專利名稱：優(yōu)化nadph消耗性生物合成途徑的微生物菌株的制作方法
NADP(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)以它的還原形式NADPH參與細(xì)胞內(nèi)涉及具有脫氫酶和還原酶活性的酶的氧化還原反應(yīng)。
本發(fā)明涉及優(yōu)化的微生物菌株，以便通過生物轉(zhuǎn)化以NADPH消耗生物合成途徑生產(chǎn)物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的菌株可用于NADPH消耗生物轉(zhuǎn)化工藝。根據(jù)本發(fā)明定義的菌株可以是原核的或者真核的。優(yōu)選的實(shí)施方案中，原核菌株是大腸桿菌菌株。進(jìn)一步的實(shí)施方案中，真核菌株是酵母菌株，具體而言是釀酒酵母。
本發(fā)明還涉及通過使根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的菌株的生長在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中而進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化來制備物質(zhì)的方法，優(yōu)化的菌株也包含對制備這種物質(zhì)必需的遺傳元件。
生物轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)發(fā)展到可以大量而低成本地生產(chǎn)所需物質(zhì)，同時可以有效的使用工業(yè)和農(nóng)業(yè)上的副產(chǎn)品。
下面是用活體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化生成所需物質(zhì)的兩種主要方法1)發(fā)酵，微生物通過發(fā)酵從簡單碳源產(chǎn)生一種物質(zhì)(例如，WO0102547，描述了谷氨酸棒桿菌在葡萄糖存在下發(fā)酵生成賴氨酸)。
2)微生物通過生物轉(zhuǎn)換將給定共底物轉(zhuǎn)換成感興趣物質(zhì)(例如，WO0012745，描述了R-哌啶衍生物的生成，和WO0068397，描述了塔格糖的生成)。共底物不被同化，區(qū)別于用于單獨(dú)生成生物轉(zhuǎn)換必需的生物物質(zhì)和NADPH的碳源。
生物轉(zhuǎn)化方法的改進(jìn)涉及各種因素，如溫度、氧化、培養(yǎng)基成分、恢復(fù)方法等等。也可以修飾微生物以增加感興趣物質(zhì)的生成和/或排出。
發(fā)酵方法中，例如可以通過改變基因調(diào)控或通過修飾基因以改變參與的酶的特征，或者通過優(yōu)化輔因子的再生來改進(jìn)生物合成途徑。
生物轉(zhuǎn)換方法中重點(diǎn)放在減少副產(chǎn)物的形成和優(yōu)化參與生物轉(zhuǎn)換步驟的輔因子的再生上。
在參與生物轉(zhuǎn)化的輔因子中，NADPH對下列物質(zhì)的生成尤其重要，氨基酸(例如精氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、賴氨酸)、維生素(例如泛酸鹽、維生素K1、生育酚)、芳香物(例如WO9401564)、多元醇(例如木糖醇)、多胺(例如亞精胺)、羥基酯(例如4-氯-3-羥基丁酸乙酯)和其它高附加值的物質(zhì)。
本發(fā)明涉及利用具有NADPH消耗性生物合成途徑生產(chǎn)物質(zhì)的優(yōu)化微生物菌株。
不去嘗試優(yōu)化每個生物轉(zhuǎn)化中微生物的NADPH/NADP+比率，發(fā)明者選擇產(chǎn)生改進(jìn)的微生物，以獲得不同的NADPH/NADP+比率，改進(jìn)的微生物隨后用于進(jìn)行NADPH消耗性生物轉(zhuǎn)化。
根據(jù)本發(fā)明，微生物菌株是表示同物種的一系列微生物，包括該物種的至少一種微生物。因而所描述的菌株的特征適用于該種類的所有微生物。同樣地，所描述的任何一個微生物菌株的特征也適用于整個微生物系列。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的微生物包括細(xì)菌、酵母和絲狀霉菌，具體而言細(xì)菌和酵母屬于下列物種曲霉屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、埃希氏菌屬、葡萄糖桿菌屬、青霉菌屬、畢赤酵母屬、假單胞菌屬、紅球菌屬、酵母菌屬、鏈霉菌屬、黃單胞菌屬、假絲酵母屬物種。
下面描述了大腸桿菌和釀酒酵母的NADPH/NADP+比率優(yōu)化原則。同一原則同樣適用于所有在有氧條件下生長的微生物。
NADPH/NADP+比率優(yōu)化的原則在于限制參與NADPH氧化的酶活性，和/或促進(jìn)還原NADP+的酶活性。參與NADPH氧化的酶活性被還原反應(yīng)限制，具體而言，通過將那些活性，尤其是如醌氧化還原酶和/或可溶性轉(zhuǎn)氫酶的活性滅活而限制。通過調(diào)整經(jīng)過磷酸戊糖循環(huán)的碳流量和/或改進(jìn)至少一種酶的輔因子專一性增強(qiáng)利于NADP+還原的酶活性，從而使其對NADP的利用優(yōu)先于其慣用輔因子NAD。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的菌株通過分子生物學(xué)方法獲得。那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道用于改變微生物遺傳特性的方案。這些方法都有據(jù)可查，并且是技術(shù)人員容易操作的(Sambrook et al，1989 Molecular cloninga Iaboratory manual.2ndEd.Cold SpringHarbor Lab.，Cold Spring Harbor，New York.)。
用于限制酶活性的方法包括用適當(dāng)?shù)姆椒ǜ淖儽磉_(dá)它的基因，例如通過引起相關(guān)基因的編碼部分的突變，或者改變啟動子區(qū)域，具體而言就是用一個減少基因表達(dá)的序列來替換它。
用于滅活酶的方法包括用適當(dāng)?shù)姆绞綔缁钕嚓P(guān)基因表達(dá)的產(chǎn)物，或者抑制相關(guān)基因的表達(dá)，或者刪除至少相關(guān)基因的一部分以阻止其表達(dá)(例如，刪除其表達(dá)所必需的部分或全部啟動子區(qū)域)，或者導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物失去它的功能(例如，刪除相關(guān)基因的編碼部分)。
優(yōu)選地，刪除基因包括去除那個基因，而且如果需要，選擇一個便于鑒別的標(biāo)記基因代替它，分離和提純根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的菌株。
大腸桿菌基因的滅活優(yōu)選通過同源重組實(shí)現(xiàn)(Datsenko K.A.，Wanner B.L.(2000)One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCRproducts.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 976640-6645)。方案的原理簡要敘述如下將線性片段導(dǎo)入細(xì)胞，所述線性片段在活體內(nèi)獲得，包括兩個旁側(cè)基因區(qū)域和定位于這兩個區(qū)域之間的至少一個選擇基因(通常是抗生素抗性基因)。這個片段因此含有滅活基因。隨后通過在選擇性培養(yǎng)基上鋪板來選擇發(fā)生了重組事件并整合有導(dǎo)入片段的細(xì)胞。然后選擇經(jīng)歷了雙重重組事件的細(xì)胞，該細(xì)胞中滅活基因替代了野生基因。為了加速雙重重組的檢出，這個方案可以用陽性和陰性選擇系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)。
釀酒酵母基因的滅活也是優(yōu)選通過同源重組進(jìn)行(Baudin et al.，Nucl.Acids Res.21，3329-3330，1993；Wach et al.，Yeast 10，1793-1808，1994；Brachmann et al.，Yeast.14115-32，1998)。
促進(jìn)酶活性的方法包括通過適當(dāng)?shù)姆绞椒€(wěn)定相關(guān)基因表達(dá)的產(chǎn)物，例如通過減小它對變構(gòu)效應(yīng)物的靈敏性，或者通過增強(qiáng)基因的表達(dá)以增加產(chǎn)生的酶量。
基因的超表達(dá)可以通過在原位用強(qiáng)啟動子或誘導(dǎo)型啟動子替換基因的啟動子來實(shí)現(xiàn)。作為替代方案，將復(fù)制的質(zhì)粒(單拷貝或多拷貝)導(dǎo)入細(xì)胞，其中超表達(dá)的基因由適當(dāng)?shù)膯幼涌刂?。在大腸桿菌修飾的情況下，例如，可以用啟動子Plac-o、Ptrc-o和ptac-o三種刪除了乳糖操縱子(lacO)而構(gòu)成的強(qiáng)細(xì)菌啟動子。在釀酒酵母修飾的情況下，例如，可以用啟動子Ppgk、Padhl、Pgal1、Pgal10。
本方法可用于改變酶的輔因子專一性，以使它對NADP的利用優(yōu)先于NAD，包括改變使那種酶表達(dá)的基因序列(Bocanegra，J.A.Scrutton，N.S.；Perham，R.N.(1993)Creation of an NADP-dependent pyruvate dehydrogenase multienzyme complex byprotein engineering.Biochemistry 322737-2740)。
根據(jù)發(fā)明優(yōu)化的菌株，即有增強(qiáng)的NADP+還原能力的菌株，通過一種或多種NADPH氧化酶活性的衰減或失活來表現(xiàn)其特征，NADPH氧化酶活性具體而言是醌氧化還原酶和/或可溶性轉(zhuǎn)氫酶的活性。
下面列出了一些NADPH氧化酶活性和基因的非限制性的實(shí)例
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的菌株(即具有增強(qiáng)的NADP+還原能力)還包括促進(jìn)一種或多種NADP+還原酶活性的修飾，尤其是經(jīng)過磷酸戊糖途徑設(shè)定碳流量的修飾，和/或涉及至少一種酶的輔因子專一性的修飾，以使它對NADP的利用優(yōu)先于它的慣用輔因子NAD。
在根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的促進(jìn)一種或多種NADP+還原酶活性的菌株(即具有增強(qiáng)的NADP+還原能力)中對修飾易感的活性在下面列出
在根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的菌株中對修飾易感的酶活性主要是通過大腸桿菌或釀酒酵母中蛋白質(zhì)或基因的命名來定義的。然而，根據(jù)本發(fā)明這種用法有更普遍的含義，并且包括其他微生物中相應(yīng)的酶活性。用大腸桿菌或釀酒酵母中蛋白質(zhì)或基因的序列，那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以鑒定出大腸桿菌和釀酒酵母以外的微生物中的等效基因。
那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知鑒別同源序列和它們的同源性百分比的方法，并且尤其包括BLAST程序，它可以在網(wǎng)址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/中用那里顯示的默認(rèn)參數(shù)使用。得到的序列然后可以被利用(例如比對)，例如用CLUSTALW程序(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或者M(jìn)ULTALIN程序(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)，用它們網(wǎng)址上顯示的默認(rèn)參數(shù)使用。
作為替代方案，CD-Search程序(http://www.ncbi.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)可用于鑒別大腸桿菌或釀酒酵母蛋白質(zhì)序列中的保守性結(jié)構(gòu)域，并用于搜索其他微生物中表現(xiàn)相同結(jié)構(gòu)域的序列。保守性結(jié)構(gòu)域記錄在CDD數(shù)據(jù)庫中(Conserveddomain database；Marchler-Bauer A，Anderson JB，DeWeese-Scott C，F(xiàn)edorova ND，Geer LY，He S，Hurwitz DI，Jackson JD，Jacobs AR，Lanczycki CJ，Liebert CA，LiuC，Madej T，Marchler GH，Mazumder R，Nikolskaya AN，Panchenko AR，Rao BS，Shoemaker BA，Simonyan V，Song JS，Thiessen PA，Vasudevan S，Wang Y，YamashitaRA，Yin JJ，Bryant SH.CDDa curated Entrez database of conserved domainalignments.Nucleic Acids Research 31383-387(2003))，其中將數(shù)據(jù)分組成PFAM或COG類型。
PFAMs(Protein FAMilies database of alignment and hidden Markov models；http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)是蛋白質(zhì)序列比對的一個大集合。每個PFAM可以顯示多重比對，看蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，評估在生物中的分布，進(jìn)入其它數(shù)據(jù)庫和顯示已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
COGs(Clusters of Orthologous Groups of Proteins；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)是通過比較代表30種主要系統(tǒng)發(fā)育系的43個完全測序的基因組的蛋白質(zhì)序列獲得的。每個COG至少以3條線定義，這樣可以識別古老的保守性結(jié)構(gòu)域。
從通過這些不同方法識別的共有序列，可以設(shè)計簡并寡核苷酸探針以克隆另一種微生物中的相應(yīng)基因。這些常規(guī)分子生物學(xué)方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的，例如在Sambrook et al.(1989 Molecular cloninga laboratory manual.2ndEd.Cold SpringHarbor Lab.，Cold Spring Harbor，New York.)中已經(jīng)描述。
由udhA基因編碼的大腸桿菌可溶性轉(zhuǎn)氫酶的蛋白質(zhì)類似物的編碼基因的實(shí)例
由qor基因編碼的大腸桿菌醌氧化還原酶的蛋白質(zhì)類似物的編碼基因的實(shí)例
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的菌株(即具有增強(qiáng)的NADP+還原能力)特征在于刪除至少一個編碼NADPH氧化活性的基因，尤其是刪除編碼醌氧化還原酶的基因(例如qor，ZTA1)和/或編碼可溶性轉(zhuǎn)氫酶活性的基因(例如udhA)。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中udhA和qor基因都被刪除。
本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的菌株還有特征是刪除編碼磷酸葡糖異構(gòu)酶活性(例如pgi，PGI1)和/或磷酸果糖激酶活性(例如pfkA，PFK1)的一個或多個基因。
本發(fā)明進(jìn)一步具體的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的菌株還有特征在于修飾編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶(例如lpd，LPD1)和/或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(例如gapA，TDH1)活性的一個或多個基因，這些修飾引起酶優(yōu)選NADP，而不是它的常見輔因子NAD。
以刪除編碼磷酸葡糖異構(gòu)酶和/或磷酸果糖激酶活性的基因?yàn)樘卣鞯谋景l(fā)明菌株尤其適合于生物轉(zhuǎn)化方法。
為了提高根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的微生物中可用的NADPH含量，可以有利的超表達(dá)編碼下列酶活性之一的至少一個基因葡萄糖6-磷酸脫氫酶(例如zwf，ZWF1)，6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶(例如SOL1)、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(例如gnd，GND1)、異檸檬酸脫氫酶(例如icd，IDP1)和膜結(jié)合轉(zhuǎn)氫酶(例如pntA)，和/或刪除編碼下列酶活性之一的至少一個基因磷酸葡萄糖酸脫水酶(例如edd)、蘋果酸合酶(例如aceB，DAL7)、異檸檬酸裂合酶(例如aceA，ICL1)和異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸酶(例如aceK)。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是如前后所述為了生產(chǎn)NADPH而優(yōu)化的微生物，該微生物還包括編碼參與感興趣物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化的酶活性的一個或多個基因，和一個或多個選擇標(biāo)記基因。
這些基因可以是本發(fā)明所優(yōu)化的菌株自身的，也可以是使用合適的載體經(jīng)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入本發(fā)明所優(yōu)化的菌株內(nèi)的，這些基因即可以整合到微生物的基因組，也可以是復(fù)制型載體，適合的載體攜帶一個或多個編碼參與相關(guān)感興趣物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化的相關(guān)酶的基因和/或相關(guān)選擇標(biāo)記。
這些基因包括編碼參與感興趣物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化的酶和/或選擇標(biāo)記的核酸序列，該編碼序列與選用于生物轉(zhuǎn)化的真核和/或原核細(xì)胞中的有效啟動子序列結(jié)合。載體(或質(zhì)粒)可以是大腸桿菌和另一種微生物之間的穿梭載體。
優(yōu)化NADPH/NADP+比率的菌株的選擇取決于生物轉(zhuǎn)化的類型(發(fā)酵或生物轉(zhuǎn)換)、所考慮生物轉(zhuǎn)換途徑中對NADPH的總需求、碳源的性質(zhì)、生物物質(zhì)流量需求等等。
如果不能控制碳流量在糖酵解和磷酸戊糖途徑之間的分布，必須刪除編碼磷酸葡糖異構(gòu)酶和/或磷酸果糖激酶活性的基因。對于發(fā)酵或當(dāng)NADPH需求要求每摩爾輸入葡萄糖2摩爾NADP+的最小還原流量時，優(yōu)選刪除編碼磷酸葡糖異構(gòu)酶的基因。對于生物轉(zhuǎn)換或當(dāng)NADPH需求要求每摩爾輸入葡萄糖3-4摩爾NADP+的最小還原流量時，優(yōu)選刪除編碼磷酸果糖激酶的基因。當(dāng)生物轉(zhuǎn)化要求每摩爾輸入葡萄糖的最小還原流量大于3摩爾NADP+，尤其是為了優(yōu)化大腸桿菌菌株Δ(udhA，qor)或大腸桿菌菌株Δ(udhA，qor，pgi)或大腸桿菌菌株Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)，如前面和后面所述，將修飾編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶和/或甘油醛3-磷酸脫氫酶的基因?？梢赃M(jìn)行其它所述修飾，即超表達(dá)至少一個編碼下列酶活性之一的基因葡萄糖6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶和膜轉(zhuǎn)氫酶，和/或刪除至少一個編碼下列酶活性之一的基因6-磷酸葡糖酸脫水酶、蘋果酸合酶、異檸檬酸裂合酶或異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸酶，以精細(xì)調(diào)節(jié)NADPH/NADP+比率的優(yōu)以滿足細(xì)胞以及所考慮生物轉(zhuǎn)化方法的需要。
本發(fā)明還涉及如前后所述根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的菌株的制備方法，其特征在于刪除編碼醌氧化還原酶或可溶性轉(zhuǎn)氫酶活性的基因，還有可能刪除編碼葡萄糖6-磷酸脫氫酶或6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶活性的基因，和/或修飾至少一個編碼NAD酶的基因，尤其是編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶或甘油醛3-磷酸脫氫酶的基因，使得它們優(yōu)先使用NADP，并且如果需要，刪除至少一個編碼6-磷酸葡糖酸脫水酶、蘋果酸合酶、異檸檬酸裂合酶或異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸酶的基因，這種刪除和修飾通過適合的方式進(jìn)行，和/或特征在于超表達(dá)至少一個編碼下列活性的基因葡萄糖6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶或膜轉(zhuǎn)氫酶，這通過使用合適的允許超表達(dá)的載體來修飾菌株實(shí)現(xiàn)，或通過修飾控制待超表達(dá)基因的內(nèi)源性啟動子的強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明制備菌株的方法還包括用至少一個合適的載體轉(zhuǎn)化優(yōu)化菌株，載體包括編碼一種或多種參與感興趣物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化的酶的一個或多個基因，和一個或多個選擇標(biāo)記基因。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的還涉及根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的這些菌株用于NADPH依賴性生物轉(zhuǎn)化以獲得與沒有優(yōu)化NADPH的菌株相比具有更高生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)率的用途。
生物轉(zhuǎn)化將使用根據(jù)本發(fā)明定義的菌株進(jìn)行，其中將表達(dá)編碼那些催化NADPH依賴性反應(yīng)的酶活性的基因。那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以輕易地鑒定這些酶。其中包括下列酶EC 1.1.1.10L-木酮糖還原酶、EC 1.1.1.21甲基乙二醛還原酶、EC1.1.1.513(或17)β-羥基類固醇脫氫酶、EC 1.1.1.54烯丙基醇脫氫酶、EC 1.1.1.80異丙醇脫氫酶、EC 1.1.1.134dTDP-6-脫氧-L-塔羅糖4-脫氫酶、EC 1.1.1.14920α-羥基類固醇脫氫酶、EC 1.1.1.15121-羥基類固醇脫氫酶、EC 1.1.1.189前列腺素-E29-還原酶、EC 1.1.1.191吲哚-3-乙醛還原酶、EC 1.1.1.207(-)-薄荷醇脫氫酶、EC1.1.1.234黃烷酮4-還原酶、EC 1.2.1.50長鏈脂肪?；o酶A還原酶、EC 1.3.1.4可的松α-還原酶、EC 1.3.1.23膽甾烯酮5β-還原酶、EC 1.3.1.70Δ14-甾醇還原酶、EC1.4.1.122，4-二氨基戊酸脫氫酶、EC 1.5.1.10形成L-谷氨酸的酵母氨酸脫氫酶、EC1.7.1.6偶氮苯還原酶、EC 1.8.1.52-氧代丙基-CoM還原酶(羧化)、EC 1.10.1.1反苊-1，2-二醇脫氫酶、EC 1.14.13.7苯酚2-單加氧酶、EC 1.14.13.12苯甲酸4-單加氧酶、EC 1.14.13.26磷脂酰膽堿12-單加氧酶、EC 1.14.13.644-羥基苯甲酸1-羥化酶、EC 1.14.13.70甾醇14-脫甲基酶、EC 1.16.1.5水合鈷胺素(aquacobalamine)還原酶、EC 1.17.1.1CDP-4-脫氫-6-脫氧葡萄糖還原酶、EC 1.18.1.2鐵氧還蛋白-NADP還原酶。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)感興趣物質(zhì)的方法，該物質(zhì)由包括至少一個NADPH依賴性反應(yīng)的生物合成途徑形成，其特征在于，它包括下列步驟a)使根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的微生物培養(yǎng)物在合適的促進(jìn)其生長的培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)基中包含通過發(fā)酵或生物轉(zhuǎn)換進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化必需的物質(zhì)，NADPH除外。
b)從培養(yǎng)基中提取感興趣物質(zhì)，如果必要進(jìn)行純化。
優(yōu)選地，感興趣物質(zhì)可以是氨基酸、維生素、甾醇、類黃酮、脂肪酸、有機(jī)酸、多元醇或羥基酯。氨基酸和它們的前體具體包括賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、谷氨酸、高絲氨酸、異亮氨酸和纈氨酸。維生素和它們的前體具體包括泛酸(pantoate)、反-鏈孢紅素、葉綠醌和生育酚。甾醇具體包括角鯊烯、膽固醇、睪酮、黃體酮和可的松。類黃酮具體包括羥苯基丁酮和vestitone。有機(jī)酸包括香豆酸和3-羥基丙酸。多元醇包括山梨醇、木糖醇和甘油。羥基酯包括3-羥基丁酸乙酯和4-氯-3-羥基丁酸乙酯。
在生物轉(zhuǎn)換情況下，方法還包括添加待轉(zhuǎn)化底物的合適的培養(yǎng)基。
上述在根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟b)中提及的培養(yǎng)基包含至少一種可同化的碳水化合物，其可以是多種可同化糖的任一種，例如葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、糖蜜或這些糖的副產(chǎn)品。特別優(yōu)選的簡單碳源是葡萄糖。另一種優(yōu)選的簡單碳源是蔗糖。培養(yǎng)基還可以包含一種或多種有利于微生物生長和/或感興趣物質(zhì)生成的物質(zhì)(例如氨基酸、維生素或礦質(zhì)鹽)。具體而言，大腸桿菌的礦物培養(yǎng)基可以含有與M9培養(yǎng)基(Anderson，1946，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32120-128)、M63培養(yǎng)基(Miller，1992；A Short Course in Bacterial GeneticsA Laboratory Manual and Handbook forEscherichia coli and Related Bacteria，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York)或Schaefer等描述的培養(yǎng)基(1999，Anal.Biochem.27088-96)同樣或近似的組成。
生物轉(zhuǎn)化條件由那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員設(shè)定。具體而言，微生物在20-55℃之間的溫度發(fā)酵，優(yōu)選25-40℃之間的溫度，并且對于釀酒酵母優(yōu)選約30℃，對于大腸桿菌優(yōu)選約37℃。
下列實(shí)施例僅限于舉例說明，決不限制實(shí)施方案或本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1計算由乙酰乙酸乙酯向3-羥基丁酸乙酯的生物轉(zhuǎn)換的理論最佳產(chǎn)量a)使用大腸桿菌進(jìn)行生物轉(zhuǎn)換預(yù)測建模使用算法MetOpt-Coli進(jìn)行，這是由METabolic EXplorer公司研發(fā)的化學(xué)計量學(xué)模型，用這種模型可以確定1)由乙酰乙酸乙酯向3-羥基丁酸乙酯的最大生產(chǎn)量，和2)滿足對細(xì)胞生長和達(dá)到最大生物轉(zhuǎn)換產(chǎn)率必需的生長和氧化還原平衡需要的葡萄糖最佳流量分配。
模型變量的具體設(shè)置為1)葡萄糖輸入流量為3mmol.g-1.h-1，2)生長速率變量為0、0.15和0.25h-1，3)膜結(jié)合轉(zhuǎn)氫酶流量變量(pntAB)小于或等于1mmol.g-1.h-1；膜結(jié)合轉(zhuǎn)氫酶流量的限制值根據(jù)文獻(xiàn)確定(Hanson，1979；Anderlund et al.，1999；Emmerling et al.，2002)，和4)維持流量限制在5-22mmol.g-1.h-1之間。
在所有情況下模型建議刪除udhA和qor基因。然而實(shí)際上，大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor)]不提供與理論最佳產(chǎn)率相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)率，這是由于很難維持碳流量在戊糖磷酸途徑和糖酵解之間的合理分配，根據(jù)生長速率這種分配是變化的。因此，實(shí)際上，優(yōu)選大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)]或[Δ(udhA，qor，pgi)]，它們之間的選擇依賴于生物轉(zhuǎn)換過程中菌株的生長速率。
對于根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的不同大腸桿菌菌株計算由乙酰乙酸乙酯向3-羥基丁酸乙酯生物轉(zhuǎn)換的理論最佳產(chǎn)率。
優(yōu)化NADP+還原能力的大腸桿菌菌株將乙酰乙酸乙酯生物轉(zhuǎn)換為3-羥基丁酸乙酯的理論最佳產(chǎn)率(摩爾/摩爾葡萄糖)為了進(jìn)一步提高根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的菌株的理論最佳產(chǎn)率，還可以進(jìn)行另外的修飾，例如超表達(dá)至少一個基因，它們可以是zwf、gnd、pntA、pntB或icd，和/或刪除至少一個基因，它們可以是edd、aceA、aceB或aceK。
b)使用釀酒酵母進(jìn)行生物轉(zhuǎn)換預(yù)測建模使用算法MetOpt-Scere進(jìn)行，這是由本公司研發(fā)的化學(xué)計量學(xué)模型，用這種模型可以確定1)由乙酰乙酸乙酯向3-羥基丁酸乙酯的最大產(chǎn)率，并且2)為滿足對細(xì)胞生長和達(dá)到最大生物轉(zhuǎn)換產(chǎn)率必需的生長和氧化還原平衡需要的葡萄糖最佳流量分配。
模型變量的具體設(shè)置為1)葡萄糖輸入流量為3mmol.g-1.h-1，2)生長速率變量為0、0.15和0.25h-1，3)維持流量小于或等于22mmol.g-1.h-1，4)醛脫氫酶反應(yīng)(ALD2、ALD3、ALD6)是不可逆的，并且設(shè)定方向?yàn)橐宜?NAD(P)H→乙醛+NAD(P)，和5)沒有與udhA或phtA，B相當(dāng)?shù)幕钚浴?br> 模型允許區(qū)隔化線粒體和過氧化物酶體。
所有情況下，模型建議刪除編碼氧化NADPH的酶的基因，尤其是基因ZTA1。然而實(shí)際上，釀酒酵母菌株[ΔZTA1]不提供與理論最佳產(chǎn)率相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)率，這是由于很難維持碳流量在戊糖磷酸途徑和糖酵解之間的合理分配，因?yàn)檫@種分配是隨生長速率變化的。實(shí)際上優(yōu)選使用釀酒酵母菌株[Δ(ZTA1，PFK1，PFK2)]或[Δ(ZTA1，PGI1)]，它們之間的選擇依賴于生物轉(zhuǎn)化過程中菌株的生長速率。
對于根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的不同釀酒酵母菌株計算由乙酰乙酸乙酯向3-羥基丁酸乙酯生物轉(zhuǎn)換的理論最佳產(chǎn)率。
優(yōu)化NADP+還原能力的釀酒酵母菌株將乙酰乙酸乙酯生物轉(zhuǎn)換為3-羥基丁酸乙酯的理論最佳產(chǎn)率(摩爾/摩爾葡萄糖)為了進(jìn)一步提高根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的菌株的理論最佳產(chǎn)率，還可以進(jìn)行另外的修飾，例如超表達(dá)至少一個基因，它們可以是ZWF、SOL1、SOL2、SOL3、SOL4、GND1、GND2、IDP1、IDP2或IDP3，和/或刪除至少一個基因，它們可以是ICL1或DAL7。
實(shí)施例2大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor)]的構(gòu)建udhA基因的滅活通過同源重組實(shí)現(xiàn)，使用Datsenko和Wanner描述的方法(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCRproducts，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，976640-6645)。
該方法包括插入抗生素(氯霉素)抗性盒并同時刪除大多數(shù)相關(guān)基因。為此目的合成一對寡核苷酸，每個包含100pb組成，其中80pb(小寫)和待刪除基因同源，20pb(大寫)和氯霉素抗性盒同源。
DudhAFggtgcgcgcgtcgcagttatcgagcgttatcaaaatgttggcggcggttgcacccactggggcaccatcccgtcgaaagcCATATGAATATCCTCCTTAGDudhARCccagaatctcttttgtttcccgatggaacaaaattttcagcgtgcccacgttcatgccgacgatttgtgcgcgtgccagTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG質(zhì)粒pKD3攜帶的抗生素盒通過使用寡核苷酸DudhAF和DudhAR的PCR進(jìn)行擴(kuò)增。獲得的PCR產(chǎn)物隨后通過電穿孔導(dǎo)入大腸桿菌菌株[pKD46]，該菌株攜帶編碼Red重組酶的基因，這是一種催化同源重組的酶。隨后選擇氯霉素抗性轉(zhuǎn)化子，并通過使用寡核苷酸UdhAF和UdhAR的PCR分析檢查抗性盒的插入。
UdhaFGgccgctcaggatatagccagataaatgacUdhaRGcgggatcactttactgccagcgctggctg隨后除去氯霉素抗性盒。為此，將攜帶作用于氯霉素抗性盒FRT位點(diǎn)的FLP重組酶的質(zhì)粒pCP20通過電穿孔導(dǎo)入重組體菌株。一系列的42℃溫度下的培養(yǎng)之后，抗生素抗性盒的缺失通過使用寡核苷酸UdhAF和UdhAR的PCR分析進(jìn)行檢測。
基因qor的滅活通過相同方法用下列寡核苷酸進(jìn)行DqorFggtggcccggaagtacttcaagccgtagagttcactcctgccgatccggcggagaatgaaatccaggtcgaaaataaagcCATATGAATATCCTCCTTAGDqorRcgcccggctttccagaatctcatgcgcacgctgcgcatccttcagcggatatttctgctgctcggcgacatcgaccttaaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGQorFCgcccaacaccgactgctccgcttcgatcgQorRcagcgttatgaccgctggcgttactaaggg因?yàn)閷?shí)踐的原因同時刪除兩個基因是有用的。為此，每個基因用不同的抗生素抗性盒替換(例如udhA對氯霉素和qor對卡那霉素)。
這樣獲得的是大腸桿菌[Δ(udhA，qor)]。
實(shí)施例3構(gòu)建質(zhì)粒pSK-PgapA-GRE2p，導(dǎo)入大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor)]并將乙酰乙酸乙酯生物轉(zhuǎn)換為3-羥基丁酸乙酯質(zhì)粒pSK-PgapA是通過在載體pBluescript-SK(pSK)中插入啟動子gapA構(gòu)建的。為此，大腸桿菌的啟動子gapA通過聚合酶Pwo從染色體DNA擴(kuò)增。
然后將獲得的PCR產(chǎn)物用限制酶HindIII消化并與經(jīng)限制酶HindIII消化和去磷酸化的載體pSK連接，得到質(zhì)粒pSK-PgapA。載體pSK載有大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)和氨芐青霉素抗性基因。
質(zhì)粒pSK-PgapA隨后導(dǎo)入大腸桿菌DH5α來驗(yàn)證構(gòu)建。質(zhì)粒pSK-PgapA中啟動子gapA隨后使用寡核苷酸通用M13正向引物測序來確認(rèn)該構(gòu)建。
質(zhì)粒pSK-PgapA-GRE2p通過在質(zhì)粒pSK-PgapA中插入基因GRE2p構(gòu)建。為此，釀酒酵母的基因GRE2p通過聚合酶Pwo使用下列寡核苷酸從染色體DNA擴(kuò)增。
Ome119_GRE2F(NdeI)AcgtacgtggcatatgtcagtcagttttcgtttcaggtgctaacgggOme120_GRE2R(PstI)Acgtacctgcagttatattctgccctcaaattttaaaatttggg獲得的PCR產(chǎn)物隨后通過限制酶NdeI-PstI消化并與經(jīng)限制酶NdeI-PstI消化和去磷酸化的載體pSK-PgapA連接，得到質(zhì)粒pSK-PgapA-GRE2p。質(zhì)粒pSK-PgapA載有大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)和氨芐青霉素抗性基因。
質(zhì)粒pSK-PgapA-GRE2p隨后導(dǎo)入大腸桿菌DH5α來驗(yàn)證構(gòu)建。質(zhì)粒pSK-PgapA-GRE2p中的基因GRE2p隨后使用寡核苷酸通用M13反向引物和通用M13正向引物測序來確認(rèn)此構(gòu)建。
已驗(yàn)證的質(zhì)粒通過電穿孔導(dǎo)入大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor)](實(shí)施例2)。
隨后使獲得的大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor)pSK-PgapA-GRE2p]在含有葡萄糖和乙酰乙酸乙酯的基本培養(yǎng)基中生長。大腸桿菌菌株[pSK-PgapA-GRE2p]也在同樣條件下生長。
當(dāng)完成生長時比較下列變量-每個菌株在生物轉(zhuǎn)換階段的生物量的時間曲線。
-胞外培養(yǎng)基中生成的3-羥基丁酸乙酯的量。
-細(xì)胞內(nèi)積聚的3-羥基丁酸乙酯的量。
-3-羥基丁酸乙酯的生產(chǎn)速率。
-葡萄糖/3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)率。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor)pSK-PgapA-GRE2p]得到的3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)量大于未優(yōu)化菌株。
實(shí)施例4大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi)pSK-PgapA-GRE2p]的構(gòu)建和乙酰乙酸乙酯向3-羥基丁酸乙酯的生物轉(zhuǎn)換基因pgi的滅活是在大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor)](實(shí)施例2)中使用實(shí)施例2描述的方法進(jìn)行的，并用下列寡核苷酸DpgiFccaacgcagaccgctgcctggcaggcactacagaaacacttcgatgaaatgaaagacgttacgatcgccgatctttttgcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGDpgiRgcgccacgctttatagcggttaatcagaccattggtcgagctatcgtggctgctgatttctttatcatctttcagctctgCATATGAATATCCTCCTTAGpgiFgcggggcggttgtcaacgatggggtcatgcpgiRcggtatgatttccgttaaattacagacaag構(gòu)建在豐富培養(yǎng)基(例如LB培養(yǎng)基)中進(jìn)行。質(zhì)粒pSK-PgapA-GRE2p隨后通過電穿孔導(dǎo)入獲得的菌株(實(shí)施例3)，產(chǎn)生的大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi)pSK-PgapA-GRE2p]在豐富培養(yǎng)基上選出。
上面獲得的菌株隨后在包含葡萄糖和乙酰乙酸乙酯的基本培養(yǎng)基上生長。大腸桿菌菌株[pSK-PgapA-GRE2p]在相同條件下生長。
當(dāng)完成生長時比較下列變量-每個菌株在生物轉(zhuǎn)換階段的生物量時間曲線。
-胞外培養(yǎng)基中生成的3-羥基丁酸乙酯的量。
-細(xì)胞內(nèi)積聚的3-羥基丁酸乙酯的量。
-3-羥基丁酸乙酯的生產(chǎn)速率。
-葡萄糖/3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)率。
已經(jīng)觀察到大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi)pSK-PgapA-GRE2p]得到的3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)量大于未優(yōu)化菌株。
實(shí)施例5大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi，edd)pSK-PgapA-GRE2p]的構(gòu)建和乙酰乙酸乙酯向3-羥基丁酸乙酯的生物轉(zhuǎn)換基因edd的滅活是在大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi)](實(shí)施例4)中使用實(shí)施例2描述的方法進(jìn)行的，并用下列寡核苷酸DeddF(1932582-1932499)CgcgcgagactcgctctgcttatctcgcccggatagaacaagcgaaaacttcgaccgttcatcgttcgcagttggcatgcggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGDeddR(1930866-1930943)cgcaaggcgctgaataattcacgtcctgttcccacgcgtgacgcgctcaggtcaggaatgtgcggttcgcgagcagccCATATGAATATCCTCCTTAGEddF(1932996-1932968)GggtagactccattactgaggcgtgggcgEddR(1930439-1930462)Ccccggaatcagaggaatagtccc構(gòu)建在豐富培養(yǎng)基(例如LB培養(yǎng)基)中進(jìn)行。質(zhì)粒pSK-PgapA-GRE2p隨后通過電穿孔導(dǎo)入獲得的菌株大腸桿菌[Δ(udhA，qor，pgi，edd)](實(shí)施例3)，產(chǎn)生的大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi，edd)pSK-PgapA-GRE2p]在豐富培養(yǎng)基上選出。
上面獲得的菌株大腸桿菌[Δ(udhA，qor，pgi，edd)pSK-PgapA-GRE2p]隨后在包含葡萄糖和乙酰乙酸乙酯的基本培養(yǎng)基上生長。大腸桿菌菌株[pSK-PgapA-GRE2p]在相同條件下生長。
當(dāng)完成生長時比較下列變量-每個菌株在生物轉(zhuǎn)換階段的生物量時間曲線。
-胞外培養(yǎng)基中生成的3-羥基丁酸乙酯的量。
-細(xì)胞內(nèi)積聚的3-羥基丁酸乙酯的量。
-3-羥基丁酸乙酯的生產(chǎn)速率。
-葡萄糖/3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)率。
我們觀察到大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi，edd)pSK-PgapA-GRE2p]的3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)量大于未優(yōu)化菌株。
實(shí)施例6大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)pSK-PgapA-GRE2p]的構(gòu)建和乙酰乙酸乙酯向3-羥基丁酸乙酯的生物轉(zhuǎn)換基因pfkA和pfkB的滅活是在大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor)](實(shí)施例2)中使用實(shí)施例2描述的方法和下列寡核苷酸進(jìn)行的
DpfkAFggt gtg ttg aca agc ggc ggt gat gcg cca ggc atg aac gcc gca att cgc ggg gtt cgt tct gcg ctgaca gaa ggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGDpfkARTtcgcgcagtccagccagtcacctttgaacggacgcttcatgttttcgatagcgtcgatgatgtcgtggtgaaccagctgCATATGAATATCCTCCTTAGPfkAFCgcacgcggcagtcagggccgacccgcPfkARccctacgccccacttgttcatcgcccgDpfkBF(1804421-1804499)gcgccctctctcgatagcgcaacaattaccccgcaaatttattcccgaaggaaaactgcgctgtaccgcaccggtgttcgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGDpfkBR(1805320-1805241)gcgggaaaggtaagcgtaaattttttgcgtatcgtcatgggagcacagacgtgttccctgattgagtgtggctgcactccCATATGAATATCCTCCTTAGPfkBF(1803996-1804025)tggcaggatcatccatgacagtaaaaacggPfkBR(1805657-1805632)gccggttgcactttgggtaagccccg構(gòu)建在豐富培養(yǎng)基(例如LB培養(yǎng)基)中進(jìn)行。質(zhì)粒pSK-PgapA-GRE2p隨后通過電穿孔導(dǎo)入獲得的菌株大腸桿菌[Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)](實(shí)施例3)，產(chǎn)生的大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)pSK-PgapA-GRE2p]在豐富培養(yǎng)基上選出。
上面獲得的菌株大腸桿菌[Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)pSK-PgapA-GRE2p]隨后在包含葡萄糖和乙酰乙酸乙酯的基本培養(yǎng)基上生長。大腸桿菌菌株[pSK-PgapA-GRE2p]在相同條件下生長。
當(dāng)完成生長時比較下列變量-每個菌株在生物轉(zhuǎn)換階段的生物量時間曲線。
-胞外培養(yǎng)基中生成的3-羥基丁酸乙酯的量。
-細(xì)胞內(nèi)積聚的3-羥基丁酸乙酯的量。
-3-羥基丁酸乙酯的生產(chǎn)速率。
-葡萄糖/3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)率。
我們觀察到大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor，pfkA，pfkB)pSK-PgapA-GRE2p]的3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)量大于未優(yōu)化菌株。
實(shí)施例7大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi，lpd)plpd*，pSK-PgapA-GRE2p]的構(gòu)建和乙酰乙酸乙酯向3-羥基丁酸乙酯的生物轉(zhuǎn)換除了初始菌株用實(shí)施例4中描述的大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi)]代替野生菌株以外，使用實(shí)施例2描述的方法刪除編碼NAD依賴性的二氫硫辛酰胺脫氫酶的基因lpd，該酶參與丙酮酸鹽脫氫酶多酶復(fù)合體。修飾后菌株的構(gòu)建和選擇在豐富培養(yǎng)基(例如LB培養(yǎng)基)中進(jìn)行。獲得的菌株是大腸桿菌[Δ(udhA，qor，pgi，lpd)]。
另外構(gòu)建質(zhì)粒p-lpd*，該質(zhì)粒允許超表達(dá)NADP依賴性二氫硫辛酰胺脫氫酶。有多種修飾酶輔因子專一性的可能方式。例如，Bocanegra et al.(1993)報道了創(chuàng)建NADP依賴性二氫硫辛酰胺脫氫酶的一種方法。
質(zhì)粒p-lpd*和pSK-PgapA-GRE2p隨后通過電穿孔導(dǎo)入大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi，lpd)]。作為替代方案，lpd*可以克隆到pSK-PgapA-GRE2p上，得到的質(zhì)粒pSK-PgapA-GRE2p-lpd*隨后通過電穿孔導(dǎo)入大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi，lpd)]。修飾后菌株的構(gòu)建和選擇是在豐富培養(yǎng)基(例如LB)中進(jìn)行。
獲得的大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi，lpd)pSK-PgapA-GRE2p，p-lpd*]隨后在包含葡萄糖和乙酰乙酸乙酯的基本培養(yǎng)基上生長。大腸桿菌菌株[pSK-PgapA-GRE2p]在相同條件下生長。
當(dāng)完成生長時比較下列變量-每個菌株在生物轉(zhuǎn)換階段的生物量時間曲線。
-胞外培養(yǎng)基中生成的3-羥基丁酸乙酯的量。
-細(xì)胞內(nèi)積聚的3-羥基丁酸乙酯的量。
-3-羥基丁酸乙酯的生產(chǎn)速率。
-葡萄糖/3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)率。
我們觀察到大腸桿菌菌株[Δ(udhA，qor，pgi，lpd)pSK-PgapA-GRE2p，p-lpd*]的3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)量大于未優(yōu)化菌株。
實(shí)施例8質(zhì)粒pRSGK-GRE2p的構(gòu)建質(zhì)粒pYGK通過在載體pBluescript-SK(pSK)中插入載體pYPG2的啟動子Ppgk、多克隆位點(diǎn)和終止子cyc1構(gòu)建。為此，啟動子Ppgk、多克隆位點(diǎn)和終止子cvc1使用聚合酶Pfu Turbo從載體pYPG2擴(kuò)增。獲得的PCR產(chǎn)物隨后使用限制酶SacII-NotI消化，并與使用限制酶ApaI-SmaI消化、連接、用限制酶NotI-ScaII消化并去磷酸化的載體pSK連接，得到質(zhì)粒pYGK。
質(zhì)粒pYGK隨后導(dǎo)入大腸桿菌菌株DH5α來檢驗(yàn)構(gòu)建。質(zhì)粒pYGK的啟動子Ppgk、多克隆位點(diǎn)和終止子cycl使用寡核苷酸通用M13反向引物和通用M13正向引物測序以確定構(gòu)建。
質(zhì)粒pYGK-GRE2p通過在質(zhì)粒pYGK中插入基因GRE2p構(gòu)建。為此，釀酒酵母的基因GRE2p使用聚合酶Pwo從染色體DNA擴(kuò)增，其中使用下列寡核苷酸
Ome376_Gre2 pYGK F(SmaI)AcgtacgtcccccgggaaaatgtcagttttcgtttcaggtgcOme377_Gre2 pYGK R(ApaI)ACGTACGGGCCCTTATATTCTGCCCTCAAATTTTAAAATTGGG獲得的PCR產(chǎn)物隨后使用限制酶ApaI-SmaI消化，并與經(jīng)限制酶ApaI-SmaI消化和去磷酸化的載體pYGK連接，得到質(zhì)粒pYGK-GRE2p。
質(zhì)粒pYGK-GRE2p隨后導(dǎo)入大腸桿菌菌株DH5α來檢驗(yàn)構(gòu)建。質(zhì)粒pYGK-GRE2p的基因GRE2p使用寡核苷酸通用M13反向引物和通用M13正向引物測序以確定構(gòu)建。
通過使用限制酶NotI-SacII消化質(zhì)粒pYGK-GRE2p和pRS426，然后連接，最終獲得質(zhì)粒pRSGK-GRE2p。
實(shí)施例9釀酒酵母菌株[Δ(ZTA1)pRSGK-GRE2p]的構(gòu)建和乙酰乙酸乙酯向3-羥基丁酸乙酯的生物轉(zhuǎn)換基因ZTA1的滅活是通過插入標(biāo)記(抗生素抗性，營養(yǎng)缺陷型)同時刪除大多數(shù)相關(guān)基因進(jìn)行的。使用的技術(shù)如Brachmann et al.描述(Designer deletion strainsderived from Saccharomyes cerevisae S288Ca useful set of strains and plasmids forPCR-mediated gene disruption and other applications，Yeast，1998，14115-32)。也可以使用Wach et al.描述的方法(New heterologous modules for classical orPCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae，Yeast，1994，101793-1808)。
在所有情況下獲得最終釀酒酵母菌株[Δ(ZTA1)]，然后向其中導(dǎo)入質(zhì)粒pRSGK-GRE2p(實(shí)施例8)。
作為替代方案，還可以將質(zhì)粒pRSGK-GRE2p導(dǎo)入可用的Δ(ZTA1)菌株，例如菌株EUROSCARF Y33183(基因型BY4743；Mat a/α；his3D1/his3D1；leu2D0/leu2D0；lys2d0/LYS2；MET15/met15D0；ura3D0/ura3D0；YBR046c::kanMX4/YBR046c::kanMX4)。之后可以在孢子形成以后回收釀酒酵母純合體菌株[Δ(ZTA1)pRSGK-GRE2p]。
獲得的釀酒酵母菌株[Δ(ZTA1)pRSGK-GRE2p]隨后在包含葡萄糖和乙酰乙酸乙酯的基本培養(yǎng)基上生長。
釀酒酵母對照菌株[pRSGK-GRE2p]在同樣條件下生長。
當(dāng)完成生長時比較下列變量-每個菌株在生物轉(zhuǎn)換階段的生物量時間曲線。
-胞外培養(yǎng)基中生成的3-羥基丁酸乙酯的量。
-細(xì)胞內(nèi)積聚的3-羥基丁酸乙酯的量。
-3-羥基丁酸乙酯的生產(chǎn)速率。
-葡萄糖/3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)率。
我們發(fā)現(xiàn)釀酒酵母菌株[Δ(ZTA1)pRSGK-GRE2p]的3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)量大于未優(yōu)化菌株。
實(shí)施例10釀酒酵母菌株[Δ(ZTA1，PGI1)pRSGK-GRE2p]的構(gòu)建和乙酰乙酸乙酯向3-羥基丁酸乙酯的生物轉(zhuǎn)換基因PGI1的滅活在釀酒酵母[Δ(ZTA1)pRSGK-GRE2p]中使用實(shí)施例9描述的方法和下列寡核苷酸進(jìn)行
Dpgi1FCCAACGCAGACCGCTGCCTGGCAGGCACTACAGAAACACTTCGATGAAATGAAAGACGTTACGATCGCCGATCTTTTTGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGDpgi1RGCGCCACGCTTTATAGCGGTTAATCAGACCATTGGTCGAGCTATCGTGGCTGCTGATTTCTTTATCATCTTCAGCTCTGCATATGAATATCCTCCTTAGPgi1FGCGGGGCGGTTGTCAACGATGGGGTCATGCPgi1RCGGTATGATTTCCGTTAAATTACAGACAAG作為替代方案，可以使用可用的Δ(PGI1)菌株，例如菌株EUROSCARF Y23336(Mat a/α；his3D1/his3D1；leu2D0/leu2D0；lys2D0/LYS2；MET15/met15D0；ura3D0/ura3D0；YBR196c::kanMX4/YBR196c)。該菌株隨后用質(zhì)粒pRSGK-GRE2p轉(zhuǎn)換(實(shí)施例8)，并且使用實(shí)施例9描述的方法刪除基因ZTA1。
獲得的釀酒酵母菌株[Δ(ZTA1，PGI1)pRSGK-GRE2p]隨后在包含葡萄糖和乙酰乙酸乙酯的基本培養(yǎng)基上生長。
釀酒酵母對照菌株[pRSGK-GRE2p]在同樣條件下生長。
當(dāng)完成生長時比較下列變量-每個菌株在生物轉(zhuǎn)換階段的生物量時間曲線。
-胞外培養(yǎng)基中生成的3-羥基丁酸乙酯的量。
-細(xì)胞內(nèi)積聚的3-羥基丁酸乙酯的量。
-3-羥基丁酸乙酯的生產(chǎn)速率。
-葡萄糖/3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)率。
我們發(fā)現(xiàn)釀酒酵母菌株[Δ(ZTA1，PGI1)pRSGK-GRE2p]的3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)量大于未優(yōu)化菌株。
實(shí)施例11釀酒酵母菌株[Δ(ZTA1，PFK1，PFK2)pRSGK-GRE2p]的構(gòu)建和乙酰乙酸乙酯向3-羥基丁酸乙酯的生物轉(zhuǎn)換使用實(shí)施例9描述的方法和下列寡核苷酸刪除釀酒酵母菌株[Δ(ZTA1)]中的基因PFK1和PFK2，Dpfk1FATGCAATCTCAAGATTCATGCTACGGTGTTGCATTCAGATCTATCATCACAAATGATGAAAAGCTTCGTACGCTGCAGGTCGDpfk1RTTTGTTTTCAGCGGCTAAAGCGGCTACCTCAGCTCTCAACTTTAATCTACCGGACAGGATGGGCCACTAGTGGATCTGATATCPfk1 int FGCTTTCTTAGAAGCTACCTCCGPfk1 int RGAACCGACAAGACCAACAATGGPfk2 int FCAGTTGTACACTTTGGACCCPfk2 int RGATCAGCACCAGTCAAAGAACC該菌株隨后用質(zhì)粒pRSGK-GRE2p轉(zhuǎn)換(實(shí)施例8)。
獲得的釀酒酵母菌株[Δ(ZTA1，PFK1，PFK2)pRSGK-GRE2p]隨后在包含葡萄糖和乙酰乙酸乙酯的基本培養(yǎng)基上生長。
釀酒酵母對照菌株[pRSGK-GRE2p]在同樣條件下生長。
當(dāng)完成生長時比較下列變量-每個菌株在生物轉(zhuǎn)換階段的生物量時間曲線。
-胞外培養(yǎng)基中生成的3-羥基丁酸乙酯的量。
-細(xì)胞內(nèi)積聚的3-羥基丁酸乙酯的量。
-3-羥基丁酸乙酯的生產(chǎn)速率。
-葡萄糖/3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)率。
我們發(fā)現(xiàn)釀酒酵母菌株[Δ(ZTA1，PFK1，PFK2)pRSGK-GRE2p]的3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)量大于未優(yōu)化菌株。
實(shí)施例12使用優(yōu)化大腸桿菌生產(chǎn)3-羥基丁酸乙酯的代謝模型比較實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測值我們發(fā)現(xiàn)預(yù)測性建模(實(shí)施例1)和實(shí)施例3、4、5、6、7、9、10和11中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果緊密相關(guān)。
上面的實(shí)施例1-11是本發(fā)明的具體應(yīng)用，并不限制本發(fā)明的范圍。那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以輕易的適應(yīng)性改變這些實(shí)施例，用于由NADPH依賴性合成形成的物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化。驗(yàn)證了算法MetOpt和通過優(yōu)化NADPH/NADP+比率來優(yōu)化NADPH依賴性生物轉(zhuǎn)化過程的策略；因此本專利要求保護(hù)所有可以使用MetOpt或其任何派生物建模和預(yù)測的、使用大腸桿菌、釀酒酵母或任何其它微生物進(jìn)行NADPH依賴性生物轉(zhuǎn)化的應(yīng)用。
實(shí)施例13大腸桿菌發(fā)酵過程中理論最佳產(chǎn)量的計算實(shí)施例12顯示本公司研發(fā)的MetOpt模型可用于生物轉(zhuǎn)換，并將更普遍的用于生物轉(zhuǎn)化，例如發(fā)酵。
例如，MetOpt-Coli模型應(yīng)用于通過在根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的大腸桿菌菌株內(nèi)發(fā)酵葡萄糖來生產(chǎn)半胱氨酸或3-羥基丙酸。使用的參數(shù)和實(shí)施例1中相同，也就是1)葡萄糖輸入流量3mmol.g-1.h-1，2)生長速率變量0、0.15和0.25h-1，3)膜結(jié)合轉(zhuǎn)氫酶流量(pbtAB)變量小于或等于1mmol.g-1.h-1；膜結(jié)合轉(zhuǎn)氫酶流量的限制值根據(jù)文獻(xiàn)確定(Hanson，1979；Anderlund et al.，1999；Emmerling et al.，2002)，和4)維持流量限制于5-22mmol.g-1.h-1之間。
a)通過葡糖糖發(fā)酵生產(chǎn)半胱氨酸的情況
優(yōu)化NADP+還原能力的大腸桿菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)半胱氨酸的理論最佳產(chǎn)率(摩爾/摩爾葡萄糖)為了進(jìn)一步提高根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的菌株的理論最佳產(chǎn)率，可以進(jìn)行另外的修飾，例如超表達(dá)至少一個基因，它們可以是zwf、gnd、pntA、pntB或icd，和/或刪除至少一個基因，它們可以是edd、aceA、aceB或aceK。
實(shí)際上，為了獲得這樣的產(chǎn)率必須對根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的菌株做其它修飾，例如如專利WO0127307描述的超表達(dá)基因cysB，或如專利EP0885962描述的修飾基因cvsE。
b)通過葡糖糖發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸的情況生產(chǎn)3-羥基丙酸在含有編碼3-羥基丙酸合成途徑酶的基因的大腸桿菌菌株內(nèi)進(jìn)行，所述酶例如綠色絲狀菌(Chloroflexus aurantiacus)的丙二酰輔酶A還原酶(Hügler et al.，Journal of Bacteriology，2002，1842404-2410)。
優(yōu)化NADP+還原能力的大腸桿菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸的理論最佳產(chǎn)率(摩爾/摩爾葡萄糖)為了進(jìn)一步提高根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的菌株的理論最佳產(chǎn)率，可以進(jìn)行另外的修飾，例如超表達(dá)至少一個基因，它們可以是zwf、gnd、pntA、pntB或icd，和/或刪除至少一個基因，它們可以是edd、aceA、aceB或aceK。
實(shí)施例14釀酒酵母發(fā)酵過程中的理論最佳產(chǎn)量的計算；生產(chǎn)氫化可的松的應(yīng)用實(shí)施例12顯示本公司研發(fā)的MetOpt模型可用于生物轉(zhuǎn)換，并將更普遍的用于生物轉(zhuǎn)化，例如發(fā)酵。
例如，MetOpt-Scere模型應(yīng)用于通過在根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的釀酒酵母菌株內(nèi)經(jīng)葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)氫化可的松。使用的參數(shù)和實(shí)施例1中相同，也就是1)葡萄糖輸入流量3mmol.g-1.h-1，2)生長速率變量0、0.15和0.25h-1，3)維持流量小于或等于22mmol.g-1.h-1，4)醛脫氫酶(ALD2，ALD3，ALD6)的反應(yīng)是不可逆的，并設(shè)置方向?yàn)橐宜?NAD(P)H→乙醛+NAD(P)，和5)沒有與udhA或udhB相當(dāng)?shù)幕钚浴?br> 該模型允許區(qū)隔化線粒體和過氧化物酶體。
此結(jié)果證明了根據(jù)本發(fā)明所做的每個突變對于改進(jìn)NADPH生成以及改進(jìn)氫化可的松生產(chǎn)流量的真實(shí)貢獻(xiàn)。
氫化可的松的生產(chǎn)在含有編碼氫化可的松合成途徑酶的基因的釀酒酵母菌株內(nèi)實(shí)現(xiàn)(Szczebara et al.，2003，Nature biotechnology，21143-149)。
優(yōu)化NADP+還原能力的大腸桿菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)氫化可的松的理論最佳產(chǎn)率(摩爾/摩爾葡萄糖)已經(jīng)刪除了基因PFK1和PFK2的菌株不能生產(chǎn)氫化可的松，甚至可能是沒有活力的。這是因?yàn)闅浠傻乃傻纳a(chǎn)相對于NADPH需求來說更受限于碳需求。一種解決方案是使在酵母內(nèi)弱表達(dá)轉(zhuǎn)氫酶型活性。然而，建模顯示氫化可的松的生產(chǎn)將不會象刪除PGI1基因時那樣高。
為了進(jìn)一步提高根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化的菌株的理論最佳產(chǎn)量，可以進(jìn)行另外的修飾，例如超表達(dá)至少一個基因，它們可以是ZWF、SOL1、SOL2、SOL3、SOL4、GND1、GND2、IDP1、IDP2或IDP3，和/或刪除至少一個基因，它們可以是ICL1或DAL7。
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序列表<110> 代謝探索者公司<120> 優(yōu)化NADPH消耗性生物合成途徑的微生物菌株<130> D21726<150> FR 0313056<151> 2003-11-06<160> 38<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 100<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 1ggtgcgcgcg tcgcagttat cgagcgttat caaaatgttg gcggcggttg cacccactgg 60ggcaccatcc cgtcgaaagc catatgaata tcctccttag 100<210> 2<211> 100<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 2cccagaatct cttttgtttc ccgatggaac aaaattttca gcgtgcccac gttcatgccg 60acgatttgtg cgcgtgccag tgtaggctgg agctgcttcg 100<210> 3<211> 30<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 3ggccgctcag gatatagcca gataaatgac 30<210> 4<211> 30<212> DNA
<213> 合成的寡核苷酸<400> 4gcgggatcac tttactgcca gcgctggctg 30<210> 5<211> 100<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 5ggtggcccgg aagtacttca agccgtagag ttcactcctg ccgatccggc ggagaatgaa 60atccaggtcg aaaataaagc catatgaata tcctccttag 100<210> 6<211> 100<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 6cgcccggctt tccagaatct catgcgcacg ctgcgcatcc ttcagcggat atttctgctg 60ctcggcgaca tcgaccttaa tgtaggctgg agctgcttcg 100<210> 7<211> 30<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 7cgcccaacac cgactgctcc gcttcgatcg 30<210> 8<211> 30<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 8cagcgttatg accgctggcg ttactaaggg 30<210> 9<211> 43<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸
<400> 9acgtacgtgg catatgtcag ttttcgtttc aggtgctaac ggg 43<210> 10<211> 44<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 10acgtacctgc agttatattc tgccctcaaa ttttaaaatt tggg 44<210> 11<211> 100<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 11ccaacgcaga ccgctgcctg gcaggcacta cagaaacact tcgatgaaat gaaagacgtt 60acgatcgccg atctttttgc tgtaggctgg agctgcttcg 100<210> 12<211> 100<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 12gcgccacgct ttatagcggt taatcagacc attggtcgag ctatcgtggc tgctgatttc 60tttatcatct ttcagctctg catatgaata tcctccttag 100<210> 13<211> 30<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 13gcggggcggt tgtcaacgat ggggtcatgc 30<210> 14<211> 30<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 14
cggtatgatt tccgttaaat tacagacaag 30<210> 15<211> 102<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 15cgcgcgagac tcgctctgct tatctcgccc ggatagaaca agcgaaaact tcgaccgttc 60atcgttcgca gttggcatgc ggtgtaggct ggagctgctt cg 102<210> 16<211> 98<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 16cgcaaggcgc tgaataattc acgtcctgtt cccacgcgtg acgcgctcag gtcaggaatg 60tgcggttcgc gagcagccca tatgaatatc ctccttag 98<210> 17<211> 29<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 17gggtagactc cattactgag gcgtgggcg 29<210> 18<211> 24<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 18ccccggaatc agaggaatag tccc24<210> 19<211> 100<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 19ggtgtgttga caagcggcgg tgatgcgcca ggcatgaacg ccgcaattcg cggggttgtt 60
cgttctgcgc tgacagaagg tgtaggctgg agctgcttcg 100<210> 20<211> 100<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 20ttcgcgcagt ccagccagtc acctttgaac ggacgcttca tgttttcgat agcgtcgatg 60atgtcgtggt gaaccagctg catatgaata tcctccttag 100<210> 21<211> 27<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 21cgcacgcggc agtcagggcc gacccgc 27<210> 22<211> 27<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 22ccctacgccc cacttgttca tcgcccg 27<210> 23<211> 99<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 23gcgccctctc tcgatagcgc aacaattacc ccgcaaattt atcccgaagg aaaactgcgc 60tgtaccgcac cggtgttcgt gtaggctgga gctgcttcg99<210> 24<211> 100<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 24gcgggaaagg taagcgtaaa ttttttgcgt atcgtcatgg gagcacagac gtgttccctg 60
attgagtgtg gctgcactcc catatgaata tcctccttag 100<210> 25<211> 30<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 25tggcaggatc atccatgaca gtaaaaacgg 30<210> 26<211> 26<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 26gccggttgca ctttgggtaa gccccg 26<210> 27<211> 43<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 27acgtacgtcc cccgggaaaa atgtcagttt tcgtttcagg tgc 43<210> 28<211> 44<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 28acgtacgggc ccttatattc tgccctcaaa ttttaaaatt tggg 44<210> 29<211> 100<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 29ccaacgcaga ccgctgcctg gcaggcacta cagaaacact tcgatgaaat gaaagacgtt 60acgatcgccg atctttttgc tgtaggctgg agctgcttcg 100<210> 30
<211> 100<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 30gcgccacgct ttatagcggt taatcagacc attggtcgag ctatcgtggc tgctgatttc 60tttatcatct ttcagctctg catatgaata tcctccttag 100<210> 31<211> 30<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 31gcggggcggt tgtcaacgat ggggtcatgc 30<210> 32<211> 30<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 32cggtatgatt tccgttaaat tacagacaag 30<210> 33<211> 82<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 33atgcaatctc aagattcatg ctacggtgtt gcattcagat ctatcatcac aaatgatgaa 60aagcttcgta cgctgcaggt cg 82<210> 34<211> 83<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 34tttgttttca gcggctaaag cggctacctc agctctcaac tttaatctac cggacaggat 60gggccactag tggatctgat atc 83<210> 35
<211> 22<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 35gctttcttag aagctacctc cg 22<210> 36<211> 22<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 36gaaccgacaa gaccaacaat gg 22<210> 37<211> 20<212> DNA<2l3> 合成的寡核苷酸<400> 37cagttgtaca ctttggaccc 20<210> 38<211> 22<212> DNA<213> 合成的寡核苷酸<400> 38gatcagcacc agtcaaagaa cc 2權(quán)利要求
1.微生物菌株，其特征在于，其一種或多種NADPH氧化活性受到限制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的菌株，其特征在于，其一種或多種NADPH氧化活性通過刪除編碼醌氧化還原酶和/或可溶性轉(zhuǎn)氫酶的一個或多個基因而受到限制。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2中任一項(xiàng)的菌株，其特征在于，它還進(jìn)行了促進(jìn)一種或多種其NADP+-還原酶活性的修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的菌株，其特征在于，它刪除了編碼磷酸葡糖異構(gòu)酶和/或磷酸果糖激酶的一個或多個基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的菌株，其特征在于，它還進(jìn)行了編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶和/或甘油醛3-磷酸脫氫酶的一個或多個基因的修飾，使得它優(yōu)先利用NADP。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的菌株，其特征在于，它還超表達(dá)編碼葡萄糖6-磷酸脫氫酶、或6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶、或6-磷酸葡糖酸脫氫酶、或異檸檬酸脫氫酶或膜結(jié)合轉(zhuǎn)氫酶的一個或多個基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的菌株，其特征在于，它還刪除了編碼6-磷酸葡糖酸脫水酶、或蘋果酸合酶、或異檸檬酸裂合酶或異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸酶的一個或多個基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的菌株，其特征在于，它包含編碼參與感興趣物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化的酶的一個或多個內(nèi)源性或外源性基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的菌株，其特征在于，它包含一個或多個選擇標(biāo)記基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的菌株，其特征在于，它選自曲霉屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、埃希氏菌屬、葡萄糖桿菌屬、青霉菌屬、畢赤酵母屬、假單胞菌屬、紅球菌屬、酵母菌屬、鏈霉菌屬、黃單胞菌屬或假絲酵母屬物種。
11.制備根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的優(yōu)化菌株的方法，其特征在于，它包括刪除編碼醌氧化還原酶和/或可溶性轉(zhuǎn)氫酶的一個或多個基因，如果需要，刪除編碼磷酸葡糖異構(gòu)酶、或磷酸果糖激酶、或6-磷酸葡糖酸脫水酶、或蘋果酸合酶、或異檸檬酸裂合酶或異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸酶的一個或多個基因，和/或修飾編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶和/或甘油醛3-磷酸脫氫酶的一個或多個基因，使得它優(yōu)先利用NADP，所述刪除和修飾通過適當(dāng)?shù)姆绞綄?shí)行，和/或超表達(dá)編碼葡萄糖6-磷酸脫氫酶、或6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶、或6-磷酸葡糖酸脫氫酶、或異檸檬酸脫氫酶或膜轉(zhuǎn)氫酶的一個或多個基因，這通過用含有編碼一種或多種參與感興趣物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化的酶的一個或多個基因和/或一個或多個選擇標(biāo)記基因的適當(dāng)載體轉(zhuǎn)換菌株實(shí)現(xiàn)，或通過修飾控制待超表達(dá)基因的內(nèi)源性啟動子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)。
12.生產(chǎn)由包括至少一個NADPH依賴性步驟的生物合成途徑形成的感興趣物質(zhì)的方法，其特征在于，包括以下兩個步驟a)使根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)優(yōu)化的微生物培養(yǎng)物在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中生長，所述培養(yǎng)基促進(jìn)其生長并含有通過發(fā)酵或生物轉(zhuǎn)換進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化必需的物質(zhì)，NADPH除外，b)從培養(yǎng)基中提取感興趣物質(zhì)，如果必要進(jìn)行純化。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于，所述感興趣物質(zhì)是氨基酸、或維生素、或甾醇、或類黃酮、或脂肪酸、或有機(jī)酸、或多元醇或羥基酯。
全文摘要
本發(fā)明涉及優(yōu)化的微生物菌株，用于具有NADPH消耗性生物合成途徑的分子的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)。本發(fā)明的菌株可以用于NADPH消耗性生物轉(zhuǎn)化方法。所述菌株的特征在于一種或多種NADPH氧化活性受到限制。
文檔編號C12P33/00GK1875096SQ200480031980
公開日2006年12月6日 申請日期2004年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月6日
發(fā)明者格旺埃勒·貝斯泰爾－科爾, 塞德里克·布瓦薩爾, 米歇爾·沙托, 邦雅曼·岡薩雷斯, 菲利普·蘇卡耶, 雷納·菲格, 奧利維耶·津克 申請人:代謝探索者公司