專利名稱：生物傳感器及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用電化學(xué)方法測定試樣中的測定對象物的生物傳感器。
背景技術(shù)：
一直以來，廣泛使用著不對含特定測定對象物的試樣液進行例如試樣液的稀釋或攪拌等，就能簡便且迅速地定量上述測定對象物的生物傳感器。這種生物傳感器可如下制作(如參照專利文獻1)例如在電絕緣性的基板上，通過網(wǎng)板印刷等方法形成具有作用極(也稱為測定極)和對極的電極系，在其上形成含有與上述測定對象物發(fā)生反應(yīng)的氧化還原酶和介質(zhì)(電子傳遞物質(zhì))等的試劑層，由此制作。如果使含有上述測定對象物的試樣液與此試劑層相接觸，則通過上述氧化還原酶的催化作用，例如上述測定對象物被氧化，而上述介質(zhì)被還原。通過使用了上述電極系的電化學(xué)方法將該被還原的介質(zhì)(以下稱為“還原型介質(zhì)”)進行再氧化，能夠從由此得到的氧化電流值計算出上述試樣液中測定對象物的濃度。
但是，當(dāng)反應(yīng)氛圍中存在氧或試樣液中存在溶存氧時，上述還原型介質(zhì)不僅如上所述那樣被電化學(xué)再氧化，也被上述氧再氧化。因此，存在著在由電化學(xué)的再氧化得到的氧化電流值中產(chǎn)生誤差，從而使測定精度降低的問題。
作為回避此問題的方法，考慮到了例如在氮氣氛圍下進行測定等，但這種方法花費時間且操作也煩雜。并且，也存在著在完全沒有氧的條件下，不能使用在酶反應(yīng)中必需氧的氧化還原酶的問題，適用范圍變得非常窄。
專利文獻1日本特開平1-291153號公報

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供回避了氧對介質(zhì)的影響、并能夠迅速且簡便地以高精度來測定試樣液中的測定對象物的生物傳感器。
為了達成上述目的，本發(fā)明的生物傳感器的制造方法包括下述工序準(zhǔn)備具有電極的基板，在上述電極表面上形成至少含有介質(zhì)、表面活性劑、緩沖劑以及層狀無機化合物的無機凝膠層。
另外，本發(fā)明的生物傳感器為通過上述本發(fā)明的制造方法制造得到的生物傳感器。
本發(fā)明人等為了防止由試樣中的測定對象物與氧化還原酶的反應(yīng)而被還原的介質(zhì)(還原型介質(zhì))被自然氧化，對生物傳感器進行了銳意研究。通常來說，已知例如由層狀無機化合物形成無機凝膠層，但此研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過在無機凝膠層中進一步含有表面活性劑和緩沖劑，能夠形成發(fā)揮防止上述還原型介質(zhì)的自然氧化效果的無機凝膠層。本發(fā)明人等首次發(fā)現(xiàn)通過這種方法能夠得到上述防止自然氧化的效果。如果通過上述方法形成無機凝膠層，則能夠防止用于間接測定試樣中測定對象物的上述還原型介質(zhì)被例如測定氛圍中的氧或試樣中的溶存氧等再氧化。因此，能夠提供消除了上述還原型介質(zhì)的再氧化導(dǎo)致的測定誤差、且測定精度優(yōu)異的生物傳感器。在本發(fā)明中，所謂“上述介質(zhì)的自然氧化”是指例如上述介質(zhì)被使用生物傳感器時的液體試樣中的溶存氧、被空氣中的水分吸收的氧(如保存時空氣中水分吸收空氣中的氧)所氧化。
通過在表面活性劑和緩沖劑的存在下形成無機凝膠層來發(fā)揮防止氧化的功能，被推測為或許源自以下所示的機理。
例如認為，在涂布含有上述介質(zhì)、表面活性劑、緩沖劑以及層狀無機化合物的分散液而形成的上述無機凝膠層中，形成了上述介質(zhì)緊密嵌入于上述層狀無機化合物的片材中的復(fù)合體，從而防止上述介質(zhì)與液體試樣等中所含的溶存氧發(fā)生接觸。通常，由于試樣液中溶存有氧，因此如上所述，通過層狀無機化合物將水遮蔽，能夠防止上述溶存氧對上述介質(zhì)的攻擊。并且，如上所述，通過進一步存在表面活性劑，層狀無機化合物和介質(zhì)不會聚合而變得不溶，而是成為這些復(fù)合體分散的狀態(tài)，能夠形成可充分發(fā)揮上述效果的無機凝膠層。
另外，通過上述分散液中含有緩沖劑，能夠形成均勻的無機凝膠層，能夠進一步提高防止氧化的功能。這是由于上述緩沖劑在形成上述介質(zhì)和層狀無機化合物的復(fù)合體時作為粘合劑發(fā)揮作用。通過這種粘合劑的作用，介質(zhì)和層狀無機化合物的結(jié)合形成了更加牢固的復(fù)合體，因此能夠例如進一步遮蔽含有溶存氧的液體，可防止氧導(dǎo)致的介質(zhì)的再氧化。另一方面，此種情況下表面活性劑也發(fā)揮了防止上述緩沖劑、層狀無機化合物以及介質(zhì)形成聚合物而變得不能分散、即所謂的阻斷劑的功能。
本發(fā)明的生物傳感器通過以上述方法進行制造，能夠防止例如介質(zhì)被測定氛圍中的氧或試樣中的溶存氧等再氧化。因此，本發(fā)明的生物傳感器消除了由上述還原型介質(zhì)的再氧化導(dǎo)致的測定誤差，且測定精度優(yōu)異。
通過本發(fā)明的制造方法得到的生物傳感器從氧化還原酶向介質(zhì)進行的電子授受，不是介由水，而是介由上述層狀無機化合物的層間、即電偶極子層進行的。因此，根據(jù)水分被上述無機凝膠層遮蔽的本發(fā)明的生物傳感器，即便在例如高濕度環(huán)境等下也發(fā)揮能夠防止劣化的效果。另外，由于上述層狀無機化合物的電偶極子層比水更易通過電子，因此認為與反應(yīng)速度的增大也有關(guān)。
由本發(fā)明的制造方法得到的生物傳感器，通過遮斷上述的氧也能防止例如氧化導(dǎo)致的電極生銹等。
本發(fā)明中，將防止上述介質(zhì)的自然氧化的無機凝膠層也稱為“防止氧化層”。


圖1為顯示本發(fā)明實施方案中生物傳感器的制造方法一例的工序圖，(A)～(F)分別表示各工序。
圖2為上述實施方案的生物傳感器的剖面圖。
圖3為顯示本發(fā)明實施例中使用葡萄糖傳感器測定試樣時電流值隨時間變化的圖，圖3(A)表示實施例的結(jié)果，圖3(B)表示比較例的結(jié)果。
圖4為顯示本發(fā)明其它實施例中試樣中的溶存氧濃度與變化率(％)的關(guān)系的圖。
圖5為顯示本發(fā)明另一實施例中試樣中的溶存氧濃度與變化率(％)的關(guān)系的圖。
圖6為顯示本發(fā)明另一實施例中試樣中的溶存氧濃度與變化率(％)的關(guān)系的圖。
具體實施方案本發(fā)明中，上述層狀無機化合物優(yōu)選為層狀粘土礦物，特別優(yōu)選膨潤性粘土礦物。
上述層狀無機化合物可以指，例如無機物的多面體連接成為平面狀而形成片材結(jié)構(gòu)，此片材結(jié)構(gòu)進一步重疊為層狀而形成晶體結(jié)構(gòu)的化合物。作為上述多面體的形狀，有例如四面體片材、八面體片材等，具體地說，例如可列舉出Si四面體、Al八面體等。作為這種層狀無機化合物，包括例如層狀粘土礦物、水滑石、蒙脫石、多水高嶺石、高嶺土礦物、云母等。
所謂上述層狀粘土礦物，一般可列舉出占據(jù)粘土(為細小土狀的無機粒狀物，用水潤濕狀態(tài)下顯示可塑性)大部分的硅鋁酸鹽礦物，其通常將Si被4個氧原子(O)包圍的Si四面體和Al或Mg被6個羥基(OH基)或6個氧原子包圍的Al八面體或Mg八面體作為最小構(gòu)成單位。
作為上述層狀粘土礦物的結(jié)構(gòu)，可列舉出例如上述Si四面體與其他Si四面體共有一個面，剩余頂點的氧原子朝向同一個方向形成六角網(wǎng)狀的片材(以下稱為“四面體片材”)，而Al八面體或Mg八面體與其他八面體共有棱角而形成片材(八面體片材)，上述四面體片材與上述八面體片材層疊為層狀的結(jié)構(gòu)。具體地說，例如分別將在上述四面體片材與上述八面體片材各重疊1張而成的1∶1層上進一步層疊幾層的結(jié)構(gòu)的礦物稱為1∶1型礦物；將在用2張四面體片材夾住1張八面體片材的2∶1層上進一步層疊幾層的結(jié)構(gòu)的礦物稱為2∶1型礦物；將在上述2∶1層的層間進一步還夾有1張八面體片材的結(jié)構(gòu)的礦物稱為2∶1∶1型礦物。另外，將例如八面體片材為Mg(OH)2、且在所有的八面體位置上都有金屬離子的物質(zhì)稱為3八面體型(Trioctahedral)；將八面體片材為Al(OH)3、且1/3成為空位的物質(zhì)稱為2八面體型(Dioctahedral)。其中，作為本發(fā)明的上述層狀無機化合物，優(yōu)選2∶1型礦物。
作為構(gòu)成上述層狀無機化合物的元素，可以列舉出例如鋰、鈉、鉀、鎂、鋁、硅、氧、氫、氟、碳等，可以由任何一種構(gòu)成，也可以由兩種或更多種構(gòu)成。沒有特別的限定，作為具體例，可列舉出例如下述式(1)～(9)所示的化合物等，這些化合物例如也可含有結(jié)晶水。這些下述式是作為礦物學(xué)上或化學(xué)上的純化合物的化學(xué)式，但實際上有時含有例如硅酸鈉等雜質(zhì)。因此，通過元素分析等確定化學(xué)式時不一定非要與這些化學(xué)式一致，此在例如文獻(D.W，Thompson，J.T.Butterworth，J.ColloidInterf.Sci.，151，236-243(1992))等中也有記載。
MxSi4(Al2-xMgx)O10X2(1)上述式(1)中，優(yōu)選M為選自H、Li、Na和K中的至少一個，X為OH和F中的至少一個，x為小于2的正數(shù)。
Mx(Si4-xAlx)Al12O10X2(2)上述式(2)中，優(yōu)選M為選自H、Li、Na和K中的至少一個，X為OH和F中的至少一個，x為小于4的正數(shù)。
MxSi4(Mg3-xLix)O10X2(3)
上述式(3)中，優(yōu)選M為選自H、Li、Na和K中的至少一個，X為OH和F中的至少一個，x為小于3的正數(shù)。
Mx(Si4-xAlx)Mg3O10X2(4)上述式(4)中，優(yōu)選M為選自H、Li、Na和K中的至少一個，X為OH和F中的至少一個，x為小于4的正數(shù)。
MSi4Mg2.5O10X2(5)上述式(5)中，M優(yōu)選為Li和Na中的至少一個、更優(yōu)選為Na，X優(yōu)選為OH和F中的至少一個、更優(yōu)選為F。
M2Si4Mg2O10X2(6)上述式(6)中，M優(yōu)選為Li和Na中的至少一個、更優(yōu)選為Li，X優(yōu)選為OH和F中的至少一個、更優(yōu)選為F。
Mg6Al12(OH)16Xx(7)上述式(7)中，X優(yōu)選為選自鹵素、NO3、SO4、CO3和OH中的至少一個基團以及陰離子型有機酸中的至少一種，更優(yōu)選為CO3；x在X為鹵素、OH、NO3或一元有機酸時優(yōu)選為2，在X為SO4、CO3或二元有機酸時優(yōu)選為1。
Na0.33Si4(Mg2.67Li0.33)O10X2(8)上述式(8)中，X優(yōu)選為OH和F中的至少一個、更優(yōu)選為OH。
Naa-b(Si4-aAla)(Mg3-bAlb)O10X2(9)上述式(9)中，X優(yōu)選為OH和F中的至少一個、更優(yōu)選為OH；a優(yōu)選為小于4的正數(shù)；b優(yōu)選為小于3的正數(shù)；優(yōu)選a-b＞0。
作為上述層狀無機化合物的具體例，可以列舉出例如高嶺石、多水高嶺石、蛇紋石等1∶1型粘土礦物；滑石、葉臘石、蒙脫石、蛭石(上述式(2)所示的化合物，以下相同)、四硅氟云母(上述式(5))、含有帶云母(上述式(6))的云母等2∶1型粘土礦物；綠泥石等2∶1∶1型粘土礦物；2∶1～2∶1∶1型的中間礦物；伊毛縞石等半晶質(zhì)粘土礦物；水鋁英石等非晶質(zhì)粘土礦物；水滑石(上述式(7))等。
另外，蒙脫石中根據(jù)例如被同晶型置換的四面體、八面體晶格中離子種類的不同，包括蒙脫石(上述式(1))、含有40～80％蒙脫石的天然物膨潤土、貝得石(上述式(2))等2八面體型；鋰蒙脫石(上述式(3)、優(yōu)選上述式(8))、皂石(上述式(4)、優(yōu)選上述式(9))、綠脫石等3八面體型等。
水滑石由例如上述式(7)表示。具體地說，是以例如Mg6Al2(OH)16CO3·4H2O表示的層狀礦物，Mg(OH)2(氫氧鎂石具有中心帶有Mg2+的氧八面體的層進行層壓重疊而形成的結(jié)構(gòu))中的Mg2+的一部分被同晶型置換為Al3+。其帶有正電荷，但由于層間的CO32-而保持電中性，并具有陰離子交換能力。雖然不是硅酸鹽礦物，但通常作為粘土礦物處理。
上述層狀無機化合物的組成的例子示于下述表1。下述表1中，“MI”表示以1價陽離子為代表的交換性陽離子，如H+、Na+、K+、Li+等。
表1

上述層狀無機化合物的平均孔徑?jīng)]有特別限定，但優(yōu)選例如相對于溶劑能夠均勻分散的粒徑。由于上述層狀無機化合物一般為片狀粒子，并且多個粒子處于反復(fù)凝集和分裂的動態(tài)平衡中，因此定義平均粒徑的本身是困難的，但通過例如光散射法或使用電子顯微鏡觀察等方法進行測定時，在水中分散的狀態(tài)下，優(yōu)選在1nm～20μm的范圍，更優(yōu)選在10nm～2μm的范圍.
這些粘土礦物等層狀無機化合物，也可以例如搭建季銨鹽等支柱，從而事先調(diào)整層間距離、層間電荷或極性。
上述層狀無機化合物中，更優(yōu)選2∶1型粘土礦物，特別優(yōu)選具有離子交換能力的膨潤性粘土礦物。
上述膨潤性粘土礦物中更優(yōu)選膨潤土、蒙脫石、蛭石、合成氟云母等，特別優(yōu)選合成鋰蒙脫石、合成皂石等合成蒙脫石；以合成氟云母為代表的膨潤性合成云母；Na型云母等合成云母(天然云母通常為非膨潤性粘土礦物)等。這些層狀無機化合物可以單獨使用，也可以2種或更多種組合使用。
作為這種層狀無機化合物，可以使用例如市售品，可以列舉出CO-OP CHEMICAL(株)生產(chǎn)的商品名LUCENTITE SWN、商品名LUCENTITE SWF(合成鋰蒙脫石)，商品名ME(氟云母)，KUNIMINE工業(yè)(株)生產(chǎn)的商品名SUMECTON SA(合成皂石)，協(xié)和化學(xué)工業(yè)(株)生產(chǎn)的商品名THIXOPY W(合成鋰蒙脫石)、商品名KYOWAAD500(合成水滑石)，Laporte公司生產(chǎn)的商品名Laponite(合成鋰蒙脫石)，(株)Nacalai Tesque公司生產(chǎn)的天然膨潤土，(株)豐順礦業(yè)公司生產(chǎn)的商品名Multigel(膨潤土)等。
本發(fā)明中，作為上述表面活性劑，優(yōu)選為兩性表面活性劑，更優(yōu)選例如在同一分子內(nèi)帶有正電荷和負電荷的兩性表面活性劑，可列舉出例如烷基氨基羧酸(或其鹽)、羧基甜菜堿、磺基甜菜堿和磷酸甜菜堿等。其中更優(yōu)選同一分子內(nèi)帶有正電荷和負電荷、且上述正電荷和負電荷分開的兩性表面活性劑，例如為羧基甜菜堿、磺基甜菜堿和磷酸甜菜堿等。具體地說，作為上述羧基甜菜堿，可使用烷基二甲基氨基醋酸甜菜堿等，作為上述磺基甜菜堿，可使用CHAPS、CHAPSO和烷基羥基磺基甜菜堿等。其中優(yōu)選磺基甜菜堿，更優(yōu)選CHAPS、CHAPSO，特別優(yōu)選CHAPS。
本發(fā)明中，作為上述緩沖劑，優(yōu)選胺系緩沖劑，可以列舉出例如Tris、ACES、CHES、CAPSO、TAPS、CAPS、Bis-Tris、TAPSO、TES、Tricine和ADA等，優(yōu)選ACES、Tris，更優(yōu)選ACES。這些物質(zhì)可單獨使用1種，也可2種或更多種組合使用。
作為上述緩沖劑，也優(yōu)選具有羧基的緩沖劑，可以列舉出例如醋酸-醋酸鈉緩沖劑、蘋果酸-醋酸鈉緩沖劑、丙二酸-醋酸鈉緩沖劑、琥珀酸-醋酸鈉緩沖劑等，其中優(yōu)選琥珀酸-醋酸鈉緩沖劑。
作為上述胺系緩沖劑和上述表面活性劑的組合，可列舉出例如Tris和CHAPS、ACES和CHAPS、ACES和CHAPSO的組合等，更優(yōu)選為CHAPS和ACES。另外，作為具有羧基的緩沖劑和上述表面活性劑的組合，可列舉出例如琥珀酸-醋酸鈉和CHAPS或CHAPSO、丙二酸-醋酸鈉和CHAPS、蘋果酸-醋酸鈉和CHAPS或CHAPSO、醋酸-醋酸鈉和CHAPS等，優(yōu)選琥珀酸-醋酸鈉和CHAPS的組合。
本發(fā)明中，作為上述介質(zhì)，優(yōu)選例如通過后述的氧化還原酶和測定對象物發(fā)生的反應(yīng)可成為還原型、被電化學(xué)氧化、并通過氧化電流能夠檢測的介質(zhì)，可以使用以往公知的介質(zhì)。
具體的說，可以使用鐵氰化鉀、對苯醌及其衍生物、吩嗪硫酸甲酯、靛酚、2，6-二氯苯酚靛酚等靛酚衍生物、β-萘醌-4-磺酸鉀、二茂鐵、二茂鐵羧酸等二茂鐵衍生物、鋨絡(luò)合物、釕絡(luò)合物、NAD+、NADP+、吡咯喹啉醌(PQQ)、亞甲藍、細胞色素c、細胞色素b、銅絡(luò)合物等。其中可優(yōu)選使用鐵氰化鉀、二茂鐵、鋨絡(luò)合物、釕絡(luò)合物、NAD+、NADP+等。
另外，除此之外，作為介質(zhì)，還可以使用例如1，1’-二甲基-4，4’-二吡啶鹽、1，1’-二芐基-4，4’-二吡啶鹽、1，4-二氨基苯、2-甲基-1，4-萘醌、N-甲基吩嗪鹽、1-羥基-5-甲基吩嗪鹽、1-甲氧基-5-甲基吩嗪鹽、9-二甲基氨基苯并α吩噁嗪-7-金屬鹽、亞鐵氰鹽、7-羥基-3H-吩噁嗪-3-酮10-氧化物、3，7-二氨基-5-苯基吩嗪鹽、3-(二乙基氨基)-7-氨基-5-苯基吩嗪鹽、1，4-苯二醇、1，4-二羥基-2，3，5-三甲基苯、N，N，N’，N’-四甲基-1，4-苯二胺、Δ2，2’-二-1，3-二硫醇、2，6-二甲基苯醌、2，5-二甲基苯醌、2，3，5，6-四甲基-2，5-環(huán)己二烯-1，4-二酮、2，6-二氯-4-[(4-羥基苯基)亞氨基]-2，5-環(huán)己二烯-1-酮、2，6-二氯-4-[(3-氯-4-羥基苯基)亞氨基]-2，5-環(huán)己二烯-1-酮、7-(二乙基氨基)-3-亞氨基-8-甲基-3H-吩噁嗪鹽、3，7-雙(二甲基氨基)酚噻嗪-5-金屬鹽等。
本發(fā)明的制造方法中，上述無機凝膠層優(yōu)選通過涂布至少含有介質(zhì)、表面活性劑、緩沖劑以及層狀無機化合物的分散液而形成。
本發(fā)明中，可以在上述無機凝膠層上形成含有氧化還原酶的層來作為層疊體的試劑層；或者也可在上述分散液中進一步含有氧化還原酶，在電極表面上形成含有上述氧化還原酶的無機凝膠層，以此作為單層的試劑層。這樣形成單層的試劑層時，由于沒有必要另外形成含有氧化還原酶的層和含有介質(zhì)的層，因此制造變得更加簡單。這種生物傳感器像例如葡萄糖脫氫酶(GDH)那樣，在酶反應(yīng)中使用不必需氧的酶時，特別優(yōu)選。
作為上述氧化還原酶，只要是例如與試樣中的測定對象物和上述介質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)的酶即可，沒有特別限定，可以根據(jù)測定對象物的種類等進行適當(dāng)決定。
具體地說，可列舉出例如葡萄糖氧化酶(GOD)、吡喃糖氧化酶、葡萄糖脫氫酶(GDH)、乳酸氧化酶、乳酸脫氫酶、果糖脫氫酶、半乳糖氧化酶、膽固醇氧化酶、膽固醇脫氫酶、醇氧化酶、醇脫氫酶、膽紅素氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、氨基酸脫氫酶、甲酸脫氫酶、甘油脫氫酶、酰基輔酶A氧化酶、膽堿氧化酶、4-羥基安息香酸羥基化酶、馬來酸脫氫酶、肌氨酸氧化酶、尿酸酶等。
上述氧化還原酶和上述介質(zhì)的組合沒有特別限定，可列舉出例如GOD和鐵氰化鉀、GDH和釕絡(luò)合物、膽固醇脫氫酶和二茂鐵、醇脫氫酶和銅絡(luò)合物的組合等。
(實施方案1)對本發(fā)明的第1生物傳感器制造方法的一例以圖1和圖2為基礎(chǔ)進行說明。圖1(A)～(F)為顯示制造生物傳感器的一系列工序的立體圖。圖2為上述圖1(F)所示生物傳感器的I-I方向的剖面圖。圖1(A)～(F)和圖2中的同一位置帶有同一符號。
如圖1(F)和圖2所示，此生物傳感器1具備基板11、由具有導(dǎo)線部12a的作用極12和具有導(dǎo)線部13a的對極13構(gòu)成的電極系、絕緣層14、含有介質(zhì)和層狀無機化合物及表面活性劑的無機凝膠層(防止氧化層)16、含有氧化還原酶的酶試劑層17、具有開口部的隔板18和具有貫通孔20的蓋19。如圖1(B)所示，基板11的一個端部(兩圖中的右側(cè))上設(shè)有檢測部15，在檢測部15中，作用極12和對極13與基板11的寬度方向平行配置。上述兩電極的一端分別成為導(dǎo)線部12a、13a(兩圖中的左側(cè))，它們按照與檢測部15的其他端垂直的方式而被配置(圖1(A))。作用極12和對極13之間成為絕緣部。在具備這種電極系的基板11上，如圖1(B)所示，除了導(dǎo)線部12a、13a和檢測部15之外，其余層疊絕緣層14，在未層疊絕緣層14的上述檢測部15上，按順序?qū)盈B無機凝膠層16和酶試劑層17。在絕緣層14上，如圖1(E)所示，配置有隔板18，其與檢測部15對應(yīng)的位置成為開口部。在隔板18上，在與上述開口部相對應(yīng)的一部分上配置具有貫通孔20的蓋19(圖1(F))。在此生物傳感器1中，為上述開口部的空間部分、且上述酶試劑層17和絕緣層14及蓋19所夾的空間部分，成為毛細管結(jié)構(gòu)的試樣供給部21。并且，上述貫通孔20成為用于通過毛細管現(xiàn)象而吸入試樣的空氣孔。
此生物傳感器1的大小沒有特別限定，可以根據(jù)供給試樣的量等進行適當(dāng)設(shè)定，如全長為5～50mm、全寬為1～50mm、最大厚度為2000～500μm、最小厚度為50～500μm?！伴L”是指生物傳感器的長度方向的長度；“寬”是指寬度方向的長度(以下相同)。
基板11的大小例如長為5～50mm、寬為1～50mm、厚為1000～10μm；絕緣層14的大小例如長為5～50mm、寬為1～50mm、厚為10～200μm；檢測部15的大小例如長為0.1～10mm、寬為0.1～10mm；無機凝膠層16的大小例如長為0.1～10mm、寬為0.1～10mm、厚為0.001～500μm；酶試劑層17的大小例如長為0.1～10mm、寬為0.1～10mm、厚為0.001～500μm。隔板的大小例如長為1～50mm、寬為1～50mm、厚為10～1000μm，其開口部例如長為0.1～10mm、寬為0.01～10mm。蓋19的大小例如長為5～50mm、寬為1～50mm、厚為10～1000μm，其貫通孔例如直徑為0.1～10mm。
無機凝膠層16中的層狀無機化合物的含量可根據(jù)供給試樣的種類及其量、檢測部15的面積等進行適當(dāng)決定，例如每1cm2的檢測部15的面積為0.003～30mg的范圍、優(yōu)選0.1～10mg的范圍、更優(yōu)選0.3～3mg的范圍。具體地說，上述層狀無機化合物為蒙脫石時，例如每1cm2上述面積為0.003～30mg的范圍、優(yōu)選0.1～10mg的范圍、更優(yōu)選0.3～3mg的范圍。如果上述含量為每1cm2面積0.003mg或以上，例如能夠充分發(fā)揮氧阻斷效果；如果為每1cm2面積30mg或以下，則能夠進一步提高氧阻斷效果和重現(xiàn)性、反應(yīng)性。上述單位面積的層狀無機化合物的量與無機凝膠層16的厚度有關(guān)，如上所述，層厚優(yōu)選為0.001～500μm的范圍。
另外，無機凝膠層16中表面活性劑(如兩性表面活性劑)的含量例如可根據(jù)上述層狀無機化合物的量進行適當(dāng)決定，相對于300mg層狀無機化合物例如為0.1mmol～100mmol的范圍、優(yōu)選為0.5mmol～10mmol、更優(yōu)選為0.5mmol～1mmol的范圍。
無機凝膠層16中介質(zhì)的含量例如可根據(jù)測定試樣的種類、測定對象物的種類、后述酶試劑層中氧化還原酶的量等進行適當(dāng)決定，例如每1cm2檢測部15的面積，優(yōu)選為10mmol～100mol、更優(yōu)選為10mmol～50mmol、特別優(yōu)選為15mmol～20mmol的范圍。
此無機凝膠層16還可以進一步含有緩沖劑。無機凝膠層16的上述緩沖劑含量例如可根據(jù)上述層狀無機化合物的量進行適當(dāng)決定，相對于0.3g層狀無機化合物，緩沖劑例如優(yōu)選為0.1mmol～100mmol、更優(yōu)選為1mmol～50mmol、特別優(yōu)選為10mmol～20mmol的范圍。
上述酶試劑層17的氧化還原酶的含量沒有特別限定，可以根據(jù)試樣的種類及其量、測定對象物的種類和量等進行適當(dāng)決定。具體地說，每1cm2檢測部15的面積，例如為0.1U～100KU的范圍、優(yōu)選為1U～10KU的范圍、更優(yōu)選為1U～100U的范圍。
酶試劑層17中的酶量和上述無機凝膠層16中的介質(zhì)的比例為例如每1000U的酶，介質(zhì)為0.01～1M的范圍、優(yōu)選為0.01～0.5M的范圍、更優(yōu)選為50mM～200mM的范圍。
這種生物傳感器例如可如下制作。
首先準(zhǔn)備用于形成電極系的基板11。作為上述基板11的材料，優(yōu)選電絕緣性材料，可以列舉出例如塑料、玻璃、紙、陶瓷、橡膠等。作為上述塑料，可列舉出例如聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸酯(PMMA)、聚丙烯(PP)、丙烯酸樹脂、玻璃環(huán)氧樹脂等。
接著，如圖1(A)所示，在基板11上形成由具有導(dǎo)線部12a的作用極12和具有導(dǎo)線部13a的對極13構(gòu)成的電極系。電極的形狀并不限于圖1(A)所示的形狀。作為上述電極，優(yōu)選碳電極、金電極、鈀電極、鉑電極等，根據(jù)其種類可以通過例如網(wǎng)板印刷、涂布法、蒸鍍法等公知的方法形成。
碳電極的情況下，例如可以在上述基板11上通過網(wǎng)板印刷手段、涂布手段等形成碳墨。
上述金電極可以通過例如蒸鍍法、電鍍法、濺射法、金箔貼附法等形成。上述蒸鍍法為通過例如離子電鍍法，在真空度為1.33×10-4Pa、輸入功率為300W、速率為5×10-1nm/秒、時間為2分鐘的條件下，在例如PET等塑料片材上蒸鍍金，進一步使用kisscut裝置，在蒸鍍于上述片材上的金箔層中插入間隙的方法。由此，間隙部分成為絕緣部，能夠形成由作用極和對極構(gòu)成的電極系。
接著，如圖1(B)所示，在形成有上述電極系12、13的基板11上形成絕緣層14。此絕緣層在除了電極的導(dǎo)線部12a、13a(圖1(B)中的左側(cè))和形成后述無機凝膠層等的檢測部15之外的基板11上形成。
上述絕緣層14可如下形成例如將在溶劑中溶解有絕緣性樹脂的絕緣漿料印刷在上述基板11上，對其進行加熱處理或者紫外線處理而形成。
作為上述絕緣性樹脂，可以列舉出例如聚酯、丁縮醛樹脂、酚樹脂等，作為上述溶劑，可列舉出例如乙酸卡必酯、二元酸酯系混合溶劑(DBE溶劑)等。上述漿料中的上述絕緣性樹脂的濃度優(yōu)選為例如65～95重量％的范圍、更優(yōu)選為75～90重量％的范圍、特別優(yōu)選80～85重量％的范圍。
上述加熱處理的條件可根據(jù)所用上述絕緣性樹脂的種類進行適當(dāng)決定。
上述絕緣層14除了使用上述印刷法以外，還可以通過例如涂布、貼膜、蝕刻等方法形成。
接著，如圖1(C)所示，在未形成絕緣層14的檢測部15中，在基板11和電極12、13上形成無機凝膠層16。無機凝膠層16可如下形成例如制備含有介質(zhì)和表面活性劑、且分散有上述層狀無機化合物的分散液，將其分注于上述檢測部15中并干燥，由此形成。此無機凝膠層16不一定非要總是凝膠狀，在使用前也可以是通過上述干燥工序干燥了的狀態(tài)，在浸漬在液體試樣等的情況下，優(yōu)選為凝膠狀。
作為用于制備上述分散液的溶劑，如可以使用水、緩沖液、醇、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)等，其中優(yōu)選超純水。
上述分散液中的上述層狀無機化合物的濃度例如為0.1～100mg/mL的范圍、優(yōu)選為1～100mg/mL的范圍、更優(yōu)選為10～30mg/mL的范圍。上述分散液中的上述表面活性劑的濃度例如為1～200mM的范圍、優(yōu)選為1～100mM的范圍、更優(yōu)選為1～10mM的范圍。
分散液中的層狀無機化合物與表面活性劑的添加比例為，相對于300mg的上述層狀無機化合物，表面活性劑例如為0.1mmol～100mmol的范圍、優(yōu)選為0.5mmol～10mmol、更優(yōu)選為0.5mmol～1mmol的范圍。
上述分散液的上述介質(zhì)的濃度例如為1～1000mM的范圍、優(yōu)選為100～800mM的范圍、更優(yōu)選為200～500mM的范圍、特別優(yōu)選為300mM左右。
優(yōu)選上述分散液中進一步含有上述胺系等緩沖劑，此時上述緩沖劑的濃度例如在1～1000mM的范圍、優(yōu)選在10～500mM的范圍、更優(yōu)選在50～200mM的范圍。作為相對于層狀無機化合物的上述緩沖劑的添加比例為，相對于0.3g的上述層狀無機化合物，上述緩沖劑優(yōu)選例如為0.1mmol～100mmol、更優(yōu)選1mmol～50mmol、特別優(yōu)選在10mmol～20mmol的范圍。
由于上述表面活性劑和上述緩沖劑的添加量能夠如上所述，由相對于無機微粒的比例來決定，因此上述表面活性劑和上述緩沖劑的添加比例(摩爾比A∶B)沒有特別限定，例如在A∶B＝1∶1～1∶250的范圍、優(yōu)選在1∶10～1∶100的范圍、更優(yōu)選在1∶25～1∶50的范圍。
相對于上述溶劑，上述介質(zhì)、上述層狀無機化合物和表面活性劑等各成分的添加順序沒有特別限定，例如首先在上述溶劑中添加層狀無機化合物，充分攪拌后，添加表面活性劑。然后優(yōu)選再添加上述緩沖劑，最后溶解介質(zhì)。按照此順序，雖然機理不清楚，但能夠形成更加均勻、且防止與氧接觸的無機凝膠層。上述緩沖劑也可與表面活性劑一起添加，但特別優(yōu)選在添加表面活性劑后再添加。
上述分散液的制備方法沒有特別限定，如優(yōu)選根據(jù)所用介質(zhì)的種類等來調(diào)整pH或選擇使用的緩沖劑的種類。以下，舉出與介質(zhì)種類相應(yīng)的具體例。
首先，舉例說明使用優(yōu)選在中性左右下使用的介質(zhì)的情況。一般來說，蒙脫石這樣的層狀化合物(無機凝膠)溶解在水等溶劑中則變得透明，其分散液的pH為高堿性(pH 10左右)。而優(yōu)選在中性左右下使用的介質(zhì)、酶等優(yōu)選在穩(wěn)定的pH條件下、即中性左右下進行添加。但是，無機凝膠在中性左右下有時會產(chǎn)生混濁或者沉淀。此時，作為緩沖劑如果添加上述胺系緩沖劑，則能夠?qū)⑸鲜龇稚⒁旱膒H調(diào)整到中性左右，并且，雖然機理不清楚，但無論是否在中性左右都可以在不產(chǎn)生沉淀的情況下添加介質(zhì)。而且，作為其結(jié)果，如上所述那樣，能夠確實地形成可充分防止介質(zhì)再氧化的無機凝膠層。本發(fā)明人等還首次發(fā)現(xiàn)，通過在添加兩性表面活性劑這樣的表面活性劑后添加胺系緩沖劑，能夠充分防止所制備的分散液的混濁和沉淀。作為具體的添加順序，優(yōu)選為在層狀無機化合物的分散液中添加表面活性劑，之后添加胺系緩沖劑。添加胺系緩沖劑后的分散液的pH例如在9～5的范圍、優(yōu)選為8～6、更優(yōu)選為7.5～7。
作為優(yōu)選在中性左右下使用的介質(zhì)，可列舉出如鐵氰化鉀、細胞色素c、PQQ、NAD+、NADP+、銅絡(luò)合物等。
在使用優(yōu)選在酸性左右下使用的介質(zhì)的情況下，優(yōu)選下述制備方法。如上所述，一般來說，將層狀無機化合物(無機凝膠)溶解在溶劑中則變得透明，其分散液的pH變?yōu)閺妷A性。此時，為了添加優(yōu)選在酸性左右下使用的介質(zhì)，優(yōu)選例如在上述分散液中添加HCl等酸，將上述分散液的pH調(diào)整至酸性側(cè)，添加上述表面活性劑，之后添加上述具有羧基的緩沖劑來調(diào)整pH，然后添加介質(zhì)。
優(yōu)選這種方法的理由如下。本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，蒙脫石這樣的無機層狀化合物，在其分散液中添加HCl等酸而成為強酸性條件(如pH 2左右)時，雖然變得混濁發(fā)生凝集，但進一步通過持續(xù)攪拌(例如24小時左右)，即便在酸性側(cè)也能使分散液變得透明。但是，在此種狀態(tài)的分散液中不加入如上所述的成為粘合劑的緩沖劑，無法得到緩沖劑的效果，并且考慮到使用酶，在pH 2等的強酸性下，酶有可能失活。因此，通過進一步研究，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，通過在強酸性左右下變得透明的分散液中加入兩性表面活性劑這樣的表面活性劑后，再添加具有羧基的緩沖劑，并設(shè)定不影響介質(zhì)和酶的各成分的pH(如pH 4.5左右)，就能夠充分防止沉淀的產(chǎn)生，能夠在充分穩(wěn)定的狀態(tài)下使用介質(zhì)和酶。
上述分散液的pH，最初優(yōu)選為1～3的強酸性、更優(yōu)選為pH 1.5～2。作為所使用的酸，沒有特別限定，如鹽酸、磷酸、醋酸等。在強酸性下的上述分散液的攪拌條件沒有特別限定，攪拌時間如為12～72小時、優(yōu)選為18～48小時、特別優(yōu)選24～30小時。通過添加具有羧基的緩沖劑，上述分散液的pH優(yōu)選設(shè)定為3～6、更優(yōu)選為4～5、特別優(yōu)選為4.5～4.8。
作為優(yōu)選在酸性左右下使用的介質(zhì)，可列舉出例如釕絡(luò)合物、鋨絡(luò)合物、二茂鐵、吩嗪硫酸甲酯、靛酚、亞甲藍等。
在將層狀無機化合物、表面活性劑和緩沖劑添加到上述溶劑中后，優(yōu)選靜置一段時間。靜置時間優(yōu)選例如24小時或以上、更優(yōu)選為3天或以上。
此分散液向檢測部15的注入比例可根據(jù)例如檢測部15的大小、分散液中上述層狀無機化合物等的含量、上述層狀無機化合物的種類等進行適當(dāng)決定。具體地說，相對于檢測部15的單位面積(cm2)，例如優(yōu)選按照上述層狀無機化合物變?yōu)?.003～30mg的范圍的方式注入上述分散液、更優(yōu)選在0.1～10mg的范圍、特別優(yōu)選在0.3～3mg的范圍。因此，分散液的層狀無機化合物的濃度為0.3重量％時，相對于檢測部的單位面積(cm2)，優(yōu)選注入例如0.001～10mL的范圍、更優(yōu)選在0.03～3.3mL的范圍、特別優(yōu)選在0.1～1mL的范圍。
將上述分散液注入到檢測部15的方法沒有特別限定，如可以使用自動驅(qū)動式分注機等來進行。
干燥注入的上述分散液的手段沒有特別限定，如可采用自然干燥、風(fēng)干、減壓干燥、冷凍減壓干燥等方法。另外，也可組合使用這些手段。其處理溫度優(yōu)選在10～60℃的范圍、更優(yōu)選在25～50℃的范圍、特別優(yōu)選在30～40℃的范圍。相對濕度RH優(yōu)選在5～40％的范圍、更優(yōu)選在10～20％的范圍、特別優(yōu)選在10～15％的范圍。處理時間可以根據(jù)例如干燥手段進行適當(dāng)決定，優(yōu)選在1～60分鐘的范圍、更優(yōu)選在5～30分鐘的范圍、特別優(yōu)選在5～10分鐘的范圍。
接著，如圖1(D)所示，在上述無機凝膠層16上形成酶試劑層17。此酶試劑層17可如下形成制備含有上述氧化還原酶的酶液，將其注入到上述無機凝膠層16上并干燥，進而形成。作為上述氧化還原酶，可以使用例如前述的酶。
上述酶液例如可以將酶充分溶解于溶劑中而制備。作為上述溶劑，沒有特別限定，可以使用例如水、緩沖液、乙醇、甲醇、丁醇、二甲基亞砜(DMSO)和四氫呋喃等有機溶劑等。作為上述緩沖液，可以列舉出例如磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液、Good’s緩沖液等，其pH可根據(jù)酶的種類進行適當(dāng)決定，例如優(yōu)選pH5～10的范圍、更優(yōu)選在6～9的范圍、特別優(yōu)選在7～8的范圍。另外，作為水，可列舉出精制水、蒸餾水、超純水等，其中優(yōu)選超純水，這是因為超純水中的雜質(zhì)極少，能夠制作高精度的生物傳感器。
上述酶液中的試劑的濃度沒有特別限定，優(yōu)選例如1～10KU/mL的范圍、更優(yōu)選在3～6KU/mL的范圍。
優(yōu)選上述酶液中進一步含有表面活性劑，特別優(yōu)選含有兩性表面活性劑。作為上述兩性表面活性劑，可使用例如與上述相同的物質(zhì)。
此酶液除了含有氧化還原酶之外，還可以含有例如不會成為氧化還原酶基質(zhì)的糖類、氨基酸及其衍生物、咪唑等胺化合物、甜菜堿等。作為上述糖類，可以舉出例如蔗糖、蜜三糖、乳糖醇、核糖醇、阿拉伯醇等。其中，上述糖類能夠以例如提高酶的穩(wěn)定性為目的進行添加、上述氨基酸及其衍生物和甜菜堿能夠以例如防止干燥導(dǎo)致的試劑硬化為目的進行添加、咪唑能夠以例如穩(wěn)定介質(zhì)等為目的進行添加。
上述酶液的注入量可根據(jù)形成的酶試劑層17的大小、試劑的濃度、試樣的量、測定對象物的種類等進行適當(dāng)決定。
注入的上述酶液的干燥手段沒有特別限定，可采用例如自然干燥、風(fēng)干、減壓干燥、冷凍減壓干燥等方法，也可以將這些手段組合使用。作為干燥條件，例如溫度在10～60℃的范圍、相對濕度RH在5～40％的范圍、時間在1～60分鐘的范圍。使用酶作為試劑時，可以根據(jù)酶的種類按照不失活的方式設(shè)定適宜溫度。
接著，如圖1(E)所示，在絕緣層14上配置隔板18。如圖所示，隔板18與上述酶試劑層17相對應(yīng)的位置成為開口部。
作為上述隔板18的材料，可以使用例如樹脂制膜或膠帶等。另外，如果是雙面膠帶，則不僅僅與上述絕緣膜14粘接，也可以容易地粘接后述的蓋19。另外，也可以使用例如抗蝕劑印刷等手段形成隔板。
然后，如圖1(F)所示，在上述隔板18上配置蓋19。作為上述蓋19的材料，沒有特別限定，如可使用各種塑料等，可優(yōu)選列舉出PET等透明樹脂。
這樣制作的生物傳感器1，在長期保存的情況下為了防止?jié)駳獾挠绊?，?yōu)選與例如分子篩、硅膠、氧化鈣等干燥劑共同密封保存。
此生物傳感器1可以與例如下述測定機器組合使用，該測定機器具備在一定時間施加規(guī)定電壓的構(gòu)件、測定從上述生物傳感器傳送的電信號的構(gòu)件、將上述電信號換算為測定對象物濃度的換算構(gòu)件等各種構(gòu)件。
對該生物傳感器1的使用方法舉例說明，此例中的試樣為全血、測定對象物為葡萄糖、氧化還原酶為GDH、介質(zhì)為鐵氰化鉀。
首先，使全血試樣與生物傳感器1的開口部21的一端相接觸。此開口部21如上所述為毛細管結(jié)構(gòu)，由于在與另一端相對應(yīng)的蓋19上設(shè)有空氣孔20，因此能夠通過毛細管現(xiàn)象將上述試樣吸入至內(nèi)部。被吸入的上述試樣浸透在設(shè)置于檢測部15上的酶試劑層17中，溶解酶試劑層17中的GDH，接著到達作為酶試劑層17的下層的無機凝膠層16的表面。然后，到達表面的試樣中的葡萄糖與GDH、無機凝膠層16中的鐵氰化鉀發(fā)生反應(yīng)。具體地說，作為測定對象物的葡萄糖被GDH氧化，通過因該氧化反應(yīng)而移動了的電子，鐵氰化鉀被還原，生成亞鐵氰化鉀(亞鐵氰離子)。
此時，雖然試樣通過酶試劑層17到達無機凝膠層16，但沒有通過無機凝膠層16到達電極表面。因此，能夠防止被還原的亞鐵氰化鉀被試樣中的溶存氧再氧化，由此抑制測定精度的降低。另外，通過電子顯微鏡確認了水分未達到電極表面。由于含在上述試樣中的紅血球等雜質(zhì)也不能通過層狀無機化合物之間，因此不通過此無機凝膠層16，也防止了向電極12、13表面的吸附。
之后，在無機凝膠層16中被還原的亞鐵氰鉀與位于無機凝膠層16下部的電極之間進行電子授受，由此，能夠測定葡萄糖濃度。具體可如下進行。
從供給全血試樣開始經(jīng)過一定時間后，通過上述施加電壓的構(gòu)件在對極13和作用極12之間施加電壓，將與電極接觸的上述還原型亞鐵氰化鉀(亞鐵氰離子)電化學(xué)氧化為鐵氰化鉀，介由作用極12的導(dǎo)線部12a、通過上述測定電信號的構(gòu)件等檢測此時的氧化電流。由于此氧化電流的值與試樣中葡萄糖濃度成比例，因此如果使用上述換算構(gòu)件將其換算為葡萄糖濃度，則能夠求出試樣中的葡萄糖濃度。
通過這種生物傳感器，能夠防止如上所述溶存氧等的影響導(dǎo)致的還原型介質(zhì)的再氧化，且能夠提高測定精度和重現(xiàn)性。
本實施方案中，示例了將本發(fā)明的生物傳感器用于葡萄糖測定的例子，但并不限定于此，例如可根據(jù)測定對象物適當(dāng)決定試劑，制成各種測定對象的生物傳感器。具體地說，例如乳酸測定用生物傳感器時可使用乳酸氧化酶、醇測定用生物傳感器時可使用醇氧化酶、膽固醇測定用生物傳感器時可使用膽固醇氧化酶等。另外，葡萄糖測定用生物傳感器時還可以將例如吡喃糖氧化酶、葡萄糖氧化酶等作為試劑使用。
代替層疊上述無機凝膠層和酶試劑層，也可在分散有上述層狀無機化合物等的分散液中再添加氧化還原酶，在檢測部15上形成兼作酶試劑層和無機凝膠層的單層。此時，上述分散液的氧化還原酶量等沒有特別限定，如可參考上述添加量。
實施例1如下所示，制作與上述圖1(F)相同結(jié)構(gòu)的葡萄糖傳感器。
首先，準(zhǔn)備PET制基板(長為50mm、寬為6mm、厚為250μm)作為葡萄糖傳感器的絕緣基板11，通過網(wǎng)板印刷，在其中一個表面上形成由分別具有導(dǎo)線部的作用極12和對極13構(gòu)成的碳電極系。
接著，如下所示在上述電極上形成絕緣層14。首先，將絕緣性樹脂聚酯按照濃度達到75重量％的方式溶解于溶劑乙酸卡必酯中，制備絕緣性漿料，將其網(wǎng)板印刷在上述電極上。印刷條件為300網(wǎng)篩、橡膠輥壓40kg，印刷的量是每1cm2電極面積為0.002mL。對檢測部15和導(dǎo)線部12a、13a不進行網(wǎng)板印刷。然后，通過在90℃下加熱處理60分鐘而形成絕緣層14。
接著，在未形成上述絕緣層14的上述檢測部15上，如下所示形成無機凝膠層16。首先在100mL精制水中混懸0.6g商品名為“LUCENTITESWN”(CO-OP CHEMICAL公司生產(chǎn))的合成蒙脫石，攪拌約8～24小時。此合成蒙脫石混懸液的pH約為10。在10mL此合成蒙脫石混懸液中按順序添加0.1mL 10％(w/v)的CHAPS(同仁化學(xué)研究所生產(chǎn))水溶液、5.0mL 1.0M的ACES緩沖液(pH為7.4，同仁化學(xué)研究所生產(chǎn))和4.0mL的精制水，接著混合1.0g作為介質(zhì)的[Ru(NH3)6]Cl3(Aldrich公司生產(chǎn))。將此混合液作為無機凝膠層形成液(pH為7.5)。此無機凝膠形成液中的組成物的最終濃度如下所示。
LUCENTITE SWN0.3％(w/v)CHAPS0.3％(w/v)ACES緩沖液(pH為7.5) 100mM[Ru(NH3)6]Cl35.0％(w/v)將1.0μL此無機凝膠形成液分注于檢測部15。檢測部15的表面積約為0.1cm2，上述檢測部15的電極12、13的表面積約為0.12cm2。然后，在30℃、相對濕度為10％的條件下使其干燥10分鐘，形成無機凝膠層16。
在上述無機凝膠層16上形成酶試劑層17。其如下形成將1.0μL5000U/mL的GDH水溶液分注于檢測部15的上述無機凝膠層16上，在30℃、相對濕度為10％的條件下干燥10分鐘進而形成。
最后，在絕緣層14上配置具有開口部的隔板18，然后在上述隔板18上配置具有貫通孔20的蓋19，此貫通孔成為空氣孔，制作生物傳感器1。由于夾在上述蓋19和絕緣層14的隔板18的開口部的空間為毛細管結(jié)構(gòu)，因此將其作為試樣供給部21。
作為比較例1，除了在制備無機凝膠層形成液時使用精制水代替上述合成蒙脫石混懸液之外，與實施例1同樣操作，制作葡萄糖傳感器。
實施例2此例為使用上述實施例1制作的葡萄糖傳感器，測定與葡萄糖濃度相對應(yīng)的應(yīng)答電流的隨時間變化。
液體試樣使用人的全血。首先，將采血后的全血在37℃下放置約1天，將葡萄糖濃度調(diào)整至0mg/100mL。然后，向其中添加葡萄糖，制備各種葡萄糖濃度(約200、400、600mg/100mL)的試樣。將未添加葡萄糖的全血調(diào)整為葡萄糖濃度0mg/100mL。然后，作為實施例2，對上述葡萄糖傳感器1施加200mV的電壓，然后將試樣滴加在試樣供給部21上，測定滴加5秒后的應(yīng)答電流的時間過程。作為比較例2，對比較例1的葡萄糖傳感器進行同樣地測定。實施例和比較例都各進行3次測定(n＝3)。這些結(jié)果示于圖3(A)(B)。圖3為顯示使用葡萄糖傳感器測定試樣時的電流值隨時間變化的圖，圖3(A)為實施例2的結(jié)果，圖3(B)為比較例2的結(jié)果。
如同圖(A)所示，通過實施例1的葡萄糖傳感器，與同圖(B)所示的比較例1的葡萄糖傳感器相比，應(yīng)答電流值的峰在更早的時間出現(xiàn)，并且也得到了更高的峰電流值。能夠得到高的峰電流值的原因認為是通過實施例1的葡萄糖傳感器，由于在無機凝膠層中的氧被阻斷，因此通過葡萄糖與GDH的反應(yīng)而被還原的介質(zhì)不會被氧再氧化，而被電化學(xué)氧化，從而能夠測定其氧化電流。另外，電流值的峰在早時間出現(xiàn)的原因認為是在電極上的無機凝膠層中，蒙脫石的片材內(nèi)混入作為介質(zhì)的[Ru(NH3)6]Cl3而被牢固地固定，因此在電極表面介質(zhì)介由蒙脫石而變?yōu)楸惠p微固定的狀態(tài)，從而在電極左右的介質(zhì)濃度增大，反應(yīng)速度增大。
實施例3此例為使用本發(fā)明的葡萄糖傳感器，確認從滴加試樣開始經(jīng)過一定時間后的應(yīng)答電流值的重現(xiàn)性。
在人全血中添加葡萄糖，分別制備葡萄糖濃度為0、103、415、616、824mg/100mL的試樣。
作為實施例3，除了將上述無機凝膠層形成液中的蒙脫石濃度(LUCENTITE SWN)變?yōu)?.24％(w/v)以外，與上述實施例1同樣操作，制作了葡萄糖傳感器。在上述葡萄糖傳感器的電極間施加200mV的電壓后，滴加試樣，測定滴加5秒后的應(yīng)答電流值。上述測定使用同一個葡萄糖傳感器，對各試樣分別進行10次(n＝10)。作為比較例3，使用上述比較例1的葡萄糖傳感器，與上述實施例3同樣進行測定(n＝10)。
從所測定的實施例3和比較例3的應(yīng)答電流值(n＝10)求出表示測定重現(xiàn)性的CV值。這些結(jié)果示于下述表2。
表2

由上述表2的結(jié)果可知，比較例3特別將試樣中的葡萄糖濃度增加到824mg/100mL，由此CV值大幅度地變?yōu)?.30，與此相對，通過實施例3，CV值穩(wěn)定在2.34～3.02之間，無論上述葡萄糖濃度增加與否，都能重現(xiàn)性良好地進行測定。其結(jié)果可說明，實施例的葡萄糖傳感器能夠以比不含蒙脫石的比較例的生物傳感器更高的重現(xiàn)性進行測定。
實施例4此例為確認在一定濕度和溫度下暴露對上述實施例3制作的葡萄糖傳感器的影響。
將上述葡萄糖傳感器放置并暴露于維持在相對濕度為80％、溫度為40℃的室內(nèi)17小時后，在電極間施加200mV的電壓。然后滴加人全血試樣，此全血試樣中按照葡萄糖濃度為0、600mg/100mL的方式添加有葡萄糖，測定滴加5秒鐘后的應(yīng)答電流值。將其作為實施例4。作為比較例4，對上述比較例1的葡萄糖傳感器進行同樣測定。作為實施例4和比較例4的對照，分別使用上述葡萄糖傳感器，在上述通常的室溫濕度(約25℃、約60％Rh)條件下，對上述試樣測定應(yīng)答電流值。然后，將對照的電流值作為100％時，求出上述實施例4和比較例4的靈敏度(％)。結(jié)果示于以下表3。
表3

由上述表3可知，實施例3的葡萄糖傳感器即便在高濕度條件下暴露，與比較例1的葡萄糖傳感器相比，暴露后的靈敏度降低更小。即，可以說實施例3的葡萄糖傳感器，如上所述，通過無機凝膠層阻斷了例如空氣中的水分和試樣中的溶存氧，能夠防止介質(zhì)與氧的接觸，因此對濕度具有耐受性。
實施例5此例為確認試樣中的溶存氧對本發(fā)明的葡萄糖傳感器的影響。
在人全血中添加葡萄糖，按照葡萄糖濃度變?yōu)?11mg/100mL的方式制備試樣，然后分別將溶存氧調(diào)整為25.1mmHg左右(未調(diào)整)、92.0mmHg左右和171.6mmHg左右。通過在試管內(nèi)將溶存氧未調(diào)整(25.1mmHg)的上述試樣與氧混合，將溶存氧濃度調(diào)整到高濃度(92.0mmHg、171.6mmHg)。
作為實施例5，除了將上述無機凝膠層形成液的蒙脫石濃度(LUCENTITE SWN)調(diào)整至0.12％、0.24％、0.36％、0.48％(w/v)之外，與上述實施例1同樣制備4種葡萄糖傳感器。然后，在上述葡萄糖傳感器的電極間施加200mV的電壓后，滴加上述試樣，測定滴加5秒后的應(yīng)答電流值。對于這些各葡萄糖傳感器，以相對于溶存氧未調(diào)整(25.1mmHg)試樣的上述應(yīng)答電流值為基準(zhǔn)，根據(jù)下述式(10)求出各試樣(溶存氧為92.0mmHg、171.6mmHg)的應(yīng)答電流值的變化率(％)。作為比較例5，對上述比較例1的葡萄糖傳感器液進行同樣地測定，求出變化率(％)。它們的結(jié)果示于圖4。圖4為顯示試樣中溶存氧濃度與變化率(％)關(guān)系的圖，圖中△、○、□、分別為實施例5，●為比較例5。變化率(％)的絕對值越大，應(yīng)答電流越變化。
變化率(％)＝[(A/B)-1]×100(10)A溶存氧調(diào)整試樣的應(yīng)答電流B溶存氧未調(diào)整試樣的應(yīng)答電流如圖4所示，根據(jù)實施例5，即便增加試樣的溶存氧，與比較例5相比，變化率(％)的絕對值也小。由此可知，根據(jù)含有蒙脫石的實施例的葡萄糖傳感器，溶存氧導(dǎo)致的靈敏度降低小、且能夠減輕試樣等溶液中的溶存氧的影響。
實施例6此例為確認試樣中的溶存氧對將GOD用作氧化還原酶的本發(fā)明的葡萄糖傳感器的影響。
使用按照達到以下最終濃度的方式制備的分散液作為無機凝膠層形成液，作為酶溶液，使用1200U/mL的GOD溶液(天野公司生產(chǎn))代替GDH水溶液，使用鐵氰化鉀(和光純藥工業(yè)公司生產(chǎn))代替[Ru(NH3)6]Cl3、使用Tris-HCl緩沖液(pH為7.4，同仁化學(xué)研究所生產(chǎn))代替ACES緩沖液，除此之外，與上述實施例1同樣操作制作葡萄糖傳感器。
LUCENTITE SWN 0.3％(w/v)CHAPS 0.1％(w/v)Tris-HCl緩沖液100mM鐵氰化鉀 3.0％(w/v)作為比較例6，將1μL含有1200U/mL的GOD和3.0％(w/v)的鐵氰化鉀的溶液注入到檢測部并干燥，以此來代替形成無機凝膠層和酶試劑層，除此之外與上述實施例6同樣操作制作生物傳感器。
在人全血中添加葡萄糖，按照葡萄糖濃度變?yōu)?00mg/100mL的方式制備試樣，然后分別將溶存氧調(diào)整為48.9mmHg(未調(diào)整)、106.4mmHg和180.4mmHg。與上述實施例5相同，通過在試管內(nèi)將溶存氧未調(diào)整的上述試樣與氧混合，將溶存氧濃度調(diào)整到高濃度。
在人全血中添加葡萄糖，制備葡萄糖濃度變?yōu)?00mg/100mL的試樣。然后，在上述葡萄糖傳感器的電極間施加500mV的電壓后，測定滴加試樣5秒后的應(yīng)答電流值。對比較例6的葡萄糖傳感器也進行同樣測定。對實施例6和比較例6與上述實施例5相同，以相對于溶存氧未調(diào)整(48.9mmHg)試樣的上述應(yīng)答電流值為基準(zhǔn)，根據(jù)上述式(10)求出相對于各試樣(溶存氧為106.4mmHg、180.4mmHg)的應(yīng)答電流值的變化率(％)。它們的結(jié)果示于圖5。圖5為顯示試樣中溶存氧濃度與變化率(％)關(guān)系的圖，同圖中○為實施例6、●為比較例6的結(jié)果。
如圖5所示，可知使用GOD作為氧化還原酶的實施例6與比較例6相比，試樣中的溶存氧導(dǎo)致的靈敏度下降小，且能夠減輕溶存氧的影響。
實施例7實施例7使用了實施例1制作的葡萄糖傳感器，該葡萄糖傳感器中分別使用CHAPS作為表面活性劑(兩性表面活性劑)、使用ACES緩沖液作為胺系緩沖劑。另一方面，作為比較例7，除了使用膽酸(陰離子系表面活性劑)代替CHAPS作為表面活性劑、使用磷酸鈉代替ACES作為緩沖劑之外，其余與上述實施例1同樣操作，制作葡萄糖傳感器并使用。
在人全血中添加葡萄糖，制備葡萄糖濃度為100mg/100mL的試樣，然后分別將溶存氧調(diào)整為34.7mmHg(未調(diào)整)、117.1mmHg和185.3mmHg左右。與上述實施例5相同，通過在試管內(nèi)將溶存氧未調(diào)整的上述試樣與氧混合，將溶存氧濃度調(diào)整到高濃度。
在葡萄糖傳感器的電極間施加200mV的電壓后，滴加上述試樣，測定滴加5秒后的應(yīng)答電流值。對這些各葡萄糖傳感器，以相對于溶存氧未調(diào)整試樣的上述應(yīng)答電流值為基準(zhǔn)，根據(jù)上述式(10)求出相對于其他試樣的應(yīng)答電流值的變化率(％)。比較例7也使用上述葡萄糖傳感器進行同樣的測定，求出變化率(％)。它們的結(jié)果示于圖6。圖6為顯示試樣中溶存氧濃度與變化率(％)關(guān)系的圖，同圖中○為實施例7、●為比較例7的結(jié)果。
如圖6所示，不使用兩性表面活性劑而使用陰離子性表面活性劑、不使用胺系緩沖劑而使用磷酸鈉作為緩沖劑的比較例7的葡萄糖傳感器，不論是否含有蒙脫石，與實施例7相比，受到溶存氧的很大影響。由此可知，像實施例那樣，通過在兩性表面活性劑和胺系緩沖劑的存在下形成含有蒙脫石的無機凝膠層，能夠防止試樣中的氧的影響。另外，像比較例那樣使用陰離子性表面活性劑時，難以在電極上承載分散液，制作本身是困難的。
實施例8根據(jù)以下所示的方法，除了制備了無機凝膠形成液以外，與上述實施例1同樣制作了生物傳感器。
將0.6g合成蒙脫石(商品名LUCENTITE SWNCO-OP CHEMICAL公司生產(chǎn))、1g 10％(w/v)的CHAPS(同仁化學(xué)研究所生產(chǎn))水溶液和98.4g精制水混合(合計為100g)，將此蒙脫石混懸液攪拌一晚。在40g攪拌后的混懸液中加入2N的HCl(4g)并攪拌一晚(約24小時)(攪拌機商品名Magnetic StirrerHS-3E株式會社井內(nèi)盛榮堂生產(chǎn))。通過添加HCl，上述混懸液變渾濁，但攪拌一晚后變得透明。在此混懸液中按照200mM琥珀酸-醋酸鈉緩沖液(pH為4.5)達到1∶1的方式進行混合?；旌显摼彌_液后的混懸液的pH約為4.5。在添加有上述緩沖劑的混懸液中，進一步添加作為介質(zhì)的[Ru(NH3)6]Cl3(Aldrich公司生產(chǎn))，使其為5％(w/v)，將此作為無機凝膠層形成液。此無機凝膠形成液中組成物的最終濃度如下所示。
LUCENTITE SWN 0.3％(w/v)CHAPS 0.3％(w/v)琥珀酸-醋酸鈉緩沖液(pH為4.5)100mM[Ru(NH3)6]Cl35.0％(w/v)如上所述，通過本發(fā)明的生物傳感器的制造方法，由于例如能夠防止用于間接測定試樣中測定對象物的還原型介質(zhì)被測定氛圍中的氧和試樣中的溶存氧等再氧化，因此能夠提供消除了上述還原型介質(zhì)的再氧化導(dǎo)致的測定誤差、且測定精度優(yōu)異的生物傳感器。
權(quán)利要求
1.一種生物傳感器的制造方法，其包含下述工序準(zhǔn)備具有電極的基板，并在所述電極表面上形成至少含有介質(zhì)、表面活性劑、緩沖劑以及層狀無機化合物的無機凝膠層。
2.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其中，所述表面活性劑為兩性表面活性劑。
3.如權(quán)利要求2所述的制造方法，其中，所述兩性表面活性劑為在同一分子內(nèi)帶有正電荷和負電荷的表面活性劑。
4.如權(quán)利要求3所述的制造方法，其中，所述兩性表面活性劑為選自烷基氨基羧酸鹽、羧基甜菜堿、磺基甜菜堿和磷酸甜菜堿中的至少一種表面活性劑。
5.如權(quán)利要求2所述的制造方法，其中，所述兩性表面活性劑為在同一分子內(nèi)帶有正電荷和負電荷、且所述正電荷和負電荷分開的表面活性劑。
6.如權(quán)利要求5所述的制造方法，其中，所述兩性表面活性劑為選自羧基甜菜堿、磺基甜菜堿和磷酸甜菜堿中的至少一種表面活性劑。
7.如權(quán)利要求2所述的制造方法，其中，所述兩性表面活性劑為烷基二甲基氨基醋酸甜菜堿。
8.如權(quán)利要求2所述的制造方法，其中，所述兩性表面活性劑為選自CHAPS、CHAPSO和烷基羥基磺基甜菜堿中的至少一種磺基甜菜堿。
9.如權(quán)利要求1或2所述的制造方法，其中，所述緩沖劑為胺系緩沖劑。
10.如權(quán)利要求9所述的制造方法，其中，所述胺系緩沖劑為選自Tris、ACES、CHES、CAPSO、TAPS、CAPS、Bis-Tris、TAPSO、TES、Tricine和ADA中的至少一種物質(zhì)。
11.如權(quán)利要求1或2所述的制造方法，其中，所述緩沖劑為具有羧基的緩沖劑。
12.如權(quán)利要求11所述的制造方法，其中，所述具有羧基的緩沖劑為選自醋酸-醋酸鈉緩沖劑、蘋果酸-醋酸鈉緩沖劑、丙二酸-醋酸鈉緩沖劑和琥珀酸-醋酸鈉緩沖劑中的至少一種緩沖劑。
13.如權(quán)利要求1或2所述的制造方法，其中，通過涂布至少含有介質(zhì)、表面活性劑、緩沖劑以及層狀無機化合物的分散液來形成所述無機凝膠層。
14.如權(quán)利要求13所述的制造方法，其中，在使表面活性劑和層狀無機化合物分散到分散介質(zhì)中后，添加緩沖劑，并進一步添加介質(zhì)，由此制備所述分散液。
15.如權(quán)利要求14所述的制造方法，其中，在使層狀無機化合物分散在分散介質(zhì)中后，添加表面活性劑，然后添加胺系緩沖劑，接著進一步添加介質(zhì)，由此制備所述分散液。
16.如權(quán)利要求15所述的制造方法，其中，所述介質(zhì)為選自鐵氰化鉀、細胞色素c、PQQ、NAD+、NADP+、銅絡(luò)合物和釕絡(luò)合物中的至少一種物質(zhì)。
17.如權(quán)利要求15所述的制造方法，其中，添加了所述胺系緩沖劑后的分散液的pH在5～9的范圍。
18.如權(quán)利要求14所述的制造方法，其中在使層狀無機化合物分散在分散介質(zhì)中并在強酸性條件下攪拌后，添加表面活性劑，接著添加具有羧基的緩沖劑，進一步添加介質(zhì)，由此制備所述分散液。
19.如權(quán)利要求18所述的制造方法，其中，所述介質(zhì)為選自釕絡(luò)合物、鋨絡(luò)合物、二茂鐵、吩嗪硫酸甲酯、靛酚和亞甲藍中的至少一種物質(zhì)。
20.如權(quán)利要求18所述的制造方法，其中，所述強酸性條件為pH在1～3的范圍。
21.如權(quán)利要求18所述的制造方法，其中，添加了具有羧基的緩沖劑后的分散液的pH在3～6的范圍。
22.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其中，所述無機凝膠層為防止所述介質(zhì)自然氧化的層。
23.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其中，在所述無機凝膠層上進一步形成含有氧化還原酶的層。
24.如權(quán)利要求13所述的制造方法，其中，在所述分散液中進一步含有氧化還原酶，從而形成含有所述氧化還原酶的無機凝膠層。
25.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其中，所述層狀無機化合物為層狀粘土礦物。
26.如權(quán)利要求25所述的制造方法，其中，所述層狀粘土礦物為膨潤性層狀粘土礦物。
27.如權(quán)利要求13所述的制造方法，其中，所述分散液中的層狀無機化合物和表面活性劑的添加比例為，相對于0.3g的層狀無機化合物，表面活性劑在1～200mmol的范圍。
28.如權(quán)利要求13所述的制造方法，其中，所述分散液中的層狀無機化合物和緩沖劑的添加比例為，相對于0.3g的層狀無機化合物，緩沖劑在1～1000mM的范圍。
29.如權(quán)利要求23或24所述的制造方法，其中，所述氧化還原酶為選自葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、葡萄糖脫氫酶、乳酸氧化酶、乳酸脫氫酶、果糖脫氫酶、半乳糖氧化酶、膽固醇氧化酶、膽固醇脫氫酶、醇氧化酶、醇脫氫酶、膽紅素氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、氨基酸脫氫酶、甲酸脫氫酶、甘油脫氫酶、酰基輔酶A氧化酶、膽堿氧化酶、4-羥基安息香酸羥基化酶、馬來酸脫氫酶、肌氨酸氧化酶和尿酸酶中的至少一種酶。
30.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其中，所述介質(zhì)為選自鐵氰化鉀、對苯醌及其衍生物、靛酚衍生物、β-萘醌-4-磺酸鉀、二茂鐵衍生物、鋨絡(luò)合物、釕絡(luò)合物、NAD+、NADP+、吡咯喹啉醌、亞甲藍、細胞色素c、細胞色素b和銅絡(luò)合物中的至少一種物質(zhì)。
31.一種通過權(quán)利要求1所述的生物傳感器的制造方法制造得到的生物傳感器。
全文摘要
本發(fā)明提供一種能夠回避氧對介質(zhì)的影響、并可迅速且簡便地以高精度對試樣溶液中的測定對象物進行測定的生物傳感器?？梢詼?zhǔn)備具有電極的基板，在所述電極表面上涂布含有介質(zhì)、表面活性劑、緩沖劑和層狀無機化合物的溶劑，形成防止所述介質(zhì)自然氧化的無機凝膠層，進一步在所述層上形成含有氧化還原酶的酶試劑層，從而制造生物傳感器。此生物傳感器通過所述無機凝膠層，可以將由測定對象物和氧化還原酶的反應(yīng)而被還原的介質(zhì)在不被溶存氧等再氧化的情況下用電化學(xué)方法測定。
文檔編號C12Q1/00GK1875265SQ20048003255
公開日2006年12月6日 申請日期2004年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月30日
發(fā)明者山岡秀亮, 辻朋吾 申請人:愛科來株式會社