用目的、目標(biāo)疾病(類型、嚴(yán)重程度等)、患者的年齡、體重、性別、病史、細(xì)胞形態(tài)或類型、等等，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定組合物用于本發(fā)明治療方法中的用量。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可根據(jù)使用目的、目標(biāo)疾病(類型、嚴(yán)重程度等)、患者的年齡、體重、性別、病史或治療進(jìn)展等確定本發(fā)明治療方法施用于受試者(或患者)的頻率。頻率的實(shí)例包括但不限于每天一次到數(shù)月一次(如每周一次到每月一次)。優(yōu)選的是根據(jù)進(jìn)展情況每周到每月進(jìn)行一次?？赏ㄟ^估計(jì)所要治療部位的需用量來確定劑量。
本文中術(shù)語“使用說明”向本發(fā)明藥物的施用者或施用對象或是診斷者或診斷對象(如醫(yī)生、患者等)說明本發(fā)明藥物的施用方法、診斷方法等。該說明含有描述了施用本發(fā)明診斷、藥物等的恰當(dāng)方法的說明。使用說明根據(jù)本發(fā)明所應(yīng)用國家當(dāng)局(如日本的厚生勞動(dòng)省(Health，Labor and Welfare Ministry)，美國的食品和藥品管理局(FDA)等)定義的格式制備，明確地說明該說明由當(dāng)局批準(zhǔn)。所述說明也是所謂的包裝插頁，通常以紙介質(zhì)的形式提供。使用說明不受此限制，也可以電子媒介的形式(如因特網(wǎng)上的網(wǎng)站、電子郵件等)提供。
本發(fā)明治療方法終止可根據(jù)下述支持來判斷用商品測試或儀器的標(biāo)準(zhǔn)臨床試驗(yàn)室檢查結(jié)果，或所治療相關(guān)疾病(如骨病、心臟病、神經(jīng)疾病等)特征性臨床癥狀的消失，或是美容狀態(tài)的恢復(fù)(如外觀恢復(fù)等)。與分化細(xì)胞缺陷等相關(guān)的疾病(如神經(jīng)疾病)復(fù)發(fā)或美容狀態(tài)破壞時(shí)可重啟治療。
本發(fā)明也提供包括一個(gè)或多個(gè)容器的藥物包裝或藥盒，所述容器裝有一種或多種藥物組合物。這樣的一個(gè)容器可以隨意地貼上由管理藥品或生物制品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)所規(guī)定的公告，表明其施用于人的生產(chǎn)、使用或銷售已得到該政府機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)。該藥盒可包括注射裝置。
可使用各種動(dòng)物模型(如小鼠、兔、非嚙齒類動(dòng)物)進(jìn)行毒性研究。在這些動(dòng)物模型中觀察一般狀況、體重、進(jìn)食量、飲水量，并進(jìn)行血液學(xué)檢查、血生化檢查、尿液檢查及眼科檢查等。已知本領(lǐng)域內(nèi)有各種檢查，包括但不限下述檢查血液學(xué)檢查測定紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)、血紅蛋白、血細(xì)胞比容、血像(白細(xì)胞類型的百分比)、其他網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)、凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血激酶時(shí)間等。例如血細(xì)胞組成可按下述進(jìn)行測定(1)向小鼠(未處理的對照小鼠也應(yīng)測定)施用藥劑；(2)通過尾靜脈定期從各處理小鼠組的每只鼠取血樣；以及(3)分析上述血樣的紅細(xì)胞數(shù)及白細(xì)胞數(shù)、血細(xì)胞組成以及淋巴細(xì)胞與多形核細(xì)胞的比值。各劑量方案及對照的結(jié)果顯示是否有毒性。
血生化檢查測定血清(血漿)蛋白、白蛋白、A/C比、蛋白級分、葡萄糖、膽固醇、甘油三酯、膽紅素、尿素氮、肌酐、轉(zhuǎn)氨酶(ASAT(GOT)、ALAT(GPT))、堿性磷酸酶、電解質(zhì)(鈉、鉀、氯、鈣、無機(jī)磷等)。
尿液檢查測定尿體積、pH、蛋白質(zhì)、碳水化合物、酮體、膽紅素、潛血、血沉、比重或滲透壓、電解質(zhì)(鈉、鉀等)。
眼科檢查用肉眼及檢眼鏡分析前房(anterior eye)、透光介質(zhì)(optic media)和眼底。
在每一毒性研究結(jié)束時(shí)，還進(jìn)一步將動(dòng)物處死進(jìn)行研究(優(yōu)選地按照美國獸醫(yī)協(xié)會的美國獸醫(yī)協(xié)會指南報(bào)告。Panel on Euthanasia，(1993)J.Am.Vet.Med.Assoc.202229～249)。之后，可對各處理組的代表性動(dòng)物進(jìn)行檢查，觀察全身是否有變化、異常疾病或毒性的直接跡象。描述組織中整體異常并對該組織進(jìn)行組織學(xué)檢查。不優(yōu)選使體重下降或血液組分減少的化合物，因?yàn)檫@是對主要器官有副作用的藥物。通常藥物的副作用越大則越不優(yōu)選。
(優(yōu)選實(shí)施方案說明)下文將說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。提供下述實(shí)施方案是為了更好地理解本發(fā)明，本發(fā)明的范圍不應(yīng)受下述說明限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚地理解，參考本說明書可以作出變更和修改而不偏離本發(fā)明的范圍。
(從吸脂所得抽取物制備干細(xì)胞的方法)在本發(fā)明的一方面中，本發(fā)明提供了從吸脂所得抽取物制備干細(xì)胞的方法，該方法包括A)獲得吸脂所得抽取物；B)將吸脂所得抽取物離心以獲得細(xì)胞級分；C)將細(xì)胞級分通過比重離心如密度梯度離心使細(xì)胞分離開來；以及D)收集比重小于紅細(xì)胞的細(xì)胞層。在發(fā)明方法中所用的吸脂所得抽取物包括但不限于吸脂過程中與脂肪一起抽吸出來的液體(例如，包括但不限于Tumescent溶液及血液)、用液體洗滌抽吸出來的脂肪所產(chǎn)生的廢液。
脂肪來源前體細(xì)胞可按下述方法或?qū)ζ浼右宰兏鼜奈贸槿∥?脂肪抽取物)的脂肪部分分離(如WO00/53795、WO03/022988、WO01/62901；Zuk，P.A.，etal.，Tissue Engineering，Vol.7，211-228，2001；Zuk，P.A.，et al.，Molecular Biology ofthe Cell，Vol.13，4279-4295，2002)。例如，具體地說，(1)通過1升分液漏斗用生理鹽水充分洗滌抽吸出來的脂肪；(2)確認(rèn)上層中的抽吸脂肪與下層生理鹽水充分分離之后棄去下層。重復(fù)此過程，直到生理鹽水用肉眼觀察基本透明為止；(3)加入與抽吸脂肪等量的0.075％膠原酶/PBS，然后在充分?jǐn)嚢璧耐瑫r(shí)于37℃孵育30分鐘；(4)上述樣品中加入等量的補(bǔ)充有10％血清的DMEM；(5)樣品以1200×g離心10分鐘；(6)將所得沉淀懸浮于0.16M NH4Cl/PBS中，然后室溫孵育10分鐘；(7)樣品用直徑100μm的篩網(wǎng)抽濾；以及(8)將所得濾液以1200×g離心5分鐘。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)制劑量對上述方案放大或縮小。
另一方面，舉例來說，脂肪來源前體細(xì)胞可按照下述方法從吸脂所得抽取物(脂肪抽取物)的液體部分(液體抽取物)分離(1)制備吸脂所得抽取物的液體部分；(2)將所述液體部分離心以獲得細(xì)胞級分；(3)將該細(xì)胞級分進(jìn)行密度梯度離心，按比重使細(xì)胞分離；及(4)從比重小于紅細(xì)胞的細(xì)胞層收集細(xì)胞。抽取物的液體部分可以用生理鹽水或林格氏注射液制備。離心可以約800×g或更低的速度進(jìn)行，或是以約400×g或更高的速度離心。密度梯度離心以約370×g～1,100×g的速度進(jìn)行。密度梯度離心使用比重(20℃)約1.076～約1.078的介質(zhì)進(jìn)行。密度梯度離心中所用介質(zhì)可以是FicollTM、PercollTM或蔗糖。所收集細(xì)胞層的比重可為約1.050～1.075。所述細(xì)胞層可用移液器收集。
抽吸脂肪的方法可用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員公知的技術(shù)進(jìn)行。抽吸脂肪方法中所用裝置包括但不限于Keisei SAL泵(SAL 76-A、Keisei Ika-Kogyo、Hongo 3-19-6、Bunkyo，Tokyo，Japan)。在人類情況下，將含0.0001％腎上腺素的液體如鹽水注入等量的待抽吸脂肪組織中，使該組織的體積加倍，然后用內(nèi)徑為2～3mm的插管(金屬制成的抽吸管)在約-250～900mmHg的負(fù)壓下抽吸。
用于洗滌抽吸出來的脂肪細(xì)胞的液體通常是鹽水。但是，也可使用鹽水之外的其他任意液體，只要其對將要分離的干細(xì)胞沒有副作用即可。具體地說，例如本發(fā)明中可使用任意等滲液如林格氏溶液及哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基(如DMEM、MEM、M199和MCDB153等)。
從吸脂所得抽取物制備干細(xì)胞時(shí)，可以任選地將所述吸脂所得抽取物用酶進(jìn)行處理，如用膠原酶處理。但是吸脂所得抽取物用作制備干細(xì)胞的來源時(shí)，吸脂所得抽取物中的膠原量與脂肪組織相比要低，膠原酶處理時(shí)間和/或酶處理所需酶用量相對低于脂肪組織所需用量。
通過離心吸脂所得抽取物獲得細(xì)胞級分的步驟中，可使用任何條件，只要此細(xì)胞級分與其他組分(如血漿、操作中污染的鹽水、麻醉劑、止血?jiǎng)?、從破裂脂肪?xì)胞排出的脂質(zhì)組分)分離開來即可。例如，可以在400～800×g離心約5～15分鐘。
通過比重分離細(xì)胞的步驟中，例如分離的細(xì)胞級分可進(jìn)行密度梯度離心。任何可用于密度梯度離心的可用介質(zhì)均可用作這樣的介質(zhì)。優(yōu)選的介質(zhì)比重可為1.076～1.078g/ml。而且優(yōu)選介質(zhì)的pH介于4.5和7.5之間。優(yōu)選介質(zhì)的內(nèi)毒素含量可為0.12EU/ml或更低。典型的介質(zhì)包括蔗糖、Ficoll(蔗糖和表氯醇的共聚物)和Percoll(具有聚乙烯吡咯烷酮膜的硅膠產(chǎn)品)。Ficoll是商用產(chǎn)品，如Ficoll-Paque PLUS(Pharmacia Biotech Japan，Tokyo，Japan)，Histopaque-1077(SIGMA-AldrichJapan，Tokyo，Japan)等。Percoll是以Percoll為商品名的商用產(chǎn)品(SIGMA-AldrichJapan，Tokyo，Japan)。
比重離心的條件可如下所述當(dāng)使用Ficoll-Paque PLUS作為介質(zhì)時(shí)，以400×g離心30～40分鐘；當(dāng)使用Histopaque-1077作為介質(zhì)時(shí)，以370×g離心約30分鐘。當(dāng)使用Lymphoprep作為介質(zhì)時(shí)，條件包括但不限于以800×g離心約20分鐘及以1,100×g離心約10分鐘等。
比重離心時(shí)最多的細(xì)胞通常是紅細(xì)胞，這可通過觀察到紅細(xì)胞層來證實(shí)。干細(xì)胞的比重小于紅細(xì)胞，分離干細(xì)胞時(shí)收集比重小于紅細(xì)胞的細(xì)胞層。優(yōu)選的是收集比重為1.050～1.075的細(xì)胞層。
細(xì)胞的大致比重可以這樣檢查制備密度梯度離心介質(zhì)如Percoll，Readygrad的氯化鈉溶液或蔗糖溶液，將收集的細(xì)胞與densitimer marker珠一起離心，在分成5～10層的梯層中證實(shí)哪一層含有細(xì)胞。
可進(jìn)一步收集分層的細(xì)胞，如用移液器收集。
比重離心時(shí)可使用細(xì)胞分離器如血液組分分離裝置(ASTEC204，Amco)。
本發(fā)明的另一方面中，本發(fā)明干細(xì)胞的制備方法包括A)獲得吸脂所得材料；以及B)將所述吸脂所得材料進(jìn)行離心以獲得細(xì)胞級分而不分離脂肪組織。該方法還可包括過濾所述細(xì)胞級分以獲得干細(xì)胞。該方法還可包括使所述材料處于至少一部分細(xì)胞脫離所述材料的條件下。
吸脂所得材料可以是進(jìn)行吸脂手術(shù)時(shí)可獲得的任意材料。此類材料包含脂肪、脂肪細(xì)胞、液體、細(xì)胞外基質(zhì)如膠原，等等。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，除了吸脂所得抽取物外，此類吸脂所得材料通常也含有大量的干細(xì)胞或前體細(xì)胞。因此，吸脂所得材料通常是制備干細(xì)胞的好來源。本領(lǐng)域中從未預(yù)料到這樣的結(jié)果。
脂肪組織與細(xì)胞分離的條件可以是任意條件，只要脂肪組織與細(xì)胞分開并有助于細(xì)胞的分離即可。此類條件包括但不限于降解細(xì)胞外基質(zhì)，例如加入膠原酶如可從Wako獲得的膠原酶(用于分散細(xì)胞的膠原酶，032-10534)。將這種膠原酶溶于PBS中，濃度為0.075％，將溶液加溫至37℃然后加到等體積的脂肪中。樣品用攪拌器于37℃以80rpm攪拌30分鐘。
在本發(fā)明采用的離心步驟中，本發(fā)明還可包括除去上清液以獲得細(xì)胞層。
優(yōu)選的是該方法還可包括除去步驟B)中上清液或過濾步驟B)所得材料的步驟，以除去殘余的脂肪團(tuán)。任意濾器均可用于此目的，只要不引起阻塞即可。
優(yōu)選的是該方法還可包括除去血細(xì)胞這一步驟，以使干細(xì)胞的純度更高。但是，這些血細(xì)胞可隨后在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)時(shí)通過細(xì)胞傳代除去，使所得細(xì)胞中含多于80％、優(yōu)選多于90％的干細(xì)胞。這也是意外的結(jié)果，是現(xiàn)有技術(shù)未預(yù)期到的。這些血細(xì)胞可以通過除去血細(xì)胞的步驟除去，該步驟包括加入降解血細(xì)胞的組分。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備干細(xì)胞的方法，該方法包括i)獲得吸脂所得材料；ii)將所述材料置于細(xì)胞與脂肪組織分開的條件下，優(yōu)選不分離脂肪組織；iii)將所述材料進(jìn)行離心；iv)向所述材料加入降解血細(xì)胞的組分并加以攪拌；v)將所述材料離心以獲得沉淀；vi)從所述沉淀抽取材料的上清液。
本發(fā)明中使用的吸脂所得材料通常包括吸脂所得抽取物和脂肪，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)按照本發(fā)明進(jìn)行處理時(shí)，所述材料含有的干細(xì)胞比抽取物中所含干細(xì)胞多得多。
優(yōu)選的是步驟ii)所述條件包括加入膠原酶。
優(yōu)選的是該方法還包括將所述材料置于包括維持吸脂所得抽取物的所述條件的步驟。
優(yōu)選的是本發(fā)明中所用的吸脂所得材料還可包含吸脂所得抽取物以及脂肪。
另一實(shí)施方案中，所述步驟iii)中的離心以400～1200×g進(jìn)行。通常使用400×g或800×g。
另一實(shí)施方案中，所述降解血細(xì)胞的組分包含氯化銨和碳酸氫鉀。
另一實(shí)施方案中，所述氯化銨在該組分中的濃度為100mM～200mM，優(yōu)選約155mM。另一實(shí)施方案中，所述碳酸氫鉀在該組分中的濃度為5mM～20mM，優(yōu)選約10mM。優(yōu)選的是有利地使用兩者的組合。
另一實(shí)施方案中，所述步驟v)中的所述離心以400～1200×g進(jìn)行。
本發(fā)明獲得的沉淀包括大量干細(xì)胞或前體細(xì)胞。這些細(xì)胞已經(jīng)證明具有分化成大量分化細(xì)胞如骨、軟骨、脂肪等的能力。
本發(fā)明中優(yōu)選將紅細(xì)胞除去，但是這并不是必須的。因?yàn)椴唤?jīng)過此除去步驟制備的本發(fā)明干細(xì)胞也展現(xiàn)出明顯的分化和增殖活性。
用于培養(yǎng)這些收集的細(xì)胞的培養(yǎng)基包括但不限于如DMEM、M199、MEM、HBSS、Ham’s F12、BME、RPMI1640、MCDB104、MCDB153(KGM)等。優(yōu)選培養(yǎng)基包括DMEM和M199。
收集的細(xì)胞為異源細(xì)胞群，包括表達(dá)CD13、CD29、CD44、CD49d、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151的干細(xì)胞，還可包括表達(dá)CD31或CD34或二者均表達(dá)的干細(xì)胞。
本發(fā)明的一方面中，收集的細(xì)胞在多種條件下培養(yǎng)以獲得各種細(xì)胞，如血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、韌帶細(xì)胞和基底細(xì)胞等。
這些條件在本領(lǐng)域內(nèi)已知，包括將所得細(xì)胞種植到含DMEM培養(yǎng)基的60mm培養(yǎng)皿上，濃度為1.8×106細(xì)胞。
一周到兩周的培養(yǎng)使細(xì)胞達(dá)到近匯合狀態(tài)，之后將細(xì)胞置于脂肪分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基、軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基或骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中并繼續(xù)培養(yǎng)約2～4周。
示范性脂肪發(fā)生培養(yǎng)基可以是補(bǔ)充有10％FBS、含有0.5mM的IBMX、1μM地塞米松、10μM胰島素、200μM吲哚美辛和1％AMAM的DMEM。
示范性骨發(fā)生培養(yǎng)基可以是補(bǔ)充有10％FBS和5％馬血清、含有1μM地塞米松、50μM抗壞血酸-2-磷酸、10mMβ-甘油磷酸和1％ABAM的DMEM。
示范性軟骨發(fā)生培養(yǎng)基可以是補(bǔ)充有1％FBS、含有6.25μg/ml胰島素、6.25μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、10ng/ml的TGF β1、50nM抗壞血酸-2-磷酸和1％ABAM的DMEM。ABAM抗菌抗霉菌溶液可從Gibco獲得(ABAM；Cat.No.600-5240)。
這些細(xì)胞誘導(dǎo)后用油紅O評估脂肪組織，用阿辛藍(lán)評估軟骨組織，用馮科薩染料評價(jià)骨組織。
本發(fā)明中還可進(jìn)一步地使用下述方法從收集的細(xì)胞群分離和收集血管內(nèi)皮前體細(xì)胞。
例如，將收集的細(xì)胞群置于1％明膠包被的培養(yǎng)皿上使用培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)約4～5天。培養(yǎng)后用0.25％胰蛋白酶使細(xì)胞脫落下來，并通過MACS(磁性細(xì)胞分離系統(tǒng))或FACS(流式細(xì)胞儀)與抗-PECAM-1磁珠反應(yīng)從而分離只與該抗體反應(yīng)的細(xì)胞。將分離的細(xì)胞置于1％明膠包被的培養(yǎng)皿上用培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。為了除去污染的成纖維細(xì)胞等，利用血管內(nèi)皮細(xì)胞比其他細(xì)胞更容易脫落的性質(zhì)，使細(xì)胞與0.25％胰蛋白酶反應(yīng)約30～40秒，僅收集脫落的細(xì)胞并在另外的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，使分化的血管內(nèi)皮前體細(xì)胞得以分離(例如參見，Hutley LJ，etalHuman adipose tissue endothelial cells promote preadipocyte proliferation.Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.2001 Nov；281(5)E1037-44)。
本發(fā)明的進(jìn)一步方面中，本發(fā)明提供了制備干細(xì)胞的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括A)獲得吸脂所得抽取物的裝置；B)分離吸脂所得抽取物以獲得細(xì)胞級分的裝置；以及C)將所述細(xì)胞級分通過比重分離如用于細(xì)胞分離的密度梯度離心加以分離的裝置。該系統(tǒng)可以簡單、大量并可自動(dòng)化的方式制備干細(xì)胞。
在一個(gè)不同方面中，本發(fā)明提供了制備干細(xì)胞的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括A)獲得吸脂所得材料的裝置；以及B)將所述吸脂所得材料進(jìn)行離心以獲得細(xì)胞級分而不分離脂肪組織的裝置。
在另一個(gè)不同方面中，本發(fā)明提供了制備干細(xì)胞的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括i)獲得吸脂所得材料的裝置；ii)將所述材料置于不分離脂肪組織而使至少一部分細(xì)胞脫離所述材料的條件下的裝置；iii)將所述材料進(jìn)行離心的裝置；iv)向所述材料加入降解血細(xì)胞的組分并加以攪拌；v)將所述材料離心以獲得沉淀的裝置；以及vi)從所述沉淀抽取材料上清液的裝置。
通過吸脂獲取抽取物的裝置包括使用真空從身體抽吸脂肪的裝置。例如，此類裝置包括但不限于脂肪抽吸手術(shù)(使用手動(dòng)真空注射器以及真空抽吸器等的抽吸手術(shù))和切開皮膚的脫脂手術(shù)。
分離吸脂所得抽取物獲得細(xì)胞級分的裝置以及將該細(xì)胞級分按比重分離如用于細(xì)胞分離的的密度梯度離心進(jìn)行分離的方法包括但不限于離心。通過離心吸脂所得抽取物獲取細(xì)胞級分時(shí)，所用條件包括200～1200×g離心30～60分鐘，優(yōu)選260～900×g離心3～30分鐘，更優(yōu)選400～800×g離心3～15分鐘，最優(yōu)選400×g離心5～10分鐘。Ficoll用于密度梯度離心來按比重進(jìn)行細(xì)胞分離時(shí)，所用條件可以是200～1200×g離心10～60分鐘，優(yōu)選260～900×g離心10～60分鐘，更優(yōu)選400～800×g離心10～40分鐘，最優(yōu)選400×g離心30～40分鐘。而且本發(fā)明可選地包括收集感興趣比重的細(xì)胞層的裝置。優(yōu)選的是所收集細(xì)胞層的比重小于紅細(xì)胞。此類裝置包括但不限于手動(dòng)吸液器、手動(dòng)抽吸器、自動(dòng)吸液器及自動(dòng)抽吸器等。
本發(fā)明的干細(xì)胞可用于獲取多種分化細(xì)胞和/或前體細(xì)胞。具體方法如下所述。(制備分化細(xì)胞的方法)一方面本發(fā)明提供了從干細(xì)胞制備分化細(xì)胞的方法。此類可從干細(xì)胞得到的分化細(xì)胞可以是最終的分化細(xì)胞，也可以是前體細(xì)胞。
從來源于吸脂所得抽取物的干細(xì)胞制備分化細(xì)胞的方法包括(1)向培養(yǎng)基中加入分化誘導(dǎo)劑如地塞米松的方法；以及(2)將干細(xì)胞和對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞一起培養(yǎng)的方法。
(向培養(yǎng)基中加入分化誘導(dǎo)劑來誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的方法)本發(fā)明的細(xì)胞混合物還可進(jìn)一步包括促進(jìn)分化成對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞的因子。此類因子可以是已知或已證實(shí)可促進(jìn)分化成對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞的任意因子。優(yōu)選分化促進(jìn)因子的實(shí)例包括但不限于腎上腺皮質(zhì)類固醇(如地塞米松等)、胰島素、葡萄糖、吲哚美辛、異丁基-甲基黃嘌呤(IBMX)、抗壞血酸-2-磷酸(抗壞血酸-2-磷酸鹽)、抗壞血酸及其衍生物、甘油磷酸、雌激素及其衍生物、孕酮及其衍生物、雄激素及其衍生物、生長因子(如αFGF、βFGF、EGF、IGF、TGF-β、ECGF、BMP、PDGF等)、垂體腺提取物、松果體提取物、視黃酸、維生素D、甲狀腺激素、胎牛血清、馬血清、人血清、肝素、碳酸氫鈉、HEPES、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒酸(如亞硒酸鈉等)、亞油酸、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、去甲基試劑(如5-氮雜胞苷等)、組蛋白去乙酰基試劑(如制滴菌素等)、活化素、細(xì)胞因子(如LIF、IL-2、IL-6等)、六亞甲基二乙酰胺(HMBA)、二甲基乙酰胺(DMA)、二丁基cAMP(dbcAMP)、二甲基亞砜(DMSO)、碘脫氧尿苷(IdU)、羥基脲(HU)、阿糖胞苷(AraC)、絲裂霉素C(MMC)、丁酸鈉(NaBu)、凝聚胺及硒等。
對于本發(fā)明的細(xì)胞混合物來說，可以使用任意培養(yǎng)基，只要混合細(xì)胞可以維持而且分化成對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞的分化過程可以維持即可。此類培養(yǎng)基的實(shí)例包括但不限于DMEM、M199、MEM、HBSS(Hank’s平衡鹽溶液)、Ham’s F12、BME、RPMI1640、MCDB104、MCDB153(KGM)等。這些培養(yǎng)基可以添加腎上腺皮質(zhì)類固醇(如地塞米松等)、胰島素、葡萄糖、吲哚美辛、異丁基-甲基黃嘌呤(IBMX)、抗壞血酸-2-磷酸(抗壞血酸-2-磷酸鹽)、抗壞血酸及其衍生物、甘油磷酸、雌激素及其衍生物、孕酮及其衍生物、雄激素及其衍生物、生長因子(如αFGF、βFGF、EGF、IGF、TGF-β、ECGF、BMP、PDGF等)、垂體腺提取物、松果體提取物、視黃酸、維生素D、甲狀腺激素、胎牛血清、馬血清、人血清、肝素、碳酸氫鈉、HEPES、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒酸(如亞硒酸鈉等)、亞油酸、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、去甲基試劑(如5-氮雜胞苷等)、組蛋白去乙?；噭?如制滴菌素等)、活化素、細(xì)胞因子(如LIF、IL-2、IL-6等)、六亞甲基二乙酰胺(HMBA)、二甲基乙酰胺(DMA)、二丁基cAMP(dbcAMP)、二甲基亞砜(DMSO)、碘脫氧尿苷(IdU)、羥基脲(HU)、阿糖胞苷(AraC)、絲裂霉素C(MMC)、丁酸鈉(NaBu)、凝聚胺及硒等，可單獨(dú)加入或聯(lián)合加入。
從來源于吸脂所得抽取物的干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞的條件包括但不限于，例如在添加異丁基-甲基黃嘌呤、地塞米松、胰島素和吲哚美辛的DMEM中培養(yǎng)干細(xì)胞。
從來源于吸脂所得抽取物的干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞的條件包括但不限于，例如在添加胰島素、抗壞血酸-2-磷酸和TGF-β1的DMEM中培養(yǎng)干細(xì)胞。
從來源于吸脂所得抽取物的干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞的條件包括但不限于，例如在添加地塞米松、抗壞血酸-2-磷酸和β-甘油磷酸的DMEM中培養(yǎng)干細(xì)胞。
從來源于吸脂所得抽取物的干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肌細(xì)胞的條件包括但不限于，例如在補(bǔ)充有10％胎牛血清(FBS)和5％馬血清(HS)并添加地塞米松和氫化可的松的DMEM中培養(yǎng)干細(xì)胞。
(將干細(xì)胞和對應(yīng)于感興趣部位的分化細(xì)胞一起培養(yǎng)來誘導(dǎo)分化)這種將干細(xì)胞和感對應(yīng)于興趣部位的分化細(xì)胞一起培養(yǎng)可以產(chǎn)生一定數(shù)量具有期望性質(zhì)的分化細(xì)胞，優(yōu)選以均一方式。該方法包括A)將a)脂肪來源前體細(xì)胞及b)對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞加以混合；以及B)將所述混合物在使得脂肪組織來源前體細(xì)胞分化的充分條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞可用本領(lǐng)域公知的技術(shù)制備。作為替代方案，這樣的分化細(xì)胞可從商品細(xì)胞系獲得(如從ATCC等獲得的細(xì)胞系等)。這樣的分化細(xì)胞可從來自需要移植的受試者的原代培養(yǎng)細(xì)胞(如肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等)獲得。原代培養(yǎng)及細(xì)胞系培養(yǎng)的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，例如可見于Hiroshi Hatanaka & Akira Asano，eds.，“AMBO Manuaru Saibo Kenkyuho [AMBOManual of Cell Study Methods]”，TaKaRa；Toshio Watanabe，ed.，“Baio JikkenIrasutoreiteddo(6)Sukusuku Sodate Saibo Baiyo[Illustrated Culture Experiments-Cells grow quickly]”，Shujun sha(1996)等，在此將其引入作為參考。
本發(fā)明中可使用任意分化細(xì)胞，只要所述細(xì)胞與期望部位對應(yīng)即可，優(yōu)選間充質(zhì)細(xì)胞，包括但不限于脂肪細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞和胰細(xì)胞等。這些細(xì)胞可以是鑒定過的細(xì)胞，但是，即使這些細(xì)胞的性質(zhì)是未知也可用諸如FACS的分離技術(shù)將其用于制備對應(yīng)于期望部位的細(xì)胞。
用于確定對應(yīng)于此類期望部位的細(xì)胞的標(biāo)記實(shí)例包括但不限于(1)脂肪胞漿內(nèi)有甘油三酯存在，油紅O染色，甘油磷酸脫氫酶(GPDH)活性，胞漿內(nèi)GLUT4，Ap2(脂肪酸結(jié)合蛋白)，LPL(脂蛋白脂酶)，PPARγ1，2(過氧化物酶體生長活化受體γ1，2)，瘦素的表達(dá)；(2)骨細(xì)胞、骨組織存在堿性磷酸酶，骨鈣化(鈣沉積)程度確定，以及骨鈣蛋白、骨橋蛋白或骨粘連蛋白的表達(dá)；(3)軟骨細(xì)胞、軟骨組織存在粘多糖，II型膠原和軟骨素-4-硫酸的表達(dá)和存在；(4)骨骼肌細(xì)胞胞漿內(nèi)存在大量肌球蛋白；等等。例如，F(xiàn)ACS方案的描述可見于Nakauchi，ed.，“Furosaitometori Jiyujizai [Master of Flow cytometery]”，special Issue，Saibokogaku[Cell Engineering](Shujunsha)，1999等，在此將其引入作為參考。
本發(fā)明的細(xì)胞混合物還可進(jìn)一步包含促進(jìn)分化成對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞的因子。此類因子可以是已知的，或已證實(shí)可促進(jìn)分化成對應(yīng)于目標(biāo)部位的分化細(xì)胞的任意因子。優(yōu)選分化促進(jìn)因子的實(shí)例包括但不限于腎上腺皮質(zhì)類固醇(如地塞米松等)、胰島素、葡萄糖、吲哚美辛、異丁基-甲基黃嘌呤(IBMX)、抗壞血酸-2-磷酸(抗壞血酸-2-磷酸鹽)、抗壞血酸及其衍生物、甘油磷酸、雌激素及其衍生物、孕酮及其衍生物、雄激素及其衍生物、生長因子(如αFGF、βFGF、EGF、IGF、TGF-β、ECGF、BMP、PDGF等)、垂體腺提取物、松果體提取物、視黃酸、維生素D、甲狀腺激素、胎牛血清、馬血清、人血清、肝素、碳酸氫鈉、HEPES、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒酸(如亞硒酸鈉等)、亞油酸、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、去甲基試劑(如5-氮雜胞苷等)、組蛋白去乙?；噭?如制滴菌素等)、活化素、細(xì)胞因子(如LIF、IL-2、IL-6等)、六亞甲基二乙酰胺(HMBA)、二甲基乙酰胺(DMA)、二丁基cAMP(dbcAMP)、二甲基亞砜(DMSO)、碘脫氧尿苷(IdU)、羥基脲(HU)、阿糖胞苷(AraC)、絲裂霉素C(MMC)、丁酸鈉(NaBu)、凝聚胺及硒等。
對于本發(fā)明的細(xì)胞混合物來說，可以使用任意培養(yǎng)基，只要混合物細(xì)胞可以維持并分化成對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞即可。此類培養(yǎng)基的實(shí)例包括但不限于DMEM、M199、MEM、HBSS(Hank’s平衡鹽溶液)、Ham’s F12、BME、RPMI1640、MCDB104、MCDB153(KGM)等。這些培養(yǎng)基可以添加腎上腺皮質(zhì)類固醇(如地塞米松等)、胰島素、葡萄糖、吲哚美辛、異丁基-甲基黃嘌呤(IBMX)、抗壞血酸-2-磷酸(抗壞血酸-2-磷酸鹽)、抗壞血酸及其衍生物、甘油磷酸、雌激素及其衍生物、孕酮及其衍生物、雄激素及其衍生物、生長因子(如αFGF、βFGF、EGF、IGF、TGF-β、ECGF、BMP、PDGF等)、垂體腺提取物、松果體提取物、視黃酸、維生素D、甲狀腺激素、胎牛血清、馬血清、人血清、肝素、碳酸氫鈉、HEPES、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒酸(如亞硒酸鈉等)、亞油酸、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、去甲基試劑(如5-氮雜胞苷等)、組蛋白去乙?；噭?如制滴菌素等)、活化素、細(xì)胞因子(如LIF、IL-2、IL-6等)、六亞甲基二乙酰胺(HMBA)、二甲基乙酰胺(DMA)、二丁基cAMP(dbcAMP)、二甲基亞砜(DMSO)、碘脫氧尿苷(IdU)、羥基脲(HU)、阿糖胞苷(AraC)、絲裂霉素C(MMC)、丁酸鈉(NaBu)、凝聚胺及硒等，可單獨(dú)添加或聯(lián)合添加。
因此，本發(fā)明在另一方面提供了細(xì)胞混合物，該細(xì)胞混合物包含來自于吸脂所得抽取物的干細(xì)胞和對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞。此類混合物可用于細(xì)胞移植，而且還有這樣的優(yōu)勢，如每一組分的需用量少于現(xiàn)有技術(shù)中使用單種細(xì)胞時(shí)的需用量。另外，還有優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的其他優(yōu)勢，例如包括(1)不需要離體產(chǎn)生再生組織；(2)允許以更確定的方式繁殖更大的組織；(3)有可能以簡單的方式在更短的時(shí)間內(nèi)實(shí)施該方法；(4)不需要進(jìn)行切開器官如皮膚的手術(shù)，有可能只使用針頭來施用(移植)細(xì)胞和/或組織。
本發(fā)明的細(xì)胞混合物優(yōu)選為在足以誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成脂肪的條件下處理過的混合物，但是本發(fā)明并不限于此。細(xì)胞混合物置于分化條件以后，可用于直接移植或分化成組織或器官。
(細(xì)胞移植組合物)另一方面本發(fā)明提供了用于細(xì)胞移植的組合物(如組織外植體，外植體和含這些外植體與組合物)。此移植可用于任何目的，只要其用于治療或預(yù)防與期望部位所對應(yīng)分化細(xì)胞缺陷或退化相關(guān)的疾病、障礙或異常狀況，或是治療或改善美容狀況即可。此類移植優(yōu)選包括但不限于移植入期望部位，并且本發(fā)明的含細(xì)胞的組合物可施用于或移植到任意期望部位，只要最終有可能治療或預(yù)防這樣的期望部位即可。
得自吸脂抽取物的干細(xì)胞與分化細(xì)胞的比例可以是任意比，只要期望的分化發(fā)生即可，一般為約1∶10～約10∶1，優(yōu)選約1∶5～約5∶1，更優(yōu)選1∶2～約2∶1，最優(yōu)選的是各細(xì)胞近似等量存在。該細(xì)胞混合物中，用于移植的分化細(xì)胞及吸脂所得抽取物來源干細(xì)胞可采用如前文所述“制備分化細(xì)胞的方法”部分中所述的任意形式和實(shí)施方案。
相對于將要植入的宿主來說，分化細(xì)胞和脂肪來源前體細(xì)胞可以彼此是異種、同種異體或同基因的。優(yōu)選的是同種異體或同基因的，更優(yōu)選的是同基因的。本發(fā)明并不局限于此。然而不希望受任何理論約束，因?yàn)橛锌赡芤种泼庖吲懦夥磻?yīng)。但是，如果預(yù)計(jì)會有排斥反應(yīng)，本發(fā)明還可包括避免排斥反應(yīng)。避免排斥反應(yīng)的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的(例如，參見“Shin Gekagaku Taikei，Dai 12 Kan，Zoki Ishoku(ShinzoIshoku·Hai Ishoku Gijutsuteki Rinriteki Seibi kara Jisshi ni Mukete[New WholeSurgery，Vol.12，Organ Transplantation(Heart Transplantation·LungTransplantation From Technical and Ethical Improvements to Practice)])”(修訂第3版)，Nakayama Shoten))。此類方法的實(shí)例包括但不限于使用免疫抑制劑或甾體類藥物的方法，等等。例如，目前有下述用于預(yù)防排斥反應(yīng)的免疫抑制劑“環(huán)胞菌素”(SANDIMMUNE/NEORAL)、“他克莫司(tacrolimus)”(PROGRAF)、“硫唑嘌呤”(IMURAN)、“甾體激素”(強(qiáng)的松龍，甲基強(qiáng)的松龍)和“T-細(xì)胞抗體”(OKT3、ATG等)。許多情況下作為預(yù)防性免疫抑制治療的全球廣泛使用的方法是同時(shí)使用環(huán)孢菌素、硫唑嘌呤和甾體激素這三種藥物。理想的是免疫抑制劑與本發(fā)明的藥物制劑同時(shí)使用。本發(fā)明并不局限于此。免疫抑制劑可以在本發(fā)明的再生/治療方法實(shí)施之前或之后使用，只要可以達(dá)到免疫抑制的效果即可。
分化細(xì)胞和脂肪來源前體細(xì)胞可以彼此是異種、同種異體或同基因的。優(yōu)選的是同種異體或同基因的，更優(yōu)選的是同基因的。然而不希望受任何理論約束，這是因?yàn)橥N異體或同基因(自體)(優(yōu)選同基因)的分化細(xì)胞和脂肪來源前體細(xì)胞很有可能形成均一的細(xì)胞群。
上述細(xì)胞混合物或組合物可作為藥物提供。這樣的藥物可用于期望部位所對應(yīng)分化細(xì)胞缺陷或退化相關(guān)的疾病、障礙或異常狀況的治療或預(yù)防，或是治療或改善美容狀況。除了包含所述細(xì)胞混合物或含細(xì)胞混合物的組合物外，本發(fā)明的藥物可包括藥學(xué)上可接受的載體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)目的選擇和使用本文中所述任意載體作為這樣的載體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將可以更改本發(fā)明中所含的組分。
(使用細(xì)胞混合物進(jìn)行治療和預(yù)防)另一方面本發(fā)明提供了分化細(xì)胞缺陷所致疾病、障礙或異常狀況的治療或預(yù)防方法，以及美容狀況的治療或改善方法，這些方法包括以下步驟A)提供一種組合物，其包含a)脂肪來源前體細(xì)胞及b)對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞；以及B)將該組合物施用于受試者。在該方法中，用于移植的分化細(xì)胞及吸脂所得抽取物來源干細(xì)胞可采用如前文所述“制備分化細(xì)胞的方法”部分中所述的任意形式和實(shí)施方案。
本發(fā)明中可使用任意施用方法，包括本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法。例如但不限于使用注射器、導(dǎo)管、管等注射所述組合物。優(yōu)選的是，示范性施用途徑包括但不限于局部注射(皮下注射、器官內(nèi)注射(如肌肉、脂肪等))、靜脈注射、動(dòng)脈注射、施用于組織上等。與常規(guī)技術(shù)相比，本發(fā)明通過植入進(jìn)行治療或預(yù)防的方法具有但不限于下列優(yōu)點(diǎn)(1)不需要在體外(離體)產(chǎn)生再生組織；(2)可更可靠地再生更大的組織；(3)可簡單、迅速地完成再生；(4)不需要進(jìn)行切開器官如皮膚的手術(shù)，可通過針穿刺來施用(植入或移植)細(xì)胞和/或組織。
(用途)另一方面，本發(fā)明提供了由a)脂肪來源前體細(xì)胞和b)對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞所組成的混合物用于細(xì)胞移植的用途，其用于治療或預(yù)防與期望部位所對應(yīng)分化細(xì)胞缺陷或退化相關(guān)的疾病、障礙或異常狀況，或是治療或改善美容狀況。用于移植的分化細(xì)胞及脂肪來源前體細(xì)胞可采用如前文所述“制備分化細(xì)胞的方法”部分中所述的任意形式。
下文將以實(shí)施例的方式說明本發(fā)明。下文所述的實(shí)施例僅用于示范目的。因此，本發(fā)明的范圍僅受所附的權(quán)利要求書限制，而不受上文所述實(shí)施方案或下文所述實(shí)施例限制。
實(shí)施例如無特別說明則下文實(shí)施例中所用試劑從Wako Pure Chemical Industries或Sigma獲得。動(dòng)物的護(hù)理根據(jù)動(dòng)物保護(hù)的精神遵照國家醫(yī)學(xué)研究協(xié)會制定的“實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理原則”及由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源學(xué)會制定并由國立衛(wèi)生研究院發(fā)布的“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南”(NIH出版物，No.86-23，1985年修訂)。人類受試者在進(jìn)行任何試驗(yàn)之前均獲得其知情同意。
(實(shí)施例1吸脂所得抽取物的制備)將過量Tumescent溶液(含0.0001％腎上腺素的鹽水)注入皮下脂肪層(Tumescent方法)，所述過量超過吸脂手術(shù)前待抽吸的吸脂量；然后將內(nèi)徑為2～3mm的插管(金屬制成，帶抽吸器)用于吸脂手術(shù)。吸脂手術(shù)在本領(lǐng)域是公知的，例如可參考BiyoSeikei Shujutsu Practice 2(Cosmetic Operation Practice 2)，ed.Masanari ICHIDA，Ryusaburo TANINO，and Yoshiaki HOSAKA，BUNKODO出版，pp.429-469，將其整體引入作為參考。
抽吸出來的脂肪用鹽水洗滌。約可以產(chǎn)生5到10升的洗滌抽取物，其中起始的1到2升含有豐富的細(xì)胞材料，用于下列操作。
(實(shí)施例2從吸脂所得抽取物制備干細(xì)胞懸液)使用兩種干細(xì)胞制備方法中的任一種將所得抽取物如下所述進(jìn)行處理。下述兩種方法不需要使用酶如膠原酶處理，這些方法與常規(guī)方法以及用常規(guī)技術(shù)從脂肪組織制備的干細(xì)胞的不同之處在于不含酶如膠原酶污染。
(I)制備方法11)吸脂所得抽取物(通常約2～4升)的液體部分于400×g離心10分鐘。
2)棄上清。應(yīng)注意沉淀的細(xì)胞有可能浮起來，因此用抽吸器小心地進(jìn)行抽吸而不破壞細(xì)胞。
3)沉淀的細(xì)胞(大部分為紅細(xì)胞)轉(zhuǎn)移到數(shù)個(gè)50ml聚丙烯管中，然后離心(400×g，5分鐘)。
4)吸出上清。獲得總體積為15～20ml的沉淀細(xì)胞。當(dāng)其中含有大量基質(zhì)組分時(shí)，用100μm的濾器將其過濾掉。之后可根據(jù)需要進(jìn)行離心。
5)在50ml的管中加入Ficoll(注冊商標(biāo))(15ml)。之后緩慢加入15～20ml的細(xì)胞溶液以在上面形成一層。
6)將該管于400×g離心30分鐘(18～20℃)。
7)離心后，細(xì)胞溶液分成4層從最頂層開始分別為A層(無細(xì)胞層，透明)，B層(單核細(xì)胞層，淡紅色)，C層(Ficoll層，透明)，以及D層(紅細(xì)胞層，深紅色)。包括干細(xì)胞的粘附細(xì)胞位于B層和C層中。將A層吸去。將B層和C層(約3ml)回收為細(xì)胞懸液，然后轉(zhuǎn)移到50ml的管中。
8)回收的細(xì)胞懸液中加入補(bǔ)充了血清的PBS(補(bǔ)充有10％FBS或10％人血清的PBS)至體積50ml。通過吹吸使混合物混合，然后離心(400×g，5分鐘)。
9)抽取上清。再加入補(bǔ)充了血清的PBS至體積50ml。通過吹吸使混合物混合，然后離心(400×g，5分鐘)。
10)抽取上清?；厥蘸杉?xì)胞的沉淀細(xì)胞。
(II)制備方法21)吸脂所得抽取物的液體部分在潔凈臺內(nèi)用抽吸管抽吸并經(jīng)濾器(孔徑大小120μm)進(jìn)入儲蓄器。所得濾液用密封分離袋封裝。
2)用細(xì)胞分離器(血液組分分離裝置可從日本東京AMCO，Inc獲得的ASTEC204)離心三次以盡可能地除去比重更小的血小板、比重更大的紅細(xì)胞以及粒細(xì)胞。
3)收集含高濃度干細(xì)胞的級分(約30～40ml)。分離細(xì)胞的比重為1.050～1.075。
細(xì)胞的比重可以如下所述粗略確定。將密度梯度離心介質(zhì)如PercollTM，ReadyGradTM等用氯化鈉溶液或蔗糖溶液進(jìn)行配制。將收集的細(xì)胞與密度標(biāo)記珠加入混合物中，然后進(jìn)行離心?；旌衔锓殖?～10層(取決于珠)。含細(xì)胞的梯層顯示細(xì)胞的比重。
圖1顯示了分離細(xì)胞的照片。
(實(shí)施例3回收干細(xì)胞的表征)實(shí)施例2中回收的干細(xì)胞用FACS按下述方法進(jìn)行表征。
約5ml細(xì)胞懸液用染色介質(zhì)(SM；補(bǔ)充了0.5％牛血清白蛋白及0.05％NaN3的PBS)洗滌兩次。根據(jù)需要可進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
加入標(biāo)記抗體(標(biāo)記藻紅蛋白(PE)、allophycocyannin(APC)和/或熒光素異硫氰酸酯(FITC))到約1～10×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液中，使其終濃度為0.001～0.1μg/ml。
將混合物置冰上孵育30分鐘，然后洗滌細(xì)胞。細(xì)胞懸浮液的濃度用SM調(diào)到約5×105細(xì)胞/ml。
使用FACS Vantage(Becton Dickinson)?？贵w標(biāo)記用作分析所分離干細(xì)胞中各CD蛋白表達(dá)的標(biāo)志物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)來源于吸脂所得抽取物液體部分的干細(xì)胞表達(dá)CD90和CD49d，如表1所示。
分離的干細(xì)胞在DMEM中傳代培養(yǎng)(subculture)兩次。傳代培養(yǎng)于80％匯合時(shí)進(jìn)行。第二次傳代培養(yǎng)后細(xì)胞用FACS如上所述進(jìn)行分析。結(jié)果如表1所示。
(表1兩次傳代培養(yǎng)后各CD在干細(xì)胞中的表達(dá))CD 表達(dá)水平3 -4 -11c-
13++14-15-16-19-29++31+33-34+36++38-44+45+49d ++54+56-58+61-62E -62P -69-71++73++90++104 -105 ++106 -117 +135 -144 -146 +151 ++235a -SH3 +STRO-1+“-”＝未檢測到表達(dá)+和++表示20％
“+”＝在20％或更少的細(xì)胞中檢測到，“++”＝在20％或更多細(xì)胞中檢測到。
根據(jù)上述結(jié)果，盡管從吸脂所得抽取物液體部分制備的干細(xì)胞包括與間充質(zhì)干細(xì)胞對應(yīng)的細(xì)胞群，但這些干細(xì)胞包括CD31和CD34陽性細(xì)胞，這是常規(guī)技術(shù)所制備脂肪來源干細(xì)胞所不包含的。因此，可以理解的是本發(fā)明方法制備的干細(xì)胞可容易、高效地分化成血管內(nèi)皮(血管形成)。另外，本文中用作標(biāo)記的CD表達(dá)在兩次傳代培養(yǎng)后得到證實(shí)。因此，可以理解的是本發(fā)明的干細(xì)胞在經(jīng)過約兩次傳代培養(yǎng)后基本不改變表型。
(實(shí)施例4表征從得自多個(gè)受試者的吸脂所得抽取物液體部分回收的干細(xì)胞)進(jìn)一步從得自多個(gè)受試者的吸脂所得抽取物的液體部分回收干細(xì)胞，然后加以表征。結(jié)果如下所示。
(表2回收于得自多個(gè)受試者吸脂所得抽取物的液體部分的干細(xì)胞表征結(jié)果)

數(shù)字表示在細(xì)胞群中表達(dá)各種蛋白的干細(xì)胞的比例(％)，“-”＝未檢測到表達(dá)，“+”＝檢測到表達(dá)，而N.T.＝未檢測。
大部分收集到的干細(xì)胞對CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和SH3呈陽性。因此本發(fā)明的脂肪來源前體細(xì)胞是表達(dá)選自下組的至少一種蛋白質(zhì)的細(xì)胞CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和SH3。表達(dá)CD106的干細(xì)胞是本發(fā)明中所用脂肪來源前體細(xì)胞的特性之一。干細(xì)胞群的一部分對于CD31、CD45、CD117和CD146呈陽性，而另一部分呈陰性。
干細(xì)胞群對CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144呈陰性。因此，本發(fā)明的脂肪來源前體細(xì)胞是不表達(dá)選自下組的至少一種蛋白質(zhì)的細(xì)胞CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144。
當(dāng)干細(xì)胞群在分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，器官特異性如骨特異性、軟骨特異性、脂肪特異性等的蛋白表達(dá)在2～3周后可以識別。所述干細(xì)胞群不表達(dá)大部分成纖維細(xì)胞表達(dá)的CD56，這不同于人真皮來源的培養(yǎng)成纖維細(xì)胞。相反，干細(xì)胞群中的CD105表達(dá)在成纖維細(xì)胞中通常觀察不到。干細(xì)胞群所表現(xiàn)出來的CD49d表達(dá)在骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞中通常觀察不到。
另外，對于CD31、CD34、CD36、CD45、CD106和CD117來說，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間長的時(shí)侯，這些CD的表達(dá)傾向于消失。因此，如果繼續(xù)傳代培養(yǎng)，所觀察到的CD106表達(dá)可能就觀察不到了。
(實(shí)施例5將來自于吸脂所得抽取物的干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞)如下所述將來源于吸脂所得抽取物的干細(xì)胞置于脂肪發(fā)生DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞。
所用脂肪發(fā)生DMEM具有如下組成DMEM(補(bǔ)充有10％FBS) 100ml異丁基-甲基黃嘌呤(0.5M) 100μl(終濃度為0.5mM)地塞米松(10-4M) 1ml(終濃度為1μM)胰島素(10-3M) 1ml(終濃度為10μM)吲哚美辛 100μl(終濃度為200μM)
按實(shí)施例2制備的約三十萬干細(xì)胞進(jìn)行不傳代培養(yǎng)約4周。結(jié)果如圖2所示，干細(xì)胞分化成細(xì)胞內(nèi)含有貯存脂肪樣物質(zhì)的細(xì)胞。
將分化細(xì)胞按如下方法用油紅染色，證實(shí)貯存脂肪樣物質(zhì)為脂肪，而該分化細(xì)胞實(shí)際上是脂肪細(xì)胞。
如下所述進(jìn)行油紅染色1)棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌；2)細(xì)胞用10％福爾馬林固定約10分鐘；3)用蒸餾水洗滌；4)加入60％異丙醇約1分鐘；5)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到油紅O染色液*中15分鐘；6)加入60％異丙醇約1分鐘；7)用蒸餾水洗滌；8)加入蘇木精兩分鐘使細(xì)胞核染色；9)用蒸餾水洗滌；10)加入碳酸鋰**數(shù)秒，進(jìn)行著色；11)用蒸餾水洗滌。
*油紅O染色液如下制備將0.3g油紅O(SIGMAO-0625)溶于100ml的99％異丙醇中。使用時(shí)，將此溶液和蒸餾水以6∶4的比例混合并用力振搖?；旌?分鐘后，將所得溶液加以過濾，備用。
**碳酸鋰如下制備將3mg碳酸鋰溶夜(1.54g溶于100ml蒸餾水中；Sigma-Aldrich)加到100ml蒸餾水中。
染色細(xì)胞的照片見圖3。如圖3所示，實(shí)施例2中制備的干細(xì)胞在上述脂肪發(fā)生DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，以證實(shí)貯存于細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)為脂肪，因此從干細(xì)胞分化而來的細(xì)胞實(shí)際上是脂肪細(xì)胞。
(實(shí)施例6將來自于吸脂所得抽取物的干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞)如下所述將來源于吸脂所得抽取物的干細(xì)胞置于軟骨發(fā)生DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞。
如下所述制備軟骨發(fā)生DMEM1)將DMEM(不加血清，加入合適的抗生素)100ml、胰島素(6.25mg/ml)100μl(加入量625μl)、抗壞血酸-2-磷酸(5μM)1ml(終濃度為50nM)以及胎牛血清1mL(終濃度1％)混合。
2)所得混合物用0.22μm的濾器過濾后，加入1ml TGF-β1(1μg/ml)，吹吸后于4℃儲存。
按實(shí)施例2制備的約三十萬干細(xì)胞進(jìn)行不傳代培養(yǎng)約4周。結(jié)果如圖4所示，干細(xì)胞分化為軟骨樣細(xì)胞，這些細(xì)胞形成微細(xì)胞團(tuán)。
分化細(xì)胞用阿辛藍(lán)染色以證實(shí)該分化細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。
如下所述進(jìn)行阿辛藍(lán)染色1)棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌；2)細(xì)胞用10％福爾馬林固定約10分鐘；3)加入3％醋酸溶液3分鐘；4)加入阿辛藍(lán)染色溶液*約1小時(shí)；5)加入3％醋酸溶液3分鐘；6)用蒸餾水洗滌2兩分鐘；7)加入核堅(jiān)牢紅(Nulcear Fast Red)(Kernechtrot)**2分鐘；8)用蒸餾水洗滌。
*將1g阿辛藍(lán)8GX溶于3％醋酸水溶液100ml，過濾備用。
**核堅(jiān)牢紅溶液如下所述制備0.1g核堅(jiān)牢紅(核酸酶固紅(nuclease fast red))加入100ml蒸餾水中，加入5g硫酸鋁，煮沸溶液。過濾備用。
用阿辛藍(lán)紅染色的細(xì)胞照片見圖5。如圖5所示，證實(shí)了在上述軟骨發(fā)生DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的干細(xì)胞實(shí)際上是軟骨細(xì)胞。
(實(shí)施例7脂肪組織的制備)接下來，作為分化細(xì)胞，從知情同意的人受試者制備脂肪組織。用本領(lǐng)域內(nèi)公知的技術(shù)進(jìn)行分離。簡要地說，從知情同意的人受試者抽吸脂肪組織，并無菌分離出人脂肪組織。組織團(tuán)保存于用于脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)基(500ml組成＝Eagle’s培養(yǎng)基4.75g、10％NaHCO310ml、谷氨酰胺0.3g、卡那霉素(20mg/ml)1.5ml、青鏈霉素5ml、FBS(10％))中。組織團(tuán)可作為組織團(tuán)使用，或可以分離成脂肪細(xì)胞后使用。
Eagle’s培養(yǎng)基的成分(每9.5g)氯化鈉6400mg氯化鉀400mg氯化鈣(無水) 200mg硫酸鎂(無水) 97.7mg磷酸二氫鈉(無水) 108mg硝酸汞(九水合物) 0.1mg葡萄糖1000mg丙酮酸鈉 110mg琥珀酸106mg琥珀酸鈉(六水合物)27mg鹽酸L-精氨酸 84mg鹽酸L-半胱氨酸(一水合物) 70.3mg甘氨酸30mg鹽酸L-組氨酸(一水合物)42mgL-異亮氨酸104.8mgL-亮氨酸 104.8mg鹽酸L-賴氨酸 146.2mgL-甲硫氨酸30mgL-苯丙氨酸66mgL-絲氨酸 42mg
L-蘇氨酸95.2mgL-色氨酸16mgL-酪氨酸二鈉89.5mgL-纈氨酸93.6mg重酒石酸膽堿7.2mg葉酸4mg煙酰胺 4mg泛酸鈣 4mg鹽酸吡哆醛 4mg核黃素 0.4mg鹽酸硫胺素 4mgi-肌醇 7.2mg酚紅5mg(實(shí)施例8脂肪細(xì)胞混合物)接下來實(shí)施例2中制備的脂肪來源前體細(xì)胞(PLA)不經(jīng)進(jìn)一步處理即與實(shí)施例6中制備為分化細(xì)胞的脂肪組織(脂肪細(xì)胞群)混合。確定分化是否被促進(jìn)而引起再生。
取實(shí)施6中制備的脂肪組織團(tuán)(A)1ml(900mg)或1ml(900mg)該脂肪組織團(tuán)與10ml實(shí)施例2中制備的抽吸脂肪來源的干細(xì)胞的混合物(B)皮下注入SCID小鼠(Charles River，日本)的背部。用注射器進(jìn)行注射。4周后從注射部位收集組織。測定植入脂肪組織的重量并分析該組織。
可以證實(shí)來源于吸脂抽取物的干細(xì)胞混合物在維持組織重量方面的作用。
(由脂肪細(xì)胞混合物再生脂肪組織)混合脂肪來源的干細(xì)胞與脂肪組織時(shí)，再生脂肪的平均重量比單獨(dú)的脂肪組織重。這清楚地說明了PLA的影響。當(dāng)切開SCID小鼠進(jìn)行檢查時(shí)可以證實(shí)再生的作用。正如看到的一樣，當(dāng)施用含脂肪來源干細(xì)胞的混合物時(shí)，組織明顯更大。
只注射脂肪組織時(shí)，4周后脂肪組織的重量約減至原來的一半。這可能是因?yàn)橹窘M織發(fā)生了壞死。施用含脂肪來源干細(xì)胞的混合物時(shí)組織重量可以維持的原因被認(rèn)為是脂肪來源的干細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成脂肪組織，或者脂肪來源的干細(xì)胞可以防止組織破壞，或者兩者兼而有之。
(實(shí)施例9在DMEM中維持和培養(yǎng)的PLA的作用)實(shí)施例2中制備的、來源于吸脂所得抽取物的干細(xì)胞維持于DMEM培養(yǎng)基(與實(shí)施例7中所用培養(yǎng)基相同)中。所得脂肪來源干細(xì)胞用于證實(shí)類似的效果。具體地說，此制品用于代替實(shí)施例2中制備并在實(shí)施例7中使用的脂肪來源干細(xì)胞或脂肪來源前體細(xì)胞(PLA)。
結(jié)果是2.50×108個(gè)所述脂肪來源干細(xì)胞加到900mg脂肪中時(shí)，約40～50％的脂肪組織成功地生長。因此發(fā)現(xiàn)可以使用收集并維持于生長培養(yǎng)基中的干細(xì)胞。
(實(shí)施例10在M199中培養(yǎng)的脂肪來源干細(xì)胞的作用)用在M199中培養(yǎng)的脂肪來源干細(xì)胞代替實(shí)施例2中制備并在實(shí)施例7中使用的脂肪來源干細(xì)胞或脂肪來源前體細(xì)胞(PLA)。M199含有以下成分。
M199(用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基)的成分(每升)199培養(yǎng)基 9.5gNaHCO32.2gFBS (15％)酸性FGF 2μg肝素5mg抗菌抗霉菌素10ml(注意)下列成分的單位為mg/mlL-丙氨酸50鹽酸L-精氨酸70
L-天冬氨酸60L-半胱氨酸0.1L-胱氨酸 20L-谷氨酸 150(H2O)L-谷氨酰胺100甘氨酸50鹽酸L-組氨酸一水合物 20羥基-L-脯氨酸 10L-異亮氨酸40L-亮氨酸 120鹽酸L-賴氨酸 70L-甲硫氨酸30L-苯丙氨酸50L-脯氨酸 40L-絲氨酸 50L-蘇氨酸 60L-色氨酸 20L-酪氨酸 40L-纈氨酸 50谷胱甘肽(還原型) 0.05CaCl2.2H2O 264.9KCl 400MgSO4.7H2O 97.7(無水形式)NaCl 6800NaHCO32200NaH2PO4140(2H2O)Fe(NO3)3.9H2O 0.72
CH3COONa.3H2O 83酚紅 15D-生物素 0.01葉酸 0.01煙酰胺 0.025泛酸鈣 0.01鹽酸吡哆醛 0.025鹽酸吡哆醇 0.025核黃素 0.01鹽酸硫胺素 0.01腺嘌呤 10(SO4)氯化膽堿 0.5次黃嘌呤 0.3i-肌醇 0.05對氨基苯甲酸 0.05鹽酸鳥嘌呤 0.3黃嘌呤 0.3胸腺嘧啶 0.3尿嘧啶 0.3煙酸 0.025維生素A 0.1鈣化醇 0.1甲萘醌 0.01α-生育酚0.05抗壞血酸 20吐溫80 20膽固醇 0.2
ATP·2Na1腺苷酸 0.2核糖0.5脫氧核糖0.5結(jié)果發(fā)現(xiàn)在M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)的脂肪來源前體細(xì)胞加到脂肪中時(shí)，脂肪組織可以生長。因此發(fā)現(xiàn)可以使用收集后維持在任意培養(yǎng)基中的干細(xì)胞。
(實(shí)施例11骨細(xì)胞應(yīng)用)接下來用骨細(xì)胞進(jìn)行類似的本發(fā)明細(xì)胞混合物的植入試驗(yàn)。對于骨細(xì)胞來說，用本領(lǐng)域內(nèi)公知的技術(shù)從小鼠收集骨(骨組織)。將骨組織與實(shí)施例2中制備的PLA混合，將混合物植入骨中。此時(shí)觀察到本發(fā)明的混合植入物支持骨的再生。
(實(shí)施例12血管形成應(yīng)用)接下來用血管細(xì)胞進(jìn)行類似的本發(fā)明細(xì)胞混合物的植入試驗(yàn)。對于血管細(xì)胞來說，用本領(lǐng)域內(nèi)公知的技術(shù)從小鼠收集血管(血管組織)。將血管組織與實(shí)施例1中制備的PLA混合，將混合物植入血管中。此時(shí)觀察到本發(fā)明的混合移植物支持血管的再生。
(實(shí)施例13干細(xì)胞制備條件的測定)(實(shí)施例2從吸脂所得抽取物制備干細(xì)胞懸液)(I)制備方法1中用于細(xì)胞層的密度梯度離心條件是用Ficoll于400×g離心30分鐘。接下來對此密度梯度離心條件進(jìn)一步作詳細(xì)的測定。
(1)所用介質(zhì)的研究用于密度梯度離心的可用介質(zhì)除了Ficoll外還包括Percoll、Histopaque及Lymphoprep等。用這些介質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞層的密度梯度離心并將其結(jié)果與使用Ficoll的結(jié)果進(jìn)行比較。分離的細(xì)胞用FACS測定。表現(xiàn)最高純度的介質(zhì)是Ficoll。
(2)離心條件的研究實(shí)施例2中離心操作于400×g進(jìn)行30分鐘。下面研究了下述離心條件。
以Ficoll為分離干細(xì)胞的介質(zhì)測試了200×g離心60分鐘、400×g離心20分鐘、400×g離心30分鐘、400×g離心40分鐘、600×g離心30分鐘以及800×g離心20分鐘。用FACS分析細(xì)胞純度。400×g離心30分鐘時(shí)分離干細(xì)胞的純度和收率最高。
(實(shí)施例14從吸脂所得材料制備干細(xì)胞)下面為了在分離成抽取物和組織(以下也稱“脂肪組織+抽取物”)之前檢驗(yàn)吸脂所得材料，我們用分離之前的吸脂材料進(jìn)行類似的分離試驗(yàn)。
此分離方法如下所述1.向含“脂肪組織+抽取物”(脂肪組織位于“抽取物”之上)的帶蓋容器中加入膠原酶(7.5％膠原酶，Sigma，加入總樣本體積的1/100)，以適當(dāng)?shù)乃俣日駬u。于37℃振搖30分鐘后，脂肪細(xì)胞間基質(zhì)的主要組分——膠原被降解，有助于脂肪細(xì)胞的分離。此處使用8個(gè)500ml的管或4個(gè)1000ml的管。
2.所得樣品于800×g離心，從而將脂肪組分和細(xì)胞分離，脂肪組分的比重小于細(xì)胞的比重。離心后，材料分成4層，包括油層、基質(zhì)層、液體層和細(xì)胞層。
3.吸取油層、基質(zhì)層和液體層，只取細(xì)胞層。將細(xì)胞層可選地用500μm和250μm的濾器過濾?？雌饋?00μm的濾器不是必須的。
4.加入10ml裂解液(例如，氯化銨和碳酸氫鉀水溶液)，攪拌2～5分鐘使紅細(xì)胞裂解。任選地可略去此裂解步驟。
5.向所得沉淀中加入磷酸鹽緩沖液。終止裂解緩沖液反應(yīng)。裂解樣品用100μm濾器過濾。用175ml的圓錐形管離心。
6.所得樣品進(jìn)一步于800×g或400×g離心5分鐘。沉淀細(xì)胞就是感興趣的細(xì)胞。
7.吸去上清以除去不必要的溶液，得到細(xì)胞濃縮物。
對收集到的細(xì)胞進(jìn)行類似分析。
(實(shí)施例15來自“脂肪組織+抽取物”的干細(xì)胞)按實(shí)施例4分析實(shí)施例14制備的干細(xì)胞。
大部分從“脂肪組織+抽取物”收集的干細(xì)胞對CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和SH3呈陽性。因此本發(fā)明的脂肪來源前體細(xì)胞是表達(dá)選自下組的至少一種蛋白質(zhì)的細(xì)胞CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和SH3。表達(dá)CD106的干細(xì)胞是本發(fā)明中所用脂肪來源前體細(xì)胞的特性之一。干細(xì)胞群的一部分對于CD31、CD45、CD117和CD146呈陽性，而另一部分呈陰性。
來自“脂肪組織+抽取物”的干細(xì)胞群對于CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144呈陰性。因此，本發(fā)明的脂肪來源前體細(xì)胞是不表達(dá)選自CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144的至少一種的細(xì)胞。
當(dāng)來自“脂肪組織+抽取物”的干細(xì)胞群在分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，器官特異性如骨特異性、軟骨特異性、脂肪特異性等的蛋白表達(dá)在2～3周后可以識別。所述干細(xì)胞群不表達(dá)大部分成纖維細(xì)胞表達(dá)的CD56，這不同于人真皮來源的培養(yǎng)成纖維細(xì)胞。相反，干細(xì)胞群中的CD105表達(dá)在成纖維細(xì)胞中通常觀察不到。干細(xì)胞群表現(xiàn)的CD49d表達(dá)在骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞中通常觀察不到。
另外，對于CD31、CD34、CD36、CD45、CD106和CD117來說，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間長的時(shí)侯，這些CD的表達(dá)傾向于消失。因此，如果繼續(xù)傳代培養(yǎng)，所觀察到的CD106表達(dá)可能就觀察不到了。
如上所述，即使使用“脂肪組織+抽取物”作為干細(xì)胞的來源也可得到具有良好質(zhì)量的干細(xì)胞。因此說明分開或分離脂肪組織(脂肪)對于從吸脂材料獲得干細(xì)胞是不必要的。而且可從所述材料中獲得大量干細(xì)胞。
(實(shí)施例16本發(fā)明干細(xì)胞的生長)接下來按實(shí)施例2(制備方法1)處理吸脂抽取物以得到干細(xì)胞，只是省略除去紅細(xì)胞這一步。
將1.8×107個(gè)制備的干細(xì)胞置60mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)皿中用M199(使用明膠包被的培養(yǎng)皿)和DMEM(使用未包被培養(yǎng)血)作為培養(yǎng)基。從第6天(或第二輪的第3天)開始進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后隔天計(jì)數(shù)一次。
結(jié)果如下第1輪

第2輪

如上表所示，可以看出去除紅細(xì)胞不是高效獲得干細(xì)胞所必須的，因?yàn)榧?xì)胞生長曲線與從吸脂所得抽取物制備的干細(xì)胞類似。生長曲線也如圖6所示。圖7～圖10為顯示干細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基(圖7＝第一輪，第6、8、10和第12天；圖8＝第二輪，第3、5、7和第9天)和M199培養(yǎng)基(圖9＝第一輪，第6、8、10和第12天；圖10＝第二輪，第3、5、7和第9天)中生長的照片，所述干細(xì)胞由吸脂所得材料不經(jīng)除去紅細(xì)胞而制備。
(實(shí)施例17亞匯合條件生長的測定)此實(shí)施例證明在亞匯合條件下進(jìn)行培養(yǎng)導(dǎo)致誘導(dǎo)分化成各種分化細(xì)胞。
所用方案如下所述1)分化成骨收集的細(xì)胞置60mm培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，細(xì)胞濃度為1.8×107細(xì)胞/皿，培養(yǎng)基為DMEM。培養(yǎng)十天后細(xì)胞達(dá)到亞匯合，此時(shí)現(xiàn)用培養(yǎng)基用分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(組成示例性骨發(fā)生培養(yǎng)基可以是DMEM，再添加10％FBS和5％馬血清，還含有1μM地塞米松、50μM抗壞血酸-2-磷酸、10mM的β-甘油磷酸和1％ABAM)替換，繼續(xù)培養(yǎng)22天。通過馮科薩染色觀察細(xì)胞。
馮科薩染色棄去培養(yǎng)基，取感興趣的樣品用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌。洗滌后的樣品用4％多聚甲醛固定10分鐘。之后用milliQ水洗滌樣品。然后在暗處將樣品與2.5％硝酸銀接觸20分鐘。之后用milliQ水洗滌樣品。然后將樣品置熒光燈下15分鐘。將樣品與0.5％的氫醌孵育2分鐘，隨后與5％的硫代硫酸鈉孵育2分鐘。之后用milliQ水洗滌樣品。然后將樣品與核堅(jiān)牢紅染色2分鐘。之后用milliQ水洗滌樣品。然后用MountQuick(Daido Sangyo，日本)對樣品計(jì)數(shù)，并在顯微鏡下觀察。
2)分化為軟骨細(xì)胞收集的細(xì)胞置60mm培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，細(xì)胞濃度為1.8×107細(xì)胞/皿，培養(yǎng)基為DMEM。培養(yǎng)十天后細(xì)胞達(dá)到亞匯合，此時(shí)現(xiàn)用培養(yǎng)基用分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(組成示范性軟骨發(fā)生培養(yǎng)基可以是補(bǔ)充有1％FBS的DMEM，其中還含有6.25μg/ml胰島素、6.25μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、10ng/ml的TGFβ1、50nM抗壞血酸-2-磷酸和1％ABAM)替換，繼續(xù)培養(yǎng)22天。通過阿辛藍(lán)染色觀察細(xì)胞。
阿辛藍(lán)染色將培養(yǎng)基從感興趣樣本中棄去。樣品用4％多聚甲醛固定10分鐘。之后用milliQ水洗滌樣品。然后用3％醋酸洗滌樣品3分鐘。將樣品浸入阿辛藍(lán)染色液(組成示范性脂肪發(fā)生培養(yǎng)基可以是補(bǔ)充有10％FBS的DMEM，其中含有0.5mM的IBMX、1μM地塞米松、10μM胰島素、200μM吲哚美辛和1％AMAM)中30分鐘。然后用3％醋酸洗滌樣品3分鐘。之后用milliQ水洗滌樣品。然后將樣品用核堅(jiān)牢紅染色2分鐘。之后用milliQ水洗滌樣品。然后用MountQuick(Daido Sangyo，日本)對樣品計(jì)數(shù)，并在顯微鏡下觀察。
3)分化為脂肪收集的細(xì)胞置60mm培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，細(xì)胞濃度為1.8×107細(xì)胞/皿，培養(yǎng)基為DMEM。培養(yǎng)十天后細(xì)胞達(dá)到亞匯合，此時(shí)現(xiàn)有培養(yǎng)基用分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(組成示范性脂肪發(fā)生培養(yǎng)基可以是補(bǔ)充有10％FBS的DMEM，其中還含有0.5mM的IBMX、1μM地塞米松、10μM胰島素、200μM吲哚美辛和1％AMAM)替換，繼續(xù)培養(yǎng)22天。通過油紅O染色觀察細(xì)胞。
油紅O染色棄去培養(yǎng)基，取感興趣的樣品用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌。洗滌后的樣品用4％多聚甲醛(PFA)固定10分鐘。之后用milliQ水洗滌樣品。將樣品浸入60％異丙醇中1分鐘。之后用milliQ水洗滌樣品。然后將樣品浸入蘇木精中10分鐘。之后用milliQ水洗滌樣品。然后將樣品浸入碳酸鋰中數(shù)秒，之后用milliQ水洗滌樣品。然后用MountQuick(Daido Sangyo，日本)對樣品計(jì)數(shù)，并在顯微鏡下觀察。
1)油紅O染色液如下制備將0.3g油紅O溶于100ml的99％異丙醇中。使用時(shí)，將此溶液和MilliQ水以6∶4的比例混合，振搖后放置30分鐘?；旌先芤涸谑褂们凹右赃^濾。
2)碳酸鋰溶液將3ml碳酸鋰飽和溶液(1.54g碳酸鋰每100ml)加到100ml的milliQ水中。
結(jié)果見圖11～圖20。從圖中可見按實(shí)施例3或?qū)嵤├?5制備的干細(xì)胞具有良好的多潛能性質(zhì)。
(實(shí)施例18亞匯合條件下生長的測定-無紅細(xì)胞除去步驟)此實(shí)施例證明在亞匯合條件下進(jìn)行培養(yǎng)導(dǎo)致誘導(dǎo)分化成各種分化細(xì)胞，即使是制備的原材料不經(jīng)紅細(xì)胞去除步驟也是如此。
所用分化步驟同實(shí)施例17。
結(jié)果與實(shí)施例17類似。結(jié)果是不經(jīng)紅細(xì)胞去除步驟而制備的干細(xì)胞具有良好的多潛能性質(zhì)。
(實(shí)施例19用分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化)此實(shí)施例證明用分化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)導(dǎo)致誘導(dǎo)分化成各種分化細(xì)胞。
所用方案如下所述1)分化為骨收集的細(xì)胞種植于60mm培養(yǎng)皿上，細(xì)胞濃度為1.8×107細(xì)胞/皿，培養(yǎng)基為分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(組成示范性骨發(fā)生培養(yǎng)基可以是補(bǔ)充有10％FBS和5％馬血清的DMEM，其中還含有1μM地塞米松、50μM抗壞血酸-2-磷酸、10mM的β-甘油磷酸和1％ABAM)。樣品培養(yǎng)22天后用馮科薩染色進(jìn)行評估。馮科薩染色如上述實(shí)施例17所述進(jìn)行。
2)分化為脂肪收集的細(xì)胞種植于60mm培養(yǎng)皿上，細(xì)胞濃度為1.8×107細(xì)胞/皿，培養(yǎng)基為分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(組成示范性脂肪發(fā)生培養(yǎng)基可以是補(bǔ)充有10％FBS的DMEM，其中還含有0.5mM的IBMX、1μM地塞米松、10μM胰島素、200μM吲哚美辛和1％AMAM)。樣品培養(yǎng)25天后用油紅O染色進(jìn)行評估。油紅O染色如上述實(shí)施例17所述進(jìn)行。
結(jié)果見圖21-圖26。從圖中可見按實(shí)施例3或?qū)嵤├?5制備的干細(xì)胞不經(jīng)過培養(yǎng)成亞匯合狀態(tài)即應(yīng)用分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基時(shí)具有良好的多潛能性質(zhì)。
(實(shí)施例20分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基生長的測定-無紅細(xì)胞除去步驟)此實(shí)施例證明用分化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)導(dǎo)致誘導(dǎo)分化成各種分化細(xì)胞，即使是制備的原材料不經(jīng)紅細(xì)胞去除步驟也是如此。
所用分化步驟同實(shí)施例19。
結(jié)果與實(shí)施例19類似。結(jié)果是不經(jīng)紅細(xì)胞去除步驟而制備的干細(xì)胞具有良好的多潛能性質(zhì)。
(實(shí)施例21定量)本實(shí)施例展示了可從吸脂所得材料獲得的干細(xì)胞數(shù)。簡單地對每特定體積的細(xì)胞樣品進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)來進(jìn)行定量。
結(jié)果見下表。下表包括剛制備后及培養(yǎng)7天后的細(xì)胞數(shù)。通過培養(yǎng)干細(xì)胞樣品將血細(xì)胞除去，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞的濃度升高了。

如上所示，吸脂所得抽取物(LFA)含有與單獨(dú)固體脂肪組織相當(dāng)量的干細(xì)胞。因此，這有利于使用吸脂所得抽取物和/或含有此吸脂所得抽取物和脂肪組織的材料作為制備干細(xì)胞的來源。
盡管本文描述了一些優(yōu)選實(shí)施方案，這并不意味著這些實(shí)施方案對本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制，本發(fā)明的范圍只受所提出的權(quán)利要求書限制。本文所引用的所有專利、已公開專利申請及出版物均引入本文作為參考，就像其全文在本說明書中列出一樣。
對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，不脫離本發(fā)明范圍及實(shí)質(zhì)，各種其它變化是顯而易見的，也是容易實(shí)施的。因此并不意味著所附權(quán)利要求書的范圍僅限于本文所提出的說明，而是對所述權(quán)利要求書的廣義解釋。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明證實(shí)了來源于吸脂所得抽取物、可以簡單方式獲得的干細(xì)胞可以應(yīng)用于再生藥物。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明在藥物產(chǎn)業(yè)等的工業(yè)實(shí)用性。
權(quán)利要求
1.一種制備干細(xì)胞的方法，包括A)獲得吸脂所得抽取物；B)將吸脂所得抽取物離心以獲得細(xì)胞級分；C)將細(xì)胞級分進(jìn)行比重離心；以及D)收集比重小于紅細(xì)胞的細(xì)胞層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述吸脂所得抽取物用鹽水或林格氏溶液制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述離心以等于或小于800×g的速度進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述離心以等于或小于400×g的速度進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述比重離心以370×g-1,100×g的速度進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述比重離心在20攝氏度下使用比重為1.076～1.078g/ml的介質(zhì)進(jìn)行。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述比重離心的所述介質(zhì)選自Ficoll、Percoll和蔗糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述比重離心介質(zhì)為Ficoll。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所收集細(xì)胞層的比重在1.050～1.075之間。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞層的收集用移液器進(jìn)行。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，還包括將所述細(xì)胞層在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟，該培養(yǎng)基含有選自DMEM、M199、MEM、HBSS、Ham’s F12、BME、RPMl1640、MCDB104、MCDB153(KGM)及其混合物的組分。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述比重離心包括密度梯度離心。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，還包括除去血細(xì)胞的步驟。
14.一種制備干細(xì)胞的方法，包括A)獲得吸脂所得材料；和B)將吸脂所得材料離心以獲得細(xì)胞級分，而不分離脂肪組織。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，還包括將所述材料置于至少一部分細(xì)胞脫離所述材料的條件下。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述條件用于細(xì)胞外基質(zhì)的降解。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，所述細(xì)胞外基質(zhì)降解通過膠原酶實(shí)現(xiàn)。
18.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，還包括除去步驟B)中上清液的步驟。
19.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，還包括過濾步驟B)所得材料的步驟。
20.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，還包括除去血細(xì)胞的步驟。
21.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中除去血細(xì)胞的步驟包括加入降解血細(xì)胞的組分。
22.一種制備干細(xì)胞的方法，包括i)獲得吸脂所得材料；ii)將所述材料置于至少一部分細(xì)胞脫離所述材料的條件下，而不分離脂肪組織；iii)將所述材料進(jìn)行離心；iv)向所述材料加入降解血細(xì)胞的組分并攪拌所述材料；v)將所述材料進(jìn)行離心以獲得沉淀；以及vi)從所述沉淀抽取材料的上清液。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中將材料置于所述條件的步驟包括維持吸脂所得抽取物。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述吸脂所得材料包含吸脂所得抽取物和脂肪。
25.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述步驟ii)中所述條件包括加入膠原酶。
26.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述步驟iii)的離心以400～1200×g進(jìn)行。
27.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述降解血細(xì)胞的組分包含氯化銨和碳酸氫鉀。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述氯化銨在組分中的含量為155mM。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述碳酸氫鉀在組分中的含量為10mM。
30.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述步驟v)的所述離心以400～1200×g進(jìn)行。
31.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述沉淀含有干細(xì)胞。
32.根據(jù)權(quán)利要求1～31中任一項(xiàng)所述方法制備的干細(xì)胞。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的干細(xì)胞，其表達(dá)選自CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和SH3的至少一種蛋白質(zhì)。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的干細(xì)胞，其表達(dá)CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和SH3。
35.根據(jù)權(quán)利要求33的干細(xì)胞，還表達(dá)選自CD31、CD45、CD117和CD146的至少一種蛋白質(zhì)。
36.根據(jù)權(quán)利要求32的干細(xì)胞，不表達(dá)CD56。
37.根據(jù)權(quán)利要求32的干細(xì)胞，不表達(dá)選自CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144的至少一種蛋白質(zhì)。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的干細(xì)胞，不表達(dá)CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144。
39.根據(jù)權(quán)利要求32的干細(xì)胞，表達(dá)CD49d，而不表達(dá)CD56。
40.一種制備干細(xì)胞的系統(tǒng)，包含A)獲得吸脂所得抽取物的裝置；B)將吸脂所得抽取物進(jìn)行離心以獲得細(xì)胞級分的裝置；以及C)將所述細(xì)胞級分進(jìn)行比重離心的裝置。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的系統(tǒng)，其中該系統(tǒng)還包含D)收集比重小于紅細(xì)胞的細(xì)胞層的裝置。
42.一種制備干細(xì)胞的系統(tǒng)，包含A)獲得吸脂所得材料的裝置；以及B)將所述吸脂所得材料進(jìn)行離心以獲得細(xì)胞級分而不分離脂肪組織的裝置。
43.一種制備干細(xì)胞的系統(tǒng)，包含i)獲得吸脂所得材料的裝置；ii)將所述材料置于不分離脂肪組織而使至少一部分細(xì)胞脫離所述材料的條件下的裝置；iii)將所述材料進(jìn)行離心的裝置；iv)向所述材料加入降解血細(xì)胞的組分并攪拌所述材料；v)將所述材料進(jìn)行離心以獲得沉淀的裝置；以及vi)從所述沉淀抽取材料上清液的裝置。
44.一種獲取外植體的方法，包括A)獲得吸脂所得抽取物；B)將所述吸脂所得抽取物進(jìn)行離心以獲得細(xì)胞級分；C)將所述細(xì)胞級分進(jìn)行比重離心；D)收集比重小于紅細(xì)胞的細(xì)胞層；E)培養(yǎng)所收集的細(xì)胞層以獲得外植體。
45.一種制備組織移植物的方法，包括A)獲得吸脂所得抽取物；B)將所述吸脂所得抽取物進(jìn)行離心以獲得細(xì)胞級分；以及C)培養(yǎng)所收集的細(xì)胞層以獲得組織移植物。
46.一種制備組織移植物的方法，包括A)獲得吸脂所得抽取物；B)將所述吸脂所得抽取物進(jìn)行離心以獲得細(xì)胞級分；C)將所述細(xì)胞級分進(jìn)行比重離心；D)收集比重小于紅細(xì)胞的細(xì)胞層；E)培養(yǎng)所收集的細(xì)胞層以獲得組織移植物。
47.一種移植組織移植物的方法，包括A)獲得吸脂所得抽取物；B)將所述吸脂所得抽取物進(jìn)行離心以獲得細(xì)胞級分；C)將所述細(xì)胞級分進(jìn)行比重離心；D)收集比重小于紅細(xì)胞的細(xì)胞層；E)培養(yǎng)所收集的細(xì)胞層以獲得組織移植物；以及F)移植所述組織移植物。
48.吸脂所得抽取物在制備干細(xì)胞中的用途。
49.一種制備細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞選自血管內(nèi)皮前體細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和肌細(xì)胞，該方法包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1～31中任一項(xiàng)所述方法所得干細(xì)胞的步驟。
50.一種制備分化細(xì)胞的方法，包括A)將下列a)和b)混合得到混合物a)根據(jù)權(quán)利要求1～31中任一項(xiàng)所得的干細(xì)胞，b)對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞；以及B)將所述混合物在使得脂肪組織來源的前體細(xì)胞分化的充分條件下培養(yǎng)。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述分化細(xì)胞為間充質(zhì)細(xì)胞。
52.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述分化細(xì)胞選自脂肪細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞和胰細(xì)胞。
53.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，還包括向所述分化細(xì)胞提供促進(jìn)分化的因子的步驟。
54.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述混合物在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有選自下列的至少一種成分腎上腺皮質(zhì)類固醇、胰島素、葡萄糖、吲哚美辛、異丁基-甲基黃嘌呤(IBMX)、抗壞血酸及其衍生物、甘油磷酸、雌激素及其衍生物、孕酮及其衍生物、雄激素及其衍生物、生長因子、垂體腺提取物、松果體提取物、視黃酸、維生素D、甲狀腺激素、胎牛血清、馬血清、人血清、肝素、碳酸氫鈉、HEPES、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒酸鹽、亞油酸、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、去甲基試劑、組蛋白去乙?；噭?、活化素、細(xì)胞因子、六亞甲基雙乙酰胺(HMBA)、二甲基乙酰胺(DMA)、二丁基cAMP(dbcAMP)、二甲基亞砜(DMSO)、碘脫氧尿苷(IdU)、羥基脲(HU)、阿糖胞苷(AraC)、絲裂霉素C(MMC)、丁酸鈉(NaBu)、凝聚胺及硒。
55.一種細(xì)胞混合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1～31中任一項(xiàng)所得的干細(xì)胞和對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的細(xì)胞混合物，其中所述細(xì)胞混合物置于足以誘導(dǎo)所述干細(xì)胞分化的條件下。
57.一種用于細(xì)胞移植的組合物，包含a)根據(jù)權(quán)利要求1～31中任一項(xiàng)所得的干細(xì)胞；和b)對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的組合物，其中所述移植在期望部位進(jìn)行。
59.根據(jù)權(quán)利要求57的組合物，其中所述干細(xì)胞和所述分化細(xì)胞的比例為約1∶10～約10∶1。
60.根據(jù)權(quán)利要求57的組合物，其中所述干細(xì)胞和所述分化細(xì)胞的比例為約1∶2～約2∶1。
61.根據(jù)權(quán)利要求57的組合物，其中所述干細(xì)胞和所述分化細(xì)胞的比例基本相同。
62.根據(jù)權(quán)利要求57的組合物，其中所述分化細(xì)胞包括間充質(zhì)細(xì)胞。
63.根據(jù)權(quán)利要求57的組合物，其中所述分化細(xì)胞選自脂肪細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞和胰細(xì)胞。
64.根據(jù)權(quán)利要求57的組合物，還包含選自下列成分的至少一種成分腎上腺皮質(zhì)類固醇、胰島素、葡萄糖、吲哚美辛、異丁基-甲基黃嘌呤(IBMX)、抗壞血酸及其衍生物、甘油磷酸、雌激素及其衍生物、孕酮及其衍生物、雄激素及其衍生物、生長因子、垂體腺提取物、松果體提取物、視黃酸、維生素D、甲狀腺激素、胎牛血清、馬血清、人血清、肝素、碳酸氫鈉、HEPES、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒酸鹽、亞油酸、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、去甲基試劑、組蛋白去乙?；噭?、活化素、細(xì)胞因子、六亞甲基雙乙酰胺(HMBA)、二甲基乙酰胺(DMA)、二丁基cAMP(dbcAMP)、二甲基亞砜(DMSO)、碘脫氧尿苷(IdU)、羥基脲(HU)、阿糖胞苷(AraC)、絲裂霉素C(MMC)、丁酸鈉(NaBu)、凝聚胺及硒。
65.根據(jù)權(quán)利要求57的組合物，其中所述干細(xì)胞和分化細(xì)胞是同種異體的。
66.根據(jù)權(quán)利要求57的組合物，其中所述干細(xì)胞和分化細(xì)胞是同基因的。
67.一種治療或預(yù)防與分化細(xì)胞衰竭相關(guān)的疾病、障礙或異常狀況的方法，包括A)提供一種組合物，其包含a)根據(jù)權(quán)利要求1～31中任一項(xiàng)所得的干細(xì)胞；和b)對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞；以及B)將該組合物施用于受試者。
68.一種治療或預(yù)防因分化細(xì)胞缺陷所致疾病、障礙或異常狀況的藥物，其包含a)根據(jù)權(quán)利要求1～31中任一項(xiàng)所得的干細(xì)胞；b)對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞；和c)藥學(xué)上可接受的載體。
69.由a)根據(jù)權(quán)利要求1～31中任一項(xiàng)所得的干細(xì)胞和b)對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞所組成的混合物用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療或預(yù)防因分化細(xì)胞缺陷所致的疾病、障礙或異常狀況。
70.一種治療或改善美容狀況的方法，包括下列步驟A)提供一種組合物，其包含a)根據(jù)權(quán)利要求1～26中任一項(xiàng)所得的干細(xì)胞；和b)對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞；以及B)將該組合物施用于受試者。
71.一種治療或改善美容狀況的藥物，其包含a)根據(jù)權(quán)利要求1～31中任一項(xiàng)所得的干細(xì)胞；b)對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞；和c)藥學(xué)上可接受的載體。
72.由a)根據(jù)權(quán)利要求1～31中任一項(xiàng)所得的干細(xì)胞和b)對應(yīng)于期望部位的分化細(xì)胞所組成的混合物用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療或改善美容狀況。
全文摘要
本發(fā)明提供了以簡單而高效的方式從人(特別是受試者本身)大量制備同種干細(xì)胞和/或前體細(xì)胞的方法。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明干細(xì)胞和/或前體細(xì)胞大量制備組織植入物或移植物的方法。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)吸脂所得抽取物中含有大量干細(xì)胞，并且建立了從此類吸脂所得抽取物制備干細(xì)胞的方法，從而實(shí)現(xiàn)了上述目的。
文檔編號C12N5/07GK1871343SQ20048003150
公開日2006年11月29日 申請日期2004年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月4日
發(fā)明者吉村浩太郎, 松本大輔 申請人:株式會社寶瑪斯特