專利名稱：淀粉中具有增加了直鏈淀粉含量的水稻及水稻制品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種谷粒淀粉中直鏈淀粉含量相對(duì)較高的水稻作物。本發(fā)明還涉及一種胚乳中降低了淀粉分支酶IIa(SBEIIa)活性的水稻作物。本發(fā)明還涉及由此而獲得的谷粒、淀粉及其食物、非食物制品。
背景技術(shù)：
谷類淀粉中包含有兩種分子類型直鏈淀粉和分支淀粉。直鏈淀粉本質(zhì)上是由α-1.4鏈接葡萄糖單元組成的線性分子，而支鏈淀粉是高度分支的連接在直鏈上的α-1，6葡萄糖甙鍵。
高等植物的胚乳中，淀粉的合成是通過(guò)在四個(gè)關(guān)鍵的步驟起催化作用的一系列酶來(lái)完成的。第一步，通過(guò)將G-1-P和ATP合成ADP-葡萄糖，由ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase，ADGP)活化淀粉的單體前體。第二步，活化后的葡糖糖供體——ADP-葡萄糖——通過(guò)淀粉合酶被轉(zhuǎn)換成預(yù)先存在的α-1，4鍵的非還原性的末端。第三步，淀粉分支酶(starchbranching enzymes，SBE)把由葡聚糖連接的α-1，4區(qū)劈開，插入分支點(diǎn)，隨后將裂開的鏈轉(zhuǎn)換為受體鏈，形成新的α-1，6鍵。SBE是唯一一種能將α-1，6鍵插入α-聚葡萄糖的酶，因而在支鏈淀粉的形成過(guò)程中起著非常關(guān)鍵的作用。最后一步，淀粉分支酶去掉一部份分支鏈，盡管其中得機(jī)理尚未被解決(Myerset al.，2000)。但是，很清楚地是，高等植物的常規(guī)淀粉顆粒的合成過(guò)程，至少包括以上四個(gè)行為，在突變分析(Wang et al，1998a，Buleon et al.，1998)或者在通過(guò)基因改造的方法來(lái)修改基因表達(dá)水平(Abel et al.，1996，Jobling et al.，1999，Scwall et al.，2000)時(shí)，在高等作物胚乳中，上述四個(gè)行為的每一行為中都發(fā)現(xiàn)有多元同源異構(gòu)體，每個(gè)同源異構(gòu)體被認(rèn)為有特定的作用。然而，目前還不清楚每個(gè)同源異構(gòu)體對(duì)淀粉生物合成的確切貢獻(xiàn)，也不知道在不同物種之間這些貢獻(xiàn)是否會(huì)顯著地不同。
谷類的胚乳中存在兩種ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的同源異構(gòu)體一個(gè)是淀粉質(zhì)體形式，另一個(gè)是細(xì)胞質(zhì)形式(Denyer et al.，1996，Thorbjornsen et al.，1996)。每種形式都包含著兩個(gè)亞組類型。玉米中的縮水突變(sh2)和易碎突變(bt2)，分別表現(xiàn)出大亞組和小亞組的病癥(Giroux and Hannan，1994)。在谷類胚乳中，發(fā)現(xiàn)有四類淀粉合成酶，一種同源異構(gòu)體排他性地位于淀粉顆粒、顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSS)中，有兩種被分隔在顆粒和可溶片段之間(SSI，Li et al.，1999a，SSII，Li et al.，1999b)，第四種完全位于可溶片段——SSIII之中(Cao et al，2000，Li et al.，1999b，Li et al，2000)。GBSS在直鏈淀粉合成過(guò)程起著很重要的作用(Shure et al.，1983)，而SSII和SSIII之間的突變改變了支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)(Gao et al，1998，Craig et al.，1998)。目前已經(jīng)有水稻GBSS(蠟質(zhì))基因的描述(Wang et al.，1990)以及用反義方法抑制其表達(dá)(Terada et al.，2000)。蠟質(zhì)基因在胚乳及花粉中有表達(dá)但在水稻的其他器官中卻沒(méi)有表達(dá)(Hirano and Sano，2000)。
植物中有兩種主要的淀粉分支酶(Starch Branching Enzyme，SBE)SBEI和SBEII。在谷類中，SBEII還分成兩種類型SBEIIa和SBEIIb(Boyer and Preiss，1978；Gao et al.，1996；Fisher et al.，1996；Hedman and Boyer，1982；Mizuno et al.，1992；Sun et al.，1997；Sun et al.，1998)。據(jù)報(bào)道，在其它谷類中也有其他類型的SBE，如小麥中推定的149kDa SBEI(Baga et al.，2000)和大麥中的50/51kDaSBE(Sun et al.，1996)。水稻(Nakamura and Yamanouchi，1992；Mizuno et al.，1992；Mizuno et al.，1993；Mizuno et al.，2001)、玉米(Baba et al.，1991；Fisher etal.，1993；Gao et al.，1997)和小麥(Repellin et al.，1997；Nair et al.，1997；Rahmanet al.，1997)以及其他谷類的基因組和cDNA序列已經(jīng)被表征。序列排列顯示，核苷酸水平與氨基酸水平同時(shí)具有的高度序列相似性，使得SBEI、SBEIIa、SBEIIb能被分組。SBEIIa和SBEIIb通常表現(xiàn)出80％的序列等同性，特別是基因的中心區(qū)域。
SBEIIa和SBEIIb也可根據(jù)他們的表達(dá)模式來(lái)區(qū)分，包括時(shí)間上和空間上，在胚乳及其他組織中。SBEI在小麥和玉米的中期胚乳發(fā)展階段表現(xiàn)(Morell et al.，1997)。相反，SBEIIa和SBEIIb在早期的胚乳發(fā)展階段表現(xiàn)。在玉米中，SBEIIb是胚乳的主要形式，而SBEIIb在葉子上有較高的表達(dá)水平(Gao et al.，1997)。在水稻中，發(fā)現(xiàn)SBEIIa和SBEIIb在胚乳中的含量大致相同(Yamanouchi and Nakamura，1992)。然而是，這兩者的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)組織各不相同。SBEIIa在種子成長(zhǎng)的早期表達(dá)，通常在開花后3天(3days afterflowering，3DAF)被檢測(cè)到，而且是在葉子中表達(dá)；但是在3DAF時(shí)檢測(cè)不到SBEIIb，在7-10DAF時(shí)在成長(zhǎng)的種子中發(fā)現(xiàn)大量的SBEIIb，卻不在葉子中表達(dá)(Mizuno et al.，2001)。在小麥胚乳中，發(fā)現(xiàn)SBEI(Morell et al，1997)排他性地出現(xiàn)在可溶片段里，而SBEIIa和SBEIIb則在可溶片段和淀粉顆粒聯(lián)合片段中(Rahman et al.，1995)都出現(xiàn)。
高等植物中存在兩種分支脫支酶，根據(jù)其底物專一性定義為異淀粉酶型脫支酶和支鏈淀粉型脫支酶(Myers et al.，2000)。玉米和小麥的1-含糖(Sugary-1)突變與該兩種脫支酶的缺失有關(guān)(James et al.，1995，Kubo et al.，1999)，然而其因果突變基因圖譜與異淀粉酶型脫支酶基因卻處于相同位置。水稻中，反義異淀粉酶抑制改變了直鏈淀粉的結(jié)構(gòu)及淀粉的性質(zhì)(Fujita et al.，2003)，這表明在支鏈淀粉的生物合成中需要用到異淀粉酶。
表1中列出了從谷類中克隆的代表性淀粉分支酶基因。
表1谷類包括水稻的淀粉分支酶基因表征


玉米和水稻中，高直鏈淀粉顯型表明是SBEIIb基因損傷而導(dǎo)致的，也被稱為直鏈淀粉補(bǔ)充劑(amylose extender，ae)基因，(Boyer and Preiss，1981，Mizuno et al.，1993；Nishi et al.，2001)。在這些SBEIIb突突變中，谷類淀粉胚乳顯示出反常的形態(tài)，直鏈淀粉的含量顯著地提高，殘余的的支鏈淀粉的分支率降低，短鏈(＜DP 17，尤其是DP 8-12)的比例下降。此外，淀粉的糊化溫度升高。另外，還存在一個(gè)相當(dāng)數(shù)量的原料集中區(qū)域，被稱為直鏈淀粉和支鏈淀粉之間的“中間體”(Boyer et al.，1980，Takeda，et al.，1993b)。水稻中，SBEIIb的失活導(dǎo)致直鏈淀粉含量約為25％，而野生水稻直鏈淀粉含量約為18％(Nishi et al.，2001)。
相反，玉米植物的SBEIIa基因突變?nèi)Q于增變基因(Mu)插入元導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)中缺乏SBEIIa，它與野生玉米在胚乳淀粉的分支上難以被區(qū)別開來(lái)(Baluth et al.，2001)，盡管它們?cè)谌~片淀粉中發(fā)生了改變。同樣地，缺失SBEIIa活性的稻類作物在胚乳中的支鏈淀粉鏈屬性上沒(méi)有明顯的改變(Nakamura 2002)。在玉米和水稻中，SBEIIa和SBEIIb基因在基因組中都沒(méi)有連環(huán)遺傳。
目前已知有多種高直鏈淀粉的玉米品種。低支鏈淀粉的(low amylopectinstarch，LAPS)玉米淀粉中有非常高的直鏈淀粉含量(＞90％)已經(jīng)通過(guò)大量地減少SBEI的活性以及幾乎完全喪失SBEII活性的方法來(lái)獲得(Sidebottom etal.，1998)。
馬鈴薯中，使用反義方法降低塊莖中主要的SBE(SBE B，等價(jià)于SBEI)，能導(dǎo)致一些異常的淀粉特性，但不改變直鏈淀粉含量(Saffor et al.，1998)。對(duì)較少形式的SBE(SBE A，類似于谷類的SBEII)進(jìn)行反以抑制，導(dǎo)致直鏈淀粉的適當(dāng)升高至38％(Jobling et al.，1999)。然而，同時(shí)降低SBEII和SBEI比單獨(dú)降低SBEII對(duì)直鏈淀粉含量帶來(lái)更大的提高，提高至60-89％(Schwallet al.，2000)。
小麥中，完全缺失SGP-1(SSII)蛋白的變異改變了支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)，使淀粉顆粒變形，使淀粉的直鏈淀粉含量增加到約30-37％，這比野生種類的小麥增加了約8％(Yamamori et al.，2000)。直鏈淀粉通過(guò)比色測(cè)量、電流滴定(兩者都是碘結(jié)合)和伴刀豆球蛋白A(concanavalin A)方法測(cè)定。比較于相同的、沒(méi)有突變的作物，SSII無(wú)效突變(SSII null mutant)的淀粉表現(xiàn)出糊化溫度下降，谷粒的淀粉含量從野外的60％減少到低于50％。
玉米中，不活潑突變(dull1 mutation)引起胚乳中淀粉含量的下降以及直鏈淀粉含量的升高，改變的范圍取決于遺傳本底遺傳本底，以及剩下的支鏈淀粉的分支率提高程度(Shannon and Garwood，1984)。相應(yīng)的突變基因可采用轉(zhuǎn)位增變基因(Mu)通過(guò)轉(zhuǎn)位標(biāo)簽法進(jìn)行識(shí)別和分離，并表明可對(duì)被指定的淀粉合成酶(SSII)進(jìn)行編碼(Gao et al.，1998)。該被指定的SSII酶現(xiàn)在已被認(rèn)知是谷類SSIII家族的成員(Li et al.，2003)。突變的胚乳中，SBEIIa活性的降低與不活潑突變有關(guān)。目前不知道這些發(fā)現(xiàn)是否與其他谷類作物相關(guān)，如水稻。
一系列的谷粒淀粉中直鏈淀粉含量增加的大麥已經(jīng)被識(shí)別，這包括高直鏈淀粉冰川(High Amylose Glacier，AC38)，其直鏈淀粉的相對(duì)含量為45％；以及在SSIIa基因中用化學(xué)方法引入突變的大麥，其谷粒淀粉中直鏈淀粉含量增加到約65-70％(WO 02/37955A1；Morell et al.，2003)。這種淀粉表現(xiàn)出糊化溫度的降低。
水稻(Oryza sativa L.)是發(fā)展國(guó)家中最重要的和廣泛種植的谷類植物，尤其在亞洲，水稻產(chǎn)量占全球的90％左右。
淀粉被廣泛用于食品、紙張和化學(xué)工業(yè)中。淀粉的物理結(jié)構(gòu)，對(duì)淀粉的營(yíng)養(yǎng)特性和其在食品、非食用產(chǎn)品或工業(yè)產(chǎn)品中的加工特性有重大影響。某些特征是由淀粉的物理結(jié)構(gòu)造成的，包括支鏈淀粉鏈長(zhǎng)的分布、結(jié)晶的類型和程度，其他特性如糊化溫度、粘性和膨脹體積等。支鏈淀粉鏈長(zhǎng)的改變是結(jié)晶的改變、糊化的改變或支鏈淀粉退化的指示。。
淀粉組合物，特別是抗性淀粉，具有高含量的直鏈淀粉，對(duì)腸胃特別是大腸的健康，有重要的影響。因此，作為食品以促進(jìn)腸胃的健康，已開發(fā)了特定的谷物如玉米，使其含有較高的直鏈淀粉含量?？剐缘矸鄣臓I(yíng)養(yǎng)效果，主要體現(xiàn)在它給大腸提供營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備。其中，腸微生物群發(fā)酵抗性淀粉，生成其他短鏈的脂肪酸而成為本身的能量源。這些短鏈脂肪酸給結(jié)腸粘膜細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)大腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，提高結(jié)腸的生理活性。通常，如果不對(duì)結(jié)腸提供抗性淀粉或其他食用纖維，結(jié)腸的代謝作用就會(huì)相對(duì)地鈍化。
同時(shí)，經(jīng)化學(xué)或其他方式改造的淀粉可以用來(lái)食用，以提供正常的、未經(jīng)改造淀粉所沒(méi)有的功能。這些加工處理，要么是修改其他價(jià)值成分，要么是去掉某些不需要的內(nèi)容。因此，更可取的是提供以未經(jīng)改造的形式存在的組分的食品源。
因此，淀粉中直鏈淀粉含量大于40％的水稻仍然是未知的。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了高直鏈淀粉含量的玉米和大麥，而水稻種植區(qū)的國(guó)家希望有較高直鏈淀粉含量的水稻。這種水稻的淀粉是相對(duì)抗消化的，因此，較高直鏈淀粉含量的水稻被認(rèn)為對(duì)大部分人的健康有很大的益處。
概要本領(lǐng)域的技術(shù)人員都知道，本發(fā)明并不限于本說(shuō)明書的描述，是可變更的和修改的。要知道，本發(fā)明在此描述的，包括這些變化和修改，還包括該文本所提及的和指出的單獨(dú)或共同的所有的步驟、特征、組合物和化合物，也包括任何兩個(gè)或兩個(gè)以上的步驟/特征的組合。
通過(guò)本文本，“包括”和“包含”之類的詞，要理解為包含規(guī)定的整體或步驟，但不排除其他的規(guī)定的整體或步驟，除非文中有特別說(shuō)明。本發(fā)明不局限于所列舉的實(shí)施例的范圍。所列舉的實(shí)施例，僅僅為了便于說(shuō)明。功能相同的產(chǎn)品、合成物和方法都落入本發(fā)明的范圍。
該文本后面，附有本發(fā)明參考過(guò)的公開發(fā)行的著錄的詳細(xì)資料列表。本說(shuō)明書中提及的參考資料是指這些完整的資料。這些現(xiàn)有技術(shù)中的參考資料，包括任何一種或多種現(xiàn)有技術(shù)文件，并不認(rèn)為是對(duì)其的承認(rèn)，或建議。這些現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)成了普通的通用知識(shí)或形成了其中的一部分。
此處，“獲得、取得、源于”之類的詞，應(yīng)被認(rèn)為是表示某特定的整體來(lái)源于特定的種類，但是不要求是直接地獲取。
該文本所涉及的核苷殘留物的名稱，都是IUPAC-IUB生物化學(xué)名稱委員會(huì)(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissio)推薦的，其中，A表示腺嘌呤(Adenine)，C表示胞核嘧啶(Cytosine)，G表示鳥嘌呤(Guanine)，T表示腺嘧啶脫氧核苷(Thymidine)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一方面提供一種從水稻作物中獲得的谷粒，包括淀粉，其中該谷粒的淀粉中直鏈淀粉的百分比至少是40％。優(yōu)選地，該谷粒含有降低活性或水平的SBEIIa和SBEIIb。在一種形式中，通過(guò)兩種或多種基因變異獲取所述谷粒，該基因變異是選自a)抑制SBEIIa表達(dá)和/或活性的SBEIIa基因突變，以及b)引入抑制SBEIIa表達(dá)和/或活性的核苷酸；第二種基因突變是選自a)抑制SBEIIb表達(dá)和/或活性的SBEIIb基因突變，和b)引入抑制SBEIIb表達(dá)和/或活性的核苷酸。
在一種形式的谷粒中包括轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)基因可用于編碼反義、共抑制、核酶或雙RNA分子。此外，該谷粒可以是非轉(zhuǎn)基因的，其抑制是來(lái)自染色體突變或重排列。該谷粒可包括SBEIIa和SBEIIb基因的無(wú)效突變。
該第一方面所要求的谷?？砂ń档土说鞍踪|(zhì)水平和/或活性的SBEIIa和SBEIIb。在一特定的形式中，該谷粒還包括降低了蛋白質(zhì)水平和/或活性的SBEI或也有可能還包括改變了蛋白質(zhì)水平和/或酶活性的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、GBSS、SSI、SSII、SSIII、異淀粉酶類型的脫麩酶和普魯蘭類型的脫麩酶。在另一特定形式中，該谷粒包括改變了蛋白質(zhì)水平和/或酶活性的GBSS。在另一可選的形式中，所述谷粒是秈稻(Indica)或者谷粒中包含Wxα等位基因。
優(yōu)選地，所述谷粒的淀粉中直鏈淀粉的含量是至少50％。
優(yōu)選地，所述谷粒是不縮水的，并且在一特定形式中，該谷粒是糙米，其平均粒重至少是25mg左右，且優(yōu)選地，其淀粉含量至少是未經(jīng)改變的相同谷粒的淀粉含量的90％。優(yōu)選地，在偏振光下，該谷粒中至少50％的淀粉顆粒沒(méi)有雙折射。
本發(fā)明的第二方面在于提供一種能產(chǎn)出本發(fā)明第一方面所述谷粒的水稻作物。
本發(fā)明的第三和第四方面涉及從本發(fā)明第一方面所述的谷粒中提取的淀粉及淀粉顆粒。
本發(fā)明第五方面涉及從本發(fā)明第一方面所述的谷粒所產(chǎn)出的面粉或淀粉產(chǎn)品。所述產(chǎn)品可包括所述面粉或淀粉與其他來(lái)源的面粉或淀粉的混合物。所述產(chǎn)品可以是食用產(chǎn)品或非食用產(chǎn)品。
本發(fā)明第六方面涉及本發(fā)明第三方面所述的淀粉與其他食物成分或水的組合物。
本發(fā)明第七方面涉及一種能產(chǎn)出淀粉中包括至少40％的直鏈淀粉的谷粒的水稻作物的方法，包括以下步驟a)引入基因變種到母體水稻作物或者種子里；和b)識(shí)別母體水稻作物的后代水稻作物或種子，其中該后代作物或種子的淀粉中直鏈淀粉至少占40％。優(yōu)選地，基因變種導(dǎo)致了水稻胚乳中SBEIIa和SBEIIb蛋白質(zhì)和/或活性水平的降低。
優(yōu)選地，該方法中的后代水稻作物包含至少兩種基因變種，其中的一種基因變種是選自a)抑制SBEIIa表達(dá)和/或活性的SBEIIa基因變異，以及b)導(dǎo)入抑制SBEIIa表達(dá)和/或活性的核酸；其中的第二種基因變種是選自a)抑制SBEIIb表達(dá)和/或活性的SBEIIb基因變異，以及b)導(dǎo)入抑制SBEIIb表達(dá)和/或活性的核酸。
所述引入基因變種的步驟可以包括引入外來(lái)的核酸。該外來(lái)的核酸被引入到水稻細(xì)胞中并再生成水稻植株。優(yōu)選地，該外來(lái)核酸編碼SBEIIa和/或SBEIIb表達(dá)和/或活性的抑制子。所述抑制子可以是反義、共抑制、核酶或雙RNA分子。
可選地，該引入基因變種的步驟中可包括采用化學(xué)試劑或輻射對(duì)水稻作物母體或種子進(jìn)行突變變異。
所述后代水稻植株可包括SBEIIa和/或SBEIIb的無(wú)效變異。
所述引入基因變種的步驟可附加地導(dǎo)致SBEI蛋白質(zhì)和/或活性水平的降低。
所述后代植株可根據(jù)谷粒淀粉中直鏈淀粉水平來(lái)鑒別，或者根據(jù)后代植株的胚乳中SBEIIa和/或SBEIIb蛋白質(zhì)和/或活性的水平的降低來(lái)鑒別。
所述方法還包括將Wxα等位基因引入到水稻植株中，例如通過(guò)雜交引入。
本發(fā)明的第八方面在于提供一種產(chǎn)生水稻植株的方法，所述水稻植株中具有同時(shí)降低了SBEIIa和SBEII蛋白質(zhì)水平和/或酶活性的胚乳，包括以下步驟a)誘變具有降低SBEIIa蛋白質(zhì)水平和/或酶活性的種子；或b)誘變具有降低SBEIIb蛋白質(zhì)水平和/或酶活性的種子；或c)將具有降低SBEIIb蛋白質(zhì)水平和/或酶活性的種子與具有降低SBEIIa蛋白質(zhì)水平和/或酶活性的種子雜交；和d)識(shí)別出胚乳中含有降低了SBEIIa和SBEIIb蛋白質(zhì)活性和/或酶活性的水稻植株。
所述識(shí)別水稻植株的步驟可包括篩選出具有分子標(biāo)記的水稻植株，所述的分子標(biāo)記分別鏈接在SBEIIa或SBEIIb基因；然后根據(jù)從對(duì)鏈接分子標(biāo)記的篩選中是否存在信號(hào)來(lái)識(shí)別作物。
所述識(shí)別水稻植株的步驟可包括從在SBEIIa或SBEIIb蛋白上結(jié)合有抗體的水稻植株中篩選出種子，再根據(jù)是否存在抗體的結(jié)合來(lái)識(shí)別植株。
本發(fā)明還包括一種產(chǎn)出改變的水稻淀粉的方法，包括從本發(fā)明第一方面所述的谷粒中提取淀粉的步驟。
本發(fā)明還附加地包括使用兩種或多種外來(lái)核酸分子，其中至少一種外來(lái)核酸分子編碼水稻SBEIIa表達(dá)和/或活性的抑制子，且至少另外一種所述的外來(lái)核酸分子編碼水稻SBEIIb表達(dá)和/或活性的抑制子，以產(chǎn)出具有降低了SBEIIa和SBEIIb蛋白質(zhì)和/或活性水平的水稻植株。所述抑制子是選自反義分子、共抑制分子、核酶、雙RNA分子及其組合。
本發(fā)明還包括用以編碼水稻SBEIIa抑制子和水稻SBEIIb抑制子的單個(gè)核酸分子，該核酸分子可以是相同的或不同的分子。被分離的遺傳媒介可以是載體?？梢岳斫獾氖牵景l(fā)明涉及包括所述單個(gè)核酸分子的細(xì)胞，優(yōu)選水稻細(xì)胞。還可理解的是，本發(fā)明涉及一種包括所述單個(gè)核酸分子的轉(zhuǎn)基因水稻植株。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是具有水稻淀粉分支酶I基因編碼(SBEI)的cDNA序列-基因庫(kù)序列D11082(序列ID.No.1)；圖2是具有水稻淀粉分支酶IIa(SBEIIa)基因編碼的cDNA序列-基因庫(kù)序列AB023498(序列ID.No.2)；圖3是水稻淀粉分支酶IIb(SBEIIb)基因編碼的cDNA序列-基因庫(kù)序列D16021(序列ID.No.3)；圖4是pRint9_BC質(zhì)體的示意圖，該質(zhì)體包括嵌入到pBC SK-的水稻SBEI基因的基因內(nèi)含子9的500bp片斷；圖5是雙RNA結(jié)構(gòu)的示意圖；所采用的基因元的順序是啟動(dòng)子、正義方向的SBEIIa或SBEIIb cDNA序列、內(nèi)含子(Rini9)、反義方向的SBEIIa或SBEIIb cDNA序列，以及轉(zhuǎn)錄終結(jié)子/多聚腺苷酸化序列；SBEIIa和SBEIIb基因的轉(zhuǎn)錄形成具有由正義和反義序列雜合而成的雙絞合區(qū)“發(fā)夾式”(hairpin)RNA結(jié)構(gòu)。與GT和AG核苷毗接的內(nèi)含子序列被剪除(spliced out)；圖中還示出了pRBEI.IR(pBC SK-(正義/Rinit9/反義))示意圖，以及對(duì)應(yīng)的pRBEIIa.IR和pRBEIIb.IR結(jié)構(gòu)。
圖6所示是質(zhì)體載體pBx17casNOT的示意圖；圖7所示是水稻SBEIIa(序列ID.NO.2)和水稻SBEIIb(序列ID.NO.3)的cDNA序列比較圖。上面的是SBEIIb序列(大寫)，下面的是SBEIIa序列(小寫)。該圖中沒(méi)有示出5’和3’的末端序列，因?yàn)樗鼈儧](méi)有顯著的同一性。
圖8所示是采用用于基因沉默結(jié)構(gòu)的SBEIIa、SBEIIb和SBEI 3’序列的基因沉默程序(Gene Silencing program)的爆破輸出(BLAST output)。
具體實(shí)施例方式
產(chǎn)出水稻植株的方法本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供一種產(chǎn)出水稻植株的方法，該水稻植株的谷粒中含有經(jīng)改造的淀粉，尤其是該淀粉的直鏈淀粉相對(duì)含量提高到至少40％。此處對(duì)淀粉的直鏈淀粉相對(duì)含量的定義是基于重量百分含量(w/w)，即直鏈淀粉的重量占淀粉重量的百分比。優(yōu)選地，所述淀粉中直鏈淀粉的比例至少是45％、50％、55％或60％，更優(yōu)選地，是至少65％、70％或75％。通常在水稻中，淀粉中直鏈淀粉的含量是0至35％。所述方法包括降低水稻胚乳中淀粉分支酶IIa(SBEIIa)蛋白質(zhì)水平和淀粉分支酶IIb(SBEIIb)蛋白質(zhì)水平或酶活性。與未經(jīng)改造的水稻胚乳中相應(yīng)的蛋白質(zhì)或活性水平相比，本發(fā)明中，蛋白質(zhì)或活性至少降低40％，更優(yōu)選的是至少降低60％，甚至至少75％，特別優(yōu)選地是至少降低90％或95％。在本發(fā)明的水稻胚乳中，該兩種蛋白質(zhì)中的一種或兩種都有可能不被檢測(cè)到。該方法還包括改變了SBEIIa和SBEIIb基因表達(dá)的水稻，或者包括水稻中SBEIIa和SBEII基因的突變，或者以上的組合。從而胚乳中SBEIIa和SBEIIb的活性都被降低?？赏ㄟ^(guò)引入核酸如轉(zhuǎn)基因來(lái)抑制其中任何一種或同時(shí)兩種基因的表達(dá)。
應(yīng)當(dāng)注意到，本文中的“提高”、“降低”、“減少”、“改變”等詞語(yǔ)是比較性詞語(yǔ)，用于本發(fā)明的作物或產(chǎn)品與對(duì)應(yīng)的野生作物或產(chǎn)品的比較，所述野生作物或產(chǎn)品沒(méi)有經(jīng)本發(fā)明的方法改良。
此處，直鏈淀粉被定義為主要由由α-1，4吡喃型葡萄糖連接的、類直鏈淀粉的長(zhǎng)鏈分支淀粉組成的線性分子(有時(shí)也叫“中間材料”，“intermediatematerial”，Takeda et al.，1993b；Fergason，1994)。直鏈淀粉的含量可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)任何已知的方法來(lái)測(cè)定，包括尺寸排除的分子篩高效液法(HPLC)，例如，90％(w/v)的二甲基亞砜(DMSO)，伴刀豆球蛋白(concanavalin)A方法(Megazyme Int，Ireland)，最好是碘量法，如實(shí)例1中所述。HPLC法可以包括或不包括淀粉的脫支(Batey and Curtin，1996)。從谷粒的重量和直鏈淀粉的含量，可以計(jì)算出每單位谷粒中直鏈淀粉的量，并與基因改造和控制種系進(jìn)行比較。
該方法包括檢測(cè)水稻胚乳中SBEIIa和/或SBEIIb活性的步驟——最好是兩者同時(shí)檢測(cè)。例如，這可通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)水平，如采用免疫檢測(cè)(immunodetection)法來(lái)實(shí)現(xiàn)，或采用業(yè)內(nèi)公知的方法如RNA印跡交分析法(Northern blot hybridization analysis)、槽印跡交法(slot-blot hybridization)、RNAse保護(hù)分析(RNAse protection assays)、微組合分析(microarray analysis)或反向轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)來(lái)測(cè)定其相應(yīng)的蛋白質(zhì)的mRNA水平。該方法還包括篩選胚乳中具有降低的SBEIIa和/或SBEIIb活性的水稻植株，或包括選擇/標(biāo)識(shí)該植株或谷粒。該篩選/選擇步驟可基于SBEIIa和/或SBEIIb活性或蛋白質(zhì)水平的降低，或者基于水稻植株的谷粒的顯型，如直鏈淀粉含量的增加或支鏈淀粉含量的降低，或其他可視顯型，如縮水谷粒。
SBE活性可以采用酶分析來(lái)測(cè)量，例如，通過(guò)磷酸化酶刺激分析法(phosphorylase stimulation assay，Boyer and Preiss，1978)。該方法用磷酸化酶結(jié)合葡萄糖1-磷酸鹽和α-D-葡萄糖來(lái)測(cè)量SBE的刺激性。SBE活性可以通過(guò)碘印跡法測(cè)量，它所測(cè)量的是來(lái)源于葡萄糖聚合物的分支的葡萄糖-多碘聚合體的吸光率的降低。SBE活性也可以用分支鏈分析法來(lái)測(cè)定，該方法是測(cè)量底物上被減少了的直鏈淀粉的還原性端的產(chǎn)出，再經(jīng)異淀粉酶消化(Takeda etal.，1993a)。更適宜地，SBE活性是以SBEI活性的缺失來(lái)測(cè)定的。SBE的同功異構(gòu)體顯示出不同的底物特異性。例如，SBEI在分支直鏈淀粉中顯示出更高的活性，而SBEIIa和SBEIIb在分支的直鏈淀粉底物上顯示出更高的活性。這些異構(gòu)體也可根據(jù)所轉(zhuǎn)換的葡聚糖鏈的長(zhǎng)度來(lái)區(qū)分。SBE蛋白質(zhì)也可以采用此文描述的特定抗體來(lái)測(cè)量。在一優(yōu)選的實(shí)施例中，SBEIIa和SBEIIb蛋白質(zhì)的水平可通過(guò)免疫方法，如采用特別的抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)或ELISA化驗(yàn)法來(lái)進(jìn)行測(cè)定，所述特別的抗體被培育成對(duì)應(yīng)于水稻SBEIIa和SBEIIb的N-末端氨基酸序列的多肽片斷。SBEII活性可以在胚乳發(fā)育過(guò)程的谷粒成長(zhǎng)時(shí)期測(cè)定，也可在沒(méi)有被改良的成熟谷粒的等量的蛋白質(zhì)中通過(guò)免疫化驗(yàn)方法來(lái)測(cè)定。
本發(fā)明的更進(jìn)一方面在于提供一種改變、尤其是降低水稻胚乳中第三種淀粉生物合成酶活性的方法，并結(jié)合SBEIIa和SBEIIb活性的降低，使谷粒的淀粉中直鏈淀粉含量是至少40％。優(yōu)選地，胚乳中SBEI活性也被降低。其他與SBEIIa和SBEIIb結(jié)合的、可能被改變的淀粉生物合成酶是SSI、SSII或SSIII。淀粉分支酶也可以被改變，如異淀粉酶或普魯蘭酶的活性。與未經(jīng)改造的水稻相比，所述第三種淀粉生物合成酶活性可以被提高或被降低，最好是被降低，至少降低40％，更優(yōu)選地是降低至少60％或80％，特別優(yōu)選地是90％。
在另一個(gè)實(shí)施例中，淀粉生物合成酶的活性除了在作物的胚乳之外，也在其他組織中被改變，如葉片中SBEI或SBEII的活性，特別是SBEIIa活性，可以被增加以補(bǔ)償植株基因變種所遭受的活性損失，該植株的基因變種造成胚乳中SBEIIa活性降低?；蜃儺惒粌H引起胚乳中SBEIIa活性的降低，也引起其他組織中特別是葉片中SBEIIa活性的降低時(shí)，是最佳的。這是因?yàn)榕呷橐酝獾钠渌M織的活性補(bǔ)償，例如，可由不在胚乳中表達(dá)的啟動(dòng)子控制之下而形成核酶編碼區(qū)。所述啟動(dòng)子可以是光合作用相關(guān)的基因，如rbcS。選擇性地，通過(guò)SBEIIa和SBEIIb活性的減少再結(jié)合一個(gè)或多個(gè)淀粉生物合成酶的過(guò)度表達(dá)，可以進(jìn)一步提高胚乳的淀粉合成。編碼這種酶的基因具有多個(gè)來(lái)源，例如來(lái)自細(xì)菌或水稻之外的其他來(lái)源，而且可以對(duì)其進(jìn)行改造以改變其催化屬性，例如，改變酶的溫度依賴性(見(jiàn)WO 94/09144)。
高直鏈淀粉顯型可通過(guò)部分地或全部地破壞SBEIIa和SBEIIb的基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的方法中包括篩選或標(biāo)識(shí)或選擇具有SBEIIa和/或SBEIIb基因無(wú)效變異的水稻植株或谷粒。所述“無(wú)效變異”定義為導(dǎo)致所期望的植株器官尤其是胚乳中不可檢測(cè)到蛋白質(zhì)或核酶的突變。所述篩選/標(biāo)識(shí)步驟因而包括基因水平的篩選，例如，篩選對(duì)SBEIIa和/或SBEIIb編碼缺失的基因；也包括對(duì)所期望的基因表達(dá)水平的篩選?；虮灰种频某潭仍谝欢ǔ潭壬蠜Q定了水稻谷粒中淀粉的特性。通過(guò)對(duì)引物采用PCR放大法可方便地篩選出這種缺失，該引物被設(shè)計(jì)成使至少一部分放大產(chǎn)物區(qū)間(spans)至少跨越一部分所期望的基因。對(duì)從經(jīng)過(guò)改造的水稻胚乳中提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行的任何凝膠電泳技術(shù)將顯出SBEIIa和SBEIIb活性的本性以及改性程度。所述改性可導(dǎo)致胚乳中SBEIIa和/或SBEIIb活性的降低或者核酶活性的完全消除。為實(shí)施這些實(shí)驗(yàn)，可從水稻胚乳中提取淀粉并分析其蛋白質(zhì)。業(yè)內(nèi)公知的技術(shù)如SDS-PAGE和免疫轉(zhuǎn)漬(immunoblotting)，都可在淀粉顆粒碎片和溶液上實(shí)施，以識(shí)別出SBEIIa和SBEIIb核酶變性的植株或谷粒。
本發(fā)明的方法還包括將基因變種引入到水稻植株或者世系的水稻植株或種子。所述基因變種可包括下述轉(zhuǎn)基因，或者經(jīng)誘變，如化學(xué)誘變或輻射，引入的轉(zhuǎn)基因。
水稻植物本發(fā)明的另一方面在于提供一種水稻作物，該水稻作物的淀粉中，直鏈淀粉含量至少為40％。所述水稻作物定義為任何的Oryza sativa L種類。該水稻作物可以是O.sativa L.的三個(gè)已知品種中的任意一種，即粳稻(Japonica)(或sinica)、秈稻(Indica)和爪洼稻(Javanica)，優(yōu)選地是秈稻品種。每一品種都有很多栽培變種和亞種，都包含在本發(fā)明的植株中。優(yōu)選的栽培變種生長(zhǎng)在澳大利亞，包括，如栽培品種亞瑪茹(Amaroo)、艾麗康蕃(Ali Combo)、笆斯瑪?shù)?Basmati)、蕃桿(Bogan)、蕃比芽(Bombia)、冬嘎喇(Doongara)、谷拉哈(Goolarah)、伊納幫(Illabong)、加哈(Jarrah)、越光米(Koshihikari)、吉爾瑪(Kyeema)、朗節(jié)(Langi)、米林(Millin)、納瑪葛(Namage)、澳派司(Opus)、蓓耳德(Pelde)。直鏈淀粉的含量?jī)?yōu)選地是至少45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。所述水稻植物至少包括一種抑制胚乳中SBEIIa和/或SBEIIb表達(dá)和/或活性的基因變種。該基因變種可以是任何的基因變種，或者結(jié)合導(dǎo)致水稻胚乳中SBEIIa和SBEIIb活性和/或蛋白質(zhì)減少的基因變異，如SBEIIa和SBEIIb基因的突變，被引入的核酸如編碼反義、增強(qiáng)反義、共抑制的基因、核酶、雙RNA或者類似的抑制SBEIIa和/或SBEIIb表達(dá)或活性的分子，以及其組合。所述基因變種優(yōu)選地是無(wú)效變異。具有降低了SBEIIa和SBEIIb活性的植株可通過(guò)將SBEIIb減少的植株與SBEIIa減少的植株進(jìn)行雜交而產(chǎn)出，或者引入對(duì)抑制SBEIIa和SBEIIb的基因表達(dá)的分子進(jìn)行編碼的轉(zhuǎn)基因而獲得。在優(yōu)選的實(shí)施例中，所述水稻作物具有SBEIIa和SBEIIb的無(wú)效變異。
本發(fā)明還提供一種水稻作物，至少在谷粒生長(zhǎng)的部分時(shí)期內(nèi)，其胚乳中具有降低水平的SBEIIa和SBEIIb活性，該水稻作物產(chǎn)生的谷粒的淀粉與從等同的、未經(jīng)改造的作物中提取的淀粉相比，具有提高的直鏈淀粉含量。與野生的相比，優(yōu)選地，胚乳中SBEIIa和SBEIIb水平降低至少50％，更優(yōu)選地是至少75％，特別優(yōu)選地，是至少90％或95％。所述“野生”在基因領(lǐng)域具有其本意，包括未經(jīng)本發(fā)明改良的基因型或水稻栽培變種。
本發(fā)明還提供一種后代作物和谷粒，所述后代作物和谷粒在基因型和/或顯型上具有母體水稻作物的期望特性。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)出具有期望特性的水稻作物的繁殖材料，如栽培變種組織或細(xì)胞。
本發(fā)明改造的水稻植株可與具有更期望的遺傳本底遺傳本底的植株雜交，因此，本發(fā)明還包括具有其他遺傳本底的變異。初次雜交后，可進(jìn)行適當(dāng)次數(shù)的回交以去除不太希望的本底。所述期望的遺傳本底可包括適當(dāng)?shù)幕蚪M合，所述基因具有商業(yè)收益和其他特性，如農(nóng)業(yè)性能或非生物的抗壓性等。所述遺傳本底也可包括其他改造了的淀粉生物合成或改良基因，例如，胚乳縮水且致因基因尚未知道的其它水稻品種的基因。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，水稻植株中包括蠟質(zhì)基因的Wxα等位基因。該等位基因通常在水稻的秈稻品種中發(fā)現(xiàn)，而Wxb等位基因通常在粳稻(Japonica)品種中發(fā)現(xiàn)。Wxb等位基因在蠟質(zhì)基因的第一基因內(nèi)區(qū)的5’結(jié)合點(diǎn)攜帶替換突變(GT替換為TT)，而導(dǎo)致了比對(duì)應(yīng)的包括Wxα等位基因的作物更低的蠟質(zhì)基因表達(dá)，因此導(dǎo)致更低的GBSS活性和更低的直鏈淀粉水平(Isshiki et al.，1998；Hirano et al.，1998；Frances et al.，1998)。
由此所得的作物和谷?？梢允寝D(zhuǎn)基因的或非轉(zhuǎn)基因的。
谷粒本發(fā)明還提供一種相對(duì)于等同的、未經(jīng)改良的水稻作物而言淀粉成分被改變的水稻谷粒。在這里，谷粒被定義為本質(zhì)上成熟的谷粒，包括出于商業(yè)目的而收割的谷粒。收割時(shí)，所述水稻谷粒可以是未加工的形式，其包括外殼；或者是“糙米”形式，其外殼已去除。只有糙米是可食用的。所述糙米包括果皮的外層、種皮和珠心、幼芽(胚芽)和胚乳。所述胚乳定義為包括糊粉層和嚴(yán)格意義上的胚乳，包括亞糊粉層(subaleurone layer)和含淀粉的或內(nèi)部的胚乳。對(duì)糙米進(jìn)行研磨或摩擦以去除果皮、種皮、外種皮、糊粉層和胚芽，可以獲得去殼米(milled rice)，其本質(zhì)上包括含淀粉的胚乳。碾磨導(dǎo)致種皮和糊粉成分的損失，包括一定的脂肪、蛋白質(zhì)、纖維、礦物質(zhì)和維生素，所述維生素包括維生素B1、維生素B2、維生素PP和維生素E。去殼米中，碳水化合物含量，主要是淀粉含量比糙米更高。碾磨后的野生水稻谷粒中包含77-89％左右的碳水化合物，6.3-7.1％的蛋白質(zhì)、1.5-1.7％的含淀粉(starch-bound)和不含淀粉(non-starch)形式的液體、0.3-0.8％的礦物質(zhì)、0.3-0.5％的天然纖維、0.7-2.3％的中性洗滌劑纖維，還可包含10-15％的水分?！八竟攘！被蚝?jiǎn)單的“水稻”定義為包括未加工米、糙米和去殼米，優(yōu)選地，是去殼米。
本發(fā)明的水稻谷粒包括至少一種基因變種，如在此所述的水稻谷粒是衍生出來(lái)的水稻植株。該基因變異導(dǎo)致水稻谷粒的胚乳中SBEIIa和SBEIIb活性和/或蛋白質(zhì)的減少。與等同的、未經(jīng)改良的作物的谷粒相比較，所述谷粒包含了增加的直鏈淀粉百分比(作為總淀粉含量的百分比)和減少的支鏈淀粉的百分比。去殼米的主要成分是淀粉，干的去殼米包含90％左右的淀粉。未經(jīng)本發(fā)明改良的水稻的胚乳淀粉中直鏈淀粉含量在0-37％的范圍，取決于其基因型?；跍y(cè)定“表觀直鏈淀粉含量”的碘量法(比色法)，去殼米可分類為蠟質(zhì)(1-2％的直鏈淀粉)、特低直鏈淀粉(2-12％)、低直鏈淀粉(12-20％)、中直鏈淀粉(20-25％)和高直鏈淀粉(25-33％)(Juliano，1979，1985)。最近采用HPLC法的研究表明最大的實(shí)際直鏈淀粉含量約為20％，其他的碘結(jié)合取決于支鏈淀粉的長(zhǎng)線性鏈(Takeda et al.，1987)。此處的“直鏈淀粉含量”或“表觀直鏈淀粉含量”定義為采用碘量法測(cè)定，或者業(yè)內(nèi)公知的，如Morrison和Laignelet(1983)所述的分光光度法測(cè)定。當(dāng)然其他方法如高性能液相色譜法(HPLC，例如Batey和Curtin，1996)僅分析“實(shí)際直鏈淀粉”，其可能會(huì)低估此處所定義的“直鏈淀粉含量”。
本發(fā)明的谷粒的淀粉中包含至少40％(w/w)的直鏈淀粉。優(yōu)選地，直鏈淀粉占總淀粉的百分比是至少45％、50％或55％的，更優(yōu)選地，是60％，特別優(yōu)選地，是65％、70％或75％。在一優(yōu)選的實(shí)施例中，谷粒是非轉(zhuǎn)基因的，其淀粉中包含至少40％的直鏈淀粉?？蛇x擇地，所述谷粒具有降低水平的SBEIIa和SBEIIb蛋白質(zhì)且其淀粉中含有至少40％的直鏈淀粉。增加的直鏈淀粉水平可通過(guò)異常的淀粉顆粒形態(tài)證明，或者通過(guò)在光學(xué)顯微鏡下觀察淀粉顆粒的雙折射損失來(lái)證明，或者采用業(yè)內(nèi)公知的其他方法來(lái)證明。
在一優(yōu)選的實(shí)施例中，所述水稻是秈稻品種，或者包含蠟質(zhì)基因的Wxα等位基因。
所述谷粒所含有的淀粉可具有改變后的物理特性，例如，糊化溫度和升高/降低，和/或在電泳時(shí)或之后膨脹特性的改變。
所述的谷粒可以是縮水的或不縮水的，最好是具有不縮水的顯型。此處所說(shuō)的“不縮水”被定義為大多數(shù)谷粒，至少90％的谷粒是飽滿的，具有豐滿的或全填充的顯型。這通常與淀粉集聚的正常或接近正常水平相關(guān)聯(lián)。相比之下，此處的“縮水”顯形是對(duì)大多數(shù)谷粒而言，至少90％的谷粒的淀粉集聚都是降低了的。輕度縮水谷粒是指平均淀粉含量至少降低30％，中等縮水谷粒是指平均淀粉含量至少降低50％，高度縮水谷粒是指平均淀粉含量至少降低70％?？s水率可以通過(guò)相對(duì)淀粉含量來(lái)測(cè)定，如占谷粒重量的百分比。野生糙米的大小和形狀參數(shù)定義如下超長(zhǎng)，＞7.50mm；長(zhǎng)，6.61至7.50mm；中等，5.51至6.60mm；短，＜5.50mm。基于長(zhǎng)與寬的比率特性將谷粒形狀定義為細(xì)長(zhǎng)，＞3.0；中等，2.1至3.0；粗，1.1至2.0；圓，＜1.0。本發(fā)明的水稻谷粒中，上述的每一個(gè)特性都可以被改變。
本發(fā)明還提供用該谷粒產(chǎn)出的粉、粗粉或其他產(chǎn)品。包括經(jīng)加工或未加工，如分餾，漂白等。本發(fā)明還提供從本發(fā)明的水稻作物中取得的對(duì)食品生產(chǎn)有用的谷粒。此外，本發(fā)明還包括以其他方式加工的谷粒，如碾磨、碾碎、成珠狀、粗磨、裂碎、煮等。
淀粉本發(fā)明的另一方面，提供一種從上述的水稻作物的谷粒中獲得的淀粉或淀粉顆粒，其具有增加了的直鏈淀粉含量和降低了的支鏈淀粉含量。所述水稻作物的胚乳中具有減少的SBEIIa和SBEIIb活性水平。另外一方面，本發(fā)明提供一種從所述水稻植株的谷粒中獲得的淀粉或淀粉顆粒，其包括至少40％、50％、55％或60％的直鏈淀粉，更優(yōu)選地，是至少65％、70％或75％的直鏈淀粉。可以通過(guò)碾磨加工如濕磨法來(lái)獲得純淀粉。所述濕磨包括把淀粉與蛋白質(zhì)、油類、纖維分離。碾磨加工后的最初產(chǎn)品是淀粉顆粒的混合物。因此，本發(fā)明包括這些顆粒。
野生品種水稻的淀粉顆粒是多邊形的，并且尺寸在3到9微米之間，平均單峰分布(unimodal distribution)尺寸在5微米左右。蛋白質(zhì)主要以尺寸在0.5至4微米的球形蛋白質(zhì)形式而存在于整個(gè)胚乳之中。
所述的淀粉具有提高或減少了的糊化溫度，優(yōu)選提高了的糊化溫度。相比較于從相似的、未經(jīng)改良的谷粒提取的淀粉，用DSC法測(cè)量的糊化溫度尤其是第一峰值的起點(diǎn)溫度或第一峰值的頂點(diǎn)溫度至少升高了3℃，優(yōu)選地是至少5℃，更優(yōu)選地，是7℃。所述的淀粉中還可包括提高了的抗性淀粉水平，結(jié)構(gòu)的改變顯示出以下一項(xiàng)或多項(xiàng)特定的物理性質(zhì)消化酶的物理難接近性，這可能是因?yàn)榈矸垲w粒形態(tài)的改變、與脂類相關(guān)聯(lián)的淀粉的存在、結(jié)晶度的改變或分支淀粉分布鏈長(zhǎng)度的改變。較高的直鏈淀粉含量，對(duì)抗性淀粉的水平也有貢獻(xiàn)。
本發(fā)明還提供一種從實(shí)施例的水稻作物的谷粒中獲得的淀粉。所述谷粒中食用纖維的含量增加了，優(yōu)選地，抗性淀粉的水平也同時(shí)升高。這些增加，至少部分導(dǎo)致了直鏈淀粉含量的提高。
減少基因活性的方法轉(zhuǎn)基因可以通過(guò)引入一個(gè)或多個(gè)基因變種到水稻作物中改變其SBEIIa和SBEIIb或者其他淀粉合成、修改基因的活性。也可以通過(guò)引入轉(zhuǎn)基因到該水稻作物中的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。所述“基因變種”是基因組上的任何改變，在這里，所述改變引起SBEIIa和SBEII活性的減少，還可選擇性地引起其他淀粉生物合成或改良基因活性的減少。該基因變種包括包括點(diǎn)突變、點(diǎn)置換、點(diǎn)復(fù)制、點(diǎn)遷移，優(yōu)選地，包括點(diǎn)的缺失、把一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因引入到基因組中。在一優(yōu)選的實(shí)施例中，基因變種是無(wú)效突變，例如是倒置、復(fù)制、遷移、缺失、移碼(frameshift)或RNA接合突變的結(jié)果。在這里，“轉(zhuǎn)基因”是生物技術(shù)領(lǐng)域常用的含義，包括通過(guò)DNA或RNA重組技術(shù)生產(chǎn)的或改變的且被引入到期望器官或細(xì)胞的基因序列。轉(zhuǎn)基因可以包括源自器官或細(xì)胞中的基因序列，如反義序列。在一優(yōu)選的實(shí)施例中，轉(zhuǎn)基因包括核苷序列，該核苷序列至少有19連續(xù)的核苷與所述的水稻SBEIIa序列或SBEIIb的19個(gè)連續(xù)的核苷具有至少94％的同一性。典型地，轉(zhuǎn)基因包括不是來(lái)自水稻的外生核酸?！稗D(zhuǎn)基因的”是指水稻作物或谷?；蚣?xì)胞中含有轉(zhuǎn)基因?！胺寝D(zhuǎn)基因的”是指水稻作物的基因組中沒(méi)有任何的轉(zhuǎn)基因。為了遺傳的穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)基因通常被整合到器官或細(xì)胞的基因組中。
這里所述的“基因”，包括SBEIIa、SBEIIb或其他淀粉生物合成基因，或者對(duì)反義、增強(qiáng)反義、共抑制、核酶、雙RNA之類的分子進(jìn)行編碼的基因，以及在其最大范圍內(nèi)接收的類似物，包括基因組基因，以及對(duì)應(yīng)于基因的編碼區(qū)(基因內(nèi)區(qū))的mRNA或cRNA——如果他們存在的話，已轉(zhuǎn)錄但尚未翻譯的序列，以及包括調(diào)節(jié)區(qū)，所述調(diào)節(jié)區(qū)包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子/多聚腺苷酸化序列?！盎颉币灿糜诿枋龊铣傻幕蚓酆系木幋a部分或全部功能產(chǎn)品的分子。首選的基因是使用標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)從自然的SBEIIa、SBEII或淀粉生物合成基因中提取。通常，基因可能屈服于突變而產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)核苷替代、缺失和/或加成物。這些基因的核苷插入衍生物包括5’和3’末端聚合，以及單個(gè)或多個(gè)核苷中的序列內(nèi)插入。隨機(jī)的插入似乎是可行的，只要從結(jié)果產(chǎn)品中進(jìn)行適宜地篩選；但插入核苷序列變異體是將一個(gè)或多個(gè)核苷引入到核苷序列中預(yù)定的位置。缺失變異體表征為從序列中移除一個(gè)或多個(gè)核苷。替代核苷變異體是指序列中至少一個(gè)核苷被移除和至少一個(gè)不同的核苷被插入到該位置。這種替代可以是“沉默”的，在根本上不改變由密碼子所定義的氨基酸。同樣，保守替代則是指有計(jì)劃地把一個(gè)氨基酸改變成另一個(gè)相似的氨基酸。典型的替代如下氨基酸替代的適宜殘留物原始的殘留物 典型的替代物Ala SerArg LysAsn Gln；HisAsp GluCys SerGln AsnGlu AspGly AlaHis Asn；GlnIle Leu；ValLeu Ile；ValLys Arg；Gln；GluMet Leu；IlePhe Met；Leu；TyrSer ThrThr SerTrp TyrTyr Trp；PheVal Ile；Leu業(yè)內(nèi)技術(shù)人員應(yīng)該知道，細(xì)胞中基因的表達(dá)以及互補(bǔ)序列要求將所述基因與啟動(dòng)子序列可操作地鏈接。實(shí)現(xiàn)本目的的啟動(dòng)子的選擇取決于需要的表達(dá)水平和/或該表達(dá)所在的組織、器官或細(xì)胞，優(yōu)選的是胚乳特定的啟動(dòng)子。
把核酸分子置于啟動(dòng)子序列的調(diào)節(jié)控制之下，意味著放置所述核酸分子，使啟動(dòng)子序列能控制該核酸分子的表達(dá)。啟動(dòng)子通常但不是必須在上游，或者在其所控制的核酸分子的5’-端。更進(jìn)一步地，包括啟動(dòng)子在內(nèi)的調(diào)節(jié)單元通常位于基因轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)的2kb處。在異種的啟動(dòng)子/結(jié)構(gòu)基因結(jié)合的結(jié)構(gòu)中，啟動(dòng)子的位置離基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離，最好大致等于啟動(dòng)子與其所控制的基因(即，衍生該啟動(dòng)子的基因)之間固有的距離。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，這個(gè)位置的啟動(dòng)子可以被容納而不會(huì)引起啟動(dòng)子功能的損失。同樣，與異種基因有關(guān)調(diào)節(jié)序列元的最佳位置定義為該調(diào)節(jié)序列元固有配置下(即，衍生該調(diào)節(jié)序列元的基因)的位置，其中，所述異種基因被放置在所述調(diào)節(jié)序列元的控制下。同樣，業(yè)內(nèi)公知，所述距離會(huì)有某些變化。
本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)中，適用的啟動(dòng)子的實(shí)例包括，取自由病毒基因、酵母菌基因、霉菌基因、細(xì)菌基因、昆蟲基因、鳥類基因、哺乳動(dòng)物基因和植物基因的衍生而來(lái)的啟動(dòng)子，優(yōu)選植物細(xì)胞中的功能性基因，特別是在水稻胚乳中表達(dá)的基因。啟動(dòng)子根據(jù)表達(dá)發(fā)生所在的組織的不同，而恒定地或差分地調(diào)節(jié)表達(dá)。而且，隨著表達(dá)發(fā)生的發(fā)展階段不同，或者隨著物理壓力、溫度等外部刺激的不同，該表達(dá)也會(huì)不同。
降低SBEIIa或其他淀粉生物合成基因活性的方法，包括將轉(zhuǎn)基因引入到可再生的水稻細(xì)胞中，或者引入到取自變性細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因水稻細(xì)胞中的步驟。支鏈淀粉的合成中涉及的分支酶包括SBEI、SBEIIa、SBEIIb，而該轉(zhuǎn)基因能鈍化其中至少一種基因。此外，對(duì)SBEIIb和/或SBEI的鈍化可是直接的，即轉(zhuǎn)基因(如對(duì)雙RNA、反義、或核酶RNA等編碼的轉(zhuǎn)基因，見(jiàn)下述)直接針對(duì)SBEIIb或SBEI的表達(dá)，或轉(zhuǎn)基因間接地導(dǎo)致SBEIIb或SBEI表達(dá)的減少。例如，根據(jù)序列的同一性或者堿基配對(duì)的順序，RNA轉(zhuǎn)基因可以不但針對(duì)SBEIIa基因/RNA，而且還通過(guò)改變胚乳中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性或分布來(lái)降低SBEIIb或SBEI的活性。本發(fā)明的其它形式在于將減少了SBEIIa和SBEIIb活性和一種或多種其他的支鏈淀粉合成酶的改變相結(jié)合，所述其他的支鏈淀粉合成酶包括SSI、SSII、SSIII和脫麩酶，如異淀粉酶或普魯蘭酶。其中任何一種酶或所有酶的表達(dá)，都可以通過(guò)引入轉(zhuǎn)基因來(lái)改變。在一優(yōu)選的實(shí)施例中，水稻作物的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADGP)的過(guò)度表達(dá)顯示出提高了產(chǎn)量(Smidansky et al.，2003)。
目前已經(jīng)知道水稻中分支淀粉合成基因的幾個(gè)DNA序列，其中任何一個(gè)都可作為設(shè)計(jì)出鈍化水稻基因的轉(zhuǎn)基因的基礎(chǔ)。這些序列包括水稻cDNAsSBEIIa(基因庫(kù)序列E14723，日本專利申請(qǐng)?zhí)朜o.JP1998004970)、SBEIIb(D16021，Mizuno et al.，1993)和SBEI(D11082，Mizuno et al.，1992；D10752，Nakamura和Yamanouchi，1992)。水稻的SBEI基因已被Rahmant et al.，(1997)和Rahman et al.，(1999)或基因庫(kù)序列D10838，Kawasaki et al.，(1993)所公開。更多基因序列可從下面的網(wǎng)址獲取http://www.ncbi.nlm.nih.gov/；http://www.tigr.org；http://www.gramene.org/about/index.html。
小麥、大麥、玉米或其他近親物種的SBEIIa、SBEIIb同族體或其他支鏈淀粉合成基因也能用于修改水稻中的基因表達(dá)水平?？捎脴I(yè)內(nèi)公知的方法獲得所述基因或片斷，包括PCR放大法或雜交標(biāo)記探針。同源染色體中準(zhǔn)備用作轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的區(qū)域，應(yīng)該與水稻基因具有至少85％的等同性，在適當(dāng)?shù)膮^(qū)域，最好是具有85％甚至95～100％的同一性。優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)基因是具體針對(duì)水稻胚乳中的支鏈淀粉合成基因的表達(dá)，對(duì)作物中其他部分的支鏈淀粉合成只有很小的或極微弱的影響。這可以通過(guò)使用適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列，如轉(zhuǎn)基因的胚乳特定啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)。
文中“嚴(yán)格的雜交條件”意味著，探針和目前序列之間，至少有90％最好是至少95％的序列同一性時(shí)，雜交才發(fā)生。嚴(yán)格的雜交條件的一個(gè)例子是在含有下述組分的溶液中通宵培養(yǎng)50％甲酰胺、5×SSC(1×SSC＝150mM的NaCl和15mM檸檬酸化三鈉)、50mM苯酚鈉(PH＝7.6)、5×丹哈德溶液(Denhardt’s solution)、10％硫酸化右旋糖苷和20up/ml變性剪切帶菌DNA，如在鮭魚精子DNA，然后在大概65℃的條件下，在0.1×SSC中清洗雜交支撐物。其它雜交和清洗的條件是公開的且被Sambrook et al，所示證，“《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版，ColdSpring Harbor，NY(1989)，particularly chapter 11?！狈戳x已知的的基因工程或基因改造用于于修改特別是降低作物中基因的活性，在業(yè)界是公知技術(shù)。引入基因變種到水稻作物中的方法包括適當(dāng)?shù)姆戳x分子表達(dá)，該反義分子與目標(biāo)基因的RNA互補(bǔ)并能與之雜交。反義分子被認(rèn)為干擾了目標(biāo)基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄或處理或穩(wěn)定性，從而鈍化了該目標(biāo)基因的表達(dá)。設(shè)計(jì)反義序列的方法在領(lǐng)域內(nèi)是廣泛知曉的。一些相關(guān)例子可以在美國(guó)專利號(hào)5190131、歐洲專利文本0467349-A1、歐洲專利文本0223399-A1和歐洲專利文本0240208中找到，本發(fā)明也參考結(jié)合了這些的文獻(xiàn)。對(duì)作物采用反義技術(shù)已被Bourque(1995)和Senior(1998)所論述。Bourque列舉了很多關(guān)于如何將反義序列用在作物系統(tǒng)而作為基因失活的方法的例子，她同時(shí)闡述，沒(méi)必要100％地抑制酶活性，因?yàn)椴糠值匾种泼富钚?，更可能?dǎo)致作物系統(tǒng)發(fā)生可測(cè)定的變化。Senior(1998)闡述，反義法是目前非常完善的用于控制基因表達(dá)的技術(shù)。
用于水稻SBEIIa、SBEIIb、SBEI或其他支鏈淀粉生物合成基因的反義分子是以水稻mRNA序列為基礎(chǔ)，或以取自其他物種如大麥的與DNA或mRNA序列同族的序列為基礎(chǔ)。這些反義序列可以對(duì)應(yīng)于結(jié)構(gòu)基因，或者對(duì)應(yīng)于影響控制基因表達(dá)或基因剪除的序列。例如，所述反義序列可以對(duì)應(yīng)于水稻SBEIIa或其他基因的目標(biāo)編碼區(qū)，或者對(duì)應(yīng)于5’-未轉(zhuǎn)錄區(qū)(UTR)或3’-UTR，及其組合。所述反義序列可以與內(nèi)含子序列部分互補(bǔ)，從而在轉(zhuǎn)錄時(shí)或轉(zhuǎn)錄后被剪除掉，優(yōu)選地，僅僅剪除掉目標(biāo)基因的外含子序列。考慮到UTR通常具有較大的趨異性，以UTR為目標(biāo)就為基因抑制提供了較大的特異性。反義序列的長(zhǎng)度是至少19個(gè)連續(xù)的核苷，優(yōu)選地是至少50個(gè)、更優(yōu)選地是至少100、200、500或1000個(gè)核苷。與整個(gè)基因轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)的標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度序列也會(huì)用到，其優(yōu)選的長(zhǎng)度是100～2000核苷。反義序列與目標(biāo)轉(zhuǎn)錄之間的同一性程度是至少85％，優(yōu)選地是至少95％，更優(yōu)選地是至少95～100％。反義RNA分子理所當(dāng)然地可以包括不相關(guān)的、用以穩(wěn)定該分子的序列，。
共抑制另一可用的分子生物學(xué)方法是共抑制。共抑制的機(jī)理尚未完全了解，共抑制被認(rèn)為包含轉(zhuǎn)錄后的基因沉默(PTGS)，從這一點(diǎn)看來(lái)，與很多反義抑制的例子相似。共抑制包含以正義方向?qū)⒒蚧蚱瑪嗟念~外復(fù)制引入到作物中，所述正義方向與基因表達(dá)的啟動(dòng)子有關(guān)。正義片段的大小、與目標(biāo)基因區(qū)域的一致性、與目標(biāo)基因的等同性程度，見(jiàn)上述反義序列。在一些實(shí)施例中，基因序列的額外復(fù)制干擾了目標(biāo)作物基因的表達(dá)。實(shí)施共抑制的方法可以參考專利文本W(wǎng)O 97/20936和歐洲專利文本0465572。
雙鏈RNA-媒介基因沉默將基因突變引入到水稻作物的另一種方法就是雙鏈或雙向RNA媒介基因沉默。該方法也涉及PTGS。該方法中，被引入的DNA至少部分地指引雙向RNA產(chǎn)物的合成，與將被鈍化的目標(biāo)基因有同源性。因此，該DNA包含正義和反義序列。所述正義和反義序列被轉(zhuǎn)錄成RNA時(shí)，能夠雜交以形成雙鏈RNA區(qū)。在優(yōu)選的實(shí)施例中，正義序列和反義序列被包含內(nèi)含子的間隔區(qū)域隔開，所述內(nèi)含子在被轉(zhuǎn)錄成RNA時(shí)被剪除掉。這種安排能帶來(lái)高效率的基因沉默(Smith et al.，2000)。所述雙鏈區(qū)域可以包括一個(gè)或兩個(gè)RNA分子，該RNA分子由一個(gè)或兩個(gè)DNA區(qū)域轉(zhuǎn)錄而來(lái)。雙鏈分子的存在引起了內(nèi)生作物系統(tǒng)的反應(yīng)，該反應(yīng)破壞雙鏈RNA，也破壞了從目標(biāo)作物基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)的同源RNA，有效地降低或消除目標(biāo)基因的活性。為實(shí)施該方法，可以參考澳大利亞專利文本99/29514-A和專利文本W(wǎng)O 99/53050。雜交的正義和反義序列的長(zhǎng)度至少是19個(gè)連續(xù)的核苷，優(yōu)選地是至少30個(gè)或50個(gè)，更優(yōu)選地是至少100、200、500或1000個(gè)核苷。與整個(gè)基因轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)的標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度序列也會(huì)用到，其優(yōu)選長(zhǎng)度是100～2000核苷。反義序列與目標(biāo)轉(zhuǎn)錄之間的同一性程度是至少85％，優(yōu)選地是至少95％，更優(yōu)選地是至少95～100％。反義RNA分子理所當(dāng)然地可以包括不相關(guān)的、用以穩(wěn)定該RNA分子的序列。RNA分子可以在RNA聚合酶II啟動(dòng)子或者RNA聚合酶III啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。后者包括tRNA或snRNA啟動(dòng)子。
反義、共抑制或雙鏈RNA分子包括大規(guī)模雙鏈RNA區(qū)域，優(yōu)選地包括核定位信號(hào)(nuclear localization signal)，如PCT/AU03/00292所述。在優(yōu)選的實(shí)施例中，所述大規(guī)模雙鏈RNA區(qū)域源于PSTVd類病毒，或者包括至少35個(gè)CUG三核甘酸重復(fù)(trinucleotide repeats)。
核酶核酶用于引入使水稻中所期望的基因表達(dá)失活的基因變異。核酶是帶有酶的或催化功能的RNA分子，它能夠在由一個(gè)或(通常是)兩個(gè)雜交序列定義的特定位點(diǎn)分裂其它RNA分子。RNA的分裂而鈍化了目標(biāo)基因的表達(dá)。核酶可以扮演反義分子的角色，促成基因鈍化。核酶包含在雜交序列子間的一個(gè)或多個(gè)催化域，優(yōu)選錘頭(hammerhead)或發(fā)夾(hairpin)類?？捎玫钠渌嗣割愋桶≧NAseP、組I或II內(nèi)含子以及肝炎病毒類型等。參考?xì)W洲專利文本0321201和美國(guó)專利6,221,661。用核酶來(lái)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物中基因的鈍化已有示證，如Wegener et al(1994)。
遺傳構(gòu)體/載體本發(fā)明還提供單個(gè)的核酸分子，其中包括RNA，最好包括對(duì)基因抑制分子進(jìn)行編碼的DNA。優(yōu)選地，核酸分子以水稻SBEIIa和/或SBEIIb基因序列為目標(biāo)且有效地對(duì)失活水稻胚乳中SBEIIa和/或SBEIIb基因表達(dá)的反義、正義(共抑制)、雙鏈RNA或核酶分子進(jìn)行編碼。本發(fā)明還提供一種基因結(jié)構(gòu)，其包括一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)單元如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄終止或多腺苷序列。這些單元已為業(yè)內(nèi)所公知。該基因結(jié)構(gòu)還可以包括促進(jìn)作物——尤其是單子葉作物如水稻——的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的內(nèi)含子序列。此處的“內(nèi)含子”是其通用含義，指已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄的、但沒(méi)有對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的且在轉(zhuǎn)換之前被剪除掉的遺傳片段。如果轉(zhuǎn)基因?qū)D(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行編碼，那么內(nèi)含子可以結(jié)合到5’-UTR或編碼區(qū)域；反之，其可以結(jié)合到任何的轉(zhuǎn)錄區(qū)。在一特定的實(shí)施例中，所采用的是直接的胚乳特定表達(dá)內(nèi)含子，如大麥基因內(nèi)含子(Ahlandsberg et al.，2002)。
本發(fā)明還提供了一種載體，如質(zhì)粒載體，其中包含基因結(jié)構(gòu)。此處的“載體”包括表達(dá)載體和轉(zhuǎn)錄載體。表達(dá)載體能夠在體外表達(dá)和體內(nèi)表達(dá)；轉(zhuǎn)錄載體能夠從一個(gè)細(xì)胞或器官被轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞或器官中。載體包括在細(xì)胞中提供復(fù)制的序列，如原核細(xì)胞中E大腸桿菌或土壤桿菌。優(yōu)選地，載體是包括T-DNA序列的二元載體，由至少一個(gè)T-DNA邊界序列定義。本發(fā)明還提供了一種包括載體的細(xì)胞，例如土壤桿菌或水稻細(xì)胞，所述細(xì)胞是可再生的，如幼胚盾片上的細(xì)胞?？蛇x地，這些細(xì)胞可以是轉(zhuǎn)化后含轉(zhuǎn)基因的水稻細(xì)胞。
啟動(dòng)子/終止子本發(fā)明中的轉(zhuǎn)基因或其他基因結(jié)構(gòu)可包含為水稻胚乳提供調(diào)節(jié)和本質(zhì)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(啟動(dòng)子)。這些啟動(dòng)子可以是組織特異性的，在胚乳中具有選擇性與排他性表達(dá)。這些啟動(dòng)子既可以是胚乳特異性的(如高分子量麥谷蛋白啟動(dòng)子、水稻SSI啟動(dòng)子、水稻SBEII啟動(dòng)子、水稻GBSS啟動(dòng)子)也可以是非胚乳特異性的啟動(dòng)子[如泛素啟動(dòng)子(ubiquitin promoter)或CaMV35S或增強(qiáng)35S啟動(dòng)子]。這些啟動(dòng)子可以被溫度、光或壓力等因素所調(diào)整。通常，這些啟動(dòng)子由被表達(dá)的5’基因序列提供。這樣的結(jié)構(gòu)還包含其他加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的單元，如nos 3’或ocs 3’多聚腺苷酸化區(qū)域或轉(zhuǎn)錄終端。所列舉的DNA區(qū)域可以結(jié)合在含有選擇性標(biāo)記基因序列和其它單元的載體之中，或結(jié)合在含有這些序列的與該載體共轉(zhuǎn)化的載體之中。
水稻的改造方法通過(guò)引入外生核酸的方式引入遺傳變種到作物中來(lái)對(duì)水稻進(jìn)行改造的方法，在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。如見(jiàn)Chan et al.，1993；Hiei et al.，1994；Zhang et al.，1997；Buchholz et al.，1998。如業(yè)內(nèi)所知，適當(dāng)?shù)耐寥罈U菌族(Agrobacteriumstrains)、或者基因槍法、或者水稻質(zhì)體吸收的聚乙二醇媒介，或類似物，都作為改造的媒介。攜帶有所期望的核苷序列或基因結(jié)構(gòu)以及可選擇的標(biāo)志的載體，可被引入到培養(yǎng)作物或外植體組織的可再生細(xì)胞中，例如，原生質(zhì)體或未發(fā)育完全的胚晶或胼胝體(callus)。所述可選擇的標(biāo)志基因可以為水稻細(xì)胞提供抗生素或除草劑抵抗力，或者允許使用底物，如甘露糖，用于生長(zhǎng)。優(yōu)選地，所述可選擇的標(biāo)志將甘氨酸、潮霉素或草銨膦(phosphinothricin)抵抗力引入到水稻細(xì)胞中。優(yōu)選地，所述可再生的水稻細(xì)胞來(lái)自幼胚或成熟晶胚的盾片及其愈合組織，或者分生組織(meristematic tissue)。改造后的細(xì)胞用業(yè)內(nèi)公知的方法篩選和再生以產(chǎn)出改造后的水稻作物，如實(shí)施例2所述。
改造后的作物可包含可選擇的標(biāo)志基因，或者包含在再生過(guò)程/再生之后被移除的基因。如從基因組中切除所述的可選擇的標(biāo)志基因，或從導(dǎo)致抑制SBEIIa和/SBEIIb的轉(zhuǎn)基因中分離出可選擇的標(biāo)志基因。
轉(zhuǎn)基因或突變已被整合到染色體之中的作物可以被篩選出來(lái)，如采用恰當(dāng)?shù)牡膶?duì)該轉(zhuǎn)基因或表型的觀測(cè)具有特效的核酸探針來(lái)篩選。可以采用任何一種可行的方法來(lái)確認(rèn)轉(zhuǎn)基因作物的存在。例如，可以用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來(lái)放大經(jīng)改造的作物特有的序列，再用凝膠電泳法或其他方法對(duì)放大產(chǎn)物進(jìn)行探測(cè)。從作物中提取DNA的方法可以是傳統(tǒng)的方法或PCR反應(yīng)，其中，PCR反應(yīng)的實(shí)施采用了能區(qū)分改造過(guò)的和未經(jīng)改造的作物的引子。例如，可以設(shè)定引子來(lái)放大DNA區(qū)域，該DNA區(qū)來(lái)自隱藏在構(gòu)體中的載體并設(shè)定反引子來(lái)放大相關(guān)基因的DNA區(qū)域。如果該作物已經(jīng)被成功改造，那么這些引子僅放大某一片段。另一個(gè)能證實(shí)進(jìn)行了有效改造的替換方法是業(yè)內(nèi)公知的DNA印跡交法(Southern blot hybridization)?？梢愿鶕?jù)顯型，來(lái)區(qū)分或識(shí)別改造作物或突變作物與未改造作物或天然作物。如根據(jù)可選擇的標(biāo)志基因的存在所帶來(lái)的顯型，或免疫法的特異蛋白質(zhì)的存在所帶來(lái)的顯型，或者某特異蛋白質(zhì)不存在所帶來(lái)的顯型，如用ELISA化驗(yàn)法或蛋白質(zhì)印跡分析(Western blot analysis)分析法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胚乳中不存在SBEIIa蛋白質(zhì)所帶來(lái)的顯型?？梢酝ㄟ^(guò)觀察谷粒的表形特性來(lái)篩選這樣的作物，如對(duì)不縮水谷粒/升高的直鏈淀粉含量進(jìn)行可視化的檢測(cè)或測(cè)量，或者通過(guò)顯微鏡來(lái)檢測(cè)淀粉顆粒是否存在雙折射等。
突變通過(guò)在相應(yīng)的基因或調(diào)節(jié)序列進(jìn)行適當(dāng)?shù)耐蛔?，可以?shí)現(xiàn)導(dǎo)致胚乳中SBEIIa酶活性或其他淀粉生物合成酶活性降低的遺傳變種的引入?；虮灰种频某潭?，在一定程度上決定了改造后的淀粉的特性。這些突變可以是截?cái)啵蛘呤菬o(wú)效突變，它們被認(rèn)為對(duì)淀粉的本性有著顯著的影響，然而，淀粉結(jié)構(gòu)的改變也可由滲漏突變體(leaky mutant)引起，所述滲漏突變體顯著地減少了水稻谷粒或淀粉的支鏈淀粉合成酶的活性以提供所期望的特性。其它染色體重組也是有效的方法，包括缺失、插入、復(fù)制或、點(diǎn)突變等。
突變可以通過(guò)化學(xué)的或輻射的手段來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如對(duì)種子進(jìn)行EMS或疊氮鈉(Zar and Chandler，1995)處理，或者γ輻射。對(duì)于γ輻射誘導(dǎo)突變，種子在鈷60放射源下以20-50kR劑量照射(Zikiryaeva and Kasimov，1972)。EMS突變是把種子用EMS(0.03％，v/v)進(jìn)行處理(Mullins et al.，1999)。突突變種的分離可以采用篩選突變作物或種子來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，可以用ELISA法，從一定數(shù)量的突變的水稻中，篩選出谷粒中直鏈淀粉含量高的和/或大于正常的支鏈淀粉分布鏈長(zhǎng)度的、或者不含SBEIIa和/或SBEIIb蛋白質(zhì)的，或者根據(jù)已改變的谷粒形態(tài)(Green et al.，1997)來(lái)篩選。篩選最好在缺少某種SBE活性的谷粒形態(tài)下進(jìn)行，例如SBEIIb-或SBEIIb-陰性背景下。然后，通過(guò)采用具有所期望的遺傳本底的作物與這種突突變種進(jìn)行雜交，并通過(guò)適當(dāng)數(shù)量的回交把不想要的母體遺傳本底除掉，從而把這些突變被引入到所期望的遺傳本底中。優(yōu)選的突變是影響水稻的SBEIIa和SBEIIb表達(dá)或活性的突變。
因此，本發(fā)明提供高直鏈淀粉、非轉(zhuǎn)基因的水稻谷粒及其產(chǎn)品。
對(duì)SBEIIa、SBEIIb或涉及支鏈淀粉合成有關(guān)的核酶編碼的突變，例如GBSS水平的提高，使水稻胚乳的淀粉中直鏈淀粉含量升高。每顆谷粒中直鏈淀粉量的增加，是碳元素從支鏈淀粉轉(zhuǎn)到直鏈淀粉的結(jié)果；如果每顆谷粒的淀粉量顯著減少，直鏈淀粉的量也可能減少。但這兩種情況下，直鏈淀粉占淀粉的百分比都是升高的。
據(jù)報(bào)道，高直鏈淀粉大麥的種子中有扭曲形狀的淀粉顆粒(Morell et al.，2003)，低支鏈淀粉(LAPS)玉米淀粉中有90％左右的直鏈淀粉(Sidebottomet al.，1998)。這些顯型可用于選擇一定數(shù)量的誘變水稻。雙折射也可用于此。雙折射是物質(zhì)在兩個(gè)方向反射光的能力；在偏振顯微鏡下觀察時(shí)，雙折射在淀粉顆粒上產(chǎn)生暗十字，稱為“馬爾他十字”(“maltese cross”)。雙折射是顆粒內(nèi)聚合體的結(jié)構(gòu)組織規(guī)則程度的反映(Thomas和Atwell，1999)。淀粉顆粒中雙折射的損失通常與增加的直鏈淀粉含量有關(guān)。
適宜的食用產(chǎn)品本發(fā)明另一方面提供一種適于食用產(chǎn)品的水稻，其谷粒的淀粉中包含相對(duì)高的直鏈淀粉含量和降低了的支鏈淀粉含量。優(yōu)選地，所述谷粒來(lái)源的水稻作物的生長(zhǎng)期胚乳中具有降低了蛋白質(zhì)和/或活性水平的SBEIIa和SBEIIb。本發(fā)明的水稻作物適用于食用產(chǎn)品，尤其是商業(yè)食用產(chǎn)品。
水稻的期望遺傳本底包括農(nóng)業(yè)收益和其他特性。這些特性可以包括農(nóng)學(xué)性能、抗病體和非生物壓力抵抗性。在澳大利亞，某些人希望把改造后的淀粉特性雜交到水稻栽培變種，包括亞瑪茹(Amaroo)、艾麗康蕃(Ali Combo)、笆斯瑪?shù)?Basmati)、蕃桿(Bogan)、蕃比芽(Bombia)、冬嘎喇(Doongara)、谷拉哈(Goolarah)、伊納幫(Illabong)、加哈(Jarrah)、越光米(Koshihikari)、吉爾瑪(Kyeema)、朗節(jié)(Langi)、米林(Millin)、納瑪葛(Namage)、澳派司(Opus)、蓓耳德(Pelde)或其他廣泛種植的變種。所列舉這些品種是適宜于澳大利亞生產(chǎn)區(qū)的，其他的變種適宜于其他種植區(qū)。優(yōu)選地，在至少一些栽培區(qū)，相對(duì)于所種植的野生水稻品種，本發(fā)明的水稻變種能帶來(lái)不少于80％的收益，更優(yōu)選地是不少于90％，特別優(yōu)選地，是不少于95％的收益。所述產(chǎn)量收益可通過(guò)試驗(yàn)控制田很容易地測(cè)量到。
谷粒中淀粉含量(w/w)至少是25％，優(yōu)選地是至少35％或45％，更優(yōu)選地是接近野生水平的55％至65％(w/w)。更優(yōu)選地，谷粒的淀粉含量至少是等同的、未經(jīng)改造的水稻的谷粒淀粉含量的90％。淀粉含量低于野生作物的，很可能是降低了支鏈淀粉水平的結(jié)果。即使淀粉含量更低，這種谷粒在食品生產(chǎn)上也還是有用的，因?yàn)楦咧辨湹矸郛a(chǎn)品具有相對(duì)的高價(jià)值。其他期望的特性包括谷粒的碾磨能力，特別是谷粒的硬度。另一方面，是谷粒中淀粉提取程度，淀粉提取率越高，越有用，這種谷粒就越有價(jià)值。谷粒的形狀也是影響作物商業(yè)有用性的一個(gè)特性，因?yàn)槠鋵?duì)碾磨的難易程度產(chǎn)生影響。例如，細(xì)長(zhǎng)形狀的谷粒就難碾磨和加工。
使用標(biāo)準(zhǔn)的方法能很容易地從水稻谷粒中分離出淀粉，例如通過(guò)在堿性溶液中濕磨以去除蛋白質(zhì)。碎米在堿性溶液中浸泡24小時(shí)后，接著在堿性溶液粉磨機(jī)、錘磨機(jī)或石磨中濕磨。米糊存放10至24小時(shí)候，用篩除去纖維，通過(guò)離心收集淀粉，然后用水清洗，干燥后就得到淀粉。
改性淀粉的物理特性本發(fā)明另一方面，水稻淀粉具有改變了的糊化溫度，可用采用差式掃描量熱法(DSC)測(cè)量。糊化是在過(guò)量的水中淀粉顆粒的分子順序被熱驅(qū)動(dòng)瓦解(分裂)，具有伴隨的和不可逆轉(zhuǎn)的屬性變化，如微粒膨脹，晶體溶解、雙折射損失、粘性增加和淀粉加溶。與野生作物的淀粉相比，糊化溫度升高或降低取決于殘余的支鏈淀粉的鏈長(zhǎng)。玉米中的ae(amylose extender，直鏈淀粉補(bǔ)充劑)突變帶來(lái)的直鏈淀粉含量增高，顯示出玉米的膠凝溫度比常態(tài)的高(Fuwa et al.，1999，Krueger et al.，1987)。換句話說(shuō)，相對(duì)于控制作物，大麥的sex6突變的淀粉缺乏淀粉合成酶IIa活性，糊化溫度變低，糊化峰點(diǎn)的焓減少(Morell et al.，2003)。
膠凝溫度的改變，可能與直鏈淀粉含量高有關(guān)系。用差式掃描量熱法測(cè)定出野生水稻淀粉膠凝第一峰值的溫度典型的是61-67℃(Rahman etal.，2000)，該溫度定義為起點(diǎn)溫度(onset temperature)。
與野生作物的淀粉比較，可以通過(guò)在過(guò)量的熱水中的膨脹率來(lái)描述本發(fā)明所涉及的淀粉的特征。膨脹體積的測(cè)量，通常是將淀粉或面粉和水混合，再加熱到高溫，通常是90℃以上。然后通過(guò)離心法取樣，膨脹體積通常用樣品沉淀物的質(zhì)量除以樣品的干重來(lái)標(biāo)示。在食品加工中，特別是含水食品加工中，要增加淀粉的含量，就期望淀粉具有低膨脹率的特性。
本發(fā)明中篩選出來(lái)的水稻淀粉的結(jié)構(gòu)，與普通水稻淀粉的不同之處是，結(jié)晶度比普通水稻淀粉低。淀粉結(jié)晶度的降低，被認(rèn)為能加強(qiáng)其感官屬性，口感上會(huì)覺(jué)得更滑。淀粉結(jié)晶度的降低，可能是因?yàn)橐粋€(gè)或多個(gè)支鏈淀粉合成酶活性的減少。結(jié)晶度可以通過(guò)X-射線結(jié)晶學(xué)來(lái)探測(cè)。
支鏈淀粉結(jié)構(gòu)改變的一個(gè)尺度就是淀粉鏈長(zhǎng)的分布，或者聚合度。可以先用熒光輔助糖類電泳(FACE)，接著使用異淀粉酶脫麩來(lái)測(cè)定鏈長(zhǎng)分布。本發(fā)明中，淀粉中的支鏈淀粉鏈長(zhǎng)分布的范圍是從5到60，大于野生作物脫麩后的淀粉的鏈長(zhǎng)分布范圍。鏈長(zhǎng)更長(zhǎng)的淀粉，分支的頻率有相應(yīng)的減少。因此，淀粉的支鏈淀粉中，仍然存在具有更長(zhǎng)的支鏈淀粉鏈長(zhǎng)的分布。
食用特性淀粉是人類飲食中碳水化合物的主要來(lái)源，尤其是亞洲。本發(fā)明的谷粒及其產(chǎn)物都可加工成食品。這些食品可以供人或動(dòng)物食用，如家畜食品或?qū)櫸锸称?。?lái)自改造后的水稻作物的谷粒，能容易地用在食品加工中。因此，本發(fā)明所得的改性淀粉顆?？捎糜谑称芳庸こ绦颍蚨景l(fā)明包括碾磨的、磨碎的、粗磨的、爆裂的、碾軋的、煮的或蒸的谷粒，或由此而得的產(chǎn)品，包括粉、面包、禮品(brokers)、米糠和米糠油。所述產(chǎn)品可以是預(yù)煮的或速煮的米，速食米、粒狀米、糊化米、罐裝米或米飯布丁。谷?；虻矸劭捎糜诩庸じ鞣N水稻產(chǎn)品，包括面條、年糕、米紙或蛋卷，或者發(fā)酵食品，如發(fā)酵的面粉或者飲料，如酒。所述谷?；虻矸垡材苡糜诿姘⒌案?、爆米花、餅干等，包括將米粉與面粉(小麥粉)或其他粉、食品添加劑如增稠劑、結(jié)合劑混合，或者用于制造飲料、面、意大利面食或速食湯等。這些米制食品也適用于無(wú)麥?zhǔn)澄?。本發(fā)明的谷粒衍生的米或產(chǎn)品，如爆米花、米薄片等是特別受歡迎的早餐食品。本發(fā)明的直鏈淀粉含量高的淀粉，可以用做強(qiáng)力凝膠劑，這在制糖產(chǎn)品中很有用，節(jié)省了成型和固化時(shí)間；還可以用來(lái)做食物敷層，如應(yīng)用到油炸馬鈴薯上，可以減少對(duì)油的吸收。
食用纖維在本文本中所述的食用纖維，是指碳水化合物和碳水化合物消化產(chǎn)物。這些消化產(chǎn)物不會(huì)被健康人體的小腸吸收，而是進(jìn)入到大腸中。食用纖維包括抗性淀粉和其他可溶的或不可溶的碳水化合物聚合體，還包括部分的碳水化合物蛋白，這種蛋白是可發(fā)酵的，至少能夠被大腸的常駐微生物群部分地發(fā)酵。
本發(fā)明所述的淀粉優(yōu)選地包括相對(duì)高含量的食用纖維，特別是相對(duì)高含量的直鏈淀粉。本發(fā)明中的谷粒中食用纖維的含量，可以是胚乳中直鏈淀粉含量增加單方面造成的；也可以是多方面造成的。
本發(fā)明的其他方面涉及高蛋白淀粉層、微生物、高含量的食用纖維的結(jié)合。具體地，涉及谷粒中更高的相對(duì)的蛋白淀粉/微生物高含量。輕度縮水的水稻谷粒中，胚乳的量也減少，而高蛋白淀粉層和微生物含量卻相對(duì)地提高了。這種水稻具有相對(duì)高含量的特定有益的元素或者維生素、抗性淀粉等，包括二價(jià)陽(yáng)離子、可生物利用的Ca++和維生素如葉酸、抗氧化劑如維生素E和生育三烯酚類等。碾磨產(chǎn)物的一種形式是包括高蛋白淀粉層。特定的碾磨處理可以提高碾磨產(chǎn)品中糊份層的含量。因而由碾磨谷粒衍生的或其他處理所衍生來(lái)的任何食品都具有高蛋白淀粉層和微生物含量，具有附加的營(yíng)養(yǎng)成分，而不需要從其他來(lái)源添加相應(yīng)的元素。
抗性淀粉抗性淀粉，是一個(gè)總稱，指沒(méi)有被健康人體的小腸吸收而進(jìn)入大腸的淀粉及淀粉產(chǎn)品。因此，抗性淀粉不包括被小腸吸收消化的淀粉，抗性淀粉包括不能被身體吸收的淀粉(RS1型)，抗性原淀粉顆粒(RS2型)，回生淀粉(retrograded starch，RS3)，化學(xué)變性淀粉(RS4)。本發(fā)明中改變淀粉的組成特別是提高直鏈淀粉的含量，會(huì)引起食物中抗性淀粉的增加。增加的抗性淀粉可能是RS1型的，基本上不會(huì)被消化。經(jīng)V-complex結(jié)晶度測(cè)量的淀粉-脂肪的結(jié)合度，也對(duì)抗性淀粉含量升高產(chǎn)生影響。
可以理解，本發(fā)明的一個(gè)好處就是其能產(chǎn)生具有特定營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的食品，并且，不需要對(duì)水稻谷粒的淀粉或其他的成分作收割后的改性。但是，有時(shí)可能期望對(duì)谷粒的淀粉或其他的成分進(jìn)行改性，本發(fā)明就包含這種改性要素。改性方法是公知的，包括用傳統(tǒng)的方法提取淀粉或其他成分，以及改良淀粉以增加抗性形式的淀粉。可使用熱/濕度、物理加工(如碾磨)、酶促(如用α-直鏈淀粉或β-直鏈淀粉酶，普魯蘭酶等)、化學(xué)水解(采用液態(tài)或氣態(tài)試劑進(jìn)行濕式或干式水解)、氧化、雙官能劑交聯(lián)(如三偏磷酸鈉、三氯氧磷等)、羧甲基化等處理方法來(lái)對(duì)淀粉進(jìn)行改性。
糖解指數(shù)醣解指數(shù)(GI)涉及含淀粉食物的消化率，是用來(lái)比較試驗(yàn)食物與白面包或葡萄糖所帶來(lái)的血液中葡萄糖濃度效果的。醣解指數(shù)根據(jù)膳食后血糖濃度，以及要維持血液中葡萄糖的動(dòng)態(tài)平衡所需要胰島素量來(lái)衡量該食物可能存在的效用。本發(fā)明涉及的食物，一個(gè)重要的特性就是降低了醣解指數(shù)。志愿者攝取高直鏈淀粉水稻30分鐘后，血糖水平比攝食等同低直鏈淀粉水稻的要低(Goddard et al.，1984)。更進(jìn)一步地，該食物最終消化水平低，是相對(duì)低能量的食物。低能量產(chǎn)品包括含有面粉的糙米顆粒。這些產(chǎn)物有利于補(bǔ)充、增強(qiáng)腸胃的健康，有利于減少膳食后血糖濃度和油脂濃度，同時(shí)也能提供低熱量的食品。
非食用的應(yīng)用本發(fā)明提供一種改造過(guò)的或改良的淀粉，其具有提高了的直鏈淀粉含量或降低了的支鏈淀粉含量，這些特性滿足工業(yè)上的很多要求。淀粉廣泛用于非食用工業(yè)，包括薄膜、紙張、紡織品、瓦楞紙、粘合劑產(chǎn)業(yè)(Young 1984)，如用作漿料。水稻淀粉可以當(dāng)作生產(chǎn)葡萄糖漿產(chǎn)品或乙醇產(chǎn)品的原料。未經(jīng)改性的淀粉，其物理特性限制了其在某些方面的使用，經(jīng)常需要對(duì)其進(jìn)行化學(xué)改造，這種化學(xué)改造通常成本很高或者有其他方面的缺陷。本發(fā)明提供的淀粉，收割后不需要對(duì)其做太多的改造，其支鏈淀粉含量已經(jīng)被減少，還附帶著其他物理特性。如，糊化溫度、抗剪應(yīng)力(shearing stresses)、成膜強(qiáng)度和/或淀粉的抗水性，由本發(fā)明的谷粒制造的產(chǎn)品的性能也可以被改變。本發(fā)明所涉及的淀粉還可以用來(lái)加工可生物降解的寬松包裝材料，可以作為聚苯乙烯或者其他包裝材料的替代品。
本上面已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的多個(gè)方面進(jìn)行了說(shuō)明，可以理解地，本發(fā)明也可以包含于上述兩個(gè)或多個(gè)方面的組合。
實(shí)施例實(shí)施例1材料與方法材料與溶液宏量元素(macro-elements)N6(20×原液)
(NH4)2SO49.3KNO356.6KH2PO48MgSO4.7H2O 3.7CaCl2.2H2O 3.3宏量元素MS(20×原液)g/lNH4NO333.0KNO338.0KH2PO43.4MgSO4.7H2O 7.4CaCl2.2H2O 8.8微量元素N6(1000×原液)mg/100mlMnSO4.4H2O 440ZnSO4.7H2O 150H3BO3160KI80微量元素MS(1000×原液)mg/lMnSO4.4H2O 22300Na2MoO4.2H2O 250H3BO36220ZnSO4.7H2O 8600CuSO4.5H2O 25
CoCl2.6H2O 25KI 830微量元素B5(100×原液)mg/lMnSO4.4H2O 1000Na2MoO4.2H2O 25H3BO3300ZnSO4.7H2O 200CuSO4.5H2O 3.87CoCl2.6H2O 2.5KI 75維生素N6(100×原液)mg/100ml甘氨酸(Glycine)20鹽酸硫胺(Thiamine-HCl) 10鹽酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 5煙酸(Nicotinic acid) 5維生素MS(100×原液)mg/100ml肌醇(myo-Inositol) 1000鹽酸硫胺(Thiamine-HCl) 1鹽酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 5煙酸(Nicotinic acid) 5維生素B5(100×原液)
mg/100ml甘氨酸(Glycine) 1000鹽酸硫胺(Thiamine-HCl) 100鹽酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 10煙酸(Nicotinic acid)10鐵MS(MS iron)(200×原液)ml/500mlFeCl3(60％w/v) 2.7乙二胺四乙酸二鈉MS(MS Na2.EDTA)(200×原液)g/500ml乙二胺四乙酸二鈉(Na2.EDTA) 3.7制備2，4二氯苯氧乙酸(2，4-D)(1mg/ml，Sigma No.D-6679)原液將100mg的2，4-D溶解在1ml無(wú)水乙醇中，并在其中加入3ml 1N的KOH，再用1N的HCL將pH調(diào)為6。
制備6-芐氨基嘌呤(6-benzyl amino purine，BAP)(1mg/ml BAP，Sigma No.B-3408)溶液和萘乙酸(naphthalene acetic acid，NAA)(1mg/ml NAA，SigmaNo.N-0640)溶液。
制備脫落酸(Abscisic acid，ABA)將250mg ABA溶解在2ml的1M NaOH中，用無(wú)菌注射用水(sterile water)將其稀釋到100ml。
制備特美汀(Timentin)(150mg/ml，Smith-Kline Beecham 6571-30)將3.1g特美汀溶解在20.66ml的無(wú)菌注射用水中。
從羅氏(Roche)公司(No.843 555)或者Sigma的其他試劑中提取潮霉素(50mg/ml)。
愈傷組織誘導(dǎo)溶液N6D(N6D media for callus induction)
(總量/升)amount/litre宏量N6(N6macro)(20×) 50ml微量N6(N6micro)(1000×)1ml維生素N6(N6vitamins)(100×)10ml鐵MS(MS iron)(200×) s5ml乙二胺四乙酸二鈉MS(MS Na2.EDTA)(200×) 5ml肌醇(Myoinositol) 100mg酸水解酪素(Casamino acid) 300mg脯氨酸(proline)2.9g2，4-D(1mg/ml) 2ml蔗糖(Sucrose) 30g用1M的KOH將pH調(diào)至5.8，每升溶液添加3g有機(jī)抗敏(phytogel)，混合后高壓滅菌。
接種溶液(media for subculturing)NB總量/升(amount/liter)宏量元素N6(20×) 50ml微量元素B5(100×) 10ml維生素B5(100×)10ml鐵MS(200×)5ml乙二胺四乙酸二鈉MS(200×) 5ml2，4-D(1mg/ml) 2ml蔗糖(Sucrose) 30g脯氨酸(proline)500mg谷酰胺(Glutamine) 500mg酶水解酪素(Casein enzymatic hydrolysate，CEH)300mg用1M的KOH將pH調(diào)至5.8-5.85，每升溶液添加3g有機(jī)抗敏(phytogel)，混合后高壓滅菌。
接種溶液MS總量/升(amount/liter)宏量元素MS(20×) 25ml微量元素MS(1000×) 1ml維生素MS(100×)10ml鐵MS(200×)5ml乙二胺四乙酸二鈉MS(200×) 5ml蔗糖 10g用1M的KOH將其pH調(diào)至58-5.85，每升溶液添加2.5g有機(jī)抗敏(phytogel)，混合后高壓滅菌。
NBONB溶液在調(diào)節(jié)pH值之前，加入30g/l的甘露醇(mannitol)和30g/l的山梨糖醇(sorbitol)。
NBHT30NB溶液在高壓滅菌之后且傾倒之前，加入30g/l的潮霉素(hygromycin)和150g/l的特美汀(Timentin)。
NBHT50NB溶液在高壓滅菌之后且傾倒之前，加入50g/l的潮霉素(hygromycin)和150g/l的特美汀(Timentin)。
PRHT50NB溶液(不含2，4-D)在高壓滅菌后加入以下物質(zhì)，使其最終成分如下BAP(2mg/l)，NAA(1mg/l)，ABA(5mg/l)，潮霉素(50mg/l)和特美汀(150mg/l)。
MST溶液MS溶液在高壓滅菌后，添加NAA和特美汀，使該媒介MS的NAA和特美汀分別為0.05mg/l和150mg/l。
水稻改造將成熟谷粒脫殼，在70％的乙醇中浸泡1分鐘，然后用消毒水清洗3次，接著在50％的漂白劑中浸泡30分鐘。在無(wú)菌條件下將滅菌后的谷粒用消毒水徹底清洗，接著在N6D溶液中培養(yǎng)。培養(yǎng)板用微孔膜密封，在光照下孵化6-8周，孵化溫度為26-28℃，以產(chǎn)生愈傷組織(callus)。不用對(duì)谷粒的晶胚作任何解剖，從晶胚的角質(zhì)鱗片(scutellum)即可推測(cè)愈傷組織的生成。需要接種時(shí)，將愈傷組織(calli)轉(zhuǎn)移得到NB溶液中，用封口膜密封培養(yǎng)板，置于鋁箔覆蓋的暗箱中，溫度28℃。每4周實(shí)施一次接種。在將愈傷組織用于改造前，接種次數(shù)不多于5次。
對(duì)于土壤桿菌屬為媒介的改造，將含有要被轉(zhuǎn)移的基因結(jié)構(gòu)的土壤桿菌族在28℃下、在具有適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)板上生長(zhǎng)。生長(zhǎng)兩天后，從培養(yǎng)板上刮下土壤桿菌族細(xì)胞，將其重新懸浮在含100um乙酰丁香酮液體的NB溶液中。10分鐘后，看起來(lái)健康的愈傷組織會(huì)浸入在懸浮液中。將健康的愈傷組織排出，將其置于含有100um乙酰丁香酮的NBO培養(yǎng)板上，在25℃的陰暗處放置2天。這個(gè)階段稱為含有基因結(jié)構(gòu)的土壤桿菌族的“協(xié)同培養(yǎng)”。協(xié)同培養(yǎng)之后，用含150ml/l特美汀的消毒水沖洗愈傷組織，簡(jiǎn)單洗干后在含有150mg/l特美汀的NBHT30(其包括選擇性的潮霉素試劑)中培養(yǎng)。在26-28℃下，3-4周后，將生長(zhǎng)區(qū)的愈傷組織在相同的溶液中再培養(yǎng)10-24天。再培養(yǎng)表明愈傷組織中具有了抗潮霉素，即變性的愈傷組織。將這些愈傷組織轉(zhuǎn)移到含特美汀的NBHT50培養(yǎng)板上，再在26-28℃的陰暗處孵化14-21天。將看起來(lái)健康的愈傷組織轉(zhuǎn)移到PRHT50排樣板上，置于陰暗處8-12天。最后，在28℃的RHT50溶液中培養(yǎng)30天或更長(zhǎng)時(shí)間，即長(zhǎng)出新芽(shoot)。將具有根系的芽轉(zhuǎn)移到1/2MST溶液中，當(dāng)芽長(zhǎng)到一定程度后，再將其轉(zhuǎn)移到溫室的土壤中。該方法已在多種水稻品種上試驗(yàn)成功，包括秈稻(indica)和粳稻(japonica)。
實(shí)施例2基因減量調(diào)節(jié)的構(gòu)造準(zhǔn)備用PCR放大水稻的SBEI、SBEIIa和SBEIIb基因片斷，以用于水稻基因表達(dá)的減量調(diào)節(jié)的基因構(gòu)造準(zhǔn)備。所述基因片斷從靠近基因3’末端的外顯子區(qū)選取，因?yàn)樵搮^(qū)域具有更多的分支，該區(qū)域被認(rèn)為是能通過(guò)變性水稻的構(gòu)造來(lái)降低可能的基因交叉沉默。被放大的片斷是基因庫(kù)序列為D11082的SBEI-核苷的1982-2527片斷；；基因庫(kù)序列為AB023498的SBEIIa-核苷的2458-2997片斷；基因庫(kù)序列為D16201的SBEIIb-核苷的2414至2912片斷(其序列分別在圖1-3中示出)。放大后的片斷被克隆到質(zhì)體載體pGEM-T中所述放大后的片斷包括附加的序列，其末端包括核酸內(nèi)切酶限制點(diǎn)(restrictionendonuclease sites)以利于該克隆步驟。同時(shí)通過(guò)放大水稻SBEI內(nèi)含子9的序列而獲取內(nèi)含子的序列。該片斷包括基因庫(kù)序列為D10838的遺傳序列的核苷9112-9606片斷序列，然后在SpeI和EcoRI限制點(diǎn)側(cè)接，再將片斷插入到pBCSK-(stratagene公司)以形成pRint9_BC(圖4)。接著，在pRint9_BC中，以反義和正義方向分別在SpeI/XbaI和XhoI/EcoRI點(diǎn)克隆SBEI、SBEII和SBEIIb基因的外顯子片斷。這就得到了每個(gè)序列的反向重復(fù)，且各自被內(nèi)含子序列所分隔。所得到的質(zhì)體被稱為pRBEI.IR、pRBEIIa.IR和pRBEIIb.IR(圖5)。采用BamHI和KpnI可切掉嵌合片斷(chimeric fragments)，將所切掉的嵌合片斷插入到pBx17casNOT的相同位置(圖6)。這樣，Bx17啟動(dòng)子區(qū)和nos3’末端區(qū)的以正確的方向(correct orientation)連接了反義/內(nèi)含子/正義嵌合片斷。接著使用HindIII和NotI消化切掉每個(gè)表達(dá)盒(expression cassette)，將被切掉的表達(dá)盒插入到二元載體WBvec8(Wang et al.，Acta Hort 461401-407，1998)，該二元載體WBvec8包含作物可表達(dá)的潮霉素基因和奇霉素基因，其中，潮霉素用于選擇作物細(xì)胞，記霉素用于選擇細(xì)菌。這些結(jié)構(gòu)稱為dsSBEI、dsSBEIIa、dsSBEIIb。接著，通過(guò)電穿孔法(electroporation)將這些結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌族(Agrobacterium tumefaciens)(AGL1)細(xì)胞之中(Lazo etal.，(1991))。
采用小麥中對(duì)應(yīng)的SBEIIa基因，另一種雙RNA(dsRNA)構(gòu)造導(dǎo)致降低水稻中SBEIIa基因也可能是SBEIIb基因的表達(dá)。對(duì)于上面的其他構(gòu)造，在正義和反義方向?qū)?yīng)于部分SBEIIa基因的所期望的核酸序列與啟動(dòng)子有關(guān)，這樣被表達(dá)的RNA中包含能堿基配對(duì)形成雙鏈RNA的互補(bǔ)區(qū)。當(dāng)在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)轉(zhuǎn)錄部分RNA時(shí)，在正義和反義序列之間的隔離區(qū)域包含的基因內(nèi)區(qū)序列就會(huì)被剪除而形成緊密的“發(fā)夾式的”雙重結(jié)構(gòu)?；騼?nèi)區(qū)的內(nèi)含物被發(fā)現(xiàn)由于雙RNA結(jié)構(gòu)的關(guān)系而能增加基因沉默(gene silencing)的效率(Smithet al，2000)。所期望的核酸與高分子量的麥谷蛋白(HMWG)啟動(dòng)子序列(Dx5亞基因啟動(dòng)子，編號(hào)Accession No.X12928，Anderson et al.，1989)和來(lái)自農(nóng)桿菌(Agrobacterium，nos3′)胭脂氨酸合酶基因的終止序列相連接。這就造成了雙鏈RNA胚乳的特定表現(xiàn)。
SBEIIa雙鏈RNA結(jié)構(gòu)包含來(lái)自小麥SBEIIa基因被PCR放大了的1536bp核苷酸序列(基因庫(kù)序列AF338431)。其中包括含有整個(gè)外顯子1和2以及部分外顯子3，在兩旁具有EcoRI和KpnI限制位的468bp序列(片斷1)；由部分外顯子3和4以及SBEIIa的整個(gè)基因內(nèi)區(qū)3組成的兩旁具有KpnI和SacI位的512bp片斷(片斷2)；以及由SBEIIa的整個(gè)外顯子1、2和3組成的在兩旁具有BamHI和SacI位SBEIIa的528bp片斷(片斷3)。所使用的序列與水稻SBEIIa基因(SBE4)有超過(guò)217個(gè)核苷具有80％的同一性，在更短的區(qū)域上有更高的同源性(50個(gè)核苷為87％；27個(gè)核苷為92％)，因此可以預(yù)測(cè)到，這些基因在水稻中的表達(dá)將顯著降低水稻SBEIIa的表達(dá)。小麥序列與水稻分子酶-3有超過(guò)113個(gè)核苷上有76％的同一性，因此，認(rèn)為等同的SBEIIa也會(huì)影響該轉(zhuǎn)錄水平。
接著，將片斷1、2和3捆綁在一起，其中片斷3和片斷2相對(duì)于片斷1的反義方向捆綁。雙鏈RNA結(jié)構(gòu)最初產(chǎn)生于包含有HMWG啟動(dòng)子序列和nos3’終止子的載體pBx17casNOT(圖6)。載體中pBx17casNOT的基因結(jié)構(gòu)稱為pBx17ds-wSBEIIa，而雙鏈RNA結(jié)構(gòu)稱為ds-wSBEIIa。包含ds-wSBEIIa基因的cassette被插入到pWBvec8中，然后被引入到農(nóng)桿菌(Agrobacterium)屬AGLL1中，并用于如實(shí)施例1所述的水稻改造。
實(shí)施例3生產(chǎn)具有降低了SBE活性的水稻根據(jù)實(shí)施例1所述的方法，AGL1細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)dsSBEI、dsSBEIIa、dsSBEIIb和ds-sWBEIIa用于產(chǎn)生改性水稻作物(粳稻亞種，cv.Nipponbare)。每個(gè)結(jié)構(gòu)、選擇的改性愈傷組織以及再生的水稻植株會(huì)用到500個(gè)水稻愈傷組織。植株被轉(zhuǎn)移到土壤中后，使用對(duì)SBEI、SBEIIa或SBEIIb基因片斷特效的引物或探針，用PCR或DNA印跡交分析法顯示該植株的改性。在具有ds-wSBEIIa的變性中，每23個(gè)再生的植株中有21個(gè)對(duì)引入的SBEIIa序列呈陽(yáng)性。
在丙烯酰胺凝膠體中進(jìn)行胚乳蛋白質(zhì)的電泳后，用蛋白質(zhì)印跡分析法采用與相應(yīng)蛋白質(zhì)的特定抗體化驗(yàn)改性植株的谷粒(T1種子)的SBE蛋白質(zhì)。改性品種中，大部分品種SBE活性已降低。對(duì)谷粒的淀粉中直鏈淀粉含量進(jìn)行測(cè)定，一些SBEIIa改性品種的相對(duì)直鏈淀粉水平是至少40％，一部分是至少50％。當(dāng)SBEIIa和SBEIIb的活性都減少時(shí)，直鏈淀粉的百分比更高。
實(shí)施例4淀粉和蛋白質(zhì)分析碳水化合物測(cè)定和分析使用Takeda et al.，(1986)、Lumdubwong et al.，(2000)、Chiou et al(2002)或Sculman et al.，(1991)的方法從生長(zhǎng)期的胚乳或成熟的谷粒中分離淀粉。用Megazyme(Bray，Co Wicklow，Republic of Ireland)提供的總淀粉分析工具測(cè)定淀粉含量。接著，將該淀粉含量與控制作物的淀粉含量作比較。谷?？傊販p去淀粉總重，得到谷粒中非淀粉部分的總重，以確定所減少的總重是否是由于淀粉成分的減少。
淀粉中直鏈淀粉成分的確定是采用如下經(jīng)稍微修訂的Morrison andLaignelet(1983)比色(碘滴定)法。準(zhǔn)確稱取大約2毫克(精準(zhǔn)至0.1毫克)淀粉加入帶橡膠墊圈蓋子的2毫升螺帽試管中；為去除油脂，在淀粉中加入1毫升85％(v/v)的甲醇并將試管放入65℃水浴中加熱1小時(shí)，偶爾攪動(dòng)水體；在13,000g下離心過(guò)濾5分鐘之后小心除去表面浮物，再重復(fù)進(jìn)行萃取步驟。將淀粉在65℃下干燥1小時(shí)再溶入尿素-二甲基亞砜溶液中(UDMSO；9份二甲基亞砜與1份6M的尿素)，每2毫克淀粉(上面稱取的)加1毫升UDMSO；將混合物立即充分?jǐn)噭?dòng)并置于95℃水浴中加熱1小時(shí)，間歇攪動(dòng)水體直至淀粉完全溶解。取部分淀粉-UDMSO溶液(50微升)用20微升碘-碘化鉀(I2-KI)試劑處理，碘-碘化鉀試劑是由將2毫克碘與20毫克碘化鉀溶解在1毫升水中制得的；將混合物加水至1毫升，取200微升，采用Emax精密酶標(biāo)測(cè)定儀(美國(guó)分子儀器公司，Molecular Devices，USA)在650nm光波下測(cè)定混合物的吸光率。含有0～100％直鏈淀粉和100～0％支鏈淀粉的標(biāo)準(zhǔn)樣品是將馬鈴薯直鏈淀粉和玉米(或馬鈴薯)支鏈淀粉(Sigma)進(jìn)行處理而制成測(cè)試樣品的。直鏈淀粉含量(直鏈淀粉百分率)是通過(guò)測(cè)定吸光率值再通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)樣品的回歸方程式計(jì)算而得。不脫麩淀粉中直鏈淀粉/支鏈淀粉的比率同樣可按照Case et al.，(1998)提供的方法或Batey and Curtin(1996)提供的分離脫麩淀粉的HPLC法測(cè)定。
淀粉的鏈長(zhǎng)分布可在將淀粉樣品脫麩之后，通過(guò)Morell et al(1998)的熒光輔助碳水化合物電泳方法(FACE)的毛細(xì)電泳儀來(lái)測(cè)定。淀粉的凝膠溫度曲線圖可通過(guò)Pyris 1微分掃描熱量計(jì)來(lái)測(cè)定(Perkin Elmer，Norwalk CT，USA)。淀粉溶液的粘度可通過(guò)快速粘度測(cè)定儀來(lái)測(cè)量(RVA，NewportScientific Pty Ltd，Waniewood，Sydney)，例如采用Batey et al.，1997所報(bào)道的條件，測(cè)量的參數(shù)包括峰值粘度(最高熱粘度)、上止強(qiáng)力、終值粘度以及糊化溫度。面粉或淀粉的溶脹比可通過(guò)Konik-Rose et al(2001)方法來(lái)確定。吸水力的確定是通過(guò)稱量樣品面粉或淀粉在一定溫度下混入水之前后的重量變化以及所聚集的膠狀物來(lái)完成的。
β-葡萄糖水平可采用Megazyme(Bray，Co Wicklow，Republic of Ireland)所提供的組件來(lái)確定。
胚乳中蛋白質(zhì)表現(xiàn)的分析胚乳中特定蛋白質(zhì)表現(xiàn)的分析是采用蛋白質(zhì)印跡程序(Western blotprocedures)。從母體組織中切下胚乳并將0.2毫克的樣品在600微升的50mM的Kpi緩沖液中均勻成粒(42mM的K2HPO4和8mM的KH2PO4)，該緩沖溶液的pH值為7.5，含有5mM的EDTA，20％的丙三醇、5mM的DTT以及1mM的蛋白酵素抑制劑。研磨樣品在13,000g下離心分離10分鐘并將表面漂浮物在使用前于-80℃下冷凍。對(duì)于總蛋白質(zhì)的估算，用0，20，40，60，80及100微升的0.25毫克每毫升的牛血清清蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)建立牛血清清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，取3微升樣品用蒸餾水稀釋至100微升并向每一樣品中加入1毫升蛋白質(zhì)試劑(Coomassie Plus Protein reagent)，5分鐘后在595nm處錄得吸光率。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上把含0微升BSA的樣品，即不含BSA的樣品的吸光率設(shè)為空白值，這樣就測(cè)量出了樣品的蛋白質(zhì)水平。在含有20微克取自胚乳的蛋白總量的樣品中加入8％的含有0.34M的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl，pH 8.8)的非改性聚丙烯酰胺膠體、丙稀酰胺(8.0％)、過(guò)二硫酸銨(ammonium persulphate)(0.06％)以及TEMED(0.1％)。在電泳作用下，蛋白質(zhì)以Morell et al.，(1997)所述的方式被轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上并與SBEIIa或SBEIIb種類抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。
實(shí)施例5通過(guò)鑒定水稻基因組的獨(dú)特序列來(lái)優(yōu)化目標(biāo)基因的基因沉默將基因序列用于減少目標(biāo)基因的表達(dá)(基因沉默)，如通過(guò)雙鏈RNA、反義或共抑制結(jié)構(gòu)等方法，是優(yōu)選的對(duì)目標(biāo)基因有特效的方法。就是說(shuō)，沉默分子的核苷序列中，至少有19個(gè)連續(xù)的核苷與目標(biāo)基因的至少19個(gè)連續(xù)的核苷具有至少95左右的同一性。理想地，最大的特異性是所述沉默分子(targeted sequence)對(duì)目標(biāo)序列是唯一的，不是植株基因組的遺傳基因。這樣就能最小化“基因偏移效應(yīng)”(off-gene effects)。我們使用了幾乎所有的水稻基因組序列的知識(shí)來(lái)比較SBE目標(biāo)基因序列與水稻基因組剩下的基因序列，以在這些目標(biāo)基因序列中鑒定出最優(yōu)的目標(biāo)序列。
可從TIGR網(wǎng)站(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/)以FASTA格式下載水稻基因組DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)(OSA1.seq)。用“formatdb”格式化數(shù)據(jù)庫(kù)，使之對(duì)BLAST可用；使用“dbifasta”使之可用EMBOSS函數(shù)。以FASTSA格式創(chuàng)建查詢序列，通過(guò)運(yùn)行基于基因沉默程序的BLAST(P.Waterhouse et al，CSIROPlant Industry，personal communication)以及一組預(yù)設(shè)的參數(shù)(比較的選項(xiàng)詞18和嚴(yán)格度19)來(lái)使用該查詢序列搜索水稻基因組的同源序列。
如實(shí)施例2所述，用于基因沉默結(jié)構(gòu)的SBEIIa、SBEIIb和SBEI序列用作反水稻基因組的查詢序列。其輸出如圖8所示。輸出多個(gè)“NNNN...”表示該區(qū)域內(nèi)與水稻基因組至少19個(gè)連續(xù)核苷同源。可以看到，所使用的SBEIIa序列是唯一的；所使用的SBEIIb序列包括一些非唯一序列；而所使用的SBEI序列看起來(lái)像是在水稻基因組中復(fù)制的，處理末端57個(gè)核苷之外，該57個(gè)核苷被去掉了(圖8)。對(duì)當(dāng)前的水稻基因序列檢查發(fā)現(xiàn)在包括SBEI基因區(qū)的兩個(gè)重疊BAC克隆體之間，有重疊的遺傳DNA序列。，這些貌似的SBEI序列的復(fù)制可能是真實(shí)的或表征在這一區(qū)域的水稻基因組的聚集中發(fā)生的錯(cuò)誤。
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序列表<110>聯(lián)邦科技產(chǎn)業(yè)研究組織<120>淀粉中具有增加了直鏈淀粉含量的水稻及水稻制品<160>3<210>1<211>2739<212>DNA<213>水稻亞種Oryza sativa<223>sbeI cDNA<400>1Gccaccgaca tccgccgcaa tgctgtgtct cacctcctct tcctcctccg cgcccgctcc 60gctccttccc tctctcgctg atcgaccgag cccgggaatc gcgggcgggg gtggcaatgt 120tcgcctgagc gtggtttctt cgccgcgccg gtcgtggcct ggaaaggtca agaccaattt 180ctcagttcct gcgactgcgc gaaaaaacaa aaccatggtg actgttgtgg aggaggtcga 240ccaccttcct atatatgatc tggaccctaa gttggaggaa ttcaaggatc acttcaacta 300taggataaaa agatacctcg accagaaatg cctgattgaa aaacatgagg ggggccttga 360agaattttct aaaggctatt tgaagtttgg gattaataca gttgatggtg ccacaatata 420tcgtgaatgg gcgcctgctg cacaagaagc acagctcatt ggtgagttca ataactggaa 480tggtgcaaaa cacaagatgg agaaggataa atttggcatt tggtcaatca agatttcaca 540tgtcaatggg aagcctgcca tccctcacaa ttccaaggtt aaatttcgct ttaggcatgg 600gggtggagca tgggttgatc gtattcccgc atggattcgt tatgcaactt ttgatgcctc 660taaatttgga gctccatatg atggtgtaca ctgggatcct ccagcctgtg aaaggtacgt 720gtttaagcat cctcgacctc caaaacctga tgctccacgc atctatgagg ctcatgtggg 780gatgagtggt gaagagccag aagtaagcac atacagagaa tttgcagaca atgtgttacc 840acgcatacgg gcaaataact acaacacagt tcagttaatg gcaatcatgg aacattccta 900ctatgcttct tttgggtatc acgtgacaaa ttttttcgca gtcagcagca gatcaggaac 960accagaggat ctgaaatatc ttgttgacaa ggcacatagt ttaggattac gagttctgat1020ggatgttgtc catagccatg cgagtaataa tgtgaccgat ggtctaaatg gctatgacgt1080tggacaaaac actcatgagt cttattttca tacaggagat aggggctacc ataaactctg1140ggatagtcgt ctgttcaact atgccaattg ggaggtctta agatttcttc tttctaattt1200gagatattgg atggacgaat tcatgtttga tggcttccga tttgatgggg ttacatcaat1260gctataccat caccatggta tcaataaggg atttactgga aactacaagg agtatttcag1320tttggatacc gatgtggatg caattgttta catgatgctc gcaaaccatt taatgcataa1380actcttgccg gaagcaacta ttgttgctga agatgtttcg ggcatgccag tgctttgtcg1440gccagttgat gaaggtggag tagggtttga cttccgcctg gcaatggcca ttcctgatag1500atggattgac tacctgaaga acaaagagga ccgcaaatgg tcaatgagtg aaatagtgca1560aactttgact aacaggagat atacagaaaa atgcattgcc tatgccgaga gccatgatca1620gtccattgtt ggtgacaaga ctatagcatt tctcttgatg gacaaggaaa tgtacactgg1680catgtcagac ttgcagcctg cttcacctac catcaaccgt ggcattgcac tccaaaagat1740gattcacttc attacgatgg cccttggagg tgatggctac ttaaatttta tgggcaatga1800gtttggccat ccagaatgga ttgactttcc aagagaaggc aacaactgga gctatgataa1860atgcagacgt cagtggagcc ttgtcgacac tgatcacctt cgatacaagt atatgaatgc1920atttgatcaa gcaatgaatg cactcgagga ggaattttcc ttcctgtcat catcaaagca1980gattgttagc gacatgaacg agaaagataa ggttattgtc tttgaacgtg gagatttggt2040ttttgttttc aattttcatc ccaacaaaac ttacaagggt tacaaagtcg gatgtgactt2100gcccgggaag tacagagtag ctctggactc tgatgctttg gtctttggtg gccatggaag2160agttggccat gatgtggatc acttcacgtc tcccgaggga atgccaggag taccagaaac2220aaatttcaac aaccgcccta actcattcaa agtcctttcc ccgccccgta cctgtgtggc2280ttactatcgc gttgatgaag atcgtgaaga gctcaggagg ggtggagcag ttgcttctgg2340aaagattgtt acagagtata tcgatgttga agcaacaagt ggggagacta tctctggtgg2400ctggaagggc tccgagaagg acgattgtgg caagaaaggg atgaagtttg tgtttcggtc2460ttctgacgaa gactgcaaat gaagcatcag atttcttgat caggagcaac tgttggtgcc2520cttgtaatct ggagatcctg gcttgccttg gacttggttg tggttcttta gcagttgcta2580tgtacctatc tatgatatga actttatgta tagttcgcct taaagaaaga ataagcagtg2640atgatgtggc cttaaacctg agctgcacaa gcctaatgta aaaataaagt ttcaggcttt2700catccagaat aaaacagctg ttcatttacc atctcaaaa 2739<210>2<211>3015<212>DNA<213>水稻亞種Oryza sativa<223>sbeIIa cDNA<400>2cttgactccc cccactcctc cctcgtgctg ctcctcctcg tcgctcggct cgaggcgcgg 60catttgcggc gggagggatc tgcgcgcgag tgcgtgcggg caggcggcgg gggagcacgc 120accgggggat ggcgtcgttc gcggtgtccg gcgcgaggct cggggtcgtg cgggcggggg 180gcggcggcgg cggcgggggt ggcccggcgg cgcgatccgg cggggtggac ttgccgtcgg 240tgctcttcag gaggaaggac tccttctcac gtggcgttgt gagctgcgcg ggtgctcctg 300ggaaggtgct ggtgcctggc ggtgggagcg acgacttgct gtcctctgcg gaaccagacg 360tggaaactca agagcaacct gaagaatctc agatacctga tgataataaa gtaaaacctt 420ttgaggagga ggaagagatt ccagcagtgg cagaagcaag cataaaggtt gtggctgaag 480acaaacttga atcttcagaa gtgattcaag acattgagga aaatgtgact gagggtgtga 540tcaaagatgc tgatgaacca actgtggagg ataaaccacg agttatccca ccaccaggag 600atgggcagaa gatataccaa attgacccaa tgctggaagg atttcggaac catcttgact 660accgatacag tgaatacaag agaatgcgtg cagctattga ccaacatgaa ggtggcttgg 720
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權(quán)利要求
1.一種從水稻作物中獲得的谷粒，其中包含淀粉，其特征在于，所述谷粒的淀粉中直鏈淀粉的比例是至少40％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒包括兩種或多種遺傳變種，其中一種遺傳變種是選自a)具有抑制SBEIIa表達(dá)和/或活性的SBEIIa基因突變，和b)被引入了具有抑制SBEIIa表達(dá)和/或活性的的核酸；第二種遺傳變種是選自c)具有抑制SBEIIb表達(dá)和/或活性的SBEIIb基因突變，和d)被引入了具有抑制SBEIIb表達(dá)和/或活性的核酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒包含降低了水平的SBEIIa和SBEIIb蛋白質(zhì)和/或活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒的淀粉中直鏈淀粉的比例是至少50％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒中包含轉(zhuǎn)基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的谷粒，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因?qū)Ψ戳x、共抑制、核酶或雙RNA分子進(jìn)行編碼。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒是非轉(zhuǎn)基因的。
8.根據(jù)權(quán)利要求2至7任意一項(xiàng)所述的谷粒，其特征在于，還包括降低了水平的SBEI蛋白質(zhì)和/或活性。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任意一項(xiàng)所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒包含改變了水平和/或酶活性的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、SSI、SSII、SSIII、異淀粉脫麩酶和普魯蘭脫麩酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒包含改變了水平的GBSS蛋白質(zhì)和/或酶活性。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10任意一項(xiàng)所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒是不縮水的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11任意一項(xiàng)所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒是平均粒重是至少25mg的糙米。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12任意一項(xiàng)所述的谷粒，其特征在于，在偏振光下觀察時(shí)，所述谷粒的淀粉顆粒中至少50％不顯出雙折射。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13任意一項(xiàng)所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒的淀粉含量至少是等同的、未經(jīng)改造的谷粒中淀粉含量的90％。
15.根據(jù)權(quán)利要求2至14任意一項(xiàng)所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒包含SBEIIa和SBEIIb的無(wú)效突變。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15任意一項(xiàng)所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒是秈稻或者其中包含Wxα等位基因。
17.一種能產(chǎn)出權(quán)利要求1至16任意一項(xiàng)所述谷粒的水稻作物。
18.一種從權(quán)利要求1至16任意一項(xiàng)所述谷粒中提取的淀粉顆粒。
19.一種從權(quán)利要求1至16任意一項(xiàng)所述谷粒中提取的淀粉。
20.一種含有從權(quán)利要求1至16任意一項(xiàng)所述谷粒中產(chǎn)出的面粉或淀粉制品的產(chǎn)品。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述面粉或淀粉與來(lái)自其他來(lái)源的面粉或淀粉相混合。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品其是非食品產(chǎn)品。
23.一種含有權(quán)利要求19所述的淀粉以及其他食品成分或水的組合物。
24.一種生產(chǎn)能夠產(chǎn)出谷粒的水稻作物的方法，所述谷粒淀粉中包含至少40％的直鏈淀粉，其特征在于，該方法包括以下步驟a)將基因變種引入到母體水稻作物或者種子里；和b)識(shí)別母體水稻作物的后代水稻作物或種子，所述后代作物或種子的淀粉中直鏈淀粉含量至少是40％。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述后代水稻作物包括2種或多種遺傳變種，其中一種遺傳變種是選自e)具有抑制SBEIIa表達(dá)和/或活性的SBEIIa基因突變，和f)被引入了具有抑制SBEIIa表達(dá)和/或活性的核酸；第二種基因變種是選自g)具有抑制SBEIIb表達(dá)和/或活性的SBEIIb基因突變，和h)被引入了具有抑制SBEIIb表達(dá)和/或活性的核酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的方法，其特征在于，所述遺傳變種導(dǎo)致水稻作物的胚乳中SBEIIa和SBEIIb蛋白質(zhì)和/或活性的降低。
27.根據(jù)權(quán)利要求24或27所述的方法，其特征在于，所述引入遺傳變種的步驟包括引入外來(lái)核酸。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，水稻細(xì)胞被引入所述外來(lái)核酸后再生成水稻植株。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述外來(lái)核酸對(duì)SBEIIa和/或SBEIIb的表達(dá)和/或活性的抑制子進(jìn)行編碼。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述抑制子可以是反義、共抑制、核酶或雙RNA分子。
31.根據(jù)權(quán)利要求24至25中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述引入遺傳變種的步驟包括采用化學(xué)試劑或輻射來(lái)形成水稻作物母體或種子的變異。
32.根據(jù)權(quán)利要求25至31中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述后代水稻植株中包含SBEIIa和/或SBEIIb的無(wú)效變異。
33.根據(jù)權(quán)利要求25至32中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述引入遺傳變種的步驟還導(dǎo)致SBEI蛋白質(zhì)和/或活性水平的降低。
34.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的方法，其特征在于，所述后代植株根據(jù)谷粒淀粉中直鏈淀粉水平來(lái)識(shí)別，或者根據(jù)后代植株的胚乳中SBEIIa和/或SBEIIb蛋白質(zhì)和/或活性的水平的降低來(lái)識(shí)別。
35.根據(jù)權(quán)利要求24至34中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將Wxα等位基因引入到水稻植株中。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述Wxα等位基因通過(guò)雜交而引入的。
37.一種產(chǎn)出其胚乳中具有降低了水平的SBEIIa蛋白質(zhì)和SBEII蛋白質(zhì)和/或酶活性的水稻植株的方法，其特征在于，包含以下步驟a)誘變具有降低水平的SBEIIa蛋白質(zhì)和/或酶活性的種子；或b)誘變具有降低水平的SBEIIb蛋白質(zhì)和/或酶活性的種子；或c)使用具有降低水平的SBEIIb蛋白質(zhì)和/或酶活性的種子與具有降低水平的SBEIIa蛋白和/或酶活性的種子進(jìn)行雜交；和d)識(shí)別出胚乳中含有降低的SBEIIa和SBEIIb蛋白質(zhì)活性和/或酶活性的水稻植株。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述識(shí)別水稻植株的步驟包括篩選出具有分子標(biāo)記的種子，所述的分子標(biāo)記分別鏈接到SBEIIa或SBEIIb基因；根據(jù)是否有來(lái)自篩選具有分子標(biāo)記鏈接的信號(hào)來(lái)識(shí)別所述植株。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述鑒定水稻植株的步驟包括從具有抗體的水稻植株中篩選種子，所述抗體結(jié)合水稻的SBEIIa或SBEIIb蛋白質(zhì)；然后根據(jù)是否存在抗體結(jié)合來(lái)識(shí)別所述植株。
40.一種產(chǎn)出改性后的水稻淀粉的方法，其特征在于，包括從權(quán)利要求1至16任意一項(xiàng)所述的谷粒中提取淀粉的步驟。
41.一種產(chǎn)生水稻植株的方法，所述水稻植株具有降低水平的SBEIIa和SBEIIb蛋白質(zhì)和/或活性，該方法使用兩種或多種外來(lái)核酸分子，其中，至少一種所述的外來(lái)核酸分子編碼水稻SBEIIa表達(dá)的抑制子和/或活性，且至少另外一種所述的外來(lái)核算分子編碼水稻SBEIIb表達(dá)的抑制子和/或活性。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述抑制子是選自反義分子、共抑制分子、核酶、雙RNA分子及其組合。
43.一種被分離的核酸分子，其對(duì)水稻SBEIIa的抑制子和水稻SBEIIb的抑制子進(jìn)行編碼，該兩種抑制子可以相同，也可以不同。
44.一種包括權(quán)利要求43所述的被分離的核酸分子的載體。
45.一種包括權(quán)利要求43所述的被分離的核酸分子的細(xì)胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的細(xì)胞是水稻細(xì)胞。
47.一種包括權(quán)利要求43所述的被分離的核酸分子的轉(zhuǎn)基因水稻作物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有降低了淀粉分支酶水平的水稻，其產(chǎn)出的谷粒的胚乳具有相對(duì)高的直鏈淀粉含量。本發(fā)明的水稻谷粒盡管支鏈淀粉合成路徑受損，但是是不縮水的顯形，其可以是轉(zhuǎn)基因的，也可以是非轉(zhuǎn)基因的。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1886507SQ200480031589
公開日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2004年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月27日
發(fā)明者中易·李, 馬太·肯尼迪·莫維爾, 薩德奎·拉曼 申請(qǐng)人:聯(lián)邦科技產(chǎn)業(yè)研究組織