專利名稱：分析物注射系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析性電泳系統(tǒng)和方法領(lǐng)域。本發(fā)明包括高分辨率和高靈敏度的等速電泳(ITP)和毛細(xì)管電泳(CE)測(cè)定。
背景技術(shù)：
總的來(lái)說(shuō)，電泳是帶電荷的分子在電場(chǎng)中的移動(dòng)?；陔娪镜姆治龇椒ň哂袕V泛用途，尤其是在蛋白和核酸分析領(lǐng)域。可將含有感興趣帶電分析物分子的樣品置于選擇性介質(zhì)，如大小排阻介質(zhì)、離子交換介質(zhì)或具有pH梯度的介質(zhì)中，在這些介質(zhì)中它們可因差別性遷移而與其它樣品分子高分辨?？蓹z測(cè)分離的分子進(jìn)行鑒定和定量。
毛細(xì)管和微流體級(jí)電泳分離在需要小體積樣品或高通量的分析中尤其常用。例如，可制作含有微米級(jí)加樣通道、分離通道和檢測(cè)通道的塑料或玻璃基材芯片?？赏ㄟ^(guò)機(jī)器人操縱的樣品收集管將樣品從微孔板中轉(zhuǎn)移到加樣通道中。電勢(shì)可引起諸樣品成分通過(guò)分離通道中的選擇性介質(zhì)移動(dòng)，而順序檢測(cè)從分離通道洗脫到檢測(cè)通道中的諸成分。該試驗(yàn)系統(tǒng)的微米級(jí)尺寸可采用微米級(jí)或納米級(jí)樣品體積而提供快速分析。然而，對(duì)于復(fù)雜樣品或稀釋樣品而言，其分辨率或靈敏度可能不夠。
提高毛細(xì)管電泳(CE)方法的分辨率和靈敏度的一種方法是在CE分離之前用等速電泳(ITP)預(yù)分解和預(yù)濃縮樣品。在ITP中，將樣品加到電泳遷移率大于樣品的先行電解質(zhì)(LE)和電泳遷移率小于樣品的拖尾電解質(zhì)(TE)之間的通道中。在電場(chǎng)影響下，感興趣分析物可通過(guò)樣品藥團(tuán)(bolus)遷移，在LE和/或TE溶液的界面上累積。以這種方式，可將感興趣分析物與某些其它樣品成分相分離，并濃縮至較高的檢測(cè)水平。因此，可濃縮樣品并脫鹽，以提供改進(jìn)的注射材料，用于進(jìn)一步以高分辨率進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)的毛細(xì)管電泳分離。例如，在Vreeland等的“通過(guò)堿介導(dǎo)的去堆積進(jìn)行串聯(lián)等速電泳-區(qū)帶電泳提高微流體系統(tǒng)的檢測(cè)靈敏度”(TandemIsotachophoresis-Zone Electrophoresis via Base-Mediated Destacking forIncreased Detection Sensitivity in Microfluidic Systems)，Anal.Chem.(2003)ASAP文章中，用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)進(jìn)一步分解和檢測(cè)經(jīng)ITP濃縮的樣品。在Vreeland文章中，將樣品在電泳遷移率受Tris緩沖液的pH控制的TE和LE之間進(jìn)行ITP。在通過(guò)ITP濃縮分析物的同時(shí)，分離通道陰極端處的水解作用形成羥基離子(-OH)。該羥基離子通過(guò)分離通道遷移最終可中和Tris緩沖液而消除了LE和TE溶液之間的遷移率差異。Tris中和將ITP分離介質(zhì)轉(zhuǎn)變成CZE分離介質(zhì)。然后，由于樣品有效體積減少和ITP試驗(yàn)步驟引起的分析物濃縮，可以比相同樣品的標(biāo)準(zhǔn)CZE方法更高的靈敏度和分辨率來(lái)分離分析物。Vreeland方法受限于相容性樣品的以ITP為基礎(chǔ)的pH，可能由于中和步驟而很耗時(shí)，和由于緩沖液制備或羥基離子產(chǎn)生中的變化而前后不一致。
在ITP與CE相結(jié)合的另一方案中，將電場(chǎng)切換到分離通道進(jìn)行分析物的毛細(xì)管電泳分離之前，感興趣分析物以ITP模式遷移，直到它們達(dá)到與CE分離通道的交界點(diǎn)。例如，在Wainright等的“在微流體裝置中通過(guò)等速電泳預(yù)濃縮樣品”(SamplePre-concentration by Isotachophoresis in Microfluidic Devices)，J.Chromat.A979(2002)第69-80頁(yè)中，在ITP通道中預(yù)濃縮樣品，直到它們到達(dá)與CE通道的交界點(diǎn)。通過(guò)聚焦于該交界點(diǎn)的共聚焦物鏡接受光線的光電倍增管(PMT)用顯微鏡監(jiān)測(cè)該交界點(diǎn)。
可通過(guò)，例如熒光或光吸收來(lái)檢測(cè)進(jìn)入該交界點(diǎn)的分析物，手動(dòng)切換電場(chǎng)將分析物注入CE通道中。然而，問(wèn)題在于手動(dòng)切換可能前后不一致，一些分析物用PMT可能檢測(cè)不到，微米級(jí)的PMT檢測(cè)可能麻煩而昂貴。
如上所述，需要提高毛細(xì)管和微米級(jí)電泳方法的靈敏度、一致性和分辨率。需要可以在電泳模式之間自動(dòng)一致地切換的系統(tǒng)。通過(guò)閱讀以下內(nèi)容將會(huì)明白本發(fā)明提供的這些和其它特征。
發(fā)明概要本發(fā)明提供，例如，基于觸發(fā)電壓將分析物連貫一致地注射入分離介質(zhì)中的系統(tǒng)和方法?？稍谄渫ǖ乐型ㄟ^(guò)等速電泳(ITP)堆積預(yù)處理和濃縮分析物，然后當(dāng)該通道中檢測(cè)到電壓時(shí)，將堆積的分析物施加于分離通道區(qū)段。
本發(fā)明方法可提供具有高靈敏度、速度和分辨率的高度可重復(fù)的分析結(jié)果。該方法可包括，例如，在堆積通道區(qū)段中堆積一種或多種分析物進(jìn)行分析物注射，檢測(cè)該通道中的電勢(shì)，和當(dāng)檢測(cè)到所選電壓時(shí)，通過(guò)沿分離通道區(qū)段施加電場(chǎng)或壓差將堆積的分析物施加到分離通道區(qū)段中。該通道可以是，例如具有構(gòu)成加樣通道區(qū)段、堆積通道區(qū)段和/或分離通道區(qū)段的交叉或共同通道區(qū)段的微米級(jí)通道。
堆積分析物可發(fā)生在堆積通道區(qū)段中，可將感興趣分析物夾在該區(qū)段中所選緩沖液之間，使分析物在ITP期間聚集成濃縮條帶。典型的注入分析物包括例如蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、糖蛋白、離子等。堆積通道區(qū)段可含有遷移率不同的拖尾電解質(zhì)和/或先行電解質(zhì)。例如，在電場(chǎng)影響下先行電解質(zhì)的遷移率可以比拖尾電解質(zhì)或感興趣分析物更快。在許多實(shí)施方式中，拖尾電解質(zhì)和先行電解質(zhì)的pH、粘度、電導(dǎo)率、大小排阻、離子強(qiáng)度、離子組成、溫度和/或可影響電解質(zhì)相對(duì)遷移率的其它參數(shù)可以不同?？烧{(diào)整拖尾電解質(zhì)的遷移率，使其小于分析物，以致在ITP期間分析物累積在拖尾界面上。任選地，可調(diào)整先行電解質(zhì)的遷移率，使其大于一種或多種分析物，以致在ITP分離期間該分析物累積在先行界面上。通過(guò)小幅度調(diào)整拖尾和先行電解質(zhì)的遷移率，可使分析物聚集在先行和拖尾電解質(zhì)之間，而不感興趣樣品成分遷移到堆積通道區(qū)段的其它區(qū)帶。即，可調(diào)整拖尾電解質(zhì)的遷移率，使其大于一種或多種不感興趣樣品成分，或可調(diào)整先行電解質(zhì)的遷移率，使其小于一種或多種不感興趣樣品成分，以使它們不會(huì)與感興趣分析物一起聚集在這兩種電解質(zhì)之間。
當(dāng)分析物注射方法的通道包括分開的堆積和分離通道區(qū)段時(shí)，可通過(guò)把電場(chǎng)從堆積通道區(qū)段切換到分離通道區(qū)段而從堆積通道切換到分離通道區(qū)段，例如，當(dāng)堆積的分析物進(jìn)入堆積和分離通道區(qū)段的交界點(diǎn)時(shí)。例如，將電場(chǎng)施加于分離通道區(qū)段可包括從分離通道區(qū)段中缺少實(shí)質(zhì)電流而堆積通道區(qū)段中有電流，切換到分離通道區(qū)段中有電流而堆積通道區(qū)段中電流切斷?？赏ㄟ^(guò)施加浮動(dòng)電壓以防止電流在該通道區(qū)段流動(dòng)，或僅通過(guò)在該通道區(qū)段中提供高電阻(例如，不允許從該通道區(qū)段輸出任何明顯電流)切斷該通道區(qū)段的電流。任選地，可通過(guò)施加跨分離通道區(qū)段的壓差進(jìn)行切換。
該注射方法中的分離通道區(qū)段可分辨分析物與其它分析物或樣品成分。這種分辨能力可鑒定或定量測(cè)定感興趣分析物。分離通道區(qū)段可具有選擇性條件或分離介質(zhì)，以影響分析物和樣品成分的遷移。例如，分離通道可含有pH梯度、大小選擇性介質(zhì)、離子交換介質(zhì)、提高粘度的介質(zhì)、疏水介質(zhì)等。
可檢測(cè)分離通道區(qū)段中被分辨的分析物，以鑒定和/或定量?？墒箼z測(cè)器集中監(jiān)測(cè)分離通道區(qū)段中的分析物或當(dāng)其從分離通道區(qū)段中洗脫時(shí)檢測(cè)分析物。可通過(guò)監(jiān)測(cè)分析物的相關(guān)參數(shù)，例如電導(dǎo)率、熒光、吸光度、折射指數(shù)等來(lái)檢測(cè)分析物。
例如，可用各種技術(shù)將樣品溶液加樣到這些方法的通道中，以提供足夠的靈敏度和速度。例如，當(dāng)加樣通道不能容納進(jìn)行所需檢測(cè)的足量分析物樣品時(shí)，可連續(xù)多次加樣堆積，然后融合多次堆積物，提供小體積濃度提高的分析物。可通過(guò)以下方法來(lái)堆積兩個(gè)或多個(gè)分析物樣品，例如將第一個(gè)樣品加到加樣通道中；跨樣品施加電場(chǎng)，從而堆積該樣品；將第二個(gè)樣品加到加樣通道中；和跨堆積樣品和第二樣品施加電場(chǎng)以堆積第二樣品，和使這兩個(gè)堆積樣品在拖尾和先行電解質(zhì)之間聚集在一起。在加樣第二樣品之前讓堆積的第一樣品流向加樣通道以清除過(guò)多電解質(zhì)和除空樣品溶液可有助于該多重堆積技術(shù)。濃縮分析物樣品的另一種方法可以是，例如，將分析物樣品加到加樣通道中，該加樣通道的橫截面大于堆積通道區(qū)段的橫截面，以致大體積樣品的分析物不必遠(yuǎn)距離遷移到拖尾或先行電解質(zhì)的界面上累積。
可將遷移率介于其本身遷移率介于拖尾電解質(zhì)和先行電解質(zhì)之間的兩種或多種分析物之間的間隔電解質(zhì)加到樣品和/或堆積的分析物之間，以將樣品分離成兩種或多種感興趣分析物。在一個(gè)實(shí)施方式中，堆積包括在兩個(gè)或多個(gè)分析物樣品區(qū)段之間加入遷移率大于其本身的遷移率大于拖尾電解質(zhì)的至少一種分析物，和小于其本身的遷移率小于先行電解質(zhì)的至少一種其它分析物的一種或多種間隔電解質(zhì)。在另一實(shí)施方式中，兩個(gè)或多個(gè)分析物樣品區(qū)段中的一種或多種是先前堆積的分析物樣品，在多次堆積加樣步驟期間插入該間隔電解質(zhì)。也可在樣品中包括該間隔電解質(zhì)，而不將其注入分析物之間?？烧{(diào)整該間隔電解質(zhì)的遷移率，使其位于兩種或多種分析物遷移率之間，以在ITP中分離分析物?？赏ㄟ^(guò)選擇合適的電解質(zhì)pH、間隔電解質(zhì)組成、間隔電解質(zhì)粘度、間隔電解質(zhì)電導(dǎo)率等來(lái)進(jìn)行這種間隔電解質(zhì)的調(diào)節(jié)。
在一些注射方法中，可聰明地配制電解質(zhì)，以對(duì)注射的分析物進(jìn)行ITP分離。例如，如果要通過(guò)實(shí)驗(yàn)或計(jì)算確定某分析物的pK，可調(diào)整先行和拖尾電解質(zhì)的pH值，使其包括pK，以使擠入先行電解質(zhì)的分析物所帶電荷減少和移動(dòng)性降低，和/或擠入拖尾電解質(zhì)的分析物所帶電荷增多和移動(dòng)性提高。在注射堆積的分析物之前進(jìn)行這種調(diào)整可提高ITP的選擇性和濃縮能力。
可通過(guò)檢測(cè)所選電壓引起堆積的分析物注射入分離通道區(qū)段中?？杀O(jiān)測(cè)該通道中各種位置的電壓，可確定能準(zhǔn)確表明進(jìn)行注射的優(yōu)選時(shí)機(jī)的電壓。例如，檢測(cè)電壓可包括監(jiān)測(cè)維持分離通道區(qū)段零電流(或其它定義的電流)條件所必需的空載電壓。用于觸發(fā)分離啟動(dòng)的典型電壓可包括，例如電壓峰、電壓槽、預(yù)先設(shè)定的電壓、相對(duì)電壓、電壓絕對(duì)量、作為時(shí)間函數(shù)的電壓導(dǎo)數(shù)(例如第一次導(dǎo)數(shù)測(cè)量電壓變化速率和第二次導(dǎo)數(shù)測(cè)量電壓變化速率的變化率)(例如在電壓圖形頂部觀察到的零斜率)、上述任何電壓或上述電壓的任何組合之間的時(shí)間。從ITP轉(zhuǎn)換到注射堆積的分析物到分離通道區(qū)段中可以是在檢測(cè)到該電壓時(shí)沿該通道區(qū)段自動(dòng)施加電場(chǎng)或壓差。
本發(fā)明的用于注射分析物的系統(tǒng)可自動(dòng)注射堆積的分析物，以提供可靠的連貫一致和靈敏的分析。分析物注射系統(tǒng)可包括，例如堆積在通道中的分析物、與通道電接觸和與控制器通信的電壓檢測(cè)器，以使在該電壓檢測(cè)器檢測(cè)到所選電壓時(shí)控制器可啟動(dòng)通道分離區(qū)段中的電流，或沿該通道區(qū)段產(chǎn)生壓差。一般該通道是具有加樣通道區(qū)段、堆積通道區(qū)段和分離通道區(qū)段的微米級(jí)通道。
通常，該系統(tǒng)中的堆積通道區(qū)段的結(jié)構(gòu)適合用拖尾電解質(zhì)(TE)和/或先行電解質(zhì)(LE)進(jìn)行等速電泳。所述電解質(zhì)可具有不同的可調(diào)節(jié)的遷移率。例如，所述電解質(zhì)可具有不同pH值、粘度、電導(dǎo)率、大小排阻截留值、離子強(qiáng)度、離子組合物、溫度、濃度或抗衡離子和協(xié)同離子。堆積在該通道中的分析物可包括分子，如蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、糖蛋白、衍生分子、離子等?？啥ㄖ齐娊赓|(zhì)，以選擇性堆積感興趣分析物同時(shí)排斥其它樣品成分。例如，可配制拖尾電解質(zhì)使其遷移率小于感興趣分析物的遷移率和大于不感興趣樣品成分的遷移率，以使感興趣分析物累積在TE前緣，而不感興趣成分通過(guò)TE離去?？膳渲芁E，使其遷移率大于感興趣分析物的遷移率和小于不感興趣樣品成分的遷移率，以使分析物累積在LE界面上，而不感興趣成分遷移到遠(yuǎn)離LE界面的前緣。
該系統(tǒng)的分離通道區(qū)段可含有能分離堆積在堆積柱中的分析物和不感興趣成分的條件或選擇性介質(zhì)。例如，該分離柱可包含pH梯度，大小選擇性介質(zhì)、離子交換介質(zhì)、疏水介質(zhì)、提高粘度的介質(zhì)等。
所述控制器可接受電壓檢測(cè)器的輸出，以在檢測(cè)到所選電壓時(shí)啟動(dòng)注射。該控制器可以是，例如邏輯設(shè)備或系統(tǒng)操作員。在一些實(shí)施方式中，注射是從堆積通道的ITP電場(chǎng)狀態(tài)切換到施加將堆積的分析物插入分離通道區(qū)段所需的驅(qū)動(dòng)力。例如，在檢測(cè)到電壓時(shí)，注射可以是從ITP電流切換到基本消除堆積通道區(qū)段中的電流，同時(shí)啟動(dòng)分離通道區(qū)段中的電場(chǎng)或電壓。
該系統(tǒng)的各通道區(qū)段可包括與堆積通道區(qū)段流體接觸的加樣通道區(qū)段。可采用各種加樣方案來(lái)滿足具體分析的需要。在一個(gè)實(shí)施方式中，加樣通道區(qū)段的橫截面可大于堆積通道區(qū)段的橫截面，以便在較短時(shí)間內(nèi)在堆積通道區(qū)段中累積較大體積的分析物樣品，即分析物分子通過(guò)大橫截面加樣通道區(qū)段的平均遷移距離比在相同體積的長(zhǎng)加樣通道區(qū)段中的遷移距離短。在加樣的另一方面，在多個(gè)堆積方案中，可在加入第二樣品之前將第一堆積分析物樣品拖回到加樣通道區(qū)段，以提高分析物濃度和試驗(yàn)靈敏度。可通過(guò)，例如，提供跨堆積通道區(qū)段的壓差，使第一堆積樣品返流回加樣通道區(qū)段來(lái)實(shí)現(xiàn)這種“拖回”?？蓮?，例如微流體芯片上的孔，或通過(guò)流體處理系統(tǒng)，如通過(guò)收集管(吸管)接受微陣列的樣品來(lái)填滿加樣通道區(qū)段。
間隔電解質(zhì)可用于此系統(tǒng)，例如，以提高兩種或多種感興趣分析物之間的分辨率。例如，可將遷移率位于兩種或多種分析物遷移率之間的間隔電解質(zhì)引入堆積通道區(qū)段中含有分析物的樣品區(qū)段之間。遷移率比間隔電解質(zhì)慢的分析物被隔開在間隔電解質(zhì)之后，而遷移率更快的分析物被隔開在間隔電解質(zhì)前方。在另一實(shí)施方式中，可將分析物樣品與間隔電解質(zhì)混合，例如，在ITP的瞬時(shí)或穩(wěn)定狀態(tài)條件的影響下被隔開在分離的分析物區(qū)帶中。
本發(fā)明系統(tǒng)可具有與控制器通信的電壓檢測(cè)器，以檢測(cè)通道中的電壓和對(duì)電壓起反應(yīng)。電壓檢測(cè)器可檢測(cè)跨通道諸區(qū)段的兩個(gè)或多個(gè)電接觸點(diǎn)之間的電壓或通道中任何位置接觸點(diǎn)之間的電壓和參比電壓如接地電壓。在該系統(tǒng)的一些實(shí)施方式中，電壓檢測(cè)器在堆積過(guò)程中可監(jiān)測(cè)分離通道區(qū)段中的電壓?？杀O(jiān)測(cè)堆積期間分離通道區(qū)段與堆積通道區(qū)段的交界點(diǎn)或沿分離通道區(qū)段的任何位置上的電壓，例如，當(dāng)分離通道區(qū)段中沒(méi)有實(shí)質(zhì)電流時(shí)，如當(dāng)通過(guò)空載電壓調(diào)節(jié)器向分離通道區(qū)段施加空載電壓時(shí)，此時(shí)沒(méi)有電流從該通道區(qū)段的一端輸出，或此時(shí)該通道區(qū)段的控制開關(guān)處于關(guān)閉位置。
在檢測(cè)到所選電壓時(shí)，控制器可自動(dòng)將該系統(tǒng)從堆積模式切換到分離模式，將堆積的分析物注射入分離通道區(qū)段中。該電壓可以是，例如，電壓峰、選擇電壓、電壓槽、相對(duì)電壓、電壓改變速率等。自動(dòng)切換可以是，例如，電流在該通道區(qū)段中流動(dòng)、跨通道區(qū)段的相對(duì)電壓改變或沿該通道區(qū)段施加的壓差，以誘導(dǎo)堆積的分析物沿分離通道區(qū)段遷移。
可用該系統(tǒng)的分析物檢測(cè)器檢測(cè)分離通道區(qū)段中分離的分析物，以鑒定和/或定量感興趣分析物?？稍O(shè)置分析物檢測(cè)器，以監(jiān)測(cè)分離通道區(qū)段中的分析物，或從分離通道區(qū)段洗脫的分析物。分析物檢測(cè)器可包括熒光計(jì)、分光光度計(jì)、折射計(jì)、電導(dǎo)計(jì)等。
本發(fā)明系統(tǒng)非常適合微流體應(yīng)用?？蓪⒗纾訕油ǖ绤^(qū)段、堆積通道區(qū)段、分離通道區(qū)段、檢測(cè)室等結(jié)合在微流體芯片中。微流體裝置的微米級(jí)尺寸與本發(fā)明的許多系統(tǒng)相容。本領(lǐng)域已知的微流體系統(tǒng)可提供用于實(shí)施本發(fā)明系統(tǒng)的電壓、壓力、液體處理、通訊和檢測(cè)器等。
定義除非本文或說(shuō)明書以下部分有特別定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的涵義。
在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于具體的方法或系統(tǒng)，當(dāng)然它們可以不同。也應(yīng)理解本文所用術(shù)語(yǔ)目的是描述具體實(shí)施方式
，不旨在限制。
本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求中所用術(shù)語(yǔ)，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“這種”包括復(fù)數(shù)涵義，除非該內(nèi)容明確指出其它涵義。因此，例如，提到“一種成分”可包括兩種或多種成分的組合；提到“諸分析物”可包括一種分析物等。
雖然實(shí)施本發(fā)明可采用與本文所述類似的、經(jīng)修飾的或相當(dāng)?shù)脑S多方法和材料，而無(wú)需進(jìn)行額外實(shí)驗(yàn)，但本文描述的是優(yōu)選的材料和方法。在本發(fā)明說(shuō)明書和權(quán)利要求書中，對(duì)以下列出的術(shù)語(yǔ)定義如下。
本文所用術(shù)語(yǔ)“分析物”指由分析物檢測(cè)器檢測(cè)到的樣品成分。本文所用的“感興趣分析物”指需要在某試驗(yàn)中進(jìn)行檢測(cè)和/或定量的分析物。
本文所用術(shù)語(yǔ)“通道”指在本發(fā)明方法和系統(tǒng)中流動(dòng)和/或保留液體的管道。通道可以是例如管、柱、毛細(xì)管、微流體通道等。一個(gè)通道可在該通道的不同部分中包括各種通道區(qū)段例如，該通道的共享部分和/或與該通道其它區(qū)段相交的部分。通道區(qū)段通常是通道的功能部分，例如加樣通道區(qū)段、堆積通道區(qū)段和分離通道區(qū)段。
本發(fā)明中“傾斜通道”可以是引起通道中流動(dòng)的樣品成分傾斜的通道區(qū)段。例如，傾斜通道的內(nèi)表面形狀在樣品流經(jīng)該傾斜通道時(shí)可使樣品產(chǎn)生相對(duì)于該通道軸傾斜走向的條帶或峰。
本文所用術(shù)語(yǔ)“遷移率”指帶電分子，如溶液中的分析物或電解質(zhì)在通道電場(chǎng)影響下的遷移速率。
本文所用術(shù)語(yǔ)“空載電壓”指基本上阻止通道區(qū)段中電流流過(guò)該區(qū)段所需的或在該區(qū)段中建立恒定電流所需的電壓。
本文所用術(shù)語(yǔ)“微米級(jí)”指約1000μm-0.1μm范圍的尺寸。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是等速電泳系統(tǒng)示意圖。
圖2是ITP將某分析物瞬時(shí)濃縮在先行電解質(zhì)界面上的示意圖。
圖3是ITP瞬時(shí)分離感興趣分析物和分析物經(jīng)ITP處在穩(wěn)定并列狀態(tài)的示意圖。
圖4是在ITP期間選擇性去除樣品成分的示意圖。
圖5A-5C是示范性樣品溶液加樣技術(shù)的示意圖。
圖6A-6E是描述多次加載分析物樣品堆積技術(shù)的順序的示意圖。
圖7A-7C是顯示利用橫截面大于堆積通道區(qū)段橫截面的加樣通道區(qū)段提高樣品溶液加載體積的示意圖。
圖8A-8D是檢測(cè)堆積通道區(qū)段接觸點(diǎn)上電壓的示意圖。
圖9A-9D是分析物流經(jīng)傾斜通道時(shí)產(chǎn)生傾斜條帶的示意圖。
圖10A-10D是樣品成分傾斜并分散于ITP傾斜通道中而感興趣分析物條帶維持聚集的示意圖。
圖11A-11C是將堆積的分析物施加于分離通道區(qū)段的示意圖。
圖12A和12B是具有將樣品溶液提供給加樣通道區(qū)段的收集管的微流體芯片示意圖。
圖13A和13B是分析物注射系統(tǒng)示意圖，其中堆積通道區(qū)段與分離通道區(qū)段共享共有的通道。
圖14A-14C是加入了螺旋形和蛇形傾斜通道的分析物注射系統(tǒng)的示意圖。
圖15是通過(guò)轉(zhuǎn)彎使外側(cè)移動(dòng)距離與內(nèi)側(cè)移動(dòng)距離比例增加的傾斜通道的示意圖。
圖16A-16C是傾斜通道示意圖，其傾斜是通過(guò)通道一邊提供的表面移動(dòng)距離比另一邊更大而產(chǎn)生的。
圖17是本發(fā)明另一實(shí)施方式的示范性微流體芯片通道結(jié)構(gòu)示意圖，利用間隔分子進(jìn)行等速電泳和將感興趣成分峰與不需要的成分峰相分開和相分離。
圖18A-D是圖17通道結(jié)構(gòu)的一部分的示意圖，它用于將感興趣成分峰與不需要的成分峰相分離和用于將感興趣成分峰分成分開的成分并檢測(cè)分開的諸成分。
圖19是圖18A-D中所示的通道的另一種結(jié)構(gòu)，用于將感興趣成分峰與不需要的成分峰相分開和相分離，和用于將感興趣成分峰分成分開的成分并檢測(cè)分開的諸成分。
圖20A顯示了DNA-抗體偶聯(lián)物和抗原復(fù)合物利用合適的間隔分子作等速電泳將其互相分離的電壓和光學(xué)特性。圖20B-C是圖20A中所示的DNA抗體偶聯(lián)物峰(圖20B)和抗體復(fù)合物峰(圖20C)的分解圖，顯示出各成分峰的電壓斜率轉(zhuǎn)變發(fā)生在檢測(cè)到優(yōu)化的最大信號(hào)圖形約半秒鐘內(nèi)。
圖21顯示了用于進(jìn)行免疫試驗(yàn)檢測(cè)血清AFP水平時(shí)DNA抗體偶聯(lián)物和抗原復(fù)合物的示范性電壓和光學(xué)特性，顯示至少有三個(gè)可用于引發(fā)等速電泳從堆積相切換到CE分離相的電壓斜率轉(zhuǎn)變。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及將分析物注射入分離通道的方法和系統(tǒng)。分析物樣品的堆積可以較小注射體積較高分析物濃度，改進(jìn)電泳分離的試驗(yàn)靈敏度和分辨率。
在許多情況下，可通過(guò)注射前在傾斜通道中堆積分析物來(lái)提高靈敏度和分離效果。通過(guò)檢測(cè)到電壓而觸發(fā)自動(dòng)注射的時(shí)機(jī)可提高該試驗(yàn)運(yùn)行之間結(jié)果的一致性。
本發(fā)明方法和系統(tǒng)可以高水平的靈敏度和分辨率用于分離、鑒定和/或定量測(cè)定分析物。本發(fā)明分析物可以是，例如，帶電分子如蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、糖蛋白、離子、衍生分子等。
分析物注射方法對(duì)于靈敏的、可重復(fù)的、高分辨率的試驗(yàn)本發(fā)明方法可提供將堆積的分析物注射入分離通道的精確時(shí)機(jī)。本發(fā)明方法通常包括，例如，將樣品加到加樣通道區(qū)段，然后在堆積通道區(qū)段中進(jìn)行等速電泳(ITP)，檢測(cè)能表明堆積的分析物樣品已處于注射位置的電壓，施加電場(chǎng)或壓差以將堆積的分析物樣品施加于分離通道區(qū)段，和檢測(cè)分離的感興趣分析物。ITP可包括分析物通過(guò)傾斜通道遷移?？赏ㄟ^(guò)評(píng)價(jià)檢測(cè)信號(hào)來(lái)確定分析物的存在或量。
堆積感興趣分析物可用等速電泳(ITP)將感興趣分析物堆積與比原始分析物樣品小的體積中。例如，可將樣品藥團(tuán)加到通道中兩種不同緩沖液系統(tǒng)之間，施加電流，產(chǎn)生溶質(zhì)區(qū)帶的穩(wěn)定遷移狀態(tài)，以降低遷移率。在穩(wěn)定狀態(tài)中，這些區(qū)帶可采取相同的濃度以先行電解質(zhì)相同的速度沿通道遷移。或者，可將樣品藥團(tuán)加到某電解質(zhì)附近，以動(dòng)態(tài)(瞬時(shí))狀態(tài)堆積在注射界面，例如，不需要ITP電解質(zhì)之間達(dá)到穩(wěn)態(tài)平衡。
可在，例如，微流體芯片的通道中進(jìn)行堆積，將樣品加到芯片中拖尾電解質(zhì)和先行電解質(zhì)的通道區(qū)域之間。如圖1A所示，可通過(guò)真空孔12和樣品孔13之間的壓差將分析物樣品10加到加樣通道區(qū)段11。當(dāng)施加跨堆積通道區(qū)段14的電場(chǎng)時(shí)，高遷移率(例如，電荷/質(zhì)量比高)的先行電解質(zhì)15、中等遷移率的分析物16和低遷移率的拖尾電解質(zhì)17即攜帶電流，如圖1B所示。隨著ITP進(jìn)行，可建立一種穩(wěn)定狀態(tài)，此時(shí)分析物16的體積降低到帶電分析物16的濃度與先行電解質(zhì)15的濃度相等。在此穩(wěn)定狀態(tài)中，堆積分析物溶液沿堆積通道區(qū)段14遷移，與先行和拖尾電解質(zhì)的速率相同，如圖1C所示，在堆積通道區(qū)段中每單位體積的電解質(zhì)和帶電分析物攜帶相同量的電流。在ITP期間，一些因素，如分析物和電解質(zhì)的電荷密度和不同的瞬時(shí)遷移速率，趨向?qū)⒎治鑫锖碗娊赓|(zhì)聚集在各區(qū)帶中。本發(fā)明的堆積通道區(qū)段可以是任何尺寸，包括尺寸為(寬度或深度)的范圍例如約1000μm-0.1μm，或約100μm-1μm，或約10μm的微米級(jí)通道。
也可以瞬時(shí)狀態(tài)進(jìn)行堆積。如圖2A所示，起初稀釋和分散的分析物分子20可累積在例如先行電解質(zhì)界面21上，如圖2B所示。分析物在界面上的這種濃積可發(fā)生在建立穩(wěn)定狀態(tài)均一的分析物和電解質(zhì)運(yùn)載體濃積之前。任選地，例如，可在ITP開始施加電場(chǎng)期間，在拖尾電解質(zhì)界面22上以瞬時(shí)狀態(tài)累積某分析物。在其它實(shí)施方式或瞬時(shí)ITP中，可在ITP電解質(zhì)界面以外的其它區(qū)帶中濃積分析物。
多種感興趣分析物可以穩(wěn)定狀態(tài)或瞬時(shí)狀態(tài)累積，例如，累積在一種或兩種電解質(zhì)界面上。如圖3A-3C所示，可將含有第一種感興趣分析物31和第二種感興趣分析物32的樣品溶液30加到拖尾電解質(zhì)溶液33和先行電解質(zhì)溶液34之間。當(dāng)?shù)谝环N分析物的遷移率低于第二種分析物但高于拖尾電解質(zhì)時(shí)，第一種分析物在電場(chǎng)存在下可累積在拖尾電解質(zhì)界面上。同時(shí)，在瞬時(shí)狀態(tài)，如圖3B所示，遷移率稍高于第一種分析物的第二種分析物可在樣品藥團(tuán)的另一端沿遷移率較快的先行電解質(zhì)的界面上累積。這種情況可提供機(jī)會(huì)來(lái)分別順序地或平行地將第一種和第二種分析物施加于一個(gè)或多個(gè)分離通道區(qū)段，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣。一旦在ITP中建立了穩(wěn)定狀態(tài)，如圖3C所示，可將帶電的第一種和第二種分析物壓積到狹窄的相鄰條帶中，例如，一起用于在分離通道區(qū)段中分離。
在本發(fā)明方法中，可調(diào)節(jié)拖尾電解質(zhì)和先行電解質(zhì)的遷移率，對(duì)感興趣分析物進(jìn)行選擇性預(yù)濃縮，同時(shí)將該分析物與不感興趣樣品成分相分離。如圖4A所示，可將含有感興趣分析物41、低遷移率的不感興趣樣品成分42和高遷移率的不感興趣樣品成分43的樣品溶液40加到拖尾電解質(zhì)44和先行電解質(zhì)45之間。當(dāng)對(duì)該通道施加電場(chǎng)時(shí)，低遷移率的不感興趣樣品成分42可以落在拖尾電解質(zhì)之后，而高遷移率的不感興趣樣品成分43可以跑在先行電解質(zhì)之前，如圖4B所示。連續(xù)進(jìn)行ITP到穩(wěn)定狀態(tài)可(例如)將該分析物與不感興趣樣品成分相分離，如圖4C所示。從感興趣分析物中去除不感興趣樣品成分可提供改進(jìn)的注射材料，而在分離通道區(qū)段中進(jìn)行分離。在用ITP預(yù)處理樣品以去除不感興趣樣品成分之后，分析施加于分離通道區(qū)段的感興趣分析物時(shí)，優(yōu)點(diǎn)例如有背景干擾降低，因注射體積減少而具有較高分辨率，因基線較佳和重疊峰較少而能更準(zhǔn)確地定量等。
可根據(jù)本領(lǐng)域已知方法定制拖尾電解質(zhì)和先行電解質(zhì)，通過(guò)調(diào)整電解質(zhì)遷移率高度特異地保留和堆積感興趣分析物，同時(shí)去除不感興趣樣品成分。在該方法的一個(gè)實(shí)施方式中，選擇電解質(zhì)的pH，使其包括感興趣分析物的pK，以使pK在該范圍之外的不感興趣樣品成分在ITP中被去除。例如，可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或根據(jù)分析物的已知分子結(jié)構(gòu)來(lái)確定感興趣分析物的pK。在其它實(shí)施方式中，可使感興趣分析物緊密地?cái)D在所選的已知遷移率低于和高于該分析物的拖尾和先行電解質(zhì)組合物之間。電解液中可采用許多離子和緩沖劑來(lái)溶解分析物，例如氯化物、TAPS、MOPS和HEPES。任選地，可通過(guò)調(diào)整樣品溶液、拖尾電解質(zhì)溶液和/或先行電解質(zhì)溶液的粘度或大小排阻特征來(lái)調(diào)節(jié)電解質(zhì)和/或分析物的遷移率。調(diào)整ITP溶液的遷移率、分析物溶液和/或電解質(zhì)溶液的遷移率的另一種選擇可以是，通過(guò)在瞬時(shí)ITP遷移期間調(diào)整這些溶液的濃度、離子強(qiáng)度或電導(dǎo)率。在其它選擇中，可通過(guò)選擇溶液的溫度來(lái)調(diào)整分析物、電解質(zhì)或ITP溶液的遷移率。
各種樣品溶液加樣方法可用于本發(fā)明方法中的分析得益。堆積通道可一次加入樣品溶液、多次加入樣品溶液和在樣品溶液加樣之間加入間隔電解質(zhì)，如以下所詳述那樣。
可根據(jù)本領(lǐng)域已知技術(shù)將一加樣樣品加到樣品加樣通道區(qū)段，如圖5A-5C所示?？蓪悠啡芤?0施加于加樣通道區(qū)段51，例如利用電滲流(EOF)或壓差使樣品溶液從樣品孔52流經(jīng)加樣通道區(qū)段，出來(lái)后流過(guò)廢液通道53交叉口，再沿加樣通道區(qū)段分流，如圖5A所示?；蛘?，在樣品孔52和廢液孔54之間的壓差的作用下，可將樣品溶液50加到分支處進(jìn)入加樣通道區(qū)段51，如圖5B所示。在圖5A和5B中，必須調(diào)整無(wú)電流的其它孔的電壓來(lái)保證零電流。在另一加樣方式中，廢液孔54上的相對(duì)真空可以將樣品溶液50、拖尾電解質(zhì)和先行電解質(zhì)拖成“收聚”流，如圖5C所示，用于精確和一致地測(cè)定樣品體積。
可用多種堆積技術(shù)加入額外量的樣品溶液進(jìn)行ITP?？蓪⒌谝环N樣品加到加樣通道區(qū)段60中，如圖6A所示。可施加跨堆積通道區(qū)段61的電場(chǎng)來(lái)堆積分析物樣品62，如圖6B所示。堆積的分析物樣品62可回流到加樣通道區(qū)段，將樣品溶液63再加到第一堆積分析物的附近，如圖6C所示?？煽缍逊e通道區(qū)段施加電場(chǎng)以第二次堆積第二種分析物樣品64，如圖6D所示。在第二次堆積期間開始時(shí)，可存在基本上由拖尾緩沖液組成的分離區(qū)帶65，但其在電場(chǎng)中可分散成為落在第二次堆積分析物之后的拖尾電解質(zhì)。最終，在電場(chǎng)影響下可使第一次和第二次堆積的分析物混合，形成多層堆積物66，它的量?jī)杀队诘谝淮味逊e的分析物，如圖6E所示。再增加數(shù)輪堆積物拖回、加樣和堆積可進(jìn)一步提高多次堆積物中分析物的量。任選地，可將大體積的樣品溶液加到橫截面大于堆積通道區(qū)段橫截面的加樣通道區(qū)段中。如圖7A所示，例如，可利用跨樣品孔72和廢液孔73的壓差將樣品溶液70加到大橫截面的加樣通道區(qū)段71中。在電場(chǎng)影響下，分析物樣品74可濃積在堆積通道區(qū)段入口附近，如圖7B所示。具有更大橫截面的加樣通道區(qū)段可在較短時(shí)間中濃縮分析物，這是因?yàn)榕c體積類似而橫截面較小的加樣通道區(qū)段相比，分析物移動(dòng)的軸向距離75減少?？蓪⑼衔搽娊赓|(zhì)76任選地加入相鄰于濃縮的分析物樣品74的位置，以通過(guò)提供壓差用拖尾電解質(zhì)來(lái)沖洗加樣通道區(qū)段進(jìn)行后續(xù)ITP，如圖7C所示。
本發(fā)明方法可通過(guò)將間隔電解質(zhì)置于ITP的分析物樣品段之間而具有優(yōu)點(diǎn)。間隔電解質(zhì)的遷移率可介于拖尾電解質(zhì)和先行電解質(zhì)之間。間隔電解質(zhì)的遷移率可介于兩種或多種感興趣分析物之間。間隔電解質(zhì)可提高多種感興趣分析物之間的分辨率。在一個(gè)實(shí)施方式中，間隔電解質(zhì)可存在于加入的樣品溶液中，以在施加電場(chǎng)時(shí)提供分析物之間的間隔區(qū)帶。在另一實(shí)施方式中，可在多輪堆積之間加入間隔電解質(zhì)。例如，可如上所述，但利用遺留的最初堆積中存在的間隔電解質(zhì)，利用一種或多種加樣樣品溶液區(qū)段中存在的間隔電解質(zhì)，或通過(guò)在樣品溶液區(qū)段各輪加樣之間加入間隔電解質(zhì)，來(lái)進(jìn)行多次堆積?？扇缟纤稣{(diào)整間隔電解質(zhì)，以調(diào)整拖尾和先行電解質(zhì)的遷移率，確定感興趣分析物之間的遷移間隔。
檢測(cè)電壓檢測(cè)與溶液、分析物和/或電解質(zhì)在堆積通道區(qū)段中遷移相關(guān)的電壓，可提供，例如，將堆積的分析物施加到分離通道區(qū)段相一致的啟動(dòng)信號(hào)。在ITP期間，跨堆積通道區(qū)段的電壓或沿堆積通道區(qū)段上任何點(diǎn)上可測(cè)量的電壓可隨時(shí)間變化。從一次ITP運(yùn)作到下一次運(yùn)作，各運(yùn)作之間可能有相一致的可檢測(cè)電壓，其作用可以是用于連貫一致地觸發(fā)注射和從ITP轉(zhuǎn)換到不同分離方案的計(jì)時(shí)標(biāo)記。
在檢測(cè)電壓的典型實(shí)施方式中，進(jìn)行ITP期間拖尾電解質(zhì)、分析物和先行電解質(zhì)在堆積通道區(qū)段中流動(dòng)。拖尾電解質(zhì)對(duì)電流的阻抗比先行電解質(zhì)高。例如，用伏特計(jì)監(jiān)測(cè)沿堆積通道區(qū)段半途某點(diǎn)的電壓，如圖8所示，可檢測(cè)隨著ITP進(jìn)行時(shí)的電壓。隨著開始加樣時(shí)施加于堆積柱入口的樣品溶液80(的流動(dòng))，先行電解質(zhì)81填滿了堆積通道區(qū)段，在沿該通道區(qū)段半途的接觸點(diǎn)82上檢測(cè)到的電壓約為ITP電場(chǎng)電壓的一半。隨著分析物和拖尾電解質(zhì)83從堆積通道區(qū)段遷移下來(lái)，堆積通道區(qū)段的入口側(cè)電阻增加，導(dǎo)致在伏特計(jì)接觸上可檢測(cè)的電壓升高，如圖8B所示。約在堆積分析物抵達(dá)伏特計(jì)接觸點(diǎn)時(shí)，隨著檢測(cè)電壓(的升高)，接觸點(diǎn)兩側(cè)的電阻差達(dá)到最大值，如圖8C所示。最后，隨著分析物接近堆積通道區(qū)段末端，該區(qū)段基本上充滿了拖尾電解質(zhì)，使接觸點(diǎn)兩側(cè)的電阻相等，檢測(cè)到的電壓回復(fù)到約為ITP電場(chǎng)電壓的一半，如圖8D所示。在這個(gè)例子中，電壓的檢測(cè)可包括起始電壓值、電壓開始升高、電壓升高或降低的變化速率(斜率、凹度等)、最大電壓(電壓峰值)、在最大電壓處觀察到斜率為零、返回到起始電壓、任何預(yù)定的電壓、該通道區(qū)段中各位置之間的相對(duì)電壓、上述電壓之一的兩種或多種(變化)之間的時(shí)間等。例如，可利用接觸沿堆積通道區(qū)段上不同點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)伏特計(jì)觀察連貫一致但有所不同的電壓變化圖。可選擇這些連貫一致的可檢測(cè)電壓來(lái)觸發(fā)各通道區(qū)段中電流或壓差的轉(zhuǎn)換，而將堆積的分析物施加于分離通道區(qū)段。
如果分離通道不是整個(gè)電路的一部分(例如，沒(méi)有接地連接的“死路”)或如果將空載電壓施加于分離通道區(qū)段，與堆積通道區(qū)段電接觸的分離通道區(qū)段將沒(méi)有任何實(shí)質(zhì)性電流。在檢測(cè)電壓的優(yōu)選結(jié)構(gòu)中，伏特計(jì)接觸點(diǎn)可位于分離通道區(qū)段和堆積通道區(qū)段之間的某點(diǎn)上，或位于沿分離通道區(qū)段的任何位置上。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，可通過(guò)監(jiān)測(cè)分離通道區(qū)段空載電壓來(lái)檢測(cè)電壓。
提高傾斜通道的分離效果可在分析物通過(guò)傾斜通道區(qū)段期間和/或之后使其堆積來(lái)提高感興趣分析物與其它樣品成分的分離。例如，在等速電泳方法中當(dāng)不感興趣樣品成分經(jīng)數(shù)輪(電泳)變得分散而感興趣分析物繼續(xù)被電解質(zhì)聚集時(shí)，可提高試驗(yàn)的靈敏度。
當(dāng)通道從直線路徑分叉時(shí)，在分析系統(tǒng)通道中流動(dòng)的分析物條帶可能變得分散。如圖9A-9D所示，在轉(zhuǎn)彎91內(nèi)側(cè)流動(dòng)的分析物90移動(dòng)距離比在轉(zhuǎn)彎外側(cè)流動(dòng)的分析物短。開始時(shí)緊密的條帶沿該通道的較長(zhǎng)側(cè)變?yōu)閮A斜和分散的條帶，如圖9C所示。傾斜條帶的軸向擴(kuò)散可稀釋該條帶，并阻止條帶的重排，如圖9D所示。傾斜和擴(kuò)散后，圖9A中聚焦于該條帶的檢測(cè)器所檢測(cè)的條帶最大信號(hào)比圖9D中聚焦于該條帶的檢測(cè)器所檢測(cè)的更強(qiáng)更窄。在許多色譜分析中，因?yàn)樗a(chǎn)生的峰加寬和變短，這種條帶分散可能是成問(wèn)題的。然而，本發(fā)明可聯(lián)用ITP技術(shù)和有意加強(qiáng)的傾斜，通過(guò)堆積感興趣分析物同時(shí)分散不感興趣樣品成分來(lái)提高分離效果。
例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，可采用靈敏度提高的和改進(jìn)的定量方法將小量的感興趣分析物與較大量的不感興趣樣品成分相分離。在沒(méi)有傾斜通道的ITP系統(tǒng)中，例如圖10A示意圖所示，小量堆積的感興趣分析物100可在例如選擇的拖尾和先行電解質(zhì)之間遷移，而較大量的遷移率類似于拖尾電解質(zhì)的不感興趣樣品成分101，在拖尾電解質(zhì)前緣附近遷移。聚焦于該通道的檢測(cè)器102不能分辨分析物與不感興趣樣品成分峰，如檢測(cè)器輸出信號(hào)表103中所示。可通過(guò)例如將多個(gè)傾斜通道區(qū)段之一引入堆積通道來(lái)提高此分析的靈敏度和定量能力。在堆積通道中遷移的分析物100和樣品成分101(圖10B)可變得傾斜，并分散于傾斜通道104中(圖10C)。退出傾斜通道一段時(shí)間后，先行和拖尾電解質(zhì)的堆積力可使該通道中的分析物峰聚集并重排，而無(wú)引導(dǎo)的樣品成分峰維持傾斜，并變得彌散。聚焦于該通道的檢測(cè)器可從樣品成分背景的減弱和侵入減少來(lái)檢測(cè)分析物的存在和量。
可通過(guò)選擇拖尾和/或先行電解質(zhì)來(lái)提高分析物的堆積聚集，同時(shí)提高電解質(zhì)和樣品成分之間的遷移率差別來(lái)提高傾斜通道中ITP分離的效果。在選擇性ITP中，選擇先行和拖尾電解質(zhì)的遷移率使其接近某分析物的已知遷移率和/或提高這兩種電解質(zhì)與一種或多種不感興趣樣品成分之間的遷移率差別。例如，在上述情況下，在感興趣分析物的遷移率大于不感興趣樣品成分時(shí)，可選擇遷移率不同于(不感興趣的)樣品成分但更接近于分析物的拖尾電解質(zhì)，從而分析物受到緊密引導(dǎo)同時(shí)不感興趣樣品成分落在后面而經(jīng)歷傾斜和彌散作用。如果感興趣分析物的遷移率低于不感興趣樣品成分，可以相似方式選擇遷移率處于分析物和不感興趣樣品成分之間的先行電解質(zhì)，以提高傾斜通道的ITP分離效果。在優(yōu)選實(shí)施方式中，選擇遷移率處于感興趣分析物和一種或多種不感興趣樣品成分之間，但更接近于分析物的電解質(zhì)。在另一實(shí)施方式中，可選擇遷移率接近感興趣分析物的已知遷移率的先行和拖尾電解質(zhì)。當(dāng)較快和較慢樣品成分遷移到該分析物附近和/或在ITP期間當(dāng)瞬時(shí)堆積奏效時(shí)，這種方法可提供特別效益。
傾斜通道ITP的有效性可因各種因素而發(fā)生很大變化，這些因素例如有通道涉及的轉(zhuǎn)彎半徑、通道的內(nèi)徑、通道壁的形狀、傾斜通道的橫截面、溶液的流動(dòng)速度和粘度。例如以下章節(jié)“傾斜通道ITP系統(tǒng)”中所述，可利用短轉(zhuǎn)彎半徑、在同一方向上重復(fù)轉(zhuǎn)彎、提高相對(duì)通道壁表面長(zhǎng)度之間差異和垂直于轉(zhuǎn)彎軸線的更寬的通道橫截面的通道形狀來(lái)提高通道的傾斜度。例如，可通過(guò)計(jì)算和/或?qū)嶒?yàn)產(chǎn)生適合于具體方法或系統(tǒng)的條件。
為了考慮擴(kuò)散如何影響轉(zhuǎn)彎所引起的傾斜量，可考慮二維度、非維度化的平流-擴(kuò)散方程(也參見《分析化學(xué)》(Analytical Chemistry)，第73卷，第6期，1350-1360，2001年3月15日) 其中，L是轉(zhuǎn)彎通道的長(zhǎng)度，w是轉(zhuǎn)彎通道的內(nèi)部寬度，Pe’w是分散的佩克萊數(shù)；u’、c’、t’、x’和y’分別是標(biāo)準(zhǔn)化的速度、濃度、時(shí)間、軸向通道尺寸和橫向通道尺寸。經(jīng)測(cè)定，在本發(fā)明中Pe’w、L和w這三個(gè)參數(shù)對(duì)在傾斜通道的影響下分析物的傾斜和分散特別重要。
佩克萊數(shù)(Pe)是一種無(wú)維度因數(shù)，代表某分析物的平流(或前向運(yùn)動(dòng))和擴(kuò)散的比例。如果Pe大，通過(guò)第一傾斜通道的傾斜峰可足夠長(zhǎng)時(shí)間地保持穩(wěn)定的傾斜形狀，而受相反方向的第二個(gè)轉(zhuǎn)彎作用而轉(zhuǎn)向。如果Pe小，傾斜通道中的傾斜峰可在較短時(shí)間中通過(guò)該通道的寬度擴(kuò)散，將傾斜峰轉(zhuǎn)變成彌散加寬的峰。在本發(fā)明方法中，可以最容易地使不感興趣樣品成分傾斜并擴(kuò)散離開感興趣分析物，例如，當(dāng)傾斜通道中存在的條件所提供的佩克萊數(shù)大于傾斜通道長(zhǎng)度與傾斜通道內(nèi)部寬度的比值(即Pe＞L/w)時(shí)。當(dāng)這些條件所提供的佩克萊數(shù)比傾斜通道長(zhǎng)度與傾斜通道寬度的比值高約0.01倍、0.1倍、1倍、10倍、100倍或更多時(shí)，可獲得不感興趣樣品在傾斜通道中發(fā)生傾斜、擴(kuò)散和分散的顯著效果。
影響佩克萊數(shù)的條件可以是，例如，影響分子在該通道中的平流和/或擴(kuò)散的條件，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的那樣。例如，溶液粘度、凝膠的存在、溫度、分子濃度、分子沿該通道遷移的速度、該通道直徑等可影響Pe。調(diào)整控制平流和擴(kuò)散的條件可提供能導(dǎo)致樣品成分在通過(guò)本發(fā)明的傾斜通道區(qū)段期間和/或之后分散至所需水平的佩克萊數(shù)。
將堆積的分析物施加于分離通道可通過(guò)，例如施加跨分離通道區(qū)段和堆積的分析物的電場(chǎng)或壓差將ITP所堆積的分析物注射入分離通道區(qū)段中。電場(chǎng)和/或電壓可使分析物遷移或流入分離通道區(qū)段中。如上所述，可通過(guò)檢測(cè)電壓來(lái)觸發(fā)施加電場(chǎng)或電壓以提供一致性和功能性分析物的注射時(shí)機(jī)。施加于分離通道區(qū)段的電場(chǎng)或壓差可與堆積通道區(qū)段中的電流消除同時(shí)進(jìn)行?？稍O(shè)定(施加)電壓和注射之間的時(shí)機(jī)，與通道、交界點(diǎn)和溶液區(qū)段的具體形狀相符合。該時(shí)機(jī)在確定峰的分辨率和信號(hào)強(qiáng)度中可起到關(guān)鍵作用，因?yàn)樗捎绊懸平缓笏矔r(shí)等速電泳持續(xù)的時(shí)間。
分離通道區(qū)段可提供通過(guò)電泳分離分析物和/或通過(guò)選擇性介質(zhì)分離的條件。在優(yōu)選實(shí)施方式中，分離通道區(qū)段具有微米級(jí)尺寸(例如，深度或?qū)挾确秶s為1000μm-0.1μm，或約為1000μm-1μm)，例如，可快速分離小體積分析物樣品。分離通道區(qū)段可含有能夠?qū)Ψ治鑫锏姆蛛x起作用的分離介質(zhì)，例如pH梯度介質(zhì)、大小選擇性介質(zhì)、離子交換介質(zhì)、提高粘度的介質(zhì)、疏水性介質(zhì)等。
分離通道區(qū)段(以及堆積通道區(qū)段)可含有提高粘度的介質(zhì)如凝膠，以在不需要EOF的分離模式中降低電滲流(EOF)。分離通道區(qū)段可以獨(dú)立于其它通道區(qū)段，或可與其它通道區(qū)段，例如加樣通道區(qū)段和堆積通道區(qū)段共享通道所有的部分或一部分。在優(yōu)選實(shí)施方式，分離通道區(qū)段是獨(dú)立的，但在沿堆積通道區(qū)段長(zhǎng)度的一些點(diǎn)上以液體接觸相交。
在典型實(shí)施方式中，當(dāng)堆積通道區(qū)段和分離通道區(qū)段的交界點(diǎn)上檢測(cè)到峰電壓時(shí)，將經(jīng)ITP分離的堆積分析物注射入分離通道區(qū)段中。例如，隨著夾在拖尾電解質(zhì)112和先行電解質(zhì)113之間的堆積分析物111，在ITP中遷移通過(guò)分離通道區(qū)段與堆積通道區(qū)段交界處的伏特計(jì)接觸點(diǎn)時(shí)，分離通道區(qū)段110中的空載電壓達(dá)到最大(和電壓改變的速率或電壓圖形的斜率變?yōu)榱?，如圖11A所示。電壓最大可觸發(fā)堆積通道區(qū)段中ITP電場(chǎng)的消除，和在分離通道區(qū)段中施加電泳電場(chǎng)而誘導(dǎo)堆積的分析物111遷移(施加)進(jìn)入分離通道區(qū)段中，如圖11B所示。分析物遷移通過(guò)分離通道區(qū)段的選擇性介質(zhì)可在ITP期間使感興趣分析物114與該分析物共同遷移通過(guò)堆積通道區(qū)段的不感興趣樣品成分115相分離(分辨)，如圖11C所示。在一些實(shí)施方式中，在ITP期間，例如可通過(guò)毛細(xì)管區(qū)帶電泳使分離通道區(qū)段中堆積在一起或互相貼近的多種感興趣分析物互相分離。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道確定注射時(shí)機(jī)的另一方案。此方案可根據(jù)計(jì)算或模型，或可憑經(jīng)驗(yàn)確定。例如，可將時(shí)間延誤構(gòu)建到觸發(fā)的反應(yīng)中，該反應(yīng)基于通道體積、通道的幾何形狀、伏特計(jì)接觸位置、電壓的選擇、與影響電壓的溶液特性相關(guān)的分析物位置等。在一具體實(shí)施例中，分析物在瞬時(shí)ITP(還未達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài))中堆積拖尾電解質(zhì)界面附近，而其余的樣品溶液藥團(tuán)具有高電阻，合適的觸發(fā)時(shí)間可以是電壓峰后的某個(gè)時(shí)間，使堆積的分析物有額外的遷移時(shí)間到達(dá)與分離通道區(qū)段的交界點(diǎn)。
可沿分離通道區(qū)段自動(dòng)施加電場(chǎng)(即不需要手動(dòng)切換)?？赏ㄟ^(guò)，例如電子裝置和本領(lǐng)域已知的算法實(shí)現(xiàn)這種自動(dòng)施加電場(chǎng)。例如，可設(shè)置伏特計(jì)，使當(dāng)接觸點(diǎn)的電壓達(dá)到設(shè)定水平時(shí)跳過(guò)開關(guān)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，可對(duì)邏輯裝置，例如，集成電路或計(jì)算機(jī)進(jìn)行編程，以根據(jù)設(shè)定的參數(shù)(例如，發(fā)生設(shè)定的電壓)啟動(dòng)傳動(dòng)裝置的開關(guān)。
檢測(cè)分析物可檢測(cè)分離通道區(qū)段中和/或從分離通道區(qū)段順序洗脫后用本發(fā)明方法分離的分析物?？晒潭ê线m的檢測(cè)器，例如，監(jiān)測(cè)檢測(cè)通道中的分析物，順序掃描諸通道區(qū)段中的分析物，或提供整個(gè)通道的連續(xù)攝像。
合適的檢測(cè)器常常由待檢測(cè)分析物的類型所決定。常?？赏ㄟ^(guò)，例如分光光度法監(jiān)測(cè)特定的吸收光波長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)蛋白和核酸?？赏ㄟ^(guò)監(jiān)測(cè)溶液電導(dǎo)率的改變來(lái)檢測(cè)許多離子型感興趣分析物。許多分析物具有熒光或可用熒光標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記，用熒光計(jì)檢測(cè)?？梢杂谜凵溆?jì)檢測(cè)溶液中的許多分析物，尤其是碳水化合物。
在一個(gè)典型實(shí)施方式中，可利用顯微鏡物鏡聚焦于該通道的光電倍增管(PMT)監(jiān)測(cè)透過(guò)分離通道區(qū)段的光源進(jìn)行檢測(cè)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，如何通過(guò)加入合適的激發(fā)光源，例如激光或燈泡的過(guò)濾光，將這種安排設(shè)置為熒光檢測(cè)器。任選地，可將物鏡裝在X-Y掃描機(jī)上，監(jiān)測(cè)微流體芯片上的任何位置。通過(guò)這種安排，可掃描分離通道區(qū)段長(zhǎng)度中的沿pH梯度分離的分析物。在另一實(shí)施方式中，可跨分離通道出口安置電導(dǎo)計(jì)傳感器，以在帶電分析物從通道區(qū)段中洗脫出來(lái)時(shí)監(jiān)測(cè)它們。
檢測(cè)器可以與數(shù)據(jù)儲(chǔ)存裝置和/或邏輯裝置相連，以記錄實(shí)驗(yàn)的運(yùn)行?？蓪⒌米詸z測(cè)器，如PMT和電導(dǎo)計(jì)的模擬輸出供給圖表繪圖機(jī)，以將分析物分離圖形的蹤跡保留在紙上。模數(shù)轉(zhuǎn)換器可將檢測(cè)信號(hào)傳遞給邏輯裝置進(jìn)行數(shù)據(jù)存儲(chǔ)、分離圖形的提供和/或試驗(yàn)評(píng)價(jià)。通過(guò)與回歸分析的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較，數(shù)字邏輯裝置可大大有助于分析物的定量。
分析物注射系統(tǒng)本文所述的動(dòng)電性分析物注射系統(tǒng)可提供靈敏的分析物檢測(cè)，具有高度一致方式的高分辨率?？筛鶕?jù)諸通道中電壓的檢測(cè)所確定的精確時(shí)機(jī)，將選擇性堆積于堆積通道區(qū)段中的分析物注射(施加)到分離通道區(qū)段中?？赏ㄟ^(guò)提供自動(dòng)注射子系統(tǒng)提高此精確性。
本發(fā)明系統(tǒng)通常包括，在通道中堆積分析物，與控制器通信和與通道一個(gè)或多個(gè)位置相接觸的電壓檢測(cè)器，在電壓檢測(cè)器檢測(cè)到所選電壓時(shí)在通道中建立電流或壓差，和將該電流或壓差傳輸?shù)娇刂破?。該通道可包括相交的堆積通道區(qū)段和分離通道區(qū)段，形成連續(xù)的通道或共享公用通道部分。施加于分離通道區(qū)段被分離的分析物可以用與邏輯裝置相連的檢測(cè)器檢測(cè)，以測(cè)定特定分析物的存在或評(píng)價(jià)分析物的量。
通道本發(fā)明通道可以是，例如，包括加樣區(qū)段、堆積區(qū)段、分離區(qū)段和/或檢測(cè)區(qū)段的一條多功能通道。任選地，該通道可包括以交接點(diǎn)上液體接觸但分開的加樣通道區(qū)段、堆積通道區(qū)段和分離通道區(qū)段。在優(yōu)選實(shí)施方式中，如圖11示意圖所示，加樣通道區(qū)段是堆積通道區(qū)段的延伸，分離通道區(qū)段與堆積通道區(qū)段通過(guò)分析物注射的交界點(diǎn)以液體相接觸。該系統(tǒng)的諸通道可以是本領(lǐng)域已知的任何通道，例如，管、柱、毛細(xì)管、微流體通道等。在優(yōu)選實(shí)施方式中，例如，該通道是微流體芯片上的微米級(jí)通道。
可通過(guò)模型注射、光刻、蝕刻、激光消融等將微流體裝置的通道包埋在基材表面上。這些通道可具有微米級(jí)尺寸，例如，深度或?qū)挾鹊姆秶s為1000μm-0.1μm，或約為100μm-1μm。例如，可通過(guò)電滲流、毛細(xì)管作用(表面張力)、壓差、重力等使液體在通道中流動(dòng)。通道末端可在(例如)溶液孔中和/或在與其它通道或腔室的交界點(diǎn)上。通道的各端可具有電接觸，以提供電場(chǎng)和/或電流來(lái)分離分析物或誘導(dǎo)EOF。檢測(cè)器可與通道功能性相連，以監(jiān)測(cè)感興趣的參數(shù)，例如電壓、電導(dǎo)率、電阻、電容、電流、折射率、光吸收、熒光、壓力、流速等。微流體芯片可在功能性信息通訊上連接和用途上連接以支持儀器的使用，如電力連接、真空源、氣壓源、液壓源、模擬和數(shù)字通訊線路、光纖等。
該通道可包括加樣通道區(qū)段以將一個(gè)或多個(gè)體積的樣品溶液引入該通道?？梢员绢I(lǐng)域技術(shù)人員所知道的方式安置這種加樣通道，例如注射器環(huán)，包括通向微流體芯片的收集管120，如圖12所示，和/或沖洗通道區(qū)段，如圖5A-5C的示意圖所示。加樣通道區(qū)段的橫截面可大于堆積通道區(qū)段的橫截面，如圖7所示，以將大體積樣品溶液中的分析物快速濃積在堆積通道區(qū)段入口附近。
本系統(tǒng)通道可包含凝膠狀物質(zhì)，它能有益地影響通道的遷移和流動(dòng)特征，如2003年9月4日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/500,177，“減少遷移率變動(dòng)試驗(yàn)的干擾”(Reduction of Migration Shift Assay Interference)中所述，將其全部?jī)?nèi)容納入本文作為參考?？蓪⒛z摻入到通道中，以降低溶液的不良電滲流，同時(shí)為分離提供更佳的電泳特性。凝膠可通過(guò)減慢較大分子的泳動(dòng)來(lái)影響分析物和/或電解質(zhì)的相對(duì)遷移率。凝膠可作為工具幫助調(diào)節(jié)堆積通道區(qū)段中分析物和ITP電解質(zhì)的遷移區(qū)帶。例如，感興趣分析物通常大于常用的ITP電解質(zhì)。通過(guò)將凝膠置于堆積通道區(qū)段中，可使快速分析物(大但荷質(zhì)比高)變慢，在先行電解質(zhì)小分子鹽或緩沖液之后遷移。任選地，凝膠可減慢分析物，使其遷移僅比拖尾電解質(zhì)稍快?？赏ㄟ^(guò)(例如)改變凝膠類型、凝膠基質(zhì)濃度和凝膠基質(zhì)交聯(lián)程度來(lái)調(diào)節(jié)凝膠對(duì)大分子遷移的阻抗。在堆積或分離通道區(qū)段中，凝膠可提高分析物的濃度和/或分辯率。在堆積通道區(qū)段或分離通道區(qū)段中可存在一種或多種不同凝膠。在實(shí)施本發(fā)明方法過(guò)程中，可采用各種不同凝膠，包括但不限于聚丙烯酰胺凝膠、聚乙二醇(PEG)、聚環(huán)氧乙烷(PEO)、蔗糖和表氯醇的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羥乙基纖維素(HEC)、聚-N，N-二甲基丙烯酰胺(pDMA)或瓊脂糖凝膠。在該裝置的微流體通道中存在的凝膠濃度約為0.1-3.0％，例如0.9-1.5％。
堆積通道區(qū)段的功能是，例如，通過(guò)ITP選擇性堆積感興趣分析物，注射入分離通道區(qū)段作進(jìn)一步分離和檢測(cè)。堆積通道區(qū)段的各端上可具有電接觸點(diǎn)，以施加適合于分析物堆積的電場(chǎng)。堆積通道區(qū)段可以與例如，外部驅(qū)動(dòng)的氣動(dòng)或液壓分支管液體相接觸，從而可以實(shí)施上述“堆積感興趣分析物”章節(jié)中所述的多次堆積技術(shù)的壓力驅(qū)使的流動(dòng)，如電解質(zhì)加載或拖回。堆積通道區(qū)段可含有例如，適用于等速電泳(ITP)的電解質(zhì)，如拖尾電解質(zhì)、間隔電解質(zhì)和/或先行電解質(zhì)，如上述方法章節(jié)中所述。堆積通道區(qū)段可具有拖尾電解質(zhì)孔18，如圖1所示，和先行電解質(zhì)孔19，以將電解質(zhì)引入通道區(qū)段中。
分離通道區(qū)段可接受從堆積通道區(qū)段注射的堆積分析物，通過(guò)各種分離技術(shù)，例如增加ITP輪次、離子交換、大小排阻、疏水作用、反相層析、等電聚焦、毛細(xì)管區(qū)帶電泳等進(jìn)一步分離。分離通道區(qū)段可包括沿通道區(qū)段施加電場(chǎng)的電接觸和/或驅(qū)使液體流動(dòng)的外部連接電壓源。分離通道區(qū)段可以是(例如)與堆積通道區(qū)段相交的通道區(qū)段、與堆積通道區(qū)段共有通道的通道區(qū)段和/或與堆積通道區(qū)段在功能上共享通道部分的通道區(qū)段。在典型實(shí)施方式中，分離通道區(qū)段與堆積通道區(qū)段在沿堆積通道區(qū)段長(zhǎng)度上的一些點(diǎn)上相交，如圖11所示。在這個(gè)實(shí)施方式中，將感興趣的堆積分析物注射入分離通道區(qū)段后，不感興趣樣品成分可保留在分開的堆積通道區(qū)段部分中。在其它實(shí)施方式中，例如，堆積和分離通道區(qū)段可以在功能上位于一共同通道中，而沒(méi)有插入的交界點(diǎn)。如圖13A所示，通道區(qū)段中的堆積可持續(xù)直到檢測(cè)到電壓。一旦檢測(cè)到該電壓，可改變通道中的條件，以過(guò)渡到分離模式。這種過(guò)渡可包括(例如)在通道二末端130上施加壓差，以導(dǎo)致分析物流入大小排阻樹脂131中，如圖13B所示。較小分子先于較大分子洗脫通過(guò)檢測(cè)器132。過(guò)渡到分離模式的其它例子可包括(例如)電流流動(dòng)方向的改變、液體流動(dòng)方向的改變、將分離緩沖液注射入通道、電場(chǎng)電壓的改變等。
傾斜通道ITP系統(tǒng)本發(fā)明的等速電泳系統(tǒng)可包括在堆積通道之中和/或之前的傾斜通道區(qū)段，用以提高感興趣分析物與不感興趣樣品成分的分離?？煞稚悠烦煞?，同時(shí)通過(guò)在傾斜通道中堆積聚集感興趣分析物。例如，可轉(zhuǎn)向通過(guò)累積的大角度、急轉(zhuǎn)彎、橫截面寬度較大的傾斜通道、具有不同長(zhǎng)度相反表面形狀的傾斜通道和/或具有使佩克萊數(shù)大于傾斜通道長(zhǎng)度與傾斜通道寬度的比值的條件的傾斜通道系統(tǒng)，來(lái)提高分離效果。
提高傾斜通道區(qū)段中的傾斜和分散的一種方法是在通道中提供較大轉(zhuǎn)角。在二維平面中，可利用(例如)連續(xù)的螺旋形彎道或轉(zhuǎn)換成蛇形彎道來(lái)累積轉(zhuǎn)角，如圖14A-14C所示。螺旋形彎道的優(yōu)點(diǎn)是，可通過(guò)在一個(gè)方向上累積大量轉(zhuǎn)角，伴隨地累積傾斜。螺旋形傾斜通道的缺點(diǎn)可能是彎道半徑所固有的連續(xù)擴(kuò)展變?yōu)橛行暂^低的曲率。螺旋形傾斜通道構(gòu)造的困難也可能是與內(nèi)部通道末端連接的進(jìn)入問(wèn)題。在螺旋形傾斜通道構(gòu)造中提供進(jìn)入通道末端的一種方法可以是加入能進(jìn)出中心的并排螺旋通道，如圖14B所示?；蛘?，例如，可通過(guò)吸管或另一平面中的后通道以第三維度進(jìn)入螺旋形通道末端，如圖14A所示。對(duì)螺旋形通道長(zhǎng)度的另一限制是優(yōu)化傾斜所需的佩克萊數(shù)隨螺旋形通道長(zhǎng)度增加而增加。如圖14C所示的蛇形傾斜通道可容易地通向通道末端，但產(chǎn)生的彎道可消除前面彎道造成的傾斜，尤其在各彎道之間的佩克萊數(shù)大或時(shí)間短的情況下。任選地，可采用三維傾斜通道，如螺旋和卷曲。
通過(guò)傾斜通道區(qū)段而產(chǎn)生的傾斜和分散可能在具有相對(duì)于通道內(nèi)徑形成的急轉(zhuǎn)彎的通道中更明顯。例如，流經(jīng)通道內(nèi)徑與彎道寬度比值高的傾斜通道可提高傾斜作用。在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)通道的沿彎道半徑(傾斜通道的內(nèi)部寬度)的橫截面大于垂直于該彎道半徑(傾斜通道的深度)的橫截面時(shí)，提高了含有彎道的傾斜通道區(qū)段的傾斜作用。
傾斜通道區(qū)段的形狀可影響遷移分析物的傾斜和分散。例如，對(duì)于通道表面外形，通過(guò)提高沿彎道外側(cè)的移動(dòng)距離與沿彎道內(nèi)側(cè)的移動(dòng)距離之間的比例可提高傾斜作用?？赏ㄟ^(guò)增加彎道點(diǎn)的通道內(nèi)部寬度與通道深度的比例來(lái)增加傾斜作用。如圖15所示，在流經(jīng)具有bolbus外側(cè)彎道表面的彎道時(shí)，可使分析物150高度傾斜。當(dāng)傾斜通道第一側(cè)邊151上的表面移動(dòng)距離大于傾斜通道第二側(cè)邊152上的表面移動(dòng)距離時(shí)，可增加傾斜通道中的傾斜作用，即使在整個(gè)傾斜通道上沒(méi)有彎曲，如圖16所示。例如，可從相反的表面移動(dòng)距離差別范圍在500％以上、到100％、到50％、到10％或更小獲得明顯的傾斜作用。
在先行和拖尾電解質(zhì)之間選擇性堆積感興趣分析物是本發(fā)明傾斜通道ITP系統(tǒng)的一個(gè)重要方面?？稍趦A斜期間和/或之后將感興趣分析物連續(xù)重聚集于此二電解質(zhì)之間，同時(shí)不感興趣樣品成分變得分散。可通過(guò)計(jì)算或經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)了解感興趣分析物的遷移率。可選擇遷移率在感興趣分析物和侵入性不感興趣樣品成分之間的拖尾和/或先行電解質(zhì)。為提高分析物的聚集和不感興趣樣品成分的分散，可選擇遷移率不同于不感興趣樣品成分但更接近感興趣分析物的電解質(zhì)。
可將傾斜的ITP通道區(qū)段結(jié)合到上述系統(tǒng)和分析物的注射方法中。通過(guò)傾斜通道ITP分散其它樣品成分后，可將較高純度的感興趣分析物注射入分離通道。一旦檢測(cè)到電壓，就可開始注射分析物。
利用間隔分子進(jìn)行ITP和分離樣品成分峰本發(fā)明提供了提高本發(fā)明等速電泳系統(tǒng)分辨靈敏度的額外技術(shù)。當(dāng)采用熒光標(biāo)記抗體偶聯(lián)物以本發(fā)明所述內(nèi)容進(jìn)行遷移率變動(dòng)免疫試驗(yàn)時(shí)，可發(fā)現(xiàn)這些額外技術(shù)的具體實(shí)用性，如2003年9月4日提交的題為“減少遷移率變動(dòng)試驗(yàn)的干擾”(Reduction of Migration Shift Assay Interference)的共待審專利申請(qǐng)USSN60/500,177。遷移率變動(dòng)免疫試驗(yàn)是檢測(cè)和定量生物分子之間相關(guān)性的有用方法。例如，在電泳或?qū)游鲈囼?yàn)中分子的保留時(shí)間的改變可表明存在著一種結(jié)合分子。結(jié)合可以是特異性的，例如抗體-抗原相互作用，或者是非特異性的，例如帶正電分子的離子吸引于帶負(fù)電的聚合物。
可在親和性分子與分析物的其它相互作用中觀察到遷移率變動(dòng)。例如，當(dāng)抗體與抗原結(jié)合時(shí)，或當(dāng)多糖與凝集素結(jié)合時(shí)，可觀察到遷移率變動(dòng)。然而，由于這些分子有多種構(gòu)象和不穩(wěn)定的電荷密度，這些分子的層析或電泳常常產(chǎn)生寬大而分辨率差的峰。也可能各對(duì)親和性分子/分析物存在多樣性需要為各對(duì)開發(fā)專門的遷移率變動(dòng)試驗(yàn)。如果在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行的試驗(yàn)中將親和性分子連接于能夠高度可辨的運(yùn)載體聚合物上就可避免這些問(wèn)題。例如，日本專利申請(qǐng)?zhí)朩O 02/082083“電泳方法”(Method for Electrophoresis)中描述了采用運(yùn)載體/親和分子的技術(shù)例子，將其全文納入本文作為參考。雖然在遷移率變動(dòng)試驗(yàn)中對(duì)親和分子使用統(tǒng)一的運(yùn)載體分子可提高分辨率，但問(wèn)題是過(guò)量的標(biāo)記抗體偶聯(lián)物產(chǎn)生的峰干擾，尤其是采用大量過(guò)量的標(biāo)記抗體偶聯(lián)物來(lái)加速結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)和提高試驗(yàn)的動(dòng)態(tài)范圍時(shí)。例如，加入過(guò)量的標(biāo)記抗體偶聯(lián)物所產(chǎn)生的問(wèn)題是它常?？稍陔娪痉蛛x圖案中產(chǎn)生大峰，此大峰可干擾結(jié)合于該偶聯(lián)物(即抗原組合物)的抗原的檢測(cè)，這種組合物被用于檢測(cè)樣品中抗原或分析物的存在。
因此，遷移率變動(dòng)試驗(yàn)中，尤其是采用親和分子運(yùn)載體的試驗(yàn)中仍然需要阻斷或基本消除過(guò)量的標(biāo)記偶聯(lián)物遷移峰所造成的干擾的方法。本領(lǐng)域中描述了可用于解決這個(gè)問(wèn)題的數(shù)種技術(shù)，如將第二抗體偶聯(lián)物加入結(jié)合反應(yīng)混合物中，進(jìn)一步改變抗原復(fù)合物的遷移，使其遠(yuǎn)離抗體偶聯(lián)物峰，如美國(guó)專利號(hào)5,948,231所述，將其全文內(nèi)容納入本文作為參考。此外，采用遷移率介于先行和拖尾電解質(zhì)之間的間隔分子的等速電泳技術(shù)，可在抗體偶聯(lián)物和抗原偶聯(lián)物峰之間產(chǎn)生間隔，以幫助提高對(duì)這些峰的分辨率，參見例如Kopwillem，A.等，“利用氨基酸間隔物對(duì)血清蛋白質(zhì)組分進(jìn)行等速電泳”(Serum Protein Fractionation by Isotachophoresis UsingAmino Acid Spacers)，J.Chroma.(1976)11835-46和Svendsen，P.J.等，“在等速電泳系統(tǒng)中用安福林運(yùn)載體兩性電解質(zhì)作為緩沖液和間隔離子分離蛋白質(zhì)”(Separation of Proteins Using Ampholine Carrier Ampholytes as Buffer andSpacer Ions in an Isotachophoresis System)，Science Tools，《KLB器械雜志》(KLB Instrument Journal)(1970)1713-17中所述，將其全文內(nèi)容納入本文作為參考。
然而，即使當(dāng)采用這些技術(shù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用高濃度的標(biāo)記抗體偶聯(lián)物和樣品(如混合的人血清樣品)中存在少量分析物(如抗原)(如約1皮摩爾數(shù)量級(jí)或更少)時(shí)，抗體偶聯(lián)物遷移峰可能仍趨于分散到抗原復(fù)合物區(qū)域中，而影響試驗(yàn)的檢測(cè)靈敏度。
本文所述的本發(fā)明內(nèi)容可用于在將該復(fù)合物注入微流體裝置的分離通道中之前(如，當(dāng)將抗原復(fù)合物與樣品中的其它污染成分相分離時(shí))，通過(guò)將偶聯(lián)物與抗體復(fù)合物相分離來(lái)基本消除干擾來(lái)源的抗體偶聯(lián)物。具體說(shuō)，如下所述，揭示了將樣品(如臨床體液樣品或組織樣品)中感興趣的第一種成分(如抗原復(fù)合物)與至少第二種成分(如過(guò)量的標(biāo)記抗體偶聯(lián)物)相分離的方法，該方法通常包括通過(guò)等速電泳在第一通道區(qū)段中堆積第一種和第二種成分；讓堆積的第二種成分流過(guò)在交叉點(diǎn)上流體連接于第一通道區(qū)段的第二通道區(qū)段，檢測(cè)該交叉點(diǎn)或附近與第一種和/或第二種堆積成分相對(duì)應(yīng)的預(yù)先選定的電信號(hào)；和沿流體連接于交叉點(diǎn)的第三通道區(qū)段施加電場(chǎng)或壓差，當(dāng)檢測(cè)到預(yù)先選定的的電信號(hào)時(shí)，將堆積的第一種成分引入第三通道區(qū)段。該方法還可包括在第三通道區(qū)段中將堆積的第一種成分分離成各種成分，并檢測(cè)諸分離成分。
在一個(gè)
具體實(shí)施例方式
中，堆積包括將先行電解質(zhì)緩沖液、拖尾電解質(zhì)緩沖液和含有間隔分子電泳遷移率介于先行電解質(zhì)離子和拖尾電解質(zhì)離子之間的間隔緩沖液引入第一通道區(qū)段，和通過(guò)等速電泳堆積第一種和第二種成分。該先行電解質(zhì)可選自，例如氯化物、溴化物、氟化物、磷酸鹽、乙酸鹽、硝酸鹽和二甲胂酸鹽。拖尾電解質(zhì)可選自，例如HEPES、TAPS、MOPS(3-(4-嗎啉基)-1-丙烷磺酸)、CHES(2-(環(huán)己基氨基)乙烷磺酸)、MES(2-(4-嗎啉基)乙烷磺酸)、甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸等。間隔分子可選自，例如MOPS(3-(4-嗎啉基)-1-丙烷磺酸)、安福林、氨基酸、MES、壬酸、D-葡糖醛酸、乙酰水楊酸、4-乙氧基苯甲酸、戊二酸、3-苯基丙酸、苯氧基乙酸、半胱氨酸、馬尿酸、對(duì)羥基苯乙酸、異丙基丙二酸、衣康酸、檸康酸、3，5-二甲基苯甲酸、2，3-二甲基苯甲酸、對(duì)羥基肉桂酸和5-溴-2，4-二羥基苯甲酸，或者其它適合的間隔分子包括電泳遷移率在先行和拖尾電解質(zhì)緩沖液中所存在離子之間的離子。這種間隔分子能在間隔分子與先行和拖尾電解質(zhì)之間的離子前緣處堆積的第一種成分和堆積的第二種成分之間產(chǎn)生分隔區(qū)域。
可通過(guò)產(chǎn)生跨第一和第二通道區(qū)段的電勢(shì)進(jìn)行樣品的等速電泳，使第二種成分堆積，然后流入第二通道區(qū)段(在此處與感興趣的第一種堆積成分相分離)。如上所述，第一種成分可包括，例如熒光標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物，第二種成分可包括熒光標(biāo)記的抗體(如，標(biāo)記的DNA-抗體偶聯(lián)物)。優(yōu)選第一種和第二種成分都帶有電荷，其中第一種和第二種成分可以都帶負(fù)電或都帶正電，或者一種成分帶正電另一種帶負(fù)電。第一種和第二種帶電成分也可選自，例如核酸、蛋白質(zhì)、多肽、多糖和合成聚合物。
檢測(cè)電信號(hào)的步驟可包括，例如檢測(cè)第一和第二通道區(qū)段的交叉點(diǎn)上或其附近的光學(xué)信號(hào)、電壓信號(hào)或電流信號(hào)。因此，通過(guò)使用等速電泳間隔分子以及可以誘捕分離自主要分離通道的側(cè)通道中的不良成分遷移峰的微流體通道網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)和測(cè)定腳本的組合，發(fā)現(xiàn)可大大提高從等速電泳獲得的分辨率的靈敏度。
參見圖17，顯示了利用間隔分子進(jìn)行等速電泳將不良成分峰與感興趣的成分峰分開和分離得到感興趣成分所用的示范性微流體芯片通道結(jié)構(gòu)示意圖。圖17的微流體芯片含有一般命名為150的通道網(wǎng)絡(luò)，其中包括許多通道或通道區(qū)段，其中幾個(gè)的末端在緩沖液或電解質(zhì)貯存室中。具體說(shuō)，該通道網(wǎng)絡(luò)包括末端在拖尾電解質(zhì)緩沖液貯存室160中的通道區(qū)段162，末端在廢液貯存室168中的通道區(qū)段166，末端在含有間隔緩沖液如MOPS的樣品(和間隔緩沖液)貯存室174中的通道區(qū)段172，末端在廢液貯存室180中的通道區(qū)段178，位于還連接于通道區(qū)段186和190的ITP堆積通道區(qū)段182和分離通道區(qū)段194的流體連接處的短互連通道區(qū)段184，其中通道區(qū)段186和190依次分別終止于間隔緩沖液貯存室188和先行電解質(zhì)緩沖液貯存室192，以及分別終止于先行電解質(zhì)緩沖液貯存室198和202的通道區(qū)段196和200。注意，各緩沖液貯存室的組成可因微流體芯片的具體用途而不同。先行電解質(zhì)貯存室192、198和202中充滿了含有電泳遷移率高于任何樣品成分遷移率的離子的電解質(zhì)溶液。拖尾電解質(zhì)貯存室160中充滿了含有電泳遷移率低于任何樣品成分遷移率的電解質(zhì)離子溶液。間隔緩沖液貯存室174和188中充滿了含有電泳遷移率介于先行和拖尾電解質(zhì)之間的電解質(zhì)離子溶液。在這種情況下，將樣品置入間隔緩沖液貯存室174中，含有至少兩種不同的樣品成分，如DNA抗體偶聯(lián)物和抗原-DNA-抗體復(fù)合物。
該微流體芯片也包括許多連接通道區(qū)段164、170和176，ITP堆積通道區(qū)段182和流體相連的分離通道區(qū)段194，這構(gòu)成整個(gè)通道網(wǎng)絡(luò)。將芯片的諸貯存室與真空(或壓力)源連接，和/或接受一個(gè)電極，或這二者。例如，可在2001年2月23日提交的題為“多端口壓力控制系統(tǒng)”(Multi-Port Pressure Control Systems)的共待審專利申請(qǐng)USSN 09/792,435中找到包括選擇性和各自改變此系統(tǒng)各貯存室的壓力和/或電壓的多端口壓力控制微流體裝置和系統(tǒng)的例子，將其全部?jī)?nèi)容納入本文作為參考。在使用時(shí)，當(dāng)將電極置于相應(yīng)的貯存室中時(shí)，例如將電極板置于基材上時(shí)可在基材上形成或獨(dú)立地形成與相連的貯存室以液體相接觸的電極。進(jìn)而使各電極操作性連接于控制單元或電壓控制器(未顯示)，以控制輸出到各電極的電壓(或電流)。也提供真空或壓力源(未顯示)，它們給一個(gè)或多個(gè)相連的貯存室提供合適的真空(或壓力)?？蓪⒍囝^貯存室壓力控制器連接于多個(gè)獨(dú)立控制的壓力調(diào)節(jié)器，以影響液體在微流體通道網(wǎng)絡(luò)各通道中的受壓移動(dòng)，如上述共待審專利申請(qǐng)USSN 09/792,435中所述。通過(guò)選擇性控制和改變施加于微流體裝置各貯存室的壓力，可將交叉連接的微流體通道中液流精確地控制在所需流速?？蓪⒃撌軌毫鲃?dòng)與動(dòng)電學(xué)液體控制相結(jié)合，從而提供復(fù)合的壓力/動(dòng)電學(xué)液流控制系統(tǒng)，用于將樣品加樣到該系統(tǒng)的通道中進(jìn)行ITP試驗(yàn)。雖然圖17中僅顯示了一個(gè)單獨(dú)的通道網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)理解，該裝置可包括通道網(wǎng)絡(luò)陣列，各自具有上述通道網(wǎng)絡(luò)的總體特征。
將樣品加到通道網(wǎng)絡(luò)中，用等速電泳以間隔分子首先進(jìn)行樣品堆積步驟，優(yōu)選用壓力引起的流動(dòng)控制加樣，以幫助降低動(dòng)電液體運(yùn)輸相關(guān)電場(chǎng)所引起的樣品偏移作用。然而，應(yīng)理解，本文描述的加樣技術(shù)也可能必需依賴動(dòng)電液體控制和運(yùn)輸(例如，當(dāng)系統(tǒng)不具有多端口壓力控制能力時(shí))。首先對(duì)廢液貯存室168和180施加真空，同時(shí)對(duì)貯存室188施加相應(yīng)的反壓力(或真空)，以阻止間隔緩沖液流入通道區(qū)段186中。對(duì)貯存室168和180施加真空可停止電解質(zhì)160流入并充滿通道區(qū)段164，同時(shí)置于間隔緩沖液貯存室174中的樣品將流入并充滿通道區(qū)段170和176。此外，緩沖液貯存室192、198和202中的先行電解質(zhì)將流入并充滿通道區(qū)段182和194。因此，這種流動(dòng)模式將使樣品和間隔緩沖液夾在通道區(qū)段164中的拖尾電解質(zhì)溶液和通道區(qū)段182和194中的先行電解質(zhì)緩沖液之間。
為通過(guò)ITP使樣品堆積在兩個(gè)(或多個(gè))小體積(例如對(duì)應(yīng)于樣品中的DNA抗體偶聯(lián)物和抗原復(fù)合物)，然后在與貯存室160和192液體接觸的電極之間建立正電壓梯度，隨著樣品移動(dòng)通過(guò)各通道區(qū)段，這樣使170、176和主要堆積通道區(qū)段182中發(fā)生ITP。間隔緩沖液(在圖18A-D中稱為“SP”)可在樣品中，例如此時(shí)在堆積的抗體偶聯(lián)物峰210和堆積的抗原復(fù)合物峰212之間，在間隔與先行和拖尾電解質(zhì)緩沖液(在圖18A-D中分別稱為“L”和“T”)之間的離子前緣處，提供了兩個(gè)堆積體積210和212之間的分隔區(qū)域。圖18A-D和圖19中最好地說(shuō)明了這一點(diǎn)。允許比抗原復(fù)合物峰212移動(dòng)更快的抗體偶聯(lián)物峰210首先遷移到側(cè)通道184中，通過(guò)通道區(qū)段190向貯存室192移動(dòng)。電壓檢測(cè)器(如伏特計(jì))和/或光學(xué)檢測(cè)器安置處能與通道區(qū)段188和192的交叉點(diǎn)187發(fā)生傳感器通信，在樣品通過(guò)交叉點(diǎn)187時(shí)監(jiān)測(cè)樣品的電壓信號(hào)和/或光學(xué)信號(hào)。本文所用的短語(yǔ)“傳感器通信”指安置在能接受特定位置(例如微米級(jí)通道)的特定信號(hào)位置上的檢測(cè)系統(tǒng)。例如，就光學(xué)檢測(cè)器而言，傳感器通信指安置在所述微米級(jí)通道或者液流交叉點(diǎn)或連接點(diǎn)透明區(qū)域附近的檢測(cè)器，這種設(shè)置使該光學(xué)檢測(cè)器能接受并檢測(cè)此通道的光學(xué)信號(hào)，例如熒光、化學(xué)發(fā)光等。這種結(jié)構(gòu)一般包括采用位于足夠接近流動(dòng)控制元件或通道之處能收集到可檢測(cè)水平的光學(xué)信號(hào)的合適物鏡和光具系列。顯微鏡檢測(cè)器，如熒光檢測(cè)器是本領(lǐng)域熟知的。參見，例如，美國(guó)專利號(hào)5,274,240和5,091,652，各自納入本文作為參考。
如上所述，當(dāng)在與堆積的第二種成分210對(duì)應(yīng)的交叉點(diǎn)187處檢測(cè)到峰電壓時(shí)，該檢測(cè)到的電壓信號(hào)可通過(guò)合適方法觸發(fā)貯存室160和192之間產(chǎn)生的ITP電場(chǎng)消除，隨后在分離通道區(qū)段194中施加毛細(xì)管電泳(CE)電場(chǎng)以誘導(dǎo)堆積的第一種成分峰212遷移(施加)到分離通道區(qū)段中，如圖18C-D所示。為了確定上述切換電壓梯度的時(shí)間，可采用交叉點(diǎn)187(或例如圖19的芯片結(jié)構(gòu)的ITP堆積通道區(qū)段182和分離通道區(qū)段194的流體連接交叉點(diǎn))的電壓、電流和/或光學(xué)信號(hào)數(shù)據(jù)。根據(jù)以下所述的這些數(shù)據(jù)，然后可將電壓梯度切換到貯存室188和202之間，而允許與貯存室192接觸的電極空載，使得在通道區(qū)段190中沒(méi)有電流。
圖20A-C顯示了用等速電泳以合適的間隔分子互相分離的DNA-抗體偶聯(lián)物和抗原復(fù)合物的示范性電壓和光學(xué)特性，和類似于圖17的微流體通道網(wǎng)絡(luò)。如圖所示，樣品中的諸成分分別產(chǎn)生了兩個(gè)光學(xué)最大值216和218，和電壓信號(hào)220和222分別產(chǎn)生了兩個(gè)電壓斜率改變。光學(xué)最大值信號(hào)216、218和隨后出現(xiàn)的電壓斜率改變220、222彼此發(fā)生在大約半秒內(nèi)，如圖20B-C所示。換句話說(shuō)，在第一個(gè)光學(xué)最大值216出現(xiàn)后大約1/2秒發(fā)生了第一個(gè)電壓斜率改變220，在第二個(gè)光學(xué)最大值218出現(xiàn)后大約1/2秒發(fā)生了第二個(gè)電壓斜率改變222。因此，可利用測(cè)量到電壓斜率改變220、222(和/或光學(xué)信號(hào)最大值216、218)之一的出現(xiàn)，將電壓梯度改變的切換信號(hào)從該試驗(yàn)ITP相的孔160和192切換到該試驗(yàn)分離相的孔188和202。通過(guò)控制緩沖液和間隔電解質(zhì)的相對(duì)電導(dǎo)率，可控制電壓斜率的大小，以使上述測(cè)量易于進(jìn)行。
參見圖21，也觀察到在某些試驗(yàn)結(jié)構(gòu)中，電壓(和光學(xué)信號(hào)圖形)包括兩種以上，例如三種以上不同的電壓斜率改變，它們互相發(fā)生在相對(duì)接近(例如，約1/2秒級(jí)或更短)的時(shí)間。已證明這是在微流體裝置中進(jìn)行甲胎蛋白(AFP)檢測(cè)的免疫試驗(yàn)所發(fā)生的情況，甲胎蛋白是胎兒早期血漿蛋白，功能相當(dāng)于白蛋白，由胎兒卵黃囊、肝臟和胃腸道產(chǎn)生，如2003年9月4日提交的題為“減少遷移率變動(dòng)試驗(yàn)的干擾”(Reduction of Migration Shift Assay Interference)的共待審美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)60/500,177所述，此前已將其納入本文作為參考。在AFP免疫試驗(yàn)時(shí)，常需要區(qū)分和比較各種AFP組分的不同水平。通過(guò)凝集素-親和電泳(采用兵豆凝集素LCA)可將AFP分為至少3種組分。LCA將AFP分成三條條帶LCA-無(wú)反應(yīng)性(AFP-L1)、弱反應(yīng)性(AFP-L2)；以及強(qiáng)反應(yīng)性(AFP-L3)。
例如，已證明，AFP L1與AFP L3的相對(duì)水平比較，可用作肝細(xì)胞癌的標(biāo)記，總AFP可用作懷孕婦女可能懷有神經(jīng)管缺陷嬰兒的標(biāo)記。進(jìn)行AFP免疫試驗(yàn)時(shí)采用DNA-抗體偶聯(lián)物來(lái)捕獲微流體系統(tǒng)中感興趣的各種AFP組分，如上述USSN60/500,177中所詳述，雖然任何一個(gè)電壓斜率改變都可用于將電壓梯度改變信號(hào)從孔160和192切換到該試驗(yàn)CE分離相的孔188和202，但是據(jù)觀察，采用最后產(chǎn)生的電壓導(dǎo)數(shù)(例如，對(duì)于四種專利樣品各自通過(guò)該裝置而言，圖21中顯示了第三個(gè)不同的電壓改變224)可提供觸發(fā)該切換的最佳結(jié)果。
感興趣的第一種堆積成分212遷移通過(guò)分離通道區(qū)段194可通過(guò)毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離(分辨)樣品中的感興趣成分214，如圖18D所示。通過(guò)將間隔緩沖液經(jīng)貯存室188和通道區(qū)段186(和184)引入分離通道區(qū)段194中，將把第一種堆積的成分212夾在其上游的間隔緩沖液和下游液體邊界之間，這會(huì)導(dǎo)致去堆積作用和使堆積成分212與該試驗(yàn)ITP相期間堆積在ITP堆積通道區(qū)段182中的其它污染物質(zhì)相分離。
因?yàn)橐苍S不可能將所有堆積的第二種成分210轉(zhuǎn)移到通道區(qū)段184中，導(dǎo)致在分離通道區(qū)段194中有一些堆積成分210的遺留物，在分離通道區(qū)段中存在作為拖尾緩沖液的間隔緩沖液，將意味著分離通道中的不良遺留物成分210將被夾在較慢的分隔緩沖液和較快的先行電解質(zhì)緩沖液之間，這將使其進(jìn)一步堆積于分離通道區(qū)段194中。因此，該ITP界面的自身靈敏特性將最大程度減少分離通道區(qū)段中存在第二種成分210遺留物所引起的干擾和移動(dòng)較快的成分210擴(kuò)散進(jìn)入移動(dòng)較慢的成分峰212中。以這種方式，可基本上將實(shí)質(zhì)量的成分210，和與感興趣成分212(如抗原復(fù)合物)堆積在一起可能干擾遷移率變動(dòng)試驗(yàn)的不感興趣的任何其它標(biāo)記物質(zhì)，與堆積成分212相分離。這可顯著降低影響分離通道區(qū)段檢測(cè)區(qū)域基線信號(hào)的物質(zhì)的量，從而提高該試驗(yàn)的靈敏度。應(yīng)注意，各種緩沖液中存在的篩選介質(zhì)可幫助調(diào)節(jié)該試驗(yàn)ITP相期間感興趣成分的遷移率，也可提高該試驗(yàn)CE相期間污染物質(zhì)與成分212相分離的效果。
為了進(jìn)一步使偶聯(lián)物遺留成分峰進(jìn)入分離通道區(qū)段194可能造成的干擾減至最小，可采用圖19所示的通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的另一實(shí)施方式，此方式中取消了將通道區(qū)段186和190與ITP堆積通道區(qū)段182和分離通道區(qū)段194流體相連接的互連通道區(qū)段184。在此替代實(shí)施方式中，將電壓檢測(cè)器和/或光學(xué)檢測(cè)器置入與ITP堆積通道區(qū)段182和分離通道區(qū)段194之間流體連接的傳感器通信中。此外，在該具體實(shí)施方式
中，利用在分離通道區(qū)段194中檢測(cè)到對(duì)應(yīng)于感興趣的成分峰212的第二個(gè)電壓斜率改變222(或第二個(gè)光學(xué)最大值218)來(lái)觸發(fā)將電壓梯度從該試驗(yàn)的ITP相切換到該試驗(yàn)的CE相，可保證幾乎所有的第二種成分210進(jìn)入側(cè)通道190中，在此將其丟棄到液體貯存室192中。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，通道區(qū)段186也可與通道區(qū)段190的對(duì)側(cè)通道區(qū)段182、194相交和位于其上。
電壓檢測(cè)器可使本發(fā)明系統(tǒng)中的電壓檢測(cè)器與各通道接觸，以檢測(cè)傳輸給控制器的電壓。電壓檢測(cè)器的類型和復(fù)雜性可取決于(例如)通道硬件的配置和待檢測(cè)電壓的類型。
電壓檢測(cè)器的范圍可包括，例如簡(jiǎn)單的受電壓作用而跳閘的繼電器開關(guān)，模擬檢流計(jì)，裝有圖表記錄器的模擬裝置，具有數(shù)字輸出的伏特計(jì)，通過(guò)邏輯裝置進(jìn)行評(píng)價(jià)。伏特計(jì)通?？蓹z測(cè)兩個(gè)位置電極之間，例如，通道中和地面的接觸位置或通道中兩個(gè)不同位置之間的電壓電勢(shì)。與通道相接觸的電壓電極的位置可改變堆積運(yùn)作期間檢測(cè)到的電壓圖形。然而，可能常常要為范圍廣闊的通道位置上的伏特計(jì)接觸點(diǎn)(例如，伏特計(jì)接觸點(diǎn)不一定在堆積和分離通道區(qū)段之間的交界點(diǎn)上)確定連貫一致地和明確地觸發(fā)注射所需的定義明確的電壓。
在一個(gè)實(shí)施方式中，伏特計(jì)接觸處可位于通道兩端。因?yàn)殡娮柘鄬?duì)高的拖尾電解質(zhì)在通道中取代了先行電解質(zhì)，維持所選電流流過(guò)該通道需要的電壓可能要提高。在這種情況下，觸發(fā)注射的電壓可以是(例如)設(shè)定的電壓。
在另一實(shí)施方式中，可將伏特計(jì)接觸點(diǎn)定位在地面(或其它參比電壓)上和與堆積通道區(qū)段相交的分離通道區(qū)段的任何點(diǎn)上。如果不允許電流流過(guò)分離通道區(qū)段(例如空載電壓使分離通道區(qū)段維持零電流時(shí)或分離通道區(qū)段不是整個(gè)電路的一部分時(shí))，分離通道區(qū)段中的任何位置將反映堆積通道區(qū)段交界處的電壓。隨著TE/LE界面通過(guò)該交界處，在分離通道區(qū)段中檢測(cè)到的電壓可升高到峰值然后降低，其方式類似于圖8的電壓圖形，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的那樣。
在無(wú)電流和與堆積通道區(qū)段接觸的分離通道區(qū)段中監(jiān)測(cè)電壓時(shí)，缺少電流可能由于(例如)空載電壓的調(diào)節(jié)或電路分隔所引起?？蛰d電壓調(diào)節(jié)裝置可以是本領(lǐng)域已知的電子設(shè)備，它能檢測(cè)電流在通道區(qū)段中的流動(dòng)，并對(duì)該通道區(qū)段施加電壓，以中和任何跨該通道區(qū)段的電壓電勢(shì)，從而阻止電流流動(dòng)?？扇芜x地設(shè)置空載電壓調(diào)節(jié)器，以調(diào)節(jié)該通道區(qū)段的壓差，在該通道區(qū)段中提供選擇的恒定電流。阻止電流在通道區(qū)段中流動(dòng)的另一種方法是確保該通道區(qū)段不是整個(gè)電路的一部分。例如，可將電開關(guān)安置于該通道區(qū)段的一端，以選擇性打開或關(guān)閉任何相關(guān)電路。
可將伏特計(jì)與控制器相連接，以啟動(dòng)將分析物施加(注射)于分離通道區(qū)段。啟動(dòng)注射可以手動(dòng)或自動(dòng)。例如，伏特計(jì)可為系統(tǒng)操作員(控制員)提供可視電壓讀數(shù)，使其一旦觀察到電壓(如選擇的電壓或電壓峰)時(shí)，即可手動(dòng)轉(zhuǎn)換通道的電場(chǎng)或液體流動(dòng)。在另一實(shí)施例中，控制器是一種數(shù)字邏輯設(shè)備，與伏特計(jì)電連接并設(shè)置為一旦檢測(cè)到所選電壓時(shí)自動(dòng)將堆積的分析物施加到分離通道區(qū)段。
分析物檢測(cè)器可將合適的分析物檢測(cè)器摻入到本發(fā)明系統(tǒng)中以檢測(cè)分析物。檢測(cè)器的類型和構(gòu)型取決于(例如)待檢測(cè)分析物的類型和/或通道設(shè)計(jì)?？蓪⒎治鑫餀z測(cè)器與邏輯裝置相連來(lái)儲(chǔ)存分析物的檢測(cè)圖形和評(píng)價(jià)分析結(jié)果。
本系統(tǒng)可檢測(cè)的分析物范圍可以很廣，許多是帶電分子或經(jīng)修飾而帶有電荷的分子。例如，感興趣分析物可以是蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、糖蛋白、離子等。雖然可用另一種機(jī)制，如大小排阻產(chǎn)生堆積，但在本發(fā)明的許多系統(tǒng)中，通過(guò)帶電分析物在電場(chǎng)中的遷移來(lái)驅(qū)動(dòng)堆積。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，不帶電的感興趣分析物可通過(guò)適當(dāng)?shù)卣{(diào)整pH或用帶電化學(xué)基團(tuán)衍生的分析物接受電荷進(jìn)行電泳堆積。
本系統(tǒng)中的分析物檢測(cè)器可以是本領(lǐng)域已知的任何合適的檢測(cè)器。例如，檢測(cè)器可以是熒光計(jì)、分光光度計(jì)、折光計(jì)、電導(dǎo)計(jì)等。用可得到的檢測(cè)器不能檢測(cè)的分析物常?？捎脴?biāo)記分子衍生而賦予其可檢測(cè)性?？砂仓脵z測(cè)器或使其聚焦監(jiān)測(cè)通道區(qū)段，包括交界點(diǎn)和/或分離通道區(qū)段中的分析物。檢測(cè)器可在分析物流出分離通道區(qū)段時(shí)，例如在腔室的檢測(cè)通道中，監(jiān)測(cè)這些分析物。
分析物檢測(cè)器可監(jiān)測(cè)通道位置，順序掃描通道長(zhǎng)度，或提供分離的分析物的連續(xù)圖像。在一個(gè)實(shí)施方式中，靜置的分光光度檢測(cè)器可以是聚焦于具體通道位置或交界點(diǎn)的光電倍增管。在另一實(shí)施方式中，分析物檢測(cè)器可以是聚焦于微通道的熒光計(jì)，通過(guò)安置在X-Y輸送機(jī)上的共聚焦顯微鏡物鏡順序掃描微流體裝置通道中分離的分析物。在另一實(shí)施方式中，分析物檢測(cè)器可以是能夠在多個(gè)分離腔室中一次提供許多分離圖像的電耦裝置(CCD)陣列。
可將分析物檢測(cè)器與邏輯裝置相連來(lái)儲(chǔ)存和評(píng)價(jià)分析結(jié)果。該系統(tǒng)的邏輯裝置可包括，例如圖表記錄器、晶體管、電路板、集成電路、中央處理器、計(jì)算機(jī)監(jiān)視器、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)等。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可包括，例如具有可輸入軟件系統(tǒng)的數(shù)據(jù)組和指令組的數(shù)字計(jì)算機(jī)硬件。該計(jì)算機(jī)可與檢測(cè)器相連，以評(píng)價(jià)分析物的存在、身份、數(shù)量和/或位置。該計(jì)算機(jī)可以是，例如PC(Intel x86或奔騰芯片-與DOS、OS2、WINDOWS操作系統(tǒng)相容)、MACINTOSHO、Power PC、或SUN工作站(與LINUX或UNIX操作系統(tǒng)相容)或技術(shù)人員已知的其它市售計(jì)算機(jī)。解釋傳感器信號(hào)或監(jiān)測(cè)檢測(cè)信號(hào)的軟件可從市場(chǎng)上獲得，或技術(shù)人員不難利用標(biāo)準(zhǔn)編程語(yǔ)言如Visualbasic、Fortran、Basic、Java等語(yǔ)言構(gòu)建。計(jì)算機(jī)邏輯系統(tǒng)可(例如)接受系統(tǒng)操作員的輸入，指定樣品標(biāo)識(shí)和啟動(dòng)分析、命令機(jī)器人系統(tǒng)將樣品轉(zhuǎn)移到系統(tǒng)加樣通道區(qū)段中、控制液體處理系統(tǒng)、控制檢測(cè)器的監(jiān)測(cè)、接受檢測(cè)器信號(hào)、制作標(biāo)準(zhǔn)樣品結(jié)果的回歸曲線、測(cè)定分析物的量和/或儲(chǔ)存分析結(jié)果。
應(yīng)理解，本文所述實(shí)施例和實(shí)施方式的目的只是說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)這些內(nèi)容作出的各種修改或改變，應(yīng)包括在本申請(qǐng)的精神和范圍內(nèi)以及所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
雖然為了闡明和理解的目的詳述了上述發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)明白，通過(guò)閱讀本文公開的內(nèi)容，可作出各種形式和細(xì)節(jié)的改變，而不背離本發(fā)明的真實(shí)范圍。例如，可以各種組合使用上述許多技術(shù)和裝置。
將本申請(qǐng)中所引用的所有發(fā)表物、專利、專利申請(qǐng)和/或其它文檔的內(nèi)容納入作為參考用于所有目的，其程度正如單獨(dú)地將各發(fā)表物、專利、專利申請(qǐng)和/或其它文檔納入作為參考用于所有目的。
權(quán)利要求
1.一種將樣品中感興趣的第一種成分與至少一種第二種成分相分離的方法，所述方法包括在第一通道區(qū)段中堆積第一種和第二種成分；使堆積的第二種成分流過(guò)在交叉點(diǎn)上與第一通道區(qū)段流體相連的第二通道區(qū)段；檢測(cè)該交叉點(diǎn)上或附近與第一種和/或第二種堆積成分相對(duì)應(yīng)的預(yù)先選定的電信號(hào)；和，沿在交叉點(diǎn)上流體相連的第三通道區(qū)段施加電場(chǎng)或壓差，當(dāng)檢測(cè)到預(yù)先選定的的電信號(hào)時(shí)，將堆積的第一種成分引入第三通道區(qū)段。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述堆積包括將先行電解質(zhì)緩沖液、拖尾電解質(zhì)緩沖液，和先行與拖尾電解質(zhì)溶液之間的間隔緩沖液引入第一通道區(qū)段，其中所述間隔電解質(zhì)溶液包含的離子在電場(chǎng)中的電泳遷移率介于先行電解質(zhì)和拖尾電解質(zhì)中所存在離子的遷移率之間。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括在第三通道區(qū)段中將堆積的第一種成分分離成各成分。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一和第三通道區(qū)段包含在一個(gè)連續(xù)通道的各通道部分中。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述流動(dòng)步驟包括產(chǎn)生跨所述第一和第二通道區(qū)段的電勢(shì)，以使所述堆積的第二種成分流入所述第二通道區(qū)段。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種成分包含熒光標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物，所述第二種成分包含熒光標(biāo)記的抗體。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種和第二種成分均帶電。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種和第二種成分都帶負(fù)電或都帶正電。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種和第二種成分中至少一種帶正電。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一種和第二種帶電成分選自核酸、蛋白質(zhì)、多肽、多糖和合成的聚合物。
11.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一種和第二種帶電成分包含電泳遷移率不同的標(biāo)記分子。
12.如權(quán)利要求3所述的方法，還包括檢測(cè)所述分離成分。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品是獲自體液或組織樣品的臨床樣品。
14.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述先行電解質(zhì)選自氯化物、溴化物、氟化物、磷酸鹽、乙酸鹽、硝酸鹽和二甲胂酸鹽。
15.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述拖尾電解質(zhì)選自HEPES、TAPS、MOPS(3-(4-嗎啉基)-1-丙烷磺酸)、CHES(2-(環(huán)己基氨基)乙烷磺酸)、MES(2-(4-嗎啉基)乙烷磺酸)、甘氨酸、丙氨酸和β-丙氨酸。
16.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述間隔緩沖液含有的離子在電場(chǎng)中的遷移率介于第一種和第二種成分的遷移率之間。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述第二種成分包含DNA-抗體偶聯(lián)物，所述第一種成分包含DNA-抗體偶聯(lián)物和分析物的復(fù)合物。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述檢測(cè)電信號(hào)包括檢測(cè)光學(xué)信號(hào)。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述檢測(cè)電信號(hào)包括檢測(cè)電壓信號(hào)。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述檢測(cè)電信號(hào)包括檢測(cè)電流信號(hào)。
21.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過(guò)一端與第一通道區(qū)段相交而另一端與第二通道區(qū)段相交的互聯(lián)通道區(qū)段，將所述第二通道區(qū)段流體連接于該交叉點(diǎn)，其中檢測(cè)該交叉點(diǎn)上或附近預(yù)先選定的的電信號(hào)包括檢測(cè)第二通道區(qū)段與互連通道區(qū)段交叉點(diǎn)的預(yù)先選定的的電信號(hào)。
22.一種將樣品中感興趣的第一種成分分離成各分離成分并檢測(cè)諸分離成分，同時(shí)使檢測(cè)期間來(lái)自樣品中至少一種第二種成分的干擾減至最小的方法，所述方法包括將樣品引入分離通道并施加沿分離通道長(zhǎng)度的電場(chǎng)，根據(jù)各成分的電泳遷移率將感興趣的第一種成分分離成各分離成分，同時(shí)將第二種成分堆積在分離通道中先行電解質(zhì)和拖尾電解質(zhì)溶液之間，和檢測(cè)諸分離成分。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述拖尾電解質(zhì)溶液含有間隔緩沖液，其中所述感興趣的第一種成分在分離通道中被夾在第一種成分兩側(cè)的間隔緩沖液之間。
24.一種微流體裝置，所述裝置包括具有ITP堆積通道區(qū)域和分離通道區(qū)域的主體通道；和至少第一個(gè)和第二個(gè)側(cè)通道，該側(cè)通道在ITP堆積通道區(qū)域與分離通道區(qū)域的交叉點(diǎn)共同流體連接區(qū)流體連接于主體通道，第一和第二側(cè)通道的末端分別在第一和第二液體貯存室中。
25.如權(quán)利要求24所述的微流體裝置，其特征在于，所述第一液體貯存室充滿了間隔緩沖液，所述第二液體貯存室充滿了先行電解質(zhì)溶液。
26.如權(quán)利要求24所述的微流體裝置，其特征在于，所述第一和第二側(cè)通道都在共同流體連接區(qū)與主體通道相交。
27.如權(quán)利要求24所述的微流體裝置，還包括連接通道，它的一端與共同流體連接區(qū)相交，另一端與第一和第二側(cè)通道相交。
28.如權(quán)利要求24所述的微流體裝置，其特征在于，共同流體連接區(qū)包括檢測(cè)區(qū)域，經(jīng)設(shè)置該區(qū)位于能與電壓檢測(cè)器和/或光學(xué)檢測(cè)器進(jìn)行傳感器通信的部位。
29.如權(quán)利要求28所述的微流體裝置，其特征在于，設(shè)置所述電壓檢測(cè)器和/或光學(xué)檢測(cè)器，以檢測(cè)所述檢測(cè)區(qū)域樣品中的第一種堆積成分和/或第二種堆積成分的電信號(hào)。
30.一種在微流體裝置中使樣品中的至少第一種和第二種成分在空間上相分離的方法，所述方法包括將含有間隔電解質(zhì)溶液的運(yùn)載體液體中的第一種和第二種成分引入微流體裝置的第一微流體通道中，然后用等速電泳將第一種和第二種成分堆積在先行電解質(zhì)溶液和拖尾電解質(zhì)溶液之間，其中間隔電解質(zhì)溶液包含的離子在電場(chǎng)中的電泳遷移率介于先行電解質(zhì)和拖尾電解質(zhì)中所存在離子的遷移率之間，所述間隔電解質(zhì)溶液包含下述間隔離子的至少一種MOPS、MES、壬酸、D-葡糖醛酸、乙酰水楊酸、4-乙氧基苯甲酸、戊二酸、3-苯基丙酸、苯氧基乙酸、半胱氨酸、馬尿酸、對(duì)羥基苯乙酸、異丙基丙二酸、衣康酸、檸康酸、3，5-二甲基苯甲酸、2，3-二甲基苯甲酸、對(duì)羥基肉桂酸和5-溴-2，4-二羥基苯甲酸，所述第一種成分包含DNA-抗體偶聯(lián)物，所述第二種成分包含DNA-抗體偶聯(lián)物與分析物的復(fù)合物。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述DNA-抗體偶聯(lián)物與分析物的復(fù)合物還可與第二抗體、Fab’抗體片段、受體、親和肽或適體進(jìn)一步混合。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，用熒光染料、酶、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物或磷光標(biāo)記物標(biāo)記所述DNA-抗體偶聯(lián)物。
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，用熒光染料、酶、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物或磷光標(biāo)記物標(biāo)記所述第二抗體、Fab’抗體片段、受體、親和肽或適體。
34.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述運(yùn)載體溶液包括Tris緩沖液或Bis-Tris緩沖液，以及以下添加成分中的至少一種BSA、吐溫或其它運(yùn)載體蛋白或表面活性劑。
35.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，用等速電泳進(jìn)行所述堆積是在第一微流體通道中所含濃度約為0.1-3.0％的凝膠中進(jìn)行。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述凝膠包括聚丙烯酰胺凝膠、聚乙二醇(PEG)、聚環(huán)氧乙烷(PEO)、蔗糖和表氯醇的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羥乙基纖維素(HEC)、聚-N，N-二甲基丙烯酰胺(pDMA)或瓊脂糖凝膠。
37.如權(quán)利要求30所述的方法，還包括在第一微通道或流體連接于第一微通道的第二微通道中通過(guò)毛細(xì)管電泳將第一種和/或第二種成分分離成其它的分離成分。
38.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述間隔電解質(zhì)溶液含有MES，pH約為8。
39.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述間隔電解質(zhì)溶液含有壬酸，pH約為8。
40.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述間隔電解質(zhì)溶液含有戊二酸，pH約為8。
41.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述間隔電解質(zhì)溶液含有D-葡糖醛酸，pH約為8。
42.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，用熒光染料、酶、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物或磷光標(biāo)記物標(biāo)記所述DNA-抗體偶聯(lián)物。
43.一種將樣品中感興趣的第一種成分與至少一種第二種成分相分離的方法，所述方法包括在第一通道區(qū)段中堆積第一種和第二種成分；使堆積的第二種成分流過(guò)在交叉點(diǎn)上與第一通道區(qū)段流體相連的第二通道區(qū)段；檢測(cè)該交叉點(diǎn)上或附近與第一種和/或第二種堆積成分相對(duì)應(yīng)的電壓信號(hào)圖形，其中，所述電壓信號(hào)圖形包括在時(shí)間上分開的至少三個(gè)不同電壓斜率轉(zhuǎn)變；和，沿與所述第一通道區(qū)段在交叉點(diǎn)上流體相連的第三通道區(qū)段施加電場(chǎng)或壓差，當(dāng)檢測(cè)到最后電壓斜率轉(zhuǎn)變時(shí)，將堆積的第一種成分引入第三通道區(qū)段。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述堆積包括將先行電解質(zhì)緩沖液、拖尾電解質(zhì)緩沖液，和先行與拖尾電解質(zhì)溶液之間的間隔電解質(zhì)緩沖液引入第一通道區(qū)段，其中所述間隔電解質(zhì)溶液包含的離子在電場(chǎng)中的電泳遷移率介于先行電解質(zhì)和拖尾電解質(zhì)中所存在離子的遷移率之間。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述間隔緩沖液包含以下間隔離子的至少一種MOPS、MES、壬酸、D-葡糖醛酸、乙酰水楊酸、4-乙氧基苯甲酸、戊二酸、3-苯基丙酸、苯氧基乙酸、半胱氨酸、馬尿酸、對(duì)羥基苯乙酸、異丙基丙二酸、衣康酸、檸康酸、3，5-二甲基苯甲酸、2，3-二甲基苯甲酸、對(duì)羥基肉桂酸和5-溴-2，4-二羥基苯甲酸，所述第一種成分包含DNA-抗體偶聯(lián)物，所述第二種成分包含DNA-抗體偶聯(lián)物與分析物的復(fù)合物。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述DNA-抗體偶聯(lián)物與分析物的復(fù)合物還可與第二抗體、Fab’抗體片段、受體、親和肽或適體進(jìn)一步混合。
47.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，用熒光染料、酶、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物或磷光標(biāo)記物標(biāo)記所述DNA-抗體偶聯(lián)物。
48.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，用熒光染料、酶、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物或磷光標(biāo)記物標(biāo)記所述第二抗體、Fab’抗體片段、受體、親和肽或適體。
49.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述間隔緩沖液包括Tris緩沖液或Bis-Tris緩沖液，以及以下添加成分中的至少一種BSA、吐溫或其它運(yùn)載體蛋白或表面活性劑。
50.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，通過(guò)等速電泳進(jìn)行堆積在第一微流體通道中所含的濃度約為0.1-3.0％的凝膠內(nèi)進(jìn)行。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述凝膠包括聚丙烯酰胺凝膠、聚乙二醇(PEG)、聚環(huán)氧乙烷(PEO)、蔗糖和表氯醇的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羥乙基纖維素(HEC)、聚-N，N-二甲基丙烯酰胺(pDMA)或瓊脂糖凝膠。
52.如權(quán)利要求44所述的方法，還包括在第一微通道或流體連接于第一微通道的第二微通道中通過(guò)毛細(xì)管電泳將第一種和/或第二種成分分成額外的分離成分。
53.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述間隔緩沖液含有MES，pH約為8。
54.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述間隔緩沖液含有壬酸，pH約為8。
55.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述間隔緩沖液含有戊二酸，pH約為8。
56.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述間隔緩沖液含有D-葡糖醛酸，pH約為8。
57.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述間隔緩沖液含有的離子在電場(chǎng)中的遷移率介于第一種和第二種成分的遷移率之間。
58.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，可用所述方法區(qū)分和比較各種AFP組分的不同水平。
全文摘要
本發(fā)明提供了在空間上使樣品中的至少第一種和第二種成分相分離的方法，在一個(gè)示范性實(shí)施方式中，該方法包括將含有間隔電解質(zhì)溶液的運(yùn)載體液體中的第一種和第二種成分引入微流體裝置的第一微流體通道中，然后用等速電泳將第一種和第二種成分堆積在先行電解質(zhì)溶液和拖尾電解質(zhì)溶液之間，其中間隔電解質(zhì)溶液包含的離子在電場(chǎng)中的電泳遷移率介于先行電解質(zhì)和拖尾電解質(zhì)中所存在離子的遷移率之間，所述間隔電解質(zhì)溶液包含下述間隔離子的至少一種MOPS、MES、壬酸、D－葡糖醛酸、乙酰水楊酸、4－乙氧基苯甲酸、戊二酸、3－苯基丙酸、苯氧基乙酸、半胱氨酸、馬尿酸、對(duì)羥基苯乙酸、異丙基丙二酸、衣康酸、檸康酸、3，5－二甲基苯甲酸、2，3－二甲基苯甲酸、對(duì)羥基肉桂酸和5－溴－2，4－二羥基苯甲酸，所述第一種成分包含DNA－抗體偶聯(lián)物，所述第二種成分包含DNA－抗體偶聯(lián)物與分析物的復(fù)合物。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1906483SQ200480032693
公開日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2004年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月23日
發(fā)明者C·帕克斯, P·克切佳, M·斯佩蒂, M·詹森, I·G·卡扎科娃, J·穆勒, 川端智久, 度邊光雄 申請(qǐng)人:卡鉗生命科學(xué)股份有限公司, 和光純藥工業(yè)株式會(huì)社