專利名稱：產(chǎn)生琥珀酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用細(xì)菌，如棒狀細(xì)菌來產(chǎn)生琥珀酸。
背景技術(shù)：
為了通過發(fā)酵產(chǎn)生包括琥珀酸的非氨基-有機(jī)酸，通常應(yīng)用包括屬于厭氧螺菌屬(Anaerobiospirillum)或放線桿菌屬(Actinobacillus)的那些厭氧細(xì)菌(美國專利5,142,834和美國專利5,504,004，和International Journal of SystematicBacteriology(1999)，49，207-216)。雖然通過應(yīng)用上述厭氧細(xì)菌的產(chǎn)品產(chǎn)量高，但它們的增殖需要許多營養(yǎng)物，而由此必需將大量的有機(jī)氮源，如玉米漿(cornsteep liquor)(CSL)加入培養(yǎng)基。大量有機(jī)氮源的加入不僅導(dǎo)致培養(yǎng)成本的增加而且導(dǎo)致用于分離產(chǎn)品的純化成本的增加，因而上述方法是不經(jīng)濟(jì)的。
此外，本領(lǐng)域已知在好氧條件下培養(yǎng)好氧細(xì)菌，如棒狀桿菌的細(xì)菌以增殖細(xì)菌細(xì)胞，然后收獲和洗滌細(xì)菌細(xì)胞以允許它們作為靜息細(xì)菌在無需通氣的條件下來產(chǎn)生非氨基有機(jī)酸而方法(JP11-113588A和JP11-196888A)。這些方法是經(jīng)濟(jì)的，因?yàn)榧?xì)菌能在含有少量有機(jī)氮的簡單培養(yǎng)基中充分地生長以增殖細(xì)菌細(xì)胞。然而，仍然有根據(jù)所需有機(jī)酸的產(chǎn)生量、其濃度和在每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的產(chǎn)生速率以及產(chǎn)生過程的簡化等等進(jìn)行改善的需要。而且，已經(jīng)報(bào)道應(yīng)用具有增加的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性的細(xì)菌以發(fā)酵產(chǎn)生非氨基有機(jī)酸(例如，JP11-196887A)。然而，關(guān)于應(yīng)用具有增加的延胡索酸還原酶活性的細(xì)菌來產(chǎn)生非氨基有機(jī)酸還沒有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供以更高的生產(chǎn)效率產(chǎn)生琥珀酸的方法本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)為解決上述問題進(jìn)行了廣泛的研究，并發(fā)現(xiàn)通過使經(jīng)過修飾以增加延胡索酸還原酶活性的細(xì)菌或其細(xì)胞處理物與有機(jī)原料在含有碳酸根或碳酸氫根離子或二氧化碳?xì)獾姆磻?yīng)溶液中進(jìn)行反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)有機(jī)原料的消耗速率、琥珀酸的產(chǎn)生速率或其產(chǎn)量的增加，并由此完成了本發(fā)明。
即，根據(jù)本發(fā)明，提供了如下描述的發(fā)明。
(1)產(chǎn)生琥珀酸的方法，其包括使經(jīng)過修飾以增加延胡索酸還原酶活性的細(xì)菌或其細(xì)胞處理物與有機(jī)原料在含有碳酸根離子、碳酸氫根離子或二氧化碳?xì)庵蟹磻?yīng)溶液中進(jìn)行反應(yīng)以生成琥珀酸；和收集所述的琥珀酸。
(2)(1)的方法，其中所述的細(xì)菌選自棒狀細(xì)菌(coryneform bacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌或根瘤菌屬(Rhizobium)細(xì)菌。
(3)(1)或(2)的方法，其中所述細(xì)菌是經(jīng)過修飾以通過應(yīng)用來自棒狀細(xì)菌的琥珀酸脫氫酶基因增加延胡索酸還原酶活性的細(xì)菌。
(4)(1)或(2)的方法，其中所述細(xì)菌是經(jīng)過修飾以通過應(yīng)用來自大腸桿菌的延胡索酸還原酶基因增加延胡索酸還原酶活性的細(xì)菌。
(5)(1)至(4)中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌被進(jìn)一步修飾以將乳酸脫氫酶活性與未修飾的菌株相比減少到10％或更低。
(6)(1)至(5)中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌被進(jìn)一步修飾以增加丙酮酸羧化酶活性。
(7)(1)至(6)中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌或其細(xì)胞處理物與所述有機(jī)原料在厭氧條件下進(jìn)行反應(yīng)。
(8)(1)至(7)中任一項(xiàng)的方法，其中所述有機(jī)原料為葡萄糖。
(9)產(chǎn)生含有琥珀酸的聚合物的方法，其包括通過(1)至(8)中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生琥珀酸，和將得到的琥珀酸進(jìn)行聚合。


圖1顯示構(gòu)建質(zhì)粒pKMB 1的步驟及其限制性內(nèi)切酶圖譜。
圖2顯示構(gòu)建質(zhì)粒pKMB1/ΔLDH的步驟。
圖3顯示構(gòu)建質(zhì)粒pTZ4的步驟。
圖4顯示構(gòu)建質(zhì)粒pMJPC1的步驟。
圖5顯示構(gòu)建質(zhì)粒pFRPC1.1的步驟。
圖6顯示構(gòu)建質(zhì)粒pVKSDH的步驟。
圖7顯示構(gòu)建質(zhì)粒pHSGSDH的步驟。
圖8顯示構(gòu)建質(zhì)粒pSDHPC的步驟。
優(yōu)選的
具體實(shí)施例方式
在下文中，將詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施方案。
能用于本發(fā)明的產(chǎn)生方法的細(xì)菌是經(jīng)過修飾以增加延胡索酸還原酶活性的那些。本文中，術(shù)語“延胡索酸還原酶活性”指催化反應(yīng)的活性，在所述反應(yīng)中延胡索酸通過還原反應(yīng)轉(zhuǎn)化為琥珀酸，而術(shù)語“延胡索酸還原酶活性增加”指與野生型或延胡索酸還原酶-未修飾的菌株相比延胡索酸還原酶活性增加。所述的延胡索酸還原酶活性可通過后面描述的測量K3Fe(CN)6水平下降的方法進(jìn)行測定。大腸桿菌的延胡索酸還原酶是負(fù)責(zé)琥珀酸脫氫酶的逆反應(yīng)的酶，所述的琥珀酸脫氫酶在TCA循環(huán)的順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)中起作用，而且所述的延胡索酸還原酶涉及在好氧條件下的延胡索酸呼吸。有報(bào)道所述基因的表達(dá)在好氧條件下在轉(zhuǎn)錄水平受到抑制(Jones，H.M.，Gunsalus，R.P.，J.Bacteriol.，1985，Vol.164，p1100-1109)。因此可以認(rèn)為，當(dāng)所述延胡索酸還原酶活性過量地增加時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞的生長會(huì)變差。為此，在本發(fā)明中，優(yōu)選在不發(fā)生細(xì)菌細(xì)胞的顯著的生長抑制的范圍內(nèi)增加延胡索酸還原酶活性。
增加延胡索酸還原酶活性可通過修飾所述細(xì)菌的親代菌株，例如應(yīng)用延胡索酸還原酶基因通過基因重組技術(shù)來實(shí)施。此外，編碼琥珀酸脫氫酶的基因可為編碼蛋白的基因，所述的蛋白具有延胡索酸還原酶活性及琥珀酸脫氫酶活性。因此，可增加編碼蛋白的基因的表達(dá)，所述蛋白具有延胡索酸還原酶活性和琥珀酸脫氫酶活性。例如，棒狀細(xì)菌的琥珀酸脫氫酶能夠催化由延胡索酸產(chǎn)生琥珀酸的反應(yīng)，其為琥珀酸脫氫酶的逆反應(yīng)。所述琥珀酸脫氫酶活性可通過Arkell B.A.C等的方法(Meth Enzymol，53，466-483)進(jìn)行測定。
用于本發(fā)明的細(xì)菌的親代菌株無具體的限制，只要它具有產(chǎn)生琥珀酸的能力。其中，棒狀細(xì)菌、芽孢桿菌細(xì)菌或根瘤菌細(xì)菌是優(yōu)選的，而且棒狀細(xì)菌是更優(yōu)選的。棒狀細(xì)菌的實(shí)例包括屬于棒狀桿菌屬(Corynebacterium)的微生物、屬于短桿菌屬(Brevibacterium)的微生物和屬于節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)的微生物。當(dāng)然，優(yōu)選屬于棒狀桿菌屬或短桿菌屬的細(xì)菌。更優(yōu)選屬于谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)或乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)的細(xì)菌。
所述細(xì)菌的優(yōu)選的親代菌株的具體實(shí)例包括黃色短桿菌MJ-233(FERMBP-1497)、黃色短桿菌MJ-233 AB-41(FERM BP-1498)、產(chǎn)氨短桿菌ATCC6872、谷氨酸棒狀桿菌ATCC31831和乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869。黃色短桿菌目前被歸類于谷氨酸棒狀桿菌(Lielbl，W.，Ehrmann，M.，Ludwig，W.和Schleifer，K.H.，International Journal of Systematic Bacteriology，1991，vol.41，p255-260)。因此，在本發(fā)明中，黃色短桿菌MJ-233菌株及其突變體MJ-233AB-41菌株定義為分別與谷氨酸棒狀桿菌MJ-233菌株和谷氨酸棒狀桿菌MJ-233 AB-41菌株同樣的菌株。
黃色短桿菌MJ-233已經(jīng)以登錄號(hào)(accession number)FERM P-3068于1975年4月28日保藏在國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(National Institute ofBioscience and Human Technology)，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of International Trade and Industry(currently International PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science和Technology at Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken305-8566，Japan)，而且然后在1981年5月1日根據(jù)布達(dá)佩斯條約(BudapestTreaty)轉(zhuǎn)為國際保藏(international deposit)并具有登錄號(hào)FERM BP-1497。
在本發(fā)明的方法中用作親代菌株的上述細(xì)菌可為任意菌株，其包括通過用于突變的常規(guī)處理，如UV輻射和NTG處理得到的變體菌株，和通過遺傳方法(genetic procedure)，如細(xì)胞融合和基因重組技術(shù)衍生的重組菌株，以及野生型菌株。此外，基因重組菌株的宿主可為相對(duì)于親代菌株歸于同一屬和種的那些或歸于不同屬和種的那些，只要它是可轉(zhuǎn)化的微生物，但優(yōu)選所述宿主可為如上所述的好氧細(xì)菌。
在當(dāng)進(jìn)行所述的修飾以通過延胡索酸還原酶(FRD)基因增加延胡索酸還原酶活性的情況下，可以應(yīng)用的基因無具體的限制，只要它編碼具有延胡索酸還原酶活性的蛋白，而其實(shí)例包括大腸桿菌的基因，其具有SEQ ID NO19中顯示的核苷酸序列。這些基因形成操縱子，其包含基因(SEQ ID NO19的核苷酸編號(hào)440-2245、2241-2975、2986-3381和3392-3751)，其每個(gè)編碼構(gòu)成延胡索酸還原酶的四個(gè)亞基(frdA、frddB、frdC和frdD；SEQ ID NOs20-23)?？蓪⒄麄€(gè)操縱子基因引入所述細(xì)菌，或者每個(gè)亞基基因可以分別地引入。只要每個(gè)亞基基因編碼能夠形成具有FRD活性的復(fù)合物的亞基蛋白，它可為與具有上述核苷酸序列的DNA在嚴(yán)緊性條件下雜交的DNA，或同源物如相對(duì)于具有上述核苷酸序列的DNA具有不低于90％同源性、優(yōu)選不低于95％、更優(yōu)選不低于99％的同源性的DNA。本文中，所述的嚴(yán)緊性條件包括允許在這樣的鹽濃度下進(jìn)行雜交的條件，該鹽濃度對(duì)應(yīng)于常規(guī)Southern雜交的洗滌條件，60℃、1×SSC、0.1％SDS，優(yōu)選60℃、0.1×SSC、0.1％SDS。另外，在這些FRD基因同源物中，優(yōu)選編碼這樣的蛋白的基因，在所述蛋白中對(duì)應(yīng)于FRD的B亞基(frdB)(SEQ ID NO21)中第17個(gè)氨基酸的氨基酸是賴氨酸。具有SEQ ID NO19中顯示的核苷酸序列的基因或其同源物可通過PCR方法或雜交方法來獲得。
如果需要，將對(duì)應(yīng)于frdB的第17個(gè)氨基酸的氨基酸變?yōu)橘嚢彼岬耐蛔円部赏ㄟ^已知方法導(dǎo)入。
此外，可應(yīng)用編碼蛋白的基因，所述蛋白具有琥珀酸脫氫酶和延胡索酸還原酶的活性。其實(shí)例包括棒狀細(xì)菌的sdh基因，其具有SEQ ID NO28中顯示的核苷酸序列。此基因是操縱子基因，其包含基因(SEQ ID NO28的核苷酸編號(hào)1153-3171、3174-3920和363-1133)，其分別編碼構(gòu)成琥珀酸脫氫酶的三個(gè)亞基(sdhA、sdhB和sdhC)。谷氨酸棒狀桿菌的sdh操縱子在GeneBankAccession NOS.NCg10359(sdhC)、NCg10360(sdhA)和NCg10361(sdhB)中顯示。
可將整個(gè)操縱子基因?qū)胨黾?xì)菌，或可將每個(gè)亞基基因分別導(dǎo)入。只要每個(gè)亞基基因編碼能夠形成具有FRD活性的復(fù)合物的亞基蛋白，它可為與具有上述核苷酸序列的DNA在嚴(yán)緊性條件下雜交的DNA，或同源物如相對(duì)于具有上述核苷酸序列的DNA具有不低于90％同源性、優(yōu)選不低于95％、更優(yōu)選不低于99％的同源性的DNA。本文中，所述的嚴(yán)緊性條件包括允許在這樣的鹽濃度下進(jìn)行雜交的條件，該鹽濃度對(duì)應(yīng)于常規(guī)Southern雜交的洗滌條件，60℃、1×SSC、0.1％SDS，優(yōu)選60℃、0.1×SSC、0.1％SDS。
此外，它可為編碼蛋白的基因，所述蛋白具有SEQ ID NOs20-23和29-31中顯示的那些序列中的任意氨基酸序列，其中包括取代、缺失、插入或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，只要該蛋白具有延胡索酸還原酶活性。本文中，例如，術(shù)語“幾個(gè)”指2至20，優(yōu)選2至10，更優(yōu)選2至5。
也可應(yīng)用由除大腸桿菌或棒狀細(xì)菌之外的任何細(xì)菌，或由其他微生物、動(dòng)物和植物獲得的FRD基因。例如，由任何微生物、動(dòng)物或植物獲得的FRD基因可為核苷酸序列已知的基因或基于同源性由細(xì)菌、動(dòng)物或植物的染色體中分離編碼蛋白的基因之后測定其核苷酸序列的基因，所述蛋白具有FRD活性。此外，測定所述核苷酸序列之后，也可以應(yīng)用根據(jù)該序列合成的基因。這些基因可通過以雜交或PCR來擴(kuò)增包含啟動(dòng)子和ORF的區(qū)域獲得。
當(dāng)應(yīng)用棒狀細(xì)菌時(shí)，例如，在棒狀細(xì)菌中能夠增加FRD基因表達(dá)的重組質(zhì)粒，可通過將含有FRD基因的DNA片段插入合適的質(zhì)粒，如含有至少負(fù)責(zé)棒狀細(xì)菌中的質(zhì)粒復(fù)制的基因的質(zhì)粒載體來得到。能夠?qū)⑺鯢RD基因?qū)氚魻顥U菌的細(xì)菌的質(zhì)粒載體無具體的限制，只要它含有至少負(fù)責(zé)在棒狀細(xì)菌中復(fù)制和擴(kuò)增的基因。其具體實(shí)例包括JP03-210184A中描述的質(zhì)粒pCRY30；JP02-72876A和美國專利No.5,185,262中描述的質(zhì)粒pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE和pCRY3KX；JP01-191686A中描述的質(zhì)粒pCRY2和pCRY3；JP58-67679A中描述的pAM330；JP58-77895A中描述的pHM1519；JP58-192900A中描述的pAJ655、pAJ611和pAJ1844；JP57-134500A中描述的pCG1；JP58-35197A中描述的pCG2；JP57-183799A中描述的pCG4和pCG11和JP10-215883A中描述的pVK7。
如上所述，延胡索酸還原酶活性的過量增加可削弱細(xì)菌細(xì)胞的生長。因此，優(yōu)選將所述FRD基因的表達(dá)水平通過選擇適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒拷貝數(shù)調(diào)節(jié)到細(xì)菌細(xì)胞的生長不被抑制的程度。而且，增加FRD活性可通過用常規(guī)的同源重組導(dǎo)入、取代或擴(kuò)增染色體上的FRD基因來實(shí)施。
除了如上描述的方法之外，當(dāng)所述FRD基因具有操縱子結(jié)構(gòu)時(shí)，也可以通過在調(diào)控其表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)域?qū)胪蛔儊韺?shí)現(xiàn)增加，如WO00/18935中所述。
在將上述并入重組質(zhì)?；蛉旧w的過程中，F(xiàn)RD基因表達(dá)的啟動(dòng)子可為任何啟動(dòng)子，只要它在棒狀細(xì)菌中發(fā)揮作用?？商鎿Q地，它可為所述FRD基因自身的啟動(dòng)子。可合適地選擇所述啟動(dòng)子以調(diào)節(jié)FRD基因的表達(dá)水平。
到目前為止，描述了應(yīng)用棒狀細(xì)菌的實(shí)例。然而，同樣方法可應(yīng)用于其他細(xì)菌以實(shí)現(xiàn)FRD活性的增加。
另外，在本發(fā)明的反應(yīng)中，更有效地應(yīng)用細(xì)菌菌株，其被修飾除了增加延胡索酸還原酶活性外，還降低乳酸脫氫酶活性。本文中，術(shù)語“乳酸脫氫酶活性降低”是指與未修飾乳酸脫氫酶的菌株相比，乳酸脫氫酶活性降低。所述每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的乳酸脫氫酶活性與未修飾的菌株的乳酸脫氫酶相比，優(yōu)選降低到10％或更低。此外，所述乳酸脫氫酶活性可完全消除。乳酸脫氫酶活性的降低可通過用已知的方法測定乳酸脫氫酶活性來確認(rèn)(L.Kanarek和R.L.Hill，J.Biol.Chem.239，4202(1964))。作為制備乳酸脫氫酶活性降低的棒狀細(xì)菌的突變體菌株的特異性方法，例如，可應(yīng)用如JP 11-206385 A中所述的染色體上的同源重組方法或本說明書的實(shí)施例中所描述的采用SacB基因的方法(Schafer，A.等，Gene 145(1994)69-73)。例如，通過制備具有破壞的LDH基因的細(xì)菌并用含有FRD基因的重組載體轉(zhuǎn)化該細(xì)菌，如下面實(shí)施例2中所述，可以獲得本發(fā)明的棒狀細(xì)菌，其具有增加的FRD基因表達(dá)和降低的乳酸脫氫酶活性。然而，用于降低LDH活性的修飾和用于增加FRD活性的修飾中的任何一種都可以首先實(shí)施。
此外，經(jīng)過修飾以使除延胡索酸還原酶活性增加之外丙酮酸羧化酶活性增加的細(xì)菌可用于本發(fā)明的反應(yīng)。術(shù)語“丙酮酸羧化酶活性增加”指與未修飾的菌株如野生型或親代菌株相比，丙酮酸羧化酶活性增加。所述丙酮酸羧化酶活性可以，例如，通過測量如后面所述的NADH減少的方法進(jìn)行測定。具有增加的延胡索酸還原酶和丙酮酸羧化酶表達(dá)的棒狀細(xì)菌可以通過在棒狀細(xì)菌中以與JP11-196888A中所述相似的方式高水平表達(dá)延胡索酸還原酶(FRD)基因和丙酮酸羧化酶(PC)基因來制備。
用于本發(fā)明的方法的PC基因可為其核苷酸序列已知的基因?？商鎿Q地，可應(yīng)用通過從微生物、動(dòng)物、植物等的染色體通過如下所述的方法分離編碼具有PC活性的蛋白的DNA片段，并測定其核苷酸序列而得到的基因。而且，測定該核苷酸序列之后，也可以應(yīng)用基于該序列合成的基因。
含有PC基因的DNA片段存在于來自微生物、動(dòng)物和植物的染色體上。由這些供體微生物、動(dòng)物和植物制備PC基因的基本方法可通過參考源自其序列已知的棒狀細(xì)菌的基因來舉例說明。
所述的PC基因存在于谷氨酸棒狀桿菌菌株ATCC13032，一種棒狀細(xì)菌的染色體上(Peters-Wendisch，P.G et al.，Microbiology，vol.144(1998)p915-927)，而且其核苷酸序列在本領(lǐng)域中是已知的(GenBank DatabaseAccession No.AP005276)(SEQ ID NO15)，因此可以通過PCR分離并獲得所述基因。
例如，大約3.7kb的PC基因可通過應(yīng)用具有SEQ ID NOs13和14中顯示的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，并應(yīng)用谷氨酸棒狀桿菌的染色體作為模板實(shí)施PCR來進(jìn)行擴(kuò)增。在此情況中，可將適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)添加到用于PCR的引物的5′-末端，以允許將所述基因插入如下所述的載體的合適的區(qū)域，而且所得的重組載體可用于將基因轉(zhuǎn)移到棒狀細(xì)菌中。
此外，即使未鑒定核苷酸序列，可根據(jù)PC活性純化蛋白，然后根據(jù)該蛋白的N-末端氨基酸序列或部分-消化的片段的序列合成探針以通過常規(guī)的雜交方法分離基因片段。可替換地，可根據(jù)PC蛋白的保守區(qū)域中的氨基酸序列來合成探針或引物以通過雜交或PCR獲得片段。所得片段的核苷酸序列可通過常規(guī)方法進(jìn)行測定。
在本說明書中，可計(jì)算所消化的DNA片段和質(zhì)粒的大??；當(dāng)應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，基于相同瓊脂糖凝膠上由具有已知分子量的DNA片段的遷移距離繪出的參考線，所述DNA片段是通過用限制性內(nèi)切酶HindIII消化大腸桿菌λ噬菌體而得到的；或當(dāng)應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，基于相同聚丙烯酰胺凝膠上由具有已知分子量的DNA片段的遷移距離繪出的參考線，所述DNA片段是通過用限制性內(nèi)切酶HaeIII消化大腸桿菌X174噬菌體而得到的。為了測定每個(gè)DNA片段的大小，對(duì)于大小為1kb或更大的片段而言，應(yīng)用1％瓊脂糖凝膠電泳，而對(duì)于大小大約0.1kb或更大但小于1kb的片段而言，應(yīng)用4％聚丙烯酰胺凝膠電泳。
在本發(fā)明中，含有上述用于增加PC活性的PC基因的DNA片段不僅從谷氨酸棒狀桿菌的染色體DNA分離，而且應(yīng)用通常應(yīng)用的DNA合成設(shè)備，例如由Applied Biosystems Inc制造的394 DNA/RNA合成儀來合成。此外，作為由如前所述的棒狀細(xì)菌的染色體DNA中得到的PC基因，在SEQ ID NO15的核酸序列中一些核苷酸可被其他核苷酸取代，缺失，或插入附加的核苷酸，只要由該基因編碼的PC的功能，即，二氧化碳固定(carbon dioxide fixation)的性質(zhì)沒有基本的缺損。此外，一些核苷酸序列可以倒位(inverted)。任何那些衍生物可用于本發(fā)明。也可以優(yōu)選地應(yīng)用在嚴(yán)緊性條件下與具有SEQ IDNO15的核酸序列的DNA，或者與SEQ ID NO15的核苷酸序列具有不低于90％，優(yōu)選不低于95％，或更優(yōu)選不低于99％同源性的DNA雜交的DNA，和編碼具有PC活性的蛋白的DNA。本文中，所述的嚴(yán)緊性條件包括允許在這樣的鹽濃度下進(jìn)行雜交的條件，該鹽濃度對(duì)應(yīng)于常規(guī)Southern雜交的洗滌條件，60℃、1×SSC、0.1％SDS，優(yōu)選0.1×SSC、0.1％SDS。
也可以應(yīng)用由除谷氨酸棒狀桿菌外的任何細(xì)菌，或從任何微生物、動(dòng)物和植物得到的PC基因。具體地，來自所述微生物、動(dòng)物和植物的PC基因的核酸序列，如下面所述的那些，是已知的(參考文獻(xiàn)在下面指示)。因此，可以用如前所述的相同方式通過雜交或PCR擴(kuò)增ORF獲得PC基因。
人類(Homo sapiens)[Biochem.Biophys.Res.Comm.，202，1009-1014，(1994)]小鼠(Mus musculus)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，90，1766-1779，(1993)]大鼠[GENE，165，331-332，(1995)]酵母；釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[Mol.Gen.Genet.，229，307-315，(1991)]粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)[DDBJ Accession No.；D78170]嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)[GENE，191，47-50，(1997)]Rhizobium etli[J.Bacteriol.，178，5960-5970，(1996)]含有所述PC基因的DNA片段可以通過將所述DNA片段插入合適的表達(dá)質(zhì)粒，如pUC118(由Takara Shuzo Co.，Ltd.制造)，然后通過導(dǎo)入合適的宿主微生物，如大腸桿菌JM109(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)來表達(dá)。表達(dá)的PC基因產(chǎn)物丙酮酸羧化酶(SEQ ID NO16)，可以通過以Magasanik的方法[J.Bacteriol.，158，55-62，(1984)]應(yīng)用由所述轉(zhuǎn)化體制備的粗酶溶液直接測定PC活性，然后將該P(yáng)C活性與由非-轉(zhuǎn)化體制備的粗酶溶液的PC活性相比較來確認(rèn)。將含有PC基因的DNA片段插入合適的質(zhì)粒，如質(zhì)粒載體，其至少含有負(fù)責(zé)在棒狀桿菌的細(xì)菌中復(fù)制和擴(kuò)增該質(zhì)粒的基因，并由此獲得能夠在棒狀桿菌的細(xì)菌中高表達(dá)PC的重組質(zhì)粒。在重組質(zhì)粒中，表達(dá)PC基因的啟動(dòng)子可源自棒狀細(xì)菌。然而，不限于所述的啟動(dòng)子，并可應(yīng)用任何啟動(dòng)子只要它是能啟動(dòng)PC基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。例如，可應(yīng)用如在實(shí)施例3中描述的TZ4啟動(dòng)子。
其中可導(dǎo)入PC基因的質(zhì)粒載體無具體的限制，只要它至少包含負(fù)責(zé)在棒狀桿菌的細(xì)菌中復(fù)制的基因。所述具體實(shí)施例包括JP03-210184A中描述的質(zhì)粒pCRY30；JP02-72876A和美國專利No.5,185,262中描述的質(zhì)粒pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE和pCRY3KX；JP01-191686A中描述的質(zhì)粒pCRY2和pCRY3；JP58-67679A中描述的pAM330；JP58-77895A中描述的pHM1519；JP58-192900A中描述的pAJ655、pAJ611和pAJ1844；JP57-134500A中描述的pCG1；JP58-35197A中描述的pCG2；和JP57-183799A中描述的pCG4和pCG11。
那些之中，包含在棒狀細(xì)菌中負(fù)責(zé)復(fù)制的基因和負(fù)責(zé)穩(wěn)定所述質(zhì)粒的基因的質(zhì)粒優(yōu)選用作棒狀細(xì)菌中宿主-載體系統(tǒng)的質(zhì)粒載體。例如，可優(yōu)選應(yīng)用質(zhì)粒pCRY30、pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE和pCRY3KX。
具有增加的PC基因表達(dá)以用于本發(fā)明的棒狀細(xì)菌可通過用重組載體轉(zhuǎn)化棒狀桿菌的細(xì)菌，例如黃色短桿菌MJ-233(FERM BP-1497)來獲得，所述重組載體通過將所述的PC基因插入質(zhì)粒載體的適合位點(diǎn)來制備，所述質(zhì)粒載體如上所述可在好氧的棒狀桿菌的細(xì)菌中復(fù)制。此外，PC活性的增加也可以通過常規(guī)的同源重組導(dǎo)入、取代或擴(kuò)增所述基因以在染色體上使PC基因高表達(dá)化。用含有所述FRD基因的重組載體來轉(zhuǎn)化所得的細(xì)菌以獲得具有增加的PC和FRD基因表達(dá)的棒狀細(xì)菌。FRD和PC基因中的任一個(gè)可以首先導(dǎo)入。所述的轉(zhuǎn)化可通過，例如，電脈沖方法(Res.Microbiol.，Vol.144，p.181-185，1993)來進(jìn)行。
此外，在本發(fā)明中，經(jīng)過修飾以增加延胡索酸還原酶和丙酮酸羧化酶的活性并降低乳酸脫氫酶活性的細(xì)菌特別優(yōu)選地用于產(chǎn)生琥珀酸。上述細(xì)菌可通過用分別含有PC基因和FRD基因的重組載體轉(zhuǎn)化具有破壞的LDH基因的棒狀細(xì)菌而得到。任何應(yīng)用這些基因的修飾步驟可首先實(shí)施。
當(dāng)上述細(xì)菌用于產(chǎn)生琥珀酸的反應(yīng)時(shí)，可直接應(yīng)用在固體培養(yǎng)基，如瓊脂培養(yǎng)基上經(jīng)過斜面培養(yǎng)的細(xì)菌。并優(yōu)選在應(yīng)用前上述的細(xì)菌可在液體培養(yǎng)基中預(yù)-培養(yǎng)(種子培養(yǎng)(seed culture))?？赡芡ㄟ^將由種子-培養(yǎng)的細(xì)菌與有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，同時(shí)在含有有機(jī)原料的培養(yǎng)基中生長所述的細(xì)菌來產(chǎn)生琥珀酸。另外，琥珀酸可以通過將增殖的細(xì)菌細(xì)胞與有機(jī)原料在含有所述有機(jī)原料的反應(yīng)溶液中進(jìn)行反應(yīng)來產(chǎn)生。當(dāng)好氧的棒狀細(xì)菌用于本發(fā)明的方法時(shí)，優(yōu)選應(yīng)用在正常的好氧條件下培養(yǎng)之后的細(xì)菌。用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基可為任何通常用于微生物培養(yǎng)的那些培養(yǎng)基。例如，可以應(yīng)用常規(guī)培養(yǎng)基，其通過將天然營養(yǎng)源，如肉膏、酵母提取物或蛋白胨加入由無機(jī)鹽如硫酸銨、磷酸鉀和硫酸鎂組成的組合物來制備。培養(yǎng)之后通過離心、膜分離等收集所述細(xì)菌細(xì)胞，然后用于反應(yīng)。
在本發(fā)明中，也可以應(yīng)用細(xì)菌的細(xì)胞處理物。例如，所述細(xì)菌細(xì)胞處理物包括在丙烯酰胺、鹿角菜膠(carageenan)等上固定的細(xì)菌細(xì)胞；裂解的細(xì)菌細(xì)胞，其離心上清，或通過用硫酸銨處理等部分純化所述上清而得到的級(jí)分。
用于本發(fā)明的產(chǎn)生方法的有機(jī)原料是沒有局限的，只要它是所述微生物能同化以產(chǎn)生琥珀酸的碳源。通常，可發(fā)酵的糖類物質(zhì)如半乳糖、乳糖、葡萄糖、果糖、甘油(glycerin)、蔗糖(sucrose)、蔗糖(saccharose)、淀粉和纖維素；或多元醇如甘油、甘露醇、木糖醇和核醣醇可用作碳源。其中，葡萄糖、果糖和甘油是優(yōu)選的，而且葡萄糖是特別優(yōu)選的。
此外，也可以應(yīng)用糖化的淀粉溶液、糖蜜(molasses)等，其包含上述可發(fā)酵的糖類物質(zhì)。那些可發(fā)酵的碳水化合物可以單獨(dú)地或組合地應(yīng)用。上述有機(jī)原料的濃度無具體的限制，但是，在產(chǎn)生琥珀酸不受抑制的范圍內(nèi)盡可能高地增加濃度是有利的。所述有機(jī)原料的濃度通常在5至30％(w/v)的范圍內(nèi)，優(yōu)選10至20％(w/v)的范圍內(nèi)。此外，隨著反應(yīng)進(jìn)行，當(dāng)上述有機(jī)原料減少時(shí)也可補(bǔ)加所述的有機(jī)原料。
含有所述有機(jī)原料的反應(yīng)溶液無具體的限制，而且例如，可為細(xì)菌培養(yǎng)的任何培養(yǎng)基或包括磷酸鹽緩沖液的任何緩沖液。該反應(yīng)溶液優(yōu)選含有氮源、無機(jī)鹽等的水溶液。本文中，所述氮源無具體限制，只要它被所述微生物同化以產(chǎn)生琥珀酸。具體地，所述氮源包括各種有機(jī)的和無機(jī)的氮化合物，如銨鹽、硝酸鹽、脲(urea)、大豆水解物、酪蛋白水解物、蛋白胨、酵母提取物、肉膏(meat extract)和玉米漿(corn steep liquor)。所述的無機(jī)鹽包括各種類型的磷酸鹽、硫酸鹽和金屬鹽類(metal salts)如鎂鹽、鉀鹽、錳鹽、鐵鹽、鋅鹽等。此外，如果需要，可以加入促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞生長的任何組分，其包括維生素如生物素(biotin)、泛酸(pantothenic acid)、肌醇(inositol)和煙酸(nicotinicacid)、核苷酸和氨基酸。此外，優(yōu)選將最佳量的商業(yè)上可得到的消泡劑(anti-foaming agent)加入所述的培養(yǎng)基以在反應(yīng)的時(shí)候抑制發(fā)泡。
所述反應(yīng)溶液的pH可通過加入碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸鎂、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂等來調(diào)節(jié)。所述反應(yīng)的pH通常為5至10的pH，優(yōu)選6至9.5的pH，并由此，如果需要的話，在所述反應(yīng)過程中該反應(yīng)溶液的pH可用堿性物質(zhì)、碳酸鹽、脲等在上述范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。
用于本發(fā)明的反應(yīng)溶液可為水、緩沖液、培養(yǎng)基等，但優(yōu)選培養(yǎng)基。例如，將碳酸鹽或碳酸氫根離子，或二氧化碳?xì)庖约吧鲜龅挠袡C(jī)原料加入所述培養(yǎng)基，然后在厭氧條件下進(jìn)行反應(yīng)。所述碳酸鹽或碳酸氫根離子可由碳酸鎂、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀或碳酸氫鉀供給，上述物質(zhì)也可用作中和劑。然而，如果需要的話，所述碳酸鹽或碳酸氫根離子可由碳酸或重碳酸或其鹽或二氧化碳?xì)夤┙o。碳酸鹽或碳酸氫鹽的具體實(shí)例包括碳酸鎂、碳酸銨、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫銨、碳酸氫鈉和碳酸氫鉀。此外，將碳酸根離子或碳酸氫根離子以0.001至5M的濃度加入，優(yōu)選0.1至3M，更優(yōu)選1至2M。當(dāng)加入二氧化碳?xì)鈺r(shí)，所述溶液中二氧化碳?xì)獾牧繛?0mg/l至25g/l，優(yōu)選100mg/l至15g/l，更優(yōu)選150mg/l至10g/l。
用于本反應(yīng)的細(xì)菌的生長的最適溫度通常在25至35℃的范圍內(nèi)。所述反應(yīng)的溫度通常在25至40℃的范圍內(nèi)，優(yōu)選在30至37℃的范圍內(nèi)。用于本反應(yīng)的細(xì)菌細(xì)胞的量為，但不限于1至700g/L，優(yōu)選10至500g/L，更優(yōu)選20至400g/L。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選1至168小時(shí)，更優(yōu)選3至72小時(shí)。
為了培養(yǎng)所述細(xì)菌，需要通過通氣和攪拌供給氧氣。在另一方面，琥珀酸可以通氣和攪拌產(chǎn)生，或也可以在無通氣或氧氣供應(yīng)的厭氧氣氛下產(chǎn)生。本文中應(yīng)用的術(shù)語“厭氧條件”(anaerobic condition)指在將溶液中的溶氧保持在低水平的同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。在此情況中，優(yōu)選在0至2ppm的溶氧水平進(jìn)行反應(yīng)，優(yōu)選0至1ppm，更優(yōu)選0至0.5ppm。為了那個(gè)目的，可以在無通氣的密封容器進(jìn)行反應(yīng)；可在供給惰性氣體如氮?dú)獾耐瑫r(shí)進(jìn)行反應(yīng)；或供給含有二氧化碳?xì)獾亩栊詺怏w的同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。
在反應(yīng)溶液(培養(yǎng)基)中累積的琥珀酸可根據(jù)常規(guī)方法來收集并從該反應(yīng)溶液中純化。具體地，通過離心、過濾等除去固體組分如細(xì)菌細(xì)胞等，并用離子-交換樹脂等將得到的溶液脫鹽，然后通過結(jié)晶或柱色譜(columnchromatography)來收集并從所述溶液中純化琥珀酸。
在本發(fā)明中，通過本發(fā)明如前所述的方法產(chǎn)生琥珀酸之后，應(yīng)用得到的琥珀酸作為原料可進(jìn)行聚合反應(yīng)以產(chǎn)生含有琥珀酸的聚合物。近年來，環(huán)境-友好的工業(yè)產(chǎn)品的數(shù)量增加，而且由植物來源的原料制備的聚合物引起注意。本發(fā)明中產(chǎn)生的琥珀酸可以加工成聚合物，如聚酯(polyester)和聚酰胺(polyamide)。此外，由本發(fā)明的產(chǎn)生方法得到的琥珀酸或含有所述琥珀酸的組合物可用于食物添加劑、藥劑、化妝品等。
實(shí)施例在下文中，參考實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地描述。然而，本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1構(gòu)建基因破壞載體(A)提取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)基因組DNA在10mL的LB培養(yǎng)基[組成10g胰蛋白胨(tryptone)，5g酵母提取物和5g NaCl溶于1L蒸餾水]中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌ISW1214，直到對(duì)數(shù)生長后期(late logarithmic growth phase)，并收集所述的細(xì)菌細(xì)胞。得到的細(xì)菌細(xì)胞在0.15mL含有10mg/mL溶菌酶的10mM NaCl/20mM Tris緩沖液(pH 8.0)/1mM EDTA·2Na中重懸。
然后，將蛋白酶K以100μg/mL的終濃度加入所述懸浮液，并在37℃保持1個(gè)小時(shí)。然后，又將十二烷基硫酸鈉溶液以0.5％的終濃度加入，并在50℃保持6小時(shí)用于裂解。向此裂解物中，加入等量的酚/氯仿溶液，并在室溫慢慢振蕩10分鐘。然后，將總的懸浮液進(jìn)行離心(5,000×g，20分鐘，10至12℃)，并取出上清級(jí)分。將乙酸鈉溶液以0.3M的濃度加入所述的上清級(jí)分，然后加入兩倍量的乙醇并混合。通過離心(15,000×g，2分鐘)除去沉淀物，然后用70％乙醇洗滌并風(fēng)干。將5mL的10mM Tris緩沖液(pH 7.5)/1mMEDTA·2Na加入得到的DNA。將所得的溶液在4℃靜置過夜，并用作PCR的模板DNA。
(B)通過PCR擴(kuò)增和克隆SacB基因通過應(yīng)用前面(A)部分中制備的DNA作為模板；并應(yīng)用基于報(bào)道的所述基因的核苷酸序列(GenBank Database登記號(hào)X02730)設(shè)計(jì)而合成的DNA(SEQ ID NOs1和2)實(shí)施PCR來獲得枯草芽孢桿菌SacB基因。
所述反應(yīng)溶液的組成如下。將1μL的模板DNA、0.2μL的PfxDNA聚合酶(可從Invitrogen得到)、1-倍濃度的提供的緩沖液、0.3μM相應(yīng)的引物，1mM MgSO4和0.25μM dNTPs混合，并將所述反應(yīng)溶液的總體積調(diào)節(jié)至20μL。
反應(yīng)溫度條件如下應(yīng)用由MJ Research Co.，Ltd.制造的DNA熱循環(huán)儀(Thermal Cycler)PTC-2000，并將94℃、20秒和68℃、2分鐘的循環(huán)重復(fù)35次。對(duì)于第一個(gè)循環(huán)，在94℃保溫(heat-retention)進(jìn)行1分20秒。對(duì)于最后的循環(huán)，在68℃保溫進(jìn)行5分鐘。
擴(kuò)增的產(chǎn)物通過在0.75％瓊脂糖(SeaKem GTG瓊脂糖，可從FMCBioProducts得到)凝膠電泳中分離并用溴化乙錠染色顯現(xiàn)來分析，以由此檢測大約2kb的片段。應(yīng)用QIAQuick凝膠Extraction Kit(可由QIAGEN得到)從所述的凝膠中回收目標(biāo)DNA片段。
回收的DNA片段的5′-末端用T4多核苷酸激酶(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)磷酸化并通過應(yīng)用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)插入大腸桿菌載體(pBluescript II可由STRATEGENE得到)的EcoRV位點(diǎn)，并應(yīng)用得到的質(zhì)粒DNA以轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得到的重組大腸桿菌鋪在含有50μg/mL氨芐青霉素(ampicillin)和50μg/mL X-Gal的LB瓊脂培養(yǎng)基上(10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl和15g瓊脂溶于1L蒸餾水)。
將此培養(yǎng)基上每個(gè)形成白色菌落的克隆轉(zhuǎn)移到含有50μg/mL氨芐青霉素和10％蔗糖的LB瓊脂培養(yǎng)基，并在37℃培養(yǎng)24小時(shí)。這些克隆中，將在含有蔗糖的培養(yǎng)基上不能生長的克隆通過常規(guī)方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后分離所述的質(zhì)粒DNA。SacB基因被功能性表達(dá)的大腸桿菌菌株必不能在含有蔗糖的培養(yǎng)基中生長。得到的質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶Sal I和Pst I進(jìn)行消化。確認(rèn)所述質(zhì)粒DNA具有大約2kb的插入片段并將該質(zhì)粒命名為pBS/SacB。
(C)構(gòu)建氯霉素-抗性的SacB載體500ng大腸桿菌質(zhì)粒載體pHSG396(氯霉素抗性標(biāo)記，可由Takara ShuzoCo.，Ltd.得到)與10單位的限制性內(nèi)切酶PshBI在37℃反應(yīng)1小時(shí)，并通過酚/氯仿提取和乙醇沉淀回收。將得到的DNA的兩個(gè)末端每個(gè)用Klenow片段(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)平末端化，并將MluI接頭(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)通過應(yīng)用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)連接于其上以形成環(huán)狀質(zhì)粒，并且應(yīng)用得到的質(zhì)粒以轉(zhuǎn)化所述的大腸桿菌(DH5α菌株)。將得到的重組大腸桿菌鋪在含有34μg/mL氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。通過常規(guī)方法將質(zhì)粒DNA從所得到的克隆中分離。選擇具有限制性內(nèi)切酶MluI的切割位點(diǎn)的克隆并命名為pHSG396Mlu。
同時(shí)，在前面(B)部分構(gòu)建的pBS/SacB用限制性內(nèi)切酶SalI和PstI消化，并將得到的DNA的兩個(gè)末端每個(gè)用Klenow片段平末端化。將MluI接頭通過應(yīng)用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)連接于其上。然后，含有SacB基因大約2.0kb的DNA片段在0.75％瓊脂糖凝膠電泳中分離并回收。將此SacB基因片段連接于通過用限制性內(nèi)切酶MluI消化pHSG396Mlu而得到的片段上，并用小牛小腸堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase Calfintestine)(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)脫磷酸，通過應(yīng)用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)，所得到的DNA用于轉(zhuǎn)化所述大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得的重組大腸桿菌鋪于含有34μg/mL氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
將得到的菌落轉(zhuǎn)移到含有34μg/mL氯霉素和10％蔗糖的LB瓊脂培養(yǎng)基上，并在37℃培養(yǎng)24小時(shí)。這些克隆中，從在含有蔗糖的培養(yǎng)基上不能生長的克隆中通過常規(guī)方法分離質(zhì)粒DNA。將得到的質(zhì)粒DNA進(jìn)行MluI消化和分析。結(jié)果，確認(rèn)所述質(zhì)粒DNA具有大約2kb的插入片段并命名為pCMB1。
(D)獲得卡那霉素-抗性基因應(yīng)用大腸桿菌質(zhì)粒載體pHSG299(卡那霉素抗性標(biāo)記，Takara Shuzo Co.，Ltd.)的DNA作為模板，并應(yīng)用合成的DNA(在SEQ ID NOs3和4中顯示)作為引物，通過實(shí)施PCR獲得卡那霉素-抗性基因。反應(yīng)溶液的組成如下1ng模板DNA、0.1μL的Pyrobest DNA聚合酶(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)、1-倍濃度的提供的緩沖液、0.5μM相應(yīng)的引物和0.25μM dNTPs混合，并將所述反應(yīng)溶液的總體積調(diào)節(jié)至20μL。
反應(yīng)溫度條件如下應(yīng)用由MJ Research Co.，Ltd.制造的DNA熱循環(huán)儀PTC-2000，并將94℃、20秒，62℃、15秒和72℃、1分20秒的循環(huán)重復(fù)20次。對(duì)于第一個(gè)循環(huán)，在94℃保溫進(jìn)行1分20秒。對(duì)于最后的循環(huán)，在72℃保溫進(jìn)行5分鐘。
擴(kuò)增的產(chǎn)物通過在0.75％瓊脂糖(SeaKem GTG瓊脂糖，可從FMCBioProducts得到)凝膠電泳中分離并用溴化乙錠染色顯現(xiàn)來分析，以由此檢測大約1.1kb的片段。應(yīng)用QIAQuick凝膠Extraction Kit(可由QIAGEN得到)從所述的凝膠中回收目標(biāo)DNA片段。回收的DNA片段的5′-末端用T4多核苷酸激酶(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)磷酸化。
(E)構(gòu)建卡那霉素-抗性的SacB載體通過用限制性內(nèi)切酶Van91I和ScaI消化在前面(C)部分中構(gòu)建的pCMB1而獲得的大約3.5kb的DNA片段，在0.75％瓊脂糖凝膠電泳中分離并回收。將得到的DNA與前面(D)部分中制備的卡那霉素抗性基因混合，并通過應(yīng)用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)連接于其上，而且所得的質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化所述大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得的重組大腸桿菌鋪在含有50μg/mL卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
確認(rèn)在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上生長的菌株不能在含有蔗糖的培養(yǎng)基上生長。此外，由相同菌株制備的質(zhì)粒DNA通過限制性內(nèi)切酶HindIII消化顯示354、473、1,807和1,997bp的片段。因此斷定，所述質(zhì)粒具有圖1所示的結(jié)構(gòu)，并將所述質(zhì)粒命名為pKMB1。
實(shí)施例2構(gòu)建LDH基因-破壞的菌株(A)從黃色短桿菌MJ233-ES菌株中提取基因組DNA在10mLA培養(yǎng)基(2g脲、7g(NH4)2SO4、0.5g KH2PO4、0.5g K2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、6mg FeSO4·7H2O、6mg MnSO4·4-5H2O、200μg生物素、100μg硫胺素、1g酵母提取物、1g酪蛋白氨基酸(casamino aid)和20g葡萄糖溶于1L蒸餾水)中培養(yǎng)黃色短桿菌MJ-233菌株直到對(duì)數(shù)生長后期。所得的細(xì)菌細(xì)胞用于通過在實(shí)施例1的(A)部分中描述的方法制備基因組DNA。
(B)克隆乳酸脫氫酶基因通過應(yīng)用在前面(A)部分中制備的DNA作為模板；并應(yīng)用基于JP11-206385A中描述的基因的核酸序列設(shè)計(jì)而合成的DNA((SEQ ID NOs5和6)實(shí)施PCR獲得MJ233菌株的乳酸脫氫酶基因。所述反應(yīng)溶液的組成如下將1μL模板DNA、0.2μL TaqDNA聚合酶(可從Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)、1-倍濃度的提供的緩沖液、0.2μM相應(yīng)的引物和0.25μM dNTPs混合，并將所述反應(yīng)溶液的總體積調(diào)節(jié)至20μL。
反應(yīng)溫度條件如下應(yīng)用由MJ Research Co.，Ltd.制造的DNA熱循環(huán)儀PTC-2000，并將94℃、20秒，55℃、15秒和72℃、1分鐘的循環(huán)重復(fù)30次。對(duì)于第一個(gè)循環(huán)，在94℃保溫進(jìn)行1分20秒。對(duì)于最后的循環(huán)，在72℃保溫進(jìn)行5分鐘。
擴(kuò)增的產(chǎn)物通過在0.75％瓊脂糖(SeaKem GTG瓊脂糖，可從FMCBioProducts得到)凝膠電泳中分離并用溴化乙錠染色顯現(xiàn)來分析，以由此檢測大約0.95kb的片段。應(yīng)用QIAQuick凝膠Extraction Kit(可由QIAGEN得到)從所述的凝膠中回收目標(biāo)DNA片段。
將回收的DNA片段與PCR產(chǎn)物-克隆載體pGEM-T Easy(可由PromegaCorporation得到)混合，并應(yīng)用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)連接于其上，而且得到的質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得的重組大腸桿菌鋪在含有50μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL X-Gal的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
將此培養(yǎng)基上每個(gè)形成白色菌落的克隆通過常規(guī)方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后純化所述的質(zhì)粒DNA。將得到的質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶SacI和SphI切割。確認(rèn)所述質(zhì)粒DNA具有大約1.0kb的插入并命名為pGEMT/CgLDH。
(C)破壞乳酸脫氫酶基因質(zhì)粒的構(gòu)建在前面(B)部分制備的pGEMT/CgLDH用限制性內(nèi)切酶EcoRV和XbaI消化以去除乳酸脫氫酶大約0.25kb的編碼區(qū)。殘留的大約3.7kb的DNA片段的每個(gè)末端通過Klenow片段平末端化并通過應(yīng)用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)自身環(huán)化，而且所得的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得的重組大腸桿菌鋪在含有50μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
在此培養(yǎng)基上生長的菌株通過常規(guī)方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后分離所述的質(zhì)粒DNA。將得到的質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶SacI和SphI消化。選擇具有大約0.75kb插入的克隆并命名為pGEMT/ΔLDH。
接著，通過用限制性內(nèi)切酶SacI和SphI消化pGEMT/ΔLDH而得到的大約0.75kb的DNA片段在0.75％瓊脂糖凝膠電泳中分離并回收，以制備乳酸脫氫酶基因片段，其中其區(qū)域的一部分缺失。將此DNA片段與用限制性內(nèi)切酶SacI和SphI消化的實(shí)施例1中構(gòu)建的pKMB1混合，并應(yīng)用Ligation Kitver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)連接于其上，而得到的質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α菌株)。將得到的重組大腸桿菌鋪在含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL X-Gal的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
將此培養(yǎng)基上每個(gè)形成白色菌落的克隆通過常規(guī)方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后分離所述的質(zhì)粒DNA。將得到的質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶SacI和SphI消化。選擇具有大約0.75kb插入片段的克隆并命名為pKMB1/ΔLDH(圖2)。
(D)構(gòu)建源自黃色短桿菌MJ233-ES菌株的乳酸脫氫酶基因-破壞的菌株用于轉(zhuǎn)化黃色短桿菌MJ-233菌株的質(zhì)粒DNA從通過氯化鈣方法以pKMB1/ΔLDH轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM110菌株中(Journal of Molecular Biology，53，159，1970)來分離。
從黃色短桿菌MJ233菌株(FERM BP-1497)(消除(curing))根據(jù)常規(guī)步驟(WolfH等，J.Bacteriol.1983，156(3)1165-1170，Kumsu Y等，Agric Biol Chem.1990，54(2)443-7)去除內(nèi)源質(zhì)粒，然后，得到的質(zhì)粒-消除(plasmid-cured)菌株黃色短桿菌MJ233-ES用于后續(xù)的轉(zhuǎn)化。
轉(zhuǎn)化黃色短桿菌MJ233-ES菌株通過電脈沖方法(Res.Microbiolo.，Vol.144，p.181-185，1993)進(jìn)行，并將得到的轉(zhuǎn)化體鋪于含有50μg/mL卡那霉素的LBG瓊脂培養(yǎng)基(10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl、20g葡萄糖和15g瓊脂溶于1L蒸餾水)。
因?yàn)閜KMB1/ΔLDH是在黃色短桿菌MJ233-ES菌株中不能復(fù)制的質(zhì)粒，在此培養(yǎng)基上生長的菌株必須具有源自其基因組上的質(zhì)粒的SacB基因和卡那霉素-抗性基因，這是所述質(zhì)粒上的乳酸脫氫酶基因和黃色短桿菌MJ-233菌株的基因組上的相同基因之間同源重組的結(jié)果。
接著，通過同源重組得到的菌株在含50μg/mL卡那霉素的LBG培養(yǎng)基上進(jìn)行液體培養(yǎng)。將假定包含大約1,000,000個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)溶液鋪在含10％蔗糖的LBG培養(yǎng)基上。結(jié)果，得到大約10個(gè)蔗糖-不敏感的菌株，其中所述的SacB基因通過第二次同源重組去除。
所得到的菌株包括乳酸脫氫酶基因被源自pKMB1/ΔLDH的缺失型替代的菌株；和乳酸脫氫酶基因回復(fù)(revert)為野生型的菌株。該乳酸脫氫酶基因是變異型還是野生型可通過將由在LBG培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)得到的細(xì)菌菌株進(jìn)行直接PCR并檢測所述的乳酸脫氫酶基因來容易地確認(rèn)。通過應(yīng)用PCR擴(kuò)增的引物(SEQ ID NOs7和8)分析乳酸脫氫酶基因得到野生型720bp的DNA片段和具有缺失的變異型471bp的DNA片段。
作為通過上述方法分析蔗糖-不敏感菌株的結(jié)果，選擇只具有變異型基因的菌株并命名為黃色短桿菌MJ233/ΔLDH。
(E)測定乳酸脫氫酶活性將由上述(D)制備的黃色短桿菌MJ233/ΔLDH菌株接種到培養(yǎng)基A中，然后在30℃好氧地振蕩培養(yǎng)15小時(shí)。將得到的培養(yǎng)物離心(3,000×g，4℃，20分鐘)，并收集細(xì)菌細(xì)胞，然后用鈉-磷酸(sodium-phosphate)緩沖液(50mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.3))洗滌。
隨后，將0.5g(濕重)洗滌的細(xì)菌細(xì)胞懸于2ml上述磷酸鈉緩沖液，然后用超聲儀(由Branson，Ltd.制造)在冰上處理以得到細(xì)菌細(xì)胞的裂解產(chǎn)物。將該裂解產(chǎn)物離心(10,000×g，4℃，30分鐘)，并得到所述上清作為粗酶溶液(crudeenzyme solution)。類似地，制備黃色短桿菌MJ233-ES菌株的粗酶溶液作為對(duì)照，然后進(jìn)行如下的活性測定。
對(duì)于兩個(gè)粗酶溶液，通過測定輔酶NADH到NAD+的氧化作為340nm吸光度的變化，連同由作為底物的丙酮酸產(chǎn)生乳酸來測定乳酸脫氫酶活性(L.Kanarek和R.L.Hill，J.Biol.Chem.239，4202(1964))。該反應(yīng)在37℃、存在10mM丙酮酸和0.4mM NADH的條件下，在50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.2)中進(jìn)行。因此，由黃色短桿菌MJ233/ΔLDH菌株制備的粗酶溶液的乳酸脫氫酶活性為由黃色短桿菌MJ233-ES菌株制備的粗酶溶液的乳酸脫氫酶活性的十分之一或更少。
實(shí)施例3構(gòu)建棒狀桿菌的細(xì)菌的表達(dá)載體(A)制備棒狀桿菌的細(xì)菌的啟動(dòng)子片段應(yīng)用顯示于JP07-95891A中的SEQ ID NO4并報(bào)道為在棒狀桿菌的細(xì)菌中具有高啟動(dòng)子活性的DNA片段(在下文中，稱為TZ4啟動(dòng)子)。通過應(yīng)用實(shí)施例2的(A)部分中制備的黃色短桿菌MJ233基因組DNA作為模板；并應(yīng)用基于JP07-95891A中SEQ ID NO4描述的序列設(shè)計(jì)而合成的DNAs(SEQ IDNOs9和10)作為引物，實(shí)施PCR可得到所述的啟動(dòng)子片段。
所述反應(yīng)溶液的組成如下將1μL模板DNA、0.2μL PfxDNA聚合酶(可由Invitrogen Japan K.K.得到)、1-倍濃度的提供的緩沖液、0.3μM相應(yīng)的引物、1mM MgSO4和0.25μM dNTPs混合，并將所述反應(yīng)溶液的總體積調(diào)節(jié)至20μL。
反應(yīng)溫度條件如下應(yīng)用由MJ Research Co.，Ltd.制造的DNA熱循環(huán)儀PTC-2000，并將94℃、20秒，60℃、20秒和72℃、30秒的循環(huán)重復(fù)35次。對(duì)于第一個(gè)循環(huán)，在94℃保溫進(jìn)行1分20秒。對(duì)于最后的循環(huán)，在72℃保溫進(jìn)行2分鐘。
擴(kuò)增的產(chǎn)物通過在2.0％瓊脂糖(SeaKem GTG瓊脂糖，可從FMCBioProducts得到)凝膠電泳中分離并用溴化乙錠染色顯現(xiàn)來分析，以由此檢測大約0.25kb的片段。應(yīng)用QIAQuick凝膠Extraction Kit(可由QIAGEN得到)從所述的凝膠中回收目標(biāo)DNA片段。
回收的DNA片段的5′-末端用T4多核苷酸激酶(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)磷酸化并通過應(yīng)用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)連接到大腸桿菌載體pUC19(Takara Shuzo Co.，Ltd.)的SmaI位點(diǎn)，而且得到的質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得到的重組大腸桿菌鋪在含有50μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL X-Gal的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
將此培養(yǎng)基上形成白色菌落的六個(gè)克隆通過常規(guī)方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后分離所述的質(zhì)粒DNA，并測定核苷酸序列。從中選擇TZ4啟動(dòng)子以具有相對(duì)于pUC19上的lac啟動(dòng)子反方向的轉(zhuǎn)錄活性的方式插入的克隆并命名為pUC/TZ4。
接著，將由合成的DNAs(SEQ ID NOs11和12)組成的DNA接頭添加到通過用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI消化pUC/TZ4制備的DNA片段并通過應(yīng)用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)相互連接，所述合成的DNAs每個(gè)具有磷酸化的5′-末端并具有對(duì)應(yīng)于BamHI和PstI每個(gè)的粘性末端，所得的質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α菌株)。此DNA接頭包括核糖體結(jié)合序列(AGGAGG)和所述核糖體結(jié)合序列下游排列的克隆位點(diǎn)(從上游PacI、NotI和ApaI的順序)。
將此培養(yǎng)基上形成白色菌落的克隆通過常規(guī)方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后分離所述的質(zhì)粒DNA。在得到的質(zhì)粒DNA中，選擇能用限制性內(nèi)切酶NotI切割的質(zhì)粒DNA并命名為pUC/TZ4-SD。
通過用限制性內(nèi)切酶PstI消化pUC/TZ4-SD，用Klenow片段使其末端平末端化和用限制性內(nèi)切酶KpnI切割所得DNA得到大約0.3kb的啟動(dòng)子片段，并在2.0％瓊脂糖凝膠電泳中分離和回收。
(B)構(gòu)建棒狀桿菌的細(xì)菌的表達(dá)載體JP 12-93183A中描述的pHSG298par-rep用作在棒狀桿菌的細(xì)菌中能穩(wěn)定且自主復(fù)制的質(zhì)粒。此質(zhì)粒包括來自停滯短桿菌(Brevibacterium stationis)IFO12144菌株的天然質(zhì)粒pBYS03的復(fù)制區(qū)(replicating region)和穩(wěn)定功能的區(qū)域，源自大腸桿菌載體pHSG298(Takara Shuzo Co.，Ltd.)的卡那霉素抗性基因和大腸桿菌的復(fù)制區(qū)。通過用限制性內(nèi)切酶SseI消化pHSG298par-rep，用Klenow片段使其末端平末端化，并用限制性內(nèi)切酶KpnI消化所得的DNA來制備DNA，并且將該DNA與前面(A)部分中制備的TZ4啟動(dòng)子片段混合并應(yīng)用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)連接于其上，而且所得的質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α菌株)。將得到的重組大腸桿菌鋪于含有50μg/mL卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
將此培養(yǎng)基上生長的菌株通過常規(guī)方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后純化所述的質(zhì)粒DNA。在得到的質(zhì)粒DNA中，選擇能用限制性內(nèi)切酶NotI消化的質(zhì)粒DNA并命名為pTZ4(圖3顯示構(gòu)建步驟)。
實(shí)施例4構(gòu)建丙酮酸羧化酶活性-增加的菌株(A)獲取丙酮酸羧化酶基因源自黃色短桿菌MJ233菌株的丙酮酸羧化酶基因通過應(yīng)用實(shí)施例2的(A)部分中制備的DNA作為模板；并應(yīng)用基于其全部基因組序列已報(bào)道的(GenBank Database登記號(hào)AP005276)谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032菌株的丙酮酸羧化酶基因序列設(shè)計(jì)而合成的DNAs(SEQ ID NOs13和14)作為引物，實(shí)施PCR而得到。所述反應(yīng)溶液的組成如下將1μL模板DNA、0.2μL PfxDNA聚合酶(可由Invitrogen Japan K.K.得到)、1-倍濃度的提供的緩沖液、0.3μM相應(yīng)的引物、1mM MgSO4和0.25μM dNTPs混合，并將所述反應(yīng)液的總體積調(diào)節(jié)至20μL。
反應(yīng)溫度條件如下應(yīng)用由MJ Research Co.，Ltd.制造的DNA熱循環(huán)儀PTC-2000，并將94℃、20秒和68℃、4分鐘的循環(huán)重復(fù)35次。對(duì)于第一個(gè)循環(huán)，在94℃保溫進(jìn)行1分20秒。對(duì)于最后的循環(huán)，在68℃保溫進(jìn)行10分鐘。完成PCR之后，加入0.1M的Takara Ex Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)并在72℃保持30分鐘。
擴(kuò)增的產(chǎn)物通過在0.75％瓊脂糖(SeaKem GTG瓊脂糖，可從FMCBioProducts得到)凝膠電泳中分離并用溴化乙錠染色顯現(xiàn)來分析，以由此檢測大約3.7kb的片段。應(yīng)用QIAQuick凝膠提取試劑盒(可由QIAGEN得到)從所述的凝膠中回收目標(biāo)DNA片段。
將回收的DNA片段與PCR產(chǎn)物-克隆載體pGEM-TEasy(可由PromegaCorporation得到)混合，并通過應(yīng)用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)連接于其上，而且得到的質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得到的重組大腸桿菌鋪在含有50μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL X-Gal的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
將此培養(yǎng)基上每個(gè)形成白色菌落的克隆通過常規(guī)方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后分離所述的質(zhì)粒DNA。將得到的質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶PacI和ApaI消化，確認(rèn)所述的質(zhì)粒DNA具有大約3.7kb的插入片段并命名為pGEM/MJPC。
通過應(yīng)用核苷酸測序設(shè)備(model 377XL，由Applied Biosystems制造)和BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit ver.3(由Applied Biosystems制造)測定pGEM/MJPC中插入片段的核苷酸序列。SEQ ID NO15顯示測定的核苷酸序列和預(yù)測的氨基酸序列。所述氨基酸序列與源自谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032菌株的序列非常高度地同源(99.4％)，可斷定所述的pGEM/MJPC插入片段是源自黃色短桿菌MJ233菌株的丙酮酸羧化酶基因。
(B)增加丙酮酸羧化酶活性的質(zhì)粒構(gòu)建接著，前面(A)部分中通過用限制性內(nèi)切酶PacI和ApaI消化pGEM/MJPC得到的大約3.7kb的丙酮酸羧化酶基因片段在0.75％瓊脂糖凝膠電泳中分離并回收。
將此DNA片段與實(shí)施例3中用限制性內(nèi)切酶PacI和ApaI消化的pTZ4混合并應(yīng)用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)連接于其上，而且得到的質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得的重組大腸桿菌鋪于含有50μg/mL卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
將此培養(yǎng)基上生長的菌株通過常規(guī)方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后純化所述的質(zhì)粒DNA。將得到的質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶PacI和ApaI消化，選擇具有大約3.7kb的插入片段的克隆并命名為pMJPC1(圖4)。
(C)轉(zhuǎn)化黃色短桿菌MJ233/ΔLDH菌株從前面(B)部分中轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(DH5α菌株)中分離能在黃色短桿菌MJ233菌株中復(fù)制的質(zhì)粒DNA pMJPC1。
轉(zhuǎn)化黃色短桿菌MJ233/ΔLDH菌株通過電脈沖方法進(jìn)行(Res.Microbiolo.，Vol.144，p.181-185，1993)，并將得到的轉(zhuǎn)化體鋪于含有50μg/mL卡那霉素的LBG瓊脂培養(yǎng)基(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，20g葡萄糖和15g瓊脂溶于1L蒸餾水)。
將此培養(yǎng)基上生長的菌株通過常規(guī)方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后提取所述的質(zhì)粒DNA并以限制性內(nèi)切酶消化來分析。此結(jié)果證實(shí)所述菌株保留pMJPC1，并將該菌株命名為黃色短桿菌MJ233/PC/ΔLDH菌株。
(D)丙酮酸羧化酶活性將上面(C)部分中得到的轉(zhuǎn)化體菌株黃色短桿菌MJ233/PC/ΔLDH在含有2％葡萄糖和25mg/l卡那霉素的100ml培養(yǎng)基A中過夜培養(yǎng)。收獲所得的細(xì)菌細(xì)胞然后用50ml 50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.5)洗滌，然后在20ml具有如上述同樣的組成的緩沖液中重懸。將上述懸浮液用SONIFIER 350(由Branson制造)進(jìn)行超聲處理，然后提供離心的上清作為無-細(xì)胞提取物。應(yīng)用得到的無-細(xì)胞提取物測定丙酮酸羧化酶活性。通過使所述的酶在25℃在含有100mMTris/HCl緩沖液(pH 7.5)、0.1mg/10ml生物素、5mM氯化鎂、50mM碳酸氫鈉、50mM丙酮酸鈉、5mM三磷酸腺苷二鈉(adenosine triphosphate disodium)、0.32mM NADH、20單位/1.5ml蘋果酸脫氫酶(由WAKO制造，來源于酵母)和酶的反應(yīng)溶液中進(jìn)行反應(yīng)來測量酶活性。一單位(1U)定義為每分鐘催化減少1μmol NADH的酶量。用丙酮酸羧化酶基因轉(zhuǎn)化的菌株的無-細(xì)胞提取物中的比活性為0.2U/mg蛋白。在另一方面，在通過相似地應(yīng)用培養(yǎng)基A培育親代MJ233/ΔLDH菌株制備的細(xì)菌細(xì)胞中，通過所述活性測定方法沒有檢測到丙酮酸羧化酶活性。
實(shí)施例5克隆大腸桿菌延胡索酸還原酶基因(A)提取大腸桿菌DNA在10ml LB培養(yǎng)基中培育大腸桿菌JM109菌株直到對(duì)數(shù)生長末期，然后將得到的細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)過實(shí)施例1的(A)部分中描述的方法制備基因組DNA。
(B)克隆大腸桿菌延胡索酸還原酶基因所述的大腸桿菌延胡索酸還原酶基因通過應(yīng)用前面(A)部分中制備的DNA作為模板，和基于其全部基因組序列已報(bào)道的(GenBank Database登記號(hào)U00096)大腸桿菌K12-MG1655菌株的基因序列設(shè)計(jì)而合成的DNAs(SEQID NOs17和18)，進(jìn)行PCR而得到。
所述反應(yīng)溶液的組成如下將1μL模板DNA、0.2μL PfxDNA聚合酶(可由Invitrogen Co.，Ltd.得到)、1-倍濃度的提供的緩沖液、0.3μM各自的引物、1mM MgSO4和0.25μM dNTPs混合，并將總體積調(diào)節(jié)到20μL。
反應(yīng)溫度條件如下應(yīng)用由MJ Research Co.，Ltd.制造的DNA熱循環(huán)儀PTC-2000，并將94℃、20秒和68℃、4分鐘的循環(huán)重復(fù)35次。對(duì)于第一個(gè)循環(huán)，在94℃保溫進(jìn)行1分20秒。對(duì)于最后的循環(huán)，在68℃保溫進(jìn)行10分鐘。完成PCR之后，加入0.1μl的Takara Ex Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)并在72℃保持30分鐘。
擴(kuò)增的產(chǎn)物通過在0.75％瓊脂糖(SeaKem GTG瓊脂糖，可從FMCBioProducts得到)凝膠電泳中分離然后用溴化乙錠染色顯現(xiàn)來分析，以由此檢測大約3.8kb的片段。應(yīng)用QIAQuick凝膠提取試劑盒(由QIAGEN制造)從所述的凝膠中回收目標(biāo)DNA片段。
將回收的DNA片段與PCR產(chǎn)物-克隆載體pT7 Blue T-載體(由Novagen制造)混合，并通過應(yīng)用Ligation Kit ver.2(由Takara Shuzo Co.，Ltd.制造)連接于其上，而且得到的質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得到的重組大腸桿菌鋪在含有50μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL X-Gal的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
將此培養(yǎng)基上形成白色菌落的克隆根據(jù)常規(guī)方法在液體培養(yǎng)物中進(jìn)行培育，然后純化所述的質(zhì)粒DNA。將得到的質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶HindIII和KpnI消化，由此確認(rèn)大約3.9kb的插入片段，并命名為pFRD6.0。
pFRD6.0的插入片段的核苷酸序列應(yīng)用由Applied Biosystems，Inc.制造的核苷酸測序設(shè)備(377XL型)和BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit ver.3進(jìn)行測定。得到的核苷酸序列和預(yù)測的氨基酸序列在SEQ ID NOs19和20-23中描述。
實(shí)施例6構(gòu)建丙酮酸羧化酶/延胡索酸還原酶活性增加的菌株(A)修飾pMJPC1的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)將實(shí)施例3中構(gòu)建的pMJPC1用限制性內(nèi)切酶KpnI完全消化，而且其5′-末端通過與小牛小腸(Calfintestine)堿性磷酸酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)反應(yīng)脫磷酸。由具有磷酸化的5′-末端的合成的DNAs(SEQ ID NOs24和25)組成的DNA接頭與得到的片段混合，并應(yīng)用Ligation Kit ver.2(可由TakaraShuzo Co.，Ltd.得到)連接與其上，而且所得的質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α菌株)。將得到的重組大腸桿菌鋪于含有50μg/mL卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基。
將此培養(yǎng)基上生長的菌株通過常規(guī)方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后分離所述的質(zhì)粒DNA。在得到的質(zhì)粒DNA中，選擇能用限制性內(nèi)切酶NdeI消化的質(zhì)粒DNA，并命名為pMJPC1.1。
(B)增加丙酮酸羧化酶和延胡索酸還原酶活性的質(zhì)粒構(gòu)建通過用限制性內(nèi)切酶HindIII消化實(shí)施例5中制備的pFRD6.0，用Klenow片段使其末端平末端化，并用限制性內(nèi)切酶KpnI消化得到大約3.9kb的DNA片段。該DNA片段在0.75％瓊脂糖凝膠電泳中分離并回收。將含有大腸桿菌延胡索酸還原酶基因的制備的片段混合并應(yīng)用Ligation Kit ver.2(可由TakaraShuzo Co.，Ltd.得到)連接到DNA，所述DNA用限制性內(nèi)切酶NdeI消化上述(A)部分中制備的pMJPC1.1，用Klenow片段使其末端平末端化，然后用限制性內(nèi)切酶KpnI消化得到。所得的質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α菌株)。將得到的重組大腸桿菌鋪于含有50μg/mL卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基。
將此培養(yǎng)基上生長的菌株通過常規(guī)方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后分離所述的質(zhì)粒DNA。在限制性內(nèi)切酶HindIII消化之后，所得的質(zhì)粒DNA顯示505、2,132、2,675、3,775和4,193bp。因此，可斷定所述的DNA具有圖5所示的結(jié)構(gòu)，并將此質(zhì)粒命名為pFRPC1.1.
(B)轉(zhuǎn)化黃色短桿菌MJ233/ΔLDH菌株用pFRPC1.1轉(zhuǎn)化黃色短桿菌MJ233/ΔLDH菌株通過實(shí)施例4的(C)部分中描述的方法來進(jìn)行，以由此得到具有質(zhì)粒pFRPC1.1的菌株。將此菌株命名為黃色短桿菌MJ233/FRD/PC/ΔLDH菌株。
(C)FRD酶活性測定將由上面(B)部分制備的轉(zhuǎn)化體，黃色短桿菌MJ233/FRD/PC/ΔLDH菌株，在100ml含有2％葡萄糖和25mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基A中過夜培養(yǎng)。收集所得的細(xì)菌細(xì)胞并用50ml 50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.5)來洗滌，然后在20ml具有如上述同樣的組成的緩沖液中重懸。將上述懸浮液用SONIFIER 350(由Branson制造)進(jìn)行超聲處理，并將離心的上清用作無-細(xì)胞提取物。應(yīng)用上述無-細(xì)胞提取物測定延胡索酸還原酶活性。通過使所述的提取物在25℃在含有33mM Tris/HCl緩沖液(pH 7.5)、0.1mM EDTA、20mM琥珀酸鈉、2mMK3Fe(CN)6和酶的反應(yīng)溶液中進(jìn)行反應(yīng)來測量酶活性。一單位(1U)定義為每分鐘催化減少2μmol K3Fe(CN)6的酶量。表達(dá)所述質(zhì)粒pFRRC1.1的菌株的無-細(xì)胞提取物中延胡索酸還原酶的比活性為0.02U/mg-蛋白。在另一方面，通過在培養(yǎng)基A中相似地培養(yǎng)親代MJ233/ΔLDH菌株制備的細(xì)菌細(xì)胞中，所述比活性為0.01U/mg-蛋白。
實(shí)施例7克隆棒狀細(xì)菌的琥珀酸脫氫酶基因黃色短桿菌MJ233菌株的琥珀酸脫氫酶(SDH)基因(在下文中，稱作sdhC、sdhA和sdhB)應(yīng)用基于谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的基因的核苷酸序列(GenBank Database Accession NO.NC_003450)設(shè)計(jì)而合成的DNA作為引物通過PCR來獲得。具體地，含有形成包含sdhC-sdhA-sdhB的操縱子所述基因的DNA片段(SEQ ID NO28)應(yīng)用具有SEQ ID NOs26和27的合成的DNA作為引物并應(yīng)用黃色短桿菌MJ233的染色體DNA作為模板通過PCR獲得。所述的PCR應(yīng)用KOD-PLUS-(由TOYOBO Co.，Ltd.制造)根據(jù)如下條件來實(shí)施，一步在94℃進(jìn)行保溫5分鐘，然后將在94℃變性15秒，在56℃退火30秒，和在72℃延伸4分鐘的循環(huán)重復(fù)25次。所得的PCR產(chǎn)物通過常規(guī)方法純化然后用SmaI消化。將所述DNA片段混合并應(yīng)用Ligation Kit ver.2(由Takara Bio Inc.制造)連接到通過用SalI消化pVK7(JP10-215883A)然后用DNA-Blunting Kit(由Takara Bio Inc.制造)平末端化而制備的DNA片段。此質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞(由Takara Bio Inc.制造)，然后將所述的轉(zhuǎn)化體鋪于含有25μg/ml卡那霉素(在下文中，簡稱為Km)的LB培養(yǎng)基上，然后過夜培養(yǎng)。隨后，挑取形成的菌落并分離單菌落，并由此得到轉(zhuǎn)化體。從該轉(zhuǎn)化體提取質(zhì)粒，并將其中插入PCR產(chǎn)物的該質(zhì)粒命名為pVKSDH。構(gòu)建pVKSDH的步驟顯示于圖6。
實(shí)施例8增加丙酮酸羧化酶和琥珀酸脫氫酶活性的質(zhì)粒的構(gòu)建將通過用XbaI和Sse837I消化實(shí)施例7中構(gòu)建的pVKSDH得到的含有三個(gè)基因sdhC、sdhA和sdhB的DNA片段混合并通過DNALigation Kit ver.2(由Takara Bio Inc.制造)連接于通過用XbaI和Sse8387I消化pHSG399(由TakaraBio Inc.制造)制備的片段。此DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞(由Takara Bio Inc.制造)，然后將所述轉(zhuǎn)化體鋪于含有25μg/ml氯霉素(在下文中，簡稱為Cm)、50μg/ml X-Gal和1mM IPTG的LB培養(yǎng)基，然后過夜培養(yǎng)。隨后，挑取呈現(xiàn)白色的菌落并分離單菌落，由此得到轉(zhuǎn)化體。從該轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，并將其中插入含有sdhC、sdhA和sdhB的DNA片段的質(zhì)粒命名為pHSGSDH(圖7)。
在另一方面，通過用KpnI和NdeI消化攜帶實(shí)施例6中描述的大腸桿菌的延胡索酸還原酶基因和來自黃色短桿菌的pyc基因的質(zhì)粒pFRPC1.1，能回收含有除去來自大腸桿菌的延胡索酸還原酶基因之外的殘留區(qū)域的片段。因此，用KpnI和NdeI消化pFRPC1.1和末端平末端化，和除去延胡索酸還原酶(furmarate reductase)基因，并回收殘余的DNA片段。將通過用XbaI和Sse8387I消化pHSGSDH得到的含有sdhC、sdhA和sdhB的DNA片段進(jìn)行末端-平末端化，然后連接于回收的DNA片段。此DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞(由Takara Bio Inc.制造)，并將該轉(zhuǎn)化體鋪于含有25μg/mlKm的LB培養(yǎng)基上，然后過夜培養(yǎng)。隨后，挑取呈現(xiàn)白色的菌落并分離單菌落，由此得到轉(zhuǎn)化體。從該轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，并將其中插入含有sdhC、sdhA和sdhB同時(shí)去除frdA、frdB、frdC和frdD基因的DNA片段的質(zhì)粒命名為pSDHPC(圖8)。
實(shí)施例9構(gòu)建其中丙酮酸羧化酶和琥珀酸脫氫酶增加的菌株實(shí)施例7和實(shí)施例8中分別得到的pVKSDH和pSDHPC都能在棒狀細(xì)菌的細(xì)胞中自主復(fù)制。因此，每個(gè)所述質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化棒狀細(xì)菌，并由此得到轉(zhuǎn)化體。用pVKSDH和pSDHPC中的每個(gè)通過電脈沖的方法轉(zhuǎn)化實(shí)施例2中構(gòu)建的MJ233/ΔLDH菌株，然后鋪于含有25-μg/ml卡那霉素的CM-Dex培養(yǎng)基(5g/L葡萄糖、10g/L多蛋白胨(polypeptone)、10g/L酵母提取物、1g/LKH2PO4、0.4g/L MgSO4·7H2O、0.01g/L FeSO4·7H2O、0.01g/L MnSO4·7H2O、3g/L脲、1.2g/L大豆水解物(soybean hydrolysate)、pH 7.5(KOH)和15g/L瓊脂)，然后在31.5℃培養(yǎng)大約24小時(shí)。
在此培養(yǎng)基上生長的菌株是其中導(dǎo)入所述質(zhì)粒的菌株。所得的轉(zhuǎn)化體分別命名為MJ233/SDH/ΔLDH和MJ233/SDH/PC/ΔLDH。此外，為了制備對(duì)照菌株，將實(shí)施例4中構(gòu)造的質(zhì)粒pVK7和質(zhì)粒pMJPC1通過上面的方法導(dǎo)入MJ233/ΔLDH菌株。所得的轉(zhuǎn)化體分別命名為MJ233/ΔLDH/pVK7和MJ233/PC/ΔLDH。
實(shí)施例10細(xì)菌細(xì)胞反應(yīng)(碳酸銨中和，半-好氧反應(yīng))將100ml培養(yǎng)基(其中包含4g脲、14g硫酸銨、0.5g磷酸二氫鉀、0.5g磷酸氫二鉀、0.5g七水合硫酸鎂(magnesium sulfate 7hydrate)、20mg七水合硫酸亞鐵、20mg水合硫酸錳、200μg D-生物素、200μg鹽酸硫胺素、1g酵母提取物、1g酪蛋白氨基酸和1000ml的蒸餾水)傾倒入500-mL錐形瓶，然后在120℃熱-滅菌20分鐘。將其冷卻到室溫，然后加入4mL預(yù)先滅菌的50％葡萄糖水溶液和50μL已經(jīng)通過過濾除菌的5％卡那霉素溶液，并用于實(shí)施例6(B)中制備的黃色短桿菌MJ233/FRD/PC/ΔLDH菌株在30℃進(jìn)行24小時(shí)種子培養(yǎng)。將含有12g脲、42g硫酸銨、1.5g磷酸二氫鉀、1.5g磷酸氫二鉀、1.5g七水合硫酸鎂、60mg七水合硫酸亞鐵、60mg水合硫酸錳、600μgD-生物素、600μg鹽酸硫胺素、3g酵母提取物、3g酪蛋白氨基酸、1ml消泡劑(Adecanol LG294由Asahi Denka Kogyo K.K.制造)和2,500ml蒸餾水的培養(yǎng)基傾倒入5-L發(fā)酵罐，然后在120℃熱-滅菌20分鐘。將其冷卻到室溫，然后加入500mL預(yù)先滅菌的12％葡萄糖水性(aqueous)溶液，然后將所述種子培養(yǎng)物的總量加入該培養(yǎng)基并在30℃培養(yǎng)。在500mL每分鐘的通氣速率和500rpm的攪拌速率的條件下進(jìn)行主要的培養(yǎng)。12小時(shí)后，葡萄糖幾乎全部被消耗。
將含有0.2g七水合硫酸鎂、8mg七水合硫酸亞鐵、8mg水合硫酸錳、80μg D-生物素、80μg鹽酸硫胺素、1mL消泡劑(Adecanol LG294由AsahiDenka Kogyo K.K.制造)和200mL蒸餾水的培養(yǎng)基傾倒入500-mL錐形瓶，然后在120℃熱-滅菌20分鐘。所述培養(yǎng)基冷卻到室溫后，將其加入從如上所述通過主要培養(yǎng)得到的培養(yǎng)溶液中通過在8,000rpm離心5分鐘收獲的細(xì)菌細(xì)胞，以使所述細(xì)菌細(xì)胞以60的O.D.(660nm)重懸。在1-L發(fā)酵罐中，加入200mL懸浮液和200mL預(yù)先-滅菌的20％葡萄糖溶液，并保溫在35℃。用2M碳酸銨將pH保持在7.6，并在100mL每分鐘的通氣速率和400rpm的攪拌速率的條件下進(jìn)行所述反應(yīng)。
在所述反應(yīng)開始后大約20小時(shí)，葡萄糖幾乎全部被消耗。所述葡萄糖消耗速率為5.00g/L/h，所述琥珀酸產(chǎn)生速率為2.66g/L/h且其收率為70.1％。相比之下，當(dāng)實(shí)施例4(C)中制備的黃色短桿菌MJ233/PC/ΔLDH菌株以如上所述同樣的方式進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，所述葡萄糖消耗速率為4.74g/L/h，所述琥珀酸產(chǎn)生速率為2.13g/L/h且其收率為58.7％。
實(shí)施例11細(xì)菌細(xì)胞反應(yīng)(碳酸銨中和，厭氧反應(yīng))以如前面實(shí)施例10所述同樣的方式制備反應(yīng)懸浮液，并用2M碳酸銨將所述pH保持在7.6，在200rpm攪拌無通氣的條件下進(jìn)行反應(yīng)。所述反應(yīng)開始后大約40小時(shí)，葡萄糖幾乎全部被消耗。所述葡萄糖消耗速率為2.50g/L/h，所述琥珀酸產(chǎn)生速率為1.35g/L/h且其收率為78.4％。相比之下，當(dāng)實(shí)施例4(c)中制備的黃色短桿菌MJ233/PC/ΔLDH菌株以如上所述同樣的方式進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，所述葡萄糖消耗速率為2.38g/L/h，所述琥珀酸產(chǎn)生速率為1.21g/L/h且其收率為74.4％。
實(shí)施例12細(xì)菌細(xì)胞反應(yīng)(碳酸鈉中和，半-好氧反應(yīng))以如前面實(shí)施例10所述同樣的方式制備反應(yīng)懸浮液，并用2M碳酸鈉將所述pH保持在7.6，并類似地實(shí)施反應(yīng)。所述反應(yīng)開始后大約28小時(shí)，葡萄糖幾乎全部被消耗。所述葡萄糖消耗速率為3.60g/L/h，所述琥珀酸產(chǎn)生速率為2.27g/L/h且其收率為82.8％。相比之下，當(dāng)實(shí)施例4(C)中制備的黃色短桿菌MJ233/PC/ΔLDH菌株以如上所述同樣的方式進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，所述葡萄糖消耗速率為2.97g/L/h，所述琥珀酸產(chǎn)生速率為1.97g/L/h且其收率為88.0％。
實(shí)施例13細(xì)菌細(xì)胞反應(yīng)(碳酸鈉中和，厭氧反應(yīng))以如前面實(shí)施例10所述同樣的方式制備反應(yīng)懸浮液，并用2M碳酸鈉將所述pH保持在7.6，在200rpm攪拌無通氣的條件下進(jìn)行反應(yīng)。所述反應(yīng)開始后大約32小時(shí)，葡萄糖幾乎全部被消耗。所述葡萄糖消耗速率為3.13g/L/h，所述琥珀酸產(chǎn)生速率為1.80g/L/h且其收率為97.1％。相比之下，當(dāng)實(shí)施例4(c)中制備的黃色短桿菌MJ233/PC/ΔLDH菌株以如上所述同樣的方式進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，所述葡萄糖消耗速率為2.70g/L/h，所述琥珀酸產(chǎn)生速率為1.57g/L/h且其收率為88.6％。
表1

實(shí)施例14細(xì)菌細(xì)胞反應(yīng)(碳酸鎂中和，厭氧培養(yǎng))如下培養(yǎng)黃色短桿菌MJ233/ΔLDH/pVK7菌株和MJ233/SDH/PC/ΔLDH菌株由于產(chǎn)生琥珀酸。將在CM-Dex平板(含有25μg/ml卡那霉素)上培養(yǎng)的MJ233/ΔLDH/pVK7菌株和MJ233/SDH/PC/ΔLDH菌株的細(xì)菌細(xì)胞接種到3ml種子培養(yǎng)基(10g/L葡萄糖、2.5g/L(NH4)2SO4、0.5g/L KH2PO4、0.25g/LMgSO4·7H2O、2g/L脲、0.01g/L FeSO4·7H2O、0.01g/L MnSO4·7H2O、50μg/L生物素、100μg/L VB1·HCl、15mg/L原兒茶酸(protocatechuic acid)、0.02mg/LCuSO4和10mg/L CaCl2及pH 7.0(KOH))。在好氧條件下，將這些菌株在31.5℃振蕩培養(yǎng)大約15小時(shí)。
然后，加入3ml的主要培養(yǎng)基(100g/L葡萄糖、5g/L(NH4)2SO4、2g/LKH2PO4、3g/L脲、0.01g/L FeSO4·7H2O、0.01g/L MnSO4·7H2O、200μg/L生物素、200μg/L VB1·HCl和71.4g/L MgCO3，每個(gè)濃度是加入后的終濃度，pH 6.8(NaOH))，并進(jìn)行琥珀酸產(chǎn)生培養(yǎng)，同時(shí)將所述的管用硅蓋子密封以防止通氣。所述培育在31.5℃進(jìn)行大約48小時(shí)，并在所述培養(yǎng)基中糖消失之前終止。
所述培養(yǎng)完成后，在將所述培養(yǎng)基合適地稀釋之后通過液相色譜分析琥珀酸和副產(chǎn)物乙酸在培養(yǎng)基中的累積量。兩個(gè)Shim-packSCR-102H(Simadzu)柱子串聯(lián)連接并用作柱子，并用5mM對(duì)-甲苯磺酸(p-toluene sulfonic acid)在40℃洗脫樣品。所述洗脫物應(yīng)用含有5mM對(duì)-甲苯磺酸和100μM EDTA的20mM Bis-Tris水溶液來中和。所述琥珀酸和乙酸通過用CDD-10AD(Simadzu)測定電導(dǎo)率來測量。所述結(jié)果顯示于表2中。
發(fā)現(xiàn)與通過將載體質(zhì)粒導(dǎo)入相同宿主得到的MJ233/ALDH/pVK7菌株琥珀酸相比，MJ233/SDH/ΔLDH菌株的收率增加大約4％。此外，蘋果酸的積累減少3.6g/L且延胡索酸的積累減少0.5g/L。
表2由SDH-擴(kuò)增的菌株產(chǎn)生琥珀酸、蘋果酸和延胡索酸

(B)SDH和PC同時(shí)擴(kuò)增的菌株的培養(yǎng)評(píng)價(jià)如下培養(yǎng)黃色短桿菌MJ233/PC/ΔLDH菌株和MJ233/SDH/PC/ΔLDH菌株用于琥珀酸生產(chǎn)。在CM-Dex平板上培養(yǎng)的MJ233/PC/ΔLDH菌株和MJ233/SDH/PC/ΔLDH菌株的細(xì)菌細(xì)胞接種于3ml的培養(yǎng)基A(20g/L葡萄糖、14g/L(NH4)2SO4、0.5g/L KH2PO4、0.5g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、4g/L脲、0.02g/L FeSO4·7H2O、0.02g/L MnSO4·7H2O、200μg/L生物素、200μg/LVB1·HCl，1g/L酪蛋白氨基酸和1g/L酵母提取物)中。在好氧條件下，這些菌株在管中振蕩的同時(shí)在31.5℃培育大約15小時(shí)。
其后，加入3ml主要溶液(200g/L葡萄糖、30g/L亞硫酸鈉和142.8g/LMgCO3)，并進(jìn)行琥珀酸產(chǎn)生培養(yǎng)，同時(shí)將所述的管用硅蓋子密封以防止通氣。所述培育在31.5℃進(jìn)行大約48小時(shí)，并在所述培養(yǎng)基中糖消失之前終止。
所述培養(yǎng)完成后，在將所述培養(yǎng)基合適地稀釋之后通過液相色譜分析琥珀酸和副產(chǎn)物乙酸在培養(yǎng)基中的累積量。兩個(gè)Shim-packSCR-102H(Simadzu)柱子串聯(lián)連接并用作柱子，并用5mM對(duì)-甲苯磺酸在40℃洗脫樣品。所述洗脫物應(yīng)用含有5mM對(duì)-甲苯磺酸和100μM EDTA的20mM Bis-Tris水溶液來中和。所述琥珀酸和副產(chǎn)物乙酸通過用CDD-10AD(Simadzu)測定電導(dǎo)率來測量。所述結(jié)果顯示于表3中。
通過SDH和PC的組合擴(kuò)增的菌株產(chǎn)生琥珀酸、蘋果酸和延胡索酸

在MJ233/SDH/PC/ΔLDH菌株中，與其中只有PC增加的MJ233/PC/ΔLDH菌株相比，琥珀酸的收率增加大約3％，同時(shí)蘋果酸的積累減少3.2g/L而延胡索酸的積累減少0.2g/L。
考慮到這些結(jié)果和上面(A)部分的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增SDH基因可有效地增加琥珀酸的收率又降低作為產(chǎn)生琥珀酸的副產(chǎn)物的蘋果酸和延胡索酸的量。
工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)生方法，能高效快速地產(chǎn)生琥珀酸。產(chǎn)生的琥珀酸可用作食物添加劑、藥物、化妝品等。此外，可應(yīng)用所產(chǎn)生琥珀酸作為原料通過實(shí)施聚合反應(yīng)來產(chǎn)生含有琥珀酸的聚合物。
序列表<110>三菱化學(xué)株式會(huì)社(Mitsubishi Chemical Corporation)味之素株式會(huì)社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>產(chǎn)生琥珀酸的方法<130>A4050<150>JP2003-304443<151>2003-08-28<160>31<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>1cctttttaac ccatcacata tacctgccgt tcac34<210>2<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>2aaaggttagg aatacggtta gccatttgcc tg 32<210>3<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>3gaggtctgcc tcgtgaagaa g 21<210>4<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物
<400>4ctcattagaa aaactcatcg agcatca27<210>5<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>5cgatgaaaga aaccgtcggc20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>6cgtcagaaga actgcttctg20<210>7<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>7agttgcatac gcatacgcac tga23<210>8<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>8gagactggga ctgcaacgtc ttg23<210>9<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>9gatctttcag ctgctcacac gtga 24<210>10<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>10gatcttaggt cactaaaact aattcag27<210>11<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>11gatccaggag gcattaatta agcggccgcg ggccctgca 39<210>12<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>12gggcccgcgg ccgcttaatt aatgcctcct g 31<210>13<211>43<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>13accttaatta atgtcgactc acacatcttc aacgcttcca gca 43<210>14<211>44<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物<400>14gttgggccca ggtttaggaa acgacgacga tcaagtcgcc acct 44<210>15<211>3423<212>DNA<213>黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)<220>
<221>CDS<222>(1)..(3420)<223>
<400>15atg tcg act cac aca tct tca acg ctt cca gca ttc aaa aag atc ttg48Met Ser Thr His Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ala Phe Lys Lys Ile Leu1 5 10 15gta gca aac cgc ggc gaa atc gcg gtc cgt gct ttc cgt gca gca ctc96Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Val Arg Ala Phe Arg Ala Ala Leu20 25 30gaa acc ggt gca gcc acg gta gct att tac ccc cgt gaa gat cgg gga144Glu Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Ile Tyr Pro Arg Glu Asp Arg Gly35 40 45tca ttc cac cgc tct ttt gct tct gaa gct gtc cgc att ggt act gaa192Ser Phe His Arg Ser Phe Ala Ser Glu Ala Val Arg Ile Gly Thr Glu50 55 60ggc tca cca gtc aag gcg tac ctg gac atc gat gaa att atc ggt gca240Gly Ser Pro Val Lys Ala Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Ile Ile Gly Ala65 70 75 80gct aaa aaa gtt aaa gca gat gct att tac ccg gga tat ggc ttc ctg288Ala Lys Lys Val Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Pro Gly Tyr Gly Phe Leu85 90 95tct gaa aat gcc cag ctt gcc cgc gag tgc gcg gaa aac ggc att act336Ser Glu Asn Ala Gln Leu Ala Arg Glu Cys Ala Glu Asn Gly Ile Thr100 105 110ttt att ggc cca acc cca gag gtt ctt gat ctc acc ggt gat aag tct384Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Val Leu Asp Leu Thr Gly Asp Lys Ser115 120 125cgt gcg gta acc gcc gcg aag aag gct ggt ctg cca gtt ttg gcg gaa432Arg Ala Val Thr Ala Ala Lys Lys Ala Gly Leu Pro Val Leu Ala Glu130 135 140tcc acc ccg agc aaa aac atc gat gac atc gtt aaa agc gct gaa ggc480Ser Thr Pro Ser Lys Asn Ile Asp Asp Ile Val Lys Ser Ala Glu Gly145 150 155 160cag act tac ccc atc ttt gta aag gca gtt gcc ggt ggt ggc gga cgc528Gln Thr Tyr Pro Ile Phe Val Lys Ala Val Ala Gly Gly Gly Gly Arg165 170 175ggt atg cgc ttt gtt tct tca cct gat gag ctt cgc aaa ttg gca aca576Gly Met Arg Phe Val Ser Ser Pro Asp Glu Leu Arg Lys Leu Ala Thr180 185 190gaa gca tct cgt gaa gct gaa gcg gca ttc ggc gac ggt tcg gta tat624Glu Ala Ser Arg Glu Ala Glu Ala Ala Phe Gly Asp Gly Ser Val Tyr195 200 205gtc gag cgt gct gtg att aac ccc cag cac att gaa gtg cag atc ctt672
Val Glu Arg Ala Val Ile Asn Pro Gln His Ile Glu Val Gln Ile Leu210 215 220ggc gat cgc act gga gaa gtt gta cac ctt tat gaa cgt gac tgc tca720Gly Asp Arg Thr Gly Glu Val Val His Leu Tyr Glu Arg Asp Cys Ser225 230 235 240ctg cag cgt cgt cac caa aaa gtt gtc gaa att gcg cca gca cag cat768Leu Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Ile Ala Pro Ala Gln His245 250 255ttg gat cca gaa ctg cgt gat cgc att tgt gcg gat gca gta aag ttc816Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Ile Cys Ala Asp Ala Val Lys Phe260 265 270tgc cgc tcc att ggt tac cag ggc gcg gga act gtg gaa ttc ttg gtc864Cys Arg Ser Ile Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val275 280 285gat gaa aag ggc aac cac gtt ttc atc gaa atg aac cca cgt atc cag912Asp Glu Lys Gly Asn His Val Phe Ile Glu Met Asn Pro Arg Ile Gln290 295 300gtt gag cac acc gtg act gaa gaa gtc acc gag gtg gac ctg gtg aag960Val Glu His Thr Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Val Asp Leu Val Lys305 310 315 320gcg cag atg cgc ttg gct gct ggt gca acc ttg aag gaa ttg ggt ctg1008Ala Gln Met Arg Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu325 330 335acc caa gat aag atc aag acc cac ggt gcg gca ctg cag tgc cgc atc1056Thr Gln Asp Lys Ile Lys Thr His Gly Ala Ala Leu Gln Cys Arg Ile340 345 350acc acg gaa gat cca aac aac ggc ttc cgc cca gat acc gga act atc1104Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro Asp Thr Gly Thr Ile355 360 365acc gcg tac cgc tca cca ggc gga gct ggc gtt cgt ctt gac ggt gca1152Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val Arg Leu Asp Gly Ala370 375 380gct cag ctc ggt ggc gaa atc acc gca cac ttt gac tcc atg ctg gtg1200Ala Gln Leu Gly Gly Glu Ile Thr Ala His Phe Asp Ser Met Leu Val385 390 395 400aaa atg acc tgc cgt ggt tcc gat ttt gaa act gct gtt gct cgt gca1248Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr Ala Val Ala Arg Ala405 410 415cag cgc gcg ttg gct gag ttc acc gtg tct ggt gtt gca acc aac att1296Gln Arg Ala Leu Ala Glu Phe Thr Val Ser Gly Val Ala Thr Asn Ile420 425 430ggt ttc ttg cgt gcg ttg ctg cgt gaa gag gac ttt act tcc aag cgc1344Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp Phe Thr Ser Lys Arg435 440 445atc gcc acc gga ttt atc ggc gat cac cca cac ctc ctt cag gct cca1392Ile Ala Thr Gly Phe Ile Gly Asp His Pro His Leu Leu Gln Ala Pro450 455 460cct gcg gat gat gag cag gga cgc atc ctg gat tac ttg gca gat gtc1440Pro Ala Asp Asp Glu Gln Gly Arg Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Val465 470 475 480acc gtg aac aag cct cat ggt gtg cgt cca aag gat gtt gca gca cca1488Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys Asp Val Ala Ala Pro485 490 495atc gat aag ctg ccc aac atc aag gat ctg cca ctg cca cgc ggt tcc1536Ile Asp Lys Leu Pro Asn Ile Lys Asp Leu Pro Leu Pro Arg Gly Ser500 505 510cgt gac cgc ctg aag cag ctt gga cca gca gcg ttt gcc cgc gat ctc1584Arg Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Ala Phe Ala Arg Asp Leu515 520 525
cgt gag cag gac gca ctg gca gtt act gat acc acc ttc cgc gat gca1632Arg Glu Gln Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala530 535 540cac cag tct ttg ctt gcg acc cga gtc cgc tca ttc gca ctg aag cct1680His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser Phe Ala Leu Lys Pro545 550 555 560gcg gca gag gcc gtc gca aag ctg act cct gag ctt ttg tcc gtg gag1728Ala Ala Glu Ala Val Ala Lys Leu Thr Pro Glu Leu Leu Ser Val Glu565 570 575gcc tgg ggc ggt gcg acc tac gat gtg gcg atg cgt ttc ctc ttt gag1776Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met Arg Phe Leu Phe Glu580 585 590gat ccg tgg gac agg ctc gac gag ctg cgc gag gcg atg ccg aat gtg1824Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu Ala Met Pro Asn Val595 600 605aac att cag atg ctg ctt cgc ggc cgc aac acc gtg gga tac acc cca1872Asn Ile Gln Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr Val Gly Tyr Thr Pro610 615 620tac cca gac tcc gtc tgt cgc gcg ttt gtt aag gaa gct gcc acc tcc1920Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys Glu Ala Ala Thr Ser625 630 635 640ggc gtg gac atc ttc cgc atc ttc gac gcg ctt aac gac gtc tcc cag1968Gly Val Asp Ile Phe Arg Ile Phe Asp Ala Leu Asn Asp Val Ser Gln645 650 655atg cgt cca gca atc gac gca gtc ctg gag acc aac acc gcg gtc gct2016Met Arg Pro Ala Ile Asp Ala Val Leu Glu Thr Asn Thr Ala Val Ala660 665 670gaa gtg gct atg gct tat tct ggt gat ctt tcc gat ccg aat gaa aag2064Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser Asp Pro Asn Glu Lys675 680 685ctc tac acc ctg gat tac tac ctg aag atg gca gag gag atc gtc aag2112Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala Glu Glu Ile Val Lys690 695 700tct ggc gct cac att ctg gct att aag gat atg gct ggt ctg ctt cgc2160Ser Gly Ala His Ile Leu Ala Ile Lys Asp Met Ala Gly Leu Leu Arg705 710 715 720cca gct gca gcc acc aag ctg gtc acc gca ctg cgc cgt gaa ttt gat2208Pro Ala Ala Ala Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu Arg Arg Glu Phe Asp725 730 735ctg cca gtg cac gtg cac acc cac gac act gcg ggt ggc cag ctg gca2256Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Ala Gly Gly Gln Leu Ala740 745 750acc tac ttt gct gca gct caa gct ggt gca gat gct gtt gac ggt gct2304Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp Gly Ala755 760 765tcc gca cca ctg tct ggc acc acc tcc cag cca tcc ctg tct gcc att2352Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro Ser Leu Ser Ala Ile770 775 780gtt gct gca ttc gcg cac acc cgt cgc gat acc ggt ttg agc ctc gag2400Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr Gly Leu Ser Leu Glu785 790 795 800gct gtt tct gac ctc gag cca tac tgg gaa gca gtg cgc gga ctg tac2448Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala Val Arg Gly Leu Tyr805 810 815ctg cca ttt gag tct gga acc cca ggc cca acc ggt cgc gtc tac cgc2496Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr Gly Arg Val Tyr Arg820 825 830cac gaa atc cca ggc gga cag ctg tcc aac ctg cgt gca cag gcc acc2544His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Gln Ala Thr
835 840 845gca ctg ggc ctt gcg gat cgt ttc gaa ctc atc gaa gac aac tac gcg2592Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu Ile Glu Asp Asn Tyr Ala850 855 860gca gtt aat gag atg ctg gga cgc cca acc aag gtc acc cca tcc tcc2640Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys Val Thr Pro Ser Ser865 870 875 880aag gtt gtt ggc gac ctc gca ctc cac ctc gtt ggt gcg ggt gtg gat2688Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val Gly Ala Gly Val Asp885 890 895cca gca gac ttt gct gca gat cca caa aag tac gac atc cca gac tct2736Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr Asp Ile Pro Asp Ser900 905 910gtc atc gcg ttc ctg cgc ggc gag ctt ggt aac cct cca ggt ggc tgg2784Val Ile Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn Pro Pro Gly Gly Trp915 920 925cca gag cca ctg cgc acc cgc gca ctg gaa ggc cgc tcc gaa ggc aag2832Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly Arg Ser Glu Gly Lys930 935 940gca cct ctg acg gaa gtt cct gag gaa gag cag gcg cac ctc gac gct2880Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln Ala His Leu Asp Ala945 950 955 960gat gat tcc aag gaa cgt cgc aac agc ctc aac cgc ctg ctg ttc ccg2928Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn Arg Leu Leu Phe Pro965 970 975aag cca acc gaa gag ttc ctc gag cac cgt cgc cgc ttc ggc aac acc2976Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg Arg Phe Gly Asn Thr980 985 990tct gcg ctg gat gat cgt gaa ttc ttc tac ggc ctg gtc gaa ggc cgc 3024Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly Leu Val Glu Gly Arg995 1000 1005gag act ttg atc cgc ctg cca gat gtg cgc acc cca ctg ctt gtt 3069Glu Thr Leu Ile Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr Pro Leu Leu Val1010 1015 1020cgc ctg gat gcg atc tcc gag cca gac gat aag ggt atg cgc aat 3114Arg Leu Asp Ala Ile Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly Met Arg Asn1025 1030 1035gtt gtg gcc aac gtc aac ggc cag atc cgc cca atg cgt gtg cgt 3159Val Val Ala Asn Val Asn Gly Gln Ile Arg Pro Met Arg Val Arg1040 1045 1050gac cgc tcc gtt gag tct gtc acc gca acc gca gaa aag gca gat 3204Asp Arg Ser Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala Asp1055 1060 1065tcc tcc aac aag ggc cat gtt gct gca cca ttc gct ggt gtt gtc 3249Ser Ser Asn Lys Gly His Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val1070 1075 1080act gtg act gtt gct gaa ggt gat gag gtc aag gct gga gat gca 3294Thr Val Thr Val Ala Glu Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala1085 1090 1095gtc gca atc atc gag gct atg aag atg gaa gca aca atc act gct 3339Val Ala Ile Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Ala Thr Ile Thr Ala1100 1105 1110tct gtt gac ggc aaa atc gat cgc gtt gtg gtt cct gct gca acg 3384Ser Val Asp Gly Lys Ile Asp Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr1115 1120 1125aag gtg gaa ggt ggc gac ttg atc gtc gtc gtt tcc taa 3423Lys Val Glu Gly Gly Asp Leu Ile Val Val Val Ser1130 1135 1140
<210>16<211>1140<212>PRT<213>黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)<400>16Met Ser Thr His Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ala Phe Lys Lys Ile Leu1 5 10 15Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Val Arg Ala Phe Arg Ala Ala Leu20 25 30Glu Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Ile Tyr Pro Arg Glu Asp Arg Gly35 40 45Ser Phe His Arg Ser Phe Ala Ser Glu Ala Val Arg Ile Gly Thr Glu50 55 60Gly Ser Pro Val Lys Ala Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Ile Ile Gly Ala65 70 75 80Ala Lys Lys Val Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Pro Gly Tyr Gly Phe Leu85 90 95Ser Glu Asn Ala Gln Leu Ala Arg Glu Cys Ala Glu Asn Gly Ile Thr100 105 110Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Val Leu Asp Leu Thr Gly Asp Lys Ser115 120 125Arg Ala Val Thr Ala Ala Lys Lys Ala Gly Leu Pro Val Leu Ala Glu130 135 140Ser Thr Pro Ser Lys Asn Ile Asp Asp Ile Val Lys Ser Ala Glu Gly145 150 155 160Gln Thr Tyr Pro Ile Phe Val Lys Ala Val Ala Gly Gly Gly Gly Arg165 170 175Gly Met Arg Phe Val Ser Ser Pro Asp Glu Leu Arg Lys Leu Ala Thr180 185 190Glu Ala Ser Arg Glu Ala Glu Ala Ala Phe Gly Asp Gly Ser Val Tyr195 200 205Val Glu Arg Ala Val Ile Asn Pro Gln His Ile Glu Val Gln Ile Leu210 215 220Gly Asp Arg Thr Gly Glu Val Val His Leu Tyr Glu Arg Asp Cys Ser225 230 235 240Leu Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Ile Ala Pro Ala Gln His245 250 255Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Ile Cys Ala Asp Ala Val Lys Phe260 265 270Cys Arg Ser Ile Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val275 280 285Asp Glu Lys Gly Asn His Val Phe Ile Glu Met Asn Pro Arg Ile Gln290 295 300Val Glu His Thr Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Val Asp Leu Val Lys305 310 315 320Ala Gln Met Arg Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu325 330 335Thr Gln Asp Lys Ile Lys Thr His Gly Ala Ala Leu Gln Cys Arg Ile340 345 350Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro Asp Thr Gly Thr Ile355 360 365Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val Arg Leu Asp Gly Ala370 375 380Ala Gln Leu Gly Gly Glu Ile Thr Ala His Phe Asp Ser Met Leu Val385 390 395 400Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr Ala Val Ala Arg Ala
405 410 415Gln Arg Ala Leu Ala Glu Phe Thr Val Ser Gly Val Ala Thr Asn Ile420 425 430Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp Phe Thr Ser Lys Arg435 440 445Ile Ala Thr Gly Phe Ile Gly Asp His Pro His Leu Leu Gln Ala Pro450 455 460Pro Ala Asp Asp Glu Gln Gly Arg Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Val465 470 475 480Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys Asp Val Ala Ala Pro485 490 495Ile Asp Lys Leu Pro Asn Ile Lys Asp Leu Pro Leu Pro Arg Gly Ser500 505 510Arg Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Ala Phe Ala Arg Asp Leu515 520 525Arg Glu Gln Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala530 535 540His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser Phe Ala Leu Lys Pro545 550 555 560Ala Ala Glu Ala Val Ala Lys Leu Thr Pro Glu Leu Leu Ser Val Glu565 570 575Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met Arg Phe Leu Phe Glu580 585 590Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu Ala Met Pro Asn Val595 600 605Asn Ile Gln Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr Val Gly Tyr Thr Pro610 615 620Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys Glu Ala Ala Thr Ser625 630 635 640Gly Val Asp Ile Phe Arg Ile Phe Asp Ala Leu Asn Asp Val Ser Gln645 650 655Met Arg Pro Ala Ile Asp Ala Val Leu Glu Thr Asn Thr Ala Val Ala660 665 670Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser Asp Pro Asn Glu Lys675 680 685Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala Glu Glu Ile Val Lys690 695 700Ser Gly Ala His Ile Leu Ala Ile Lys Asp Met Ala Gly Leu Leu Arg705 710 715 720Pro Ala Ala Ala Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu Arg Arg Glu Phe Asp725 730 735Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Ala Gly Gly Gln Leu Ala740 745 750Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp Gly Ala755 760 765Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro Ser Leu Ser Ala Ile770 775 780Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr Gly Leu Ser Leu Glu785 790 795 800Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala Val Arg Gly Leu Tyr805 810 815Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr Gly Arg Val Tyr Arg820 825 830His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Gln Ala Thr835 840 845Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu Ile Glu Asp Asn Tyr Ala850 855 860Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys Val Thr Pro Ser Ser865 870 875 880
Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val Gly Ala Gly Val Asp885 890 895Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr Asp Ile Pro Asp Ser900 905 910Val Ile Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn Pro Pro Gly Gly Trp915 920 925Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly Arg Ser Glu Gly Lys930 935 940Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln Ala His Leu Asp Ala945 950 955 960Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn Arg Leu Leu Phe Pro965 970 975Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg Arg Phe Gly Asn Thr980 985 990Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly Leu Val Glu Gly Arg995 1000 1005Glu Thr Leu Ile Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr Pro Leu Leu Val1010 1015 1020Arg Leu Asp Ala Ile Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly Met Arg Asn1025 1030 1035Val Val Ala Asn Val Asn Gly Gln Ile Arg Pro Met Arg Val Arg1040 1045 1050Asp Arg Ser Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala Asp1055 1060 1065Ser Ser Asn Lys Gly His Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val1070 1075 1080Thr Val Thr Val Ala Glu Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala1085 1090 1095Val Ala Ile Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Ala Thr Ile Thr Ala1100 1105 1110Ser Val Asp Gly Lys Ile Asp Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr1115 1120 1125Lys Val Glu Gly Gly Asp Leu Ile Val Val Val Ser1130 1135 1140<210>17<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>17ccacctgcag gactccacga tcggcaaaga aacga35<210>18<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>18ggtatttaaa aaggcgcaga gcgtcgtttt gaacatagg39
<210>19<211>3847<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<220>
<221>CDS<222>(440)..(2239)<223>
<220>
<221>CDS<222>(2241)..(2975)<223>
<220>
<221>CDS<222>(2986)..(3381)<223>
<220>
<221>CDS<222>(3392)..(3751)<223>
<400>19ccacctgcag gactccacga tcggcaaaga aacgacggat ctccgccata atcgccgcgc 60gttttaataa gttaggaatg gatgcgctcg gctgccagga tgccgtttcg ctcatagtta 120aatctccagt ttttgacaag ggcacgaagt ctactcgcaa cgcgacggcg agacaaattt 180tacgcaggaa tcaaacagcg gtgggcagtg actaaaaaaa gcacgatctg atggtttagt 240aattaaatta atcatcttca gtgataattt agccctcttg cgcactaaaa aaatcgatct 300cgtcaaattt cagacttatc catcagacta tactgttgta cctataaagg agcagtggaa 360tagcgttcgc agaccgtaac tttcaggtac ttaccctgaa gtacgtggct gtgggataaa 420aacaatctgg aggaatgtc gtg caa acc ttt caa gcc gat ctt gcc att gta 472Val Gln Thr Phe Gln Ala Asp Leu Ala Ile Val1 5 10ggc gcc ggt ggc gcg gga tta cgt gct gca att gct gcc gcg cag gca520Gly Ala Gly Gly Ala Gly Leu Arg Ala Ala Ile Ala Ala Ala Gln Ala15 20 25aat ccg aat gca aaa atc gca cta atc tca aaa gta tac ccg atg cgt568Asn Pro Asn Ala Lys Ile Ala Leu Ile Ser Lys Val Tyr Pro Met Arg30 35 40agc cat acc gtt gct gca gaa ggg ggc tcc gcc gct gtc gcg cag gat616Ser His Thr Val Ala Ala Glu Gly Gly Ser Ala Ala Val Ala Gln Asp45 50 55cat gac agc ttc gaa tat cac ttt cac gat aca gta gcg ggt ggc gac664His Asp Ser Phe Glu Tyr His Phe His Asp Thr Val Ala Gly Gly Asp60 65 70 75tgg ttg tgt gag cag gat gtc gtg gat tat ttc gtc cac cac tgc cca712Trp Leu Cys Glu Gln Asp Val Val Asp Tyr Phe Val His His Cys Pro80 85 90acc gaa atg acc caa ctg gaa ctg tgg gga tgc cca tgg agc cgt cgc760Thr Glu Met Thr Gln Leu Glu Leu Trp Gly Cys Pro Trp Ser Arg Arg95 100 105ccg gat ggt agc gtc aac gta cgt cgc ttc ggc ggc atg aaa atc gag808Pro Asp Gly Ser Val Asn Val Arg Arg Phe Gly Gly Met Lys Ile Glu110 115 120cgc acc tgg ttc gcc gcc gat aag acc ggc ttc cat atg ctg cac acg856
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750 755 760ctg aac cca gag ttc atc ggt ccg gct gcc att acg ctg gcg cat cgt2777Leu Asn Pro Glu Phe Ile Gly Pro Ala Ala Ile Thr Leu Ala His Arg765 770 775tat aac gaa gat agc cgc gac cac ggt aag aag gag cgt atg gcg cag2825Tyr Asn Glu Asp Ser Arg Asp His Gly Lys Lys Glu Arg Met Ala Gln780 785 790 795ttg aac agc cag aac ggc gta tgg agc tgt act ttc gtg ggc tac tgc2873Leu Asn Ser Gln Asn Gly Val Trp Ser Cys Thr Phe Val Gly Tyr Cys800 805 810tcc gaa gtc tgc ccg aaa cac gtc gat ccg gct gcg gcc att cag cag2921Ser Glu Val Cys Pro Lys His Val Asp Pro Ala Ala Ala Ile Gln Gln815 820 825ggc aaa gta gaa agt tcg aaa gac ttt ctt atc gcg acc ctg aaa cca2969Gly Lys Val Glu Ser Ser Lys Asp Phe Leu Ile Ala Thr Leu Lys Pro830 835 840cgc taa ggagtgcaac atg acg act aaa cgt aaa ccg tat gta cgg cca 3018ArgMet Thr Thr Lys Arg Lys Pro Tyr Val Arg Pro845 850 855atg acg tcc acc tgg tgg aaa aaa ttg ccg ttt tat cgc ttt tac atg3066Met Thr Ser Thr Trp Trp Lys Lys Leu Pro Phe Tyr Arg Phe Tyr Met860 865 870ctg cgc gaa ggc acg gcg gtt ccg gct gtg tgg ttc agc att gaa ctg3114Leu Arg Glu Gly Thr Ala Val Pro Ala Val Trp Phe Ser Ile Glu Leu875 880 885att ttc ggg ctg ttt gcc ctg aaa aat ggc ccg gaa gcc tgg gcg gga3162Ile Phe Gly Leu Phe Ala Leu Lys Asn Gly Pro Glu Ala Trp Ala Gly890 895 900ttc gtc gac ttt tta caa aac ccg gtt atc gtg atc att aac ctg atc3210Phe Val Asp Phe Leu Gln Asn Pro Val Ile Val Ile Ile Asn Leu Ile905 910 915act ctg gcg gca gct ctg ctg cac acc aaa acc tgg ttt gaa ctg gca3258Thr Leu Ala Ala Ala Leu Leu His Thr Lys Thr Trp Phe Glu Leu Ala920 925 930 935ccg aaa gcg gcc aat atc att gta aaa gac gaa aaa atg gga cca gag3306Pro Lys Ala Ala Asn Ile Ile Val Lys Asp Glu Lys Met Gly Pro Glu940 945 950cca att atc aaa agt ctc tgg gcg gta act gtg gtt gcc acc atc gta3354Pro Ile Ile Lys Ser Leu Trp Ala Val Thr Val Val Ala Thr Ile Val955 960 965atc ctg ttt gtt gcc ctg tac tgg taa ggagcctgag atg att aat cca 3403Ile Leu Phe Val Ala Leu Tyr TrpMet Ile Asn Pro970 975aat cca aag cgt tct gac gaa ccg gta ttc tgg ggc ctc ttc ggg gcc3451Asn Pro Lys Arg Ser Asp Glu Pro Val Phe Trp Gly Leu Phe Gly Ala980 985 990 995ggt ggt atg tgg agc gcc atc att gcg ccg gtg atg atc ctg ctg 3496Gly Gly Met Trp Ser Ala Ile Ile Ala Pro Val Met Ile Leu Leu1000 1005 1010gtg ggt att ctg ctg cca ctg ggg ttg ttt ccg ggt gat gcg ctg 3541Val Gly Ile Leu Leu Pro Leu Gly Leu Phe Pro Gly Asp Ala Leu1015 1020 1025agc tac gag cgc gtt ctg gcg ttc gcg cag agc ttc att ggt cgc 3586Ser Tyr Glu Arg Val Leu Ala Phe Ala Gln Ser Phe Ile Gly Arg1030 1035 1040gta ttc ctg ttc ctg atg atc gtt ctg ccg ctg tgg tgt ggt tta 3631Val Phe Leu Phe Leu Met Ile Val Leu Pro Leu Trp Cys Gly Leu1045 1050 1055cac cgt atg cac cac gcg atg cac gat ctg aaa atc cac gta cct 3676
His Arg Met His His Ala Met His Asp Leu Lys Ile His Val Pro1060 1065 1070gcg ggc aaa tgg gtt ttc tac ggt ctg gct gct atc ctg aca gtt 3721Ala Gly Lys Trp Val Phe Tyr Gly Leu Ala Ala Ile Leu Thr Val1075 1080 1085gtc acg ctg att ggt gtc gtt aca atc taa cgcatcgcca atgtaaatcc 3771Val Thr Leu Ile Gly Val Val Thr Ile1090ggcccgccta tggcgggccg ttttgtatgg aaaccagacc ctatgttcaa aacgacgctc 3831tgcgcctttt aatacc 3847<210>20<211>600<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>20Val Gln Thr Phe Gln Ala Asp Leu Ala Ile Val Gly Ala Gly Gly Ala1 5 10 15Gly Leu Arg Ala Ala Ile Ala Ala Ala Gln Ala Asn Pro Asn Ala Lys20 25 30Ile Ala Leu Ile Ser Lys Val Tyr Pro Met Arg Ser His Thr Val Ala35 40 45Ala Glu Gly Gly Ser Ala Ala Val Ala Gln Asp His Asp Ser Phe Glu50 55 60Tyr His Phe His Asp Thr Val Ala Gly Gly Asp Trp Leu Cys Glu Gln65 70 75 80Asp Val Val Asp Tyr Phe Val His His Cys Pro Thr Glu Met Thr Gln85 90 95Leu Glu Leu Trp Gly Cys Pro Trp Ser Arg Arg Pro Asp Gly Ser Val100 105 110Asn Val Arg Arg Phe Gly Gly Met Lys Ile Glu Arg Thr Trp Phe Ala115 120 125Ala Asp Lys Thr Gly Phe His Met Leu His Thr Leu Phe Gln Thr Ser130 135 140Leu Gln Phe Pro Gln Ile Gln Arg Phe Asp Glu His Phe Val Leu Asp145 150 155 160Ile Leu Val Asp Asp Gly His Val Arg Gly Leu Val Ala Met Asn Met165 170 175Met Glu Gly Thr Leu Val Gln Ile Arg Ala Asn Ala Val Val Met Ala180 185 190Thr Gly Gly Ala Gly Arg Val Tyr Arg Tyr Asn Thr Asn Gly Gly Ile195 200 205Val Thr Gly Asp Gly Met Gly Met Ala Leu Ser His Gly Val Pro Leu210 215 220Arg Asp Met Glu Phe Val Gln Tyr His Pro Thr Gly Leu Pro Gly Ser225 230 235 240Gly Ile Leu Met Thr Glu Gly Cys Arg Gly Glu Gly Gly Ile Leu Val245 250 255Asn Lys Asn Gly Tyr Arg Tyr Leu Gln Asp Tyr Gly Met Gly Pro Glu260 265 270Thr Pro Leu Gly Glu Pro Lys Asn Lys Tyr Met Glu Leu Gly Pro Arg275 280 285Asp Lys Val Ser Gln Ala Phe Trp His Glu Trp Arg Lys Gly Asn Thr290 295 300Ile Ser Thr Pro Arg Gly Asp Val Val Tyr Leu Asp Leu Arg His Leu305 310 315 320Gly Glu Lys Lys Leu His Glu Arg Leu Pro Phe Ile Cys Glu Leu Ala
325 330 335Lys Ala Tyr Val Gly Val Asp Pro Val Lys Glu Pro Ile Pro Val Arg340 345 350Pro Thr Ala His Tyr Thr Met Gly Gly Ile Glu Thr Asp Gln Asn Cys355 360 365Glu Thr Arg Ile Lys Gly Leu Phe Ala Val Gly Glu Cys Ser Ser Val370 375 380Gly Leu His Gly Ala Asn Arg Leu Gly Ser Asn Ser Leu Ala Glu Leu385 390 395 400Val Val Phe Gly Arg Leu Ala Gly Glu Gln Ala Thr Glu Arg Ala Ala405 410 415Thr Ala Gly Asn Gly Asn Glu Ala Ala Ile Glu Ala Gln Ala Ala Gly420 425 430Val Glu Gln Arg Leu Lys Asp Leu Val Asn Gln Asp Gly Gly Glu Asn435 440 445Trp Ala Lys Ile Arg Asp Glu Met Gly Leu Ala Met Glu Glu Gly Cys450 455 460Gly Ile Tyr Arg Thr Pro Glu Leu Met Gln Lys Thr Ile Asp Lys Leu465 470 475 480Ala Glu Leu Gln Glu Arg Phe Lys Arg Val Arg Ile Thr Asp Thr Ser485 490 495Ser Val Phe Asn Thr Asp Leu Leu Tyr Thr Ile Glu Leu Gly His Gly500 505 510Leu Asn Val Ala Glu Cys Met Ala His Ser Ala Met Ala Arg Lys Glu515 520 525Ser Arg Gly Ala His Gln Arg Leu Asp Glu Gly Cys Thr Glu Arg Asp530 535 540Asp Val Asn Phe Leu Lys His Thr Leu Ala Phe Arg Asp Ala Asp Gly545 550 555 560Thr Thr Arg Leu Glu Tyr Ser Asp Val Lys Ile Thr Thr Leu Pro Pro565 570 575Ala Lys Arg Val Tyr Gly Gly Glu Ala Asp Ala Ala Asp Lys Ala Glu580 585 590Ala Ala Asn Lys Lys Glu Lys Ala595 600<210>21<211>244<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>21Met Ala Glu Met Lys Asn Leu Lys Ile Glu Val Val Arg Tyr Asn Pro1 5 10 15Lys Val Asp Thr Ala Pro His Ser Ala Phe Tyr Glu Val Pro Tyr Asp20 25 30Ala Thr Thr Ser Leu Leu Asp Ala Leu Gly Tyr Ile Lys Asp Asn Leu35 40 45Ala Pro Asp Leu Ser Tyr Arg Trp Ser Cys Arg Met Ala Ile Cys Gly50 55 60Ser Cys Gly Met Met Val Asn Asn Val Pro Lys Leu Ala Cys Lys Thr65 70 75 80Phe Leu Arg Asp Tyr Thr Asp Gly Met Lys Val Glu Ala Leu Ala Asn85 90 95Phe Pro Ile Glu Arg Asp Leu Val Val Asp Met Thr His Phe Ile Glu100 105 110Ser Leu Glu Ala Ile Lys Pro Tyr Ile Ile Gly Asn Ser Arg Thr Ala115 120 125
Asp Gln Gly Thr Asn Ile Gln Thr Pro Ala Gln Met Ala Lys Tyr His130 135 140Gln Phe Ser Gly Cys Ile Asn Cys Gly Leu Cys Tyr Ala Ala Cys Pro145 150 155 160Gln Phe Gly Leu Asn Pro Glu Phe Ile Gly Pro Ala Ala Ile Thr Leu165 170 175Ala His Arg Tyr Asn Glu Asp Ser Arg Asp His Gly Lys Lys Glu Arg180 185 190Met Ala Gln Leu Asn Ser Gln Asn Gly Val Trp Ser Cys Thr Phe Val195 200 205Gly Tyr Cys Ser Glu Val Cys Pro Lys His Val Asp Pro Ala Ala Ala210 215 220Ile Gln Gln Gly Lys Val Glu Ser Ser Lys Asp Phe Leu Ile Ala Thr225 230 235 240Leu Lys Pro Arg<210>22<211>131<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>22Met Thr Thr Lys Arg Lys Pro Tyr Val Arg Pro Met Thr Ser Thr Trp1 5 10 15Trp Lys Lys Leu Pro Phe Tyr Arg Phe Tyr Met Leu Arg Glu Gly Thr20 25 30Ala Val Pro Ala Val Trp Phe Ser Ile Glu Leu Ile Phe Gly Leu Phe35 40 45Ala Leu Lys Asn Gly Pro Glu Ala Trp Ala Gly Phe Val Asp Phe Leu50 55 60Gln Asn Pro Val Ile Val Ile Ile Asn Leu Ile Thr Leu Ala Ala Ala65 70 75 80Leu Leu His Thr Lys Thr Trp Phe Glu Leu Ala Pro Lys Ala Ala Asn85 90 95Ile Ile Val Lys Asp Glu Lys Met Gly Pro Glu Pro Ile Ile Lys Ser100 105 110Leu Trp Ala Val Thr Val Val Ala Thr Ile Val Ile Leu Phe Val Ala115 120 125Leu Tyr Trp130<210>23<211>119<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>23Met Ile Asn Pro Asn Pro Lys Arg Ser Asp Glu Pro Val Phe Trp Gly1 5 10 15Leu Phe Gly Ala Gly Gly Met Trp Ser Ala Ile Ile Ala Pro Val Met20 25 30Ile Leu Leu Val Gly Ile Leu Leu Pro Leu Gly Leu Phe Pro Gly Asp35 40 45Ala Leu Ser Tyr Glu Arg Val Leu Ala Phe Ala Gln Ser Phe Ile Gly50 55 60Arg Val Phe Leu Phe Leu Met Ile Val Leu Pro Leu Trp Cys Gly Leu
65 70 75 80His Arg Met His His Ala Met His Asp Leu Lys Ile His Val Pro Ala85 90 95Gly Lys Trp Val Phe Tyr Gly Leu Ala Ala Ile Leu Thr Val Val Thr100 105 110Leu Ile Gly Val Val Thr Ile115<210>24<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>引物<400>26ggttcccggg gaggaggaat cccatgccca acc 33<210>27<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>27ggttcccggg ggcacctacg gtgcaacagt tg 32<210>28<211>4123
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<221>CDS<222>(3174)..(3920)<223>
<400>28ggttcccggg ggcacctacg gtgcaacagt tgcgaaaatt gtgtcacctg cgcaaagcct 60tgcttcgatt cggggaattc gggtgtctaa actttttgat tgataccaaa cggggttaga 120aactgttcgg atcggtatcc tgtgaggaag ctcaccttgg ttttagaatg ttgaaaaagc 180ctcaggtttc cgcaggtaga gcacactcaa ttaaatgagc gtcaaacgac aataaagtaa 240ggctacccta ataagtgggg ttttatgcct ctaaatagcc agttgggggc ggtaggggag 300cgtcccatga ctggttaatg cctcgatctg ggacgtacag taacaacgac actggaggtg 360cc atg act gtt aga aat ccc gac cgt gag gca atc cgt cac gga aaa 407Met Thr Val Arg Asn Pro Asp Arg Glu Ala Ile Arg His Gly Lys1 5 10 15att acg acg gag gcg ctg cgt gag cgt ccc gca tac ccg acc tgg gca455Ile Thr Thr Glu Ala Leu Arg Glu Arg Pro Ala Tyr Pro Thr Trp Ala20 25 30atg aag ctg acc atg gcc atc act ggc cta atc ttc ggt ggc ttc gtt503Met Lys Leu Thr Met Ala Ile Thr Gly Leu Ile Phe Gly Gly Phe Val35 40 45ctt gtt cac atg atc gga aac ctg aaa atc ttc atg ccg gac tac gca551Leu Val His Met Ile Gly Asn Leu Lys Ile Phe Met Pro Asp Tyr Ala50 55 60gcc gat tct gcg cat ccg ggt gaa gca caa gta gat gtc tac ggc gag599Ala Asp Ser Ala His Pro Gly Glu Ala Gln Val Asp Val Tyr Gly Glu65 70 75ttc ctg cgc gag atc gga tcc ccg atc ctc cca cac ggc tca gtc ctc647Phe Leu Arg Glu Ile Gly Ser Pro Ile Leu Pro His Gly Ser Val Leu80 85 90 95tgg atc cta cgt att atc ctg ctg gtc gca ttg gtt ctg cac atc tac695Trp Ile Leu Arg Ile Ile Leu Leu Val Ala Leu Val Leu His Ile Tyr100 105 110tgt gca ttc gca ttg acc ggc cgt tct cac cag tct cgc gga aag ttc743Cys Ala Phe Ala Leu Thr Gly Arg Ser His Gln Ser Arg Gly Lys Phe115 120 125cgc cgt acc aac ctc gtt ggc ggc ttc aac tcc ttc gcg acc cgc tcc791Arg Arg Thr Asn Leu Val Gly Gly Phe Asn Ser Phe Ala Thr Arg Ser130 135 140atg ctg gtg acc gga atc gtt ctc ctt gcg ttc att atc ttc cac atc839Met Leu Val Thr Gly Ile Val Leu Leu Ala Phe Ile Ile Phe His Ile145 150 155ctc gac ctg acc atg ggt gtt gct cca gca gcc cca acc tca ttc gag887Leu Asp Leu Thr Met Gly Val Ala Pro Ala Ala Pro Thr Ser Phe Glu160 165 170 175cac ggc gaa gta tac gca aac atg gtg gct tcc ttt agc cgc tgg cct935
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795 800 805 810cga aac gta aag gac ctc cag gac ggt atc gac aag atc cgt gcg ctc2859Arg Asn Val Lys Asp Leu Gln Asp Gly Ile Asp Lys Ile Arg Ala Leu815 820 825cgc gag gac ttc tgg aag aac atg cgc atc acc ggc agc acc gat gag2907Arg Glu Asp Phe Trp Lys Asn Met Arg Ile Thr Gly Ser Thr Asp Glu830 835 840atg aac cag gtt ctc gaa tac gca gca cgc gtt gct gat tac atc gac2955Met Asn Gln Val Leu Glu Tyr Ala Ala Arg Val Ala Asp Tyr Ile Asp845 850 855ctc ggc gaa ctc atg tgc gtc gac gcc ctc gac cgc gac gag tcc tgt3003Leu Gly Glu Leu Met Cys Val Asp Ala Leu Asp Arg Asp Glu Ser Cys860 865 870ggc gcc cac ttc cgt gac gac cac ctc tcc gaa gac ggc gaa gca gaa3051Gly Ala His Phe Arg Asp Asp His Leu Ser Glu Asp Gly Glu Ala Glu875 880 885 890cgt gac gac gaa aac tgg tgc ttc gtc tcc gca tgg gaa cca ggc aag3099Arg Asp Asp Glu Asn Trp Cys Phe Val Ser Ala Trp Glu Pro Gly Lys895 900 905aac gga acc ttc gtc cgc cac gca gaa cca ctg ttc ttc gaa tcc gtc3147Asn Gly Thr Phe Val Arg His Ala Glu Pro Leu Phe Phe Glu Ser Val910 915 920cca ctg cag aca agg aac tac aag ta atg aaa ctt aca ctt gag atc 3194Pro Leu Gln Thr Arg Asn Tyr LysMet Lys Leu Thr Leu Glu Ile925 930935tgg cgt cag gca ggc cca act gca gaa ggc aag ttc gaa acc gta cgg3242Trp Arg Gln Ala Gly Pro Thr Ala Glu Gly Lys Phe Glu Thr Val Arg940 945 950gtt gac gac gcc gtc gcg cag atg tct atc ctg gaa ctg cta gac cac3290Val Asp Asp Ala Val Ala Gln Met Ser Ile Leu Glu Leu Leu Asp His955 960 965gta aac aac aag ttc atc gaa gaa ggc aag gaa cca ttc gcg ttc gcc3338Val Asn Asn Lys Phe Ile Glu Glu Gly Lys Glu Pro Phe Ala Phe Ala970 975 980 985tct gac tgc cgc gaa ggc atc tgt ggt acc tgt ggt ctc ctc gtg aac 3386Ser Asp Cys Arg Glu Gly Ile Cys Gly Thr Cys Gly Leu Leu Val Asn990 995 1000ggt cgc cct cac ggc gcc gac cag aac aag cct gcc tgt gcg cag 3431Gly Arg Pro His Gly Ala Asp Gln Asn Lys Pro Ala Cys Ala Gln1005 1010 1015cgc ctg gtc agc tac aag gaa ggc gac acc ctt aag att gag cca 3476Arg Leu Val Ser Tyr Lys Glu Gly Asp Thr Leu Lys Ile Glu Pro1020 1025 1030ctg cgc tcc gcc gca tac cca gtg atc aag gac atg gtc gtc gac 3521Leu Arg Ser Ala Ala Tyr Pro Val Ile Lys Asp Met Val Val Asp1035 1040 1045cgc tcc gca ctg gac cgc gtc atg gaa cag ggt ggc tac gtg acc 3566Arg Ser Ala Leu Asp Arg Val Met Glu Gln Gly Gly Tyr Val Thr1050 1055 1060atc aac gca ggt acc gca cct gac gct gat acc ctc cac gtc aac 3611Ile Asn Ala Gly Thr Ala Pro Asp Ala Asp Thr Leu His Val Asn1065 1070 1075cac gaa acc gca gaa ctc gca ctt gac cac gca gcc tgc atc ggc 3656His Glu Thr Ala Glu Leu Ala Leu Asp His Ala Ala Cys Ile Gly1080 1085 1090tgt ggt gca tgt gtc gct gcc tgc cct aac ggc gca gca cac ctg 3701Cys Gly Ala Cys Val Ala Ala Cys Pro Asn Gly Ala Ala His Leu1095 1100 1105ttc acc ggc gca aag ctt gtt cac ctc tcc ctc ctc cca cta ggt 3746
Phe Thr Gly Ala Lys Leu Val His Leu Ser Leu Leu Pro Leu Gly1110 1115 1120aag gaa gag cgc gga ctg cgt gca cgt aag atg gtt gat gaa atg 3791Lys Glu Glu Arg Gly Leu Arg Ala Arg Lys Met Val Asp Glu Met1125 1130 1135gaa acc aac ttc gga cac tgc tcc ctc tac ggc gag tgc gca gac 3836Glu Thr Asn Phe Gly His Cys Ser Leu Tyr Gly Glu Cys Ala Asp1140 1145 1150gtt tgc ccc gca ggc atc cca ctg acc gct gtg gca gct gtc acc 3881Val Cys Pro Ala Gly Ile Pro Leu Thr Ala Val Ala Ala Val Thr1155 1160 1165aaa gaa cgt gcg cgt gca gct ttc cga ggc aaa gac gac tagtctttaa 3930Lys Glu Arg Ala Arg Ala Ala Phe Arg Gly Lys Asp Asp1170 1175tccaagtaag taccggttca gacagttaaa ccagaaagac gagtgaacac catgtcctcc 3990gcgaaaaaga aacccgcacc ggagcgtatg cactacatca agggctatgt acctgtggcg 4050tatagctctc cacactcatc cctcgagcgc agcgcaacct ggttgggcat gggattcctc 4110ctccccggga acc 4123<210>29<211>257<212>PRT<213>黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)<400>29Met Thr Val Arg Asn Pro Asp Arg Glu Ala Ile Arg His Gly Lys Ile1 5 10 15Thr Thr Glu Ala Leu Arg Glu Arg Pro Ala Tyr Pro Thr Trp Ala Met20 25 30Lys Leu Thr Met Ala Ile Thr Gly Leu Ile Phe Gly Gly Phe Val Leu35 40 45Val His Met Ile Gly Asn Leu Lys Ile Phe Met Pro Asp Tyr Ala Ala50 55 60Asp Ser Ala His Pro Gly Glu Ala Gln Val Asp Val Tyr Gly Glu Phe65 70 75 80Leu Arg Glu Ile Gly Ser Pro Ile Leu Pro His Gly Ser Val Leu Trp85 90 95Ile Leu Arg Ile Ile Leu Leu Val Ala Leu Val Leu His Ile Tyr Cys100 105 110Ala Phe Ala Leu Thr Gly Arg Ser His Gln Ser Arg Gly Lys Phe Arg115 120 125Arg Thr Asn Leu Val Gly Gly Phe Asn Ser Phe Ala Thr Arg Ser Met130 135 140Leu Val Thr Gly Ile Val Leu Leu Ala Phe Ile Ile Phe His Ile Leu145 150 155 160Asp Leu Thr Met Gly Val Ala Pro Ala Ala Pro Thr Ser Phe Glu His165 170 175Gly Glu Val Tyr Ala Asn Met Val Ala Ser Phe Ser Arg Trp Pro Val180 185 190Ala Ile Trp Tyr Ile Ile Ala Asn Leu Val Leu Phe Val His Leu Ser195 200 205His Gly Ile Trp Leu Ala Val Ser Asp Leu Gly Ile Thr Gly Arg Arg210 215 220Trp Arg Ala Ile Leu Leu Ala Val Ala Tyr Ile Val Pro Ala Leu Val225 230 235 240Leu Ile Gly Asn Ile Thr Ile Pro Phe Ala Ile Ala Val Gly Trp Ile245 250 255Ala
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385 390 395 400Arg Glu Arg Tyr Ser Asn Leu Phe Thr Met Tyr Glu Glu Ala Ile Gly405 410 415Glu Asp Pro Tyr Ser Ser Pro Met Arg Ile Ala Pro Thr Cys His Phe420 425 430Thr Met Gly Gly Leu Trp Thr Asp Phe Asn Glu Met Thr Ser Leu Pro435 440 445Gly Leu Phe Cys Ala Gly Glu Ala Ser Trp Thr Tyr His Gly Ala Asn450 455 460Arg Leu Gly Ala Asn Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Asp Gly Trp Phe465 470 475 480Thr Leu Pro Phe Thr Val Pro Asn Tyr Leu Gly Pro Leu Leu Gly Ala485 490 495Glu Arg Leu Ala Glu Asp Ala Pro Glu Ala Gln Ala Ala Ile Glu Arg500 505 510Ala Gln Ala Arg Ile Asp Arg Leu Met Gly Asn Arg Pro Glu Trp Ile515 520 525Gly Asp Asn Pro His Gly Pro Glu Tyr Tyr His Arg Gln Leu Gly Asp530 535 540Ile Leu Tyr Phe Ser Cys Gly Val Ser Arg Asn Val Lys Asp Leu Gln545 550 555 560Asp Gly Ile Asp Lys Ile Arg Ala Leu Arg Glu Asp Phe Trp Lys Asn565 570 575Met Arg Ile Thr Gly Ser Thr Asp Glu Met Asn Gln Val Leu Glu Tyr580 585 590Ala Ala Arg Val Ala Asp Tyr Ile Asp Leu Gly Glu Leu Met Cys Val595 600 605Asp Ala Leu Asp Arg Asp Glu Ser Cys Gly Ala His Phe Arg Asp Asp610 615 620His Leu Ser Glu Asp Gly Glu Ala Glu Arg Asp Asp Glu Asn Trp Cys625 630 635 640Phe Val Ser Ala Trp Glu Pro Gly Lys Asn Gly Thr Phe Val Arg His645 650 655Ala Glu Pro Leu Phe Phe Glu Ser Val Pro Leu Gln Thr Arg Asn Tyr660 665 670Lys<210>31<211>249<212>PRT<213>黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)<400>31Met Lys Leu Thr Leu Glu Ile Trp Arg Gln Ala Gly Pro Thr Ala Glu1 5 10 15Gly Lys Phe Glu Thr Val Arg Val Asp Asp Ala Val Ala Gln Met Ser20 25 30Ile Leu Glu Leu Leu Asp His Val Asn Asn Lys Phe Ile Glu Glu Gly35 40 45Lys Glu Pro Phe Ala Phe Ala Ser Asp Cys Arg Glu Gly Ile Cys Gly50 55 60Thr Cys Gly Leu Leu Val Asn Gly Arg Pro His Gly Ala Asp Gln Asn65 70 75 80Lys Pro Ala Cys Ala Gln Arg Leu Val Ser Tyr Lys Glu Gly Asp Thr85 90 95Leu Lys Ile Glu Pro Leu Arg Ser Ala Ala Tyr Pro Val Ile Lys Asp
100 105 110Met Val Val Asp Arg Ser Ala Leu Asp Arg Val Met Glu Gln Gly Gly115 120 125Tyr Val Thr Ile Asn Ala Gly Thr Ala Pro Asp Ala Asp Thr Leu His130 135 140Val Asn His Glu Thr Ala Glu Leu Ala Leu Asp His Ala Ala Cys Ile145 150 155 160Gly Cys Gly Ala Cys Val Ala Ala Cys Pro Asn Gly Ala Ala His Leu165 170 175Phe Thr Gly Ala Lys Leu Val His Leu Ser Leu Leu Pro Leu Gly Lys180 185 190Glu Glu Arg Gly Leu Arg Ala Arg Lys Met Val Asp Glu Met Glu Thr195 200 205Asn Phe Gly His Cys Ser Leu Tyr Gly Glu Cys Ala Asp Val Cys Pro210 215 220Ala Gly Ile Pro Leu Thr Ala Val Ala Ala Val Thr Lys Glu Arg Ala225 230 235 240Arg Ala Ala Phe Arg Gly Lys Asp Asp24權(quán)利要求
1.產(chǎn)生琥珀酸的方法，其包括使經(jīng)過修飾以增加延胡索酸還原酶活性的細(xì)菌或其細(xì)胞處理物與有機(jī)原料在含有碳酸根離子、碳酸氫根離子或二氧化碳?xì)庵械姆磻?yīng)溶液中進(jìn)行反應(yīng)以生成琥珀酸；和收集所述的琥珀酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的細(xì)菌選自棒狀細(xì)菌、芽孢桿菌屬細(xì)菌或根瘤菌屬細(xì)菌。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述細(xì)菌是經(jīng)過修飾以通過應(yīng)用來自棒狀細(xì)菌的琥珀酸脫氫酶基因增加延胡索酸還原酶活性的細(xì)菌。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述細(xì)菌是經(jīng)過修飾以通過應(yīng)用來自大腸桿菌的延胡索酸還原酶基因增加延胡索酸還原酶活性的細(xì)菌。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌被進(jìn)一步修飾以將乳酸脫氫酶活性與未修飾的菌株相比減少到10％或更低。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌被進(jìn)一步修飾以增加丙酮酸羧化酶活性。
7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌或其細(xì)胞處理物與所述有機(jī)原料在厭氧條件下進(jìn)行反應(yīng)。
8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述有機(jī)原料為葡萄糖。
9.產(chǎn)生含有琥珀酸的聚合物的方法，其包括通過權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生琥珀酸，和將得到的琥珀酸進(jìn)行聚合。
全文摘要
通過使經(jīng)過修飾以增加延胡索酸還原酶活性的細(xì)菌或其處理物與有機(jī)原料在含有碳酸根離子、碳酸氫根離子和二氧化碳?xì)庵械姆磻?yīng)溶液中進(jìn)行反應(yīng)以生成琥珀酸來產(chǎn)生琥珀酸。更優(yōu)選地，通過使經(jīng)過修飾以增加延胡索酸還原酶和丙酮酸羧化酶活性并降低乳酸脫氫酶活性的細(xì)菌或其處理物與有機(jī)原料在含有碳酸根離子、碳酸氫根離子和二氧化碳?xì)庵械姆磻?yīng)溶液中進(jìn)行反應(yīng)以生成琥珀酸來產(chǎn)生琥珀酸。琥珀酸通過收集所產(chǎn)生的琥珀酸來獲得。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1875108SQ20048003202
公開日2006年12月6日 申請(qǐng)日期2004年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月28日
發(fā)明者村瀬誠, 青山龍介, 生田美樹, 山岸兼治, 守屋美加, 中村純, 児島宏之 申請(qǐng)人:三菱化學(xué)株式會(huì)社, 味之素株式會(huì)社