專利名稱：新家族的碳水化合物結(jié)合組件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及屬于CBM新家族的非催化性碳水化合物結(jié)合組件(CBM)。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的CBM附著于糖基水解酶家族61(GH61)多肽并顯示與已知的CBM幾乎沒有同源性，這表示它是CBM新家族的第一個已知成員。本發(fā)明還涉及優(yōu)選對纖維素顯示出親和力的CBM；產(chǎn)生該CBM的方法；以及在紡織品、洗滌劑和纖維素纖維生產(chǎn)工業(yè)中、純化多肽、活性酶固定、焙烤、制造生物燃料、改變植物細(xì)胞壁中使用該CBM的方法。
背景技術(shù)：
碳水化合物結(jié)合組件(CBM)被定義為帶有具碳水化合物結(jié)合活性的不連續(xù)折疊的碳水化合物活性酶中的連續(xù)氨基酸序列。CBM在較大的酶中作為組件存在的需要將該類碳水化合物結(jié)合蛋白質(zhì)與其他非催化性糖結(jié)合蛋白質(zhì)(如凝集素和糖轉(zhuǎn)運蛋白)區(qū)別開來。
根據(jù)一些結(jié)合纖維素組件的最初發(fā)現(xiàn)(Tomme等(1989)FEBS Lett.243，239-243；Gilkes等(1988)J.Biol.Chem.263，10401-10407)，CBM曾經(jīng)被歸類為纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)。然而，持續(xù)發(fā)現(xiàn)碳水化合物活性酶中結(jié)合非纖維素外的碳水化合物并符合CBM標(biāo)準(zhǔn)的組件。
之前對纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的歸類基于氨基酸相似性。CBD分組被稱為“型”并以羅馬數(shù)字編號(例如I型或II型CBD)。為了與糖苷水解酶分類一致，現(xiàn)在將這些分組稱為家族并用阿拉伯?dāng)?shù)字編號。家族1到13與I到XIII型相同(Tomme等(1995)in Enzymatic Degradation of InsolublePolysaccharides(Saddler & Penner編)142-163，American ChemicalSociety，Washington)。
最近，已知的CBM被分類在家族1-6和8-33中。大部分分類的CBM是細(xì)菌來源的，且已知的真菌碳水化合物結(jié)合組件主要被歸類于CBM1家族。然而，在CBM13、CBM18、CBM19、CBM20和CBM24中也發(fā)現(xiàn)典型的真菌CBM。迄今為止，只有來自CBM1的真菌碳水化合物結(jié)合組件已知與微晶纖維素結(jié)合。來自CBM13、CBM18、CBM19、CBM20和CBM24家族的真菌CBM已經(jīng)顯示與底物例如殼多糖、淀粉和齒斑葡聚糖結(jié)合。然而，來自CBM1的真菌碳水化合物結(jié)合組件也與殼多糖很好的結(jié)合。
大量真菌纖維素酶已經(jīng)顯示含有CBM1家族的由36個氨基酸殘基組成的CBD。已知含有該結(jié)構(gòu)域的酶實例為來自瑞氏木霉(Trichoderma reesei)的內(nèi)切葡聚糖酶I(基因egl1)，來自瑞氏木霉的內(nèi)切葡聚糖酶II(基因egl2)，來自瑞氏木霉的內(nèi)切葡聚糖酶V(基因egl5)，來自灰腐質(zhì)酶(Humicola grisea)、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、瑞氏木霉和綠色木霉(Trichoderma viride)的外切纖維二糖水解酶I(基因CBHI)，來自瑞氏木霉的外切纖維二糖水解酶II(基因CBHII)，來自二孢蘑菇(Agaricus bisporus)的外切纖維二糖水解酶3(基因cel3)，來自尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)的內(nèi)切葡聚糖酶B、C2、F和K，在這些酶的N端(Cbh-II或egl2)或C端末端(Cbh-I、egl1或egl5)均發(fā)現(xiàn)CBD結(jié)構(gòu)域。在該類型CBD結(jié)構(gòu)域中有四個保守的半胱氨酸殘基，它們均與二硫鍵有關(guān)(Prosite，Swiss Institute of Bioinformatics)。
可使用PCR技術(shù)并根據(jù)現(xiàn)有知識常規(guī)獲得來自給定生物的編碼CBD的DNA序列；可能從其他生物找到同源序列。
設(shè)想通過克隆纖維素酶、木聚糖酶或其他植物細(xì)胞壁降解酶并測量與(例如)纖維素的結(jié)合來發(fā)現(xiàn)新的CBD。如果酶在下文描述的標(biāo)準(zhǔn)條件下結(jié)合Avicel，可假設(shè)基因的部分編碼結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
可從植物獲得的CBM樣多肽的實例為擴(kuò)展蛋白。擴(kuò)展蛋白本質(zhì)上不是CBM，因為未發(fā)現(xiàn)它們由具有酶活性的同樣的氨基酸序列編碼。然而，觀察到分離的CBM結(jié)構(gòu)域可具有對纖維素的擴(kuò)展蛋白樣活性(Levy和Shoseyov，2002，見上文)。Din等(Bio/Technology 9(1991)1096-1099)報道來自糞肥纖維單胞菌(Cellulomonas fimi)內(nèi)切葡聚糖酶A的CBDCenA能夠非水解性破壞引起小顆粒釋放的纖維素纖維活性。另外，顯示CBD CenA能夠阻止微晶細(xì)菌纖維素的絮凝(Gilkes等(1993)Int.J.Biol.Macromol.15347-351)。在其他CBD中觀察到類似的現(xiàn)象(Krull等(1988)Biotechnol.Bioeng.31321-327；Banka等(1998)World J.Microbiol.Biotechnol.14551-558；Gao等(2001)Acta Biochim.Biophys.Sin.3313-18)。
已知使用CBM廣泛應(yīng)用于洗滌、紡織品處理、牙菌斑去除、多肽純化、活性酶固定、纖維質(zhì)材料修飾、焙烤、生物燃料制造、植物細(xì)胞壁修飾。
發(fā)明概述本發(fā)明者目前發(fā)現(xiàn)可從真菌假黑盤菌(Pseudoplectania nigrella)(保藏號CBS 444.97)中獲得的具有纖維素親和力的碳水化合物結(jié)合組件(CBM)，發(fā)現(xiàn)新的CBM與屬于糖基水解酶家族61(GH61)的酶結(jié)合。新的CBM(稱為CBMX)顯示對Avicel具有親和力并與已知的CBM不具有可見的同源性(小于20％)。并且，本發(fā)明CBM中發(fā)現(xiàn)沒有一個半胱氨酸殘基位置與上述CBM1家族中很保守的半胱氨酸殘基位置對應(yīng)。這指示本發(fā)明的CBM為CBM新家族的第一個已知成員。
除具有纖維素親和力的CBM1家族的真菌CBM外，本發(fā)明CBM為第一個顯示具有纖維素親和力的已知真菌CBM。本發(fā)明者成功克隆并表達(dá)了與GH61酶家族結(jié)合的CBM。此外，發(fā)明者表達(dá)了不帶有GH61酶的結(jié)構(gòu)域并證明CBM可獨自結(jié)合纖維素(例如Avicel)。
所述CBM結(jié)構(gòu)域由SEQ ID NO1的109-531位置DNA序列編碼并具有SEQ ID NO2的34-174位置氨基酸序列。SEQ ID NO2的位置1-33組成了GH61酶的信號肽和N端區(qū)域。
因此，本發(fā)明涉及新CBM家族的CBM，其中CBM為
(a)SEQ ID NO1位置109-531的DNA序列或與SEQ ID NO1同源的DNA序列編碼的多肽，所述同源DNA序列與SEQ ID NO1位置109-531有至少40％同一性，優(yōu)選至少50％同一性，更優(yōu)選至少60％同一性，更優(yōu)選至少70％同一性，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％同一性，更優(yōu)選至少97％同一性，更優(yōu)選至少98％同一性，特別優(yōu)選與SEQ ID NO1位置109-531有至少99％的同一性；(b)通過在DNA序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)包含SEQ ID NO1位置109-531的DNA序列的細(xì)胞所產(chǎn)生的多肽；(c)具有SEQ ID NO2位置34-174氨基酸序列的多肽，或與SEQID NO2同源的多肽，其中多肽與SEQ ID NO2位置34-174有至少40％同一性，優(yōu)選至少50％同一性，更優(yōu)選至少60％同一性，更優(yōu)選至少70％同一性，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％同一性，更優(yōu)選至少97％同一性，更優(yōu)選至少98％同一性，特別優(yōu)選與SEQ ID NO2位置34-174有至少99％的同一性；(d)由與SEQ ID NO1位置109-531的DNA序列優(yōu)選在低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選至少在中嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選至少在中/高嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選至少在高嚴(yán)格條件下，特別優(yōu)選至少在非常高嚴(yán)格條件下雜交的DNA序列編碼的多肽；(e)分離的多核苷酸分子編碼的多肽，該多核苷酸分子與變性的雙鏈DNA探針優(yōu)選在低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選至少在中嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選至少在中/高嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選至少在高嚴(yán)格條件下，特別優(yōu)選至少在非常高嚴(yán)格條件下雜交，其中探針選自包含SEQ ID NO1位置109-531所示序列的DNA探針，以及包含SEQ ID NO1位置109-531的子序列的DNA探針，該子序列有至少大約100堿基對的長度，優(yōu)選至少200堿基對，更優(yōu)選至少300堿基對，更優(yōu)選至少400堿基對，更優(yōu)選至少440堿基對，甚至更優(yōu)選至少450堿基對的長度；
(f)由可從假黑盤菌CBS 444.97中獲得的DNA序列編碼的CBM多肽。
在另外的方面，本發(fā)民提供了包含例如是本發(fā)明多核苷酸分子的DNA片段的表達(dá)載體；包含DNA片段或表達(dá)載體的細(xì)胞；以及產(chǎn)生CBM多肽的方法，該方法包括在允許CBM產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收CBM。另外，可使用本領(lǐng)域眾所周知的純化方法從回收的CBM中去除雜質(zhì)(如同源的雜質(zhì))。
另一方面，本發(fā)明提供了分離的CBM多肽，其特征在于(i)不含同源的雜質(zhì)及(ii)由上述方法產(chǎn)生。
本發(fā)明的新CBM可用于洗滌、紡織品處理、多肽純化、活性酶固定、纖維質(zhì)材料修飾、焙烤、生物燃料制造、植物細(xì)胞壁修飾。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及可從真菌假黑盤菌中獲得并屬于新家族真菌CBM的非催化性碳水化合物結(jié)合組件(CBM)。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明CBM與屬于糖基水解酶家族61的蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的CBM由SEQ ID NO1位置109-531的DNA序列編碼并具有SEQ ID NO2位置34-174的氨基酸序列。所述CBM優(yōu)選顯示纖維素親和力。本發(fā)明涉及產(chǎn)生該CBM的方法；并涉及在洗滌應(yīng)用、紡織品處理、多肽純化、活性酶固定、纖維質(zhì)材料修飾、焙烤、生物燃料制造、植物細(xì)胞壁修飾中使用該CBM的方法。
本發(fā)明者成功克隆并表達(dá)了與GH61酶家族結(jié)合的CBM。此外，本發(fā)明者表達(dá)了不帶有GH61酶的結(jié)構(gòu)域并證明CBM可獨自結(jié)合纖維素。因此，本發(fā)明涉及新CBM家族的CBM，其中CBM為(a)SEQ ID NO1位置109-531的DNA序列或與SEQ ID NO1同源的DNA序列編碼的多肽，所述同源DNA序列與SEQ ID NO1位置109-531有至少40％同一性，優(yōu)選至少50％同一性，更優(yōu)選至少60％同一性，更優(yōu)選至少70％同一性，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％同一性，更優(yōu)選至少97％同一性，更優(yōu)選至少98％同一性，特別優(yōu)選與SEQ ID NO1位置109-531有至少99％的同一性；
(b)通過在DNA序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)包含SEQ ID NO1位置109-531的DNA序列的細(xì)胞所產(chǎn)生的多肽；(c)具有SEQ ID NO2位置34-174氨基酸序列的多肽，或與SEQ IDNO2同源的多肽，其中多肽與SEQ ID NO2位置34-174有至少40％同一性，優(yōu)選至少50％同一性，更優(yōu)選至少60％同一性，更優(yōu)選至少70％同一性，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％同一性，更優(yōu)選至少97％同一性，更優(yōu)選至少98％同一性，特別優(yōu)選與SEQ ID NO2位置34-174有至少99％的同一性；(d)由與SEQ ID NO1位置109-531的DNA序列優(yōu)選在低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選至少在中嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選至少在中/高嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選至少在高嚴(yán)格條件下，特別優(yōu)選至少在非常高嚴(yán)格條件下雜交的DNA序列編碼的多肽；(e)分離的多核苷酸分子編碼的多肽，該多核苷酸分子與變性的雙鏈DNA探針優(yōu)選在低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選至少在中嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選至少在中/高嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選至少在高嚴(yán)格條件下，特別優(yōu)選至少在非常高嚴(yán)格條件下雜交，其中探針選自包含SEQ ID NO1位置109-531所示序列的DNA探針，以及包含SEQ ID NO1位置109-531子序列的DNA探針，該子序列有至少大約100堿基對的長度，優(yōu)選至少200堿基對，更優(yōu)選至少300堿基對，更優(yōu)選至少400堿基對，更優(yōu)選至少440堿基對，甚至更優(yōu)選至少450堿基對的長度；(f)由可從假黑盤菌CBS 444.97中獲得的DNA序列編碼的CBM多肽。
雜交確定核苷酸探針與同源的DNA或RNA序列之間在低到非常高嚴(yán)格下雜交的合適的實驗條件包括將含有待雜交DNA片段或RNA的濾紙在5xSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉，見述于如Sambrook等(1989)《MolecularCloningA Laboratory Manual》，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)中預(yù)浸泡10分鐘，并在5x SSC、5x Denhardt雜交溶液(Sambrook等，1989，如上文)、0.5％SDS和100μg/ml超聲處理變性的鮭精DNA(Sambrook等，1989如上文)中與濾紙預(yù)雜交，然后在含有10ng/ml濃度隨機(jī)引物(Feinberg和Vogelstein(1983)Anal.Biochem.132，6-13)、32P-dCTP-標(biāo)記的探針(比活性＞1×109cpm/μg)的相同溶液中在大約45℃雜交12小時。然后將濾紙在2x SSC，0.5％SDS中在至少55℃(低嚴(yán)格)，更優(yōu)選至少60℃(中度嚴(yán)格)，更優(yōu)選至少65℃(中/高度嚴(yán)格)，特別更優(yōu)選至少70℃(高度嚴(yán)格)，以及甚至更優(yōu)選至少75℃(非常高嚴(yán)格)下30分鐘洗滌兩次。
序列比對和同一性可使用Vector NTI Program Suite 7.0(Invitrogen Inc.子公司Informax)的AlignX應(yīng)用程序，使用默認(rèn)設(shè)置比對核苷酸序列，默認(rèn)程序設(shè)置使用修飾的ClustalW算法(Thompson等，(1994)Nuc.Acid Res.224673-4680)、swgapdnarnt計分矩陣、缺口打開罰分為15，缺口延伸罰分為6.66。
可使用Vector NTI Program Suite v8(Invitrogen Inc.子公司Informax)的AlignX應(yīng)用程序使用默認(rèn)設(shè)置比對氨基酸序列，默認(rèn)設(shè)置使用修飾的ClustalW算法(Thompson等，(1994)，如上文)、blosum62mt2計分矩陣、缺口打開罰分為10，缺口延伸罰分為0.1。
在通常被認(rèn)為非常靈敏的Smith-Waterman搜索(Smith和Waterman(1981)J.Mol.Biol.147195-197)中，兩個蛋白質(zhì)顯示在氨基酸水平上一些相似性。第一個是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FIG2(Swiss-Prot No.p25653)。Smith-Waterman分?jǐn)?shù)為162，并在143堿基對的重疊中顯示28.7％的同一性。同源性的解釋本發(fā)明CBM和FIG2都高度富含絲氨酸-蘇氨酸。兩個蛋白質(zhì)之間的相似區(qū)域被認(rèn)為在FIG2中是高度糖基化的。可能該區(qū)域的相似性模式與糖基化識別更相關(guān)，而非實際上的功能相似性。第二個顯示若干相似性的蛋白質(zhì)為來自嗜煙堿節(jié)桿菌(Arthrobacternicotinovorans)的假定蛋白質(zhì)(SPTREMBLQ8GAM3)。該蛋白質(zhì)具有138的Smith-Waterman分?jǐn)?shù)并在128個氨基酸重疊中有30.5％的同一性。整體同源性非常低。難以相信這兩個蛋白質(zhì)是進(jìn)化或者功能性相關(guān)的。
大小和3D結(jié)構(gòu)本發(fā)明的CBM有六個苯丙氨酸以可能將其置于同一高級結(jié)構(gòu)(如β桶或α螺旋)表面的距離重復(fù)。CBM家族1-6、9和15典型成員的三維結(jié)構(gòu)已通過x射線衍射晶體分析法和NMR確定，而且根據(jù)Levy和Shoseyov(Biotechnology Advances 20(2002)191-213)，來自這些結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)指出來自不同家族的CBD是結(jié)構(gòu)相似的，并且它們的纖維素結(jié)合能力可至少部分地歸因于組成它們疏水表面的若干芳香族氨基酸。因此本發(fā)明發(fā)明者希望指出若干苯丙氨酸殘基和它們對于本發(fā)明CBM結(jié)合纖維素能力的重要性。以下為殘基被標(biāo)記的CBM亞區(qū)VPNFTATDVPTFTATDIPTFTATDVPIFTKKPQQPS(SEQ ID NO2的位置64-99)，并進(jìn)一步指向C端SVSFVAKPSAFIPKPSA(SEQ ID NO2的位置110-126)。
本發(fā)明的表達(dá)的CBM或含有CBM的多肽具有與非糖基化形式相等或高出大約15kD的分子量(Mw)。大多數(shù)與Avicel結(jié)合的蛋白質(zhì)顯示分子量35-45kDa的寬譜帶，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于碳水化合物結(jié)合組件蛋白質(zhì)部分的15kDa。高且不均一的分子量可能是由于蛋白質(zhì)N端O-糖基化和N-糖基化的不均一性。對于米曲霉(Aspergillus oryzae)中異源表達(dá)的CBMX，由于蛋白質(zhì)糖基化的不均一性，CBMX的大小可由14kDa變化至幾乎70kDa。此外，35-45kDa帶的N端測序唯一地給出序列SFSSSGT(SEQ IDNO9的位置47-53)，指出不存在N端氨基酸序列的不均一性。
優(yōu)選的，非糖基化形式的本發(fā)明CBM的分子量等于或低于大約70kD，更優(yōu)選等于或低于大約50kD，更優(yōu)選等于或低于大約40kD或30kD，甚至更優(yōu)選等于或低于大約25kD，甚至更優(yōu)選等于或低于大約20kD，甚至更優(yōu)選等于或低于15kD。
碳水化合物結(jié)合組件盡管專利和科學(xué)文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了許多類型的碳水化合物結(jié)合組件，其中大部分(許多來自于纖維素分解酶)通常被稱為纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)；因此典型的CBM應(yīng)在纖維素酶中出現(xiàn)并優(yōu)先結(jié)合纖維素和/或其多或寡糖片段。
纖維素結(jié)合(及其他碳水化合物結(jié)合)組件是多肽氨基酸序列，其作為大多肽或由兩個或多個多肽氨基酸序列區(qū)域組成的蛋白質(zhì)的完整部分存在，特別是在通常包含催化結(jié)構(gòu)域(含有底物水解活性位點)和碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(用于結(jié)合所述碳水化合物底物)的水解酶中。該酶可包含多于一個催化結(jié)構(gòu)域以及一個、兩個或三個碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且它們可進(jìn)一步包含一個或多個連接碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域的多肽氨基酸序列區(qū)域，后一類型的區(qū)域通常被稱為“連接子”。
在蛋白質(zhì)復(fù)合物(通常是水解酶)中，CBM位于N或C端或中間。單體CBM通常由大于大約30個并小于大約250個氨基酸殘基組成。例如，歸類于家族I的CBM由33-37個氨基酸殘基組成；歸類于家族IIa的CBM由95-108個氨基酸殘基組成；以及歸類于家族VI的CBM由85-92個氨基酸殘基組成。因此，單體CBM的分子量通常位于從大約4kD到大約40kD的范圍內(nèi)，并通常低于大約35kD。
CBM可作為單結(jié)構(gòu)域多肽或作為二聚體、三聚體或多聚體或作為蛋白質(zhì)雜合體的部分使用。
包含碳水化合物結(jié)合組件的水解酶實例為纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、乙酰酯酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、齒斑葡聚糖酶和殼多糖酶。CBM已顯示與碳水化合物(例如纖維素、木聚糖、淀粉、殼多糖、甘露聚糖、β-葡聚糖、齒斑葡聚糖和環(huán)糊精)結(jié)合。CBM已在植物和藻類中發(fā)現(xiàn)，例如在紅藻Porpgyra purpurea中以非水解多糖結(jié)合蛋白的形式(見Tomme等(1996)《Cellulose-Binding Domains，Classification andProperties in Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates》，Saddler & Penner(編)，ACS Symposium Series，No.618)。
洗滌因此本發(fā)明特別涉及除去或漂白纖維織物或紡織品上存在的污物或污質(zhì)的方法，其中織物或紡織品與含有修飾酶(酶雜合體)的水性介質(zhì)接觸，該酶中含有與包含碳水化合物結(jié)合組件(如CBD)的氨基酸序列相連的非纖維素分解酶的催化(酶促)活性氨基酸序列。
污質(zhì)可根據(jù)本發(fā)明除去的污物或污質(zhì)包括上文已經(jīng)提到的那些，即來自于例如淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、紅酒、水果(例如黑醋栗、櫻桃、草莓或番茄，特別是番茄醬或意大利粉醬中的番茄)、蔬菜(例如胡蘿卜或甜菜根)、茶、咖啡、香料(例如咖喱或辣椒)、體液、草或墨水(例如來自圓珠筆或自來水筆)的污物或污質(zhì)。作為根據(jù)本發(fā)明去除或漂白的合適靶的其他類型的污物或污質(zhì)包括皮脂、土壤(即泥土)、粘土、油和涂料。WO 97/28243描述了去除或漂白纖維織物上存在的污物或污質(zhì)的方法。該方法包括將織物與包含修飾的酶的水性介質(zhì)接觸，該酶為與包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列連接的非分解纖維素酶的催化活性氨基酸序列。
本發(fā)明的目的之一為在去除或漂白WO 97/28243中所描述的纖維織物上存在的污物或污質(zhì)的方法中使用SEQ ID NO2的CBM。
纖維織物術(shù)語“纖維織物”旨在指任意類型由含纖維素材料(如棉花)或來自纖維素的材料(由例如木質(zhì)紙漿或棉花制備)制備的織物，特別是針織織物。
本發(fā)明上下文中，術(shù)語“織物”旨在包括衣物或其他類型的加工的織物，并可與術(shù)語“紡織品”互換使用。
由天然存在的纖維質(zhì)纖維制造的纖維織物的實例為棉花、苧麻、黃麻和亞麻(亞麻線)纖維。由人造的纖維質(zhì)纖維制造的纖維織物實例為纖維膠(人造絲)和lyocell(例如TencelTM)纖維；在本發(fā)明上下文中還涉及所有纖維質(zhì)纖維(例如纖維膠、lyocell、棉花、苧麻、黃麻或亞麻)與其他纖維(例如織物毛發(fā)纖維，如羊毛、羊駝或駱駝毛)或與多聚纖維(如聚脂、聚丙烯酸、聚酰胺或聚乙烯纖維)的摻和物。
摻和的纖維織物具體實例為纖維膠/棉花摻和物、lyocell/棉花摻和物(例如TencelTM/棉花摻和物)、纖維膠/羊毛摻和物、lyocell/羊毛摻和物、棉花/羊毛摻和物、棉花/聚脂摻和物、纖維膠/棉花/聚脂摻和物、羊毛/棉花/聚脂摻和物和亞麻/棉花摻和物。
酶雜合體本發(fā)明專利申請書中涉及的酶分類編號(EC編號)根據(jù)《國際生化與分子生物學(xué)聯(lián)合會命名委員會推薦(1992)》，Academic Press Inc.，1992。
根據(jù)本發(fā)明使用的修飾的酶(酶雜合體)包含與織物或紡織品清潔相關(guān)(特別是在洗滌過程中從織物或紡織品上去除或漂白污物或污質(zhì))的非纖維素分解酶的酶活性氨基酸序列(即除纖維素酶外的酶的酶活性氨基酸序列)。優(yōu)選的酶選自與包含纖維素結(jié)合組件的氨基酸序列融合(連接)的淀粉酶(例如α-淀粉酶，EC 3.2.1.1)、蛋白酶(即肽酶，EC 3.4)、脂肪酶(例如三?；视王ッ福珽C 3.1.1.3)和氧化還原酶(例如過氧化物酶，EC1.11.1，例如分類為EC 1.11.1.7的那些；或酚氧化酶，如漆酶，EC 1.10.3.2，或其他分類為EC 1.10.3的酶)。所述催化活性氨基酸序列可包含或由整個或幾乎整個所述成熟酶全長氨基酸序列組成，或其可由保留幾乎與全長序列相同的酶性質(zhì)的全長序列的部分組成。
所述類型的修飾的酶及其制備和純化的詳細(xì)說明為本領(lǐng)域公知(見例如WO 90/00609、WO 94/24158和WO 95/16782)?？赏ㄟ^將DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，并培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以表達(dá)融合基因來制備它們，所述DNA構(gòu)建體至少包含與編碼目的酶的DNA序列連接(有或沒有連接子)的編碼CBM的DNA片段?？捎稍撏緩将@得的一種相關(guān)(但非僅此)類型的重組產(chǎn)物(酶雜合體，在本領(lǐng)域中通常稱為“融合蛋白”)可由下面的通式之一描述A-CBM-MR-X-BA-X-MR-CBM-B后一式中CBM為至少包含碳水化合物結(jié)合組件本身的氨基酸序列。
MR(中間區(qū)域；連接子)可是鍵，或包含從1到大約100個氨基酸殘基，特別是從2到40個氨基酸殘基(例如從2到15個氨基酸殘基)的連接基團(tuán)。MR通常可另外為非氨基酸連接子。
X為氨基酸序列，其包含上述由編碼目的非纖維素分解酶的DNA序列所編碼的多肽的氨基酸殘基的酶活性序列。
A和B部分為獨立任選的。當(dāng)存在時，A或B部分組成CBM或X部分的末端延長，并通常包含一個或多個氨基酸殘基。
因此，根據(jù)上文，尤其顯然所述類型酶雜合體中的CBM可置于酶雜合體的C端、N端或內(nèi)部。相應(yīng)的，所述類型酶雜合體的X部分可置于酶雜合體的N端、C端或內(nèi)部。
本發(fā)明上下文中的目的酶雜合體包括包含多于一個通常由適當(dāng)長度氨基酸殘基序列組成的CBM(例如兩個或多個CBM彼此直接相連，或通過間隔或連接子序列彼此分離)的酶雜合體。
構(gòu)建所述類型酶雜合體的非常重要的問題在于對蛋白水解降解的穩(wěn)定性。兩個或多個結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)對連接結(jié)構(gòu)域的連接子區(qū)的蛋白水解切割特別敏感。引起該切割的蛋白酶可為例如枯草桿菌蛋白酶，已知其通常顯示廣泛的底物特異性(見例如 等(1992)Biochemistry 316011-6018；Teplyakov等(1992)Protein Engineering 5413-420)。
真核生物中連接子殘基的糖基化是阻止蛋白水解降解的天然途徑之一。另一個是使用環(huán)境蛋白酶次偏好的氨基酸。連接子的長度也影響蛋白酶的趨近性。哪種“溶液”是最佳的取決于酶雜合體將被作用的環(huán)境。構(gòu)建新的酶雜合體分子時，連接子穩(wěn)定性因而成為非常重要的問題。
對制備CBM有用的纖維素酶(纖維素酶基因)適于分離纖維素酶基因的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知的。在本文上下文中，術(shù)語“纖維素酶”和“纖維素分解酶”是指催化纖維素降解為葡萄糖、纖維二糖、丙糖和/或其它細(xì)胞低聚糖的酶。
本文上下文中優(yōu)選的纖維素酶(即包含優(yōu)選的CBM的纖維素酶)為微生物纖維素酶，特別是細(xì)菌或真菌纖維素酶。內(nèi)切葡聚糖酶，特別是內(nèi)-1，4-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)，特別是單組件(重組)內(nèi)-1，4-β-葡聚糖酶為優(yōu)選纖維素酶的種類。
有用的細(xì)菌纖維素酶實例為來自選自假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、梭狀芽胞桿菌(Clostridium)、微孢子門(Microspora)、棲熱袍菌屬(Thermotoga)、Caldocellum和放線菌如鏈霉菌屬(Streptomyces)、高溫單孢菌屬(Termomonospora)和Acidothemus，特別是來自Pseudomonas cellulolyticus、燦爛芽胞桿菌(Bacillus lautus)、糞肥纖維單胞菌、熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)、Microspora bispora、Termomonospora fusca、Termomonospora cellulolyticum和Acidothemus cellulolyticus的細(xì)菌或可由其生產(chǎn)的纖維素酶。
纖維素酶可是酸性的、中性的或堿性的纖維素酶，即分別在酸性、中性或堿性范圍內(nèi)表顯最大纖維素水解活性。
有用的纖維素酶為酸性纖維素酶，優(yōu)選來自選自木霉屬(Trichoderma)、漆斑菌屬(Myrothecium)、曲霉屬(Aspergillus)、Phanaerochaete、脈孢菌(Neurospora)、Neocallimastix和葡萄孢屬(Botrytis)的真菌的真菌酸性纖維素酶。
優(yōu)選有用的纖維素酶來自選自綠色木霉、瑞氏木霉、Trichodermalongibrachiatum、粗糙脈孢菌、Neocallimastix partriciarum、假黑盤菌和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的真菌或可由其產(chǎn)生。
另一有用的纖維素酶為中性或堿性的纖維素酶，優(yōu)選來自選自曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、耙菌屬(Irpex)、鐮孢霉屬(Fusarium)、葡萄穗霉屬(Stachy-botrys)、帚霉屬(Scopulariopsis)、毛殼菌屬(Chaetomium)、疣孢霉屬(Myco-gone)、輪枝孢屬(Verticillium)、漆斑菌屬(Myrothecium)、絲葚霉屬(Papulo-spora)、粘帚霉屬(Gliocladium)、頭孢霉屬(Cephalosporium)、假黑盤菌和產(chǎn)黃頭孢霉屬(Acremonium)的真菌或可由其產(chǎn)生的真菌中性或堿性纖維素酶。
優(yōu)選的堿性纖維素酶來自選自Humicola insolens、尖孢鐮孢、Myce-liopthora thermophila、微紫青霉(Penicillium janthinellum)和頭孢霉屬，優(yōu)選選自Humicola insolens DSM 1800、尖孢鐮孢DSM 2672、Myceliopthorathermophila CBS 117.65和頭孢霉屬RYM-202的真菌或可由其產(chǎn)生。
其他有用的纖維素酶的實例為真菌或細(xì)菌來源的親本纖維素酶的變體，例如可來自真菌腐質(zhì)霉屬、木霉屬或鐮孢菌屬之一的種的菌株的親本纖維素酶變體。
淀粉酶適合作為本發(fā)明上下文中使用類型的酶雜合體主要成分的淀粉酶(例如α或β淀粉酶)包括細(xì)菌或真菌來源的那些。文中包括這些淀粉酶的化學(xué)或遺傳修飾突變體。有關(guān)的α淀粉酶包括例如可從芽孢桿菌種(特別為地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)特定菌株)獲得的α淀粉酶，更詳細(xì)描述于GB 1296839。有關(guān)的市售淀粉酶包括Duramyl、Termamyl、Fungamyl和BAN(均可獲得自Novozymes A/S，Bagsvaerd，丹麥)和RapidaseTM和MaxamylTMP(可獲得自DSM，荷蘭)。
其他有用的淀粉酶為CGTases(環(huán)糊精葡萄糖轉(zhuǎn)位酶，EC 2.4.1.19)，例如可從芽孢桿菌、Thermoanaerobactor或高溫厭氧芽孢桿菌屬(Thermoanaerobacterium)的菌種種獲得的那些。
蛋白水解酶適合作為本發(fā)明上下文中使用類型的酶雜合體合適主要成分的蛋白酶(肽酶)包括動物、植物或微生物來源的那些。優(yōu)選微生物來源的蛋白酶。文中包括這些蛋白酶的化學(xué)或遺傳修飾突變體。蛋白酶可為絲氨酸蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實例為枯草桿菌蛋白酶，特別是來自于芽孢桿菌的那些，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例為胰蛋白酶(例如豬或牛來源)和WO 89/06270中描述的鐮孢霉蛋白酶。
相關(guān)的市售蛋白酶包括Alcalase、Savinase和Esperase(均可獲得自Novozymes A/S，Bagsvaerd，丹麥)、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM和ProperaseTM(可獲得自DSM，荷蘭)、PurafectTM和PurafectTMOXP(可獲得自Genencor International，USA)和OpticleanTM和OptimaseTM(可獲得自Solvay Enzymes)。
脂肪分解酶適合作為本發(fā)明上下文中使用類型的酶雜合體主要成分的脂肪分解酶(脂肪酶)包括細(xì)菌或真菌來源的那些。文中包括這些脂肪酶的化學(xué)或遺傳修飾突變體。
有用的脂肪酶的實例包括Humicola lanuginosa脂肪酶(例如EP 258068和EP 305 216中所述)；米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(例如EP 238 023中所述)；假絲酵母(Candida)脂肪酶，例如南極假絲酵母(C.Antarctica)脂肪酶(例如EP 214 761中所述的南極假絲酵母脂肪酶A或B)；假單胞菌(Pseudomonas)脂肪酶，例如EP 721 981中(例如可獲得自保藏號FERM BP-4772的假單胞菌屬SD705菌株的脂肪酶)、PCT/JP96/00426中、PCT/JP96/00454中(例如P.solanacearum脂肪酶)、EP 571 982中或WO 95/14783中(例如P.mendocina脂肪酶)所述的那些之一、產(chǎn)堿假單胞菌(P.Alcaligenes)或類產(chǎn)堿假單胞菌(P.Pseudoalcaligenes)脂肪酶(例如EP 218 272中所述)、洋蔥假單胞菌(P.Cepacia)脂肪酶(例如EP 331 376中所述)、施氏假單胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(例如GB 1,372,034中所公開的)或熒光假單胞菌(P.Fluorescens)脂肪酶；芽孢桿菌脂肪酶(例如枯草芽孢桿菌脂肪酶(Dartois等(1993)Biochemica et Biophysica Acta1131253-260)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)脂肪酶(JP64/744992)和短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)脂肪酶(WO 91/16422))。
另外，可使用大量克隆到的脂肪酶，包括Yamaguchi等(1991)在Gene10361-67中所述的沙門柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶、白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(Schimada等(1989)J.Biochem.106383-388)，以及多種根霉(Rhizopus)脂肪酶，如R.delemar脂肪酶(Hass等(1991)Gene 109117-113)、R.niveus脂肪酶(Kugimiya等(1992)Biosci.Biotech.Biochem.56716-719)和稻根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶。
其他可能有用的脂肪分解酶類型包括角質(zhì)酶(cutinases)，例如來自WO88/09367中所述門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)的角質(zhì)酶或來自Fusarium solani f.pisi(例如WO 90/09446中所述)的角質(zhì)酶。
合適的市售脂肪酶包括Lipolase和Lipolase Ultra(可獲得自Novozymes A/S)、M1 LipaseTM、LumafastTM和LipomaxTM(可獲得自DSM，荷蘭)和Lipase P″Amano″(可獲得自Amano Pharmaceutical Co.Ltd.)。
氧化還原酶適合作為本發(fā)明上下文中使用的酶雜合體主要成分的氧化還原酶包括過氧化物酶(EC 1.11.1)和氧化酶，例如漆酶(EC 1.10.3.2)和某些相關(guān)的酶。
過氧化物酶過氧化物酶(EC 1.11.1)為作為受體作用于過氧化物(例如過氧化氫)的酶。非常合適的過氧化物酶為分類于EC 1.11.1.7的那些，或來自它們的顯示過氧化物酶活性的任何片段。其合成的或半合成的衍生物(例如含卟啉環(huán)系統(tǒng)，或微過氧化物酶，參見例如US 4,077,768，EP 537381，WO91/05858和WO 92/16634)在本發(fā)明上下文中也可是有用的。
非常合適的過氧化物酶為可從植物或微生物(如真菌或細(xì)菌)獲得的過氧化物酶(植物中如辣根過氧化物酶或大豆過氧化物酶)。在這一方面，一些優(yōu)選的真菌包括屬于Deuteromycotina亞門，Hyphomycetes綱的菌株，例如鐮孢霉、腐質(zhì)霉、木霉屬、漆斑菌、輪枝孢屬、Arthromyces、卡爾黑霉屬(Caldariomyces)、單格孢屬(Ulocladium)、艾氏霉屬(Embellisia)、枝孢屬(Cladosporium)或Dreschlera，特別為尖孢鐮孢(DSM 2672)、Humicola insolens、Trichoderma resii、疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)(IFO 6113)、黃萎輪枝孢(Verticillium alboatrum)、大麗花輪枝孢(Verticillium dahlie)、Arthromyces ramosus(FERM P-7754)、Cal-dariomyces fumago、單格孢(Ulocladium chartarum)、Embellisia alli或Dreschlera halodes。
其他優(yōu)選的真菌包括屬于Basidiomycotina亞門，擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)的菌株，例如鬼傘屬(Coprinus)、Phanerochaete、革蓋菌屬(Coriolus)或栓菌屬(Trametes)，特別為Coprinus cinereus f. microsporus(IFO 8371)、長根鬼傘(Coprinus macrorhizus)、黃孢原毛平革菌(例如NA-12)或毛栓菌(Trametes versicolor)(例如PR428-A)。
其他優(yōu)選的真菌包括屬于接合菌亞門(Zygomycotina)Mycoraceae綱的菌株，例如根霉或毛霉，特別為凍土毛霉(Mucor hiemalis)。
一些優(yōu)選的細(xì)菌包括放線菌目(Actinomycetales)的菌株，例如渾球鏈霉菌(Streptomyces spheroids)(ATTC 23965)、熱紫鏈霉菌(Streptomycesthermoviolaceus)(IFO 12382)或Strepto Verticillium verticillium ssp.Verticillium。
其他優(yōu)選的細(xì)菌包括短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)(ATCC 12905)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、球形紅桿菌(Rhodobactersphaeroides)、Rhodomonas palustri、乳鏈球菌(Streptococcus lactis)、Pseudo-monas purrocinia(ATCC 15958)或螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)(NRRL B-11)。
其他優(yōu)選的細(xì)菌包括屬于粘球菌屬(Myxococcus)的菌株，例如變綠粘球菌屬(M.virescens)。
其他有用的具體過氧化物酶的可能來源見Saunders等(1964)Peroxidase，41-43 London中所列。
過氧化物酶還可為可通過包括在允許過氧化物酶表達(dá)的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)用重組體DNA載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述載體帶有編碼所述過氧化物酶的DNA序列和編碼允許編碼過氧化物酶的DNA序列表達(dá)的功能DNA序列，并從培養(yǎng)物中回收過氧化物酶的方法產(chǎn)生的過氧化物酶。
合適的重組產(chǎn)生的過氧化物酶為來自鬼傘屬(特別是根據(jù)WO92/16634的長根鬼傘或C.cinereus)的過氧化物酶或其變體，例如WO94/12621中所述變體。
氧化酶和相關(guān)的酶本發(fā)明上下文中優(yōu)選的氧化酶為分類于EC 1.10.3的氧化酶，其為使用分子氧作為受體的氧化酶(即催化氧化反應(yīng)的酶，反應(yīng)中分子氧作為氧化劑作用)。
如上所指，漆酶(EC 1.10.3.2)在本發(fā)明上下文中為非常合適的氧化酶。本發(fā)明上下文中其他有用的氧化酶包括兒茶酚氧化酶(EC 1.10.3.1)和膽紅素氧化酶(EC 1.3.3.5)。其他有用的相關(guān)酶包括單酚單氧酶(EC1.14.18.1)。
漆酶可獲得自多種植物和微生物來源，特別是來自細(xì)菌和真菌(包括絲狀真菌和酵母)，并且合適的漆酶實例可見于可獲得自真菌的那些，包括可獲得自來自曲霉、脈孢霉(例如粗糙脈孢菌)、柄孢殼屬(Podospora)、葡萄孢屬、金錢菌屬(Collybia)、層孔菌屬(Fomes)、香菇屬(Lentinus)、側(cè)耳屬(Pleurotus)、栓菌屬(例如長絨毛栓菌(T.villosa)或毛栓菌[一些以多種名稱已知的和/或之前被分類為其他屬的栓菌屬的種/菌株；例如長絨毛栓菌＝T.pinsitus＝Polyporus pinsitis(也被稱為P.pinsitus或P.villosus)＝Coriolus pinsitus]、多孔菌(Polyporus)、絲核菌屬(Rhizoctonia)(例如立枯絲核菌(R.solani))、鬼傘屬(例如褶紋鬼傘(C.plicatilis)或C.cinereus)、小脆柄菇屬(Psatyrella)、毀絲霉屬(例如嗜熱毀絲霉)、Schytalidium、射脈菌屬(Phlebia)(例如射脈菌(P.radita)；見WO 92/01046)、革蓋菌屬(例如C.hirsutus；見JP 2-238885)、梨孢菌屬(Pyricularia)或硬孔菌屬(Rigidoporus)菌株的漆酶。
本發(fā)明上下文中優(yōu)選的漆酶包括可獲得自栓菌屬(例如長絨毛栓菌)，毀絲霉屬(例如嗜熱毀絲霉(M.thermophila))、Schytalidium或多孔菌屬菌種/菌株的漆酶。
其他酶適合作為在本發(fā)明上下文中使用類型的酶雜合體主要成分的其他種類酶包括果膠酶(例如果膠酸裂合酶(EC 4.2.2.2)、果膠裂合酶(EC 4.2.2.10)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂合酶(EC未定義))、內(nèi)-1，4-半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)、木葡聚糖酶(EC未定義)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、arabinanase(EC3.2.1.99)、α-L-阿拉伯呋喃糖酶(EC 3.2.1.55)、甘露聚糖內(nèi)-1，4-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、β-1，3-1，4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖水解酶、外多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶(EC未定義)、纖維素酶(EC 3.2.1.4)、葡聚糖1，3-β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.58)、Licheninase(EC 3.2.1.73)、葡聚糖內(nèi)-1，6-β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.75)、甘露內(nèi)-1，4-β-甘露糖酶(EC 3.2.1.78)、內(nèi)-1，4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、纖維素1，4--纖維二糖糖苷酶(EC 3.2.1.91)、纖維二糖水解酶(EC 3.2.1.91)、多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、乙?；图谆ッ?，例如鼠李糖半乳糖醛酸聚糖甲基酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙?；ッ浮⒐z甲酯酶(EC 3.1.1.11)、果膠乙酰酯酶(EC未定義)、木聚糖甲基酯酶、木聚糖乙?；ッ?EC 3.1.1.72)、阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)、苯乙烯醛基酯酶(EC 3.1.1.73)。
去污劑可向用于洗滌織物的去污劑(例如洗衣房去污劑或用于洗滌硬表面的去污劑，如盤子洗滌劑)中添加本發(fā)明的CBM。包含本發(fā)明CBM的去污劑組合物還可包含一個或多個選自蛋白酶、纖維素酶(內(nèi)切葡聚糖酶)、β-葡聚糖酶、半纖維素酶、脂肪酶、過氧化物酶、漆酶、α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、角質(zhì)酶、果膠酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、木質(zhì)酶、支鏈淀粉酶、果膠酸裂合酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果膠乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、果膠裂合酶、其他甘露糖聚酶、果膠甲酯酶、纖維二糖水解酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的酶或其混合物。
另外，根據(jù)本發(fā)明的去污劑組合物可包含普通的去污劑成分例如如WO 99/27082中所述的表面活性劑、增效劑、漂白劑、抑泡劑。
紡織品處理編織紡織品時，紗線被置于可觀的機(jī)械牽引力下。為了防止斷裂，通常用叫做“漿”的膠狀物質(zhì)將其包被(上漿)。
最普遍的漿紗劑為天然或修飾形式的淀粉。然而漿中也可富含其他多聚體物質(zhì)，如聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯酮(PVP)、聚丙烯酸(PAA)或纖維素衍生物(如羧甲基纖維素(CMC)、羥乙基纖維素、羥丙纖維素或甲基纖維素)。還可以在漿中添加少量脂肪或油作為潤滑劑。
由于漿的存在，織物纖維不能吸收足量的水、織物整理劑或其他組合物(例如漂白劑、染色或防皺組合物)。因此只有在從織物中去除漿后才能均勻和耐久的整理該織物，為該目的去除漿的方法稱為“脫漿”方法。
在漿中含有淀粉的情況下，可以使用降解淀粉的酶(如淀粉酶)進(jìn)行脫漿處理。在漿中含有脂肪和/或油的情況下，脫漿處理可以包括使用脂肪分解酶(脂肪酶)。在漿中含有大量羧甲基纖維素(CMC)或其他纖維素衍生物的情況下，可以用單獨或與其他物質(zhì)組合(任選地與其他酶(如淀粉酶和/或脂肪酶)組合)使用纖維素酶進(jìn)行脫漿處理。
本發(fā)明的目的之一是通過修飾酶以改進(jìn)酶在脫漿條件下的性能，從而改變(提高)酶對纖維質(zhì)織物的親和力，由此修飾的酶與目的漿紗計更緊密接觸。
因此本發(fā)明尤其涉及脫漿纖維質(zhì)織物或紡織品的方法，其中用含有酶(特別是非纖維素分解酶)的催化(酶)活性氨基酸序列的修飾酶(酶雜合體)處理了織物或紡織品，所述序列與含有碳水化合物結(jié)合組件的氨基酸序列(如SEQ ID NO2的CBM)連接。該方法更詳細(xì)地描述于WO97/28256。
術(shù)語“脫漿”旨在按常規(guī)方式理解，即從織物中去除漿紗劑。
洗滌洗滌過程在漂白和染色織物前從棉纖維中去除非纖維素物質(zhì)，特別是角質(zhì)層(主要由蠟組成)和初生細(xì)胞壁(主要由果膠、蛋白質(zhì)和木葡聚糖組成)。適當(dāng)?shù)南炄コ龑τ诘玫礁呖蓾裥?獲得良好染色的指標(biāo))是必要的。去除初生細(xì)胞壁可改善蠟去除并保證更均勻的染色。另外它在漂白過程中提高白度。
CBM1家族的CBM已知可楔進(jìn)微晶纖維素如擴(kuò)展蛋白和swollenin，并協(xié)助從織物中釋放非纖維素組分或污染物?？梢酝ㄟ^用CBM處理織物提高可染色性。本發(fā)明的CBM具有與CBM1家族的CBM類似的特性。因此，在洗滌過程中可以使用本發(fā)明的CBM從棉纖維中去除非纖維素物質(zhì)。
親和標(biāo)簽與碳水化合物可逆結(jié)合的CBM可用于分離和純化靶多肽。家族I的CBM與微晶纖維素可逆結(jié)合，并且是可用于親和層析的標(biāo)簽。
如Terpe(2003)Appl.Microbiol.Biotechnol.60523-533和US5,670,623所述，通過使用CBM作為親和標(biāo)簽改進(jìn)靶多肽的分離和純化是本發(fā)明的目的之一。
分子的固定一些CBM與纖維素不可逆結(jié)合并可用于固定分子，如金屬硫蛋白、植物螯合肽或酶。這種固定可用于如從環(huán)境中去除重金屬污染物，其中重金屬離子與多肽生物吸附劑(如金屬硫蛋白或植物螯合肽)結(jié)合，并通過將CBM與碳水化合物物質(zhì)結(jié)合不可逆固定CBM-生物吸附劑-重金屬復(fù)合物(Xu et al.(2002)Biomacromolecules 3462-465)。通過作為融合蛋白使用SEQ ID NO2的CBM固定分子(如金屬硫蛋白、植物螯合肽或酶)是本發(fā)明的目的之一。另外，通過用CBM固定，從環(huán)境中去除污染物(如重金屬)的方法是本發(fā)明的目的之一。
CBM綴合物碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的綴合物(如CBD綴合物)含有附著于多糖的至少兩個CBD。多糖可以能夠結(jié)合纖維素并有利地為蝗蟲豆角膠。CBD綴合物能夠如Unilever的GB 2376017中所述通過交聯(lián)纖維來提高纖維素物質(zhì)(如織物)的強(qiáng)度。通過使用SEQ ID NO2的CBM交聯(lián)纖維來提高織物的強(qiáng)度和耐久性是本發(fā)明的目的之一。
CBD綴合物還可以在洗燙過程中的任一階段中作為織物表面沉積材料的遞送載體使用?？梢酝ㄟ^包被有益試劑實現(xiàn)后一應(yīng)用，可以通過化學(xué)方法直接包被或通過與結(jié)合有益試劑的化合物(如Unilever的GB 2376017中所述的膠囊)間接包被。這些有益試劑的實例為軟化劑、織物整理劑、保護(hù)劑、芳香劑(如香料)和漂白劑。
軟化劑的實例為粘土、陽離子型表面活性劑或硅化合物。織物整理劑和保護(hù)劑的實例為多聚體潤滑劑、拒污劑、去污劑(soil release agent)、光保護(hù)劑如遮光劑、抗靜電劑、染料固定劑、抗菌劑和抗真菌劑。芳香劑或香料可以包裹于如乳膠或微粒體或基于明膠的團(tuán)聚體中。使用SEQ ID NO2的CBM作為遞送載體于洗燙過程中在織物上沉積材料是本發(fā)明的目的之一。
焙烤已知在木聚糖酶或淀粉酶或其他焙烤活性酶中加入CBM可能導(dǎo)致在焙烤實驗中比無CBM的酶更好的性能。WO 98/16112中描述了如何將防腐酶(如淀粉分解酶)與CBD融合并用于延緩焙烤面包腐敗和老化。如WO 98/16112中所述將SEQ ID NO2的CBM與淀粉分解酶融合并用其延緩焙烤面包的腐敗和老化是本發(fā)明的目的之一。
使用CBM產(chǎn)生生物乙醇可以從農(nóng)業(yè)廢物或生物質(zhì)(生物燃料)產(chǎn)生乙醇。許多類型生物質(zhì)(例如玉米桿、木漿和麥桿)的可轉(zhuǎn)化為乙醇的組分由大量微晶纖維素組成。由于纖維素原纖維緊密地填充在一起并因而對于纖維素降解酶造成了接近性問題，因此微晶纖維素對酶降解具有天然抗性。大量在生物質(zhì)中打開微晶纖維素結(jié)構(gòu)的方法正處于研究中用蒸汽爆發(fā)的酸預(yù)處理是一個被深入研究的方法(Bura等(2002)Appl Biochem Biotechnol.98-10059-72)。濕氧化法是Naito等(2001)Journal of Chemical Engineering of Japan，34(12)1545-1548描述的另一方法。
有明顯的證據(jù)證明纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以單獨改變微晶纖維素的特性(Shoseyov等(2002)Proceedings of the 223th American Chemical SocietyNational Meeting.Orlando，F(xiàn)lorida，USA)。使用本發(fā)明的CBM破壞見于產(chǎn)生生物燃料的生物質(zhì)中的纖維素原纖維的微晶性質(zhì)以提高纖維素降解酶對生物質(zhì)的可接近性是本發(fā)明的目的之一。
修飾植物細(xì)胞壁通過將編碼CBM(如CBD)的基因引入植物或微生物，可以在微生物或植物組織的細(xì)胞壁內(nèi)表達(dá)CBD蛋白。已經(jīng)顯示CBD蛋白在植物細(xì)胞壁中結(jié)合新合成的纖維素纖維，該物理-機(jī)械干擾通過纖維素合酶酶復(fù)合物的亞單位解偶聯(lián)纖維素合成。這導(dǎo)致提高的纖維素多聚體合成率，提高的多聚體質(zhì)量和增加的生物質(zhì)。細(xì)胞壁內(nèi)提高的纖維素合成率導(dǎo)致增強(qiáng)的纖維素產(chǎn)生、植物水平上更高的生物質(zhì)、改進(jìn)的纖維特性，并可能提高對生物和非生物脅迫的抗性?？梢詫BD編碼基因插入闊葉林物種并可隨后顯示出具有木密度和纖維質(zhì)量改善的顯著體積增加。這些改善將延續(xù)到制成的紙張中，表現(xiàn)出增強(qiáng)的抗拉性、抗撕裂性和耐破度指標(biāo)(US6,184,440)。
如US 6,184,440中所述將編碼CBM的SEQ ID NO1 DNA序列插入植物以改變所述植物的細(xì)胞壁，引起增大的生長和生物質(zhì)、提高的纖維素產(chǎn)生、改善的纖維特性、改善的家畜消化率和提高的產(chǎn)率特性是本發(fā)明的目的之一。
CBM組合物用于上述應(yīng)用時，本發(fā)明的CBM可以是為特定應(yīng)用產(chǎn)生的組合物的部分。這些組合物中的其他組分包括載體化合物和一種或多種選自以下的酶蛋白酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、半纖維素酶、脂肪酶、過氧化物酶、漆酶、α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蠟酶、果膠酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、木質(zhì)酶、支鏈淀粉酶、果膠酸裂合酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果膠乙酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、果膠裂合酶、其他甘露聚糖酶、果膠甲酯酶、纖維二糖水解酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或其混合物。
本發(fā)明CBM的表達(dá)含有核苷酸序列的核酸構(gòu)建體本發(fā)明涉及含有與一個或多個控制序列有效連接的本發(fā)明核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，所述控制序列于合適的宿主細(xì)胞中在與控制序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列表達(dá)。
可以以多種方式操作編碼本發(fā)明CBM的核苷酸序列，以提供CBM的表達(dá)。取決于表達(dá)載體，在插入載體前操作核苷酸序列可能是需要的或必要的。利用重組DNA方法修飾核苷酸序列的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知。
控制序列可以是適當(dāng)?shù)膯幼有蛄?、被用于表達(dá)該核苷酸序列的宿主細(xì)胞所識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導(dǎo)表達(dá)多肽的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動子可以是在選定的宿主細(xì)胞中表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列(包括突變的、截短的和雜合的啟動子)，并可從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因中獲得。
用于指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體(特別是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中)轉(zhuǎn)錄的適合的啟動子實例為，可獲得自大腸桿菌乳糖操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂水解酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽胞桿菌maltogenic淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽胞桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因，和原核β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等(1978)Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 753727-3731)的啟動子以及tac啟動子(DeBoer等(1983)Proceedings of the National Academy of Sciences USA8021-25)。更多的啟動子描述于Scientific American(1980)24274-94中的″Useful proteins from recombinant bacteria″和上文Sambrook等(1989)中。
用于指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體(特別是在真菌宿主細(xì)胞中)轉(zhuǎn)錄的適合的啟動子實例為可獲得自米曲霉TAKA淀粉酶基因、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶基因、黑曲霉酸性穩(wěn)定α-淀粉酶基因、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡萄糖淀粉酶(glaA)基因、米赫根毛霉脂肪酶基因、米曲霉堿性蛋白酶基因、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶基因、和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO 96/00787)基因的啟動子，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶基因啟動子和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶啟動子的雜合體)和它們突變的、截短的和雜合的啟動子。
在酵母宿主中有用的啟動子可獲得自釀酒酵母烯醇酶(ENO-1)基因、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)基因、釀酒酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)基因和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因。其他有用于酵母宿主細(xì)胞的啟動子由Romanos等(1992)Yeast 8423-488描述。
控制序列也可為適合的轉(zhuǎn)錄終止子序列(可被宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列)。終止子序列有效連接于編碼CBM的核苷酸序列的3’末端。本發(fā)明可使用任何在選擇的宿主細(xì)胞中有功能的終止子。絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子可獲得自米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶基因、黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶基因。
酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子可獲得自釀酒酵母烯醇酶基因、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYC1)基因和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因。其他有用的酵母宿主細(xì)胞終止子由上文Romanos等(1992)描述。
控制序列還可為適合的前導(dǎo)序列(對宿主細(xì)胞翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū))。前導(dǎo)序列有效連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’末端。本發(fā)明可使用任何在選擇的宿主細(xì)胞中有功能的前導(dǎo)序列。絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列可獲得自米曲霉TAKA淀粉酶基因和構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因。
適合于酵母宿主細(xì)胞的前導(dǎo)可獲得自釀酒酵母烯醇酶(ENO-1)基因、釀酒酵母3-酸甘油酸酯激酶基因、釀酒酵母α-因子基因和釀酒酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)基因。
控制序列還可是多腺苷酸化序列(有效連接于核苷酸序列3’末端，轉(zhuǎn)錄時被宿主細(xì)胞作為向轉(zhuǎn)錄的mRNA添加多腺苷酸殘基的信號而識別的序列)。本發(fā)明可使用在選擇的宿主細(xì)胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。
絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的多腺苷酸化序列可獲得自米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶基因、尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶基因和黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因。
對酵母宿主細(xì)胞有用的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman(1995)Molecular Cellular Biology 155983-5990描述。
控制序列還可是編碼與多肽氨基端相連并指導(dǎo)編碼的CBM進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑的氨基酸序列的信號肽編碼區(qū)。核苷酸序列的編碼序列5’端可固有地包含天然連接于翻譯讀碼框的信號肽編碼區(qū)，所述讀碼框具有編碼分泌的CBM的編碼區(qū)片段。另外，編碼序列的5’末端可包含對編碼序列而言是外源的信號肽編碼區(qū)。編碼區(qū)天然不包含信號肽編碼區(qū)時需要外源的信號肽編碼區(qū)。另外，外源信號肽編碼區(qū)可替換天然信號肽編碼區(qū)以加強(qiáng)CBM的分泌。然而，本發(fā)明可使用任何指導(dǎo)表達(dá)的CBM進(jìn)入選擇的宿主細(xì)胞分泌途徑的信號肽編碼區(qū)。本發(fā)明CBM的天然信號肽編碼區(qū)為編碼SEQ ID NO2的1到20氨基酸的SEQ ID NO110到69核苷酸。
細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效的信號肽編碼區(qū)為可獲得自芽孢桿菌NCIB11837麥芽糖(maltogenic)淀粉酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶基因、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽胞桿菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)基因和枯草芽孢桿菌prsA基因的信號肽編碼區(qū)。其他信號肽由Simonen和Palva(1993)Microbiological Reviews 57109-137中描述。
絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼區(qū)為可獲得自米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因、米赫根毛霉aspartic蛋白酶基因、Humicola insolens纖維素酶基因、南極假絲酵母脂肪酶基因和Humicola lanuginosa脂肪酶基因的信號肽編碼區(qū)。
對酵母宿主細(xì)胞有用的信號肽可獲得自釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶基因。其他有用的信號肽編碼區(qū)由上文Romanos等(1992)描述。
控制序列還可是編碼位于CBM氨基端氨基酸序列的前肽編碼區(qū)。產(chǎn)生的多肽可被稱為前CBM或前多肽。前多肽通常是非活性的并通過從前多肽催化或自催化切割前肽而轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓幕钚远嚯?。前肽編碼區(qū)可獲得自枯草桿菌酶堿性蛋白酶(aprE)基因、枯草桿菌酶中性蛋白酶(nprT)基因、釀酒酵母α-因子基因、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因和嗜熱毀絲霉漆酶(WO 95/33836)基因。
當(dāng)多肽氨基端同時存在信號肽和前肽區(qū)時，前肽區(qū)位于緊鄰多肽氨基端且信號肽位于緊鄰前肽區(qū)氨基端。
在酵母中，可使用ADH2體系或GAL1體系。在絲狀真菌中，可使用TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡萄糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡萄糖淀粉酶啟動子作為調(diào)節(jié)序列。其他調(diào)節(jié)序列的實例為允許基因擴(kuò)增的那些。在真核體系中，這包括在氨甲喋呤存在時擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因和有重金屬時擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列應(yīng)與調(diào)節(jié)序列有效連接。
包含核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。可連接上述的多種核苷酸和控制序列以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，其可包含一個或多個合宜的限制性酶切位點以允許在該位點插入或替換編碼多肽的核苷酸序列。另外，可通過向適合的表達(dá)載體中插入核苷酸序列或包含該序列的核酸構(gòu)建體來表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列。構(gòu)建表達(dá)載體時，編碼序列置于載體中使得編碼序列與適合的控制表達(dá)的序列有效連接。
重組表達(dá)載體可是可方便地經(jīng)受重組DNA操作并可引起核苷酸序列表達(dá)的任何載體(例如質(zhì)?；虿《?。載體的選擇通?；谳d體與該載體被引入的宿主細(xì)胞之間的相容性。載體可是線性的或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。
載體可為自主復(fù)制載體(即作為其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制的染色體外實體存在的載體)，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。
載體可包含任何確保自身復(fù)制的工具。另外，載體可是導(dǎo)入宿主細(xì)胞中后整合進(jìn)基因組并與其整合進(jìn)的染色體共同復(fù)制的載體。另外，可使用單個載體或質(zhì)?；蚬餐瑢⒁獙?dǎo)入宿主細(xì)胞基因組的總DNA的兩個或多個載體或質(zhì)粒，或可使用轉(zhuǎn)座子。
本發(fā)明載體優(yōu)選包含一個或多個使得轉(zhuǎn)化的細(xì)胞易于選擇的選擇性標(biāo)記物。選擇性標(biāo)記物為其產(chǎn)物提供殺蟲劑或病毒抗性、重金屬抗性、對營養(yǎng)缺陷型原養(yǎng)型等的基因。
細(xì)菌選擇標(biāo)記物為來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或給予抗生素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的標(biāo)記物。適合于酵母宿主細(xì)胞的標(biāo)記物為ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。絲狀真菌宿主細(xì)胞使用的選擇性標(biāo)記物包括(但不限于)amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)、trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)及它們的等價物。曲霉細(xì)胞中優(yōu)選使用的為構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
本發(fā)明的載體優(yōu)選包含允許載體穩(wěn)定整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組或載體在細(xì)胞中不依賴于基因組自主復(fù)制的元件。為了整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴于編碼多肽或任何其他可通過同源或非同源重組將載體穩(wěn)定整合進(jìn)基因組的載體元件的核苷酸序列。另外，載體可包含用于通過同源重組指導(dǎo)整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組的額外的核苷酸序列。額外的核苷酸序列使得載體能夠在染色體上精確的位點整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組。為了提高在精確位點整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選地包含足夠數(shù)量的核苷酸，例如100到1500堿基對，優(yōu)選400到1500堿基對，并最優(yōu)選800到1500堿基對，其與相應(yīng)的靶序列有高度的同源性以加強(qiáng)同源重組的可能性。整合元件可是與宿主細(xì)胞基因組中靶序列同源的任何序列。另外，整合元件可是非編碼或編碼核苷酸序列。另一方面，載體可通過非同源重組被整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組。
為了自主復(fù)制，載體還可包含使載體能夠在所述宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起始區(qū)。細(xì)菌復(fù)制起始區(qū)為質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和允許大腸桿菌中復(fù)制的pACYC184，和pUB110、pE194、pTA1060和允許芽孢桿菌中復(fù)制的pAMB1的復(fù)制起始區(qū)。酵母宿主細(xì)胞中使用的復(fù)制起始區(qū)實例為兩微米復(fù)制起始區(qū)ARS1、ARS4，ARS1和CEN3的組合，以及ARS4和CEN6的組合。復(fù)制起始區(qū)可為使其在宿主細(xì)胞中以溫度敏感的方式發(fā)揮功能的突變復(fù)制起始區(qū)(見例如Ehrlich(1978)Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 751433)。
可向宿主細(xì)胞中插入多于一個拷貝的本發(fā)明核苷酸序列以提高基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。核苷酸序列拷貝數(shù)的提高可通過向宿主細(xì)胞中整合至少一個額外的序列拷貝或通過包含帶有可擴(kuò)增選擇性標(biāo)記物基因的核苷酸序列(其中細(xì)胞包含擴(kuò)大拷貝的選擇性標(biāo)記基因，由此核苷酸序列的額外拷貝可通過在存在適合的選擇劑時培養(yǎng)細(xì)胞來選擇)來獲得。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明重組表達(dá)載體的方法(見例如上文Sambrook等(1989))。
包含核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞，其有利地用于多肽的重組生產(chǎn)。包含本發(fā)明核苷酸序列的載體被導(dǎo)入宿主細(xì)胞使得載體作為染色體整合體或作為前述染色體外自主復(fù)制載體存在。
宿主細(xì)胞可為單細(xì)胞微生物(例如原核生物)或非單細(xì)胞微生物(例如真核生物)。有用的單細(xì)胞細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞(例如革蘭氏陽性菌)，包括(但不限于)芽孢桿菌細(xì)胞，例如嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)；短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、燦爛芽胞桿菌、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)；或鏈霉菌細(xì)胞，例如變鉛青鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，或革蘭氏陰性菌例如大腸桿菌和假單胞菌。在優(yōu)選的實施方案中，細(xì)菌宿主細(xì)胞為遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在另一優(yōu)選的實施方案中，芽孢桿菌細(xì)胞為嗜堿的芽孢桿菌。
可例如通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(見例如Chang和Cohen(1979)MolecularGeneral Genetics 168111-115)、使用感受態(tài)細(xì)胞(見例如Young和Spizizin(1961)Journal of Bacteriology 81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson(1971)Journal of Molecular Biology 56209-221)、電穿孔法(見例如Shigekawa和Dower(1988)Biotechniques 6742-751)或接合(見例如Koehler和Thorne(1987)Journal of Bacteriology 1695771-5778)實現(xiàn)載體向細(xì)菌縮主細(xì)胞的導(dǎo)入。
宿主細(xì)胞可是真核生物(例如哺乳動物、昆蟲、植物)或真菌細(xì)胞。在優(yōu)選的實施方案中，宿主細(xì)胞為真菌細(xì)胞。文中使用“真菌”包括子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、Chytridiomycota和結(jié)合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth等(1995)在Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi，第8版，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等(1995)上文中所引)和所有的有些分裂孢子真菌(Hawksworth等(1995)上文)。
在一更優(yōu)選的實施方案中，真菌宿主細(xì)胞為酵母細(xì)胞。文中使用的“酵母”包括產(chǎn)子囊酵母(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、basidiosporogenous酵母和屬于不完全真菌(芽酵母屬(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類將來可能改變，就本發(fā)明而言，酵母應(yīng)如《Biology and Activities of Yeast》(Skinner、Passmore和Davenport編(1980)Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)中所述被定義。
在一甚至更優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細(xì)胞為假絲酵母(Candida)、漢遜酵母(Hansenula)、克魯維酵母(Kluyveromyces)、畢赤酵母(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或亞羅(Yarrowia)屬細(xì)胞。在最優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細(xì)胞為卡爾酵母(saccharomyces carlsbergensis)、釀酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克魯弗酵母(saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(saccharomyces norbensis)或卵形酵母(saccharomyces oviformis)。在另一最優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細(xì)胞為乳酸克魯維酵母(kluyveromyces lactis)細(xì)胞。在另一最優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細(xì)胞為解脂亞羅(Yarrowia lipolytica)細(xì)胞。
在另一更優(yōu)選的實施方案中，真菌宿主細(xì)胞為絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌亞門和卵菌門(如上文Hawksworth等(1995)定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌以由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其他復(fù)合多糖組成的菌絲壁為特征。營養(yǎng)性生長通過菌絲伸長并且碳代謝專性需氧。相反的，酵母(例如釀酒酵母)的營養(yǎng)生長通過單細(xì)胞葉狀體的出芽并且碳代謝可以為發(fā)酵的。
在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞屬于(但不限于)枝頂孢霉(Acremonium)、曲霉、鐮孢霉、腐質(zhì)霉、毛霉、毀絲霉、脈孢霉、青霉、梭孢殼屬(Thielavia)、Tolypocladium或木霉屬的細(xì)胞。在最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)細(xì)胞。在另一最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀鐮孢(Fusarium culmorum)、禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)、禾赤鐮孢(Fusarium graminum)、異孢鐮孢(Fusarium heterosporium)、合歡木鐮孢(Fusarium negundi)、尖孢鐮孢、多枝鐮孢(Fusarium reticulatum)、玫瑰色鐮孢(Fusarium roseum)、接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)、膚色鐮孢(Fusarium sarcochroum)、擬分枝孢鐮孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色鐮孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum細(xì)胞。在非常最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌親本細(xì)胞為Fusarium venenatum細(xì)胞(Nirenberg sp.nov.，例如CBS 458.93，CBS 127.95，CBS 128.95，CBS 148.95編號下保藏的Fusarium venenatum)。在另一最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫根毛霉(Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Trichoderma harzianum、康寧木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、瑞氏木霉或綠色木霉細(xì)胞。
真菌細(xì)胞可通過包括原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁再生的方法，以本身已知的方式被轉(zhuǎn)化。適合的曲霉宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法描述于EP238023和Yelton等(1984)Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 811470-1474。合適的轉(zhuǎn)化鐮孢霉種的方法由Malardier等(1989)Gene78147-156和WO 96/00787描述?？墒褂肁belson和Simon編《Guide to YeastGenetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology》，卷194182-187，Academic Press，Inc.，New York中Becker和Guarente描述的方法，以及Ito等(1983)Journal of Bacteriology 153163和Hinnen等(1978)Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 751920中描述的方法轉(zhuǎn)化酵母。
制備功能CBM的方法本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明CBM的方法，其包括(a)培養(yǎng)在野生型形式中能夠產(chǎn)生CBM的菌株；(b)回收CBM的菌株。優(yōu)選該菌株為真菌，更優(yōu)選腐質(zhì)霉屬(特別是Humicola insolens)或鬼傘屬(例如灰蓋鬼傘)或梭孢殼屬(例如Thielavia terrestris)或曲霉(例如米曲霉)。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生CBM多肽的方法，該方法包括在過量產(chǎn)生CBM的條件下于營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)用表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的曲霉宿主細(xì)胞，所述表達(dá)盒包含下述有效連接的組件(a)轉(zhuǎn)錄和翻譯起始調(diào)節(jié)區(qū)；(b)編碼CBM多肽的DNA序列；(c)在宿主中有功能轉(zhuǎn)錄和翻譯終止調(diào)節(jié)區(qū)；和(d)用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記物基因，并回收CBM多肽。
在本發(fā)明生產(chǎn)方法中，細(xì)胞在適于使用本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生CBM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，可通過搖瓶培養(yǎng)、在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中在適合的培養(yǎng)基中和允許多肽表達(dá)和/或分離的條件下小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)的、批式、補(bǔ)料分批式或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)在包含碳源和氮源以及無機(jī)鹽的合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，使用本領(lǐng)域已知的方法完成。合適的培養(yǎng)基可購買自供貨商或可根據(jù)發(fā)表的組合物制備(例如在AmericanType Culture Collection產(chǎn)品目錄中)。如果CBM分泌進(jìn)入營養(yǎng)培養(yǎng)基，可直接從培養(yǎng)基中回收CBM。如果CBM不是分泌的，可從細(xì)胞溶解產(chǎn)物中回收。
可使用本領(lǐng)域已知方法和該CBM特異的修飾檢測產(chǎn)生的CBM。這些檢測方法可包括使用特異的抗體或測定與碳水化合物底物(例如Avicel)結(jié)合。
產(chǎn)生的CBM可使用本領(lǐng)域已知方法回收。例如，可從營養(yǎng)培養(yǎng)基中通過傳統(tǒng)方法回收CBM，包括(但不限于)離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明多肽可通過多種本領(lǐng)域已知方法純化，包括(但不限于)層析法(例如粒子交換、親和、疏水、層析聚焦法和大小排阻)、電泳方法(例如制備級等電位焦距法)、差異溶解度法(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或抽提(見例如Protein Purification，Janson and Ryden，eds(1989)VCH Publishers，New York)。
材料和方法測定CBM活性可使用PCR技術(shù)常規(guī)地獲得來自給定生物的編碼CBM的DNA序列，而且基于現(xiàn)有知識可能發(fā)現(xiàn)來自其他生物的同源序列。
設(shè)想通過克隆碳水化合物降解酶(如纖維素酶、木聚糖酶)或其他細(xì)胞壁降解酶并測量與靶碳水化合物的結(jié)合來發(fā)現(xiàn)新的CBM。慣例上假設(shè)如果酶有結(jié)合微晶纖維素產(chǎn)物Avicel活性，則基因的一部分編碼纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在下文描述的標(biāo)準(zhǔn)條件下測試對Avicel的結(jié)合。
可通過在500ml緩沖的填料(slurry)(緩沖液0.1磷酸鈉，pH 7.5)中使用10g Avicel測量纖維素親和力，填料用勺子緩慢攪動并使其在室溫溶脹30分鐘。然后按照每150份Avicel對1份纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的比例添加酶。這在冰上完成，使得于5到10分鐘內(nèi)給予最佳結(jié)合。然后可洗滌Avicel并直接用于SDS-PAGE，以使結(jié)合的蛋白質(zhì)顯影(因為使用SDS和煮沸將釋放結(jié)合的蛋白質(zhì))。另外，將填料裝進(jìn)柱中并洗滌。結(jié)合的蛋白質(zhì)在離子化的水中或高pH緩沖液(如三乙胺(pH 11.2；1％溶液))中洗脫，pH洗脫的蛋白質(zhì)很快調(diào)節(jié)為中性。
普通的分子生物學(xué)方法使用Sambrook等，《Molecular CloningA Laboratory Manual》，ColdSpring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Ausubel等編，《Current Protocols in Molecular Biology》，John Wiley and Sons(1995)；Harwood和Cutting編，《Molecular Biological Methods for Bacillus》，JohnWiley and Sons(1990)中所述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法完成DNA操作和轉(zhuǎn)化。
用于DNA操作的酶根據(jù)供應(yīng)商的說明書使用。
實施例1構(gòu)建由GH61家族酶分泌的來自假黑盤菌的CBM結(jié)構(gòu)域的曲霉表達(dá)載體通過兩種不同的克隆方案產(chǎn)生SEQ ID NO1的表達(dá)構(gòu)建體。第一種方案(A)使用反向PCR刪除從假黑盤菌中獲得的GH61家族酶的酶核。產(chǎn)物的連接產(chǎn)生含有與編碼碳水化合物結(jié)合組件的DNA框內(nèi)融合的GH61酶天然分泌信號。第二種方案(B)為了產(chǎn)生本發(fā)明CBM過表達(dá)重組體，將編碼CBM結(jié)構(gòu)域的DNA克隆進(jìn)包含假絲酵母脂肪酶信號肽的載體中。
A-反向PCR引物NP887U1和NP887D1作為5’磷酸化引物合成。編碼GH61家族酶的全長開放讀碼框(ORF)的質(zhì)粒DNA擴(kuò)增物作為模板使用。使用引物NP887U1和NP887D1，可從保藏菌株CBS 444.97獲得OFR。使用引物A和B的PCR反應(yīng)中使用大約100納克DNA作為模板。
NP887U1(SEQ ID NO3)5′-GACATCGTTGACGGAGAGTCCGTAGACACGA-3′NP887D1(SEQ ID NO4)5′-ACATCCTCCGGCACCTCCAATGACAAGGCCGTCG-3′下面的流程為Stratagene(USA)使用手冊產(chǎn)品目錄號200502中所述Excite PCR誘變的基礎(chǔ)流程。
成分dH2O 32.75μl10X PfuUltra緩沖液 5.0μldNTPs(10mM儲備液)1.25μl
NP887U1(100pMol/μl) 5.0μlNP887D1(100pMol/μl) 5.0μl向反應(yīng)中添1μl PfuUltra(Stratagene，USA)然后將樣品在如下條件置于熱循環(huán)儀中95攝氏度 2分鐘然后是以下20個循環(huán)95攝氏度 2分鐘55攝氏度 30妙72攝氏度 7分鐘取出5μl PCR反應(yīng)物用于瓊脂糖凝膠分析以確認(rèn)預(yù)期大小(約6Kb)條帶的擴(kuò)增。向剩余的45μl中加入40單位Dpnl限制酶。將樣品置于熱循環(huán)儀中并在37攝氏度孵育30分鐘，接著65攝氏度30分鐘。按照生產(chǎn)商的說明書通過GFX柱純化試劑盒(Amersham Biosciences，USA)純化處理過的樣品。
處理過的PCR樣品 9μl10×連接緩沖液 1μl0.5μl New England Biolabs T4DNA連接酶(約200NEB粘末端單位)在17攝氏度過夜進(jìn)行連接然后按照生產(chǎn)商的說明書轉(zhuǎn)化進(jìn)TOP10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化物涂到含有50mg/l青霉素的LB瓊脂上。從長出的數(shù)百個菌落中的11個小量(Qiaspincolumns，Qiagen Ltd.)制備質(zhì)粒并用EcoRI和NotI切割以釋放插入片段。11個質(zhì)粒中的8個具有正確大小(約700bp)的插入片段。對這些含有插入片段的質(zhì)粒的插入片段進(jìn)行測序。使用載體引物PNA2I(5′-GTT TCC AAC TCA ATT TAC CTC-3′SEQ ID NO5)測序菌落。證明沒有因為PCR而在任何一條插入片段序列中引入錯誤。在8個質(zhì)粒中選擇pCBMX-K1從100μl LB青霉素培養(yǎng)的含質(zhì)粒大腸桿菌細(xì)胞中中等規(guī)模JetStar(GENOMED，Germany)制備質(zhì)粒。
SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中分別顯示了PCBMX-K1融合結(jié)構(gòu)的DNA序列和相應(yīng)的氨基酸序列。
將pCBMX-K1構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進(jìn)米曲霉將SEQ ID NO1的DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)米曲霉菌株JAL355(公開于國際專利申請WO 01/98484A1)。于選擇性和非誘導(dǎo)條件下在含有作為碳源的1M蔗糖和10mM硝酸鹽的Cove最小平板(Cove(1966)Biochim.Biophys.Acta 13351-56)上再分離SEQ ID NO1的轉(zhuǎn)化體兩次。為測試SEQ IDNO1的表達(dá)，在含有10ml YPM(2％蛋白胨、1％酵母提取物、2％麥芽糖)的試管中將轉(zhuǎn)化體于30攝氏度下培養(yǎng)3天和4天。如生產(chǎn)商所推薦，將上清液置于NuPage10％Bis-Tris SDS凝膠(Invitrogen，USA)上電泳。即使在誘導(dǎo)表達(dá)SEQ ID NO1的DNA時，所有曲霉分離物也生長良好。
B-使用南極假絲酵母脂肪酶信號肽的CBM的構(gòu)建和表達(dá)重組過表達(dá)本發(fā)明CBM結(jié)構(gòu)域所使用的第二種方法是將CBM結(jié)構(gòu)域克隆進(jìn)特別制備的載體中，所述載體含有必要的曲霉調(diào)節(jié)元件(啟動子、終止子等)和具有來自南極假絲酵母的分泌脂肪酶基因的具有信號切割位點的信號肽。將含有CBM結(jié)構(gòu)域的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)載體，使CBM結(jié)構(gòu)域和信號肽框內(nèi)融合。由于存在提供的分泌信號和切割位點，在米曲霉中表達(dá)該構(gòu)建體應(yīng)引起該酶的高效分泌。所使用的載體pDau109是描述于WO 03/008575的pJAL721的衍生物。
質(zhì)粒pDau109通過將氨芐青霉素抗性基因插入pyrG可選擇標(biāo)記物而區(qū)別于pJaL721。PDau109中的改進(jìn)首先是用通過插入氨芐青霉素抗性基因大腸桿菌β-內(nèi)酰胺酶而被破壞的URA3基因取代了選擇標(biāo)記物大腸桿菌URA3。該特征允許在通常使用的LB氨芐青霉素平板上溫和選擇使用市售且高感受態(tài)菌株的陽性重組大腸桿菌克隆。另外可以使用側(cè)翼的兩個NotI位點完全去除氨芐青霉素抗性基因而恢復(fù)功能性選擇標(biāo)記物URA3。此外，pDau109具有引入在真菌啟動子之后的南極假絲酵母脂肪酶(SWALLLLIPB_CANAR)信號肽(SEQ ID NO9的氨基酸1-57)和切割位點，其中大量方便的克隆位點可用于使提供的編碼區(qū)和南極假絲酵母分泌信號框內(nèi)融合。具體而言，pDau109具有8個可用于插入cDNA的單限制位點(BstXI-FspI-SpeI-NruI-XcmI-HindIII-XhoI)。使用標(biāo)準(zhǔn)方法將pJaL724修飾成pDau109。
通過中等規(guī)模Qiagenmidi質(zhì)粒制備試劑盒(Qiagen)從100ml于LB氨芐青霉素中生長的含有質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞中制備Pdau109質(zhì)粒。
產(chǎn)生具有HindIII位點的CBM結(jié)構(gòu)域在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)中使用以下引物，為克隆的目的引入的HindIII限制位點為下劃線部分NP887Dau1(SEQ ID NO6)5′-CCAAAGCTTTTCATCCTCCGGCACCTCCAATG-3′NP887Dau2(SEQ ID NO7)5′-GCGAAGCTTAATCTTACTCCATCTCACCTCCC-3′使用編碼GH61編碼區(qū)的NP887-1質(zhì)粒作為PCR模板。
pNP887DNA(100ng) 1μl10X ProofStart緩沖液 5μldNTP 20mM 0.75μlNP887Dau1(100pMol/μl) 0.5μlNP887Dau2(100pMol/μl) 0.5μlH2O 41.25μlProofStartDNA聚合酶(Qiagen Ltd)1μl將樣品轉(zhuǎn)移到熱循環(huán)儀中并按以下程序運行95攝氏度 5分鐘然后是以下20個循環(huán)94攝氏度 30秒60攝氏度 30秒72攝氏度 1分鐘在瓊脂糖凝膠上檢測5μl PCR反應(yīng)物并觀察到了正確大小(約500bp)的條帶。通過GFX純化方法(Amersham Biosciences)純化剩余的45μl樣品。接著在標(biāo)準(zhǔn)條件(40單位/μg DNA、37攝氏度)下用HindIII限制性切割樣品過夜。再次GFX純化處理過的片段(NP887-CBM)并在進(jìn)一步使用前保存于-20攝氏度。
制備pDau109在標(biāo)準(zhǔn)條件下用HindIII限制性切割pDau109質(zhì)粒DNA 4小時。在反應(yīng)物中加入10單位的蝦堿性磷酸酶并繼續(xù)在37攝氏度額外孵育2小時。然后在65攝氏度熱處理樣品20分鐘以失活酶。GFX純化處理過的質(zhì)粒并在進(jìn)一步使用前保存于-20攝氏度。
連接載體pDau109 HindIII*1μl(約90ng)NP887-CBM PCR frag-HindIII7μlT4 DNA連接酶緩沖液(NEB) 1μlNEB T4 DNA連接酶 0.3μl在16攝氏度下過夜完成連接，然后儲存在-20攝氏度直到使用。
轉(zhuǎn)化在16攝氏度過夜完成連接，然后根據(jù)制造商說明轉(zhuǎn)化進(jìn)TOP10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含有50mg/L氨芐青霉素的LB瓊脂上。從成百個長出的菌落中的12個中小量制備(Qiaspincolumns，QiagenLtd.)質(zhì)粒并用HindIII酶切DNA以釋放插入物。12種質(zhì)粒中的4個具有正確大小的插入(約500bp)。使用載體引物PNA21測序(SEQ ID NO5)含有插入物的質(zhì)粒以確定完整性和插入方向。確定了沒有錯誤被引入任一PCR產(chǎn)生的插入序列中。發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pCBMX-S1沒有錯誤并且是正確方向，因此被選擇用于從100μl在氨芐青霉素LB中生長的含質(zhì)粒大腸桿菌細(xì)胞的培養(yǎng)基規(guī)模Qiagenmidi質(zhì)粒制備(Qiagen)。融合構(gòu)建體pCBMX-S1的DNA序列和相應(yīng)的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO8和SEQ ID NO9。
構(gòu)建體pCBMX-S1向米曲霉的轉(zhuǎn)化將融合構(gòu)建體pCBMX-S1(SEQ ID NO8)轉(zhuǎn)化入米曲霉菌株BECh2，其如WO 00/39322所述構(gòu)建(BECh2來自米曲霉菌株JaL228，該菌株如WO 98/12300所述在保存菌株米曲霉IFO 4177基礎(chǔ)上構(gòu)建)。
轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基AMDS培養(yǎng)基瓊脂糖20gCove鹽20ml(Cove(1966)上文)蔗糖 342gdH2O 補(bǔ)足100ml121攝氏度高壓滅菌20分鐘，冷卻后添加1M 乙酰唑胺 10ml1M CsCl 15ml用于再分離轉(zhuǎn)化株的AMDS培養(yǎng)基與上文相同但不添加CsCl并且每1000ml培養(yǎng)基中添加100μl triton-X100。
在含有1M蔗糖作為碳源和10mM硝酸鹽的Cove蔗糖培養(yǎng)基(Cove(1966)Biochim.Biophys.Acta 13351-56)上再分離pCBMX-S1轉(zhuǎn)化株兩次。為測試含有南極假絲酵母脂肪酶(SWALLLIPB_CANAR)信號序列和本發(fā)明的假黑盤菌CBM多肽(SEQ ID NO8)的融合構(gòu)建體pCBMX-S1的表達(dá)，在含有10ml YPG(2％蛋白胨、1％酵母提取物、2％葡萄糖)的試管中將23個轉(zhuǎn)化體于30攝氏度培養(yǎng)3天和4天。如生產(chǎn)商所推薦將上清液置于NuPage10％Bis-Tris SDS凝膠(Invitrogen，USA)上電泳。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(Molecular Probes，USA)使用SYPROOrange凝膠染色。三個分離物在SDS凝膠上顯示出35-45kDa間的彌散條帶。使用多個150ml搖瓶培養(yǎng)基發(fā)酵進(jìn)行進(jìn)一步分析這些。使用帶側(cè)板的1000ml錐形燒瓶和每種150ml的4種不同培養(yǎng)基YPM2％蛋白胨、1％酵母提取物、2％麥芽糖YPG2％蛋白胨、1％酵母提取物、2％葡萄糖DAP2CFor 1升培養(yǎng)基中MgSO4·7H2O(Merck 5886)11g、KH2PO4(Merck 4873)1g、檸檬酸(Merck 244)2g、麥芽糊精(Roquette)、K3PO4·H2O5.2g、酵母提取物(Difco 0127)0.5g，AMG孢子金屬0.5mls(氯化鋅Merck8816，6.8g、硫酸銅Merck 2790，2.5g、氯化鎳Merck 6717，0.24g、硫酸鐵Merck 3965，13.9g、硫酸錳Merck 5941，8.45g、檸檬酸Merck 0244，3g)、PluronicPE 6100(BASF)。
FG4P3％大豆粉(SFK 102-2458)、1.5％麥芽糊精(Roquette)、0.5％Peptone bacto(Difco 0118)、1.5％KH2PO4(Merck 4873)、0.2ml/升PluronicPE 6100(BASF)。
每種使用數(shù)千孢子的重接種物，并在30攝氏度下在定軌搖床上以150RPM振蕩搖瓶。
在誘導(dǎo)表達(dá)本發(fā)明的CBM多肽時，曲霉分離物也生長良好。
實施例2從曲霉中表達(dá)SEQ ID NO8的表達(dá)純化SEQ ID NO9在搖瓶中生長實施例1B中描述的表達(dá)帶有南極假絲酵母脂肪酶信號肽的假黑盤菌CBM(CBMX)的米曲霉菌株。過濾除菌大約1升的液體培養(yǎng)基并將濾出液上樣到含有50g Avicel的柱中。通過用Milli-Q水洗滌去除不結(jié)合或弱結(jié)合的蛋白質(zhì)。用0.1M Tris(pH 11.5)洗脫對Avicel親和的蛋白質(zhì)。洗脫后立即將Avicel結(jié)合級分的pH調(diào)節(jié)至7.5，并使用具有6kDa截斷膜的Amicon單元(cell)(Millipore，USA)濃縮級分。在SDS-PAGE中，結(jié)合Avicel的大部分蛋白質(zhì)顯示分子量35-45kDa的寬譜帶，其遠(yuǎn)高于蛋白質(zhì)碳水化合物結(jié)合組件部分的分子量。高及不均一的分子量可能是由于蛋白質(zhì)N端部分的O-和N-糖基化的不均一性。35-45kDa帶的N端測序產(chǎn)生唯一的序列SFSSSGT(SEQ ID NO9的位置47-53)表明不存在N端氨基酸序列不均一性。
實施例3純化的CBMX的結(jié)合特異性進(jìn)一步研究了具有Avicel親和力并如實施例2(CBMX)中所述而純化的的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在Eppendorf管中將50μl純化的CBMX與500μl包含不同數(shù)量Avicel(0-100mg/ml)的20mM Tris(pH 7.5)混合。室溫攪動溫育4小時后，離心樣品。轉(zhuǎn)移200μl上清液至微孔板(Costar，UV平板)孔中并在微孔板讀數(shù)器(SpectraMaxPlus，Molecular Devices)上讀出280nm處的吸光度。表1中的結(jié)果指出大部分蛋白質(zhì)與最高濃度Avicel結(jié)合。
表1CBMX與Avicel的結(jié)合。A280微孔板中200μl上清液在280nm處的吸光度減去緩沖液和Avicel的吸光度。

較短孵育時間(15分鐘至1小時)的實驗產(chǎn)生較少的完全結(jié)合。
使用PASC(Phosphoric Acid Swollen Cellulose5g水合的Avicel添加150ml冰預(yù)冷的85正磷酸。1小時冰浴攪拌后，加入500ml冷丙酮。過濾懸浮液并先用丙酮再用水洗滌)進(jìn)行了類似的結(jié)合研究。在Eppendorf管中混合50μl純化的CBMX與500μl包含不同數(shù)量PASC(0-10mg/ml)的20mM Tris(pH 7.5)。樣品在室溫下攪動溫育4小時。離心后，轉(zhuǎn)移200μl上清液至微孔板孔中并讀出280nm處的吸光度。表2中的結(jié)果顯示PASC數(shù)量的提高降低了上清液中CBMX的吸光度數(shù)量，即CBMX對PASC有親和力。
表2CBMX與PASC的結(jié)合。A280微孔板中200μl上清液在280nm處的吸光度減去緩沖液的吸光度。

通過混合100μl CBMX與Avicel(400μl 50mg/ml于20mM Tris，pH7.5)和可溶性碳水化合物(溶解于500μl 20mM Tris，pH 7.5)，在競爭實驗中測定CBMX與許多可溶性碳水化合物的親和力。作為參照，使用不添加CBMX或可溶性碳水化合物的樣品。如果CBMX與可溶性碳水化合物有親和力，則應(yīng)該能夠?qū)BMX保持在溶液中，這可通過與未添加可溶性碳水化合物樣品相比280nm處的吸光度增加來測量。室溫攪動孵育4小時后離心樣品并使用200μl上清液在微孔UV板中讀出280nm處吸光度。
測試的可溶性碳水化合物為大麥B-葡聚糖(Megazyme，低粘度)、地衣多糖(Megazyme，冰島苔蘚)、CMC(羧甲基纖維素7LF，Hercules，USA)、木葡聚糖(Megazyme，淀粉狀蛋白，來自羅晃子種子)、羽扇豆半乳聚糖(Megazyme)和豆角膠(Sigma，G-0753)。
根據(jù)表3中的結(jié)果，可見β-葡聚糖和CMC能夠?qū)缀跛蠧BMX保持在溶液中。豆角膠也保持大部分CBMX在溶液中，而木葡聚糖和半乳聚糖引起大約一半的CBMX在溶液中。地衣多糖的添加不引起溶液中CBMX的任何增長。這些結(jié)果指出CBMX對β-葡聚糖、CMC和豆角膠有親和力，以及某種程度對木葡聚糖和半乳聚糖亦有親和力，而對地衣多糖則沒有可檢測到的親和力。
表3與CBMX、Avicel(20mg/ml)和可溶性碳水化合物的競爭性結(jié)合實驗。碳水化合物濃度與BMX和Avicel溫育時的可溶性碳水化合物的濃度。A280差異添加或不添加CBMX的樣品之間280nm吸光度的差異。

序列表<110>諾和酶股份有限公司<120>真菌碳水化合物結(jié)合組件<130>10499.000-DK<160>9<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>629<212>DNA<213>假黑盤菌<220>
<221>CDS<222>(10)..(531)<400>1gaattcaaa atg gtc aac ttc acc acc ctc ctc ccg gtt ctt gcc gct ctt51Met Val Asn Phe Thr Thr Leu Leu Pro Val Leu Ala Ala Leu1 5 10att gga gct gcc aat gcc cac act cgt gtc tac gga ctc tcc gtc aac 99Ile Gly Ala Ala Asn Ala His Thr Arg Val Tyr Gly Leu Ser Val Asn15 20 25 30gat gtc aca tcc tcc ggc acc tcc aat gac aag gcc gtc gct tct tcc 147Asp Val Thr Ser Ser Gly Thr Ser Asn Asp Lys Ala Val Ala Ser Ser35 40 45agt att gcg gcc gtg gac cct gtg acc agc tcc gtc gta gcc tct gtt 195Ser Ile Ala Ala Val Asp Pro Val Thr Ser Ser Val Val Ala Ser Val50 55 60cag gte cct aac ttc act gcc act gac gtc ccc act ttt act gcc acc 243Gln Val Pro Asn Phe Thr Ala Thr Asp Val Pro Thr Phe Thr Ala Thr65 70 75
gac atc cct act ttc act gct act gat gtt cct atc ttc acc aag aag 291Asp Ile Pro Thr Phe Thr Ala Thr Asp Val Pro Ile Phe Thr Lys Lys80 85 90ccc caa cag ccc tca act tta ttg acc cgc acc cgt acc cat gcc tct 339Pro Gln Gln Pro Ser Thr Leu Leu Thr Arg Thr Arg Thr His Ala Ser95 100 105 110gtt tca ttc gtc gct aag ccc tcc gct ttt att ccc aag cct tcc gcg 387Val Ser Phe Val Ala Lys Pro Ser Ala Phe Ile Pro Lys Pro Ser Ala115 120 125agc aca atc ccg tca aag ccc aag act ccc gaa gag gtt aat aag tgc 435Ser Thr Ile Pro Ser Lys Pro Lys Thr Pro Glu Glu Val Asn Lys Cys130 135 140ctt gac gct gtc aac gcc tgt att aca cag gcc cag agc tcc att gga 483Leu Asp Ala Val Asn Ala Cys Ile Thr Gln Ala Gln Ser Ser Ile Gly145 150 155gga gtt gtc aac ttt gag cct tgc gag agc cag aga gct ctt tgc tat 531Gly Val Val Asn Phe Glu Pro Cys Glu Ser Gln Arg Ala Leu Cys Tyr160 165 170taggaactgc aaagaatctg gggggatggt agcgaggttg agaggtggag gagcggagga591gtaggggagg tgagatggag taagattaag cggccgca629<210>2<211>174<212>PRT<213>假黑盤菌<400>2Met Val Asn Phe Thr Thr Leu Leu Pro Val Leu Ala Ala Leu Ile Gly1 5 10 15Ala Ala Asn Ala His Thr Arg Val Tyr Gly Leu Ser Val Asn Asp Val20 25 30
Thr Ser Ser Gly Thr Ser Asn Asp Lys Ala Val Ala Ser Ser Ser Ile35 40 45Ala Ala Val Asp Pro Val Thr Ser Ser Val Val Ala Ser Val Gln Val50 55 60Pro Asn Phe Thr Ala Thr Asp Val Pro Thr Phe Thr Ala Thr Asp Ile65 70 75 80Pro Thr Phe Thr Ala Thr Asp Val Pro Ile Phe Thr Lys Lys Pro Gln85 90 95Gln Pro Ser Thr Leu Leu Thr Arg Thr Arg Thr His Ala Ser Val Ser100 105 110Phe Val Ala Lys Pro Ser Ala Phe Ile Pro Lys Pro Ser Ala Ser Thr115 120 125Ile Pro Ser Lys Pro Lys Thr Pro Glu Glu Val Asn Lys Cys Leu Asp130 135 140Ala Val Asn Ala Cys Ile Thr Gln Ala Gln Ser Ser Ile Gly Gly Val145 150 155 160Val Asn Phe Glu Pro Cys Glu Ser Gln Arg Ala Leu Cys Tyr165 170<210>3<211>31<212>DNA<213>假黑盤菌<220>
<221>misc_feature Primer NP887U1
<222>(1)..(31)<400>3gacatcgttg acggagagtc cgtagacacg a31<210>4<211>34<212>DNA<213>假黑盤菌<220>
<221>misc_feature Primer NP887D1<222>(1)..(34)<400>4acatcctccg gcacctccaa tgacaaggcc gtcg 34<210>5<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物PNA2I<220>
<221>misc_feature Primer PNA2I<222>(1)..(21)<400>5gtttccaact caatttacct c 21<210>6<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物NP887Dau1
<220>
<221>misc_feature Primer NP887Dau1<222>(1)..(32)<400>6ccaaagcttt tcatcctccg gcacctccaa tg 32<210>7<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物N887Dau2<220>
<221>misc_feature Primer NP887Dau2<222>(1)..(32)<400>7gcgaagctta atcttactcc atctcacctc cc 32<210>8<211>573<212>DNA<213>假黑盤菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(570)<223>假絲酵母脂肪酶信號肽位置1-57、假絲酵母脂肪酶序列位置positions 58-147、假黑盤菌CBM多肽位置148-570。
<400>8atg aag cta ctc tct ctg acc ggt gtg gct ggt gtg ctt gcg act tgc48Met Lys Leu Leu Ser Leu Thr Gly Val Ala Gly Val Leu Ala Thr Cys1 5 10 15
gtt gca gcc act cct ttg gtg aag tgc gca act agt ggc cat tac ggc96Val Ala Ala Thr Pro Leu Val Lys Cys Ala Thr Ser Gly His Tyr Gly20 25 30ctc gcg agg ccg cct cgg ccc caa cga att ctt gga ata tta agc ttt144Leu Ala Arg Pro Pro Arg Pro Gln Arg Ile Leu Gly Ile Leu Ser Phe35 40 45tca tcc tcc ggc acc tcc aat gac aag gcc gtc gct tct tcc agt att192Ser Ser Ser Gly Thr Ser Asn Asp Lys Ala Val Ala Ser Ser Ser Ile50 55 60gcg gcc gtg gac cct gtg acc agc tcc gtc gta gcc tct gtt cag gtc240Ala Ala Val Asp Pro Val Thr Ser Ser Val Val Ala Ser Val Gln Val65 70 75 80cct aac ttc act gcc act gac gtc ccc act ttt act gcc acc gac atc288Pro Asn Phe Thr Ala Thr Asp Val Pro Thr Phe Thr Ala Thr Asp Ile85 90 95cct act ttc act gct act gat gtt cct atc ttc acc aag aag ccc caa336Pro Thr Phe Thr Ala Thr Asp Val Pro Ile Phe Thr Lys Lys Pro Gln100 105 110cag ccc tca act tta ttg acc cgc acc cgt acc cat gcc tct gtt tca384Gln Pro Ser Thr Leu Leu Thr Arg Thr Arg Thr His Ala Ser Val Ser115 120 125ttc gtc gct aag ccc tcc gct ttt att ccc aag cct tcc gcg agc aca432Phe Val Ala Lys Pro Ser Ala Phe Ile Pro Lys Pro Ser Ala Ser Thr130 135 140atc ccg tca aag ccc aag act ccc gaa gag gtt aat aag tgc ctt gac480Ile Pro Ser Lys Pro Lys Thr Pro Glu Glu Val Asn Lys Cys Leu Asp145 150 155 160gct gtc aac gcc tgt att aca cag gcc cag agc tcc att gga gga gtt528Ala Val Asn Ala Cys Ile Thr Gln Ala Gln Ser Ser Ile Gly Gly Val165 170 175gtc aac ttt gag cct tgc gag agc cag aga gct ctt tgc tat tag573Val Asn Phe Glu Pro Cys Glu Ser Gln Arg Ala Leu Cys Tyr180 185 190
<210>9<211>190<212>PRT<213>假黑盤菌<400>9Met Lys Leu Leu Ser Leu Thr Gly Val Ala Gly Val Leu Ala Thr Cys1 5 10 15Val Ala Ala Thr Pro Leu Val Lys Cys Ala Thr Ser Gly His Tyr Gly20 25 30Leu Ala Arg Pro Pro Arg Pro Gln Arg Ile Leu Gly Ile Leu Ser Phe35 40 45Ser Ser Ser Gly Thr Ser Asn Asp Lys Ala Val Ala Ser Ser Ser Ile50 55 60Ala Ala Val Asp Pro Val Thr Ser Ser Val Val Ala Ser Val Gln Val65 70 75 80Pro Asn Phe Thr Ala Thr Asp Val Pro Thr Phe Thr Ala Thr Asp Ile85 90 95Pro Thr Phe Thr Ala Thr Asp Val Pro Ile Phe Thr Lys Lys Pro Gln100 105 110Gln Pro Ser Thr Leu Leu Thr Arg Thr Arg Thr His Ala Ser Val Ser115 120 125Phe Val Ala Lys Pro Ser Ala Phe Ile Pro Lys Pro Ser Ala Ser Thr130 135 140
Ile Pro Ser Lys Pro Lys Thr Pro Glu Glu Val Asn Lys Cys Leu Asp145 150 155 160Ala Val Asn Ala Cys Ile Thr Gln Ala Gln Ser Ser Ile Gly Gly Val165 170 175Val Asn Phe Glu Pro Cys Glu Ser Gln Arg Ala Leu Cys Tyr180 185 190
權(quán)利要求
1.碳水化合物結(jié)合組件，其為(a)由SEQ ID NO1位置109-531的DNA序列或與SEQ ID NO1位置109-531有至少50％同一性的與SEQ ID NO1同源的DNA序列編碼的多肽，或(b)通過在表達(dá)DNA序列的條件下培養(yǎng)包含SEQ ID NO1位置109-531的DNA序列的細(xì)胞產(chǎn)生的多肽，或(c)具有SEQ ID NO2位置34-174氨基酸序列的多肽，或與SEQ IDNO2同源且與SEQ ID NO2位置34-174有至少50％同一性的多肽，或(d)由在低嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1位置109-531DNA序列雜交的DNA序列編碼的多肽，或(e)分離的多核苷酸分子編碼的多肽，該多核苷酸分子與變性的雙鏈DNA探針在低嚴(yán)格條件下雜交，其中探針選自包含SEQ ID NO1位置109-531所示序列的DNA探針，以及包含SEQ ID NO1位置109-531的子序列的DNA探針，該子序列有至少大約300堿基對的長度。
2.權(quán)利要求1中的碳水化合物結(jié)合組件，其由可從假黑盤菌CBS 444.97中獲得的DNA序列編碼。
3.編碼具有碳水化合物結(jié)合組件活性多肽的分離的核苷酸分子，其選自(a)包含SEQ ID NO1中由109核苷酸至531核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)編碼與SEQ ID NO2位置34-174氨基酸序列有大于50％同一性的多肽或其具有碳水化合物結(jié)合組件活性的片段的多核苷酸分子；(c)與(a)或(b)互補(bǔ)的分子；和(d)(a)或(b)的簡并核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的分離的多核苷酸分子，其中多核苷酸為DNA。
5.編碼具有碳水化合物結(jié)合組件活性多肽的分離的多核苷酸分子，該多核苷酸分子與變性的雙鏈DNA探針在低嚴(yán)格條件下雜交，其中探針選自包含SEQ ID NO1位置109-531所示序列的DNA探針，以及包含SEQID NO1位置109-531至少大約300堿基對長度的子序列的DNA探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的分離的多核苷酸分子，其分離自如細(xì)菌的原核生物或如真菌或酵母的真核生物的DNA文庫或在其基礎(chǔ)上產(chǎn)生。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的分離的多核苷酸分子，其分離自假黑盤菌屬菌株的DNA文庫或在其基礎(chǔ)上產(chǎn)生，優(yōu)選的是假黑盤菌CBS 444.97菌株的DNA文庫。
8.多核苷酸構(gòu)建體，其包含根據(jù)權(quán)利要求3-7中任一項的多核苷酸分子。
9.權(quán)利要求8的多核苷酸構(gòu)建體，其包含一個或多個控制序列，這些控制序列例如啟動子、前導(dǎo)序列、多腺苷酸化序列、信號肽、前肽及轉(zhuǎn)錄終止序列。
10.包含有效連接的轉(zhuǎn)錄啟動子、DNA片段和轉(zhuǎn)錄終止子的表達(dá)載體，其中DNA片段選自(a)編碼具有碳水化合物結(jié)合組件活性的多核苷酸分子，其包含SEQ ID NO1從核苷酸109-531所示核苷酸序列；(b)編碼具有碳水化合物結(jié)合組件活性且與SEQ ID NO2位置34-174氨基酸序列同一性大于50％的多肽或其具有碳水化合物結(jié)合組件活性的片段的多核苷酸分子；以及(c)(a)或(b)的簡并核苷酸序列。
11.培養(yǎng)的細(xì)胞，其導(dǎo)入了根據(jù)權(quán)利要求10的表達(dá)載體，其中所述細(xì)胞表達(dá)DNA片段編碼的多肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的細(xì)胞，其為真核細(xì)胞，具體的為真菌細(xì)胞或產(chǎn)生編碼顯示內(nèi)-β-1，4-葡聚糖酶活性的多肽的DNA片段的內(nèi)源細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的細(xì)胞，其中該細(xì)胞屬于曲霉菌株，優(yōu)選米曲霉菌株，優(yōu)選米曲霉BECh2菌株。
14.產(chǎn)生具有碳水化合物結(jié)合組件活性的多肽的方法，其包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求11的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞表達(dá)DNA片段編碼的多肽；并回收該多肽。
15.具有碳水化合物結(jié)合組件活性的分離的多肽，其中該多肽(i)不含有同源雜質(zhì)，并且(ii)由根據(jù)權(quán)利要求14的方法產(chǎn)生。
16.包含根據(jù)權(quán)利要求1、2或15的CBM的組合物。
17.權(quán)利要求16的組合物，還包括一個或多個選自蛋白酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、半纖維素酶、脂肪酶、過氧化物酶、漆酶、α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、角質(zhì)酶、果膠酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、木質(zhì)酶、支鏈淀粉酶、果膠酸裂合酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果膠乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、果膠裂合酶、其他甘露糖聚酶、果膠甲酯酶、纖維二糖水解酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；或其混合物。
18.降解含纖維素生物質(zhì)的方法，其中該生物質(zhì)用有效數(shù)量的根據(jù)權(quán)利要求1-2和15的碳水化合物組件或根據(jù)權(quán)利要求16到17的組合物處理。
19.內(nèi)切葡聚糖酶雜合體，其顯示包含根據(jù)權(quán)利要求1、2或15的CBD和催化結(jié)構(gòu)域的內(nèi)-β-1，4-葡聚糖酶活性。
20.組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1、2或15的碳水化合物結(jié)合組件或權(quán)利要求19的內(nèi)切葡聚糖酶雜合體。
21.根據(jù)權(quán)利要求1、2或15的碳水化合物結(jié)合組件或權(quán)利要求19的內(nèi)切葡聚糖酶雜合體在去污劑組合物中的用途。
22.根據(jù)權(quán)利要求1、2或15中任一項的碳水化合物結(jié)合組件或權(quán)利要求19的內(nèi)切葡聚糖酶雜合體在紡織品染整加工中的用途。
23.根據(jù)權(quán)利要求1、2或15中任一項的碳水化合物結(jié)合組件在多肽純化中的用途。
24.根據(jù)權(quán)利要求1、2或15中任一項的碳水化合物結(jié)合組件用于活性酶固定的用途。
25根據(jù)權(quán)利要求1、2或15中任一項的碳水化合物結(jié)合組件在焙烤中的用途。
26.根據(jù)權(quán)利要求1、2或15中任一項的碳水化合物結(jié)合組件用于制造生物燃料的用途。
27.根據(jù)權(quán)利要求1、2或15中任一項的碳水化合物結(jié)合組件用于修飾植物細(xì)胞壁的用途。
28.根據(jù)權(quán)利要求1、2或15任一項的碳水化合物結(jié)合組件在纖維織物加工中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及屬于CBM新家族的非催化性碳水化合物結(jié)合組件(CBM)。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的CBM附著于糖基水解酶家族61(GH61)多肽并顯示與已知的CBM幾乎沒有同源性，這表示它是CBM新家族的第一個已知成員。本發(fā)明還涉及優(yōu)選對纖維素顯示出親和力的CBM；產(chǎn)生該CBM的方法；以及在紡織品、洗滌劑和纖維素纖維生產(chǎn)工業(yè)中、純化多肽、活性酶固定、焙烤、制造生物燃料、改變植物細(xì)胞壁中使用該CBM的方法。
文檔編號C12N15/62GK1875098SQ200480032596
公開日2006年12月6日 申請日期2004年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月30日
發(fā)明者K·M·施諾爾, L·L·H·克里斯坦森 申請人:諾和酶股份有限公司