專利名稱：：用于產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及含有用于在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的多核苷酸組分和多肽組分的組合物。一方面，本發(fā)明組合物用于在組合物所給予的對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法。另一方面，本發(fā)明組合物用于產(chǎn)生抗多種毒株的廣泛免疫應(yīng)答的方法，所述毒株來源于選擇的微生物，例如人免疫缺陷病毒(HIV)的單一亞型或血清型，或多種亞型或血清型。
背景技術(shù)：
：獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)被認(rèn)為是當(dāng)代醫(yī)藥領(lǐng)域面臨的最大健康威脅之一。然而現(xiàn)在對該疾病還沒有醫(yī)治方法。在1983-1984年，三個研究團(tuán)體獨立鑒定了可疑的AIDS病原學(xué)因子。參見，例如Barre-Sinoussi等，(1983)Science220:868-871;Montagnier等，在《人T-細(xì)胞白血病病毒》(HumanT陽CellLeukemiaViruses)中所述，(Gallo，Essex和Gross編，1984);Vilmer等，(1984)TheLancet1:753;Popovic等，(1984)Science224:497-500;Levy等，(1984)Science225:840-842。這些分離物具有各種名稱，淋巴結(jié)病相關(guān)病毒(LAV)、III型人T-細(xì)胞親淋巴細(xì)胞病毒(HTLV-III)或AIDS相關(guān)逆轉(zhuǎn)錄病毒(ARV)。所有這些分離物是同一病毒的毒株，后來統(tǒng)一命名為人免疫缺陷病毒(HIV)。隨著導(dǎo)致AIDS的相關(guān)病毒的分離，起初稱為HIV的毒株現(xiàn)在命名為HIV-l，相關(guān)的病毒稱為HIV-2。參見，例如Guyader等，(1987)Nature326:662-669;Brun-Vezinet等，(1986)Science233:343-346;Clavel等，(1986)Nature324:691-695。已收集了大量有關(guān)HIV病毒的信息，然而迄今為止未鑒定到有效的疫苗。已檢測了用于疫苗開發(fā)的幾種靶位，包括HIV編碼的和Gag基因產(chǎn)物。Gag基因產(chǎn)物包括(但不限于)Gag-聚合酶和Gag-蛋白酶。Env基因產(chǎn)物包括(但不限于)單體gpl20多肽、寡聚gpl40多肽和gpl60多肽。Haas等(《當(dāng)代生物學(xué)》(Cwre"fB!'o/ogy)6(3):315-324，1996)提示HIV-1的選擇性密碼子使用似乎可解釋病毒蛋白質(zhì)合成低效的實質(zhì)性原因。Andre等(J.ViroL72(2):1497-1503，1998)描述了使用具有改變的密碼子使用的合成gpl20序列的DNA疫苗引發(fā)了增加的免疫應(yīng)答。Schneider等，(JVirol.71(7):4892-4903，1997)討論了位于Gag編碼序列和Gag蛋白酶編碼序列內(nèi)的抑制(或不穩(wěn)定)元件(INS)的失活。HIV-1的Gag蛋白是裝配病毒樣顆粒所需。HIV-1Gag蛋白參與病毒生命周期的許多階段，包括裝配、顆粒釋放后的病毒體成熟與病毒復(fù)制中的早期進(jìn)入后步驟。HIV-1Gag蛋白具有多種且復(fù)雜的作用(Freed，E.O，Virology251:1-15，1998)。Wolf等(PCT國際公布號WO96/30523，1996年10月3日公布；歐洲專利申請，公布號0449116Al，1991年10月2日公布)描述了改變的HIV-1的pr55(^g作為非感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒運載體的用途，特別是用于呈遞免疫學(xué)上重要的表位。Wang等(Virology200:524-534，1994)描述了用于研究HIVGag-P-半乳糖苷酶融合蛋白裝配進(jìn)病毒體的系統(tǒng)。他們描述了編碼HIVGag-卩-半乳糖苷酶融合蛋白的序列的構(gòu)建，這些序列在有HIVGag蛋白存在時的表達(dá)與這些蛋白質(zhì)裝配進(jìn)病毒顆粒。Shiver等(PCT國際公布號WO98/34640，1998年8月13日公布)描述了改變HIV-1(CAMl)Gag編碼序列來產(chǎn)生編碼HIVGag的合成DNA分子與HIVGag的修飾物。合成分子的密碼子是預(yù)定的宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子。近來，在免疫原性組合物中使用HIVEnv多肽已見描述。參見，1998年12月8日頒發(fā)給Hurwitz等的美國專利號5,846,546，該專利描述了含有至少4種不同的重組病毒的免疫原性組合物，每種病毒表達(dá)一種不同的HIVene變體；與1998年11月24日頒發(fā)給Vahlne等的美國專利號5,840,313，該專利描述對應(yīng)于HIV-1gpl20蛋白的表位的肽。此外，1999年3月2日頒發(fā)給Sia等的美國專利號5，876，731，該專利描述了抗HIV的候選疫苗，所述疫苗含有Gag的T細(xì)胞表位的氨基酸序列，而該氨基酸序列直接連接于HIV-1分離物的V3環(huán)蛋白的B細(xì)胞表位的氨基酸序列，該分離物含有序歹!]GPGR。PCT國際公布號WO/00/39302、WO/00/39303、WO/00/39304、WO/02/04493、WO/03/004657、WO/03/004620和WO/03/020876描述許多密碼子優(yōu)化的HIV多肽以及一些天然HIV序列。此外，描述了各種含有突變的HIV多肽。也描述了這些HIV多肽在疫苗組合物和免疫方法中的應(yīng)用。本發(fā)明提供用于產(chǎn)生抗選擇的微生物，例如一種病毒(如HIV-1)的多種亞型、血清型或毒株的免疫應(yīng)答的改進(jìn)組合物和方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物和方法。本發(fā)明的組合物含有至少兩種組分，其中每種組分提供一種不同但類似的多肽免疫原。多肽免疫原可直接以多肽的形式(包括多肽片段、修飾的形式、包囊的形式等)提供，或者在一優(yōu)選的實施方案中可以多核苷酸免疫原(包括編碼多肽免疫原的DNA和/或RNA)的形式間接提供。本發(fā)明的組合物可用在給予組合物的對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，其中免疫應(yīng)答直接抗一種選擇的微生物，例如病毒(如人免疫缺陷病毒(HIV))的多種亞型、血清型或毒株。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及含有可用于在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答(例如，產(chǎn)生中和抗體)的多核苷酸組分和多肽組分的組合物。本發(fā)明也考慮了含有至少兩種多核苷酸組分的其它實施方案，其中每種組分提供不同但類似的多肽免疫原；或者含有至少兩種多肽組分的其它實施方案，其中每種組分提供不同但類似的多肽免疫原。本發(fā)明的組合物可用于在給予組合物的對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，其中免疫應(yīng)答直接抗一種選擇的微生物，例如病毒(如人免疫缺陷病毒(HIV))的第一亞型或血清型，或抗多種亞型或血清型。在另一個實施方案中，每種免疫原可與一種病毒載體一起遞送，該載體可是相同或不同的載體。例如，作為免疫原的第一種類似的多肽可在多核苷酸中編碼，該多核苷酸由腺病毒載體遞送至對象。然后或同時，作為免疫原的第二種類似的多肽可由另一種腺病毒或甲病毒載體遞送。免疫原的遞送形式可變，前提是第一和第二種類似的免疫原來自同一亞型或不同HIV亞型的不同HIV毒株。本發(fā)明組合物和方法的多肽成分也可由病毒載體遞送。本發(fā)明的第一個方面包括用于在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物。這些組合物通常含有多核苷酸組分和多肽組分，其中所述多核苷酸組分基本上由編碼來源于第一血清型的第一HIV毒株的HIV免疫原性多肽的多核苷酸構(gòu)成；所述多肽組分含有一種或多種與所述多核苷酸組分編碼的多肽類似的HIV免疫原性多肽，前提是該多肽成分的至少一種HIV免疫原性多肽來源于第二種HIV毒株，其中所述第一種HIV毒株和所述第二種HIV毒株不同。該組合物的另一實施方案包括的前提是(i)多核苷酸組分不編碼來源于除第一亞型以外任何亞型的類似HIV免疫原性多肽，和(ii)多肽組分不含有來源于除第一亞型以外的任何亞型的類似HIV免疫原性多肽。其它實施方案考慮了第一和第二HIV毒株可來自不同亞型。這兩方面的多核苷酸組分均可含有至少一種天然多核苷酸。或者，多核苷酸組分可含有至少一種合成的多核苷酸。合成的多核苷酸可含有優(yōu)化用于在哺乳動物細(xì)胞(例如，人細(xì)胞)中表達(dá)的密碼子。多核苷酸組分可含有一種多核苷酸分子，或兩種或多種不同的多核苷酸分子，每種編碼一種或多種HIV多肽。多核苷酸組分可含有DNA或RNA或二者。HIV免疫原性多肽(多核苷酸組分編碼和/或含有多肽組分的)可是HIV包膜多肽。與野生型(即，天然存在的)HIV多肽相比，該HIV多肽可含有一個或多個突變，例如，就包膜蛋白而言，至少一種包膜多肽可在切割位點或糖基化位點中含有一個突變(在VI區(qū)域含有缺失或修飾，在V2區(qū)域含有缺失或修飾，在V3區(qū)域含有缺失或修飾，修飾以暴露與CCR5趨化因子共同受體結(jié)合的包膜結(jié)合區(qū)域，和它們的組合)。其它免疫原性HIV多肽包括(但不限于)Gag、Env、Pol、Prot、Int、RT、vif、vpr、vpu、tat、rev禾口nef多月太。HIV免疫原性多肽及其編碼序列的第一亞型可選自(但不限于)亞型A、亞型B、亞型C、亞型D、亞型E、亞型F、亞型G和亞型O以及任何已鑒定的CRF。除了免疫原性HIV多肽及其編碼序列，多核苷酸組分可編碼并且多肽組分可含有一種或多種抗原多肽，該抗原多肽包括并非來源于HIV-1編碼序列的抗原多肽。多核苷酸組分還可含有編碼一種或多種與在選擇的宿主細(xì)胞中表達(dá)相容的控制元件的序列，其中所述控制元件操作性連接于編碼HIV免疫原性多肽的多核苷酸。示范性控制元件包括(但不限于)轉(zhuǎn)錄啟動子(例如，CMV、CMV+內(nèi)含子A、SV40、RSV、HIV-Ltr、MMLV-ltr和金屬硫蛋白)、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄終止信號、聚腺苷酸化序列、用于優(yōu)化翻譯啟動的序列、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點和翻譯終止序列。多核苷酸組分可含有本文所述的其它成分(例如，運載體、載體序列、控制序列等)。多肽組分可含有本文所述的其它成分(例如，運載體、佐劑、免疫增強(qiáng)劑等)。本發(fā)明也包括在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法。方法的一個實施方案提供了用于在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的本發(fā)明組合物，例如上述的。在與多核苷酸在對象中表達(dá)相容的條件下，將一種或多種基因遞送載體給予對象來產(chǎn)生編碼的HIV免疫原性多肽，所述載體含有組合物的多核苷酸組分的多核苷酸。或者，給予對象產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物的多肽組分。所述一種或多種基因遞送載體和多肽組分，例如可同時給予或依次給予。多核苷酸組分可含有本文所述的其它成分(例如，運載體、載體序列、控制序列等)。多肽組分可含有本文所述的其它成分(例如，運載體、佐劑、免疫增強(qiáng)劑等)并且可以是可溶或顆粒狀的。一種或多種基因遞送載體可含有，例如非病毒和/或病毒載體。示范性非病毒載體包括(但不限于)質(zhì)粒或表達(dá)盒。示范性病毒載體包括(但不限于)逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、甲病毒、痘病毒、皰疹病毒、腺伴隨病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、麻疹病毒、腺病毒載體或其它已知的病毒載體。病毒載體可是不同的血清型亞型或種類。一種或多種基因遞送載體可使用顆粒載體，例如包被在金或鎢顆粒上遞送，或者包被顆?？墒褂没驑屵f送至對象，或者PLG顆?？山?jīng)電穿孔或其它方式遞送?；蛘撸环N或多種基因遞送載體包囊在脂質(zhì)體制劑中。一種或多種基因載體可經(jīng)，例如肌肉內(nèi)、粘膜內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)、經(jīng)皮、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、口服、靜脈內(nèi)或這些方法的組合來給予。本發(fā)明方法的對象通常是哺乳動物，例如人。本發(fā)明方法產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可是體液和/或細(xì)胞的。在一個實施方案中，免疫應(yīng)答導(dǎo)致在對象中產(chǎn)生抗來源于第一HIV亞型的抗多種毒株或多種亞型的廣泛中和抗體。在另一個實施方案中，免疫應(yīng)答產(chǎn)生了抗來源于不同亞型的多種毒株的廣泛中和抗體。鑒于本文的內(nèi)容，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員易于實施本發(fā)明的這些和其它實施方案。附圖簡述圖1A-1D描述了HIV亞型C8_5—TVLCZA的核苷酸序列(SEQIDNO:l;本文稱為TV1)。各種區(qū)域示于表l。圖2A-2E描述了各種HIV分離物(B型-SF162、亞型C-TV1.8—2、亞型C-TV1.8—5、亞型C-TV2.12-5/1、亞型C-MJ4、印度亞型C-93IN101、亞型A-Q2317、亞型D-92UG001、亞型E-cm235和共有序列)的Env多肽的對比情況。箭頭表示在P和/或橋連片層區(qū)域中的缺失和/或截短的示范性區(qū)域。表示N-連接的糖基化位點，其中一個或多個該位點可修飾(例如，缺失的和/或突變的；一個這種可能的突變是N—O的突變)。圖3是顯示HIVEnv多肽的以下形式之間關(guān)系的示意圖gpl60、gpl40、gpl20禾ngp41。圖4表示抗HIV-1亞型B毒株SF162的中和抗體活性數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)通過許多不同的免疫方法在家兔中獲得。圖5表示抗HIV-1亞型C毒株TV1的中和抗體活性數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)通過許多不同的免疫方法在家兔中獲得。圖6表示命名為gpl40.modSF162.delV2的多核苷酸的核苷酸序列。圖7表示命名為gpl40.mut7.modSF162.delV2的多核苷酸的核苷酸序列。圖8表示命名為gpl40mod.TVl.delV2的多核苷酸的核苷酸序列。圖9表示命名為gpl40mod.TVl.mut7.delV2的多核苷酸的核苷酸序列。圖10表示命名為gpl60mod.Q23-17的多核苷酸的核苷酸序列(基于來自肯尼亞GenBank登錄AF004885的HIV-1亞型A的分離物Q23-17的優(yōu)化序列)。圖11表示命名為gpl60mod.98UA0116的多核苷酸的核苷酸序列(基于來自烏克蘭GenBank登錄AF413987的HIV-1亞型A的分離物98UA0116的優(yōu)化序列)。圖12表示命名為gpl60mod.SE8538的多核苷酸的核苷酸序列(基于來自坦桑尼亞GenBank登錄AF069669的HIV-1亞型A的分離物SE8538的優(yōu)化序列)。圖13表示命名為gpl60mod.UG031的多核苷酸的核苷酸序列(基于亞型A人免疫缺陷病毒1的原病毒DNA，完全基因組，克隆pUG031-Al，GenBank登錄AB098330的優(yōu)化序列，)。圖14表示命名為gpl60mod.92UG001的多核苷酸的核苷酸序列(基于亞型D人免疫缺陷病毒1型的完全原病毒基因組，毒株92UG001,GenBank登錄AJ320484的優(yōu)化序列，)。圖15表示命名為gpl60mod.94UG114的多核苷酸的核苷酸序列(基于來自烏干達(dá)GenBank登錄U88824的HIV-1亞型D的分離物94UG114的優(yōu)化序列)。圖16表示命名為gpl60mod.ELI的多核苷酸的核苷酸序列(基于亞型D人免疫缺陷病毒1型的分離物ELI，GenBank登錄K03454的優(yōu)化序列)。圖17表示命名為gpl60mod.93IN101的多核苷酸的核苷酸序列(基于印度亞型C人免疫缺陷病毒1型亞型C基因組RNA，GenBank登錄AB023804的優(yōu)化序列)。圖18表示命名為gpl60mod.cm235.V3con的多核苷酸的核苷酸序列(基于HIV-1亞型E分離物的優(yōu)化序列)。圖19表示命名為gpl60partialmod.cm235.V3con的多核苷酸的核苷酸序列(基于HIV-1亞型E分離物的優(yōu)化序列)。圖20表示SF162Erw蛋白在免疫的黑猩猩中產(chǎn)生的結(jié)合抗體滴度的ELISA數(shù)據(jù)。圖21表示用HIVMNenvDNA(作為引發(fā))和HIVSF162env蛋白(作為加強(qiáng))免疫的黑猩猩的淋巴增殖數(shù)據(jù)。圖22表示用不同的亞型B毒株成分(腺病毒和HIV-MN的env/rev)和SF162的gpA140V2的本發(fā)明所述引發(fā)加強(qiáng)方案的圖示。圖23(A-B)表示針對HIV-1SF162Env蛋白的血清結(jié)合抗體滴度與針對HIVIIIBenv的血清結(jié)合抗體的動力學(xué)。圖24(A-D)表示誘導(dǎo)針對HlVgpl20的交叉進(jìn)化支結(jié)合抗體的數(shù)據(jù)。圖25(A-B)表示用復(fù)制型和非復(fù)制型腺病毒引發(fā)后誘導(dǎo)中和抗體的結(jié)果。圖26表示用進(jìn)化支B成分免疫后誘導(dǎo)針對進(jìn)化支C的中和抗體的數(shù)據(jù)。圖27表示用復(fù)制型和非復(fù)制型腺病毒作為引發(fā)成分誘導(dǎo)交叉反應(yīng)性ADCC活性的數(shù)據(jù)。圖28表示誘導(dǎo)針對亞型BHIV包膜的抗原特異性淋巴增殖應(yīng)答的數(shù)據(jù)。圖29表示用復(fù)制型或非復(fù)制型腺病毒引發(fā)后誘導(dǎo)IFN-Y分泌細(xì)胞的數(shù)據(jù)。發(fā)明詳述除非另有指出，實施本發(fā)明要采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和藥理學(xué)的常規(guī)方法。這種技術(shù)完整地解釋于參考文獻(xiàn)。參見，例如《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington'sPharmaceuticalSciences),第18版，(Easton，Pennsylvania:MackPublishingCompany,1990);《酶學(xué)方法》(MethodsInEnzymology)(S.Colowick禾口N.Kaplan編，AcademicPress,Inc.);《免疫學(xué)實驗手冊》(HandbookofExperimentalImmunology),I-IV巻(D.M.Weir禾卩C.C.Blackwell編，1986，BlackwellScientificPublications);Sambrook等，《分子克隆實驗室手冊》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(第二版，1989);《精編分子生物學(xué)實驗指南》(ShortProtocolsinMolecularBiology),第四版(Ausubel等，1999，JohnWiley&Sons);《分子生物學(xué)技術(shù)實驗室精讀課程》(MolecularBiologyTechniques:AnIntensiveLaboratoryCourse),(Ream等編，1998，AcademicPress);《PCR(生物技術(shù)叢書導(dǎo)論)》PCR(IntroductiontoBiotechniquesSeries),第二版，(Newton和Graham編，1997，SpringerVerlag)。如同每份單獨的專利、出版物、序列引用或?qū)＠暾執(zhí)貏e且獨立地出于所有目的全文納入引為參考一樣，本說明書中引用的所有專利、出版物、序列引用和專利申請均引入本文作為參考。除非文中另有明確指出，本說明書中使用的單數(shù)形式的"一個"、"一種"和"該"均包括其復(fù)數(shù)形式。因此，例如"一個抗原"包括兩個或多個這種物質(zhì)的混合物。1.0.0定義以下術(shù)語將用于描述本發(fā)明并如下定義。本文使用的"合成的"序列指其表達(dá)如本文所述，例如通過密碼子取代、改變活性和/或抑制序列的失活來修飾的編碼HIV多肽的多核苷酸。本文使用的"野生型"或"天然"序列指基本上是天然發(fā)現(xiàn)的編碼多肽的多核苷酸，例如在HIV分離物中發(fā)現(xiàn)的Gag、Pol、Vif、Vpr、Tat、Rev、Vpu、Env和/或Nef編碼序列，如SF162;SF2;AF110965;AF110967;AF110968;AF110975;MJ4(亞型C，Ndung'u等，(2001)J.Virol.75:4964-4972);亞型B-SF162;亞型C-TV1.8—2(8—2—TV1—C.ZA);亞型C-TV1.8—5(8—5—TV1—C.ZA);亞型C-TV2.12-5/1(12-5—1—TV2—C.ZA);亞型C-MJ4;印度亞型C-93IN101;亞型A-Q2317;亞型D-92UG001;亞型E-cm235;來自肯尼亞的HIV-1亞型A分離物Q23-17，GenBank登錄AF004885;來自烏克蘭的HIV-1亞型A分離物98UA0116,GenBank登錄AF413987;來自坦桑尼亞的HIV-1亞型A分離物SE8538,GenBank登錄AF069669;亞型A人免疫缺陷病毒1的原病毒DNA，完全基因組，克隆pUG031-Al，GenBank登錄AB098330;亞型Dl型人免疫缺陷病毒的完全原病毒基因組，毒株92UG001,GenBank登錄AJ320484;來自烏干達(dá)的HIV-1亞型D的分離物94UG114,GenBank登錄U88824;亞型D人免疫缺陷病毒1型的分離物ELI，GenBank登錄K03454與印度亞型C人免疫缺陷病毒1型的亞型C基因組RNA，GenBank登錄AB023804。HIV基因組的各種區(qū)域及相對于8—5一TV1一C.ZA(圖1-A-1D)的編號示于表1。因此，術(shù)語"pol"指一種或多種以下多肽聚合酶(p6Pol);蛋白酶(prot);逆轉(zhuǎn)錄酶(p66RT或RT);RNA酶(pl5RNAseH)和/或整合酶(p31Int或Int)。鑒定任何選擇的HIV分離物(例如，一種亞型中的毒株，或來源于不同亞型的毒株)的基因區(qū)域可由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員基于本文提供的指導(dǎo)和本領(lǐng)域已知的信息來進(jìn)行，例如通過進(jìn)行相對于8—5_TV1—C.ZA(圖1A-1D所示的多核苷酸序列)的核苷酸和/或多肽對比，或?qū)Ρ绕渌阎腍IV分離物，例如亞型B分離物與基因區(qū)域(例如，SF2，GenBank登錄號K02007;SF162,GenBank登錄號M38428)和亞型C分離物與基因區(qū)域(例如，GenBank登錄號AF110965和GenBank登錄號AF110975)。本文使用的術(shù)語"病毒樣顆粒"或"VLP"指來源于以下要討論幾種病毒的任一種的非復(fù)制型病毒殼。VLP—般由一種或多種病毒蛋白組成，例如(但不限于)稱為衣殼、包被、殼、表面和/或包膜蛋白的蛋白，或是來源于這些蛋白的形成顆粒的多肽。蛋白在合適的表達(dá)系統(tǒng)中重組表達(dá)后VLP可自發(fā)形成。產(chǎn)生特定VLP的方法是本領(lǐng)域已知的，下文將更完全地討論。病毒蛋白重組表達(dá)后可使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)，例如電子顯微鏡、X-射線晶體學(xué)等檢測VLP的存在。參見，例如Baker等，Biophys.J.(1991)60:1445-1456;Hagensee等，J.Virol.(1994)68:4503-4505。VLP可通過密度梯度離心和/或特征性密度顯帶來鑒定?；蛘撸稍诖龣z測VLP制劑的玻璃化含水樣品上進(jìn)行冷凍電子顯微術(shù)并在合適的曝光條件下記錄圖像。來源于特定病毒蛋白的"顆粒形成多肽"指能在有利于VLP形成的條件下形成VLP的全長或接近全長的病毒蛋白及其片段，或具有內(nèi)部缺失的病毒蛋白。因此，多肽可含有全長序列、片段、截短的和部分序列以及該參考分子的類似物和前體形式。因此只要多肽保留形成VLP的能力，該術(shù)語可指序列的缺失、添加和取代。由于包被蛋白在病毒分離物之間經(jīng)常改變，所以該術(shù)語包括特定多肽的天然變體。如果蛋白保留形成VLP的能力，則該術(shù)語也包括在參考蛋白質(zhì)中非天然存在的缺失、添加和取代。優(yōu)選的取代是在本質(zhì)上保守性的，即發(fā)生在與其側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)的取代。具體地說，氨基酸通常分為4個家族(l)酸性一天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性一賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性一丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不荷電的極性(氨基酸)一甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時也分類為芳族氨基酸。術(shù)語"HIV多肽"指表現(xiàn)出與天然HIV多肽(例如，Gag、Env、Prot、Pol、RT、Int、vif、vpr、vpu、tat、rev、nef和/或其組合)具有序列同源性和/或是功能性的氨基酸序列。HIV多肽表現(xiàn)出的功能的非限制性例子包括用作免疫原(例如，產(chǎn)生體液和/或細(xì)胞的免疫應(yīng)答)，用于診斷(例如，與合適的抗體結(jié)合用于ELISA或其它免疫測定)和/或表現(xiàn)出一種或多種與野生型或合成HIV多肽相關(guān)的生物活性的多肽。例如，本文使用的術(shù)語"Gag多肽"可指結(jié)合一種或多種抗Gag抗體；引發(fā)體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答和/或表現(xiàn)出形成顆粒能力的多肽。"抗原"指一種或多種剌激宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生體液和/或細(xì)胞的抗原特異性應(yīng)答的表位(線形的、構(gòu)象的或二者)。該術(shù)語與術(shù)語"免疫原"可互換使用。B-細(xì)胞表位通常含有至少約5個氨基酸，但也可少達(dá)約3-4個氨基酸。T-細(xì)胞表位，例如CTL表位可含有至少約7-9個氨基酸，輔助T-細(xì)胞表位至少約12-20個氨基酸。一種表位通常含有約7-15個氨基酸，例如9、10、12或15個氨基酸。術(shù)語"抗原"指兩種亞單位抗原(即，從與抗原天然相連的完整生物體分開和離散的抗原)以及殺死的、減毒的或滅活的細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲或其它微生物。本文使用的抗原定義也可包括抗體，例如抗獨特型抗體或其片段與模擬抗原或抗原決定簇的合成肽模擬表位。類似地，在體內(nèi)表達(dá)抗原或抗原決定簇的寡聚核苷酸或多核苷酸，例如在基因治療或DNA免疫應(yīng)用中的，也包括在本文抗原的定義內(nèi)。此外，表達(dá)抗原或免疫原的寡聚核苷酸或多核苷酸可由病毒載體遞送。出于本發(fā)明的目的，抗原(例如多核苷酸編碼抗原和多肽包含抗原)可來源于具有多種亞型、血清型或菌株變異的任何微生物(例如，病毒、細(xì)菌、寄生蟲、真菌等)。該術(shù)語也包括任何各種腫瘤抗原。此外，出于本發(fā)明的目的，"抗原"指相比天然序列含有修飾的蛋白質(zhì)，所述修飾例如缺失、添加和取代(一般本質(zhì)上是保守的)，前提是該蛋白質(zhì)保留引發(fā)本文定義的免疫應(yīng)答的能力。這些修飾可是有意為之，例如通過定點誘變，或可是隨機(jī)的，例如通過產(chǎn)生抗原的宿主的突變。針對抗原或組合物的"免疫應(yīng)答"是對象中產(chǎn)生的針對感興趣組合物中存在的抗原的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。出于本發(fā)明的目的，"體液免疫應(yīng)答"指由抗體分子介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而"細(xì)胞免疫應(yīng)答"是由T-淋巴細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。細(xì)胞免疫的一個重要方面涉及細(xì)胞溶解性T-細(xì)胞("CTL")介導(dǎo)的抗原特異性免疫應(yīng)答。CTL具有肽抗原特異性，該肽抗原的存在與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)編碼并表達(dá)在細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)相關(guān)。CTL協(xié)助誘導(dǎo)和促使胞內(nèi)微生物的破壞或使受這種微生物感染的細(xì)胞裂解。細(xì)胞免疫的另一方面涉及輔助T-細(xì)胞介導(dǎo)的抗原特異性應(yīng)答。輔助T-細(xì)胞協(xié)助刺激功能物對準(zhǔn)非特異性效應(yīng)物細(xì)胞的活性，該效應(yīng)物細(xì)胞抗在其表面展示MHC分子相關(guān)肽抗原的細(xì)胞。"細(xì)胞免疫應(yīng)答"也指細(xì)胞因子、趨化因子和其它這種分子的產(chǎn)生，這些分子由激活的T-細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞，包括來源于CD4+和CD8+T-細(xì)胞的細(xì)胞產(chǎn)生。引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答的組合物或疫苗可通過將MHC相關(guān)抗原呈遞到細(xì)胞表面來致敏脊椎動物對象。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答直接位于或接近在其表面呈遞抗原的細(xì)胞。此外，可產(chǎn)生抗原特異性T-淋巴細(xì)胞來進(jìn)一步保護(hù)免疫的宿主。特定抗原刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力可通過許多試驗測定，例如通過淋巴增殖(淋巴細(xì)胞激活)試驗、CTL細(xì)胞毒性細(xì)胞試驗或通過測定對致敏對象中的抗原特異的T-淋巴細(xì)胞。這種試驗是本領(lǐng)域熟知的。參見，例如Erickson等，//mm柳o/.(1993)111:4189-4199;Doe等，/附mw"o/.(1994)21:2369-2376。檢測T-細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的最新方法包括檢測T-細(xì)胞群產(chǎn)生的胞內(nèi)細(xì)胞因子或細(xì)胞因子分泌，或通過檢測表位特異性T-細(xì)胞(例如，通過四聚物技術(shù))(MeMichael，A丄和O'Callaghan，C.A的綜述，/Exp.Med187(9)1367-1371，1998;Mcheyzer-Williams，M.G.、等，/wmw"o/.iev.150:5-21，1996;Lalvani，A等，/五xp.M^/.186:859-865，1997)。所以，本文使用的免疫應(yīng)答可是刺激抗體產(chǎn)生的應(yīng)答(例如，通過與毒素和病原體結(jié)合阻斷細(xì)菌毒素和病原體，如病毒進(jìn)入細(xì)胞和復(fù)制的中和抗體，通常是保護(hù)細(xì)胞免遭感染和破壞)。感興趣的抗原也可引發(fā)CTL的產(chǎn)生。因此，免疫應(yīng)答可包括以下一種或多種作用通過B-細(xì)胞產(chǎn)生抗體；和/或激活直接特異性針對抗原或存在于感興趣組合物或疫苗中的抗原的抑制T-細(xì)胞和/或記憶細(xì)胞和/或效應(yīng)T-細(xì)胞。這些應(yīng)答可用于中和傳染性，和/或介導(dǎo)抗體-補體，或抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)來為免疫的宿主提供保護(hù)。這種應(yīng)答可使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)免疫測定和中和試驗來確定。(參見，例如Montefiori等，(1988)C/z'"M/ctoWo/.26:231-235;Dreyer等，(1999)爿/ASiw//w/w7"rovz'nw^(1999)15(17):1563-1571)。哺乳動物的先天免疫系統(tǒng)也通過激活Toll樣受體和免疫細(xì)胞上的類似受體分子來識別并響應(yīng)于病原生物體的分子特征。先天免疫系統(tǒng)激活后，各種非適應(yīng)性免疫應(yīng)答細(xì)胞得到激活，例如產(chǎn)生各種細(xì)胞因子、淋巴因子和趨化因子。由先天免疫應(yīng)答激活的細(xì)胞包括單核細(xì)胞和漿細(xì)胞樣譜系(MDC，PDC)的不成熟和成熟樹突細(xì)胞，以及y、S、a和(3T細(xì)胞和B細(xì)胞等。因此，本發(fā)明也考慮了涉及先天和適應(yīng)性應(yīng)答的免疫應(yīng)答。"免疫原性HIV多肽"是當(dāng)將免疫原性多肽給予實驗室測試動物(例如，小鼠、豚鼠、恒河猴、黑猩猩、狒狒等)時，能引發(fā)抗一種或多種天然HIV多肽的免疫應(yīng)答的多肽。"免疫原性組合物"是含有免疫原性分子的組合物，當(dāng)將該組合物給予對象可導(dǎo)致在對象中產(chǎn)生針對感興趣的抗原分子的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。免疫原性組合物可直接引入受體，例如通過注射、吸入、口服、鼻內(nèi)和粘膜(例如，直腸內(nèi)或陰道內(nèi))給藥。"亞單位疫苗"指包含一種或多種選擇的抗原(但不是全部抗原)來源于感興趣病原體的抗原或與之同源的組合物，所述病原體例如是病毒、細(xì)菌、寄生蟲或真菌。這種組合物基本上不含完整的病原體細(xì)胞或病原性顆粒，或這種細(xì)胞或顆粒的裂解物。因此，"亞單位疫苗"可從至少部分純化(優(yōu)選基本上純化的)的病原體的免疫原性多肽或其類似物制備。因此，獲得亞單位疫苗中的抗原的方法包括標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)、重組產(chǎn)生或合成產(chǎn)生。"基本上純化的"通常指分離一種物質(zhì)(化合物、多核苷酸、蛋白質(zhì)、多肽、多肽組合物)，使得該物質(zhì)占其所處樣品的大多數(shù)百分比。樣品中基本上純化的組分通常包含樣品的50%、優(yōu)選80%-85%、更優(yōu)選90-95%。純化感興趣的多核苷酸和多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，例如包括離子交換層析、親和層析和按照密度沉降。"多核苷酸編碼序列"或"編碼"選擇的多肽的多核苷酸序列是當(dāng)置于合適的調(diào)節(jié)序列(或"控制元件")控制下可在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄(就DNA而言)并翻譯(就mRNA而言)為多肽的核酸分子。編碼序列的邊界由起始密碼子(例如，在或接近5'末端)和轉(zhuǎn)錄終止密碼子(例如，在或接近3'末端)決定。編碼序列可含有(但不限于)病毒的cDNA、原核生物或真核生物mRNA、病毒的基因組DNA序列或原核生物DNA和甚至合成的DNA序列。示范性編碼序列是用于本發(fā)明的密碼子優(yōu)化的病毒多肽編碼序列。本發(fā)明的多核苷酸序列的編碼區(qū)域可由本領(lǐng)域技術(shù)人員鑒定，例如可通過翻譯多核苷酸的所有3個框和鑒定對應(yīng)于所編碼多肽的框(例如，本發(fā)明合成的nef多核苷酸編碼nef衍生的多肽)容易地鑒定。轉(zhuǎn)錄終止序列可位于編碼序列的3，端。典型的"控制元件"包括(但不限于)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，例如啟動子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄終止信號和聚腺苷酸化序列；與翻譯調(diào)節(jié)子，例如優(yōu)化翻譯起始的序列，如Shine-Dalgarno(核糖體結(jié)合位點)序列、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)(例如ECMVIRES)、Kozak-型序列(即，例如位于編碼序列的5'端用于優(yōu)化翻譯的序列，如位于起始ATG前(5')的GCCACC)、前導(dǎo)序列、翻譯起始密碼子(例如，ATG)和翻譯終止序列(例如，位于編碼序列后(3')的TAA或優(yōu)選TAAA)。在某些實施方案中，一種或多種翻譯調(diào)節(jié)或起始序列(例如，前導(dǎo)序列)來源于野生型翻譯起始序列，即調(diào)節(jié)天然狀態(tài)中編碼區(qū)域的翻譯的序列。使用本文所述方法修飾的野生型前導(dǎo)序列也可用于本發(fā)明。啟動子包括誘導(dǎo)型啟動子(操作性連接于啟動子的多核苷酸序列的表達(dá)由分析物、輔因子、調(diào)節(jié)蛋白等誘導(dǎo))、阻抑型啟動子(操作性連接于啟動子的多核苷酸序列的表達(dá)由分析物、輔因子、調(diào)節(jié)蛋白等誘導(dǎo))和組成型啟動子。"核酸"分子或"多核苷酸"可含有(但不限于)原核生物序列、真核生物mRNA、真核生物mRNA的cDNA、真核生物(例如，哺乳動物)的基因組DNA序列和甚至合成的DNA序列。該術(shù)語也包括含有任何已知的DNA和RNA堿基類似物的序列。在提及本發(fā)明的多核苷酸時，在特別述及"DNA"的例子中，應(yīng)該明白許多這種實施方案同樣需要RNA。"操作性連接"指元件的排列，其中所述成分的配置使得可行使其正常功能。因此，當(dāng)存在合適的酶時，操作性連接于編碼序列的給定啟動子能實現(xiàn)編碼序列的表達(dá)。啟動子無需與編碼序列毗連，只要其指導(dǎo)該序列表達(dá)的作用。因此，例如啟動子序列和編碼序列之間可存在插入的未翻譯但轉(zhuǎn)錄的序列，該啟動子序列仍認(rèn)為是"操作性連接"于編碼序列。按照其來源或操作，本文用于描述核酸分子的"重組體"表示基因組、cDNA、半合成或合成來源的多核苷酸，所述多核苷酸(l)不與其天然相連的多核苷酸的全部或部分相連；和/或(2)與除和其天然相連的多核苷酸以外的多核:11酸相連。用于蛋白質(zhì)或多肽的術(shù)語"重組體"指經(jīng)重組多核苷酸表達(dá)產(chǎn)生的多肽。"重組宿主細(xì)胞"、"宿主細(xì)胞""細(xì)胞"、"細(xì)胞系"、"細(xì)胞培養(yǎng)物"和其它表示作為單細(xì)胞實體培養(yǎng)的原核微生物或真核細(xì)胞系的術(shù)語可互換使用，表示可用作或已用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA受體的細(xì)胞，并且包括感染的原始細(xì)胞的后代。由于隨機(jī)或有意的突變，應(yīng)該理解的是單一親代細(xì)胞的后代在形態(tài)、基因組或總DNA補體上無需與原始親代完全相同。該定義所指的后代包括由相關(guān)特性，例如編碼所需肽的核苷酸序列的存在表征為與親代足夠相似的親代細(xì)胞的后代，并且上述術(shù)語包括這些后代。測定氨基酸序列"相似性"的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。總體上，"相似性"表示在適當(dāng)位置兩個或多個多肽的確切的氨基酸對氨基酸比較，所述位置的氨基酸相同或具有相似的化學(xué)和/或物理特性，例如荷電或疏水性。然后可確定所比較的多肽序列之間稱為"相似性百分比"的術(shù)語。測定核酸和氨基酸序列同一性的技術(shù)也是本領(lǐng)域熟知的并且包括測定編碼氨基酸序列(通常經(jīng)CDNA中間體)的基因的mRNA的核苷酸序列，測定所編碼的氨基酸序列與將其與第二條氨基酸序列比較?？傮w上，"同一性"指兩條多核苷酸或多肽序列各自精確的核苷酸-對-核苷酸或氨基酸-對-氨基酸的對應(yīng)性。兩條或多條多核苷酸序列可通過測定它們的"同一性百分比"來比較。同樣，兩條或多條氨基酸序列通過測定它們的"同一性百分比"來比較。無論核酸或肽序列，兩條序列的同一性百分比通常描述為兩條對比序列之間確切的匹配數(shù)除以較短序列的長度并乘以100。核酸序列的近似對比由Smith和Waterman,AdvancesinAppliedMathematics2:482-489(198l)的局部同源性算法提供。使用Dayhoff("蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖譜集"(AtlasofProteinSequencesandStructure),M.O.Dayhoff編，增干U5.3:353-358，NationalBiomedicalResearchFoundation，Washington，D.C.，USA)開發(fā)、Gribskov(Nucl.AcidsRes.14(6):6745-6763(1986))標(biāo)準(zhǔn)化的評分矩陣可拓展該算法用于肽序列。GeneticsComputerGroup(Madison，WI)在他們的BestFit實用程序應(yīng)用軟件執(zhí)行該算法用于核酸和肽序列。該方法的默認(rèn)參數(shù)描述于《威斯康星序列分析軟件包程序手冊》(WisconsinSequenceAnalysisPackageProgramManual),第8版(1995)沐源于GeneticsComputerGroup,Madison,WI)。其它用于計算序列之間同一性或相似性百分比的合適程序通常是本領(lǐng)域已知的。例如，特定核苷酸序列與參考序列的同一性百分比可使用默認(rèn)計分表和6個核苷酸位置的間隔罰分的Smith和Waterman同源性算法來確定。本
發(fā)明內(nèi)容中建立同一性百分比的另一種方法是使用JohnF.Collins和ShaneS.Sturrok開發(fā)的、愛丁堡大學(xué)版權(quán)所有、IntelliGenetics，Inc.(MountainView,CA)分銷的MPSRCH程序包。這套程序包可使用Smith-Waterman算法，其中計分表使用默認(rèn)參數(shù)(例如，間隔開放罰12分、間隔延伸罰1分、一個間隔罰6分)。產(chǎn)生的"匹配值"數(shù)據(jù)反映了"序列同一性"。其它計算序列間同一性或相似性百分比的合適程序一般是本領(lǐng)域公知的，例如也可以默認(rèn)參數(shù)使用的對比程序BLAST。例如，在一個優(yōu)選的實施方案中，可用使用以下核酸檢索的默認(rèn)參數(shù)的BLASTN和BLASTP:遺傳密碼=標(biāo)準(zhǔn)；過濾器=無；鏈=兩條；截斷值-60;預(yù)期值=10;矩陣BLOSUM62;描述=50條序列；排序=高分；數(shù)據(jù)庫=非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDS翻譯+Swiss蛋白+Spupdate+PIR;(ii)多肽檢索。這些程序的細(xì)節(jié)參見以下因特網(wǎng)的網(wǎng)址http:〃www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。例如，可使用Smith-Waterman相似性檢索算法(例如，位于網(wǎng)址www.ncbi.nlm.gov，或商業(yè)來源，例如TimeLogicCorporation,CrystalBay,NV)進(jìn)行蛋白質(zhì)相似性和同一性百分比序列檢索。例如，在一個優(yōu)選的實施方案中，Smith-Waterman相似性檢索可使用以下默認(rèn)參數(shù)，例如權(quán)重矩陣=BLOSUM62.MAA;開放間隔罰分=-12;延伸間隔罰分=-2;框架罰分=0;査詢形式-FASTA/PEARSON;查詢類型-AA;査詢檢索=1;查詢設(shè)置=CGI—ld82ws301bde.seq;目標(biāo)類型AA;目標(biāo)設(shè)置二NRPdbgsaa;顯著性-GAPPED;最大評分=30;最大對比=20;報道閾值=評分=1;對比閾值=20。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地確定用于給定序列的合適檢索參數(shù)，基于SmithWaterman的示范性優(yōu)選參數(shù)如上所示。例如，檢索參數(shù)可依所研究的序列而變。因此，就本發(fā)明的多核苷酸序列而言，本文公布的多核苷酸序列的長度對選擇的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索并與基本上相同長度的序列作比較來確定同一性百分比。例如，本發(fā)明的一個代表性實施方案包括含有X毗連核苷酸的分離的多核苷酸，其中(i)相對于本文所述的一條或多條序列或其片段的Y毗連核苷酸，X毗連核苷酸具有至少約一個選擇的同一性百分比水平，和(ii)出于檢索的目的，使X=Y，其中Y是長度確定的選擇的參考多核苷酸(例如，長度從15個核苷酸到選擇的全長序列中存在的核苷酸數(shù)目)。本發(fā)明的序列可包括序列的片段，例如約15個核苷酸到本文所述全長序列中存在的核苷酸數(shù)目，包括上述范圍內(nèi)的所有整數(shù)值。例如，本發(fā)明多核苷酸序列的片段可為30-60個核苷酸、60-10個核苷酸、120-240個核苷酸、240-480個核苷酸、480-1000個核苷酸，和在其間的所有整數(shù)值。當(dāng)本發(fā)明的序列用作對，例如序列數(shù)據(jù)庫的檢索序列時，本文所述合成的多核苷酸包括與本文公布的合成的多核苷酸序列具有約80%-100%、大于80-85%、優(yōu)選大于90-92%、更優(yōu)選大于95°/。、最優(yōu)選大于98%到100%序列同一性(包括所述范圍內(nèi)的所有整數(shù)值)的相關(guān)多核苷酸序列。兩個核酸片段被認(rèn)為進(jìn)行本文所述的"選擇性雜交"。兩個核酸分子之間的序列同一性的程度影響這種分子之間雜交的效率和強(qiáng)度。部分相同的核酸序列至少可部分抑制完全相同的序列與靶分子的雜交。對完全相同的序列雜交的抑制可使用本領(lǐng)域熟知的雜交試驗(例如，Southern印跡、Northern印跡、溶液雜交等，或者參見Sambrook等，同上或Ausubel等，同上)來評估。這種試驗可使用各種選擇性程度來進(jìn)行，例如使用從低到高的嚴(yán)謹(jǐn)性條件。如果使用低嚴(yán)謹(jǐn)性條件，可使用二級探針來評估非特異性結(jié)合的缺乏，該探針缺乏甚至是部分程度的序列同一性(例如，與靶分子具有小于約30%序列同一性的探針)，以致無非特異性結(jié)合時，二級探針不與靶雜交。當(dāng)使用基于雜交的檢測系統(tǒng)時，選擇與靶核酸序列互補的核酸探針，然后通過選擇合適的條件使探針與靶序列互相"選擇性雜交"或結(jié)合以形成雜交分子。能在"中等嚴(yán)謹(jǐn)性"條件下與耙序列選擇性雜交的核酸分子通常在可檢測靶核酸序列的條件下雜交，該靶核酸序列至少約10-14個核苷酸長，與選擇的核^探針具有至少約70%的序列同一性。嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件通?？蓹z測至少約10-14個核苷酸長，與選擇的核酸探針的序列具有大于約90-95%序列同一性的靶核酸序列。如本領(lǐng)域已知的，可確定用于探針/靶(序列)雜交的雜交條件，其中探針和耙具有一定程度的序列同一性(參見，例如《核酸雜交一種實用方法》(NucleicAcidHybridization:APracticalApproach),B.D.Hames禾口S丄Higgins編，(1985)Oxford;Washington,DC;IRLPress)。就雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性條件而言，本領(lǐng)域熟知利用許多等價條件通過改變，例如以下因素來建立特定的嚴(yán)謹(jǐn)性探針和靶序列的長度與性質(zhì)、各種序列的堿基組成、鹽和其它雜交溶液成分的濃度、在雜交溶液中存在或不存在阻斷劑(例如，甲酰胺、葡聚糖硫酸酯和聚乙二醇)、雜交反應(yīng)溫度和時間參數(shù)以及不同的洗滌條件。按照以下的本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法選擇特定雜交條件(參見，例如Sambrook等，同上或Ausubel等，同上)。如果第一多核苷酸具有與第二多核苷酸的一個區(qū)域、其cDNA、其補體相同的堿基對序列，或者如果第一多核苷酸與第二多核苷酸的一個區(qū)域、其cDNA、其補體表現(xiàn)出實質(zhì)性序列同一性，其中序列同一性如上述確定，則第一多核苷酸"衍生自"第二多核苷酸。實質(zhì)性的序列同一性通常約90%或更大，優(yōu)選約95%或更大，更優(yōu)選約98%或更大。如果第一多肽由衍生自第二多核苷酸的第一多核苷酸編碼，或者第一多肽具有與第二多肽或其部分相同的氨基酸序列，或者第一多肽與第二多肽或其部分表現(xiàn)出上述確定的實質(zhì)性的序列同一性，則第一多肽"衍生自"第二多肽。實質(zhì)性的序列同一性通常約90%或更大，優(yōu)選約95%或更大，更優(yōu)選約98%或更大?？傮w上，如果一個病毒多肽(i)由某病毒的一個多核苷酸(病毒多核苷酸)的相同開放讀框編碼，或者(ii)與上述該病毒的一個肽表現(xiàn)出實質(zhì)性的序列同一性，則這個病毒多肽"衍生自"該病毒的特定多肽(病毒多肽)。如果一個多肽衍生自HIV亞型成員中的多肽，衍生自該亞型成員中的多核苷酸編碼的多肽，由該亞型成員中的多核苷酸衍生而來的多核苷酸編碼，或者衍生自由該亞型成員中的多核苷酸衍生而來的多核苷酸編碼的多肽，則該多肽"衍生自"該HIV亞型。如果一條多肽衍生自HIV毒株成員中的多肽，衍生自該毒株成員中的多核苷酸編碼的多肽，由該毒株成員中的多核苷酸衍生而來的多核苷酸編碼，或者衍生自由該毒株成員中的多核苷酸衍生而來的多核苷酸編碼的多肽，則該多肽"衍生自"該HIV毒株。"類似多肽"指由來自不同多核苷酸來源的同一生物體的同一基因編碼的多肽，或衍生自由它們編碼的多肽。在本
發(fā)明內(nèi)容中，不同的多核苷酸來源可是不同的亞型、不同的血清型或不同的毒株。因此，例如B亞型HIV的Gag多肽或許是亞型CHIV的Gag多肽的類似多肽，或者來源于第一HIV-1亞型、血清型或毒株的包被多肽是來源于第二HIV-1亞型、血清型或毒株的包被多肽的類似多肽?？蓙碓从诓煌琀IV-1亞型或毒株的類似多肽類型的例子包括均被認(rèn)為是類似多肽的包被多肽gp41、gpl20、gpl40和gp160。此外，這種類似多肽的每一種可含有不同的改變或突變，例如來源于HIV-1包被基因的類似多肽包括(但不限于)gp41多肽、gpl20多肽、gpl40多肽、gpl60多肽、缺失Vl環(huán)一部分的gp140、缺失V2環(huán)一部分的gapl40多肽、缺失V3環(huán)一部分的gapl40多肽、具有突變的蛋白酶切割位點的gpl40多肽、缺失VI環(huán)一部分的gpl60、缺失V2環(huán)一部分的gpl60多肽、缺失V3環(huán)一部分的gpl60多肽和具有突變的蛋白酶切割位點的gpl60多肽。本
發(fā)明內(nèi)容中使用的"基因"是與遺傳功能相關(guān)的遺傳核酸(病毒基因組、染色體、質(zhì)粒等)中的核苷酸序列?；蚴窃谏矬w的基因組中占據(jù)特定物理位置("基因座"或"遺傳座")的遺傳單位，例如一種含有多核苷酸序列(如，HIV-1的RNA序列或原病毒HIV-1的DNA序列)的生物體。基因可編碼所表達(dá)的產(chǎn)物，例如多肽或多核苷酸(如，tRNA)?；蛘?，基因可限定用于特定情況湖能的基因組位置，例如蛋白質(zhì)和域核酸(例如，5'LTR)的結(jié)合，其中基因不編碼表達(dá)的產(chǎn)物。HIV-1基因的例子包括(但不限于》Gag、Env、Pol(prot、RNA酶、Int)、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu。基因可含有編碼序列，例如多肽編碼序列，與非編碼序列，例如啟動子序列、聚腺苷酸化序列、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(如增強(qiáng)子序列)。許多真核生物基因具有被"內(nèi)含子"間斷的"外顯子"(編碼序列)。在某些情況中，一種基因可與另一基因分享序列(例如，重疊基因)。應(yīng)該注意到在常見的群體中，野生型基因可含有多種普遍的形式，這些普遍的形式在互相有關(guān)的序列中具有改變。這些變異稱為"多態(tài)性"或"等位變異"。"純化的多核苷酸"指基本上不含該多核苷酸天然相連的蛋白質(zhì)的感興趣多肽或其片段，例如含有少于約50%、優(yōu)選少于約70%、更優(yōu)選少于約90%的天然相連的蛋白質(zhì)。純化感興趣的多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，包括例如用破膜試劑破壞含有多核苷酸的細(xì)胞并通過離子交換層析、親和層析和依密度沉降分離多核苷酸和蛋白質(zhì)。"核酸免疫"指為了體內(nèi)表達(dá)抗原、多種抗原、表位或多種表位而將編碼一種或多種選擇的抗原的核酸分子引入宿主細(xì)胞。核酸分子可直接引入對象，例如通過注射、吸入、口服、鼻內(nèi)和粘膜施用等；或者可離體引入取自宿主的細(xì)胞。后一種情況中，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再次引入對象從而在那里引發(fā)抗核酸分子編碼的抗原的免疫應(yīng)答。"基因轉(zhuǎn)移"或"基因遞送"指可靠地將感興趣的核酸(即，DNA或RNA)插入宿主細(xì)胞的方法或系統(tǒng)。這種方法可導(dǎo)致非整合轉(zhuǎn)移的DNA的瞬時表達(dá)、轉(zhuǎn)移的復(fù)制子(例如，附加體)的染色體外復(fù)制和表達(dá)。或轉(zhuǎn)移的遺傳物質(zhì)整合入宿主細(xì)胞的基因組DNA?；蜻f送表達(dá)載體包括(但不限于)來源于以下病毒的載體腺病毒、腺伴隨病毒、甲病毒、皰疹病毒、麻疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、痘病毒、水皰病毒和牛痘病毒。當(dāng)用于免疫時，這種基因遞送表達(dá)載體可稱為疫苗或疫苗載體。術(shù)語"轉(zhuǎn)染"用來指細(xì)胞攝入外來DNA。當(dāng)外源性DNA引入細(xì)胞膜內(nèi)，則該細(xì)胞被"轉(zhuǎn)染"。許多轉(zhuǎn)染技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。參見，例如Graham等，(1973)Fz>o/ogy，12:456;Sambrook等，(1989)《分子克隆，實驗室手冊》(MolecularCloning,alaboratorymanual),冷泉港實驗室，紐約；Davis等，(1986)"分子生物學(xué)基礎(chǔ)方法"(BasicMethodsinMolecularBiology),Elsevier和Chu等，(1981)U:197。這種技術(shù)可用于將一種或多種外源性DNA部分引入合適的宿主細(xì)胞。該術(shù)語指穩(wěn)定的與瞬時的攝入遺傳物質(zhì)，并且包括攝入肽或抗體連接的DNA。"載體"能轉(zhuǎn)移基因序列至靶細(xì)胞(例如，病毒載體、非病毒載體、顆粒載體和脂質(zhì)體)。"載體構(gòu)建物"、"表達(dá)載體"和"基因轉(zhuǎn)移載體"指能引導(dǎo)感興趣的基因表達(dá)并可用于將基因序列轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的任何核酸構(gòu)建物。因此，該術(shù)語包括克隆和表達(dá)載體以及病毒載體。"慢病毒載體"和"重組慢病毒載體"指攜帶并且在某些實施方案中能引導(dǎo)感興趣的核酸分子表達(dá)的核酸構(gòu)建物。慢病毒載體含有至少一個轉(zhuǎn)錄啟動子/增強(qiáng)子或基因座定義元件，或通過其它方式，例如交替剪接、核RNA輸出、信使的轉(zhuǎn)錄后修飾或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后修飾來控制基因表達(dá)的其它元件。這種載體構(gòu)建物也必須含有包裝信號，長末端重復(fù)序列(LTRS)或其部分，適合于所用逆轉(zhuǎn)錄病毒的正鏈和負(fù)鏈引物結(jié)合位點(如果這些在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中已不存在)。重組慢病毒載體也可任選含有引導(dǎo)聚腺苷酸化、選擇標(biāo)記(例如Neo、TK、潮霉素、腐草霉素、組氨醇或DHFR)以及一個或多個限制性位點和翻譯終止序列的信號。例如，這種載體通常含有5'LTR、tRNA結(jié)合位點、包裝信號、第二鏈RNA合成的起點和3'LTR或其部分。本發(fā)明使用的"慢病毒載體顆粒"指攜帶至少一種感興趣基因的慢病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒也可含有選擇標(biāo)記。重組慢病毒能將其遺傳物質(zhì)(RNA)逆轉(zhuǎn)錄為DNA并在感染時將該遺傳物質(zhì)摻入宿主細(xì)胞的DNA。慢病毒載體顆?？删哂新《景?、非慢病毒包膜(例如，ampho或VSV-G包膜)或嵌合包膜。"甲病毒載體"、"重組甲病毒載體"和"甲病毒復(fù)制子載體"指攜帶在某些實施方案中能引導(dǎo)感興趣的核酸分子表達(dá)的核酸構(gòu)建物。甲病毒載體含有至少一個轉(zhuǎn)錄啟動子/增強(qiáng)子或通過其它方式，例如交替剪接、核RNA輸出、信使的轉(zhuǎn)錄后修飾或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后修飾來控制基因表達(dá)的其它元件。這種載體構(gòu)建物也必須含有包裝信號和甲病毒復(fù)制識別序列。重組甲型病毒載體也可任選含有引導(dǎo)聚腺苷酸化、選擇標(biāo)記(例如Neo、TK、潮霉素、腐草霉素、組氨醇或DHFR)以及一個或多個限制性位點和翻譯終止序列的信號。甲病毒載體通常含有甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的編碼序列、包裝位點、復(fù)制識別序列和能引導(dǎo)感興趣的核酸分子表達(dá)的序列。"表達(dá)盒"指能引導(dǎo)感興趣的序列或基因表達(dá)的組件。表達(dá)盒通常含有操作性連接于感興趣的多核苷酸或基因的啟動子。也可有其它控制元件。本文所述的表達(dá)盒可包含于質(zhì)粒構(gòu)建物中。除了表達(dá)盒的組分以外，質(zhì)粒構(gòu)建物也可含有細(xì)菌的復(fù)制起點、一個或多個選擇標(biāo)記、允許質(zhì)粒構(gòu)建物以單鏈DNA存在的信號(例如，MB的復(fù)制起點)、多克隆位點和"哺乳動物"的復(fù)制起點(例如，SV40或腺病毒的復(fù)制起點)。"包裝細(xì)胞"指含有生產(chǎn)感染性重組病毒載體所需的元件，但缺少重組病毒載體的細(xì)胞。這種包裝細(xì)胞通常含有能表達(dá)引入載體的復(fù)制和包裝所需蛋白質(zhì)的一個或多個表達(dá)盒，例如就慢病毒載體而言，表達(dá)盒編碼Gag、pol和env蛋白，就甲病毒載體而言，表達(dá)盒編碼甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白。"產(chǎn)生細(xì)胞"或"載體生產(chǎn)細(xì)胞"指含有產(chǎn)生重組病毒載體顆粒所需的所有元件的細(xì)胞。將"自殺基因"(例如，藥物敏感性基因)轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞使得該細(xì)胞對相對正常細(xì)胞無毒的化合物或組合物敏感。Moolten，F(xiàn)丄.(1994)Omcer77zer.丄:279-287。自殺基因的例子是單純皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)、細(xì)胞色素P450(Manome等，(1996)2:513-520)、人脫氧胞苷激酶(Manome等，(1996)WaZweMec/zW"e2(5):567-573)和細(xì)菌酶胞嘧啶脫氨酶(Dong等，(1996)//wmaw77zera/w2:713-720)。表達(dá)這些基因的細(xì)胞被賦予對相對無毒前體藥物的作用的敏感性，所述物質(zhì)有更昔洛韋(HSV-tk)、環(huán)磷酰胺(細(xì)胞色素P4502B1)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(人脫氧胞苷激酶)或5-氟胞苷(細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶)。Culver等，(1992)5We恥e2M:1550-1552;Huber等，(1994)Prac.A^/.爿cadSc/.USAii:8302-8306。"選擇標(biāo)記"或"報道標(biāo)記"指包含于基因轉(zhuǎn)移載體中，無治療活性的核苷酸序列，而是含有這些標(biāo)記更便于制備、生產(chǎn)、鑒定或測試基因轉(zhuǎn)移載體。"特異性結(jié)合劑"指一對特異性結(jié)合分子的一員，其中一個分子通過化學(xué)和/或物理方式特異地結(jié)合第二個分子。特異性結(jié)合劑的一個例子是直接抗選擇的抗原的抗體。"對象"指脊索動物亞門的任一成員，包括(不限于)人和其它靈長類，包括非人靈長類，如狒狒、恒河猴、黑猩猩和其它猿類和f，；農(nóng)畜，如牛、綿羊、豬、山羊和馬；家養(yǎng)哺乳動物，如狗和貓；實驗室動物，如小鼠、大鼠、兔和豚鼠；鳥，包括家養(yǎng)、野生和狩獵野禽，如雞、火雞和其它家禽，鴨、鵝等。該術(shù)語不指明具體的年齡。所以，包括了成年的和新生的個體。由于所有這些脊椎動物的免疫系統(tǒng)相似地操作，上述系統(tǒng)可用于以上任一種脊椎動物種類。"亞型"指基于遺傳水平(即，核酸序列)的相似性將類似的生物體系統(tǒng)發(fā)生分類成組。這種組稱為"亞型"。在HIV領(lǐng)域中，LosAlamos國家實驗室是確定具體病毒分離物的這種類似性和分類成亞型的著名且廣為接受的中心組織。本文所指的HIV亞型由LosAlamos國家實驗室確定。(參見，例數(shù)據(jù)庫，LosAlamos國家實驗室，LosAlamos,新墨西哥；Myers等，"人逆轉(zhuǎn)錄病毒與艾滋病"(HumanRetrovirusesandAids),19卯，LosAlamos,新墨西哥LosAlamos國家實驗室)。一種亞型也可稱為一種"進(jìn)化支"。"血清型"指基于抗體交叉反應(yīng)性的類似生物體的分類。"菌株"指基于核酸序列的差異來自該亞型中但分化自同一亞型的其它成員的生物體。"藥學(xué)上可接受的"或"藥理學(xué)上可接受的"指非生物的或其它不理想的材料，即材料可以制劑或組合物給予個體而不會導(dǎo)致任何不理想的生物學(xué)效應(yīng)或以有害的方式與該組合物所含的任何組分相互作用。"生理pH"或"生理范圍內(nèi)的pH"指約7.0-8.0范圍的pH(包括端點)，更常見的是約7.2-7.6的范圍(包括端點)。本文使用的"治療"指以下任一種情況(i)以常規(guī)疫苗的形式來預(yù)防感染或再次感染，(ii)緩解或消除癥狀，或(iii)基本上或完全消除可疑的病原體。治療可是預(yù)防性(感染前)或治療性(感染后)地施行。"共同給藥"指給予多種組合物、組合物的組分或分子。因此，共同給藥包括經(jīng)同一或不同給藥途徑同時給予或依次給予。共同給藥方案的非限制性例子包括核酸和多肽的共同給藥；不同核酸的共同給藥(例如，本文所述的不同表達(dá)盒和/或不同的基于遞送載體)；和不同多肽的共同給藥(例如，不同HIV多肽和/或不同的佐劑)。該術(shù)語也包括共同給予的分子或組合物中的一種的多次給藥(例如，多次給予一種或多種本文所述的表達(dá)盒，然后一次或多次給予含有多肽的組合物)。當(dāng)分子或組合物依次遞送時，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本文的指導(dǎo)可容易地確定每次給藥之間的時間。"T淋巴細(xì)胞"或"T細(xì)胞"是不產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞，該細(xì)胞構(gòu)成免疫系統(tǒng)的細(xì)胞介導(dǎo)臂的一部分。T細(xì)胞來源于從骨髓遷移至胸腺的不成熟的淋巴細(xì)胞，在那里該不成熟的淋巴細(xì)胞在胸腺激素的引導(dǎo)下經(jīng)歷成熟過程。成熟的淋巴細(xì)胞在胸腺中快速大量分裂。基于其識別和結(jié)合特異性抗原的能力，成熟的T細(xì)胞成為免疫活性的。但抗原與淋巴細(xì)胞表面受體結(jié)合時觸發(fā)免疫活性T細(xì)胞的激活。2.0.0實施本發(fā)明的方式在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)該理解的是本發(fā)明不受具體制劑或方法參數(shù)的限制，因為這些參數(shù)當(dāng)然是可變的。也應(yīng)該理解的是，本文使用的術(shù)語僅是出于說明本發(fā)明的具體實施方案并非限制性的。雖然許多類似的或等價于本文所述的方法和材料可用于實踐本發(fā)明，但本文所述的方法和材料最佳。2.1.0發(fā)明概述本發(fā)明涉及使用包含免疫原性多核苷酸和多肽的組合物在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合方法。在本發(fā)明一個總的方面，本發(fā)明的多核苷酸組分基本上由一種編碼來源于一種微生物(例如，病毒、細(xì)菌、真菌等)的免疫原性多肽的多核苷酸組分和多肽組分組成，該多肽組分含有一種或多種與所述多核苷酸組分編碼的多肽類似的免疫原性多肽，前提是該多肽組分的至少一種免疫原性多肽所衍生自微生物的亞型、血清型或菌株不同于該多核苷酸組分編碼的免疫原性多肽的編碼序列。在本文中，基本上由編碼免疫原性多肽的一種多核苷酸組成的多核苷酸組分指在組合物中存在一種編碼免疫原性多肽的多核苷酸。該多核苷酸組合物可含有其它組分，例如免疫增強(qiáng)子、免疫調(diào)節(jié)組分、載體序列(例如，病毒的或非病毒的)、運載體、顆粒、賦形劑、表達(dá)控制序列等。此外，多核苷酸組分可含有其它組分，例如增強(qiáng)免疫應(yīng)答的分子(如，脂質(zhì)體、PLG、顆粒、明礬等)。此外，多肽組分可含有其它組分，例如免疫增強(qiáng)劑、免疫調(diào)節(jié)組分、佐劑、運載體、顆粒、賦形劑等。在該組合物的其它實施方案中，多核苷酸組分不編碼來源于除第一亞型以外任何亞型的類似HIV免疫原性多肽，多肽組分不含有來源于除第一亞型以外任何亞型的類似HIV免疫原性多肽。在本發(fā)明第二個總的方面，多核苷酸組分含有兩種或多種多核苷酸序列，該序列含有兩種或多種來源于一種微生物(例如，病毒、細(xì)菌、真菌等)的類似免疫原性多肽的編碼序列，其中該免疫原性多肽中至少兩種的編碼序列來源于該微生物的不同亞型、血清型或菌株，多肽組分含有一種或多種與所述多核苷酸組分編碼的多肽類似的免疫原性多肽，前提是(i)如果該多肽組分提供少于該多核苷酸組分編碼的類似免疫原性多肽的數(shù)目，則該多肽組合物的免疫原性多肽可來源于與該多核苷酸組分提供的免疫原性多肽相同和/或不同的亞型、血清型或菌株，或(ii)如果該多肽組分提供相同或大于該多核苷酸組分編碼的類似免疫原性多肽的數(shù)目，則該多肽組合物的免疫原性多肽可來源于至少一種與該多核苷酸組分提供的免疫原性多肽不同的亞型、血清型或菌株。多核苷酸組合物可含有其它組分，例如免疫增強(qiáng)子、免疫調(diào)節(jié)組分、載體序列(例如，病毒的或非病毒的)、運載體、顆粒、賦形劑、表達(dá)控制序列等。此外，多核苷酸組分可含有其它組分，例如增強(qiáng)免疫應(yīng)答的分子(如，脂質(zhì)體、PLG、顆粒、明礬等)。此外，多肽組分可含有其它組分，例如免疫增強(qiáng)劑、免疫調(diào)節(jié)組分、佐劑、運載體、顆粒、賦形劑等。本文參考人免疫缺陷病毒l(HIV-l)來舉例說明本發(fā)明。根據(jù)說明書的指導(dǎo)，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可將本發(fā)明的指導(dǎo)應(yīng)用于其它合適的生物體，例如微生物。例如，本發(fā)明的組合物和方法可利用編碼HIV包膜多肽的多核苷酸以及HIV包膜多肽(如，類似于該多核苷酸編碼的HIV包膜蛋白)來誘導(dǎo)廣泛和/或強(qiáng)烈的抗各種HIV毒株的中和活性。雖然參考HIV病毒進(jìn)行了描述，本發(fā)明的組合物和方法可應(yīng)用于具有各種亞型、血清型和/或毒株變異的其它病毒科，例如包括(但不限于)其它非-HIV逆轉(zhuǎn)錄病毒(如HTLV-1，2)、嗜肝DNA病毒(如HBV)、皰疹病毒(如HSV-1、2、CMV、EBV、水痘帶狀皰疹病毒等)、黃病毒(如HCV、黃熱、蜱傳性腦炎、圣路易斯腦炎、西尼羅河病毒等)、冠狀病毒(如SARS)、副粘病毒(如PIV、RSV、麻疹病毒等)、流感病毒、細(xì)小RNA病毒、呼腸孤病毒(如輪狀病毒)、沙粒病毒、彈狀病毒、乳多空病毒、細(xì)小病毒、腺病毒、等革熱病毒、布尼亞病毒(如漢坦病毒)、杯狀病毒(如諾沃克病毒)、絲狀病毒(如埃博拉病毒、馬爾堡病毒)。HIV病毒的多樣性和可突變性是對HIV疫苗開發(fā)的挑戰(zhàn)。HIV持續(xù)在全球蔓延，高達(dá)4千2百萬的人受HIV感染("UNAIDS有關(guān)全球HIV/AIDS流行的報道"(UNAIDSReportontheglobalHIV/AIDSepidemic),UNAIDS，日內(nèi)瓦，瑞士(2002年12月))。這些人受到不同的HIV亞型(和/或毒株)感染。感染性HIV亞型(和/或毒株)通常是地域依賴性的。本發(fā)明一方面涉及提供能誘導(dǎo)廣泛且強(qiáng)烈的抗各種HIV亞型、血清型和/或毒株的中和抗體來治療感染、降低感染風(fēng)險、減少傳播、減少疾病的表現(xiàn)和/或預(yù)防不同地區(qū)出現(xiàn)的HIV感染的組合物和方法。所進(jìn)行的支持本發(fā)明的實驗證實了本文所述組合方法誘導(dǎo)強(qiáng)烈而廣泛HIV中和活性的用途。這些方法包括聯(lián)合用各種編碼來源于不同亞型、血清型或毒株的HIV多肽的多核苷酸來免疫和用來源于不同亞型、血清型或毒株的HIV多肽來免疫。本發(fā)明還包括用這種多核苷酸和多肽的各種劑量和免疫方案來免疫。因此，在本發(fā)明的第一具體方面，本發(fā)明的多核苷酸組分基本上由一種編碼HIV免疫原性多肽的多核苷酸和多肽組分組成，該多肽組分含有一種或多種與所述多核苷酸組分編碼的多肽類似的免疫原性多肽，前提是該多肽組分的至少一種HIV免疫原性多肽所衍生自的亞型、血清型或菌株不同于該多核苷酸組分編碼的免疫原性多肽的編碼序列。在本文中，"基本上由...組成"指在多核苷酸組合物中存在一種編碼一種HIV免疫原性多肽的多核苷酸序列。該多核苷酸組合物可含有其它組分，例如免疫增強(qiáng)子、免疫調(diào)節(jié)組分、載體序列(例如，病毒的或非病毒的)、運載體、顆粒、賦形劑、表達(dá)控制序列等。在本發(fā)明的一個實施方案中，該多核苷酸組分編碼的HIV免疫原性多肽來源于亞型B，該多肽組分的至少一種編碼HIV免疫原性多肽的序列來源于亞型C。在另一個實施方案中，該多核苷酸組分編碼的HIV免疫原性多肽來源于第一亞型的第一毒株(例如，第一亞型B毒株)，該多肽組分的至少一種編碼HIV免疫原性多肽的序列來源于第一亞型的第二毒株(例如，第二亞型B毒株)。在一個實施方案中，來源于不同HIV亞型、血清型或毒株的多核苷酸和多肽用于引發(fā)和加強(qiáng)，即編碼免疫原性HIV多肽的多核苷酸經(jīng)多核苷酸遞送用于免疫(例如，引發(fā))，來源于不同HIV亞型、血清型或毒株的類似的免疫原性HIV多肽用于免疫(例如，加強(qiáng))。例如，一種多核苷酸分子用于核酸免疫，其中該多核苷酸分子編碼一種HIVgpl40包膜多肽，該多肽(i)來源于南非HIV亞型C分離物/毒株，(ii)為在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子，和(iii)通過刪除V2環(huán)而突變的(例如，PCT國際公布號WO/02/04493的實施例所述的gpl40mod.TVl.delV2)。該核酸免疫之后使用一種HIVgpl40包膜蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)加強(qiáng)免疫，該蛋白(i)來源于北美HIV亞型B分離物/毒株，和(ii)通過刪除V2環(huán)而突變的(例如，PCT國際公布號WO/00/39302的實施例所述的gpl40mut7.modSF162.delV2的蛋白質(zhì)產(chǎn)物)?？墒褂霉丫坌问降陌さ鞍?例如，PCT國際公布號WO/00/39302和美國專利號6,602,705中所述的o-gpl40)。本發(fā)明在該方面的一個實施方案含有用于在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物，該組合物包含含有編碼第一HIV免疫原性多肽的第一多核苷酸的多核苷酸組分；和含有第二HIV免疫原性多肽的多肽組分，其中所述第一和第二免疫原性HIV多肽來源于不同的HIV亞型、血清型或毒株，和(ii)所述第一和第二免疫原性多肽編碼類似的HIV多肽。在本發(fā)明的一個實施方案中，含有多核苷酸組合物的類似的HIV免疫原性多肽編碼序列與含有本發(fā)明多肽組分的HIV免疫原性多肽可來源于HIV的不同亞型，在另一個實施方案中，它們可來源于同一HIV亞型的不同HIV毒株。本發(fā)明在這方面的另一個實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸和多肽組分用于廣泛地產(chǎn)生抗用CCR5共同受體進(jìn)入細(xì)胞的病毒毒株的中和抗體。例如，用于在哺乳動物中產(chǎn)生中和抗體的組合物可含有基本上由一種編碼HIV免疫原性多肽的多核苷酸組成的多核苷酸組分，該免疫原性多肽來源于使用CCR5共同受體進(jìn)入細(xì)胞的HIV毒株;和含有一種或多種HIV免疫原性多肽的多肽組分，該免疫原性多肽來源于使用CCR5共同受體進(jìn)入細(xì)胞的HIV毒株且類似于所述多核苷酸組分編碼的多肽；前提是(i)如果該多肽組分僅有一種HIV免疫原性多肽，則該多肽組分的HIV免疫原性多肽的編碼序列來源于不同于該多核苷酸組分編碼的免疫原性多肽的編碼序列的HIV毒株，該毒株用CCR5共同受體進(jìn)入細(xì)胞，或(ii)如果該多肽組分含有多種HIV免疫原性多肽，則該多肽組分的多肽的編碼序列來源于多種用CCR5共同受體進(jìn)入細(xì)胞的HIV毒株。在本發(fā)明的第二個具體方面，多核苷酸組分含有兩種或多種多核苷酸序列，這些序列含有兩種或多種類似的HIV免疫原性多肽的編碼序列，其中該HIV免疫原性多肽的至少兩種的編碼序列來源于不同的HIV亞型、血清型或毒株，該多肽組分含有一種或多種類似于所述多核苷酸組分編碼的多肽的HIV免疫原性多肽，前提是(i)如果該多肽組分提供少于該多核苷酸組分編碼的類似HIV免疫原性多肽的數(shù)目，則該多肽組合物的HIV免疫原性多肽可來源于與該多核苷酸組分提供的HIV免疫原性多肽相同和/或不同的亞型、血清型或毒株，或(ii)如果該多肽組分提供相同或大于該多核苷酸組分編碼的類似HIV免疫原性多肽的數(shù)目，則該多肽組合物的HIV免疫原性多肽中的至少一種來源于與該多核苷酸組分提供的HIV免疫原性多肽不同的HIV亞型、血清型或毒株。在本發(fā)明的一個實施方案中，混合編碼免疫原性HIV多肽的、來源于至少兩種不同亞型、血清型或毒株的兩種或多種多核苷酸(例如，以等量)用于引發(fā)。然后，來源于用于引發(fā)的亞型、血清型或毒株之一的單一、類似的免疫原性HIV多肽用于加強(qiáng)免疫。更常見的實施方案包括用于在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物，所述組合物包含含有兩種或多種多核苷酸的多核苷酸組分，其中每種多核苷酸編碼類似的HIV免疫原性多肽，前提是每種HIV免疫原性多肽的編碼序列來源于不同的HIV亞型、血清型或毒株；和含有一種或多種HIV免疫原性多肽的多肽組分，前提是所述多肽組分含有的HIV免疫原性多肽比所述多核苷酸組分編碼的至少少一種。例如，兩種DNA分子用于核酸免疫，其中第一DNA分子編碼一種HIVgpl40包膜多肽，該多肽(i)來源于南非HIV亞型C分離物/毒株，(ii)為在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子，和(iii)通過刪除V2環(huán)而突變的(例如，PCT國際公布號WO/02/04493的實施例所述的gpl40mod.TVl.delV2)，第二DNA分子編碼一種HIVgpl40包膜蛋白，該蛋白(i)來源于北美HIV亞型B分離物，(ii)為在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子，和(iii)通過刪除V2環(huán)而突變的(例如，PCT國際公布號WO/00/39302的實施例所述的gpl40.modSF162.delV2)。該DNA免疫之后使用一種單一的HIVgpl40包膜多肽進(jìn)行蛋白質(zhì)加強(qiáng)免疫，該多肽(i)來源于北美HIV亞型B分離物，和(ii)通過刪除V2環(huán)而突變的(例如，PCT國際公布號WO/00/39302的實施例所述的gpl40mut7.modSF162.delV2的蛋白質(zhì)產(chǎn)物)?？墒褂霉丫坌问降陌さ鞍?例如，PCT國際公布號WO/00/39302中所述的o-gp140)。用于在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物的一個實施方案包括含有編碼第一免疫原性HIV多肽的第一多核苷酸和編碼第二免疫原性HIV多肽的第二多核苷酸的多核苷酸組分，其中(i)所述第一和第二免疫原性HIV多肽來源于不同的HIV亞型、血清型或毒株，和(ii)所述第一和第二免疫原性多肽編碼類似的HIV多肽；和含有所述第一HIV免疫原性多肽或所述第二HIV免疫原性多肽的多肽組分，前提是所述多肽組分含有的HIV免疫原性多肽比所述多核苷酸組分編碼的至少少一種。在一個優(yōu)選實施方案中，編碼來源于各種不同的HIV亞型、血清型或毒株的類似免疫原性HIV多肽的多核苷酸用于引發(fā)免疫，使用一種單一類似的免疫原性HIV多肽進(jìn)行一次或多次加強(qiáng)免疫。在另一個實施方案中，混合編碼免疫原性HIV多肽的、來源于至少兩種不同亞型、血清型或毒株的兩種或多種多核苷酸(例如，以等量)用于引發(fā)。然后，來源于至少兩種不同亞型、血清型或毒株的一種或多種類似的免疫原性HIV多肽用于加強(qiáng)免疫，其中至少一種該免疫原性HIV多肽來源于在該多核苷酸組分中沒有顯示的亞型、血清型或毒株。例如，該多核苷酸組分含有編碼3種免疫原性HIV多肽的3種多核苷酸，一種編碼序列來源于亞型B毒株，一種來源于亞型C毒株，一種來源于亞型E毒株；該多肽組分含有3種免疫原性HIV多肽，一種編碼序列來源于亞型B毒株，一種編碼序列來源于亞型C毒株，一種編碼序列來源于亞型O毒株。本發(fā)明在這方面的另一個實施方案中，該多核苷酸組分的多核苷酸含有編碼類似的HIV免疫原性多S太的多核苷酸，所述免疫原性多肽來自不同于該多肽組分的多肽的亞型、血清型或毒株。例如，用兩種或多種編碼HIVgpl40多肽的DNA分子(其中兩種或多種gpl40編碼序列來源于兩種或多種HIV-l亞型、血清型或毒株)進(jìn)行DNA免疫。用于蛋白免疫的多肽組分含有兩種或多種gpl40多肽(其中兩種或多種gpl40編碼序列來源于兩種或多種HIV-l亞型、血清型或毒株，前提是該多肽序列的至少一種來源于DNA組分中沒有顯示的HIV-l亞型、血清型或毒株)。在另一個實施方案中，多核苷酸組分含有兩種或多種多核苷酸序列，這些序列含有兩種或多種類似HIV免疫原性多肽的編碼序列，其中至少兩種該HIV免疫原性多肽的編碼序列來源于用CCR5共同受體進(jìn)入細(xì)胞的不同HIV毒株，多肽組分含有一種或多種類似于所述多核苷酸組分編碼的多肽的HIV免疫原性多肽，前提是(i)如果該多肽組分提供的多肽少于該多核苷酸組分所編碼的類似HIV免疫原性多肽的數(shù)目，則該多肽組合物的HIV免疫原性多肽可來源于與該多核苷酸組分提供的HIV免疫原性多肽相同和/或不同的、用CCR5共同受體進(jìn)入細(xì)胞的HIV毒株，或(ii)如果該多肽組分提供相同或大于該多核苷酸組分所編碼的類似HIV免疫原性多肽的數(shù)目，則該多肽組合物的HIV免疫原性多肽中的至少一種來源于與該多核苷酸組分提供的HIV免疫原性多肽不同的、用CCR5共同受體進(jìn)入細(xì)胞的HIV毒株。另一方面，本發(fā)明還涉及各種劑量的多核苷酸和多肽在引發(fā)/加強(qiáng)免疫方法，特別是本文所述方法中的用途。在任何免疫方法中，例如使用混合的多核苷酸引發(fā)(即，兩種或多種編碼來源于兩種或多種HIV亞型、血清型或毒株的免疫原性HIV多肽的多核苷酸)結(jié)合多肽加強(qiáng)的方法，本發(fā)明包括使用劑量降低的每種單一組分以提供與使用全劑量的每種組分相等的免疫應(yīng)答。在一個實施方案中，DNA的高閾值是DNA的最大可耐受劑量(例如，約5-10mg總DNA)，DNA的低閾值是最低有效劑量(例如，約2-10)ig的總DNA)，蛋白質(zhì)的高閾值是蛋白質(zhì)的最大可耐受劑量(例如，約lmg總蛋白)，蛋白質(zhì)的低閾值是最低有效劑量(例如，約2pg總蛋白)。所進(jìn)行的支持本發(fā)明的實驗證實總DNA劑量可在多核苷酸組分的多核苷酸中分配(例如，就使用4個多核苷酸構(gòu)建物而言，所有4個的總DNA小于或等于高閾值)(例如，實施例4)。此外，總多肽劑量可在含有多肽組分的多肽中分配(例如，就使用4個多肽構(gòu)建物而言，所有4個的總蛋白質(zhì)小于或等于高閾值)(例如，實施例4)?？偟腄NA和總的蛋白質(zhì)通常均高于低閾值。在一個優(yōu)選的實施方案中，一給定的DNA免疫中DNA的總量具有小于或等于約10mg總DNA和大于或等于lmg總DNA的高閾值，一給定的多肽加強(qiáng)免疫中蛋白質(zhì)的總量具有小于或等于約200pg的總蛋白產(chǎn)物和大于或等于10pg的總蛋白的高閾值。例如，在使用多核苷酸組分的實施方案中，該組分具有兩種DNA分子，各自編碼一種免疫原性HIV多肽，每位對象的每種DNA分子的劑量可是就兩種DNA分子的總量是2mg而言，編碼免疫原性HIV多肽的每種DNA分子是1毫克，或者就兩種DNA分子的總量是lmg而言，編碼免疫原性HIV多肽的每種DNA分子是0.5毫克。使用多肽組分的劑量也可類似地變化，例如，使用具有兩種免疫原性HIV多肽的多肽組分，每位對象的每種多肽劑量可是就兩種多肽的總量是200pg而言，每種免疫原性HIV多肽是100微克，就兩種多肽的總量是100pg而言，每種免疫原性HIV多肽是50微克，或者就兩種多肽的總量是50嗎而言，每種免疫原性HIV多肽是25微克。如上所述，兩種以上的多肽可包含于本發(fā)明的多肽組分中。本發(fā)明在這方面的一個實施方案中，多核苷酸組分的多核苷酸編碼來自與該多肽組分的多肽同一亞型、血清型或毒株的類似HIV免疫原性多肽。例如，兩種DNA分子用于核酸免疫，其中第一DNA分子編碼一種HIVgpl40包膜多肽，該多肽(i)來源于南非HIVC亞型分離物，(ii)為在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子，(iii)通過刪除V2環(huán)而突變的(例如，PCT國際公布號WO/02/04493的實施例所述的gpl40mod.TVl.delV2)，和(iv)以0.5mg遞送，第二DNA分子編碼一種HIVgpl40包膜多肽，該多肽(i)來源于北美HIV亞型B分離物，(ii)為在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子，和(iii)通過刪除V2環(huán)而突變的(例如，PCT國際公布號WO/00/39302的實施例所述的gpl40.modSF162,delV2)，和(iv)以0.5mg遞送。該DNA免疫之后使用一種HIVgpl40包膜多肽和另一種HIVgpl40包膜多肽進(jìn)行蛋白質(zhì)加強(qiáng)免疫，前者是(i)來源于南非HIV亞型C分離物，(ii)通過刪除V2環(huán)而突變的(例如，PCT國際公布號WO/02/04493的實施例所述的gpl40mod.TVl.mut7.delV2的蛋白質(zhì)產(chǎn)物)，和(iii)以50嗎蛋白遞送，后者是(i)來源于北美HIV亞型B分離物，(ii)通過刪除V2環(huán)而突變的(例如，PCT國際公布號WO/00/39302的實施例所述的gpl40.mut7.modSF162.delV2的蛋白質(zhì)產(chǎn)物)，和(iii)以50pg蛋白遞送。此外，可使用寡聚形式的包膜蛋白(例如，PCT國際公布號WO/00/39302中所述的o-gpl40)。在其它實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸組分可含有一種或多種基因遞送載體，這些載體含有編碼免疫原性HIV多肽的多核苷酸。本文描述了可包含于多核苷酸組分中的其它組分。除了免疫原性多肽之外，本發(fā)明的多肽組分可含有佐劑。本文描述了可包含于多肽組分中的其它組分。本發(fā)明也包括在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法。該方法總的方面包括給予對象以提供免疫原性多肽的第一組分和給予對象以提供不同但類似的免疫原性多肽的第二組分。第一組分和第二組分可是多核苷酸組分或多肽組分。免疫原性多肽可直接提供(以多肽組分的形式)或間接提供(以多核苷酸組分的形式)。在一個優(yōu)選的實施方案中，一種組分(第一或第二組分)是多核苷酸組分，而另一組分(第一或第二組分)是多肽組分。第一或第二組分提供的多肽免疫原優(yōu)選是類似的HIV免疫原性多肽。第一和第二組分可同時給予或可在不同的時間給予。第一和第二組分優(yōu)選用引發(fā)-加強(qiáng)方案給予。各種引發(fā)-加強(qiáng)方案已在本領(lǐng)域描述并且為普通技術(shù)人員所熟知。在一個典型的引發(fā)-加強(qiáng)方案中，將提供多肽免疫原的第一組分給予對象，通過測定所述對象中針對多肽免疫原的結(jié)合抗體的產(chǎn)量來跟蹤初次免疫應(yīng)答直至結(jié)合抗體的滴度開始降低，將提供不同但相關(guān)的多肽免疫原的第二組分給予對象。第一和第二組分可作為一種組合物提供。在特定的方面，該方法包括提供在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的本發(fā)明組合物，在與多核苷酸在對象中表達(dá)來產(chǎn)生編碼的HIV免疫原性多肽相容的條件下將一種或多種含有該組合物的多核苷酸組分的多核苷酸的基因遞送載體施用給對象，和將多肽組分施用給對象。多核苷酸和多肽組合物可同時或依次給予。在優(yōu)選的實施方案中，用多核苷酸組分免疫先于用多^C組分免疫。此外，單次引發(fā)后可進(jìn)行多次加強(qiáng)，多次引發(fā)后可進(jìn)行單次加強(qiáng)，多次引發(fā)后可進(jìn)行多次加強(qiáng)，或者可采用一系列引發(fā)和加強(qiáng)。多核苷酸組分可含有其它組分(例如，用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答的組分、運載體等)。多肽組分可含有其它組分(例如，用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答的組分、運載體等)。示范性的多核苷酸構(gòu)建物、制備多核苷酸構(gòu)建物的方法、相應(yīng)的多肽產(chǎn)物、和制造用于HIV免疫的多肽的方法以前已描述于，例如以下PCT國際公布號WO/00/39302、WO/00/39303、WO/00/39304、WO/02/04493、WO/03/004657、WO/03/004620和WO/03/020876。雖然參考亞型B和CHIV作為示范性亞型進(jìn)行了總體的描述，本發(fā)明的組合物和方法可應(yīng)用于各種HIV亞型、血清學(xué)或毒株和藉此編碼的免疫原性多肽，包括(但不限于)以前已鑒定的亞型A-K、N和0的HIV-1、已鑒定的CRF(循環(huán)重組形式)和HIV-2毒株及其亞型。參見，例如，Myers等，LosAlamos數(shù)據(jù)庫，LosAlamos國家實驗室，LosAlamos,新墨西哥；Myers等，"人逆轉(zhuǎn)錄病毒和艾滋病"(HumanRetrovirusesandAids),1990，LosAlamos,新墨西哥LosAlamos國家實驗室。此外，本發(fā)明的組合物和方法可用于產(chǎn)生抗使用CCR5共同受體進(jìn)入細(xì)胞的病毒毒株和亞型的廣泛反應(yīng)性的中和抗體(例如，TV1和SF162均使用CCR5共同受體(實施例4))。本發(fā)明的多肽組分可含有免疫原性多肽的片段，例如其中多肽序列或其部分含有核酸序列編碼的多肽的至少3-5個氨基酸的氨基酸序列，更優(yōu)選至少8-10個氨基酸，甚至更優(yōu)選至少15-20個氨基酸。還包含由該序列編碼的多肽免疫鑒定的多肽序列。此外，可通過框內(nèi)融合編碼多肽或肽產(chǎn)物的兩種或多種多核苷酸序列構(gòu)建多蛋白。此外，本發(fā)明的多核苷酸組分可包含一個或多個含有編碼免疫原性HIV多肽的多核苷酸的單順反子表達(dá)盒，或一個或多個含有編碼免疫原性HIV多肽的多核苷酸的多順反子表達(dá)盒或其組合。多順反子編碼序列一般在一個啟動子的控制下通過，例如兩條或多條編碼相互毗連的多肽產(chǎn)物的多核苷酸序列產(chǎn)生，其中可修飾每條多肽編碼序列以包括內(nèi)部核糖體結(jié)合位點的序列。編碼免疫原性多肽(例如，HIV免疫原性多肽)的多核苷酸和免疫原性多肽或其片段(例如，HIV免疫原性多肽)的各種組合可用于實踐本發(fā)明。編碼免疫原性多肽的多核苷酸序列可包含在本發(fā)明組合物的多核苷酸組分中，例如作為含有如下成分的DNA免疫構(gòu)建物合成的Env表達(dá)盒、合成的Gag表達(dá)盒、合成的pol-衍生的多肽表達(dá)盒、含有編碼一種或多種附加或調(diào)節(jié)基因(例如，tat、rev、nef、vif、vpu、vpr)的合成表達(dá)盒。本發(fā)明組合物的多肽組分中可含有作為純化的多肽的免疫原性多肽。免疫原性多肽可是合成或野生型的。在優(yōu)選的實施方案中，免疫原性多肽是抗原性病毒蛋白或其片段。2.2.0鑒定類似的多肽和編碼這種多肽的多核苷酸參考示范性HIV-1序列描述本發(fā)明的組合物和方法。本發(fā)明不限于本文所述的序列。以前描述了用于實踐本發(fā)明的許多序列(參見，例如，PCT國際公布號WO/00/39302、WO100/39303、WO/00/39304、WO/02/04493、WO/03/004657、WO/03/004620和WO/03/020876)。用于實踐本發(fā)明的多核苷酸序列通常編碼來自病毒來源(例如，HIV-1)的多肽。多肽通常來源于抗原性病毒蛋白，特別是，群特異性抗原多肽、包膜多肽、衣殼多肽和其它結(jié)構(gòu)性和非結(jié)構(gòu)性多肽。特別參考包膜多肽和其修飾物(和編碼該多肽的多核苷酸)描述了本發(fā)明，所述多肽來源于HIV-1病毒的不同亞型、血清型或毒株。其它HIV-1多肽和編碼這種多肽的多核苷酸可用于實踐本發(fā)明，包括(但不限于)Gag、Pol(包括蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶)、Tat、Rev、Nef、Vif、Vpr和Vpu。HIV基因組和各種多肽編碼區(qū)域示于表1。相對于南非毒株8一5一TV1—CZA的亞型CHIV-1分離物(圖1A-1D)給出核苷酸位置。然而，根據(jù)本文的指導(dǎo)，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可容易地理解如何確定其它HIV毒株(來自相同或不同的亞型)或變體(例如，分離物HIVrab、HIVSF2、HIV-1SF162、HIV-1謂、HIVLAV、HIVLAI、HIV麗、HIV-lc謡、HIV-1腦)、來自不同亞型的其它HIV-1毒株(例如，亞型A-K、N和O)、已鑒定的CRF(循環(huán)重組形式)、HIV-2毒株和各種亞型和毒株(例如，HIV-2UC1和HIV-2UC2)、和猿免疫缺陷病毒(SIV)中的相應(yīng)區(qū)域。參見，例如，《病毒學(xué)》(Virology),第三版，(W.K.Joldik編，1988);《基礎(chǔ)病毒學(xué)》(Am^me"to/J^Vo/ogy)，第二版(B.N.Fields和D.M.Knipe編，1991);《病毒學(xué)》(7/ro/og7)，第三版，(Fields,BN，DMKnipe，PMHowley編，1996，Lippincott-Raven，Philadelphia,PA;為描述這些和其它相關(guān)的病毒，例如使用序列比較程序(如BLAST和其它本文所述的程序)或鑒定和對比結(jié)構(gòu)特征的程序(例如，本文所述可鑒定各種區(qū)域的"ALB"程序)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>易于理解的是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可對比表1所示的任何HIV序列來確定任何特定HIV基因的相對位置。例如，使用本文所述的對比程序之一(例如，BLAST)來對比其它HIV基因組序列與8_5—TV1一C.ZA(表l)并確定基因的位置?？深愃频貙Ρ榷嚯男蛄?。例如，圖2A-2E顯示各種毒株的Env多肽序列與SF-162的對比。如PCT國際公布號中所詳述的，Env多肽(例如，gpl20、gpl40和gpl60)含有"橋連片層"，該橋連片層由4條形成p片層的反平行P鏈(卩-2、P-3、P-20和(3-21)組成。兩個環(huán)，Vl和V2從一對p-鏈((3-2和J3-3)中伸出。相對于SF-162，卩-2片層出現(xiàn)于約氨基酸殘基113(Cys)-氨基酸殘基117(Thr)，而p-3片層出現(xiàn)于約氨基酸殘基192(Ser)-氨基酸殘基194(11e)，相比于SF-162。"V1/V2"區(qū)域出現(xiàn)于約氨基酸位置120(Cys)-殘基189(Cys)，相比于SF-162。"小環(huán)"結(jié)構(gòu)從第二對(3-鏈(卩-20和p-21)中伸出，本文也將該結(jié)構(gòu)稱為"橋連片層小環(huán)"。按照本文的指導(dǎo)和PCT國際公布號WO/00/39303所述，小環(huán)和橋連片層小環(huán)的位置可對應(yīng)于HXB-2確定。p片層區(qū)域的缺失序列的大概位置見圖2A-2E中的箭頭所示。"*"表示可按照本說明書的指導(dǎo)進(jìn)行突變的N-糖基化位點。2.3.0含有多核苷酸序列、載體、多肽、其它組分的表達(dá)盒與用于實踐本發(fā)明的制劑用于產(chǎn)生免疫應(yīng)答的本發(fā)明組合物含有多核苷酸組分和多肽組分。該多肽組分可含有一種或多種編碼免疫原性病毒多肽的多核苷酸。這種多核苷酸可含有編碼免疫原性病毒多肽的天然病毒序列或編碼免疫原性多肽的合成多核苷酸。相比于天然的類似多核苷酸序列，為提高編碼的多肽表達(dá)，合成的多核苷酸可含有優(yōu)化序列。此外，相比于對應(yīng)的野生型序列，合成的多核苷酸可含有突變(單點和多點突變、錯義突變、無義突變、缺失、插入等)。本發(fā)明組合物的多肽組分可含有一種或多種免疫原性病毒多肽。這種多肽可含有天然免疫原性病毒多肽或修飾的免疫原性多肽。相比于類似的天然多核苷酸序列，為提高多肽表達(dá)，修飾的多肽可含有優(yōu)化序列。此外，相比于對應(yīng)的野生型序列，修飾的多肽可含有突變(單點和多點突變、錯義突變、無義突變、缺失、插入等)。參考HIV-1衍生的序列描述了含有多核苷酸組分和多肽組分的本發(fā)明組合物。然而，本發(fā)明的組合物和方法也可應(yīng)用于其它類型的病毒，其中這種病毒具有多種亞型、血清型和/或毒株變異，例如包括(但不限于)其它非-HIV逆轉(zhuǎn)錄病毒(如HTLV-1，2)、嗜肝DNA病毒(如HBV)、皰疹病毒(如HSV-1、2、CMV、EBV、水痘帶狀皰疹病毒等)、黃病毒(如HCV、黃熱、蜱傳性腦炎、圣路易斯腦炎、西尼羅河病毒等)、冠狀病毒(如SARS)、副粘病毒(如PIV、RSV、麻疹病毒等)、流感病毒、細(xì)小RNA病毒、呼腸孤病毒(如輪狀病毒)、沙粒病毒、彈狀病毒、乳多空病毒、細(xì)小病毒、腺病毒、等革熱病毒、布尼亞病毒(如漢坦病毒)、杯狀病毒(如諾沃克病毒)、絲狀病毒(如埃博拉病毒、馬爾堡病毒)。2.3.1修飾多核苷酸編碼序列相比于對應(yīng)的天然野生型序列，可修飾HIV-1編碼序列及相關(guān)序列提高其在靶細(xì)胞中表迖。以下是一些可對這種序列作出的示范性修飾。首先,可修飾HIV-1密碼子使用模式從而使得到的核酸編碼序列與在高度表達(dá)的人基因中發(fā)現(xiàn)的密碼子使用相差不大。HIV密碼子使用反映了密碼子-三聯(lián)體的核苷酸A或T的含量高。HIV-1密碼子使用的效果是DNA序列中的AT含量高，這導(dǎo)致mRNA的翻譯能力降低和不穩(wěn)定性。比較起來，高度表達(dá)的人密碼子優(yōu)選核苷酸G或C。可修飾HIV編碼序列使之與在高度表達(dá)的人基因中發(fā)現(xiàn)的密碼子使用相差不大。第二，抑制性(或不穩(wěn)定)元件(INS)位于編碼序列，例如Gag編碼序列中。RRE是與HIV編碼的Rev蛋白相互作用以克服INS的表達(dá)下調(diào)作用的二極RNA結(jié)構(gòu)。為克服RRE和Rev的轉(zhuǎn)錄后激活機(jī)理，可通過引入多個不改變編碼的蛋白質(zhì)的讀碼框的點突變來失活不穩(wěn)定元件。第三，就一些基因而言，改變編碼序列使得多核苷酸編碼序列編碼失活的或非功能性的基因產(chǎn)物(例如，失活的聚合酶、蛋白酶、tat、rev、nef、vif、vpr和/或vpu基因產(chǎn)物)。實施例1描述了一些示范性的突變。按照本說明書的指導(dǎo)，通過本領(lǐng)域已知的方法，例如由MidlandCertifiedReagentCompany(Midland，Texas)等公司來裝配合成的編碼序列。例如，PCT公布號WO/00/39303、WO/00/39302、WO00/39304、WO/02/04493、WO/03/020876、WO/03/004620和WO/03/004657描述了一些用于本發(fā)明方法中的示范性編碼免疫原性HIV多肽的合成多核苷酸序列及其所編碼的多肽。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及編碼Eiw多肽的多核苷酸及相應(yīng)的Env多肽。例如，可修飾Env的密碼子使用模式從而使得到的核酸編碼序列與在高度表達(dá)的人基因中發(fā)現(xiàn)的密碼子使用相差不大。這種合成的Env序列能產(chǎn)生蛋白質(zhì)的水平高于天然Env序列(參見，例如PCT國際公布號WO/00/39302)。與野生型編碼序列相比，修飾Env多肽編碼序列提高了在許多哺乳動物細(xì)胞系(以及其它類型的細(xì)胞系，包括，但不限于昆蟲細(xì)胞)中的表達(dá)?？色@得相似的Erw多肽編碼序列，修飾和測試一提高來自多種分離物的表達(dá)。Env的其它修飾包括(但不限于)產(chǎn)生編碼其中具有突變和/或缺失的Env多肽的多核苷酸。例如，可刪除本文所述的高變區(qū)，V1和/或V2。此外，可修飾或刪除可變區(qū)V3、V4和/或V5。(參見，例如美國專利6,602,705)此外，例如也可按照本說明書的指導(dǎo)對Env內(nèi)的橋連片層區(qū)域和/或N-糖基化位點進(jìn)行其它修飾。(參見，圖2A-2E以及PCT國際公布號WO/00/39303、WO/00/39302、WO00/39304、WO/02/04493、WO/03/020876和WO/03/004620)。其它有用的env修飾是熟知的并且包括以下文獻(xiàn)所述Schulke等，(J.Virol.200276:7760),Yang等，2002，(J.Virol.200276:4634)，Yang等，2001(J.Virol.200175:1165)，Shu等，(Biochem.199938:5378)，F(xiàn)arzan等，(J.Virol.199872:7620)和Xiang等，(J.Virol.200276:9888)。這些修飾的各種組合可用于產(chǎn)生合成的表達(dá)盒與本文所述相應(yīng)的多肽。本發(fā)明也包括含有來源于除Env以外HIV基因的合成序列的表達(dá)盒，包括(但不限于)Gag、Env、Pol以及tat、rev、nef、vif、vpr和vpu內(nèi)的區(qū)域。此外，本發(fā)明包括含有兩種或多種抗原多肽的合成多核苷酸和/或表達(dá)盒(以及其編碼的多肽)。例如，這種序列可全部使用，或者可按照本說明書的指導(dǎo)和本領(lǐng)域已知的信息從合成的編碼序列中選擇編碼特定表位或抗原的序列。例如，多核苷酸編碼的多肽序列可經(jīng)計算機(jī)分析來預(yù)計全長序列中的抗原肽片段。然后，相應(yīng)的多核苷酸編碼片段可用于本發(fā)明的構(gòu)建物。用于這種分析的示范性算法包括(但不限于)AMPHI.該算法已用于預(yù)計T-細(xì)胞表位(Gao等，(1989)J.Immunol.143:3007;Roberts等，(1996)AIDSResHumRetrovir12:593;Quakyi等，(1992)ScandJImmunol增刊11:9)。DNASTAR,Inc.(Madison,WI,USA)的Protean軟件包中的AMPHI算法是可用的。抗原性索引(ANTIGENICINDEX).該算法用于預(yù)計抗原性決定簇(Jameson與Wolf，(1998)CABIOS4:181:186;Sherman,KE等，Hepatology1996年4月，23(4):688-94;Kasturi，KN等，JExpMed1995年3月1日，181(3):1027-36;vanKampenV等，MolImmunol1994年10月，31(15):1133-40;FerroniP等，JClinMicrobiol1993年6月，31(6):1586-91;BeattieJ等，EurJBiochem1992年11月15日，210(l):59-66;JonesGL等，MolBiochemParasitol1991年9月，48(1):1-9)。親水性(HYDROPHILICITY).—種Hopp和Woods(1981)(PNASUSA78:3824-3828)公布的用于確定氨基酸序列的抗原決定簇的算法。以上列舉的算法可使用默認(rèn)參數(shù)來確定抗原位點。此外，可結(jié)合兩種或多種以上分析的結(jié)果來鑒定特別優(yōu)選的片段。2.3.2多核苷酸序列及其編碼的多肽的進(jìn)一步修飾本文所述免疫原性病毒的編碼多肽的表達(dá)盒也可含有一種或多種其它編碼序列，例如一種或多種轉(zhuǎn)基因。在本發(fā)明的一個實施方案中，多核苷酸組分可含有一種或多種HIV免疫原性多肽的編碼序列。此外，多肽組分可含有一種或多種HIV免疫原性多肽。在本發(fā)明另一個實施方案中，多核苷酸組分可含有一種或多種HIV免疫原性多肽的編碼序列，其中該多核苷酸組分還含有編碼其它抗原性多肽的序列，前提是所述其它的抗原性多肽不是來源于HIV-1毒株的免疫原性多肽。此外，多肽組分可含有一種或多種HIV免疫原性多肽，其中該多肽組分還含有其它抗原性多肽，前提是所述其它的抗原性多肽不是來源于HIV-1毒株的免疫原性多肽。用于實踐本發(fā)明的其它序列(例如，轉(zhuǎn)基因)包括，但不限于編碼以下物質(zhì)的其它序列病毒表位/抗原(包括但不限于HCV抗原(例如，El，E2;Houghton，M等，1998年2月3日頒發(fā)的美國專利號5,714,596;Houghton,M等，1998年1月27日頒發(fā)的美國專利號5,712,088;Houghton，M等，1997年11月4日頒發(fā)的美國專利號5,683,864;Weiner，A丄等，1998年3月17日頒發(fā)的美國專利號5,728,520;Weiner，A丄等，1998年6月16日頒發(fā)的美國專利號5，766,845;Weiner，A丄等，1997年9月23日頒發(fā)的美國專利號5，670，152)、HIV抗原(例如，來源于一種或多種HIV分離物)；和編碼腫瘤抗原/表位的序列。其它序列也可來源于非病毒來源，例如編碼以下細(xì)胞因子的序列，如白介素-2(IL-2)、干細(xì)胞因子(SCF)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、白介素-12(IL-12)、G-CSF、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-la(IL-la)、白介素-ll(IL-ll)、MIP-1、腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞抑制因子(LIF)、c-kit配體、血小板生成素(TPO)和flt3配體，這些序列可購自幾個廠家，如Genzyme(Framingham，MA)、Genentech(SouthSanFrancisco，CA)、Amgen(ThousandOaks，CA)、R&DSystemsandImmunex(Seattle，WA)。其它序列描述于下文。HIV多肽編碼序列可獲得自其它HIV分離物，參見，例如Myers等，LosAlamos數(shù)據(jù)庫，LosAlamos國家實驗室，LosAlamos,新墨西哥，(1992);Myers等，"人逆轉(zhuǎn)錄病毒和艾滋病"(HumanRetrovirusesandAids),1997，LosAlamos,新墨西哥LosAlamos國家實驗室。可按照本說明書的指導(dǎo)用這種編碼序列作為起始材料來產(chǎn)生合成的表達(dá)盒。此外，本發(fā)明的合成表達(dá)盒包含與本文所述合成表達(dá)盒序列編碼的多肽具有大于85%、優(yōu)選大于90%、更優(yōu)選大于95%、最優(yōu)選大于98%序列同一性的相關(guān)多肽序列。示范性表達(dá)盒與修飾見實施例1并在下文進(jìn)一步討論。此外，本發(fā)明的多核苷酸可含有其它聚合物骨架結(jié)構(gòu)，例如(但不限于)聚乙烯骨架(Pitha，BiochemBiophysActa,204:39，1970a;Pitha，Biopolymers，9:965，1970b)和嗎啉代骨架(Summerton，J等，08/25/92頒發(fā)的美國專利號5,142,047;Summerton，J等，02/09/93頒發(fā)的美國專利號5,185,444)。報道了各種其它荷電與未荷電的多核苷酸類似物。本領(lǐng)域已知許多骨架修飾，包括(但不限于)未荷電的鍵(例如'，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物和氨基甲酸酯)與荷電的鍵(例如，硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯)。2.3.3與編碼免疫原性多肽的多核苷酸序列一起使用的示范性克隆載體和系統(tǒng)用于本發(fā)明的組合物和方法的多核苷酸序列可使用重組技術(shù)獲得，例如通過從表達(dá)基因的細(xì)胞中篩選cDNA文庫和基因組文庫或通過從已知含有該基因的載體中取得。此外，可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如苯酚提取和cDNA或基因組DNA的PCR從含有基因的細(xì)胞和組織中直接分離所需基因。為描述用于獲得和分離DNA的技術(shù)可參見，例如Sambrook等，同上。除了克隆，感興趣的基因也可合成產(chǎn)生?？捎锰囟ǖ乃璋被嵝蛄械暮线m密碼子來設(shè)計核苷酸序列。一般可選擇序列將在其中表達(dá)的宿主的優(yōu)選密碼子。完整的序列從用標(biāo)準(zhǔn)方法制備的重疊寡核苷酸裝配并裝配成完整的編碼序列。參見，例如Edge，淑訓(xùn)(1981)292:756;Nambair等，S"'g"c"1984)223:1299;Jay等，/5/o/.CAew,(1984)塑:6311;Stemmer，W.P.C,，(1995)164:49-53。然后，編碼所需抗原的基因序列可插入含有本發(fā)明的合成表達(dá)盒的載體中。在一個實施方案中，編碼選擇的抗原的多核苷酸單獨克隆入表達(dá)載體(例如，第一Eiw編碼多核苷酸克隆入第一載體，第二類似的Env編碼多核苷酸克隆入第二載體)。在某些實施方案中，抗原插入或毗連合成的Gag編碼序列，從而使得當(dāng)組合序列表達(dá)時可產(chǎn)生含有Gag肽和感興趣抗原(例如來源于HIV的Env(天然或修飾的)或其它抗原(天然或修飾的))的VLP?？稍诰幋a序列內(nèi)或編碼序列的任一末端插入(5'，表達(dá)的Gag多肽的氨基末端；或3'，表達(dá)的Gag多肽的羧基末端)(Wagner，R.等，Jrc/Wro/.127:117-137，1992;Wagner，R.等，nro/ogy200:162-175，1994;Wu，X.等，/Wra/.69(6):3389-3398，1995;Wang，C-T.等，F(xiàn)!'n/ogy200:524-534，1994;Chazal，N.等，n>o/ogy68(1):111-122，1994;Griffiths,J.C.等，J^>o/.67(6):3191-3198，1993;Reicin，A.S.等，/P7ro/.69(2):642-650，1995)?？蓜h除高達(dá)50%的p55Gag編碼—序列而不影響病毒樣顆粒的裝配與表達(dá)效率(Borsetti，A.等，72(11):9313-9317，1998;Gamier，L.等，/Wro/72(6):4667-4677，1998;Zhang，Y.等，72(3):1782-1789，1998;Wang，C.等，JKVo/72(10):7950-7959，1998)。當(dāng)在Gag的氨基末端加上序列時，多核苷酸可在5'端含有編碼用于給含有Gag的多肽加上肉豆蔻部分的信號的編碼序列(例如，編碼Met-Gly的序列)。用于實踐本發(fā)明的表達(dá)盒也可含有操作性連接于編碼序列的控制元件，該控制元件允許基因在對象種類的體內(nèi)表達(dá)。例如，典型的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的啟動子包括SV40早期啟動子、CMV啟動子，如CMV立即早期啟動子，小鼠乳腺腫瘤病毒LTR啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP)和單純皰疹病毒啟動子等。其它非病毒啟動子，例如來源于鼠金屬硫蛋白基因的啟動子也發(fā)現(xiàn)可用于哺乳動物表達(dá)。通常也存在位于翻譯終止密碼子的3'的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列。也優(yōu)選在位于編碼序列的5'存在用于優(yōu)化翻譯啟動的序列。轉(zhuǎn)錄終止子/聚腺苷酸化信號的例子包括來源于如Sambrook等所述(同上)的SV40以及牛生長激素終止子序列。本文也可使用增強(qiáng)子元件來增加哺乳動物構(gòu)建物的表達(dá)水平。例子包括如Dijkema等，五M50丄(1985)4:761中所述SV40早期基因增強(qiáng)子，如German等，iVoc.A^/Jc^/.5W.USA(1982b)2￡:6777中所述來源于Rous肉瘤病毒的長末端重復(fù)(LTR)的增強(qiáng)子/啟動子和如Boshart等，Cell(1985)41:521中所述來源于人CMV的元件，如包含于CMV內(nèi)含子A序列中的元件。此外，可構(gòu)建包含嵌合的抗原編碼基因序列的質(zhì)粒，所述序列編碼，例如多種感興趣的抗原/表位，如來源于多種病毒分離物?？乖幋a序列通常在合成的編碼序列之前或之后，嵌合的轉(zhuǎn)錄單元具有單個編碼感興趣的抗原和合成編碼序列的開放讀框?；蛘?，可構(gòu)建允許使用EMCVIRES等表達(dá)單個mRNA的多種抗原的多個順反子盒(例如，二-順反子盒)。在本發(fā)明的一個實施方案中，免疫產(chǎn)生組合物的多核苷酸組分可含有，例如以下含有第一Env表達(dá)盒的第一表達(dá)載體，其中Env編碼序列來源于第一HIV亞型、血清型或毒株，和含有第二Env表達(dá)盒的第二表達(dá)載體，其中Env編碼序列來源于第二HIV亞型、血清型或毒株。含有本發(fā)明的編碼序列的表達(dá)盒可以任何組合數(shù)量組合，這取決于待產(chǎn)生所需免疫應(yīng)答的編碼序列產(chǎn)物(例如HIV多肽)。在另一個實施方案中，多種HIV衍生多肽的合成的編碼序列可構(gòu)建入單個啟動子控制下的多順反子信息，其中IRES置于毗連每種編碼多肽的編碼序列。用于本發(fā)明的示范性的感興趣多核苷酸序列可來源于以下毒株，包括(但不限于)亞型B-SF162,亞型C-TV1.8_2(8—2—TV1—C.ZA)，亞型C-TV1.8一5(8—5—TVl_C.ZA)，亞型C-TV2.12-5/l(12-5_l_TV2—C.ZA)，亞型C-MJ4，印度亞型C-93IN101，亞型A-Q2317,亞型D-92UG001，亞型E-cm235，肯尼亞的亞型AHIV-1分離物Q23-17、GenBank登錄號AF004885，烏克蘭的亞型AHIV-1分離物98UA0116、GenBank登錄號AF413987,坦桑尼亞的亞型AHIV-1分離物SE8538、GenBank登錄號AF069669,亞型A人免疫缺陷病毒1原病毒DNA的完全基因組、克隆:pUG031-Al、GenBank登錄號AB098330,亞型D人免疫缺陷病毒1型的完全原病毒基因組、毒株92UG001、GenBank登錄號AJ320484，烏干達(dá)的亞型DHIV-1分離物94UG114、GenBank登錄號U88824,亞型D人免疫缺陷病毒1型、分離物ELI、GenBank登錄號K03454和印度亞型C人免疫缺陷病毒1型亞型C基因組RNA、GenBank登錄號AB023804。用于本發(fā)明的多核苷酸編碼序列可編碼功能性基因產(chǎn)物或使之突變以降低(與野生型相比)、減毒、失活、消除或給予合成多核苷酸編碼的基因產(chǎn)物的非功能活性。一旦完成，表達(dá)盒一般用于使用標(biāo)準(zhǔn)基因遞送方案的核酸免疫的構(gòu)建物中。基因遞送的方法為本領(lǐng)域已知。參見，例如美國專利號5,399,346;5,580,859;5,589,466?；蚩芍苯舆f送至脊椎動物對象，或者可離體遞送至來源于對象的細(xì)胞再將細(xì)胞植入對象。已開發(fā)了許多將基因轉(zhuǎn)移入哺乳動物細(xì)胞的基于病毒的系統(tǒng)。使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)選擇的載體可插入載體并包裝入逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。然后，可分離重組病毒并體內(nèi)或離體遞送至對象的細(xì)胞中。已開發(fā)了許多用作哺乳動物宿主細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移載體的基于病毒的系統(tǒng)。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒(特別是慢病毒載體)提供了基因遞送系統(tǒng)的便利平臺。使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)可將感興趣的編碼序列(例如，用于基因治療領(lǐng)域的序列)插入基因遞送載體并包裝入逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。然后，可分離重組病毒并體內(nèi)或離體遞送至對象的細(xì)胞中。已描述了許多逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)，包括例如描述于以下文獻(xiàn)的-美國專利號5,219,740;Miller等，(1989)J5/o7>c/zm々"es2:980;Miller,A.D.(1990)//wm朋7T^ra;^丄:5;Scarpa等，(1991)K〖油gv180:849;Burns等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sei.USA迎:8033;Boris-Lawrie等，(1993)C<9p/".Ge"e/.Deve/op.2:102;GB2200651;EP0415731;EP0345242;PCT國際公布號WO89/02468;PCT國際公布號WO89/05349;PCT國際公布號WO89/09271;PCT國際公布號WO卯/02806;PCT國際公布號WO90/07936;PCT國際公布號WO卯/07936;PCT國際公布號WO94/03622;PCT國際公布號WO93/25698;PCT國際公布號WO93/25234;PCT國際公布號WO93/11230;PCT國際公布號WO93/10218;PCT國際公布號WO91/02805;U.S.5,219,740;U.S.4,405,712;U.S.4，861,719;U.S.4,980,289和U.S.4，777,127;美國系列號07/800,921和Vile(1993)Ca"cw及esfl:3860-3864;Vile(1993)Oz"cer及wH:962-967;Ram(1993)Cawcer及^H:83-88;Takamiya(1992)/iNTewcwcz'.及^H:493-503;Baba(1993)/A^wms",g2^:729-735;Mann(1983)Ce〃11:153;Cane(1984)iVocA^/爿cod6WUSAU:6349和Miller(1990)//wma"77era;^1。一種類型的逆轉(zhuǎn)錄病毒，鼠白血病病毒或"MLV"廣泛用于基因治療領(lǐng)域(一般可參見Mann等，(Ce〃33:153，1993);Cane和Mulligan(iVoc.iVa"Jcac.Scz..USA81:6349，1984)和Miller等，(/fwmawr/zerapj1:5-14，1990)?？扇菀椎貜母鞣N慢病毒中構(gòu)建慢病毒載體(參見《RNA腫瘤病毒》(RNATumorViruses),第二版，冷泉港實驗室，1985)。慢病毒的代表性例子包括HIV、HIV-1、HIV-2、FIV和SIV。這種慢病毒可獲得自患者分離物，或者更優(yōu)選獲得自保藏機(jī)構(gòu)或保藏所，如美國模式培養(yǎng)物保藏所，或者用可用的技術(shù)從已知來源分離。慢病毒基因遞送載體(或運載體)的部分可來源于不同的病毒。例如，在給定的重組慢病毒載體中，LTR可來源于HIV,包裝信號可來自SIV，第二鏈合成的起點可來自HrV-2。慢病毒載體構(gòu)建物可含有5'慢病毒LTR、tRNA結(jié)合位點、包裝信號、一種或多種異源序列、第二鏈DNA合成的起點和3'LTR。慢病毒載體具有核轉(zhuǎn)運元件，該元件在優(yōu)選的實施方案中不是RRE。合適的核轉(zhuǎn)運元件的代表性例子包括Rous肉瘤病毒中的元件(Ogert等，jr/ro丄70，3834-3843，1996)、Rous肉瘤病毒中的元件(Liu和Mertz，Ge"^&"ev.，9,1766-1789，1995)和猿逆轉(zhuǎn)錄病毒1型基因組中的元件(Zolotukhin等，68，7944-7952，1994)。其它可能的元件包括以下基因中的元件組蛋白基因(Kedes，^"肌.7ev.5/oc/zew.48，837-870，1970)、干擾素基因(Nagata等，Nature287，401-408，1980)、腎上腺素能受體基因(Koilka等，Nature329，75-79，1987)和c-Jun基因(Hattorie等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，9148-9152，1988)。也描述了許多腺病毒載體。與整合入宿主基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，腺病毒持續(xù)存在于染色體外，從而使與插入性誘變相關(guān)的危險降至最低程度(Haj-Ahmad和Graham，丄f7ro/.(1986)12:267-274;Bett等，P7ra/(1993)^2:5911-5921;Mittereder等，//wwa"77^,ap_y(1994)i:717-729;Seth等，J7/ro/(1994)^:933-940;Ban等，Ge"eT7zera/;;(1994)丄:51誦58;Berkner，K丄.5/orec/m々ww(1988)6:616-629和Rich等，/Z"mwz77zera/7_y(1993)4:461-476)。此外，已開發(fā)了用于基因遞送的各種腺伴隨病毒(AAV)載體系統(tǒng)?？捎帽绢I(lǐng)域熟知的技術(shù)容易地構(gòu)建AAV載體。參見，例如美國專利號5，173，414和5,139,941;PCT國際公布號WO92/01070(1992年1月23日公布)和WO93/03769(1993年3月4日公布)；Lebkowski等，Mo/ec.O〃.5/o/.(1988)^3988-3996;Vincent等，^cc/"m卯(1990)(冷泉港實驗室出版社)；Carter,B.J.C群ew,Op/m'ow5/o&c/wo/ogy(1992)2:533-539;Muzyczka，N.C群e"f7bp/csM/cro6/o/.朋d/麵朋o/.(1992)158:97-129;Kotin，R.M.仏廳wG認(rèn)J7z簡;j;(1994)3:793-801;Shelling和Smith,G認(rèn)77zer卿(1994)丄:165-169和Zhou等，J五xp.MeA"994)179:1867-1875。用于遞送本發(fā)明多核苷酸的另一種載體系統(tǒng)是Small,Jr.，？.八.等，(1997年10月14日頒發(fā)的美國專利號5，676,950)所述的腸給予的重組痘病毒疫苗。用于遞送編碼感興趣抗原的核酸分子的其它病毒載體包括來源于痘病毒科的病毒，包括牛痘病毒和鳥痘病毒。例如，可按以下方式構(gòu)建表達(dá)基因的牛痘病毒重組體。首先，將編碼特定的免疫原性HIV多肽編碼序列的DNA插入合適的載體，使得其接近牛痘病毒啟動子并且兩側(cè)是牛痘病毒DNA序列，例如編碼胸節(jié)激酶(TK)的序列。然后，用該載體轉(zhuǎn)染同時甩牛痘病毒感染的細(xì)胞。同源重組用于將牛痘病毒啟動子加上編碼感興趣的編碼序列的基因插入病毒基因組?？赏ㄟ^在有5-溴脫氧尿苷存在時培養(yǎng)細(xì)胞并檢得抵抗該物質(zhì)的病毒噬斑來選擇得到的TK重組體?；蛘?，禽痘病毒，例如禽痘病毒和金絲雀痘病毒(canarypox)病毒也可用于遞送基因。當(dāng)將表達(dá)哺乳動物病原體的免疫原的重組禽痘病毒給予非禽類物種時，已知可賦予保護(hù)性免疫力。由于禽痘病毒屬的成員僅能在易感禽類中生產(chǎn)性地復(fù)制，因此不感染哺乳動物細(xì)胞，所以使用禽痘病毒載體在人類和其它哺乳動物種類中特別理想。產(chǎn)生重組禽痘病毒的方法是本領(lǐng)域已知的并且采用上述關(guān)于產(chǎn)生牛痘病毒的遺傳重組方法。參見，例如，PCT國際公布號WO91/12882、WO89/03429和WO92/03545。分子偶聯(lián)載體也可用于基因遞送，例如Michael等，J.^o/.C/2em.(1993)2M:6866-6869h和Wagner等，iVoc.A^/.」ok/.Sc/.USA(1992)巡:6099-6103所述的腺病毒嵌合載體。甲病毒屬的成員，例如(但不限于)辛德畢斯、塞姆利基森林病毒和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒也發(fā)現(xiàn)可用作遞送本發(fā)明的多核苷酸的病毒載體(例如，第一和第二合成的gpl40-多肽的編碼表達(dá)盒，其中第一和第二gpl40多肽是類似的并且來源于不同的HIV亞型、血清型或毒株)。為描述用于實踐本方法的辛德畢斯病毒衍生的載體，參見Dubensky等，,K>o/.(1996)70:508-519和PCT國際公布號WO95/07995和WO96/17072;以及Dubensky，Jr.，T.W.等，1998年12月1日頒發(fā)的美國專利號5,843,723和Dubensky,Jr.，T.W.，1998年8月4日頒發(fā)的美國專利號5,789,245。優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)包括(但不限于)真核生物分層載體起始系統(tǒng)(例如，美國專利號6,015,686;美國專利號5,814,482;美國專利號6,015,694;美國專利號5,789,245;EP1029068A2;PCT國際公布號WO9918226A2/A3;EP00907746A2;PCT國際公布號WO9738087A2)。示范性表達(dá)系統(tǒng)包括(但不限于)嵌合型甲病毒復(fù)制子顆粒，例如形成VEE和SIN的顆粒(參見，例如Perri等，"來源于委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒和辛德畢斯病毒的甲病毒復(fù)制子顆粒嵌合體是基于基因的強(qiáng)有力疫苗遞送載體"(AnalphavimsrepliconparticlechimeraderivedfromVenezuelanequineencephalitisandSindbisvirusesisapotentgene-basedvaccinedeliveryvector),J.Virol2003，77(19)，印刷中；PCTWO02/099035;2002年12月4日提交的USSN10/310734)。這種基于甲病毒的載體系統(tǒng)可用于引發(fā)或在DNA引發(fā)的對象中作為加強(qiáng)免疫或能作為獨立應(yīng)用的免疫方法使用本文所述多價方法來誘導(dǎo)中和抗體。表達(dá)盒遞送載體也可包括組織特異性啟動子來驅(qū)動一種或多種感興趣的基因或序列的表達(dá)。可產(chǎn)生表達(dá)盒遞送載體構(gòu)建物，以致可表達(dá)多種感興趣的基因。這可通過使用二-或寡聚-順反子盒(例如，當(dāng)編碼區(qū)域被80個或更少的核苷酸分開時，一般參見Levin等，Gene巡:167-174，1991)或通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)來實現(xiàn)。合成的感興趣表達(dá)盒也可不用病毒載體遞送。例如，可使用含有CMV-衍生元件的真核生物表達(dá)載體來遞送本發(fā)明的表達(dá)盒，這種載體包括(但不限于)以下pCMVKm2、pCMV-link、pCMVPLEdhfr和pCMV6a(參見實施例)。例如，本發(fā)明的合成DNA表達(dá)盒(如編碼gpl40多肽的表達(dá)盒)可克隆入以下真核生物載體用于瞬時表達(dá)測定和DNA免疫研究的pCMVKm2，該pCMVKm2載體來源于pCMV6a(Chapman等，iVwc.爿c/(is(1991)ii:3979-3986)并且含有卡那霉素選擇位點、復(fù)制的ColEl起點、CMV啟動子增強(qiáng)子和內(nèi)含子A，接著是用于下述合成序列的插入位點，然后是來源于牛生長激素的聚腺苷酸化信號—pCMVKm2載體與pCMV-link載體的唯一區(qū)別在于pCMVKm2中插入了多接頭位點以產(chǎn)生pCMV-link;用于在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)的pESN2dhfr和pCMVPLEdhfr;和用于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的穿梭載體pAcC13(如MunemitsuS.等，Mo/Ce//10(11):5977-5982，1990所述pAcC13來源于pAcC12)。此外，本發(fā)明的表達(dá)盒在遞送至對象或從其中得到的細(xì)胞之前可包裝在脂質(zhì)體中。一般使用能穩(wěn)定結(jié)合或截獲和保留核酸的脂質(zhì)體實現(xiàn)脂質(zhì)包囊化。濃縮的DNA與脂質(zhì)制劑之比可變，但通常在約l:l(mgDNA:微摩爾脂質(zhì))或更多脂質(zhì)。為綜述使用脂質(zhì)體作為遞送核酸的運載體，參見，Hug和Sleight，fi/oc/n'm.^o;/z;^爿"a.(1991)1097:丄-17;Straubinger等，《酶學(xué)方法》(MethodsofEnzymology)，(1983)，第101巻，512-527頁。用于本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑包括陽離子(帶正電)、陰離子(帶負(fù)電)和中性制劑，特別優(yōu)選陽離子脂質(zhì)體。陽離子脂質(zhì)體顯示以功能性形式介導(dǎo)質(zhì)粒DNA(Felgner等，Pnc.A^/JcadSc/.USA(1987)84:7413-7416)、mRNA(Malone等，/Voc.A^/.爿c^/.Sc/.USA(1989)M:6077-6081)和純化的轉(zhuǎn)錄因子(Debs等，5/o/.C/iem.(1990)2M:10189-10192)的胞內(nèi)遞送。陽離子脂質(zhì)體可容易地獲得。例如脂質(zhì)體N[l-2,3-二油酰氧基]丙基]-N,N,N-三乙基銨(DOTMA)以商品名Lipofectin來源于GIBCOBRL，GrandIsland,NY。(也參見，F(xiàn)eigner等，iVoc.A^L4cad.5W.USA(1987)M:7413-7416)。其它市售可得的脂質(zhì)包括(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boerhinger)。其它陽離子脂質(zhì)體可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)從易得的材料制備。參見，例如描述DOTAP(l,2-二(油酰氧基)-3-(三甲基氨基)丙垸)脂質(zhì)體合成的Szoka等，/Voe.A^/Jcad.Scz'.USA(1978)75:4194-4198;PCT國際公布號WO90/11092。類似地，陰離子和中性脂質(zhì)體可容易地獲得，例如來源于AvantiPolarLipids(Birmingham，AL)，或者可用易得的材料容易地制備。這種材料包括磷脂酰膽堿、膽固醇、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等。這些材料也可以合適的比例DOTMA與DOTAP起始材料混合。用這些材料制造脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域熟知的。脂質(zhì)體可含有多層脂泡(MLV)，單層小脂泡(SUV)或單層大脂泡(LUV)。用本領(lǐng)域已知的方法可制備各種脂質(zhì)體-核酸復(fù)合物。參見，例如Straubinger等，《免疫學(xué)方法》(METHODSOFIMMUNOLOGY)(1983)，第101巻，512-527頁；Szoka等，/Vocla"JcadSc/.USA(1978)21:4194-4198;Papahadjopoulos等，5zWn'm.j5—一Jcto(1975)394:483;Wilson等，Ce〃(1979)U:77;Deamer禾口Bangham，5/oc/z/m.5/o;Aj^.爿c^;(1976)441:629;Ostro等，5z.oc/zem.5/o;/zj^ie&Commim.(1977)2^:836;Fraley等，iVoc.A^L4c"d.Sc/.USA(1979)2^:3348;Enoch和Strittmatter，iVoc.A^/JcadSc/.USA(1979)2^:145;Fraley等，《/5/o/.C7ew.(1980)211:10431;Szoka和Papahadjopoulos,/Voc.A^/Jcaof.Sc/.USA(1978)21:145和Schaefer-Ridder等，Sc/e"ce(1982)211:166。DNA和/或蛋白質(zhì)抗原也可以類似于Papahadjopoulos等，Woc/zem.Ao//^.」cto.(1975)394:483-491所述的螺旋形脂質(zhì)組合物的形式遞送。也參見，美國專利號4,663,161和4,871,488。感興趣的表達(dá)盒也可包囊入、吸附入顆粒運載體或與之相連。這種運載體具有針對免疫系統(tǒng)的選擇抗原的多份拷貝并促進(jìn)抗原在局部淋巴節(jié)中的捕獲和保留。這些顆?？捎删奘燃?xì)胞吞噬并能通過細(xì)胞因子釋放來增強(qiáng)抗原呈遞。具體運載體的例子包括來源于聚甲基丙烯酸甲酯聚合物以及來源于聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)，稱為PLG的微粒。參見，例如Jeffery等，P/mrw.iw.(1993)1^:362-368;McGeeJP等，JM/croe"cfl/m//.14(2):197誦210，1997;O'HaganDT等，F(xiàn)鎖'we11(2):149-54，1993。合適的微粒也可在荷電洗滌劑存在時生產(chǎn)以得到表面帶凈負(fù)電荷或凈正電荷的微粒。例如，用陰離子洗滌劑生產(chǎn)的微粒，如十六垸基三甲基溴化銨(CTAB)，即CTAB-PLG微粒吸附負(fù)電荷的大分子，如DNA(參見，例如，國際申請?zhí)朠CT/US99/17308)。此外，其它具體的系統(tǒng)和聚合物可用于體內(nèi)或離體遞送感興趣的基因。例如，聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥氨酸、精胺、亞精胺等聚合物以及這些分子的偶聯(lián)物可用于轉(zhuǎn)移感興趣的核酸。類似地，DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀或使用其它不溶的無機(jī)鹽，例如磷酸鍶、硅酸鋁(包括膨潤土、高嶺土、氧化鉻、硅酸鎂、滑石粉)等沉淀可用于本方法。用于基因轉(zhuǎn)移的遞送系統(tǒng)的綜述參見，例如Feigner,P丄.，^dwz"cedi>wgDe/Zveo;iev/ews(1990)1:163-187。擬肽(Zuckerman，R.N.等，1998年11月3日頒發(fā)的美國專利號5,831,005)也可用于遞送本發(fā)明的構(gòu)建物。在本發(fā)明的一些實施方案中，明礬和PLG是提高多核苷酸疫苗(例如，DNA疫苗)的免疫力的有用遞送佐劑。其它實施方案包括(但不限于)類毒素、細(xì)胞因子，共刺激分子也可作為遺傳佐劑與多核苷酸疫苗一起使用。此外，使用顆粒運載體，例如金和鎢的生物射彈遞送系統(tǒng)特別適用于遞送本發(fā)明的合成表達(dá)盒。用待遞送的合成表達(dá)盒包被顆粒并通常在減壓條件下用從"基因槍"發(fā)射出的"火藥"加速至高速度。對這種技術(shù)和有用設(shè)備的描述參見，例如美國專利號4,945,050;5,036,006;5,100,792;5,179,022;5,371,015和5,478,744。也使用無針頭注射系統(tǒng)(Davis，H丄.等，F(xiàn)acc/"eU:1503國1509，1994;Bioject，Inc.,Portland,OR)。攜帶本發(fā)明的合成表達(dá)盒的重組載體配制入用于遞送至脊椎動物對象的組合物。這些組合物可是預(yù)防性(防止感染)或治療性的(感染后治療疾病)。如果需要預(yù)防疾病，這些組合物一般在感興趣病原體的初次感染之前給予。如果需要治療，例如減少癥狀或復(fù)發(fā)，這些組合物一般在初次感染后給予。這些組合物含有"治療有效量"的感興趣基因，從而可在體內(nèi)產(chǎn)生一定量的抗原進(jìn)而在所給予的個體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。確切的所需量視以下因素而變治療的對象、待治療對象的年齡和一般情況、對象的免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護(hù)程度、治療的疾病的嚴(yán)重性、選擇的具體抗原及其給藥方式等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地確定合適的有效量。因此，可通過常規(guī)試驗確定范圍較寬的"治療有效量"。這些組合物一般可含有一種或多種"藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體"，例如水、鹽水、甘油、聚乙二醇、透明質(zhì)酸、乙醇等。此外，這種載體中可存在輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。某些核酸攝取和/或表達(dá)的易化劑，例如(但不限于)布比卡因、心毒素和蔗糖也可包含于這些組合物中或共同給予。一旦配制好，本發(fā)明的組合物可直接給予對象(例如，上述的)或者使用例如上述的方法離體遞送至來源于對象的細(xì)胞。例如，將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞離體遞送并再植入對象的方法是本領(lǐng)域已知的，包括，例如葡萄糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、多聚季銨鹽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染胺(lipofectamine)和LT-1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、將多核苷酸(有或沒有相應(yīng)的抗原)包囊在脂質(zhì)體中與將DNA直接微注射入核。合成表達(dá)盒組合物的直接體內(nèi)遞送一般可在有或沒有病毒載體時，用常規(guī)注射器或基因槍，例如Accell⑧基因遞送系統(tǒng)(PowderJectTechnologies,Inc.,牛津，英格蘭)通過注射來實現(xiàn)。這些構(gòu)建物可通過皮下、表皮、表皮內(nèi)、粘膜內(nèi)(例如鼻、直腸和陰道)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、口服或肌肉內(nèi)注射。特別優(yōu)選將DNA遞送入表皮細(xì)胞的給藥方式，因為這種方式可接近皮膚相關(guān)的淋巴樣細(xì)胞并使得DNA瞬時存在于接受者中。其它給藥方式包括口服和肺部給藥、栓劑、無針頭注射、經(jīng)皮和透皮應(yīng)用。劑量治療可是單劑量方案或多劑量方案。編碼免疫原性多肽的多肽可按照本發(fā)明的方法與類似的免疫原性多肽聯(lián)合給予。2.3.4編碼HIV-1多肽和相關(guān)多肽的合成序列的表達(dá)本發(fā)明的免疫原性病毒多肽編碼序列可克隆入許多不同的表達(dá)載體/宿主細(xì)胞系統(tǒng)以提供產(chǎn)生免疫應(yīng)答的本發(fā)明組合物的多肽組分中的免疫原性多肽。例如，編碼HIV多肽的DNA片段可克隆入真核表達(dá)載體，包括瞬時表達(dá)載體、基于CMV-啟動子的哺乳動物載體和用于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的穿梭質(zhì)粒。合成的多核苷酸序列(例如，密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列)和野生型序列一般可克隆入同一載體。許多克隆載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，選擇合適的克隆載體是選擇的問題。一般參見Sambrook等，同上。然后，該載體用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。合適的重組表達(dá)系統(tǒng)包括(但不限于)本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌、哺乳動物、桿狀病毒/昆蟲、牛痘病毒、塞姆利基森林病毒(SFV)、甲病毒(例如辛德畢斯病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE))、哺乳動物、酵母和非洲爪蟾表達(dá)系統(tǒng)。特別優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是哺乳動物細(xì)胞系、牛痘病毒、辛德畢斯病毒、真核分層載體起始系統(tǒng)(例如，美國專利號6,015,686;5，814，482;6,015,694;5,789,245;EP1029068A2;PCT國際公布號WO9918226A2/A3;EP00907746A2;PCT國際公布號WO9738087A2)、昆蟲和酵母系統(tǒng)。許多這種表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞也是本領(lǐng)域已知的。例如，哺乳動物細(xì)胞系是本領(lǐng)域已知的，包括獲得自美國模式培養(yǎng)物保藏所(A.T.C.C.)的無限增殖細(xì)胞系，例如(但不限于沖國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)以及其它細(xì)胞。類似地，細(xì)菌宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌、枯草桿菌和鏈球菌中發(fā)現(xiàn)可與本發(fā)明構(gòu)建物一起使用。用于本發(fā)明的酵母宿主尤其包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、白色念珠菌(Oz"c^aa/6/ca"力、麥芽糖假絲酵母(OmAW"m"to犯)、多形漢遜酵母(/fa騰肌/a/o/，orp/w)、脆壁克魯維酵母(^/甲erom戸s如g/叫、乳酸克魯維酵母(K/j(ywomycw/acto)、季也蒙畢赤酵母(尸/c/n'agw/〃en'mowdz7)、巴其i特畢赤酵母CP/c/z/a戸她'力、粟酒裂殖酵母(Sc/2/z畫cc/z,m戸s;ow6e)和解脂亞羅威亞酵母(7a廳ovWa/(po/y"ca)等。與桿狀病毒表達(dá)載體一起使用的昆蟲細(xì)胞包括埃及伊蚊04ec^aegy/^')、苜蓿銀紋夜蛾(^Wog^/^aca/(/brm'ca)、家蠶(5ow6jo;mor/)、黑腹果蟲雖(Z)mso/Mame/a"oga"er)、草地貪夜蛾(印o^;ferayh^;per^f)和粉紋夜蛾(7Wc/zo//im'am')等。參見，例如Summers禾卩Smith,TexasAgriculturalExperimentStationBulletinNo.1555(1987)。病毒載體可用于表達(dá)真核細(xì)胞中的多肽，例如來源于痘病毒科，包括牛痘病毒和禽痘病毒。如Tomei等，J.F&o/.(1993)^2:4017-4026和Selby等，,Gen.nra/.(1993)21:1103-1113所述基于牛痘病毒的感染/轉(zhuǎn)染系統(tǒng)也發(fā)現(xiàn)可用于本發(fā)明?；谂６徊《镜母腥?轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可容易地用于提供感興趣的編碼序列在宿主細(xì)胞中可誘導(dǎo)地瞬時表達(dá)。在該系統(tǒng)中，首先用編碼細(xì)菌噬菌體T7RNA聚合酶的牛痘病毒重組體在體外感染細(xì)胞。該聚合酶顯示精細(xì)的特異性在于它僅轉(zhuǎn)錄攜帶T7啟動子的模板。感染后，由T7啟動子驅(qū)動用感興趣的多核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞。表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中的牛痘病毒重組體的聚合酶將轉(zhuǎn)染的DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，然后RNA通過宿主的翻譯裝置翻譯為蛋白質(zhì)。該方法提供高水平、瞬時、細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生的大量RNA及其翻譯產(chǎn)物。參見，例如Elroy-Stein和Moss,/Voc.A^/士fl"c/.USA(1990)￡1:6743-6747;Fuerst等，/Voc.A^/.爿cai/.S"'.USA(1986)§1:8122-8126。用牛痘病毒或禽痘病毒重組體感染的另一種方法可使用擴(kuò)增系統(tǒng)，該系統(tǒng)在引入宿主細(xì)胞后導(dǎo)致高水平表達(dá)。特別是T7RNA聚合酶4i碼區(qū)域之前的T7RNA聚合酶啟動子可改造。翻譯來源于該模板的RNA產(chǎn)生T7RNA聚合酶，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄更多模板。同時存在T7啟動子控制下表達(dá)的cDNA。因此，從擴(kuò)增模板RNA的翻譯產(chǎn)生的一些T7RNA聚合酶導(dǎo)致所需基因的轉(zhuǎn)錄。由于啟動擴(kuò)增需要一些T7RNA聚合酶，可將T7RNA聚合酶與模板一起引入細(xì)胞以引發(fā)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。聚合酶可以蛋白質(zhì)或編碼RNA聚合酶的質(zhì)粒引入。為進(jìn)一步討論用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的T7系統(tǒng)及其用途，參見，例如PCT國際公布號WO94/26911;Studier和Moffatt，(1986)巡:113-130;Deng和Wolff，Gew(1994)141:245-249;Gao等，5/oc/2em.5〖o(jì)p/o^.iw.Commw".(1994)證:1201-1206;Gao禾卩Huang,A^c.爿c/A(1993)2i:2867曙2872;Chen等，A^cJ"'cfc(1994)21:2114-2120和美國專利號5,135,855。這些載體轉(zhuǎn)染入合適的宿主細(xì)胞。然后在合適的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞系并在上清液中評估任何合適的多肽產(chǎn)物的水平。例如，p24可用于評估Gag表達(dá)；gpl60、gpl40或gpl20可用于評估Env表達(dá)；p6po1可用于評估Pol表達(dá)；prot可用于評估蛋白酶；pl5用于RNA酶H;p31用于整合酶；其它合適的多肽用于Vif、Vpr、Tat、Rev、Vpu和Nef。此外，修飾的多肽也可用于，例如其它Env多肽，包括(但不限于)如天然gpl60、寡聚gpl40、單體gpl20以及這些多肽的修飾和/或合成的序列。Western印跡分析可用于顯示含有合成的表達(dá)盒的細(xì)胞產(chǎn)生期望的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的每個細(xì)胞的濃度一般高于含有天然表達(dá)盒的細(xì)胞。細(xì)胞裂解物和上清液中均可見HIV蛋白質(zhì)。與野生型序列相比，用合成的表達(dá)盒轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞的上清液分級顯示該表達(dá)盒提供產(chǎn)生較多的HIV蛋白質(zhì)。這些含有HIV的多肽在哺乳動物細(xì)胞系中的有效表達(dá)具有以下好處多肽不含桿狀病毒污染物；用已建立方法進(jìn)行的生產(chǎn)由FDA批準(zhǔn)；純度增加；產(chǎn)量更高(與天然編碼序列相比)；與一種在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生含有SubHIV的多肽的新穎方法，這在沒有用本發(fā)明構(gòu)建物獲得表達(dá)增加的情況下是做不到的。示范性的哺乳動物細(xì)胞系包括(但不限于)BHK、VERO、HT1080、293、293T、RD、COS-7、CHO、Jurkat、HUT、SUPT、C8166、MOLT4/克隆8、MT-2、MT-4、H9、PM1、CEM和CEMX174(例如這種細(xì)胞系可獲得自A.T.C.C.)。所需的多肽編碼序列可克隆入任何數(shù)量的可市售載體以在合適的宿主系統(tǒng)中表達(dá)多肽。這些系統(tǒng)包括(但不限于)桿狀病毒表達(dá)(Reilly，P.R.等，《桿狀病毒表達(dá)載體實驗室手冊》(BACULOVIRUSEXPRESSIONVECTORS:ALABORATORYMANUAL),(1992);Beames等，5/WecAm々w"11:378(1991);Pharmingen;Clontech,PaloAlto，CA}，牛痘表達(dá)(Earl，P丄.等，"使用牛痘在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)"(Expressionofproteinsinmammaliancellsusingvaccinia),《新編分子生物學(xué)實驗指南》(CurrentProtocolsinMolecularBiology),(F.M.Ausubel等編)，GreenePublishingAssociates&WileyInterscience，NewYork(1991);Moss，B.等，1992年8月4日頒發(fā)的美國專利號5,135,855}，在細(xì)菌中表達(dá)(Ausubel，F(xiàn).M.等，《新編分子生物學(xué)實驗指南》(CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY),JohnWileyandSons,Inc.,MediaPA;Clontech},在酵母中表達(dá)(Rosenberg，S.和Tekamp-Olson，P.，1998年3月17日頒發(fā)的美國專利號RE35,749;Shuster，J.R.，1997年5月13日頒發(fā)的美國專利號5,629,203;Gellissen，G.等，顛麵'eFaw丄ee匿"/oeA:，62(l-2):79-93(1992);Romanos，M.A.等，r簡/,:423-488(1992);Goeddel，D.V.，胸/2ot/""^z戸o/柳185(1990);Guthrie,C.和G.R.Fink，M"/zo^y五"zymo/ogy巡(1991)}，在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá){Clontech;Gibco-BRL，GroundIsland,NY;例如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系(Haynes，J.等，A^""W.i仏11:687-706(1983);1983，Lau，Y.F.等，Mo/.CW/.5/o/.4:1469-1475(1984);Kaufman,R丄，"異源基因在哺乳動物細(xì)胞中的選擇和共同擴(kuò)增"(Selectionandcoamplificationofheterologousgenesinmammaliancells)，《酶學(xué)方法》(MethodsinEnzymology)，185巻，537-566頁，AcademicPress,Inc.,SanDiegoCA(1991))，和在植物細(xì)胞中表達(dá){植物克隆載體，ClontechLaboratories,Inc.,PaloAlto，CA禾口PharmaciaLKBBiotechnology,Inc.,Pistcataway，NJ;Hood,E.等，J.5a"en'o/.168:1291-1301(1986);Nagel，R.等，F(xiàn)五MSM/cra6/o/丄e".^2:325(1990);An等，"二員載體"(BinaryVectors),《植物分子生物學(xué)手冊》(PlantMolecularBiologyManual)A3:l-19(1988);Miki，B丄.A.等，249-265頁所述的其它載體，與《植物DNA感染劑》(PlantDNAInfectiousAgents),(Hohn，T.等編)Springer-Verlag，Wien，Austria,(1987)所述的其它載體；《植物分子生物學(xué)基本技術(shù)》(PlantMolecularBiology:EssentialTechniques),P.G.Jones禾卩J.M.Sutton,NewYork,J.Wiley,1997;Miglani，《Gurbachan植物遺傳學(xué)和分子生物學(xué)詞典》(GurbachanDictionaryofPlantGeneticsandMolecularBiology),NewYork,FoodProductsPress,1998;Henry，R丄，《植物分子生物學(xué)實踐應(yīng)用》(PracticalApplicationsofPlantMolecularBiology),NewYork,Chapman&Hall，1997}。除了哺乳動物、昆蟲和酵母載體以外，本發(fā)明的合成表達(dá)盒可用選擇的表達(dá)控制元件摻入各種表達(dá)載體中。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可根據(jù)本說明書的指導(dǎo)和本領(lǐng)域關(guān)于表達(dá)載體的已知信息來選擇任何給定細(xì)胞的合適載體和控制元件。例如，合成的編碼序列可插入含有操作性連接于所需編碼序列的控制元件的載體，這些元件允許編碼序列在選擇的細(xì)胞類型中表達(dá)。例如，典型的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的啟動子含有SV40早期啟動子，CMV啟動子，如CMV立即早期啟動子(可含有內(nèi)含子A的CMV啟動子)，RSV，HIV-Ltr,小鼠乳腺腫瘤病毒LTR啟動子(MMLV-ltr)，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP)和單純皰疹病毒啟動子等。其它非病毒啟動子，例如來源于鼠金屬硫蛋白基因的啟動子也發(fā)現(xiàn)可用于哺乳動物表達(dá)。轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列一般也存在于翻譯終止密碼子的3'。用于優(yōu)化翻譯起始的序列也優(yōu)選存在于編碼序列的5'。轉(zhuǎn)錄終止子/聚腺苷酸化信號的例子包括如Sambrook等，同上所述來源于SV40的以及牛生長激素終止子序列。本發(fā)明使用的構(gòu)建物也可設(shè)計有包含剪接供體和受體位點的內(nèi)含子(Chapman等，Nuc.AcidsRes.(1991)19:3979-3986)。本文也使用增強(qiáng)子元件來增加哺乳動物構(gòu)建物的表達(dá)水平。例子包括Dijkema等，￡M5(9/.(1985)4:761所述的SV40早期基因增強(qiáng)子，Gorman等，iVoc.A^L4cat/.Sc/.USA(1982b)2￡:6777所述來源于Rous肉瘤病毒的長末端重復(fù)(LTR)的增強(qiáng)子/啟動子和Boshart等，Ce//(1985)U:521所述的來源于人CMV的元件，例如包含于CMV內(nèi)含子A序列中的元件(Chapman等，A^c.Jc/^i^.(1991)!￡:3979-3986)。本發(fā)明也包括含有編碼序列和允許編碼區(qū)域在合適宿主中表達(dá)的表達(dá)控制元件的表達(dá)盒。控制元件一般包括啟動子、翻譯起始密碼子與翻譯和轉(zhuǎn)錄終止序列，與用于將插入物引入載體的插入位點。用于表達(dá)本發(fā)明多肽的翻譯控制元件見M.Kozak的綜述(例如，Kozak，M.，Mamm.Ge"ome7(8):563-574，1996;Kozak，M.，5/oc/uw/e76(9):815-821，1994;Kozak，M.，/Ce//5/o/108(2):229-241，1989;Kozak，M.和Shatkin，A丄，M"/oJ.五w27mo/60:360-375，1979)。在酵母系統(tǒng)中表達(dá)具有商業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)點。由牛痘和CHO細(xì)胞系生產(chǎn)重組蛋白具有用哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點。此外，牛痘病毒表達(dá)具有以下幾個優(yōu)點(i)宿主范圍廣；(ii)重組蛋白質(zhì)的精確轉(zhuǎn)錄后修飾、加工、折疊、轉(zhuǎn)運、分泌和裝配；(iii)相對可溶溶重組蛋白質(zhì)的表達(dá)水平高；和(iv)容納外來DNA的能力高。免疫原性HIV多肽編碼表達(dá)盒的重組表達(dá)的多肽一般從裂解的細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離?？捎帽绢I(lǐng)域已知的方法，包括分級鹽析、離子交換層析、凝膠過濾、體積排阻層析、大小分級和親和層析來純化?？衫没?，例如HIV抗原產(chǎn)生的抗體來進(jìn)行免疫親和層析。分離寡聚形式的HIV包膜蛋白已見描述(參見，例如PCT國際申請?zhí)朩O/00/39302)。使用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的優(yōu)點包括(但不限于)良好建立的用于按比例放大生產(chǎn)的方法；符合優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)規(guī)范(GMP)標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞系；哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件本領(lǐng)域已知。2.3.5與本發(fā)明的多肽組分一起使用的免疫原性增強(qiáng)組分在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答含有多核苷酸組分和多肽組分的本發(fā)明組合物可含有各種賦形劑、佐劑、運載體、輔助物質(zhì)、調(diào)節(jié)劑等。本發(fā)明組合物的多肽組分含有的多肽量足以引起免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定合適的有效量。多肽組分可含有運載體，其中所述運載體是本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體的分子。合適的運載體一般是大的、緩慢代謝的大分子，例如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂質(zhì)聚集體(例如油滴或脂質(zhì)體)和滅活的病毒顆粒。顆粒運載體的例子包括來源于聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的顆粒以及來源于聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)，稱為PLG。參見，例如Jeffery等，Pharm.Res.(1993)邊:362-368;McGeeJP等，JMicroencapsul.14(2):197-210，1997;O'HaganDT等，Vaccine11(2):149-54，1993。這種運載體是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的。此外，這些運載體可起到免疫刺激劑的作用("佐劑")。抗原還可與細(xì)菌類毒素，例如來源于白喉、破傷風(fēng)、霍亂等的類毒素以及來源于大腸桿菌的毒素偶聯(lián)。也可使用佐劑來增強(qiáng)組合物的效力。這種佐劑包括(但不限于)(l)鋁鹽(明礬)，例如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油乳劑(有或沒有其它免疫剌激劑，例如胞壁酰肽(見下文)或細(xì)菌細(xì)胞壁組分)，例如(a)使用微流化器，例如110Y型微流化器(Microfluidics，Newton，MA)配制進(jìn)亞微米顆粒，含有5%角鯊烯、0.5%吐溫80和0.5%司盤85(任選含有各種量的MTP-PE(見下文)，但不是必需的)的MF59(PCT國際公布號WO90/14837)，(b)含有10%角鯊烯、0.4°/。吐溫80、5%普朗尼克-阻斷的聚合物L(fēng)121和thr-MDP(見下文)，微流化入亞微米乳劑或渦流以產(chǎn)生較大粒徑乳劑的SAF，和(。含有2%角鯊烯、0.2%吐溫80和選自單磷酸脂質(zhì)A(MPL)、巖藻糖二分支菌酸(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)的一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁組分，優(yōu)選MPL+CWS(DetoxTM)的Ribi佐劑系統(tǒng)(RAS)(RibiImmunochem，Hamilton,MT);(3)可使用皂苷佐劑，例如StimulonTM(CambridgeBioscience，Worcester,MA)或從中產(chǎn)生顆粒，例如ISCOM(免疫剌激復(fù)合物)；(4)完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA);(5)細(xì)胞因子，例如白介素(IL-1、IL-2等)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(6)編碼免疫刺激CpG基序的寡核苷酸或聚合分子(Davis，H丄.等，丄/mm朋o/og^160:870-876，1998;Sato，Y.等，Sc/e"ce273:352-354，1996)或抗原/寡核苷酸復(fù)合物(聚合分子含有雙鏈或單鏈RNA和DNA，其骨架修飾物，例如甲基膦酸酯鍵)；或(7)細(xì)菌ADP-核糖基化毒素的解毒突變體，例如霍亂毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素(LT)、特別是LT-K63(其中賴氨酸取代63位的野生型氨基酸)、LT-R72(其中精氨酸取代72位的野生型氨基酸)、CT-S109(其中絲氨酸取代109位的野生型氨基酸)和PT-K9/G129(其中賴氨酸取代9位的和甘氨酸取代129位的野生型氨基酸)(參見，例如PCT國際公布號WO/93/13202和WO/92/19265);(8)胞壁酰肽包括(但不限于)N-乙?；?胞壁?；?L-蘇氨?；?D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙?；?正胞壁?；?L-丙氨酰基-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙?；?胞壁酰基-L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺?；?L-丙氨酸-2-(l-2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-羥基磷酸氧基)-乙胺(MTP-PE)等；(9)Iscomatrix(CSLLimited,Victoria,Australia;也參見，例如MoreinB,BengtssonKL，"由iscom，免疫刺激復(fù)合物進(jìn)行的免疫調(diào)節(jié)"(Immunomodulationbyiscoms,immunestimulatingcomplexes),Methods.9月；19(1):94-102，1999)和(10)作為免疫刺激劑增強(qiáng)組合物效力的其它物質(zhì)(例如，明礬和CpG寡核苷酸)。優(yōu)選的佐劑包括(但不限于)MF59和Iscomatrix。用本發(fā)明的免疫刺激組合物的多肽組分進(jìn)行的劑量治療可是單劑量方案或多劑量方案。多劑量方案是其中接種疫苗的基礎(chǔ)過程為1-10份單獨劑量，然后以后續(xù)時間間隔給予其它劑量，來維持和/或加強(qiáng)免疫應(yīng)答，例如以1-4個月的間隔給予第二劑量，如果需要幾個月后給予后續(xù)劑量。劑量方案至少部分由對象的需要來確定并取決于醫(yī)師的判斷。直接遞送本發(fā)明的產(chǎn)生免疫應(yīng)答組合物的多肽組分一般可在有或沒有佐劑時，用常規(guī)注射器或基因槍，例如Accell⑧基因遞送系統(tǒng)(PowderJectTechnologies,Inc.,牛津，英格蘭)通過注射來實現(xiàn)。這些多肽可通過皮下、表皮、皮內(nèi)、粘膜內(nèi)(例如鼻、直腸和陰道)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、口服或肌肉內(nèi)注射。其它給藥方式包括口服和肺部給藥、栓劑、無針頭注射。劑量治療方案可是單劑量方案或多劑量方案。多肽可與佐劑或其它物質(zhì)聯(lián)合給予。2.3.6免疫調(diào)節(jié)分子在本發(fā)明的一些實施方案中，基于轉(zhuǎn)移載體可構(gòu)建為編碼細(xì)胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子。例如，編碼天然IL-2和Y干擾素的核酸序列可分別如美國專利號4,738,927和5,326,859所述獲得，而這些蛋白質(zhì)的有用突變蛋白可如美國專利號4，853，332所述獲得。編碼短和長形式的mCSF的核酸序列可分別如美國專利號4,847,201和4,879,227所述獲得。本發(fā)明的具體方面可產(chǎn)生表達(dá)細(xì)胞因子或免疫調(diào)節(jié)基因的逆轉(zhuǎn)錄載體(例如，題為"用于癌癥免疫治療的組合物和方法"(CompositionsandMethodsforCancerImmunotherapy)的PCT國際公布號WO/94/02951)。本文使用的合適的免疫調(diào)節(jié)分子的例子包括IL-l和IL-2(Karupiah等，(1990)//mmw"o/ogy290-298;Weber等，(1987)/五x/.Afed.1M:1716-1733;Gansbacher等，(1990)J.五xp.Afg^172:1217-1224和美國專利號4,738,927);IL-3和IL-4(Tepper等，(1989)Ce〃^Z:503-512;Golumbek等，(1991)Sc/e"ce2M:713-716和美國專利號5,017,691);IL-5和IL-6(Brakenhof等，(1987)J/wmw"o/.139:4116-4121和PCT國際公布號WO90/06370);IL-7(美國專利號4,965,195);IL-8、IL-9、IL-10、IL-ll、IL-12和IL-13("細(xì)胞因子公報"(CytokineBulletin),1994年夏)；IL-14和IL-15;a干擾素(Finter等，(1991)Z>wgs41:749-765;美國專利號4,892,743和4,966,843;PCT國際公布號WO85/02862;Nagata等，(1980)A^w廠e2M:316-320;Familletti等，(1981)M"/zo^y/"2^:387-394;Twu等，(1989)尸rac.A^/.USA巡:2046-2050和Faktor等，(1990)Owcogewei:867-872));卩-干擾素(Seif等，(1991)/Wro/,^:664-671);Y-干擾素(Radford等，(1991)T7ze爿me".cawSoc/"少o//fe;afo/ogy20082015;Watanabe等，(1989)iVocA^/JcadSc/.USAM:9456-9460;Gansbacher等，(1990)Ca"cer及e層rc/z祉7820-7825;Maio等，(1989)C肌/扁畫/./mm畫齡.祉34-42和美國專利號4,762,791和4,727,138);G-CSF(美國專利號4,999,291和4,810,643);GM-CSF(PCT國際公布號WO85/04188)。免疫調(diào)節(jié)因子夜可是這些分子的激動劑、拮抗劑或配體。例如，由于可溶形式受體能改變因子本身的形狀，它們經(jīng)?？勺鳛檫@些類型因子的拮抗劑。編碼上述物質(zhì)的核酸分子以及有利于用于本發(fā)明的其它核酸分子可容易地從各種來源獲得，包括例如保藏所，如美國模式培養(yǎng)物保藏所或來自商業(yè)來源，如BritishBio-TechnologyLimited(Cowley，牛津，英格蘭)代表性的例子包括BBG12(含有編碼127個氨基酸的成熟蛋白的GM-CSF基因)、BBG6(含有編碼Y干擾素的序列)、A.T.C.C.保藏號39656(含有編碼TNF的序列)、A.T.C.C.保藏號20663(含有編碼oc干擾素的序列)、A.T.C.C.保藏號31902、31902和39517(含有編碼(3-干擾素的序列)、A.T.C.C.保藏號67024(含有編碼白介素-lb的序列)、A.T.C.C.保藏號39405、39452、39516、39626和39673(含有編碼白介素-2的序列)、A.T.C.C.保藏號59399、59398和67326(含有編碼白介素-3的序列)、A.T.C.C.保藏號57592(含有編碼白介素-4的序列)、A.T.C.C.保藏號59394和59395(含有編碼白介素-5的序列)和A.T.C.C.保藏號67153(含有編碼白介素-6的序列)。含有細(xì)胞因子基因或免疫調(diào)節(jié)基因的質(zhì)粒(PCT國際公布號WO94/02951和WO96/21015)可用合適的限制性酶消化，含有特定的感興趣基因的DNA片段可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)插入基因轉(zhuǎn)移載體(參見，例如Sambrook等，同上或Ausubel等編，《新編分子生物學(xué)實驗指南》(CurrentProtocolsinMolecularBiology》GreenePublishingandWiley國Interscience)。編碼上述分子的多核苷酸序列可用重組方法獲得，例如通過從表達(dá)基因的細(xì)胞中篩選cDNA或基因組文庫，或從含有該序列的已知載體中獲得基因。例如，含有編碼改變的細(xì)胞產(chǎn)物的序列的質(zhì)?？蓮谋２厮@得，如A.T.C.C.或來自商業(yè)來源。含有感興趣的多核苷酸序列的質(zhì)粒可用合適的限制性酶消化，含有多核苷酸序列的DNA片段可用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)插入基因轉(zhuǎn)移載體。或者，用于本發(fā)明的cDNA序列可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從表達(dá)或含有該序列的細(xì)胞中獲得，所述技術(shù)例如cDNA或基因組DNA的苯酚提取和PCR。用于獲得和分離DNA的技術(shù)描述于，例如Sambrook等，同上。簡言之，可使用寡聚-dT或隨機(jī)引物，用逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)感興趣基因的細(xì)胞的mRNA。然后可用與所需序列的任一側(cè)上序列互補的寡核苷酸引物，通過PCR擴(kuò)增單鏈cDNA(參見美國專利號4,683,202;4,683,195和4,800,159;也參見《PCR技術(shù)DNA擴(kuò)增的原理和應(yīng)用》(PCRTechnology:PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification),Erlich編，StocktonPress,1989)。除了克隆以外，感興趣的核苷酸序列也可使用DNA合成儀(例如，392型應(yīng)用生物系統(tǒng)DNA合成儀，ABI，F(xiàn)osterCity，California)來合成產(chǎn)生?？捎帽磉_(dá)產(chǎn)物所需的合適的密碼子來設(shè)計核苷酸序列。完整的序列從用標(biāo)準(zhǔn)方法制備的重疊寡核苷酸裝配并裝配成完整的編碼序列。參見，例如Edge,A^化re(1981)塑:756;Nambair等，Sc/e"ce(1984)221:1299;Jay等，J丑/o/.CA亂(1984)259:6311。2.4.0在受治療對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答為評價效力，可采用本發(fā)明多核苷酸組分進(jìn)行的核酸免疫(例如，分別含有g(shù)pl40編碼序列的兩個表達(dá)盒，其中每條編碼序列來源于不同的HIV亞型、血清型或毒株)與用本發(fā)明多肽組分的抗原性免疫(例如，寡聚gpl40，其中編碼序列來源于多核苷酸組分中所代表的HIV亞型、血清型或毒株的一種)。實施例2描述了在小鼠中評估用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的本發(fā)明組合物的免疫原性。所述多核苷酸組分含有兩個pCMVKM2，每個攜帶具有ddV2的gpl40的密碼子優(yōu)化編碼序列，第一編碼序列來源于SF162、亞型B，第二編碼序列來源于TV1、亞型C。然后用來源于SF162、亞型B、具有delV2的gpl40密碼子優(yōu)化的寡聚多肽免疫小鼠。評估體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。這些測定的結(jié)果用于顯示在小鼠中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的本發(fā)明多核苷酸/多肽免疫方法的效力。實施例3描述了可在各種實驗室動物(包括小鼠、豚鼠、家兔、恒河猴和狒狒)中進(jìn)行的體內(nèi)免疫研究。這些研究的結(jié)果證實產(chǎn)生免疫應(yīng)答，特別是產(chǎn)生廣泛且強(qiáng)有力的抗各種HIV毒株的中和活性的本發(fā)明組合物和方法的有效性。實施例4描述了支持本發(fā)明而進(jìn)行的實驗，這些實驗評估了用作引發(fā)的各種HIV多肽編碼質(zhì)粒和用作加強(qiáng)的各種HIV多肽的免疫原性方案。該實施例使用以下編碼gpl40蛋白的載體pCMVgpl40dV2SF162DNA和pCMVgpl40dV2TV1DNA。這些載體含有編碼來源于兩種不同HIV亞型，亞型B(SF162)和亞型C(TV1)的gpl40蛋白的表達(dá)盒。兩種構(gòu)建物中均刪除了V2環(huán)，編碼序列是在人細(xì)胞中表達(dá)的優(yōu)化密碼子。特定的gP140多核苷酸已見描述(例如，gpl40.modSF162.delV2、圖6和gpl40.mut7.modSF162.delV2、圖7,也參見PCT國際公布號WO/00/39302;與gpl40mod.TVl.delV2、圖8和gpl40mod.TVl扁t7.delV2、圖9，也參見PCT國際公布號WO/02/04493)。評估了本發(fā)明組合物和方法產(chǎn)生中和抗體的能力。存在中和抗體的測定結(jié)果示于圖4和圖5。圖4總結(jié)的數(shù)據(jù)顯示7個實驗組之間抗HIV-1SF162的中和滴度。這些結(jié)果證實所有組均顯示抗HIV-1SF162分離物的強(qiáng)中和活性。此外，與第3次免疫后相比，中和活性在第4次免疫后顯著增加。就混合的(B+C)DNA引發(fā)和單次蛋白質(zhì)加強(qiáng)而言，B蛋白與C蛋白(B+CDNA+C蛋白)一樣，得到針對混合的基因引發(fā)(B+CDNA+B蛋白)的高加強(qiáng)免疫。就混合的DNA引發(fā)和蛋白質(zhì)加強(qiáng)而言，半劑量(50pg)的蛋白(B+CDNA和蛋白(l/2))誘導(dǎo)至少與全劑量(100嗎)蛋白(B+CDNA和蛋白)一樣的中和活性。圖5總結(jié)的數(shù)據(jù)顯示7個實驗組之間抗HIV-1TV1(南非亞型C)的中和滴度。這些結(jié)果證實所有組均顯示抗HIV-1亞型CTV1分離物的中和活性(如預(yù)期一樣，由于未使用亞型CDNA或蛋白，BDNA+B蛋白顯示最低的中和活性)。就失配的單次DNA引發(fā)和單次蛋白質(zhì)加強(qiáng)(CDNA+B蛋白)而言，用C基因引發(fā)和用B蛋白加強(qiáng)與用B基因和B蛋白(BDNA+B蛋白)一樣顯示高滴度。就混合的(B+C)DNA引發(fā)和單次蛋白質(zhì)加強(qiáng)而言，使用B(B+CDNA+B蛋白)與C(B+CDNA+C蛋白)蛋白具有相似的加強(qiáng)作用。比較圖4和圖5中的數(shù)據(jù)支持了在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答以及在免疫的對象中產(chǎn)生中和抗體的本發(fā)明組合方法，這些數(shù)據(jù)顯示結(jié)合來源于不同亞型的DNA引發(fā)針對多種亞型的廣泛應(yīng)答。這可能是針對亞型和/或序列特異性連續(xù)和/或不連續(xù)免疫原性表位的組合應(yīng)答以及針對本文所用寡聚V2缺失的Env免疫原中的共同保守表位呈遞的應(yīng)答的結(jié)果。此外，當(dāng)免疫力是用多種亞型的DNA引發(fā)時，用單一亞型蛋白足以加強(qiáng)廣泛的中和應(yīng)答。這些結(jié)果也證實使用較低劑量蛋白質(zhì)混合物也可提供強(qiáng)的免疫應(yīng)答。實施例5提供的數(shù)據(jù)證實可用某給定亞型的第一HIV毒株(例如，HIV-1MN)的包膜蛋白免疫對象(在該實施例中是黑猩猩)，用同一亞型的第二HIV毒株(例如，HIV-1SF162)的包膜蛋白加強(qiáng)免疫并產(chǎn)生抗兩種HIV毒株的中和抗體(例如參見，表11，實施例5)。實施例5的數(shù)據(jù)支持了本發(fā)明的組合方法可用于產(chǎn)生抗來自同一亞型的多種病毒毒株的廣泛中和抗體。結(jié)合實施例4和實施例5所示的數(shù)據(jù)證實這種HIV毒株可在同一亞型內(nèi)或來自不同的亞型。這些研究的結(jié)果證實本發(fā)明組合物(例如，含有多核苷酸組分和多肽組分)和方法產(chǎn)生免疫應(yīng)答，特別是產(chǎn)生廣泛且強(qiáng)有力的抗各種HIV亞型和毒株的中和活性的有效性。本發(fā)明很明顯可用于引發(fā)抗各種抗原的免疫應(yīng)答從而治療或預(yù)防感染，特別是HIV感染。3.0.0將本發(fā)明應(yīng)用于HIV盡管不想受任何具體的模型、理論或假說的束縛，提供以下信息為了更完全地了解本發(fā)明?？笻IV感染的保護(hù)作用可能需要在接觸病毒侵襲的接種個體中預(yù)先存在強(qiáng)有力且廣泛的反應(yīng)性中和抗體。雖然需要細(xì)胞免疫應(yīng)答來控制受感染個體中的病毒血癥，但未證實僅依賴誘導(dǎo)這些應(yīng)答的疫苗方法可提供保護(hù)作用。鑒于此，支持本發(fā)明而進(jìn)行的實驗使用組合引發(fā)-加強(qiáng)方法，該方法用多核苷酸組分和多肽組分，其中多肽組分編碼，例如來自初級HIV分離物(例如，R5亞型B(HIV-lsn62)和亞型C(HIV-1tv!)毒株)的V缺失包膜抗原，多肽組分含有這些抗原中的至少一種。本發(fā)明的多核苷酸組分可通過增強(qiáng)的DNA或RNA[聚丙交酯-共-乙交酯(PLG)微粒制劑或電穿孔]、基于腺病毒的載體、甲病毒復(fù)制子或復(fù)制子顆粒、多核苷酸或基于顆粒的疫苗方法來遞送。通過電透化作用在體內(nèi)有效表達(dá)編碼基因的質(zhì)粒已見描述(參見，例如Zucchdli等，(2000)/K'w/.74:11598-11607;Banga等，(1998)7>e"<is5fo&c^"o/.10:408-412;Heller等，(1996)389:225-228;Mathiesen等，(1999)T7zer.4:508-514;Mir等，(1999)Prac.A^7^c^/S"..USA8:4262-4267;Nishi等，(1996)C認(rèn)e"版5:1050-1055)。本發(fā)明的多肽組分可通過，例如以MF59或Iscomatrix佐劑配制的Env蛋白加強(qiáng)免疫而給予。所有蛋白制劑均高度純化并用生物物理和免疫化學(xué)方法全面鑒定。家兔免疫原性研究的結(jié)果表明可持續(xù)誘導(dǎo)抗各種HIV毒株的廣泛中和抗體應(yīng)答(實施例4)。此外，也可用組合引發(fā)-加強(qiáng)疫苗方案來產(chǎn)生強(qiáng)有力的HIV抗原特異性CD4+和CD8+T-細(xì)胞應(yīng)答。雖然任何病毒蛋白也可用于實踐本發(fā)明，但在優(yōu)選的實施方案中，Vl-、V2-和/或V3-修飾/缺失的包膜DNA和相應(yīng)的多肽是用于本發(fā)明組合物的良好候選對象。本發(fā)明這方面的一個實施方案通常如下所述。選擇用于疫苗組合物的抗原。編碼Env多肽的多核苷酸和Erw多肽一般用于產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物，該組合物含有多核苷酸組分和多肽組分。核酸引發(fā)后通常有至少一次多肽加強(qiáng)。加強(qiáng)免疫可包括，例如輔助的HIV衍生多肽(例如，類似于用在DNA疫苗接種中的)、病毒載體編碼的HIV衍生多肽的編碼序列(例如，類似于用在DNA疫苗接種中的)。加強(qiáng)免疫還可包括DNA疫苗接種和/或上述的組合。此外，相比于初始疫苗接種，不同多肽抗原可用于加強(qiáng)，反之亦然。另外，初始核酸疫苗接種可是含有DNA表達(dá)盒構(gòu)建物的病毒載體。設(shè)計HIV包膜疫苗要考慮的一些因素是有效的HIV疫苗的基本標(biāo)準(zhǔn)是其誘導(dǎo)廣泛且強(qiáng)有力的抗流行性HIV毒株的中和抗體應(yīng)答的能力。中和抗體在預(yù)防HIV、SIV和SHIV感染的發(fā)生或延遲疾病發(fā)作中的重要作用是幾項研究的重點。首先，中和耐受性病毒在受感染動物的疾病發(fā)生的同時或之前出現(xiàn)(Bums(1993)^>o/.67:4104-13;Cheng-Mayer等，(1999)/K>o/.73:5294-5300;Narayan等，(1999)f7w/ogy256:54-63)。第二，在受HIV、SIV或SHIV病毒侵襲之前在彌猴、黑猩猩和SCID小鼠的血液循環(huán)系統(tǒng)中預(yù)先輸注高濃度的強(qiáng)中和單克隆抗體(mAb)提供了保護(hù)作用或延遲疾病發(fā)生(Conley等，(1996)J.P7ra/.70:6751-6758;Emini等，(1992)A^we(London)355:728-730;Gauduin等，(1997)WafMeA3:1389-93;Mascola等，(1999)/)A^w"Med6(2):207-210;Baba等，(2000)A^weM^/.6(2):200-206)。類似地，給天然豚尾彌猴(pig-tailedmacaques)輸注收集自HIV-1感染的黑猩猩血清中的中和抗體保護(hù)后者動物免受后來SHIV病毒的侵襲(Shibata等，(1999)A^w"A/e^c/"e5:204-210)。此外，基于包膜的疫苗證實在非人靈長類模型中有抗感染的保護(hù)作用。不含Env多肽的疫苗一般賦予較弱的保護(hù)效力(參見，例如Hu，S丄.等，"作為研究抗靈長類慢病毒感染的相關(guān)方法的重組亞單位疫苗"(Recombinantsubunitvaccinesasanapproachtostudycorrelatesofprotectionagainstprimatelentivirusinfection),ImmunolLett.6月；51(1-2):115-9(1996);Amara，R.R.等，"Env以及Gag-Pol在用DNA引發(fā)/重組修飾的牛痘病毒Ankara疫苗控制猿-人免疫缺陷病毒89.6P侵襲中的關(guān)鍵作用"(CriticalroleforEnvaswellasGag-Polincontrolofasimian-humanimmunodeficiencyvirus89.6PchallengebyaDNAprime/recombinantmodifiedvacciniavirusAnkaravaccine),JVirol.6月;76(12):6138-46(2002))。來源于SF2lab毒株的單體gpl20蛋白在靈長類模型中中和HIV-1lab毒株并防止病毒侵襲(Verschoor，E丄等，(1999)，"比較核酸、MF59和ISCOM-配制的HIV-1gpl20疫苗在恒河猴中產(chǎn)生的免疫力"(Comparisonofimmunitygeneratedbynucleicacid,MF59andISCOM-formulatedHIV-1gpl20vaccinesinrhesusmacaques),/Fi>o/ogy73:3292-3300)。來源于ThaiE野外菌株的初級gpl20蛋白提供lab毒株的交叉亞型中和作用(VanCott，T.C.等，(1999)"用基于R51型原始人免疫缺陷病毒包膜的亞型Egpl20免疫原在狒狒中誘導(dǎo)交叉亞型中和抗體"(Cross-subtypeneutralizingantibodiesinducedinbaboonsbyasubtypeEgpl20immimogenbasedonanR5primaryhumanimmunodeficiencyvirustype1envelope),/.K//-o/ogy73:4640-4650)。原始亞型B寡聚o-gpl40蛋白提供對亞型B原始(野外)分離物的部分中和作用(Bamett，S.W.等，(2001)"部分刪除第二超變區(qū)后提高了寡聚HIV-1包膜抗原引發(fā)抗原始HIV-1分離物的中和抗體的能力"(TheabilityofanoligomericHIV-1envelopeantigentoelicitneutralizingantibodiesagainstprimaryHIV-lisolatesisimprovedfollowingthepartialdeletionofthesecondhypervariableregion),/F/ro/ogy，75:5526-5540)。原始亞型Bo-gpl40delV2DNA引發(fā)加上蛋白質(zhì)加強(qiáng)在靈長類模型中提供強(qiáng)有力中和各種亞型B原始分離物并防止病毒侵襲(Cherpelis，S.等，(2000)"疫苗誘導(dǎo)的抗包膜抗體為CD8+T-細(xì)胞缺失恒河猴提供對SHIV感染的部分保護(hù)作用"(Vaccine-inducedanti-envelopeantibodiesofferpartialprotectionfromSHIVinfectiontoCD8+T-celldepletedrhesusmacaques)，J.Virology，75,1547-1550)。可通過構(gòu)建暴露保守的中和表位的包膜多肽結(jié)構(gòu)來協(xié)助誘導(dǎo)強(qiáng)有力、廣泛反應(yīng)性中和抗體的疫苗方案，例如可變區(qū)的修飾/缺失和去糖基化、包膜蛋白受體復(fù)合物、基于晶體結(jié)構(gòu)(例如，P-片層缺失)的合理設(shè)計和基于免疫原的gp41-融合結(jié)構(gòu)域。使用優(yōu)化的包膜多肽編碼序列開發(fā)了用于包膜蛋白生產(chǎn)的穩(wěn)定CHO細(xì)胞系，所述序列包括(但不限于)gpl20、o-gpl40、gpl20delV2、o-gpl40delV2、gpl20delVlV2、o-gpl40delVlV2。示范性的抗原組合物和支持本發(fā)明組合物和方法的免疫原性研究示于實施例4。在用于哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的本發(fā)明組合物的第一具體方面，本發(fā)明的多核苷酸組分基本上由編碼HIV免疫原性多肽的多核苷酸組成，多肽組分含有一種或多種與所述多核苷酸組分編碼的多肽類似的HIV免疫原性多肽，前提是多肽組分的至少一種HIV免疫原性多肽來源于不同于多核苷酸組分編碼的免疫原性多肽的編碼序列的HIV亞型、血清型或毒株。在本文中，基本上由一種編碼HIV免疫原性多肽的多核苷酸組成的多核苷酸組分指在組合物中存在編碼一種HIV免疫原性多肽的一種多核苷酸。除了HIV免疫原性多肽，多核苷酸組合物可含有其它組分，例如免疫增強(qiáng)子、免疫調(diào)節(jié)組分、載體序列(例如，病毒的或非病毒的)、運載體、顆粒、賦形劑、表達(dá)控制序列等。在本發(fā)明這方面的一個實施方案中，多核苷酸組分編碼的HIV免疫原性多肽來源于亞型B毒株，多肽組分的HIV免疫原性多肽的至少一種編碼序列來源于亞型C毒株。在一個實施方案中，在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物含有基本上由編碼HIV免疫原性多肽的多核苷酸組成的多核苷酸組分，該HIV免疫原性多肽來源于第一亞型的第一HIV毒株；和含有一種或多種HIV免疫原性多肽的多肽組分，該HIV免疫原性多肽類似于該多核苷酸組分編碼的多肽；前提是多肽組分的至少一種HIV免疫原性多肽來源于第一亞型的第二HIV毒株，其中第一和第二毒株不同。在這方面的一些實施方案中，多核苷酸組分不編碼來源于除第一亞型以外任何亞型的類似HIV免疫原性多肽，和多肽組分不含有來源于除第一亞型以外的任何亞型的類似HIV免疫原性多肽。在用于哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的本發(fā)明組合物的第二具體方面，多核苷酸組分含有兩種或多種多核苷酸序列，該序列含有兩種或多種類似的HIV免疫原性多肽的編碼序列，其中至少兩種HIV免疫原性多肽的編碼序列來源于不同亞型、血清型或毒株，多肽組分含有一種或多種類似于所述多核苷酸組分編碼的多肽的HIV免疫原性多肽，前提是(i)如果該多肽組分提供的多肽少于該多核苷酸組分編碼的類似HIV免疫原性多肽的數(shù)目，則該多肽組合物的HIV免疫原性多肽可來源于與該多核苷酸組分提供的HIV免疫原性多肽相同和/或不同的HIV亞型、血清型或毒株，或(ii)如果該多肽組分提供的多肽相同或大于該多核苷酸組分編碼的類似HIV免疫原性多肽的數(shù)目，則該多肽組合物的至少一種HIV免疫原性多肽來源于與該多核苷酸組分提供的HIV免疫原性多肽不同的HIV亞型、血清型或毒株。在一個實施方案中，本發(fā)明包括用于在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物，其中所述組合物含有編碼免疫原性HIV多肽的多核苷酸和來源于不同HIV亞型、血清型或毒株的類似HIV免疫原性多肽。編碼HIV免疫原性HIV多肽的多核苷酸用于經(jīng)遞送多核苷酸(例如，引發(fā))來免疫，而來源于不同HIV亞型、血清型或毒株的類似免疫原性HIV多肽免疫用于免疫(例如，加強(qiáng))。例如，一種DNA分子用于核酸免疫，其中所述DNA分子編碼的HIV包膜多肽(i)來源于HIV亞型C分離物，和(ii)對密碼子優(yōu)化以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。該DNA免疫之后用來源于HIV亞型B分離物的HIV包膜多肽進(jìn)行蛋白質(zhì)加強(qiáng)。示范性包膜多肽包括(但不限于)gp120、gpl40、寡聚gpl40和gpl60，包括其突變形式(例如，缺失V2環(huán))。本發(fā)明這方面的一個實施方案包括用于在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物，所述組合物含有具有編碼第一HIV免疫原性多肽的第一多核苷酸的多核苷酸組分；和含有第二HIV免疫原性多肽的多肽組分，其中第一和第二免疫原性HIV多肽可來源于不同的HIV亞型、血清型或毒株，和(ii)第一和第二免疫原性多肽編碼類似的HIV多肽。本發(fā)明的第二個實施方案包括用于在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物，其中所述組合物包含含有兩種或多種編碼免疫原性HIV多肽的多核苷酸的多核苷酸組分，所述多肽來源于至少兩種不同的亞型、血清型或毒株；和具有單一、類似的免疫原性HIV多肽的多肽組分，該HIV免疫原性多肽來源于用于加強(qiáng)的亞型、血清型或毒株的一種。例如，兩種DNA分子用于核酸免疫，其中第一DNA分子編碼的HIV包膜多肽(i)來源于HIV亞型C分離物，和(ii)對密碼子優(yōu)化以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)；第二DNA分子編碼的HIV包膜多肽是(i)來源于HIV亞型B分離物，和(ii)對密碼子進(jìn)行優(yōu)化以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。該DNA免疫之后用來源于(i)HIV亞型B分離物或HIV亞型C分離物的單一HIV包膜多肽進(jìn)行蛋白質(zhì)加強(qiáng)。示范性包膜多肽包括(但不限于)gp120、gpl40、寡聚gpl40和gp160，包括其突變形式(例如，缺失V2環(huán))。本發(fā)明這方面的一個實施方案包括用于在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物，所述組合物包含含有編碼第一免疫原性HIV多肽的第一多核苷酸和編碼第二免疫原性HIV多肽的第二多核苷酸的多核苷酸組分，其中(i)第一和第二免疫原性HIV多肽可來源于不同的HIV亞型，和(ii)第一和第二免疫原性多肽編碼類似的HIV多肽；和具有第一HIV免疫原性多肽或第二HIV免疫原性多肽的多肽組分，前提是該多肽組分含有的HIV免疫原性多肽至少比該多核苷酸組分編碼的少一種。在另一個實施方案中，在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物含有多核苷酸組分，該多核苷酸組分含有兩種或多種多核苷酸序列，而這些序列含有兩種或多種來源于第一HIV亞型的類似HIV免疫原性多肽的編碼序列，其中至少兩種該HIV免疫原性多肽的編碼序列來源于第一亞型的不同HIV毒株；和含有一種或多種類似于該多核苷酸組分編碼的多肽的HIV免疫原性多肽的多肽組分，前提是(i)如果該多肽組分含有的多肽少于該多核苷酸組分編碼的類似HIV免疫原性多肽的數(shù)目，則該多肽組合物的HIV免疫原性多肽可來源于與該第一亞型相同和/或不同的HIV毒株，或(ii)如果該多肽組分包含的多肽相同或大于該多核苷酸組分編碼的類似HIV免疫原性多肽的數(shù)目，則該多肽組合物的HIV免疫原性多肽中的至少一種來源于第一亞型的不同HIV毒株；前提是(i)該多核苷酸組分不編碼來源于除第一亞型以外任何亞型的HIV免疫原性多肽，和(ii)多肽組分不含有來源于除第一亞型以外的任何亞型的HIV免疫原性多肽。多核苷酸組分還可含有本文所述的組分(例如，運載體、載體序列、控制序列等)。多肽組分可含有本文所述的其它組分(例如，運載體、佐劑、免疫增強(qiáng)劑等)。在第三方面，本發(fā)明涉及在免疫方法，特別是在本文所述的方法中使用劑量可變的多核苷酸和多肽(例如，引發(fā)/加強(qiáng)免疫方法)。因此，本發(fā)明另一方面提供在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括在與所述多核苷酸在所述對象中表達(dá)以產(chǎn)生編碼的HIV免疫原性多肽相容的條件下給予對象多核苷酸組分，該多核苷酸基本上由編碼來源于第一亞型的第一HIV毒株的HIV免疫原性多肽的一種多核苷酸組成；和，給予含有一種或多種類似于所述多核苷酸組分編碼的多肽的HIV免疫原性多肽的多肽組分，前提是該多肽組分的至少一種HIV免疫原性多肽來源于第一亞型的第二毒株，其中所述所述第一HIV毒株和所述第二HIV毒株不同。在一個實施方案中，多核苷酸組分不編碼來源于除第一亞型以外任何亞型的類似HIV免疫原性多肽，多肽組分不含有來源于除第一亞型以外任何亞型的類似HIV免疫原性多肽。本發(fā)明另一方面提供在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括在與所述多核苷酸在所述對象中表達(dá)以產(chǎn)生編碼的HIV免疫原性多肽相容的條件下給予對象多核苷酸組分，而該多核苷酸組分含有的多核苷酸含有來源于第一HIV毒株的HIV免疫原性多肽的編碼序列；和，給予含有一種或多種類似于所述多核苷酸組分編碼的多肽的HIV免疫原性多肽的多肽組分，前提是如果該多肽組分含有的多肽相同或大于該多核苷酸組分編碼的類似HIV免疫原性多肽的數(shù)目，則該多肽組合物的HIV免疫原性多肽中的至少一種來源于不同于多核苷酸組分提供的HIV免疫原性多肽的第一(亞型)的HIV毒株。多核苷酸組分能編碼來源于任何亞型的類似HIV免疫原性多肽，多肽組分可含有來源于該亞型或除第一亞型以外另一種亞型的任何其它毒株的類似HIV免疫原性多肽。在另一方面，本發(fā)明提供一種在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括提供一種含有多核苷酸組分和多肽組分的組合物，所述多核苷酸組分基本上由編碼來源于第一HIV毒株的HIV免疫原性多肽的多核苷酸組成，所述多肽組分含有一種或多種與所述多核苷酸組分編碼的多肽類似的HIV免疫原性多肽，前提是所述多肽組分的至少一種HIV免疫原性多肽來源于第二HIV毒株，其中所述第一和第二毒株不同并且可來源于相同或不同亞型；在與所述多核苷酸在所述對象中表達(dá)以產(chǎn)生編碼的HIV免疫原性多肽相容的條件下，給予所述對象以含有所述組合物的所述多核苷酸組分的多核苷酸的基因遞送載體；和給予所述對象以所述多肽組分。在另一個方面，本發(fā)明提供一種在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括提供一種含有多核苷酸組分和多肽組分的組合物，所述多核苷酸組分含有兩種或多種多核苷酸序列，而所述序列含有來源于第一HIV亞型的兩種或多種類似的HIV免疫原性多肽的編碼序列，其中至少兩種HIV免疫原性多肽的編碼序列來源于第一亞型的不同HIV毒株，所述多肽組分含有一種或多種類似于所述多核苷酸組分編碼的多肽的HIV免疫原性多肽，前提是如果該多肽組分含有的多肽相同或大于該多核苷酸組分編碼的類似免疫原性多肽的數(shù)目，則該多肽組合物的至少一種HIV免疫原性多肽來源于不同于所述多核苷酸組分提供的HIV免疫原性多肽的第一亞型的HIV毒株；在與所述多核苷酸在所述對象中表達(dá)相容的條件下，將一種或多種基因遞送載體給予對象來產(chǎn)生編碼的HIV免疫原性多肽，所述載體含有該組合物的所述多核苷酸組分的多核苷酸；和給予所述對象以所述多肽組分。在使用，例如混合多核苷酸引發(fā)(g卩，編碼來源于兩種或多種HIV血清型、亞型或毒株的免疫原性HIV多肽的兩種或多種多核苷酸)結(jié)合多肽加強(qiáng)的任何免疫方法中，本發(fā)明包括使用降低劑量的每種單一組分來提供與使用完全^o量的每種組分等效的免疫應(yīng)答。在一個實施方案中，DNA的高閾值是DNA的最高耐受劑量(例如，約5mg-10mg總DNA)、DNA的低閾值是最低有效劑量(例如，約2嗎-10嗎總DNA)、蛋白質(zhì)的高閾值是蛋白質(zhì)的最高耐受劑量(例如，約lmg總蛋白質(zhì))、蛋白質(zhì)的低閾值是最低有效劑量(例如，約2pg總蛋白質(zhì))。支持本發(fā)明進(jìn)行的實驗證實將總的DNA劑量分在多核苷酸組分的多核苷酸中的效力(例如，實施例4)。此外，支持本發(fā)明進(jìn)行的實驗(例如，實施例4)證實將總的多肽劑量分在含有多肽組分的多肽中的效力?？侱NA和總蛋白質(zhì)一般超過低閾值。在優(yōu)選的實施方案中，在給定的DNA免疫方案中的DNA總量具有低于或等于約10mg總DNA和大于或等于lmg總DNA的高閾值，在給定的多肽加強(qiáng)方案中的蛋白質(zhì)總量具有低于或等于約200pg總蛋白質(zhì)產(chǎn)物和大于或等于10pg總蛋白質(zhì)的高閾值。例如，在使用具有兩種DNA分子的多核苷酸組分的一個實施方案中，所述每種DNA分子編碼免疫原性HIV多肽，就編碼免疫原性HIV多肽的每種DNA分子而言，每位對象使用的每種DNA分子的劑量可是lmg，對于兩種DNA分子而言總共是2mg，或是0.5mg編碼免疫原性HIV多肽的每種DNA分子，對于兩種DNA分子而言總共是lmg。使用多肽組分給藥可類似地變化，例如，使用具有兩種免疫原性HIV多肽的多肽組分，就每種多肽而言，每位對象使用的劑量可是100pg，對于兩種多肽而言總共是200嗎，或是50(ig每種免疫原性HIV多肽，對于兩種多肽而言總共是IOO嗎，或是25略每種免疫原性HIV多肽，對于兩種多肽而言總共是50嗎。如上所述，本發(fā)明的多肽組分可含有多于兩種多肽。在其它實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸組分可含有一種或多種基因遞送載體，所述基因遞送載體含有編碼免疫原性HIV多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多肽組分可含有除免疫原性多肽以外的佐劑。本發(fā)明也包括用于在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括，在編碼HIV免疫原性多肽的多核苷酸與對象中表達(dá)相容的條件下，給予對象以多核苷酸組合物和多肽組合物。多核苷酸和多肽組合物可同時或依次給予。在一個優(yōu)選的實施方案中，用多核苷酸組分免疫在用至少一種多肽組分免疫之前。此外，單次引發(fā)后可進(jìn)行多次加強(qiáng)，或可使用一系列引發(fā)和加強(qiáng)。用于本發(fā)明的示范性包膜蛋白和其編碼序列包括(但不限于)gp120、gpl40、寡聚gpl40和gpl60，包括其成熟或修飾的形式(例如，刪除V2環(huán)、切割位點中突變或在糖基化位點中突變)。在一個實施方案中，修飾以暴露多肽與CCR5受體結(jié)合區(qū)域的HIV包膜多肽以及編碼這種多肽的多核苷酸序列可用于實踐本發(fā)明。從體液免疫的觀點看，產(chǎn)生提供初級分離物的中和作用的免疫應(yīng)答是有用的，所述初級分離物利用了據(jù)信對病毒進(jìn)入重要的CCR5趨化因子共同受體(Zhu，T.等，(1993)Science261:1179-1181;Fiore，J.等，(1994)Virology,204:297-303)。這些和其它用于HIV免疫的示范性多核苷酸構(gòu)建物(例如，各種包膜蛋白編碼序列)、制造多核苷酸構(gòu)建物的方法、相應(yīng)的多肽產(chǎn)物和制造多肽的方法已在，例如以下文獻(xiàn)中描述PCT國際公布號WO/00/39302;WO/00/39304;WO/02/04493;WO/03/004657;WO/03/004620和WO/03/020876;美國專利號6,602,705和美國公布專利申請?zhí)?0030143248和20020146683。雖然參考HIV亞型B和C作為示范性亞型描述了本發(fā)明，本發(fā)明的組合物和方法可應(yīng)用于各種HIV亞型、血清型或毒株及其編碼的免疫原性多肽，包括(但不限于)HIV-1亞型A-K、N和O，己鑒定的CRF(循環(huán)重組形式)和HIV-2毒株及其亞型。參見，例如Myers等，LosAlamos數(shù)據(jù)庫，LosAlamos國家實驗室，新墨西哥；Myers等，"人逆轉(zhuǎn)錄病毒和艾滋病"(HumanRetrovirusesandAids)，1990，LosAlamos,新墨西哥LosAlamos國家實驗室)。Env的進(jìn)一步修飾包括(但不限于)產(chǎn)生編碼其中具有突變和/或缺失的Env多肽的多核苷酸。例如，超變區(qū)V1、V2、V3、V4和/或V5的一些或全部可如本文所述刪除或修飾，特別是VI、V2和V3區(qū)域。VI和V2區(qū)域可掩蓋CCR5共同受體結(jié)合位點。(參見，例如Moulard等，(2002)Proc.Nat'lAcad.Sci14:9405-9416)。因此，某些實施方案中刪除了一些或全部可變環(huán)區(qū)域，例如可能暴露保守的中和表位。此外，由于高度糖基化也遮蔽了蛋白質(zhì)表面可能的中和表位，N-相連位點的去糖基化也是可能的修飾靶位。單用或與可變區(qū)刪除和/或去糖基化修飾聯(lián)用的其它任選的修飾作用包括對)3-片層區(qū)域的修飾(例如，刪除)(例如，WO00/39303所述)、對前導(dǎo)序列的修飾(例如，加入Kozak序列和/或用具有天然或序列修飾的tpa前導(dǎo)序列取代修飾的野生型前導(dǎo)序列)和/或?qū)Φ鞍酌盖懈钗稽c的修飾(例如，Chakrabarti等，(2002)J.Virol.76(11):5357-5368描述了在切割位點、gp41的促融合區(qū)域和保留天然抗原性構(gòu)象決定簇的gp41的七殘基重復(fù)序列1和2的間距含有缺失的gpl40SCFI，寡聚物的形成和體外的病毒中和作用，所述"保留天然抗原性構(gòu)象決定簇"定義為與已知的單克隆抗體或CD4結(jié)合)。這些修飾的各種組合可用于產(chǎn)生本文所述野生型或合成多核苷酸序列。.Eiw多肽編碼序列的修飾可導(dǎo)致(l)相對于野生型編碼序列，提高在許多哺乳動物細(xì)胞系中的表達(dá)(以及其它類型的細(xì)胞系，包括(但不限于)昆蟲細(xì)胞))，和/或(2)提高中和表位的呈遞。類似的Env多肽編碼序列可從各種分離物中得到、修飾和測試以提高表達(dá)。本文所述的任何多核苷酸(例如，表達(dá)盒)或多肽(由上述的任何方法遞送)也可與其它DNA遞送系統(tǒng)和/或蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng)聯(lián)用。非限制性的例子包括這些分子在，例如引發(fā)-加強(qiáng)方法中的共同給予，其中一種或多種分子在"引發(fā)"步驟中遞送，隨后在"加強(qiáng)"步驟遞送一種或多種分子。在某些實施方案中，遞送含有一種或多種核酸的組合物之后遞送含有一種或多種核酸的組合物和含有一種或多種含有多肽的組合物(例如，含有HIV抗原的多肽)。在其它實施方案中，多次核酸"引發(fā)"(相同或不同的核酸分子)之后可進(jìn)行多次多肽"加強(qiáng)"(相同或不同的多肽)。其它實施例包括多次給予核酸和多次給予多肽。在任何涉及共同給藥的方法中，各種組合物可以任何順序遞送。因此，在包括遞送多種不同的組合物或分子的實施方案中，核酸無需全部在多肽之前遞送。例如，引發(fā)步驟可包括遞送一種或多種多肽，加強(qiáng)步驟可包括遞送一種或多種核酸和/或一種或多種多肽。多次多肽給藥之后可進(jìn)行多次核酸給藥，或者多肽與核酸給藥可以任何順序進(jìn)行。因此，本文所述的一種或多種核苷分子(例如，表達(dá)盒)和本文所述的一種或多種多肽可經(jīng)任何給藥途徑以任何順序共同給藥。所以，本文所述多核苷酸和多肽的任何組合可用于引發(fā)免疫反應(yīng)。此外，采用引發(fā)-加強(qiáng)方案(例如，本文所述的那些方案)可有益于降低受感染的對象中的病毒負(fù)荷以及可能減緩或防止HIV相關(guān)疾病的進(jìn)展(相對于未治療的對象)。實驗以下是實施本發(fā)明的特定實施方案的實施例。提供這些實施例僅是為了說明性目的而決非要限制本發(fā)明的范圍。我們努力保證所用數(shù)值(例如，量、溫度等)的精確，但也當(dāng)然應(yīng)該允許一些實驗性誤差和偏差。實施例1合成表達(dá)盒的產(chǎn)生A.產(chǎn)生合成多核苷酸用于實踐本發(fā)明的多核苷酸序列通常經(jīng)處理以在所需宿主或宿主細(xì)胞中最大地表達(dá)其基因產(chǎn)物。以下是有關(guān)密碼子優(yōu)化和HIV多肽的功能性變體的一些示范性指導(dǎo)。以下步驟的順序可變。首先，可修飾HIV-1密碼子使用模式使得到的核酸編碼序列與在高度表達(dá)的人基因中發(fā)現(xiàn)的密碼子使用相差不大。HIV密碼子使用反映了密碼子-三聯(lián)體的核苷酸A或T的高含量。HIV-1密碼子使用的作用是在DNA序列中的高AT含量，這導(dǎo)致在RNA中的高AU含量以及降低mRNA的翻譯能力和穩(wěn)定性。比較起來，高度表達(dá)的人密碼子優(yōu)選核苷酸G或C。通常修飾編碼多肽的野生型多核苷酸序列以使與在高度表達(dá)的人基因中發(fā)現(xiàn)的密碼子使用相差不大。其次，產(chǎn)生了一些基因變體(例如，野生型多肽的突變形式)。下表(表2)公布了影響幾種HIV基因活性的突變。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>含有這些突變的示范性多核苷酸已見描述(參見，例如PCT國際公布號WO/00/39302;WO/00/39303;WO/00/39304;WO/02/04493;WO/03/004657;WO/03/004620和WO/03/020876)。鑒于本說明書的指導(dǎo)，采用上表所示的指導(dǎo)可降低或消除相關(guān)基因產(chǎn)物的功能。本發(fā)明一方面包括Env編碼序列，所述序列包括(但不限于)編碼以下HIV所編碼多肽的多核苷酸序列g(shù)pl60、gpl40和gpl20(參見，例如描述HIV-1SF2("SF2")Env多肽的美國專利號5，792，459)。這些多肽之間的關(guān)系示于圖3(在圖中多肽以直線表示，氨基和羧基末端示于gpl60線上；開放的圓圈表示寡聚化結(jié)構(gòu)域；開放的正方形表示跨膜結(jié)構(gòu)域(TM);"C"表示gpl40.nmt中切割位點的位置；"X"表示切割位點已突變不再作為切割位點)。多肽gpl60包括gpl20和gp41的編碼序列。多肽gp41由包括寡聚化結(jié)構(gòu)域(OD)和跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)的幾個結(jié)構(gòu)域組成。在天然包膜中，寡聚化結(jié)構(gòu)域要與三個gP41多肽非共價結(jié)合以形成三聚物結(jié)構(gòu)；通過與gP41三聚物(及自身)的非共價相互作用，gpl20多肽也組成三聚結(jié)構(gòu)。切割位點(或幾個切割位點)約存在于gpl20的多肽序列和對應(yīng)于gp41的多肽序列之間。該切割位點(或幾個切割位點)可突變以防止在該位點的切割。得到的gpl40多肽對應(yīng)于gpl60的截短形式，其中刪除了gp41的跨膜結(jié)構(gòu)域。由于在gp41部分中存在寡聚化結(jié)構(gòu)域，該gpl40多肽可以單體和寡聚(即，3聚物)形式存在。當(dāng)突變切割位點以防止切割以及刪除gp41的跨膜部分時，得到的多肽產(chǎn)物命名為"突變的"gpl40(例如，gpl40.mut)。本領(lǐng)域的人員可明白，可以各種方式突變切割位點。(也參見，例如PCT國際公布號WO00/39302和WO/02/04493)?？蓮娜魏我阎腍IV分離物選擇野生型HIV編碼序列(例如，Gag、Env、Pol、tat、rev、nef、vpr、vpu、vif等)并且可根據(jù)本發(fā)明的指導(dǎo)對這些序列進(jìn)行處理以最大表達(dá)它們的基因產(chǎn)物。野生型編碼區(qū)域可以一種或多種以下方式來修飾刪除編碼Env的超變區(qū)，特別是V1和/或V2的序列，和/或?qū)⑼蛔円?，例如編碼Env中切割位點的序列中以取消寡聚的gpl40被酶切割成gpl20單體。(參見，例如Earl等，(19卯)PNASUSA87:648-652;Earl等，(1991)J.Virol.65:31-41)。在又一實施方案中，刪除了超變區(qū)、除去了糖基化位點和/或使切割位點突變。如上所述，可將不同的突變引入不同基因的編碼序列(參見，例如表2)。為產(chǎn)生本發(fā)明的合成非編碼序列，設(shè)計含有完整的感興趣編碼序列的基因盒。通過寡核苷酸合成和PCR擴(kuò)增構(gòu)建合成的基因盒以產(chǎn)生基因片段。選擇引物以提供用于亞克隆的方便的限制性位點。然后連接得到的片段以產(chǎn)生完整的所需序列，再將該序克隆入合適的載體。最終的合成序列是(i)經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和分析篩選的，(ii)為確認(rèn)得到所需序列而經(jīng)DNA測序和(iii)通過SDS-PAGE和Western印跡確認(rèn)所表達(dá)蛋白質(zhì)的同一性和完整性。合成的編碼序歹l(由ChironCorp.(Emeryville,CA)或MidlandCertifiedReagentCompany(Midland，Texas)裝配。本發(fā)明的合成序列的同一性百分比可用，例如Smith-Waterman檢索算法(TimeLogic,InclineVillage,NV)，按照以下示范性參數(shù)來確定權(quán)重矩陣=nuc4x4hb;間隔開放罰分=20、間隔延伸罰分=5、報道閾值=1、對比閾值=20?？山M合本發(fā)明不同實施方案的各種形式(例如構(gòu)建物)。一些用于實踐本發(fā)明的合成多核苷酸的示范性實施方案討論于實施例4并示于圖6-19。B.產(chǎn)生含有本發(fā)明的合成多核苷酸的表達(dá)盒本發(fā)明的合成DNA片段可克隆入許多病毒或非病毒表達(dá)載體。例如，用于實踐本發(fā)明的多核苷酸可克隆入以下非病毒表達(dá)載體(i)用于瞬時表達(dá)測定和DNA免疫研究的pCMVKm2，該pCMVKm2載體來源于pCMV6a(Chapman等，A^c.爿c/Ai^.(1991)li:3979-3986)并含有卡那霉素選擇標(biāo)記、Coffil復(fù)制起點、CMV啟動子增強(qiáng)子和內(nèi)含子A，然后是用于下述合成序列的插入位點，接著是來源于牛生長激素的聚腺苷酸化信號-該pCMVKm2載體與pCMV-link載體的區(qū)別僅在于pCMVKm2中插入多接頭位點以產(chǎn)生pCMV-link;(ii)用于在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)的pESN2dhfr和pCMVPLEdhfr(也稱為pCMVIII);和(iii)用于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的一種穿梭載體pAcC13(pAcC13來源于如MunemitsuS.等，Mo/Ce//5/o/.10(11):5977-5982，19卯所述的pAcC12)。也參見描述這些載體的PCT國際公布號WO00/39302、WO00/39303、WO00/39304、WO02/04493。簡言之，pCMVPLEdhfr(pCMVIII)的構(gòu)建如下。為構(gòu)建DHFR盒，PCR擴(kuò)增pCite-4a+(Novagen，Inc,，Milwaukee,WI)的EMCVIRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點)前導(dǎo)序列并將其作為Z6fl-Wco片段插入pET-23d(Novagen，Inc.，Milwaukee,WI)得到pET-EMCV。PCR擴(kuò)增pESN2dhfr的dhfr基因得到具有替代翻譯終止密碼子的Gly-Gly-Gly-Ser間隔區(qū)的產(chǎn)物并作為7Vco-5amHl片段插入得到pET-E-DHFR。其次，PCR擴(kuò)增pSV2Neo(Clontech，PaloAlto，CA)衍生物的減毒基因并將其插入pET-E-DHFR的獨特的5amHl位點得到pET-E-DHFR/Neo(m2)。然后，在weo基因的下游插入pCDNA3(Invitrogen，Inc.,Carlsbad,CA)的牛生長激素終止子得到pET-E-DHFR/Neo(m2)BGHt。通過切割pET-E-DHFR/Neo(m2)BGHt來制備EMCV-W戶/"eo選擇標(biāo)記盒片段。CMV增強(qiáng)子/啟動子+內(nèi)含子A作為片段從pCMV6a(Chapman等，Nuc.AcidsRes.(1991)19:3979-3986)轉(zhuǎn)移入pUC19(NewEnglandBiolabs，Inc.,Beverly,MA)。從Ndel到Sapl位點刪除pUC19的載體骨架。上述DHFR盒加入構(gòu)建物使得EMCVIRES在CMV啟動子之后以產(chǎn)生最終構(gòu)建物。該載體也含有ampr基因和SV40復(fù)制起點。本發(fā)明的表達(dá)載體可含有一種或多種編碼免疫原性多肽的多核苷酸序列。當(dāng)表達(dá)盒含有多條編碼序列時，所述編碼序列可全部在框內(nèi)以產(chǎn)生一種多蛋白；或者，多條多肽編碼序列可含有多順反子信息，例如將IRES置于每條多肽編碼序列的5';此外，可存在多個啟動子以引導(dǎo)多條編碼序列的表達(dá)。實施例2合成的HIV表達(dá)盒以及所編碼的多肽在小鼠中的體內(nèi)免疫原性A.免疫為評價本發(fā)明的組合物用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫原性，可進(jìn)行小鼠研究。使用各種DNA劑量(0.02-20(Vg)的多核苷酸組分(例如，兩種基于pCMVlink的質(zhì)粒，每種攜帶具有ddV2的gpl40的密碼子優(yōu)化編碼序列，第一種編碼序列來源于SF162，亞型B;第二種編碼序列來源于TV1，亞型C)稀釋為總注射體積100nl。為克服稀釋的DNA的可能的負(fù)稀釋作用，每份樣品中總的DNA濃度可單獨使用載體(例如，pCMVlink)進(jìn)行調(diào)整。組10-12只的Balb/c小鼠(CharlesRiver，Boston,MA)使用各種劑量經(jīng)肌肉內(nèi)免疫(每條腿50pl，肌肉內(nèi)注射入脛骨前)。然后在DNA免疫一定間隔后以合適的多肽濃度，使用來源于SF162，亞型B,寡聚、密碼子優(yōu)化的具有delV2的gpl40多肽免疫小鼠。B.體液免疫應(yīng)答免疫后0和2-4周間隔的小鼠血清用合適抗-HIV抗體ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)檢測體液免疫應(yīng)答。血清的抗體滴度通過抗-HIV抗體ELISA測定。簡言之，篩選免疫小鼠的血清中直接抗HIV包膜蛋白的抗體。以每孔0.2|igHIV包膜gpl40蛋白涂布ELISA微滴度板過夜并洗滌4次；然后用PBS-0.2。/。吐溫(Sigma)封閉2小時。除去封閉溶液后，加入100pl稀釋的小鼠血清。此后，以l/25稀釋并通過連續(xù)的3倍稀釋測試血清。洗滌微滴度板4次并與繼發(fā)性、過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG抗體(Pierce，Rockford，IL)孵育。洗滌ELISA板并向每孔加入lOO(il3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB;Pierce)。15分鐘后測量每孔的光密度。所報道的滴度是得到最大光密度(O.D.)—半的血清稀釋度的倒數(shù)。這些測定的結(jié)果用于顯示本發(fā)明的多核苷酸/多肽免疫方法在小鼠中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的效力。C.細(xì)胞免疫應(yīng)答特定的細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞(CTL)的頻率通過肽脈沖Balb/c小鼠CD4細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測定來評價。HIV蛋白表達(dá)的牛痘病毒感染的CD-8細(xì)胞可用作陽性對照(w-蛋白)。簡言之，脾細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞，E)獲得自BALB/c小鼠(如上所述免疫)。培養(yǎng)、再次刺激細(xì)胞并測定抗，例如包膜蛋白脈沖靶細(xì)胞的CTL活性(參見，例如一般描述該測定的Doe，B.和Walker，C.M.,J/DS10(7):793-794，1996)。在標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放測定中檢測細(xì)胞毒性活性。靶細(xì)胞(T)與效應(yīng)細(xì)胞(E)以各種E:T比例一起培養(yǎng)4小時，雙復(fù)孔的平均cpm用于計算特定的"Cr釋放百分比。免疫小鼠中的抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答也可由zurMegede，J.等，在"序列修飾的1型人免疫缺陷病毒亞型Bpol和gagpolDNA疫苗的表達(dá)和免疫原性"(Expressionandimmunogenicityofsequence-modifiedhumanimmunodeficiencyvirustype1subtypeBpolandgagpolDNAvaccines),JVirol.77:6197-207，(2003)中所述的胞內(nèi)細(xì)胞因子生產(chǎn)的流式細(xì)胞術(shù)測定(細(xì)胞因子流式細(xì)胞術(shù)或"CFC")來檢測。細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)或CFC活性在回收自用本文所述HIVDNA構(gòu)建物和多肽免疫的小鼠的脾細(xì)胞中檢測。免疫動物的效應(yīng)細(xì)胞一般表現(xiàn)出特異性裂解作為CTL應(yīng)答指標(biāo)的HIV肽脈沖SV-BALB(MHC匹配)靶細(xì)胞。肽脈沖的和來源于MHC不匹配小鼠品系(MC57)的耙細(xì)胞不裂解。CTL或CFC測定的結(jié)果用于顯示本發(fā)明的多核苷酸/多肽免疫方法通過DNA免疫誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的效力。實施例3體內(nèi)免疫原性研究A.總的免疫方法為評價使用本發(fā)明的組合物(含有多核苷酸組分和多肽組分)和方法產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，使用豚鼠、家兔、小鼠、恒河猴和/或狒狒進(jìn)行研究。這些研究一般按下表(表3)所示構(gòu)成并使用，例如以下組分亞型BDNA--攜帶具有ddV2的gpl40的密碼子優(yōu)化編碼序列的pCMVlink，該編碼序列來源于SF162、亞型B;亞型CDNA-攜帶具有delV2的gpl40的密碼子優(yōu)化編碼序列的pCMVlink，該編碼序列來源于TV1、亞型C;亞型B蛋白—來源于SF162、亞型B多肽、寡聚、密碼子優(yōu)化的具有delV2的gpl40;和亞型C蛋白—來源于TV1、亞型C多肽的、寡聚、密碼子優(yōu)化的具有ddV2的gp140。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>該免疫可使用單次或多次DNA免疫與單次或多次蛋白質(zhì)免疫。上表中的免疫方法示范了以下方法引發(fā)/加強(qiáng)方案(亞型BDNA/亞型B蛋白；亞型CDNA/亞型C蛋白)；混合的引發(fā)/加強(qiáng)，單次DNA引發(fā)和單次蛋白質(zhì)加強(qiáng)(亞型BDNA/亞型C蛋白；亞型CDNA/亞型B蛋白)；混合的DNA引發(fā)單次蛋白質(zhì)加強(qiáng)(亞型B和CDNA/亞型B蛋白；亞型B和CDNA/亞型C蛋白)；單次DNA引發(fā)混合的蛋白質(zhì)加強(qiáng)(亞型BDNA/亞型B和C蛋白；亞型CDNA/亞型B和C蛋白)；與混合的DNA引發(fā)混合的蛋白質(zhì)加強(qiáng)(亞型B和CDNA/亞型B和C蛋白)。免疫方案也可包括編碼多肽的多核苷酸和來自同一亞型的兩種毒株不同毒株的類似多肽。例如，多核苷酸可編碼毒株MN的env，類似的多肽組分可含有SF162的env。如本文進(jìn)一步討論的，多肽和/或編碼多肽的多核苷酸可截短修飾或改變以增強(qiáng)免疫原性?；旌蠘悠分械拿糠NDNA和/或蛋白質(zhì)(即，在本實施例中是B和C)的量可以與單次免疫遞送相等的量加入(從而遞送2XDNA和/或蛋白質(zhì)總量)，或者可調(diào)整混合樣品中的每種DNA和/或蛋白質(zhì)的量從而在混合與單一樣品中遞送相同的DNA和/或蛋白質(zhì)總量(1X)。除了表3示范的多核苷酸組分和多肽組分組合的例子外，還提及了示范兩種多核苷酸或兩種多肽組分的其它組合。例如，使用HIV亞型B和亞型C免疫原組合繼續(xù)以上實施例，本發(fā)明也包括單次DNA引發(fā)和單次DNA加強(qiáng)(亞型BDNA/亞型CDNA);單次蛋白質(zhì)引發(fā)和單次蛋白質(zhì)加強(qiáng)(亞型B蛋白/亞型C蛋白)。B.小鼠可按照表3說明的免疫方案并使用基本上如實施例2所述的方法在小鼠中進(jìn)行實驗。C.豚鼠在豚鼠中進(jìn)行的實驗如下。各組(每組6只豚鼠)在0、4和12周用如表3所示含有表達(dá)盒的質(zhì)粒DNA經(jīng)胃腸外(例如，肌肉內(nèi)或真皮內(nèi))或粘膜免疫，所述表達(dá)盒含有一種或多種HIV免疫原性多肽(例如，實施例2所述的gpl40DNA)。然后，一亞組動物約于12-24周用如表3所示單劑量的HIV蛋白(例如，實施例2所述的gpl40DNA)加強(qiáng)(肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)或粘膜)。然后動物可以8-16周的間隔用HIV蛋白加強(qiáng)多次。在第三次DNA免疫兩周后和蛋白質(zhì)加強(qiáng)兩周后檢測抗體滴度(幾何平均滴度)。這些研究的結(jié)果用于證明本發(fā)明的組合物和方法產(chǎn)生免疫應(yīng)答，特別是產(chǎn)生廣泛和強(qiáng)有力抗各種HIV毒株的中和活性的有效性。D.家兔在家兔中進(jìn)行的實驗如下。用如表3所示含有表達(dá)盒的質(zhì)粒DNA在多位點經(jīng)肌肉內(nèi)或真皮內(nèi)(使用針注射，然后使用或不使用電穿孔，或使用Bioject無針注射)或粘膜免疫家兔，所述表達(dá)盒含有一種或多種HIV免疫原性多肽(例如，實施例2所述的gp140DNA)。然后，一亞組動物用如表3所示單劑量的HIV蛋白(例如，實施例2所述的gp140DNA)力卩強(qiáng)(肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)或粘膜)。動物可用HIV蛋白加強(qiáng)多次。用于產(chǎn)生免疫應(yīng)答的本發(fā)明組合物一般是高度免疫原性的并且基本上僅在家兔中免疫兩次后產(chǎn)生抗原結(jié)合抗體的應(yīng)答。這些研究的結(jié)果用于證明本發(fā)明的組合物和方法產(chǎn)生免疫應(yīng)答，特別是產(chǎn)生廣泛和強(qiáng)有力抗各種HIV毒株的中和活性的有效性。E.恒河猴在恒河猴中進(jìn)行的實驗如下。在約0、4、8和24周用如表3所示含有表達(dá)盒的質(zhì)粒DNA經(jīng)胃腸外或粘膜免疫恒河猴，所述表達(dá)盒含有一種或多種HIV免疫原性多肽(例如，實施例2所述的gpl40DNA)?？衫迷鰪?qiáng)的DNA遞送系統(tǒng)來增加在免疫方案的DNA引發(fā)期間的免疫應(yīng)答，所述系統(tǒng)例如使用與PLG微粒形成復(fù)合物的DNA或DNA的鹽水注射接著進(jìn)行電穿孔。然后，一亞組動物用如表3所示單劑量的HIV蛋白(例如，實施例2所述的gpl40DNA)加強(qiáng)(肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)或粘膜)。然后動物可在3-6個月的間隔用HIV蛋白加強(qiáng)多次。通常，在使用2或3次lmg劑量的多核苷酸組分后通過CTL測定或細(xì)胞因子流式細(xì)胞術(shù)檢測到恒河猴具有可檢測的HIV特異性T細(xì)胞應(yīng)答。也可檢測中和抗體。這些研究的結(jié)果用于證明本發(fā)明的組合物和方法產(chǎn)生免疫應(yīng)答，特別是產(chǎn)生廣泛和強(qiáng)有力抗各種HIV毒株的中和活性的有效性。用如表3所示含有表達(dá)盒的質(zhì)粒DNA經(jīng)胃腸外或粘膜免疫狒狒4次(在約0、4、8禾卩24周)，所述表達(dá)盒含有一種或多種HIV免疫原性多肽(例如，實施例2所述的gpl40DNA)。DNA可在鹽水中(有或沒有電穿孔)或在PLG微粒上形成復(fù)合物來遞送。然后，一亞組動物用如表3所示單劑量的HIV蛋白(例如，實施例2所述的gpl40DNA)加強(qiáng)(肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)或粘膜)。動物通?？稍?-6個月的間隔用HIV蛋白加強(qiáng)多次。每次免疫后2-4周對動物放血并用分離的血漿進(jìn)行fflV抗體ELISA。該ELISA基本上按下文G章節(jié)所述進(jìn)行，除了使用的二抗共軛物一般是以1:500稀釋的抗-人IgG，g-鏈特異性過氧化物酶共軛物(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MD63178)。50pg/ml酵母提取物可加入血漿樣品和抗體共軛物的稀釋液以降低由于狒狒中預(yù)先存在的酵母抗體造成的非特異性背景。在用HIV-多肽加強(qiáng)后通常在狒狒中觀察到淋巴增殖應(yīng)答。這種增殖結(jié)果是誘導(dǎo)T輔助細(xì)胞功能的指標(biāo)。這些研究的結(jié)果用于證明本發(fā)明的組合物和方法產(chǎn)生免疫應(yīng)答，特別是產(chǎn)生廣泛和強(qiáng)有力抗各種HIV毒株的中和活性的有效性。G.體液免疫應(yīng)答在任何免疫動物模型(包括上述以及，例如黑猩猩)中，在免疫后的各種時間用抗-HIV抗體ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)檢測免疫動物的血清樣品中的體液免疫應(yīng)答。血清的抗體滴度通過上述抗-HIV抗體ELISA測定。簡言之，篩選免疫動物的血清中直接抗用于免疫動物的DNA編碼的HIV多肽/蛋白質(zhì)和/或用于免疫動物的多肽(例如，寡聚的gpl40)的抗體。通常使用對應(yīng)于免疫研究中使用的每種亞型的多肽進(jìn)行獨立ELISA測定。ELISA微滴定板的孔用選擇的HIV多肽/蛋白質(zhì)涂布過夜，洗滌4次，然后用PBS-0.2。/。吐溫(Sigma)封閉2小時。除去封閉液后，加入100nl稀釋的小鼠血清。然后，以1/25稀釋并用連續(xù)3倍稀釋來測試血清。洗滌微滴定板4次并與繼發(fā)性、過氧化物酶偶聯(lián)的抗-小鼠IgG抗體孵育(Pierce，Rockford，IL)。洗滌ELISA板并向每孔加入100jil3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB;Pierce)。15分鐘后檢測每孔的光密度。所報道的滴度一般是得到最大光密度(O.D.)—半的血清稀釋度的倒數(shù)。'也可評價細(xì)胞免疫應(yīng)答。血清中中和抗體的存在基本上如下測定在來源于NathanielLandau博士(SalkInstitute,SanDiego，CA)的5.25.EGFP丄uc.M7(M7-luc)細(xì)胞中檢測病毒中和作用。除了使用市售熒光素酶試劑盒(Promega)通過熒光素酶報道基因表達(dá)來定量病毒感染外，該測定的形式基本上與其它文獻(xiàn)所述的MT-2試驗相同(Montefiori等，(1988)JC""Mkro嵐26:231-235)。所有血清樣品在測定前于56。C，熱滅活1小時。HIV-1分離物的病毒原種在PBMC中產(chǎn)生。實施例4用作引發(fā)的各種HIV多肽編碼質(zhì)粒和用作加強(qiáng)的各種HIV多肽的免疫原性方案的評價為評價用于DNA引發(fā)/加強(qiáng)的亞型C(TV1)和亞型B(SF162)pgl40dV2DNA和蛋白質(zhì)的組合作用，在家兔中進(jìn)行以下實驗。DNA是分別在兩個質(zhì)粒中遞送的gpl40mod.TVl.dV2和gpl40mod.SF162.dV2(DNA的來源在下文進(jìn)一步描述)。蛋白質(zhì)是寡聚物o-gpl40.dV2.TVl和o-gpl40.dV2.SF162(蛋白質(zhì)的來源在下文進(jìn)一步描述)。DNA構(gòu)建物以3種劑量按0、4、12周的時間表用于免疫。蛋白質(zhì)于12、24和41周加強(qiáng)。每只家兔在兩側(cè)IM/四頭肌處注射1.0mlDNA混合物，然后進(jìn)行電穿孔(G.Widera，"在體內(nèi)通過電穿孔增力t]DNA疫苗遞送和免疫原性"(IncreasedDNAvaccinedeliveryandimmunogenicitybyelectroporationWvo)，J.Immunology，164，4635-4640(2000))。MF59佐劑蛋白質(zhì)按lml/動物注射于兩側(cè)IM/Glut。所有基因均經(jīng)序列修飾以提高編碼的Env糖蛋白以Rev-非依賴方式表達(dá)，然后將這些基因克隆入pCMV的質(zhì)粒載體用于上述DNA疫苗和蛋白質(zhì)生產(chǎn)。。這些序列如本文所述是密碼子優(yōu)化的。簡言之，所有修飾的包膜基因克隆入ChironpCMVlink質(zhì)粒載體，優(yōu)選克隆入EcoRI/XhoI位點。為獲得gpl40多肽，每個gpl40構(gòu)建物(g口，gpl40mod.TVl.mut7.delV2和gpl40.mut7.modSF162.delV2)用于以下方法。按照生產(chǎn)商的使用說明，使用MinisTransIT-LTl多胺轉(zhuǎn)染試劑(MimsCoiporation，MadisonWI)用編碼gpl40蛋白質(zhì)(例如，pCMV載體骨架)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞并孵育96小時。96小時后，將培養(yǎng)基換為選擇培養(yǎng)基(F12專用250pg/mlG418)，細(xì)胞以l:5分裂并再孵育48小時。每5-7天更換培養(yǎng)基直至菌落開始形成，在此時檢出菌落、接種于96孔板并通過gpl20俘獲ELISA進(jìn)行篩選。陽性克隆展開于24孔板并如上述通過俘獲ELISA進(jìn)行多次Env蛋白質(zhì)生產(chǎn)的篩選。當(dāng)在24孔板上達(dá)到匯合時，陽性克隆于T25燒瓶(Corning，Coming,NY)中擴(kuò)增。長至匯合后，這些克隆經(jīng)數(shù)次篩選，陽性克隆在T75燒瓶中擴(kuò)增。陽性T75克隆冷凍于液氮，用不同濃度的0-5pM氨甲喋呤(MTX)擴(kuò)增最高表達(dá)克隆并將其接種于10mm培養(yǎng)皿。篩選形成菌落的板并如上述再次擴(kuò)增所有陽性克隆。擴(kuò)增克隆并在每一步用gpl20俘獲ELISA擴(kuò)增并篩選。陽性克隆在每種氨甲喋呤水平冷凍。為了將規(guī)模擴(kuò)大至更大的生物反應(yīng)器，產(chǎn)量最高的克隆生長于預(yù)融合生物反應(yīng)器(3L,100L)來擴(kuò)增并使之適應(yīng)低血清懸浮培養(yǎng)條件。表達(dá)Env多肽的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞系用于產(chǎn)生gpl40蛋白。純化蛋白質(zhì)，簡言之通過以前所述的三步方案進(jìn)行(Srivastava等，"初級r5亞型B人免疫缺陷病毒的寡聚包膜糖蛋白的純化和鑒定"(Purificationandcharacterizationofoligomericenvelopeglycoproteinfromaprimaryr5subtypeBhumanimmunodeficiencyvirus),JVirol76:2835-47(2002))。首先，濃縮的細(xì)胞上清液通過GalanthusNivalis-瓊脂糖柱(GNA;VectorLaboratories,Burlingame,CA)。gpl40SF162AV2蛋白結(jié)合于該柱，而大多數(shù)污染蛋白質(zhì)流過。用500mM甲基甘露糖吡喃糖苷(MMP)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。然后俘獲的蛋白質(zhì)通過DEAE和CHAP柱。這些方法適用于來源于其它HIV亞型的其它HIV基因和蛋白質(zhì)。此外，雖然該分析在家兔中進(jìn)行，類似的分析也可在其它類型，例如實施例3所述的動物中進(jìn)行。免疫周數(shù)可變。下表(表4)列出了示范性的方法，用于比較使用電穿孔的編碼包膜多肽的亞型B和亞型C多核苷酸(在pCMVlink載體中)與亞型B和C包膜多肽的各種組合(單用或作為混合亞型疫苗)在家兔中的免疫原性。根據(jù)本發(fā)明的指導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可明白這種方法也同樣適用于編碼免疫原性HIV多肽的任何其它多核苷酸和免疫原性HIV多肽。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>MF59C佐劑是在10mM檸檬酸、pH6中含有5。/。角鯊烯、0.5%吐溫80、0.5%司盤85的微流化乳劑，以10ml等份試樣保存于4°C。Iscomatrix佐劑是用于蛋白質(zhì)遞送的基于quil皂草毒蛋白的佐劑(來源于，例如，CSLLimited,Victoria,Australia)。表4所列的多核苷酸和多肽如表5所述制備。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>按下表(表6)所述制備給予各組動物的免疫原。<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>免疫3-4-蛋白質(zhì)免疫蛋白質(zhì)劑量是50pg每種蛋白/動物，總共100pg。起始蛋白在檸檬酸緩沖液中稀釋至0.200mg/ml。保存于-80'C待用。于室溫融解；物質(zhì)清澈無顆粒物。向融解的蛋白質(zhì)中加入等體積的MF95C佐劑并通過翻轉(zhuǎn)試管良好混合。用每側(cè)(IM/Glut)0.5ml佐劑蛋白免疫每只家兔，每只動物的總體積為lml。在加入佐劑后1小時內(nèi)使用蛋白質(zhì)。用針注射。11免疫1一3:鹽水配制的亞型B質(zhì)粒DNA免疫原以無菌0.9%鹽水配制的1.0mg/ml總DNA提供。保存于-8(TC待用。于室溫融解DNA;物質(zhì)清澈或略有混濁無顆粒物。用每側(cè)(IM/四頭肌)0.5mlDNA混合物免疫每只家兔，每只動物兩側(cè)的總體積為l.Oml。動物在免疫前以1X劑量IP(按動物體重計)的氯胺酮-甲苯噻嗪(80mg/ml-4mg/ml)鎮(zhèn)靜狀態(tài)下剃毛。用針注射DNA。DNA注射后，使用直徑lcm、針長lcm的6-針循環(huán)陣列進(jìn)行電穿孔。電穿孔脈沖以20V/mm、50ms脈沖長、l次脈沖/秒給予。免疫3-4,蛋白質(zhì)免疫蛋白質(zhì)劑量是50嗎蛋白/動物。起始蛋白在檸檬酸緩沖液中稀釋至0.100mg/ml。保存于-80'C待用。于室溫融解；物質(zhì)清澈無顆粒物。向融解的蛋白質(zhì)中加入等體積的MF95C佐劑并通過翻轉(zhuǎn)試管良好混合。用每側(cè)(IM/Glut)0.5ml佐劑蛋白免疫每只家兔，每只動物的總體積為lml。在加入佐劑后1小時內(nèi)使用蛋白質(zhì)。用針注射。免疫時間表(表7)如下所示表7<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table>為評價用于DNA引發(fā)/加強(qiáng)的亞型C(TV1)和亞型B(SF162)gp140dV2DNA和蛋白質(zhì)產(chǎn)生抗HIV毒株SF162(B型)的中和抗體的組合作用，進(jìn)行以下比較。使用基本上如下所述迸行的以下試驗在收集自免疫家兔的血清中檢測抗PBMC-培養(yǎng)的SF162和TVlHIV1毒株的中和抗體應(yīng)答。在來源于NathanielLandau博士(SalkInstitute,SanDiego，CA)的5.25.EGFP丄uc.M7(M7-luc)細(xì)胞中檢測病毒中和作用。除了使用市售熒光素酶試劑盒(Promega)通過熒光素酶報道基因表達(dá)來定量病毒感染外，該試驗的形式基本上與其它文獻(xiàn)所述的MT-2試驗相同(Montefiori等，乂C""M〖cro6Zo/.26:231-235，(1988))。所有血清樣品在測定前于56°C，熱滅活1小時。HIV-1分離物的病毒原種在PBMC中產(chǎn)生。中和抗體滴度報道為在測試孔中檢測到相比于病毒對照孔的50%熒光素酶活性時血清稀釋度的倒數(shù)。圖4和5所示的值是每組動物的中和滴度的幾何平均滴度加上標(biāo)準(zhǔn)偏差。中和抗體存在的測定的結(jié)果見圖4和圖5。在圖中，以下免疫組對應(yīng)于表4中的組BDNA+B蛋白質(zhì)；CDNA+B蛋白質(zhì)(組6);B+CDNA+B蛋白質(zhì)(組7);B+CDNA+C蛋白質(zhì)(組8);B+CDNA和蛋白質(zhì)(組9);B+CDNA和蛋白質(zhì)(l/2)(組IO)和B+CDNA(1/2)+C蛋白質(zhì)(組11)。在圖4中，每組3條柱中的第一豎直柱是預(yù)放血的家兔血清中抗HIV-1SF162的中和活性(圖4，預(yù)放血)，第二豎直柱是來自第三次免疫后兩周放血的血清(圖4，第三次免疫后兩周)，第三豎直柱是來自第四次免疫后兩周放血的血清(圖4，第四次免疫后兩周)。圖4總結(jié)了上述7組之間抗HIV-1SF162的中和滴度的數(shù)據(jù)。這些結(jié)果證實所有組均表現(xiàn)出抗HIV-1SF162分離物的強(qiáng)中和活性。此外，與第三次免疫后相比，第四次免疫后中和活性顯著增加。用B基因和B蛋白(BDNA+B蛋白)引發(fā)和加強(qiáng)顯示高滴度，C基因和B蛋白(CDNA+B蛋白)也這樣。就混合(B+C)DNA引發(fā)和單次蛋白質(zhì)加強(qiáng)而言，B蛋白對混合基因引發(fā)(B+CDNA+B蛋白)產(chǎn)生高加強(qiáng)和對C蛋白(B+CDNA+C蛋白)產(chǎn)生加強(qiáng)。就混合的DNA引發(fā)和蛋白質(zhì)加強(qiáng)而言，半劑量(5(Hig)的蛋白(B+CDNA和蛋白(l/2))誘導(dǎo)與全劑量(100ng)的蛋白(B+CDNA和蛋白)一樣的高中和活性。用亞型C蛋白加強(qiáng)混合的DNA引發(fā)和單次蛋白質(zhì)，半劑量(lmg)的DNA(B+CDNA+C蛋白)也得到與全劑量的2mgDNA(B+CDNA(l/2)和C蛋白)一樣的中和活性。在圖5中，預(yù)放血家兔血清中抗HIV-1TV1的中和活性的預(yù)放血值比每組柱低一個對數(shù)(圖5，預(yù)放血)，每組的灰色豎直柱是第四次免疫兩周后放血的血清(圖5，第四次免疫后兩周)。圖5總結(jié)了顯示上述7個組之間抗HIV-1TV1(南非亞型C)的中和滴度的數(shù)據(jù)。這些結(jié)果證實所有組均顯示出抗HIV-1亞型CTV1分離物的中和活性(如預(yù)期一樣，由于未使用亞型CDNA或蛋白，BDNA+B蛋白顯示出最低的中和活性)。就失配的單次DNA引發(fā)和單次蛋白質(zhì)加強(qiáng)(CDNA+B蛋白)而言，用C基因引發(fā)和B蛋白加強(qiáng)與用B基因和B蛋白(BDNA+B蛋白)一樣顯示出高滴度。就混合的(B+C)DNA引發(fā)和單次蛋白質(zhì)加強(qiáng)而言，使用B(B+CDNA+B蛋白)與C(B+CDNA+C蛋白)得到相似的加強(qiáng)效應(yīng)。就混合的DNA引發(fā)和蛋白質(zhì)加強(qiáng)而言，全劑量的100嗎蛋白(B+CDNA和蛋白)與半劑量的50嗎蛋白(B+CDNA和蛋白(l/2))—樣誘導(dǎo)高中和活性。半劑量(lmg)的DNA(B+CDNA(1/2)+C蛋白)也得到與全劑量的2mgDNA(B+CDNA+C蛋白)一樣的中和活性。比較圖4和圖5中的數(shù)據(jù)支持了在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的本發(fā)明組合方法。這種比較顯示結(jié)合來源于不同亞型的DNA可引發(fā)針對不同亞型的多種毒株的廣泛應(yīng)答。這可能表示靶向共同保守的表位。此外，當(dāng)免疫力是用不同亞型DNA的多種毒株引發(fā)時，用單一亞型蛋白足以加強(qiáng)廣泛的中和應(yīng)答。DNA引發(fā)保持了天然包膜結(jié)構(gòu)。除B細(xì)胞應(yīng)答外，這能誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答。最后，這些結(jié)果證實使用較低劑量蛋白質(zhì)混合物也可提供強(qiáng)的免疫應(yīng)答。這些研究的結(jié)果證實本發(fā)明組合物和方法產(chǎn)生免疫應(yīng)答，特別是產(chǎn)生廣泛且強(qiáng)有力的抗各種HIV毒株的中和活性的的有效性。實施例5El-E3缺失、復(fù)制缺損型Ad-HIV重組體對E3缺失、復(fù)制型Ad-HIV重組體的免疫原性研究以下實驗在黑猩猩中進(jìn)行。該實驗選擇具有最低Ad5-和Ad7-交叉反應(yīng)性抗體的黑猩猩。Ad5和Ad7微滴定中和測定基本上按照Buge等，J.Virol.71:8531-8541(1997)和Lubeck等，NatureMed.3:651-8(1997)所述進(jìn)行。根據(jù)表9所示時間表免疫黑猩猩。如表所示，每組包括2或3只動物。圖24也提供了在第49周的第二次加強(qiáng)后其它時間表和結(jié)果。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>(IN-鼻內(nèi)；IM-肌肉內(nèi))delAd5-E3、Ad7delE3、Ad5delEl/E3和Ad7delEl/E3載體已見描述(NanX.等，"Ad7粘粒系統(tǒng)的開發(fā)與Ad7deltaEldeltaE3HIV(MN)env/rev重組病毒的產(chǎn)生"(DevelopmentofanAd7cosmidsystemandgenerationofanAd7ddtaEldeltaE3HIV(M>0env/revrecombinantvirus),GeneTher.Feb，10(4):326-36(2003》。腺病毒載體(Ad重組體)含有來源于HIV-1亞型B原型毒株MN的插入物，其中該插入物編碼gp160包膜蛋白(參見，例如GenBank登錄M17449;Gurgo,C.等，"兩種新的美國HIV-1分離物的包膜序列"(EnvelopesequencesoftwonewUnitedStatesHIV-1isolates),Virology164(2):531-6(1988);Lori，F(xiàn).等，"兩種1型缺損人免疫缺陷病毒(HIV-l)分子克隆的相互互補對HIV-1細(xì)胞趨向性和毒力的影響"(Effectofreciprocalcomplementationoftwodefectivehumanimmunodeficiencyvirustype1(HIV-1)molecularclonesonHIV國lcelltropismandvirulence),J.Virol.66(9):5553-60(1992);Lukashov，V.V.等，"通過外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)、B-細(xì)胞系增殖和T-細(xì)胞系適應(yīng)增加從HIV-1毒株LAI和MN(NM)的原始基因組RNA種群中選擇基因型和表型"(IncreasinggenotypicandphenotypicselectionfromtheoriginalgenomicRNApopulationsofHIV-1strainsLAIandMN(NM)byperipheralbloodmononuclearcellculture,B-cell-linepropagationandT-cell-lineadaptation),AIDS9(12):1307-11(1995))。HIV-1MN是最早可用的HIV-1分離物之一，并且是常用的參考和疫苗毒株。MN分離物取自1984年美國，新澤西，Newark地區(qū)的6歲男性兒童AIDS患者。其母親是于1982年死于肺炎的IV毒品使用者。其父親也呈HIV血清陽性。其它來自該患者1984年的血液樣品和于死前不久所采的1987年樣品(GenBank登錄U72495)的序列也可用。也參見GenBank登錄L48364-L48379。該分離物的MN序列克隆于X噬菌體。Pol、nef和vpu的編碼序列被過早地截短；pol顯示在3783有框內(nèi)終止密碼子；nef和vpu分別在9357位和6412位被過早地截短。另一個可用的MN分離物的完整基因組是GenBank登錄號AF075719，并且雖然不是pol或vpu，它也具有缺損基因。該分離物的一組V3序列可用(GenBank登錄號L48364-L48379;Lukashov，V.等，AIDS9:1307-1311(1995))。分離物MN可獲得自NIHAIDS試劑計劃，為X4。含有HIV-1MNgpl60蛋白編碼序列的Ad-重組載體(見表9)以PBS稀釋并滴入鼻孔，500^1/鼻孔，總共lml。在接種前3天開始給予抗生素，共11天。用于蛋白質(zhì)加強(qiáng)的多肽組分含有SF162o-gpl40V2蛋白。該蛋白來自與用于多核苷酸組分中的gpl60編碼序列相同的HIV-1亞型，這些序列來源于HIV-lMN。使用在CHO細(xì)胞中表達(dá)、含有g(shù)pl40.mut7.mod.SF162.delV2序列的CMV3載體，然后基本上按照，例如PCT國際公布號WO/00/39302所述分離寡聚蛋白質(zhì)來制備SF162o-gpl40V2蛋白。蛋白質(zhì)加強(qiáng)一般為100iug的SF162o-gpl40V2/黑猩猩。SF162o國gpl40V2蛋白以用檸檬酸緩沖液配制為0.200mg/ml提供、保存于-8(TC待用并于室溫融解。該物質(zhì)清澈無顆粒物。加入等體積的MF59C佐劑?；旌衔锉４嬗?。C并在使用前翻轉(zhuǎn)試管幾次使之良好混合。每只動物以lml總體積/動物免疫(每只動物使用1或2個IM位點)。蛋白在加入佐劑l小時內(nèi)使用。收集血液、分泌樣品和糞便樣品。一般就血液樣品而言，采血10ml來獲得血清，采血30ml來獲得肝素化血液。對收集的樣品進(jìn)行以下所列的測定。A.通過ELISA對免疫的黑猩猩血清進(jìn)行HIV包膜抗體的結(jié)合測定結(jié)合測定中使用標(biāo)準(zhǔn)的HIVEnvELISA方法來檢測按上述免疫的黑猩猩血清中的HIV包膜抗體。這些方法基本上如Buge等，J.Virol.71:8531-8541(1997)和Lubeck等，NatureMed.3:651-8(1997)所述。圖23顯示了HIVIIIB和HIVSF162Env蛋白的結(jié)合抗體滴度的數(shù)據(jù)(圖23(A))以及HIVIIIB的血清抗體滴度的動力學(xué)(圖23(B))。也評價了SF162包膜蛋白的結(jié)合抗體滴度的其它數(shù)據(jù)并示于圖20。圖24A-D分別證實了使用不同的亞型B毒株組分的本發(fā)明所述的引發(fā)加強(qiáng)方案(用HIV-MN的env/rev和SF162的gpA140V2的腺引發(fā))誘導(dǎo)了交叉亞型結(jié)合抗體，該抗體識別來自所示亞型A、B、C和E的gpl20。B.抗TCLA和原始HIV分離物的中和抗體測定在MT-2試驗中檢測抗TCLA毒株的病毒中和作用(Montefiori等，J.ClinMicrobiol.26:231-235(1988))。在獲得自NathanielLandau博士(SalkInstitute,SanDiego，CA)的M7-luc細(xì)胞中測定抗原始HIV-l毒株的病毒中和作用。除了使用市售熒光素酶試劑盒(Promega)通過熒光素酶報道基因表達(dá)來定量病毒感染外，該試驗的形式基本上與其它文獻(xiàn)所述的MT-2試驗相同(Montefiori等，/C//"M/craWo/.26:231-235(1988))。所有血清樣品在測定前于56。C，熱滅活1小時。HIV-1分離物的病毒原種在PBMC中產(chǎn)生。表10顯示了在黑猩猩中進(jìn)行這些研究的一些中和抗體數(shù)據(jù)。表1020<table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table>1-通過上述MT-2試驗測定。中和抗體滴度報道為在測試孔中檢測到相比于病毒對照孔的50%細(xì)胞殺死時血清稀釋度的倒數(shù)。2-通過上述M71uc試驗測定。中和抗體滴度報道為在測試孔中檢測到相比于病毒對照孔的50%熒光素酶活性時血清稀釋度的倒數(shù)。表10的結(jié)果支持了本文所述組合方法誘導(dǎo)強(qiáng)有力和廣泛HIV-中和活性的用途。例如，在放血日273,從組1-3的所有動物獲得的血清含有中和抗體，該中和抗體抗用于多核苷酸免疫的包膜蛋白編碼序列(HIV-1MN)所來源于的亞型B毒株和用于多肽免疫的包膜蛋白編碼序列(HIV-1SF162)所來源于的亞型B毒株。總體上，復(fù)制型重組腺載體(delE3)比不能復(fù)制的腺構(gòu)建物(delE1,E3)更強(qiáng)地引發(fā)B細(xì)胞應(yīng)答并且具有由ELISA測定到的較高Erw-特異性結(jié)合抗體滴度與較高抗MN和SF162病毒毒株的血清中和抗體應(yīng)答。圖25A和B也證明了復(fù)制型腺載體產(chǎn)生的更有效的中和抗體。這些結(jié)果證實復(fù)制型腺病毒載體在引發(fā)抗亞型B疫苗毒株HIV1MN和HIV1SF162的中和抗體應(yīng)答方面更有效。下表11證實組合Ad-HIVenv/revgpl40AV2方案引發(fā)能中和原始分離物的廣泛反應(yīng)性的抗體。所測試的亞型B毒株是Bal、JR-FL、Bx08、6101、692、1168、1196和ADA。表ll.中和的原始亞型B分離物的數(shù)目<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table>下表12證實用env/rev的活腺病毒引發(fā)和用gpl40AV2多肽組分加強(qiáng)的組合方案以較低劑量的多核苷酸引發(fā)組合物提供更大的應(yīng)答。所示結(jié)果用于亞型B原始分離物Bal、JR-FL、Bx08、6101、692、1168、1196和ADA。<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>非復(fù)制型<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>RLU表示在M7-熒光素酶試驗(Montifeiori)中的相對光單位。該試驗使RLU100%降低與100%中和相關(guān)，而RLU0%降低表示0%中和。參考圖26，組合腺病毒env/rev和B型(或"進(jìn)化支B")gpl40△V2的組合方案的作用也產(chǎn)生中和抗體(S卩，能在體外阻斷進(jìn)化支C毒株(HIVTV1)細(xì)胞的感染)。圖26A和B分別顯示了證實復(fù)制型和復(fù)制缺損型腺病毒在進(jìn)化支B免疫方案后對進(jìn)化支CHIVTV1誘導(dǎo)中和抗體的結(jié)果。在此實施例中，用Ad5-fflVMNewv/"v于第0周和用Ad7-HIVMNe"v/rev于第13周鼻內(nèi)免疫黑猩猩。用以MF-59佐劑配制的寡聚HIVSF162gpl40)V2于第37和49周肌肉內(nèi)加強(qiáng)黑猩猩。顯示了所示免疫后引發(fā)的抗HIVTV-1的峰值中和抗體滴度。這些數(shù)據(jù)證實可用一給定亞型的第一HIV毒株的包膜蛋白免疫對象，用同一亞型的第二HIV毒株的包膜蛋白加強(qiáng)并產(chǎn)生抗兩種HIV毒株的中和抗體。結(jié)合實施例4和5所示的數(shù)據(jù)證明這種HIV毒株可在同一亞型內(nèi)或來自不同亞型。C.ADCC活性的產(chǎn)生如上所述，抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)也對免疫的宿主提供保護(hù)?？墒褂帽绢I(lǐng)域熟知的各種標(biāo)準(zhǔn)免疫測定來檢測這種應(yīng)答。(參見，例如Montefiori等，(1988)J.ClinMicrobiol.26:231-235;Dreyer等，(1999)AIDSResHumRetroviruses(1999)15(17):1563-1571)。分析了用不同的亞型B毒株組分(具有HIV-MN的env/rev和SF162的gpA140V2多肽組分的腺病毒)按本實施例所述方案免疫黑猩猩的血清的ADCC活性。按照上述用于中和試驗的方法免疫黑猩猩并檢測抗HIV-包膜包被的靶細(xì)胞的ADCC活性。圖27證實本實施例的方案產(chǎn)生抗用來源于進(jìn)化支BHIVIIIB毒株的HIV包膜蛋白包被的細(xì)胞的ADCC活性。此夕卜，與復(fù)制缺損型Ad-重組體相比，15-51周在用復(fù)制型Ad-重組體引發(fā)的黑猩猩中觀察到ADCC殺死％顯著增加(P=0.022)。參考表13，本發(fā)明的方案產(chǎn)生抗進(jìn)化支A、B、C或E的gpl20包被的細(xì)胞的ADCC活性(即，交叉進(jìn)化支ADCC活性)。表13交叉進(jìn)化支ADCCADCC運行031404,效應(yīng)物是人PBL，靶是用進(jìn)化支A、B、C或E的gpl20包被的CEM-NKr<table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table>D.細(xì)胞免疫應(yīng)答l.T-細(xì)胞淋巴細(xì)胞增殖圖21和28顯示了使用本實施例的方案接種后用于引發(fā)的復(fù)制型和非復(fù)制型腺病毒的淋巴細(xì)胞增殖性應(yīng)答。檢測了抗HIV-IIIBgpl20的增殖性T-細(xì)胞應(yīng)答。這些試驗基本上如Buge等，J.Virol.71:8531-8541(1997)所述進(jìn)行。數(shù)據(jù)示于圖21和28。這些結(jié)果證實作為引發(fā)免疫，復(fù)制型腺病毒載體比非復(fù)制型腺病毒載體產(chǎn)生更高的T細(xì)胞增殖性應(yīng)答。2.IFN-y產(chǎn)生進(jìn)行了HIVenv重疊肽的ELISPOT。試驗方法基本上如Zhao等，J.Virol.77:8354-8365(2003)所述。用于此試驗的肽來源于HIV-1MNEnv。圖29證實使用本實施例方案中所用的復(fù)制型和非復(fù)制型腺病毒引發(fā)后誘導(dǎo)了IFN-Y產(chǎn)生。其它試驗可用于評價免疫的黑猩猩的免疫應(yīng)答，所述試驗包括(但不限于)以下A.通過CR-釋放進(jìn)行CTL試驗該標(biāo)準(zhǔn)CTL試驗基本上如Lubeck等，NatureMed.3:651-8(1997)和Buge等，J.Virol.71:8531-8541(1997)所述進(jìn)行。B.Ad5和Ad7微滴定中和試驗。這些試驗基本上如Buge等，J.Virol71:8531-8541(1997)所述進(jìn)行。C.通過PCR在鼻和糞便樣品中進(jìn)行Ad脫落試驗這些試驗基本上如Buge等，J.Virol所述進(jìn)行。本實施例中的數(shù)據(jù)證實本發(fā)明的組合方法可用于產(chǎn)生抗相同亞型的多種病毒株的廣泛中和抗體。此外，本實施例中的數(shù)據(jù)也證實本文所述的組合方法可用于產(chǎn)生抗同一分離物的多種丙毒毒株的HIV分離物以及抗其它進(jìn)化支或亞型的抗體。組合免疫方案產(chǎn)生的抗體可結(jié)合并中和同一毒株和其它進(jìn)化支的HIV的多種分離物，所述方案利用含有編碼一亞型的一種毒株的多肽的核酸的組分和含有同一亞型的不同毒株的類似多肽的第二組分。產(chǎn)生的抗體也包括顯示抗同一毒株和其它進(jìn)化支的HIV的多種分離物的ADCC活性。雖然詳述了本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案，應(yīng)理解的是可作出明顯的改變而不脫離本發(fā)明的構(gòu)思和范圍。提供以下實施例僅為說明性目的，決非想限制本發(fā)明的范圍。權(quán)利要求1.一種在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物，所述組合物含有，多核苷酸組分和多肽組分，其中所述多核苷酸組分基本上由一種編碼來源于第一HIV毒株的HIV免疫原性多肽的多核苷酸構(gòu)成，所述多肽組分含有一種或多種與所述多核苷酸組分編碼的多肽類似的HIV免疫原性多肽，前提是該多肽組分的至少一種HIV免疫原性多肽來源于第二HIV毒株，其中所述第一HIV毒株和所述第二HIV毒株不同。2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述第二HIV毒株是與所述第一HIV毒株的亞型相同的HIV毒株。3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述第二HIV毒株是與所述第一HIV毒株的亞型不同的HIV毒株。4.一種在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物，所述組合物含有，多核苷酸組分和多肽組分，其中所述多核苷酸組分含有兩種或多種多核苷酸序列，這些序列含有兩種或多種來源于不同HIV毒株的類似HIV免疫原性多肽的編碼序列，所述多肽組分含有一種或多種與所述多核苷酸組分編碼的多肽類似的HIV免疫原性多肽，前提是如果該多肽組分含有的多肽數(shù)目相同或大于該多核苷酸組分編碼的類似HIV免疫原性多肽，則該多肽組分的至少一種HIV免疫原性多肽來源于與該多核苷酸組分提供的HIV免疫原性多肽不同的HIV毒株。5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，所述至少兩種HIV免疫原性多肽的編碼序列來源于同一亞型的不同HIV毒株。6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，來源于和多核苷酸組分提供的HIV免疫原性多肽不同的HIV毒株的多肽組分的至少一種HIV免疫原性多肽來源于多核苷酸組分提供的所述HIV免疫原性多肽相同亞型的不同HIV毒株。7.如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，所述至少兩種HIV免疫原性多肽的編碼序列來源于不同亞型的不同HIV毒株。8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，來源于和多核苷酸組分提供的HIV免疫原性多肽不同的HIV毒株的多肽組合物的至少一種HIV免疫原性多肽來源于多核苷酸組分提供的所述HIV免疫原性多肽的不同亞型的不同HIV毒株。9.一種在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物，所述組合物含有，多核苷酸組分和多肽組分，其中所述多核苷酸組分基本上由一種編碼來源于第一HIV毒株的HIV免疫原性多肽的多核苷酸構(gòu)成，所述多肽組分含有一種或多種與所述多核苷酸組分編碼的多肽類似的HIV免疫原性多肽，前提是該多肽組分的至少一種HIV免疫原性多肽來源于第二HIV毒株，其中所述第一HIV毒株和所述第二HIV毒株不同；前提是(i)該多核苷酸組分不編碼來源于除第一亞型以外任何亞型的類似HIV免疫原性多肽，和(ii)該多肽組分不含有來源于除第一亞型以外任何亞型的類似HIV免疫原性多肽。10.—種在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物，所述組合物含有，多核苷酸組分和多肽組分，其中所述多核苷酸組分含有兩種或多種多核苷酸序列，而所述序列含有來源于不同HIV毒株的兩種或多種類似HIV免疫原性多肽的編碼序列，所述多肽組分含有一種或多種與所述多核苷酸組分編碼的多肽類似的HIV免疫原性多肽，前提是該多肽組分的至少一種HIV免疫原性多肽來源于和該多核苷酸組分提供的類似HIV免疫原性多肽不同的HIV毒株。11.如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，所述一種或多種類似HIV免疫原性多肽來源于不同的HIV亞型。12.如權(quán)利要求1-11中任一項所述的組合物，其特征在于，所述多核苷酸組分或所述多肽組分含有至少一種是天然多核苷酸或多肽的多核苷酸。13.如權(quán)利要求1-11中任一項所述的組合物，其特征在于，所述多核苷酸組分含有至少一種合成的多核苷酸。14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述合成的多核苷酸含有在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子。15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述合成的多核苷酸含有在人細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子。16.如權(quán)利要求1-11中任一項所述的組合物，其特征在于，所述編碼HIV免疫原性多肽的多核苷酸組分和含有HIV免疫原性多肽的多肽組分是HIV包膜多肽。17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述編碼HIV免疫原性多肽的多核苷酸組分和所述含有HIV免疫原性多肽的多核苷酸組分的至少一種含有改變或突變。18.如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，編碼所述HIV免疫原性多肽的所述多核苷酸組分含有改變或突變。19.如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述多肽HIV免疫原性多肽組分含有改變或突變。20.如權(quán)利要求18或19所述的組合物，其特征在于，所述組合物在切割位點或在糖基化位點含有突變。21.如權(quán)利要求18或19所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有VI區(qū)域的缺失或突變。22.如權(quán)利要求18或19所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有V2區(qū)域的缺失或突變。23.如權(quán)利要求18或19所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有V3區(qū)域的缺失或突變。24.如權(quán)利要求18或19所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有區(qū)域的缺失或修飾，所述區(qū)域選自VI區(qū)域、V2區(qū)域、V3區(qū)域和它們的組合。25.如權(quán)利要求18或19所述的組合物，其特征在于，所述組合物暴露HIVenv蛋白的中和表位。26.如權(quán)利要求25所述的組合物，其特征在于，至少一種所述包膜多肽被修飾以暴露結(jié)合CCR5趨化因子共同受體的CD4結(jié)合區(qū)域或包膜結(jié)合區(qū)域。27.如權(quán)利要求1-11中任一項所述的組合物，其特征在于，所述至少一種編碼HIV免疫原性多肽的多核苷酸編碼選自以下的免疫原性HIV多肽Gag、Env、Pol、Prot、Int、RT、vif、vpr、vpu、tat、rev禾口nef。28.如權(quán)利要求1-11中任一項所述的組合物，其特征在于，所述第一HIV亞型選自亞型A、亞型B、亞型C、亞型D、亞型E、亞型F、亞型G、亞型H、亞型I、亞型J、亞型K、亞型N和亞型O。29.如權(quán)利要求1-11中任一項所述的組合物，其特征在于，至少一種所述免疫原性HIV多肽含有一種或多種改變或突變。30.如權(quán)利要求1-11中任一項所述的組合物，其特征在于，所述多核苷酸組分還含有編碼其它抗原性多肽的序列，前提是該其它抗原性多肽不是來源于HIV-1毒株的免疫原性多肽。31.如權(quán)利要求30所述的組合物，其特征在于，所述多肽組分還含有具有其它抗原性肽的多肽，前提是該其它抗原性多肽不是來源于HIV-1毒株的免疫原性多肽。32.如權(quán)利要求1-11中任一項所述的組合物，其特征在于，所述多核苷酸組分還含有編碼一種或多種與選擇的宿主細(xì)胞相容的控制元件的序列，其中所述控制元件操作性連接于編碼HIV免疫原性多肽的多核苷酸。33.如權(quán)利要求32所述的組合物，其特征在于，所述控制元件選自轉(zhuǎn)錄啟動子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄終止信號、聚腺苷酸化序列、優(yōu)化翻譯起始的序列、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點和翻譯終止序列。34.如權(quán)利要求33所述的組合物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄啟動子選自CMV、CMV+內(nèi)含子A、SV40、RSV、HIV-Ltr、MMLV-ltr和金屬硫蛋白。35.—種在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括提供如權(quán)利要求1-34和74-82中任一項所述的在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物；在與所述多核苷酸在所述對象中表達(dá)相容的條件下，將一種或多種基因遞送載體給予對象來產(chǎn)生編碼的HIV免疫原性多肽，所述載體含有該組合物的所述多核苷酸組分的多核苷酸；和將多肽組分給予所述對象。36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述一種或多種基因遞送載體和所述多肽組分同時給予。37.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述所述一種或多種基因遞送載體和所述多肽組分依次給予。38.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述多肽組分還含有佐劑。39.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸組分還含有運載體。40.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述一種或多種基因遞送載體是非病毒運載體。41.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述一種或多種基因遞送載體使用顆粒運載體遞送。42.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述一種或多種基因遞送載體包被在金或鎢顆粒上并且所述包被顆粒使用基因槍遞送至所述對象。43.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述一種或多種基因遞送載體使用PLG顆粒遞送。44.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述一種或多種基因遞送載體包囊在脂質(zhì)體制劑中。45.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述一種或多種基因遞送載體是病毒載體。46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述病毒載體選自不同亞型、種類或血清型的病毒載體。47.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。48.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述病毒載體是慢病毒載體。49.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述病毒載體是甲病毒載體。50.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述病毒載體是腺病毒載體。51.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述腺病毒載體是活的復(fù)制型載體。52.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述腺病毒載體是非復(fù)制型載體。53.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述對象是哺乳動物。54.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物是人。55.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答包括適應(yīng)性免疫應(yīng)答。56.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答還包括先天免疫應(yīng)答。57.如權(quán)利要求55或56所述的方法，其特征在于，所述方法包括抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性應(yīng)答。58.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答包括體液免疫應(yīng)答。59.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答包括細(xì)胞免疫應(yīng)答。60.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述一種或多種基因遞送載體按以下方式給予肌肉內(nèi)、粘膜內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)、經(jīng)皮、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、口服或靜脈內(nèi)。61.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答導(dǎo)致在對象中產(chǎn)生抗來源于第一HIV亞型的多種毒株的中和抗體。62.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答導(dǎo)致在對象中產(chǎn)生抗來源于多種HIV亞型的多種毒株的中和抗體。63.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答包括在所述對象體內(nèi)產(chǎn)生中和多種HIV分離物的廣泛中和抗體。64.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，表征了所述廣泛中和抗體顯示使用CCR5共同受體中和HIV毒株的活性。65.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，表征了所述廣泛中和抗體顯示抗來自相同HIV亞型的兩種或多種HIV毒株的中和活性。66.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述中和抗體顯示抗兩種或多種選自以下HIV分離物的HIV毒株的中和活性Bal、JR-FL、Bx08、6101、692、1168、1196和ADA。67.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，表征了所述廣泛中和抗體顯示抗來自兩種或多種不同HIV亞型的兩種或多種HIV毒株的中和活性。68.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述中和抗體顯示抗兩種或多種選自以下HIV亞型的中和活性A、B、C、D、E、F、G和O。69.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答包括在所述對象中產(chǎn)生介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)的抗體。70.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，表征了所述抗體顯示抗來自兩種或多種不同HIV亞型的兩種或多種HIV毒株的ADCC活性。71.如權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，所述抗體顯示抗兩種或多種選自以下HIV亞型的ADCC活性A、B、C、D、E、F、G和O。72.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，表征了所述廣泛中和抗體顯示抗來自同一HIV亞型的兩種或多種HIV毒株的中和活性。73.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述中和抗體顯示抗兩種或多種選自以下HIV分離物的HIV毒株的中和活性Bal、JR-FL、Bx08、6101、692、1168、1196和ADA。74.如權(quán)利要求1-34中任一項所述在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物，其特征在于，所述多肽組分可以表達(dá)所述多肽組分的多核苷酸的形式給予。75.如權(quán)利要求74所述的組合物，其特征在于，所述多肽組分用病毒載體給予。76.如權(quán)利要求75所述的組合物，其特征在于，所述病毒載體選自腺病毒、甲病毒和痘病毒。77.如權(quán)利要求74所述在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物，其特征在于，一種或多種所述多核苷酸作為DNA制劑給予對象。78.如權(quán)利要求68所述的組合物，其特征在于，所述DNA制劑含有DNA和PLG。79.如權(quán)利要求l-34中任一項所述的組合物，其特征在于，所述多肽組分以在病毒樣顆粒上表達(dá)的蛋白質(zhì)形式給予。80.—種在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物，所述組合物含有，多核苷酸組分和多肽組分，其中所述多核苷酸組分含有編碼來源于第一HIV毒株的HIV免疫原性多肽的多核苷酸；所述多肽組分含有與所述多核苷酸組分編碼的多肽類似的HIV免疫原性多肽，前提是該多肽組分的至少一種HIV免疫原性多肽來源于第二HIV毒株，其中所述第一HIV毒株和所述第二HIV毒株不同。81.如權(quán)利要求80所述的組合物，其特征在于，所述第二HIV毒株是與所述第一HIV毒株的亞型相同的HIV毒株。82.如權(quán)利要求81所述的組合物，其特征在于，所述第二HIV毒株是與所述第一HIV毒株的亞型不同的HIV毒株。83.如權(quán)利要求35-73中任一項所述的方法，其特征在于，所述多肽組分由病毒載體遞送。全文摘要本發(fā)明涉及編碼免疫原性HIV多肽的方法、多核苷酸和多肽，所述HIV免疫原性多肽來源于HIV亞型內(nèi)的不同毒株和/或不同亞型的免疫原性HIV多肽。描述了多核苷酸和多肽在產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合方法中的應(yīng)用。本文所述的組合方法顯示誘導(dǎo)抗給定亞型內(nèi)多種毒株的各種HIV毒株和抗各種亞型的廣泛且強(qiáng)有力的中和活性。也公布了用于產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物的制劑和使用這種組合物的方法。文檔編號C12N15/49GK101420976SQ200480033292公開日2009年4月29日申請日期2004年9月15日優(yōu)先權(quán)日2003年9月15日發(fā)明者B·彭,I·K·斯里瓦斯塔瓦,M·羅伯特-古羅夫,S·W·巴尼特,V·R·戈麥斯-羅馬,英亷申請人:諾華疫苗和診斷公司;美國政府健康及人類服務(wù)部