專(zhuān)利名稱(chēng)：重組微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)或多肽的重組微生物，以及涉及該蛋白質(zhì)和多肽。
背景技術(shù)：
微生物廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)大量有用物質(zhì)，包括酒精飲料、例如味噌和醬油之類(lèi)的某些類(lèi)型的食品、氨基酸、有機(jī)酸、核酸相關(guān)物質(zhì)、抗生素、糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。這些物質(zhì)還發(fā)現(xiàn)具有多種用途，包括食品、醫(yī)藥品、洗滌劑、例如化妝品之類(lèi)的日用品和各種化工原料。
在利用微生物工業(yè)生產(chǎn)有用物質(zhì)時(shí)，生產(chǎn)率的提高是一個(gè)主要關(guān)注點(diǎn)，因此一種方法是通過(guò)誘變或其它基因手段進(jìn)行微生物育種。最近，特別是隨著微生物遺傳學(xué)和生物技術(shù)的進(jìn)步，通過(guò)基因重組技術(shù)進(jìn)行更有效的有用微生物育種，并與其相關(guān)地是正在開(kāi)發(fā)用于獲得重組基因的宿主微生物。例如，已經(jīng)進(jìn)一步改進(jìn)了枯草桿菌Marburg No.168，其作為宿主微生物已經(jīng)被證實(shí)是安全且具有優(yōu)異特性的。
然而，微生物本身?yè)碛懈鞣N基因使其能夠應(yīng)對(duì)自然界中的環(huán)境變化，因此，它們?cè)谥徊捎糜邢薜纳a(chǎn)媒介的工業(yè)生產(chǎn)中不一定表現(xiàn)出蛋白質(zhì)和類(lèi)似物質(zhì)的高生產(chǎn)效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種重組微生物，其通過(guò)將編碼異性蛋白質(zhì)或多肽的基因轉(zhuǎn)移到至少一種參與麥芽糖的膜滲透的基因(特別是glvR或glvC)或一個(gè)或多個(gè)與該基因功能相當(dāng)?shù)幕蛉笔Щ虮惶蕹奈⑸锏耐蛔冎晟隙苽洹?br>

圖1示意性地顯示了通過(guò)SOE-PCR(SOE重疊延伸拼接法)(參見(jiàn)Gene，77，61(1989))缺失基因以制備DNA片段的方法，和使用該DNA缺失目標(biāo)基因的方法(用抗藥性基因取代目標(biāo)基因)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明針對(duì)一種通過(guò)將編碼蛋白質(zhì)或多肽的基因轉(zhuǎn)移到能夠以提高的生產(chǎn)率生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽并且由本發(fā)明人鑒別的宿主微生物上而獲得的重組微生物，以及針對(duì)使用該重組微生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽的方法。
本發(fā)明人在微生物基因組上編碼的許多不同基因中對(duì)有用蛋白質(zhì)或多肽的生產(chǎn)中不需要或有害的基因進(jìn)行了廣泛的研究，并意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)參與用作培養(yǎng)基的主要碳源的麥芽糖的膜滲透的特異性基因或與該基因功能相當(dāng)?shù)幕驈奈⑸锏幕蚪M中缺失或剔除之后，編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽的基因轉(zhuǎn)移到微生物上，與缺失或剔除之前的情況相比，目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽的生產(chǎn)率提高。
使用本發(fā)明的重組微生物，可以以高效率大規(guī)模地生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽。
在本發(fā)明中，氨基酸序列之間的同源性和核酸序列之間的同源性都使用Lipman-Pearson法(Science，227，1435(1985))測(cè)定。具體而言，將ktup參數(shù)(相匹配的單元大小)設(shè)定為2，使用Genetyx-Win(Software Development Co.，Ltd.)的遺傳信息處理軟件開(kāi)發(fā)的同源性分析程序(Search Homology)進(jìn)行計(jì)算。
對(duì)構(gòu)成本發(fā)明的微生物的母體微生物沒(méi)有特別的限制，只要其含有參與麥芽糖膜滲透的基因。具體而言，可以使用如表1所示的任何枯草桿菌基因或與其功能相當(dāng)?shù)幕?。?dāng)使用含有麥芽糖或麥芽低聚糖作為主要碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，該微生物優(yōu)選為另一種具有不同麥芽糖滲透體系的上述基因不參與其中的類(lèi)型。基因可以是野生型或突變體。具體例子包括枯草桿菌和屬于芽孢桿菌屬的類(lèi)似微生物、屬于梭狀芽孢桿菌屬的微生物和酵母。其中，優(yōu)選屬于芽孢桿菌屬的微生物。特別是從已經(jīng)獲得該微生物的完全基因組信息、并由此確立了基因工程技術(shù)和基因組工程技術(shù)、并且該微生物具有細(xì)胞外分泌所得蛋白質(zhì)的能力的角度考慮，優(yōu)選枯草桿菌。
使用本發(fā)明的微生物生產(chǎn)的目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽的例子包括酶、生理活性物質(zhì)，和其它發(fā)現(xiàn)在食品、醫(yī)藥品、化妝品、洗滌劑、纖維處理劑、臨床化驗(yàn)劑等有用的蛋白質(zhì)和多肽。
在本發(fā)明中，要缺失或剔除的基因是那些參與麥芽糖的膜滲透的基因。這些基因是表1所示的任一枯草桿菌基因，或者選自與其功能相當(dāng)?shù)幕颉?br> 此處所含表中的各個(gè)基因的名稱(chēng)、數(shù)量和功能與Nature，390，249-256(1997)中報(bào)道并由JAFAN(Japan Functional Analysis Networkfor Bacillus subtilis；BSORF DB)在互聯(lián)網(wǎng)上公開(kāi)(http:∥bacillus.genome.ad.jp/，2003年6月17日更新)的枯草桿菌基因組數(shù)據(jù)相符。
表1

來(lái)源于其它微生物的基因，優(yōu)選來(lái)源于屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌的基因，其具有與表1所示的任一枯草桿菌相同的功能，或具有與表1所示任一基因的核苷酸序列70％或更高的同源性，優(yōu)選80％或更高的同源性，更優(yōu)選90％或更高，進(jìn)一步優(yōu)選95％或更高，仍然更優(yōu)選98％或更高的同源性的，應(yīng)該被認(rèn)為與表1所示的基因功能相當(dāng)，并因此構(gòu)成根據(jù)本發(fā)明要缺失或剔除的基因。
上述基因在其并入細(xì)胞的過(guò)程中參與麥芽糖的膜滲透；即，磷酸烯醇丙酮酸依賴(lài)的糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.，4，37，2002)。具體而言，這些基因包括包含在PTS中的編碼麥芽糖-特異性通透酶IICB的glvC基因；編碼用于含有g(shù)lvC基因的glv操縱子的正調(diào)節(jié)因子的glvR基因；以及與其功能相當(dāng)?shù)幕?。如果缺失或剔除任意上述基因，就可以想象得到?xì)胞的麥芽糖膜滲透性降低。然而，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在使用其中任意基因通過(guò)采用含有麥芽糖作為主要碳源的培養(yǎng)基的酶生產(chǎn)培養(yǎng)物以缺失或剔除的宿主微生物，與使用傳統(tǒng)宿主微生物相比，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)生產(chǎn)率的顯著提高。
順便提及，ptsH基因(BG10200)和ptsI基因(BG10201)也已知通過(guò)PTS參與了細(xì)胞中麥芽糖的攝取。因此，預(yù)測(cè)缺失或剔除ptsH和ptsI的任一種可以有效提高蛋白質(zhì)的生產(chǎn)率。因此，如果缺失或剔除表達(dá)包括上述兩種基因的pts操縱子所需的調(diào)節(jié)基因glcT基因(BG12593)，可以提高蛋白質(zhì)的生產(chǎn)率。
另一種實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法是通過(guò)將另一來(lái)源的DNA片段插入目標(biāo)基因或?qū)⑼蛔凅w引入該基因的轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯起始區(qū)域以使目標(biāo)基因失活或剔除。然而，優(yōu)選物理缺失目標(biāo)基因。要缺失或剔除的基因數(shù)是一個(gè)或更多，并可以缺失兩個(gè)或更多基因。當(dāng)構(gòu)筑本發(fā)明的微生物時(shí)，可以缺失或失活除了參與麥芽糖膜滲透的基因以外的一個(gè)或多個(gè)基因。在這種情況下，預(yù)計(jì)會(huì)有更改進(jìn)的效果。
在缺失或剔除基因的示例性的方法中，根據(jù)之前提出的方案缺失或剔除表1所示的任一目標(biāo)基因?；蛘?，進(jìn)行基因的隨機(jī)缺失或通過(guò)剔除進(jìn)行突變，然后對(duì)蛋白質(zhì)生產(chǎn)率進(jìn)行評(píng)測(cè)并進(jìn)行基因分析。
目標(biāo)基因可以通過(guò)同源重組而缺失或剔除。也就是，用合適的質(zhì)粒載體克隆含有部分目標(biāo)基因的DNA片段從而獲得環(huán)形重組質(zhì)粒，并將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到母體微生物的細(xì)胞中。此后，通過(guò)在目標(biāo)基因的部分區(qū)域中進(jìn)行同源重組，使母體微生物基因組上的目標(biāo)基因裂解，從而完成目標(biāo)基因的失活?；蛘?，通過(guò)堿基的取代或插入來(lái)使目標(biāo)基因突變(剔除)，或者通過(guò)PCR或類(lèi)似方法構(gòu)成含有目標(biāo)基因序列外的區(qū)域但不含目標(biāo)基因的線型DNA片段，并將由此制成的基因或片段轉(zhuǎn)移到母體微生物的細(xì)胞中。在母體微生物基因組的目標(biāo)基因中突變點(diǎn)外部的兩個(gè)位點(diǎn)上，或在目標(biāo)基因序列外的兩個(gè)區(qū)域上，發(fā)生雙交換同源重組，從而替換成基因組上的目標(biāo)基因缺失或剔除的基因片段。
特別是當(dāng)用于構(gòu)筑本發(fā)明的微生物的母體微生物是枯草桿菌時(shí)，由于一些文獻(xiàn)已經(jīng)描述了缺失或剔除目標(biāo)基因的方法(參見(jiàn)，例如，Mol.Gen.Genet.，223，268 1990)，可以根據(jù)這些方法的任何一種重復(fù)，從而生產(chǎn)本發(fā)明的宿主微生物。
基因隨機(jī)缺失或失活可以通過(guò)使用與上述通過(guò)使用隨機(jī)克隆的DNA片段誘發(fā)同源重組的方法類(lèi)似的方法，或通過(guò)用γ射線或類(lèi)似射線輻射母體微生物而進(jìn)行。
接下來(lái)將更詳細(xì)地描述通過(guò)使用為缺失目的而設(shè)計(jì)的DNA片段采用雙交換的缺失方法，該DNA片段是通過(guò)SOE-PCR制備的(Gene，77，61，1989)。然而，在本發(fā)明中，缺失基因的方法不僅僅限于下述方法。
用于缺失目的的DNA片段是如下構(gòu)成的片段抗藥標(biāo)記基因在ca.0.2至3kb上游序列的側(cè)面之間插入并且處于要缺失的基因的上游，以及抗藥標(biāo)記基因在ca.0.2至3kb下游序列的側(cè)面之間插入并且處于相同基因的下游。在PCR的第一次循環(huán)中，制備下列三個(gè)片段要缺失的上游片段和下游片段，和抗藥標(biāo)記基因。例如，要在該步驟中使用的引物可以是專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的引物，以便將抗藥性基因的上游10-30堿基對(duì)序列加入到上游片段的下端，以及將抗藥性標(biāo)記基因的下游10-30堿基對(duì)序列加入到下游片段的上端(圖1)。
接下來(lái)，使用在第一次循環(huán)中制備的三個(gè)PCR片段作為模板，使用上游片段的上部引物和下游片段的下部引物(外部引物)進(jìn)行PCR的第二次循環(huán)。該步驟導(dǎo)致與如上制成的抗藥性基因序列中的抗藥性標(biāo)記基因片段退火接合，并通過(guò)PCR擴(kuò)增，可以獲得在上游片段和下游片段之間插有抗藥性標(biāo)記基因的DNA片段(圖1)。
當(dāng)采用抗氯霉素基因作為抗藥性標(biāo)記基因時(shí)，可以使用合適的DNA模板和如表2所示的引物組和傳統(tǒng)的PCR酶試劑盒(例如PyrobestDNA聚合酶(Takara Shuzo的產(chǎn)品)在文獻(xiàn)中描述的典型條件下(參見(jiàn)，例如，PCR Protocols.Current Methods and Applications，Edited by B.A.White，Humana Press，pp.251(1993)，Gene，77，61，1989)通過(guò)SOE-PCR獲得用于缺失基因的DNA片段。
當(dāng)由此獲得的用于實(shí)現(xiàn)基因缺失的DNA片段通過(guò)轉(zhuǎn)化方法(competent method)或類(lèi)似方法引入細(xì)胞中時(shí)，在要缺失的基因上游和下游存在的同源區(qū)域中發(fā)生細(xì)胞內(nèi)基因重組。因此，其中的目標(biāo)基因已經(jīng)被抗藥性基因取代的細(xì)胞可以通過(guò)使用抗藥性標(biāo)記物而選擇性地分離(圖1)。具體而言，當(dāng)在細(xì)胞中引入通過(guò)表2所列的引物組而制備的用于基因缺失的DNA片段時(shí)，分離出在含有氯霉素的瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，并通過(guò)例如使用基因組作模板的PCR之類(lèi)的合適方法來(lái)證實(shí)通過(guò)被抗氯霉素基因取代而缺失了目標(biāo)基因。
隨后，當(dāng)將編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽的基因轉(zhuǎn)移到表1所示的任一枯草桿菌基因或一個(gè)或多個(gè)選自與其相對(duì)應(yīng)的基因的基因從中缺失或剔除的宿主突變微生物菌株上時(shí)，可以獲得本發(fā)明的微生物。
對(duì)編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽的基因沒(méi)有特別的限制。蛋白質(zhì)和多肽的例子包括用于工業(yè)用途的例如洗滌劑、食品、纖維、飼料、化學(xué)品、藥品和診斷用藥之類(lèi)的生理活性多肽和酶。工業(yè)酶從功能上可以分成氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶和連接酶/合成酶。優(yōu)選地，可以使用例如纖維素酶、α-淀粉酶和蛋白質(zhì)酶之類(lèi)的水解酶。具體例子包括屬于水解酶分類(lèi)中的族5的纖維素酶(Bioche M.J.，280，309，1991)；特別是源自微生物的纖維素酶，更特別是源自芽孢桿菌屬的纖維素酶。這些類(lèi)型的工業(yè)酶的其它具體例子包括源自芽孢桿菌屬并含有氨基酸序列號(hào)2或4的堿性纖維素酶、氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺失、取代或添加的堿性纖維素酶，以及含有與所述氨基酸序列具有70％同源性，優(yōu)選80％同源性，更優(yōu)選90％同源性，進(jìn)一步優(yōu)選95％同源性，特別優(yōu)選98％或更高同源性的另一氨基酸序列的纖維素酶。
α-淀粉酶的具體例子包括源自微生物的α-淀粉酶，優(yōu)選源自芽孢桿菌屬的液化淀粉酶。更具體的例子包括源自芽孢桿菌屬并含有序列號(hào)22的氨基酸序列的堿性淀粉酶，以及含有與所述氨基酸序列具有70％同源性，優(yōu)選80％同源性，更優(yōu)選90％同源性，進(jìn)一步優(yōu)選95％同源性，特別優(yōu)選98％或更高同源性的另一氨基酸序列的淀粉酶。氨基酸序列的同源性通過(guò)Lipman-Pearson法(Science，227，1435(1985))計(jì)算。蛋白酶的具體例子包括源自微生物，特別是源自屬于芽孢桿菌屬的微生物的絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。
蛋白酶的具體例子包括源自微生物，優(yōu)選源自屬于芽孢桿菌屬的微生物的絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。
優(yōu)選地，編碼目標(biāo)蛋白或多肽的基因在其上游區(qū)域具有一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)?shù)亟雍系狡渖系呐c基因的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯或分泌有關(guān)的調(diào)節(jié)區(qū)域(具體而言，一個(gè)或多個(gè)選自包含啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)區(qū)域；包含核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)和起始密碼子的轉(zhuǎn)譯起始區(qū)域；和分泌信號(hào)肽區(qū)域的區(qū)域)。優(yōu)選將由轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)區(qū)域、轉(zhuǎn)譯起始調(diào)節(jié)區(qū)域和分泌信號(hào)區(qū)域構(gòu)成的三個(gè)區(qū)域接合到目標(biāo)基因上。更優(yōu)選分泌信號(hào)肽區(qū)域是源自屬于芽孢桿菌屬的微生物的纖維素酶基因，且轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域和轉(zhuǎn)譯起始區(qū)域是該纖維素酶基因上游的0.6至1kb區(qū)域。在一個(gè)優(yōu)選例子中，在例如日本專(zhuān)利申請(qǐng)(公開(kāi))第2000-210081號(hào)和第190793/1990號(hào)中公開(kāi)的源自屬于芽孢桿菌屬的微生物的纖維素酶基因；即，源自KSM-S237菌株(FERM BP-7875)或KSM-64菌株(FERMBP-2886)的纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)區(qū)域、轉(zhuǎn)譯起始區(qū)域、和分泌信號(hào)肽區(qū)域，適當(dāng)?shù)亟雍系侥繕?biāo)蛋白或多肽的結(jié)構(gòu)基因上。更具體地，要接合的優(yōu)選DNA片段包括序列號(hào)1的堿基數(shù)量為1至659的核苷酸序列；序列號(hào)3的纖維素酶基因的堿基數(shù)量為1至696的核苷酸序列；含有與所述任意一種核苷酸序列具有70％同源性，優(yōu)選80％同源性，更優(yōu)選90％同源性，進(jìn)一步優(yōu)選95％同源性，特別優(yōu)選98％或更高同源性的核苷酸序列的DNA片段；或含有缺失了所述任意一種核苷酸序列的一部分的核苷酸序列的DNA片段。優(yōu)選將這些DNA片段的一種適當(dāng)?shù)亟雍系侥繕?biāo)蛋白質(zhì)或多肽的結(jié)構(gòu)基因上。正如此處所用，含有缺失上述任意一種核苷酸序列的一部分的核苷酸序列的DNA片段是指不含上述任意一種核苷酸序列的一部分并具有與該基因的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和分泌有關(guān)的功能的DNA片段。
本發(fā)明的重組微生物可以通過(guò)傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得，其中將含有包括編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽的基因并接合到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體上的DNA片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到宿主微生物細(xì)胞中?；蛘撸亟M微生物可以利用通過(guò)將上述DNA片段接合到與宿主微生物基因組的某一部分同源的一個(gè)合適區(qū)域上而制備的DNA片段，并直接插入宿主微生物基因組中而獲得。
使用本發(fā)明的重組微生物獲得的目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽可以按照如下方式生產(chǎn)將相應(yīng)的細(xì)胞株植入含有可同化的碳源和氮源以及其它主要組分的培養(yǎng)基上；通過(guò)傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞株；隨后，收集并提純蛋白質(zhì)或多肽。對(duì)培養(yǎng)基的成分和組成沒(méi)有特別的限制，并且培養(yǎng)基優(yōu)選含有麥芽糖或麥芽低聚糖作為碳源以進(jìn)行令人滿意的培養(yǎng)。
通過(guò)前述方法，可以生產(chǎn)宿主突變微生物株，其中表1所示的任一枯草桿菌基因或一個(gè)或多個(gè)選自與其功能相當(dāng)?shù)幕虻幕蛞呀?jīng)缺失或剔除。此外，通過(guò)使用這種突變株，可以生產(chǎn)重組微生物。由此，通過(guò)使用突變株或重組微生物可以有效地生產(chǎn)有用的蛋白質(zhì)或多肽。
下面將詳細(xì)描述屬于枯草桿菌的已經(jīng)從中缺失了枯草桿菌的glvC基因(BG11848)或glvR基因(BG11847)的重組菌株的構(gòu)筑方法，以及使用該重組微生物生產(chǎn)纖維素酶和α-淀粉酶的方法的實(shí)施例。
實(shí)施例實(shí)施例1使用從枯草桿菌168菌株中提取的用作模板的基因組DNA樣品和表2所示的兩個(gè)引物組(glvC-AF和glvC-A/CmR；和glvC-B/CmF和glvC-BR)制備在該基因組上的glvC基因上游側(cè)側(cè)面的0.5kb片段(A)和在glvC基因下游側(cè)側(cè)面的0.5kb片段(B)。使用用作模板的重組質(zhì)粒pC194(J.Bacteriol.150(2)，815(1982))和由表2所示的glvC-A/CmF和glvC-B/CmR構(gòu)成的引物組制備含有抗氯霉素基因的0.9kb片段(C)。隨后，使用表2所示的引物glvC-AF和glvC-BR進(jìn)行SOE-PCR，并結(jié)合使用由此制成的三個(gè)片段(A)、(B)和(C)作為模板，制備1.9kbDNA片段，其中在該序列中接合了片段(A)、(B)和(C)(參見(jiàn)圖1)。使用由此制成的DNA片段，通過(guò)轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化枯草桿菌168菌株。收集在含氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌落作為轉(zhuǎn)化體。提取上述得到的轉(zhuǎn)化體的基因組，在其上進(jìn)行的PCR證實(shí)glvC基因已經(jīng)被缺失并被抗氯霉素基因取代。
表2

實(shí)施例2按照與實(shí)施例1所述相似的方式，使用表2所示的兩個(gè)引物組(glvR-AF和glvR-A/CmR；和glvR-B/CmF和glvR-BR)制備在該基因組上的glvR基因上游側(cè)側(cè)面的0.6kb片段(A)和在glvR基因下游側(cè)側(cè)面的0.6kb片段(B)。在質(zhì)粒pUC18的XbaI-BamHI裂解位點(diǎn)插入質(zhì)粒pC194的抗氯霉素基因(J.Bacteriol.150(2)，815(1982))，由此制備重組質(zhì)粒pCBB31。將用作模板的重組質(zhì)粒pCBB31和由表2所示的glvR-A/CmF和glvR-B/CmR構(gòu)成的引物組制備含有抗氯霉素基因的0.9kb片段(C)。隨后，使用表2所示的引物glvR-AF和glvR-BR進(jìn)行SOE-OCR，并結(jié)合使用由此制成的三個(gè)片段(A)、(B)和(C)作為模板，制備2.2kb DNA片段，其中在該序列中接合了片段(A)、(B)和(C)(參見(jiàn)圖1)。使用由此制成的DNA片段，通過(guò)轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化枯草桿菌168菌株。收集在含氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌落作為轉(zhuǎn)化體。提取上述轉(zhuǎn)化體的基因組，在其上進(jìn)行的PCR證實(shí)glvR基因已經(jīng)被缺失并被抗氯霉素基因取代。按照類(lèi)似方法，使用兩個(gè)引物組(glcT-AF和glcT-A/CmR；和glcT-B/CmF和glcT-BR)分離glcT基因已經(jīng)被缺失并被抗氯霉素基因取代的轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例3在實(shí)施例1和2獲得的每種基因缺失的菌株中和在用作對(duì)照物的枯草桿菌168菌株中，通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法引入重組質(zhì)粒pHY-S237。重組質(zhì)粒pHY-S237的制備如下將源自芽孢桿菌KSM-S237菌株的編碼堿性纖維素酶的DNA片段(3.1kb)(序列號(hào)1，日本專(zhuān)利申請(qǐng)(公開(kāi))第2000-210081號(hào))插入穿梭載體pHY300PLK的限制性內(nèi)切酶BamHI裂解位點(diǎn)。將由此制成的每種細(xì)胞株在LB培養(yǎng)基(5毫升)中以30℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)液(0.03毫升)注入2×L-麥芽糖培養(yǎng)基(2％胰胨、1％酵母提取物、1％NaCl、7.5％麥芽糖、7.5ppm4-5水合硫酸錳和15ppm四環(huán)素)中，然后在30℃震蕩培養(yǎng)三天。在培養(yǎng)完成后，通過(guò)離心去除細(xì)胞，并測(cè)定由培養(yǎng)物獲得的上層清液的堿性纖維素酶活性，由此計(jì)算細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中分泌出的堿性纖維素酶的量；即，在細(xì)胞外生成的堿性纖維素酶的量。從表3中清楚看出，與對(duì)照物168菌株(野生型菌株)相比，在使用基因缺失的可形成孢子的菌株作為宿主的所有情況下，堿性纖維素酶的生產(chǎn)或分泌都被證實(shí)更為有效。
表3

實(shí)施例4在實(shí)施例1至3獲得的每種基因缺失的菌株中和在用作對(duì)照物的枯草桿菌168菌株中，通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法引入重組質(zhì)粒pHSP-K38。重組質(zhì)粒pHSP-K38的制備如下在穿梭載體pHY300 PLK的限制性內(nèi)切酶BagII-XbaI裂解位點(diǎn)插入如下制成的2.1kb片段(序列號(hào)21)將包含堿性纖維素酶基因的啟動(dòng)子區(qū)域和信號(hào)序列區(qū)域部分的上游0.6kb片段(序列號(hào)3)與編碼源自芽孢桿菌KSM-K38菌株的堿性淀粉酶基因的成熟酶區(qū)域(Asp1-Gln480)的DNA片段(1.5kb)的上游側(cè)接合(日本專(zhuān)利申請(qǐng)(公開(kāi))第2000-184882號(hào)，Eur.J.Biochem.，268，2974(2001))。將由此獲得的每種細(xì)胞株在LB培養(yǎng)基(5毫升)中以30℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)液(0.03毫升)注入2×L-麥芽糖培養(yǎng)基(2％胰胨、1％酵母提取物、1％NaCl、7.5％麥芽糖、7.5ppm4-5水合硫酸錳和15ppm四環(huán)素)中，然后在30℃震蕩培養(yǎng)三至六天。在培養(yǎng)完成后，通過(guò)離心去除細(xì)胞，并測(cè)定由培養(yǎng)物獲得的上層清液的堿性淀粉酶的活性，由此計(jì)算在培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞分泌出的堿性淀粉酶的量；即，在細(xì)胞外生成的堿性淀粉酶的量。從表4中清楚看出，與對(duì)照物168菌株(野生型菌株)相比，在使用基因缺失的菌株作為宿主的情況下，堿性淀粉酶的生產(chǎn)或分泌被證實(shí)更為有效。
表4

序列表<110>花王株式會(huì)社<120>Host microorganisms<130>KS0796<150>JP 2003-379114<151>2003.11.7<160>20<170>PatentIn Ver.3.1<210>1<211>3150<212>DNA<213>芽孢桿菌KSM-S237<220>
<221>CDS<222>(573)..(3044)<223>
<220>
<221>sig_peptide<222>(573)..(659)<223>
<220>
<221>mat_peptide<222>(660)..()<223>
<400>1gatttgccga tgcaacaggc ttatatttag aggaaatttc tttttaaatt gaatacggaa60taaaatcagg taaacaggtc ctgattttat ttttttgagt tttttagaga actgaagatt120gaaataaaag tagaagacaa aggacataag aaaattgcat tagttttaat tatagaaaac180gcctttttat aattatttat acctagaacg aaaatactgt ttcgaaagcg gtttactata240aaaccttata ttccggctct tttttaaaac agggggtaaa aattcactct agtattctaa300tttcaacatg ctataataaa tttgtaagac gcaatatgca tctctttttt tacgatatat360gtaagcggtt aaccttgtgc tatatgccga tttaggaagg ggggtagatt gagtcaagta420
gtaataatat agataactta taagttgttg agaagcagga gagcatctgg gttactcaca480agttttttta aaactttaac gaaagcactt tcggtaatgc ttatgaattt agctatttga540ttcaattact ttaaaaatat ttaggaggta at atg atg tta aga aag aaa aca 593Met Met Leu Arg Lys Lys Thr-25aag cag ttg att tct tcc att ctt att tta gtt tta ctt cta tct tta 641Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu-20 -15 -10ttt ccg gca gct ctt gca gca gaa gga aac act cgt gaa gac aat ttt 689Phe Pro Ala Ala Leu Ala Ala Glu Gly Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe-5 -1 1 5 10aaa cat tta tta ggt aat gac aat gtt aaa cgc cct tct gag gct ggc 737Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly15 20 25gca tta caa tta caa gaa gtc gat gga caa atg aca tta gta gat caa 785Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly Gln Met Thr Leu Val Asp Gln30 35 40cat gga gaa aaa att caa tta cgt gga atg agt aca cac gga tta cag 833His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly Met Ser Thr His Gly Leu Gln45 50 55tgg ttt cct gag atc ttg aat gat aac gca tac aaa gct ctt tct aac 881Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn Ala Tyr Lys Ala Leu Ser Asn60 65 70gat tgg gat tcc aat atg att cgt ctt gct atg tat gta ggt gaa aat 929Asp Trp Asp Ser Asn Met Ile Arg Leu Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn75 80 85 90ggg tac gct aca aac cct gag tta atc aaa caa aga gtg att gat gga 977Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Leu Ile Lys Gln Arg Val Ile Asp Gly95 100 105att gag tta gcg att gaa aat gac atg tat gtt att gtt gac tgg cat 1025Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met Tyr Val Ile Val Asp Trp His110 115 120gtt cat gcg cca ggt gat cct aga gat cct gtt tat gca ggt gct aaa 1073Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp Pro Val Tyr Ala Gly Ala Lys125 130 135
gat ttc ttt aga gaa att gca gct tta tac cct aat aat cca cac att1121Asp Phe Phe Arg Glu Ile Ala Ala Leu Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile140 145 150att tat gag tta gcg aat gag ccg agt agt aat aat aat ggt gga gca1169Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala155 160 165 170ggg att ccg aat aac gaa gaa ggt tgg aaa gcg gta aaa gaa tat gct1217Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala175 180 185gat cca att gta gaa atg tta cgt aaa agc ggt aat gca gat gac aac1265Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Lys Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn190 195 200att atc att gtt ggt agt cca aac tgg agt cag cgt ccg gac tta gca1313Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala205 210 215gct gat aat cca att gat gat cac cat aca atg tat act gtt cac ttc1361Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His Thr Met Tyr Thr Val His Phe220 225 230tac act ggt tca cat gct gct tca act gaa agc tat ccg tct gaa act1409Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr Glu Ser Tyr Pro Ser Glu Thr235 240 245 250cct aac tct gaa aga gga aac gta atg agt aac act cgt tat gcg tta1457Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu255 260 265gaa aac gga gta gcg gta ttt gca aca gag tgg gga acg agt caa gct1505Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala270 275 280agt gga gac ggt ggt cct tac ttt gat gaa gca gat gta tgg att gaa1553Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu285 290 295ttt tta aat gaa aac aac att agc tgg gct aac tgg tct tta acg aat1601Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn300 305 310aaa aat gaa gta tct ggt gca ttt aca cca ttc gag tta ggt aag tct1649Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser315 320 325 330aac gca acc aat ctt gac cca ggt cea gat cat gtg tgg gca cca gaa1697
Asn Ala Thr Asn Leu Asp Pro Gly Pro Asp His Val Trp Ala Pro Glu335 340 345gaa tta agt ctt tct gga gaa tat gta cgt gct cgt att aaa ggt gtg1745Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val350 355 360aac tat gag cca atc gac cgt aca aaa tac acg aaa gta ctt tgg gac1793Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp365 370 375ttt aat gat gga acg aag caa gga ttt gga gtg aat tcg gat tct cca1841Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro380 385 390aat aaa gaa ctt att gca gtt gat aat gaa aac aac act ttg aaa gtt1889Asn Lys Glu Leu Ile Ala Val Asp Asn Glu Asn Asn Thr Leu Lys Val395 400 405 410tcg gga tta gat gta agt aac gat gtt tca gat ggc aac ttc tgg gct1937Ser Gly Leu Asp Val Ser Asn Asp Val Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala415 420 425aat gct cgt ctt tct gcc aac ggt tgg gga aaa agt gtt gat att tta1985Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu430 435 440ggt gct gag aag ctt aca atg gat gtt att gtt gat gaa cca acg acg2033Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr445 450 455gta gct att gcg gcg att cca caa agt agt aaa agt gga tgg gca aat2081Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn460 465 470cca gag cgt gct gtt cga gtg aac gcg gaa gat ttt gtc cag caa acg2129Pro Glu Arg Ala Val Arg Val Asn Ala Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr475 480 485 490gac ggt aag tat aaa gct gga tta aca att aca gga gaa gat gct cct2177Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Leu Thr Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro495 500 505aac cta aaa aat atc gct ttt cat gaa gaa gat aac aat atg aac aac2225Asn Leu Lys Asn Ile Ala Phe His Glu Glu Asp Asn Asn Met Asn Asn510 515 520atc att ctg ttc gtg gga act gat gca gct gac gtt att tac tta gat2273Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp
525 530 535aac att aaa gta att gga aca gaa gtt gaa att cca gtt gtt cat gat2321Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val Glu Ile Pro Val Val His Asp540 545 550cca aaa gga gaa gct gtt ctt cct tct gtt ttt gaa gac ggt aca cgt2369Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg555 560 565 570caa ggt tgg gac tgg gct gga gag tct ggt gtg aaa aca gct tta aca2417Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr575 580 585att gaa gaa gca aac ggt tct aac gcg tta tca tgg gaa ttt gga tat2465Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr590 595 600cca gaa gta aaa cct agt gat aac tgg gca aca gct cca cgt tta gat2513Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp605 610 615ttc tgg aaa tct gac ttg gtt cgc ggt gag aat gat tat gta gct ttt2561Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly Glu Asn Asp Tyr Val Ala Phe620 625 630gat ttc tat cta gat cca gtt cgt gca aca gaa ggc gca atg aat atc2609Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile635 640 645 650aat tta gta ttc cag cca cct act aac ggg tat tgg gta caa gca cca2657Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro655 660 665aaa acg tat acg att aac ttt gat gaa tta gag gaa gcg aat caa gta2705Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val670 675 680aat ggt tta tat cac tat gaa gtg aaa att aac gta aga gat att aca2753Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr685 690 695aac att caa gat gac acg tta cta cgt aac atg atg atc att ttt gca2801Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg Asn Met Met Ile Ile Phe Ala700 705 710gat gta gaa agt gac ttt gca ggg aga gtc ttt gta gat aat gtt cgt2849Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg Val Phe Val Asp Asn Val Arg715 720 725 730
ttt gag ggg gct gct act act gag ccg gtt gaa cca gag cca gtt gat2897Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro Val Glu Pro Glu Pro Val Asp735 740 745cct ggc gaa gag acg cca cct gtc gat gag aag gaa gcg aaa aaa gaa2945Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu750 755 760caa aaa gaa gca gag aaa gaa gag aaa gaa gca gta aaa gaa gaa aag2993Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys765 770 775aaa gaa gct aaa gaa gaa aag aaa gca gtc aaa aat gag gct aag aaa3041Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala Val Lys Asn Glu Ala Lys Lys780 785 790aaa taatctatta aactagttat agggttatct aaaggtctga tgtagatctt 3094Lys795ttagataacc tttttcttgc ataactggac acagagttgt tattaaagaa agtaag 3150<210>2<211>824<212>PRT<213>芽孢桿菌KSM-S237<400>2Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile-25 -20 -15Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Ala Ala Leu Ala Ala Glu Gly-10 -5 -1 1Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val5 10 15Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly20 25 30 35Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly40 45 50
Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn55 60 65Ala Tyr Lys Ala Leu Ser Asn Asp Trp Asp Ser Asn Met Ile Arg Leu70 75 80Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Leu Ile85 90 95Lys Gln Arg Val Ile Asp Gly Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met100 105 110 115Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp120 125 130Pro Val Tyr Ala Gly Ala Lys Asp Phe Phe Arg Glu Ile Ala Ala Leu135 140 145Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser150 155 160Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp165 170 175Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Lys180 185 190 195Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp200 205 210Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His215 220 225Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr230 235 240
Glu Ser Tyr Pro Ser Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met245 250 255Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr260 265 270 275Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp280 285 290Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp295 300 305Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr310 315 320Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Asn Leu Asp Pro Gly Pro325 330 335Asp His Val Trp Ala Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val340 345 350 355Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys360 365 370Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe375 380 385Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ile Ala Val Asp Asn390 395 400Glu Asn Asn Thr Leu Lys Val Ser Gly Leu Asp Val Ser Asn Asp Val405 410 415Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp420 425 430 435
Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val440 445 450Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser455 460 465Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn Pro Glu Arg Ala Val Arg Val Asn Ala470 475 480Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Leu Thr485 490 495Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro Asn Leu Lys Asn Ile Ala Phe His Glu500 505 510 515Glu Asp Asn Asn Met Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala520 525 530Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val535 540 545Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser550 555 560Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser565 570 575Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala580 585 590 595Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp600 605 610Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly615 620 625Glu Asn Asp Tyr Val Ala Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala
630 635 640Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn645 650 655Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu660 665 670 675Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys680 685 690Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg695 700 705Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg710 715 720Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro725 730 735Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp740 745 750 755Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys760 765 770Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala775 780 785Val Lys Asn Glu Ala Lys Lys Lys790795<210>3<211>3332<212>DNA<213>芽孢桿菌KSM-64<220>
<221>CDS<222>(610)..(3075)<223>
<220>
<221>sig_peptide<222>(610)..(696)<223>
<220>
<221>mat_peptide<222>(697)..()<223>
<400>3agtacttacc attttagagt caaaagatag aagccaagca ggatttgccg atgcaaccgg60cttatattta gagggaattt ctttttaaat tgaatacgga ataaaatcag gtaaacaggt120cctgatttta tttttttgaa tttttttgag aactaaagat tgaaatagaa gtagaagaca180acggacataa gaaaattgta ttagttttaa ttatagaaaa cgcttttcta taattattta240tacctagaac gaaaatactg tttcgaaagc ggtttactat aaaaccttat attccggctc300tttttttaaa cagggggtga aaattcactc tagtattcta atttcaacat gctataataa360atttgtaaga cgcaatatac atcttttttt tatgatattt gtaagcggtt aaccttgtgc420tatatgccga tttaggaagg gggtagattg agtcaagtag tcataattta gataacttat480aagttgttga gaagcaggag agaatctggg ttactcacaa gttttttaaa acattatcga540aagcactttc ggttatgctt atgaatttag ctatttgatt caattacttt aataatttta600ggaggtaat atg atg tta aga aag aaa aca aag cag ttg att tct tcc att651Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile-25 -20ctt att tta gtt tta ctt cta tct tta ttt ccg aca gct ctt gca gca 699Leu Ile Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Thr Ala Leu Ala Ala-15 -10 -5 -1 1gaa gga aac act cgt gaa gac aat ttt aaa cat tta tta ggt aat gac 747Glu Gly Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp5 10 15aat gtt aaa cgc cct tct gag gct ggc gca tta caa tta caa gaa gtc 795Asn Val Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val
20 25 30gat gga caa atg aca tta gta gat caa cat gga gaa aaa att caa tta843Asp Gly Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu35 40 45cgt gga atg agt aca cac gga tta caa tgg ttt cct gag atc ttg aat891Arg Gly Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn50 55 60 65gat aac gca tac aaa gct ctt gct aac gat tgg gaa tca aat atg att939Asp Asn Ala Tyr Lys Ala Leu Ala Asn Asp Trp Glu Ser Asn Met Ile70 75 80cgt cta gct atg tat gtc ggt gaa aat ggc tat gct tca aat cca gag987Arg Leu Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Ser Asn Pro Glu85 90 95tta att aaa agc aga gtc att aaa gga ata gat ctt gct att gaa aat1035Leu Ile Lys Ser Arg Val Ile Lys Gly Ile Asp Leu Ala Ile Glu Asn100 105 110gac atg tat gtc atc gtt gat tgg cat gta cat gca cct ggt gat cct1083Asp Met Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro115 120 125aga gat ccc gtt tac gct gga gca gaa gat ttc ttt aga gat att gca1131Arg Asp Pro Val Tyr Ala Gly Ala Glu Asp Phe Phe Arg Asp Ile Ala130 135 140 145gca tta tat cct aac aat cca cac att att tat gag tta gcg aat gag1179Ala Leu Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu150 155 160cca agt agt aac aat aat ggt gga gct ggg att cca aat aat gaa gaa1227Pro Ser Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu165 170 175ggt tgg aat gcg gta aaa gaa tac gct gat cca att gta gaa atg tta1275Gly Trp Asn Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu180 185 190cgt gat agc ggg aac gca gat gac aat att atc att gtg ggt agt cca1323Arg Asp Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro195 200 205aac tgg agt cag cgt cct gac tta gca gct gat aat cca att gat gat1371Asn Trp Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp210 215 220 225
cac cat aca atg tat act gtt cac ttc tac act ggt tca cat gct gct1419His His Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala230 235 240tca act gaa agc tat ccg cct gaa act cct aac tct gaa aga gga aac1467Ser Thr Glu Ser Tyr Pro Pro Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn245 250 255gta atg agt aac act cgt tat gcg tta gaa aac gga gta gca gta ttt1515Val Met Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe260 265 270gca aca gag tgg gga act agc caa gca aat gga gat ggt ggt cct tac1563Ala Thr Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro Tyr275 280 285ttt gat gaa gca gat gta tgg att gag ttt tta aat gaa aac aac att1611Phe Asp Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile290 295 300 305agc tgg gct aac tgg tct tta acg aat aaa aat gaa gta tct ggt gca1659Ser Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala310 315 320ttt aca cca ttc gag tta ggt aag tct aac gca aca agt ctt gac cca1707Phe Thr Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Scr Leu Asp Pro325 330 335ggg cca gac caa gta tgg gta cca gaa gag tta agt ctt tct gga gaa1755Gly Pro Asp Gln Val Trp Val Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu340 345 350tat gta cgt gct cgt att aaa ggt gtg aac tat gag cca atc gac cgt1803Tyr Val Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg355 360 365aca aaa tac acg aaa gta ctt tgg gac ttt aat gat gga acg aag caa1851Thr Lys Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln370 375 380 385gga ttt gga gtg aat gga gat tct cca gtt gaa gat gta gtt att gag1899Gly Phe Gly Val Asn Gly Asp Ser Pro Val Glu Asp Val Val Ile Glu390 395 400aat gaa gcg ggc gct tta aaa ctt tca gga tta gat gca agt aat gat1947Asn Glu Ala Gly Ala Leu Lys Leu Ser Gly Leu Asp Ala Ser Asn Asp405 410 415
gtt tct gaa ggt aat tac tgg gct aat gct cgt ctt tct gcc gac ggt1995Val Ser Glu Gly Asn Tyr Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asp Gly420 425 430tgg gga aaa agt gtt gat att tta ggt gct gaa aaa ctt act atg gat2043Trp Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp435 440 445gtg att gtt gat gag ccg acc acg gta tca att gct gca att cca caa2091Val Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ser Ile Ala Ala Ile Pro Gln450 455 460 465ggg cca tca gcc aat tgg gtt aat cca aat cgt gca att aag gtt gag2139Gly Pro Ser Ala Asn Trp Val Asn Pro Asn Arg Ala Ile Lys Val Glu470 475 480cca act aat ttc gta ccg tta gga gat aag ttt aaa gcg gaa tta act2187Pro Thr Asn Phe Val Pro Leu Gly Asp Lys Phe Lys Ala Glu Leu Thr485 490 495ata act tca gct gac tct cca tcg tta gaa gct att gcg atg cat gct2235Ile Thr Ser Ala Asp Ser Pro Ser Leu Glu Ala Ile Ala Met His Ala500 505 510gaa aat aac aac atc aac aac atc att ctt ttt gta gga act gaa ggt2283Glu Asn Asn Asn Ile Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Glu Gly515 520 525gct gat gtt atc tat tta gat aac att aaa gta att gga aca gaa gtt2331Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val530 535 540 545gaa att cca gtt gtt cat gat cca aaa gga gaa gct gtt ctt cct tct2379Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser550 555 560gtt ttt gaa gac ggt aca cgt caa ggt tgg gac tgg gct gga gag tct2427Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser565 570 575ggt gtg aaa aca gct tta aca att gaa gaa gca aac ggt tct aac gcg2475Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala580 585 590tta tca tgg gaa ttt gga tac cca gaa gta aaa cct agt gat aac tgg2523Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp595 600 605gca aca gct cca cgt tta gat ttc tgg aaa tct gac ttg gtt cgc ggt2571
Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly610 615 620 625gaa aat gat tat gta act ttt gat ttc tat cta gat cca gtt cgt gca2619Glu Asn Asp Tyr Val Thr Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala630 635 640aca gaa ggc gca atg aat atc aat tta gta ttc cag cca cct act aac2667Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn645 650 655ggg tat tgg gta caa gca cca aaa acg tat acg att aac ttt gat gaa2715Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu660 665 670tta gag gaa gcg aat caa gta aat ggt tta tat cac tat gaa gtg aaa2763Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys675 680 685att aac gta aga gat att aca aac att caa gat gac acg tta cta cgt2811Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg690 695 700 705aac atg atg atc att ttt gca gat gta gaa agt gac ttt gca ggg aga2859Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg710 715 720gtc ttt gta gat aat gtt cgt ttt gag ggg gct gct act act gag ccg2907Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro725 730 735gtt gaa cca gag cca gtt gat cct ggc gaa gag acg ccg cct gtc gat2955Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp740 745 750gag aag gaa gcg aaa aaa gaa caa aaa gaa gca gag aaa gaa gag aaa3003Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys755 760 765gaa gca gta aaa gaa gaa aag aaa gaa gct aaa gaa gaa aag aaa gca3051Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala770 775 780 785atc aaa aat gag gct acg aaa aaa taatctaata aactagttat agggttatct 3105Ile Lys Asn Glu Ala Thr Lys Lys790aaaggtctga tgcagatctt ttagataacc tttttttgca taactggaca tagaatggtt 3165
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Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp120 125 130Pro Val Tyr Ala Gly Ala Glu Asp Phe Phe Arg Asp Ile Ala Ala Leu135 140 145Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser150 155 160Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp165 170 175Asn Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Asp180 185 190 195Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp200 205 210Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His215 220 225Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr230 235 240Glu Ser Tyr Pro Pro Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met245 250 255Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr260 265 270 275Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp280 285 290Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp295 300 305
Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr310 315 320Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Ser Leu Asp Pro Gly Pro325 330 335Asp Gln Val Trp Val Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val340 345 350 355Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys360 365 370Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe375 380 385Gly Val Asn Gly Asp Ser Pro Val Glu Asp Val Val Ile Glu Asn Glu390 395 400Ala Gly Ala Leu Lys Leu Ser Gly Leu Asp Ala Ser Asn Asp Val Ser405 410 415Glu Gly Asn Tyr Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asp Gly Trp Gly420 425 430 435Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val Ile440 445 450Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ser Ile Ala Ala Ile Pro Gln Gly Pro455 460 465Ser Ala Asn Trp Val Asn Pro Asn Arg Ala Ile Lys Val Glu Pro Thr470 475 480Asn Phe Val Pro Leu Gly Asp Lys Phe Lys Ala Glu Leu Thr Ile Thr485 490 495Ser Ala Asp Ser Pro Ser Leu Glu Ala Ile Ala Met His Ala Glu Asn
500 505 510 515Asn Asn Ile Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Glu Gly Ala Asp520 525 530Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val Glu Ile535 540 545Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser Val Phe550 555 560Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser Gly Val565 570 575Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala Leu Ser580 585 590 595Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp Ala Thr600 605 610Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly Glu Asn615 620 625Asp Tyr Val Thr Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala Thr Glu630 635 640Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn Gly Tyr645 650 655Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu Leu Glu660 665 670 675Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys Ile Asn680 685 690Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg Asn Met695 700 705
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<400>18gttatccgct cacaattccg atcctcagct cctttgtc 38<210>19<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>19cgtcgtgact gggaaaactc atctgatacc gattaacc 38<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>20caactgaatc cgaaggaatg 20？？？？？？？？17/29？？？？？？？？5/30
權(quán)利要求
1.一種重組微生物，其通過(guò)將編碼異性蛋白質(zhì)或多肽的基因轉(zhuǎn)移到至少一種參與麥芽糖的膜滲透的基因缺失或被剔除的微生物的突變株上而制備。
2.如權(quán)利要求1所述的重組微生物，其中所述參與麥芽糖的膜滲透的基因是枯草桿菌基因glvR或glvC或與該基因功能相當(dāng)?shù)幕颉?br> 3.如權(quán)利要求1或2所述的重組微生物，其中所述微生物是枯草桿菌或?qū)儆谘挎邨U菌屬的另一細(xì)菌。
4.如權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)所述的重組微生物，其中一個(gè)或多個(gè)選自轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)區(qū)域、轉(zhuǎn)譯起始調(diào)節(jié)區(qū)域和分泌信號(hào)區(qū)域的區(qū)域接合到編碼異性蛋白質(zhì)或多肽的基因的上游區(qū)域。
5.如權(quán)利要求4所述的重組微生物，其中所述一個(gè)或多個(gè)區(qū)域是由轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)區(qū)域、轉(zhuǎn)譯起始調(diào)節(jié)區(qū)域和分泌信號(hào)區(qū)域構(gòu)成的三個(gè)區(qū)域。
6.如權(quán)利要求4或5所述的重組微生物，其中所述分泌信號(hào)區(qū)域來(lái)自屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌的纖維素酶基因，而所述轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)區(qū)域和所述轉(zhuǎn)譯起始調(diào)節(jié)區(qū)域各自來(lái)自該纖維素酶基因上游的0.6至1kb區(qū)域。
7.如權(quán)利要求5所述的重組微生物，其中由所述轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)區(qū)域、所述轉(zhuǎn)譯起始調(diào)節(jié)區(qū)域和所述分泌信號(hào)區(qū)域構(gòu)成的三個(gè)區(qū)域是序列號(hào)1的纖維素酶基因的堿基數(shù)為1至659的核苷酸序列；序列號(hào)3的纖維素酶基因的堿基數(shù)為1至696的核苷酸序列；含有與所述核苷酸序列的任意一種具有70％同源性的核苷酸序列的DNA片段；或含有缺失了所述核苷酸序列的任意一種的一部分的核苷酸序列的DNA片段。
8.一種生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽的方法，其使用如權(quán)利要求1至7任意一項(xiàng)所述的重組微生物。
9.一種生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽的方法，其特征在于包括在含麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)如權(quán)利要求1至7任意一項(xiàng)所述的重組微生物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種通過(guò)將編碼蛋白質(zhì)或多肽的基因轉(zhuǎn)移到能夠以提高的生產(chǎn)率生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽并且由本發(fā)明人鑒別的宿主微生物上而獲得的重組微生物，以及使用該重組微生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽的方法。該重組微生物通過(guò)將編碼異性蛋白質(zhì)或多肽的基因轉(zhuǎn)移到至少一種參與麥芽糖的膜滲透的基因缺失或被剔除的微生物的突變株上而制備。
文檔編號(hào)C12N15/75GK1875095SQ20048003169
公開(kāi)日2006年12月6日 申請(qǐng)日期2004年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月7日
發(fā)明者東畑正敏, 澤田和久, 尾崎克也, 關(guān)口順一 申請(qǐng)人:花王株式會(huì)社