專利名稱：腺病毒轉(zhuǎn)染的初級(jí)細(xì)胞以及路徑圖譜繪制方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及路徑圖譜繪制領(lǐng)域，特別是非永生細(xì)胞系免疫細(xì)胞的路徑圖譜繪制。本發(fā)明還涉及調(diào)控胞內(nèi)信號(hào)傳遞路徑表達(dá)的領(lǐng)域。
相關(guān)領(lǐng)域的說明胞內(nèi)信號(hào)傳遞路徑是這樣的一組基因，其表達(dá)受到由初始刺激起始的基因到基因的相互作用級(jí)聯(lián)的控制。換言之，胞內(nèi)信號(hào)傳遞路徑的初始刺激直接地或者通過路徑中的另一基因間接地控制該路徑中每一個(gè)基因的表達(dá)。已知的信號(hào)傳遞路徑參與包括免疫應(yīng)答、發(fā)育、有絲分裂和炎癥等在內(nèi)的廣泛的生物活動(dòng)，而且包括但不限于促分裂原活化蛋白激酶(“MAPK”)路徑，蛋白激酶A(“PKA”)信號(hào)傳遞路徑，蛋白激酶C(“PKC”)信號(hào)傳遞路徑，I型干擾素信號(hào)傳遞路徑，鈣調(diào)磷酸酶(“CaN”)信號(hào)傳遞路徑，κB細(xì)胞順式作用核因子(“NFκB”)信號(hào)傳遞路徑以及IκB激酶(“IKK”)信號(hào)傳遞路徑。盡管在廣泛的疾病狀態(tài)中都牽涉到信號(hào)傳遞路徑缺陷，但在許多情況下，我們對(duì)于初始刺激和最終的細(xì)胞應(yīng)答之間的信號(hào)傳遞路徑知之甚少。
路徑圖譜繪制通常是指闡明路徑初始刺激和最終應(yīng)答之間的步驟。就本發(fā)明來說，“路徑圖譜繪制”是指確定候選順式作用調(diào)節(jié)元件是否直接或間接地受給定信號(hào)傳遞路徑的控制。已知的路徑圖譜繪制方法采用來自培養(yǎng)的細(xì)胞系的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞已用含有有效地連接于待測調(diào)節(jié)元件的報(bào)告基因的DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。本領(lǐng)域已很好地確立了報(bào)告基因的使用。參見Kain，SR和Ganguly，S，《最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編》中第9.6單元的“基因報(bào)告系統(tǒng)綜述”(Overview of Genetic Reporter Systems，Unit9.6 in Current Protocols in Molecular Biology)，編輯Ausubel，F(xiàn)M等人(Wiley and Sons，NY，1995)。
轉(zhuǎn)染是指將外來DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞如培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。已證明轉(zhuǎn)染是分析基因及其相關(guān)基因產(chǎn)物的功能、調(diào)節(jié)和相互作用的強(qiáng)有力工具。本領(lǐng)域已經(jīng)很好地確立了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的操作?；瘜W(xué)和物理轉(zhuǎn)染方法包括DEAEdextran(Fox RM等人，《生物化學(xué)》(Biochemistry)10月4日；16(20)4470-7，PMID 911769(1977))，磷酸鈣(Pear，W.S.，Nolan，G.P.，Scott，M.L.，& Baltimore，D.《美國國家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90，8392(1993))，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Zhang WW等人，《生物技術(shù)》(Biotechniques)11月；15(5)868-72(1993))，微注射(Colbere-Garapin F和Garapin AC，《發(fā)育生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)》(Dev Biol Stand)；55267-71，PMID6329857(1983))以及電穿孔(Neumann E和Kakorin S，《癌癥研究和治療技術(shù)》(Technol Cancer Res Treat.)10月；1(5)329-40(2002))。本領(lǐng)域也已很好地確立了重組腺病毒載體在轉(zhuǎn)染中的用途。參見Berkner，KI和Sharp，PA《核酸研究》(Nucelic Acids Res.)116003-6020(1983)；Berkner，KI和Sharp，PA《生物技術(shù)》(BioTechniques)6616-629(1988)；Bett，AJ，Haddara，W，Prevec，L和Graham，F(xiàn)L《美國國家科學(xué)院院報(bào)》(PNAS)USA 918802-8806(1994)；Hitt，M，Addison，CL和Graham，F(xiàn)L《藥理學(xué)進(jìn)展》(Adv.Pharmacol.)40137-206(1997)。其中，重組腺病毒業(yè)已被用來轉(zhuǎn)染心臟組織(Ardehali，A.J.Thor.Cardiovas.Surg.111246-252(1996))和淋巴細(xì)胞(Leon，RP，Hedlund，T，Meech，SJ，Li，S，Schaack，J，Hunger，SP，Duke，RC和DeGregori，J《美國國家科學(xué)院院報(bào)》(PNAS)USA 9513159-13164(1998))。人類腺病毒系雙鏈DNA病毒，其通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞。這些病毒由于易于培養(yǎng)和操作且顯示出廣泛的體內(nèi)體外宿主范圍而被認(rèn)為非常適合用于基因轉(zhuǎn)移。腺病毒能夠感染靜止的以及復(fù)制中的靶細(xì)胞，并持續(xù)存在于染色體之外，而不是整合到宿主染色體組中。重組腺病毒能夠容納相對(duì)較大的外來DNA片段(大約7kb)，并具備高滴度病毒產(chǎn)量的優(yōu)點(diǎn)。
用于路徑圖譜繪制的報(bào)告基因構(gòu)建體的已知載體包括pCRE-d2EGFP質(zhì)粒，該產(chǎn)品可由BD Biosciences Clontech商購獲得。該質(zhì)粒含有有效地連接于綠色熒光蛋白(“GFP”)報(bào)告基因的環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件(“CRE”)，并且可用來測量諸如Jun N-端激酶(“JNK”)信號(hào)傳遞路徑、p38MAPK信號(hào)傳遞路徑以及蛋白激酶A(“PKA”)信號(hào)傳遞路徑中的活性。該質(zhì)粒使用pUC復(fù)制起點(diǎn)在大腸桿菌(E.coli)中進(jìn)行繁殖，并使用病毒fl起點(diǎn)用于產(chǎn)生單鏈DNA。該質(zhì)粒以比基于腺病毒載體低得多的轉(zhuǎn)染效率在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)染，并且只有用于培養(yǎng)的真核細(xì)胞系而非初級(jí)真核細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)才足夠有效。由于已知的用于免疫細(xì)胞路徑圖譜繪制的載體不能足夠行之有效地用于初級(jí)免疫細(xì)胞，使用現(xiàn)有技術(shù)的方法的路徑圖譜繪制目前僅可用于培養(yǎng)的細(xì)胞系。然而，與其非永生化對(duì)應(yīng)物相比，永生化的培養(yǎng)細(xì)胞系傾向于具有顯著不同的蛋白表達(dá)模式。人們期望能夠?qū)Ω叩壬矬w的初級(jí)宿主細(xì)胞進(jìn)行路徑圖譜繪制而無需不必要地破壞其細(xì)胞的正常表達(dá)模式。人們特別期望能夠?qū)Τ跫?jí)免疫細(xì)胞進(jìn)行路徑圖譜繪制而不必將其轉(zhuǎn)換成永生化細(xì)胞系。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明涉及確定已知調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞信號(hào)傳遞路徑表達(dá)的刺激是否能夠調(diào)節(jié)候選順式元件表達(dá)的方法，其步驟包括用具有有效地連結(jié)于候選順式元件的報(bào)告基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞；測量報(bào)告基因活性的基底水平；對(duì)免疫細(xì)胞施加刺激；以及測量響應(yīng)所述刺激的報(bào)告基因活性。在另一方面，所述刺激調(diào)控著調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)。又在另一方面，所述方法還包括共轉(zhuǎn)染調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。在可選的方面，所述刺激是引入候選調(diào)節(jié)化合物。在另一方面，報(bào)告基因?yàn)闊晒馑孛?、綠色熒光蛋白(“GFP”)、β-半乳糖苷酶(“GAL”)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(“CAT”)或抑制基因如IκBsd。另一方面，所述順式元件與炎癥相關(guān)。另一方面，所述順式元件為AP-1、CRE、ISRE、NFAT、NFκB或SRE。另一方面，所述免疫細(xì)胞為巨噬細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞或未成熟樹突細(xì)胞。
一方面，本發(fā)明涉及抑制免疫細(xì)胞信號(hào)傳遞路徑表達(dá)的方法，其步驟包括用含有有效地連結(jié)于屬于該信號(hào)傳遞路徑的順式元件的抑制基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞，并誘導(dǎo)該抑制基因表達(dá)。在另一方面，信號(hào)傳遞路徑為NFκB信號(hào)傳遞路徑。又在另一方面，抑制基因?yàn)镮κBsd。在另一方面，所述免疫細(xì)胞為巨噬細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞或未成熟樹突細(xì)胞。
附圖的簡短說明

圖1A表示轉(zhuǎn)染了能夠表達(dá)綠色熒光蛋白的重組腺病毒(“AdV:GFP”)的巨噬細(xì)胞。
圖1B表示轉(zhuǎn)染了能夠表達(dá)綠色熒光蛋白的重組腺病毒(“AdV:GFP”)的樹突細(xì)胞。
圖1C表示T淋巴細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)。
圖1D表示B淋巴細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)。
圖2表示兩種不同的細(xì)胞培養(yǎng)物，一種轉(zhuǎn)染了能夠表達(dá)IκB超顯性突變體的重組腺病毒(“Adv:IκBsd”)，另一種轉(zhuǎn)染了能夠表達(dá)綠色熒光蛋白的重組腺病毒(“AdV:GFP”)，每一種都以相差和碘化丙錠染色表示。
圖3A為表示IκB超顯性突變體(“IκBsd”)阻斷NFκB信號(hào)傳遞路徑的示意圖。
圖3B為表示樹突細(xì)胞成熟期間NFκB激活的抑制對(duì)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響的圖表。
圖4為表示基于重組腺病毒的啟動(dòng)子/報(bào)告基因系統(tǒng)的示意圖。
圖5A為表示經(jīng)刺激后CD4+T細(xì)胞中CRE順式元件的激活的圖表。
圖5B為表示經(jīng)刺激后CD4+T細(xì)胞中AP-1順式元件的激活的圖表。
圖5C為表示經(jīng)刺激后CD4+T細(xì)胞中NFκB順式元件的激活的圖表。
圖5D為表示經(jīng)刺激后CD4+T細(xì)胞中ISRE順式元件的激活的圖表。
圖6A為表示巨噬細(xì)胞中順式元件的激活的圖表。
圖6B為表示樹突細(xì)胞中順式元件的激活的圖表。
圖7A為表示假定路徑圖譜繪制試驗(yàn)的結(jié)果的示意圖。
圖7B為表示假定路徑圖譜繪制試驗(yàn)的結(jié)果的示意圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了確定順式作用調(diào)節(jié)元件在初級(jí)免疫細(xì)胞的信號(hào)傳遞路徑中的作用的方法和組合物。為本發(fā)明的目的計(jì)，“順式作用調(diào)節(jié)元件”與“順式元件”互換使用，是指有效地連接于編碼序列的多核苷酸調(diào)節(jié)元件，其中所述調(diào)節(jié)元件調(diào)控所述編碼序列的表達(dá)。為本發(fā)明的目的計(jì)，“胞內(nèi)信號(hào)傳遞路徑”與“信號(hào)傳導(dǎo)路徑”、“信號(hào)傳遞路徑”以及“路徑”互換使用，是指基因的集合，它們的調(diào)節(jié)直接或間接地受給定的初始刺激調(diào)控。在典型的信號(hào)傳遞路徑中，初始刺激激活第一順式元件，其激活相應(yīng)的第一調(diào)節(jié)蛋白的產(chǎn)生。第一調(diào)節(jié)蛋白隨之激活該路徑中的第二順式元件，其依次又激活第二調(diào)節(jié)蛋白的產(chǎn)生。第二調(diào)節(jié)蛋白隨之又激活第三順式元件，等等。在這個(gè)實(shí)例中，初始刺激間接地調(diào)控第三順式元件。為本發(fā)明的目的計(jì)，順式元件如果直接或間接地受某路徑的初始刺激調(diào)控，則將該順式元件鑒定為屬于該路徑。為本發(fā)明的目的計(jì)，“初始刺激”是指調(diào)控路徑活性的任何現(xiàn)象。初始刺激包括但不限于調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的增加或減少、病毒感染、過敏原接觸、DNA損傷和胞外應(yīng)激等。胞外應(yīng)激的實(shí)例包括但不限于熱激、滲透應(yīng)激、pH應(yīng)激和電離輻射。
許多人類疾病都源于免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞，T細(xì)胞以及樹突細(xì)胞信號(hào)傳遞路徑中的一種或多種缺陷。例如，其中，p38促分裂原活化蛋白激酶(“MAPK”)路徑業(yè)已牽涉到導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、敗血癥和HIV病毒感染的原因。同樣地，I型干擾素信號(hào)傳遞路徑的缺陷也會(huì)造成對(duì)病毒感染的應(yīng)答不足。下文描述一些已知的信號(hào)傳遞路徑及其已知的組成順式元件。
順式作用調(diào)節(jié)元件及其路徑順式作用調(diào)節(jié)元件亦稱之為順式元件，是有效連接于編碼序列的多核苷酸調(diào)節(jié)元件，其中所述調(diào)節(jié)元件調(diào)控所述編碼序列的表達(dá)。順式作用調(diào)節(jié)元件的實(shí)例包括但不限于激活蛋白1(“AP-1”)、環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件(“CRE”)、干擾素刺激的應(yīng)答元件(“ISRE”)、核因子激活的T細(xì)胞(“NFAT”)，κB細(xì)胞核因子(“NFκB”)以及血清應(yīng)答(“SRE”)。
順式作用激活蛋白1(“AP-1”)增強(qiáng)子元件受轉(zhuǎn)錄因子c-jun和c-fos調(diào)控。順式作用AP-1增強(qiáng)子元件出現(xiàn)在c-jun N-端蛋白激酶(“JNK”)信號(hào)傳遞路徑之中。JNK信號(hào)傳遞路徑為一類促分裂原活化蛋白激酶(“MAPK”)路徑，MAPK信號(hào)傳遞路徑牽涉到針對(duì)多種形式胞外應(yīng)激的細(xì)胞應(yīng)答以及對(duì)凋亡的細(xì)胞敏感性。
順式作用環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件(“CRE”)增強(qiáng)子元件受轉(zhuǎn)錄因子ATF2和CREB調(diào)控。順式作用CRE增強(qiáng)子元件出現(xiàn)在JNK信號(hào)傳遞路徑、p38信號(hào)傳遞路徑以及蛋白激酶A(“PKA”)信號(hào)傳遞路徑之中。和JNK信號(hào)傳遞路徑一樣，p38信號(hào)傳遞路徑是一類促分裂原活化蛋白激酶(“MAPK”)路徑，并牽涉到針對(duì)多種形式胞外應(yīng)激和炎癥細(xì)胞因子的細(xì)胞應(yīng)答。PKA信號(hào)傳遞路徑牽涉到有絲分裂。
順式作用干擾素刺激的應(yīng)答元件(“ISRE”)增強(qiáng)子元件受轉(zhuǎn)錄因子STAT1和STAT2調(diào)控。順式作用ISRE增強(qiáng)子元件出現(xiàn)在I型干擾素信號(hào)傳遞路徑之中。I型干擾素信號(hào)傳遞路徑牽涉到針對(duì)病毒感染的細(xì)胞應(yīng)答。
順式作用核因子激活的T細(xì)胞(“NFAT”)增強(qiáng)子元件受轉(zhuǎn)錄因子NFAT調(diào)控。順式作用NFAT增強(qiáng)子元件出現(xiàn)在蛋白激酶C(“PKC”)信號(hào)傳遞路徑和鈣調(diào)磷酸酶(“CaN”)的信號(hào)傳遞路徑之中。PKC信號(hào)傳遞路徑牽涉到組胺在血管收縮中的作用。CaN信號(hào)傳遞路徑牽涉到心臟肥大。
順式作用κB細(xì)胞核因子(“NFκB”)增強(qiáng)子元件受轉(zhuǎn)錄因子NFκB調(diào)控。順式作用NFκB增強(qiáng)子元件出現(xiàn)在IκB激酶(“IKK”)信號(hào)傳遞路徑和NFκB信號(hào)傳遞路徑之中。IKK和NFκB信號(hào)傳遞路徑牽涉到針對(duì)多種形式胞外應(yīng)激的細(xì)胞應(yīng)答。
順式作用血清應(yīng)答元件(“SRE”)增強(qiáng)子元件受轉(zhuǎn)錄因子Elk-1和SRF調(diào)控。順式作用SRE增強(qiáng)子元件出現(xiàn)在MAPK信號(hào)傳遞路徑和JNK信號(hào)傳遞路徑之中。
上文所列的順式元件已知屬于各自的路徑或上文所列的路徑。但是，還存在許多順式元件其信號(hào)傳遞路徑的歸屬尚未確定。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了一種確定候選順式元件是否屬于給定路徑的方法。在這個(gè)實(shí)施方案中，首先將含有有效地連接于報(bào)告基因的候選順式元件的報(bào)告基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到宿主初級(jí)細(xì)胞如免疫細(xì)胞之中。然后以激活待研究路徑的方式刺激該宿主細(xì)胞。然后測量該報(bào)告基因的活性。如果報(bào)告基因的活性響應(yīng)刺激而受到調(diào)控，則確定該候選順式元件屬于該待研究路徑。
報(bào)告基因構(gòu)建體的構(gòu)建和遞送本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案使用含有有效地連接于候選順式元件的報(bào)告基因的重組報(bào)告基因構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過基于腺病毒的載體將該重組報(bào)告基因構(gòu)建體遞送到宿主細(xì)胞中。圖4為顯示基于重組腺病毒的載體的示意圖。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體衍生自5型腺病毒基因組，如市售的BD ADENO-X DNA，其長度大約為33kb，并已介由缺失大部分的E1和E3區(qū)而被改變。該重組報(bào)告基因插入物含有候選順式元件、位于所述候選順式元件上游的轉(zhuǎn)錄阻遏物以及位于所述候選順式元件下游的報(bào)告基因。
該上游轉(zhuǎn)錄阻遏物(“TB”)元件降低報(bào)告基因的本底轉(zhuǎn)錄水平，并可能包括一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄中止元件或聚腺苷酸化位點(diǎn)。典型的報(bào)告基因包括但不限于熒光素酶、β-半乳糖苷酶(“GAL”)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(“CAT”)、綠色熒光蛋白(“GFP”)及它們的變體，包括但不限于去穩(wěn)定化的變體。在下文更為詳細(xì)說明的一個(gè)實(shí)施方案中，報(bào)告基因?yàn)槟軌蜃钄嘈盘?hào)傳遞路徑表達(dá)的超顯性突變體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，重組報(bào)告基因插入物側(cè)接I-Ceu I限制性位點(diǎn)和PI-Sce I限制性位點(diǎn)，并在體外連接到用I-Ceu I和PI-Sce I預(yù)切的線性化的BD ADENO-X DNA上。將所得的DNA在大腸桿菌中培養(yǎng)，并將純化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中。重組病毒通過將全長重組腺病毒DNA轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中進(jìn)行拯救，然后擴(kuò)增以產(chǎn)生高滴度的貯液。
確定候選順式元件是否屬于某一路徑包含候選順式元件的報(bào)告基因構(gòu)建體一經(jīng)克隆到基于腺病毒的載體中，則通過將載體與宿主細(xì)胞在足夠的感染復(fù)數(shù)(MOI)下接觸并孵育足夠長的時(shí)間而將報(bào)告基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。下文的實(shí)施例中提供了適當(dāng)?shù)腗OIs和孵育時(shí)間的實(shí)例。
一旦宿主細(xì)胞經(jīng)包含候選順式元件的報(bào)告基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染后，就對(duì)報(bào)告基因活性的基底水平進(jìn)行測量。然后，對(duì)細(xì)胞施加已知能激活待研究路徑的刺激。例如，如果待研究路徑為p38 MAPK路徑，則所施加的刺激可以是炎癥細(xì)胞因子或細(xì)胞應(yīng)激，如熱擊或高滲介質(zhì)。在施加刺激之后，再次測量報(bào)告基因的活性，并與其基底水平的活性進(jìn)行比較。如果報(bào)告基因的活性隨著施加刺激而受到調(diào)控，則確定該候選順式元件屬于該待研究路徑。
實(shí)施例以下的實(shí)施例為非限制的。例如，也考慮使用未列出的其它順式元件，正如使用未列出的其它報(bào)告基因和調(diào)節(jié)基因一樣。就本發(fā)明的目的來說，“離體”是指使用初級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)物，而不是使用永生化的細(xì)胞系。
實(shí)施例初級(jí)人類免疫細(xì)胞中的重組腺病毒感染本實(shí)施例中，利用能夠組成型地表達(dá)綠色熒光蛋白的重組腺病毒(“AdV:GFP”)研究了所有主要細(xì)胞類型的初級(jí)人類免疫細(xì)胞對(duì)腺病毒感染的易感性。這樣的重組腺病毒可從Quantum Biology商購獲得。本實(shí)施例中，由AdV:GFP成功轉(zhuǎn)染的初級(jí)人類免疫細(xì)胞類型包括骨髓巨噬細(xì)胞、體外分化的未成熟樹突細(xì)胞(“iDCs”)以及外周血單核細(xì)胞(“PBMCs”)。iDCs是由利用IL-4和GM-CSF從PBMCs中負(fù)選擇的CD14+細(xì)胞制備的。巨噬細(xì)胞和iDCs用Adv:GFP以每個(gè)細(xì)胞10-330范圍的感染復(fù)數(shù)感染，隨即孵育16-24小時(shí)。然后在熒光顯微鏡下檢查細(xì)胞的GFP表達(dá)。
圖1A顯示了轉(zhuǎn)染的骨髓巨噬細(xì)胞中的GFP表達(dá)，而圖1B顯示了100MOI下轉(zhuǎn)染的iDC中的GFP表達(dá)。在此MOI下，高達(dá)90％的細(xì)胞表現(xiàn)出可檢測的GFP表達(dá)。
新鮮的外周血單核細(xì)胞(“PBMCs”)用AdV:GFP以每個(gè)細(xì)胞100-1000范圍的MOI感染。在感染24小時(shí)后，用特異于CD4和CD19的單克隆抗體標(biāo)記感染的細(xì)胞。
圖1C顯示了CD4+T淋巴細(xì)胞中的GFP表達(dá)，而圖1D顯示了用AdV:GFP以300MOI感染的CD19+B淋巴細(xì)胞中的GFP表達(dá)。在這兩個(gè)圖中，GFP表達(dá)都是用可由BD Biosciences商購的FACSCalibur分析儀在515nm利用FL1設(shè)置測量的。兩圖中所示的熒光強(qiáng)度移位表明在這兩種培養(yǎng)物中大多數(shù)細(xì)胞均表現(xiàn)出可檢測的GFP表達(dá)。
實(shí)施例用AdV:IκBsd阻斷巨噬細(xì)胞中的NFκB信號(hào)傳遞路徑本實(shí)施例中，構(gòu)建了能夠組成型表達(dá)超顯性IκB突變體的重組腺病毒(“AdV:IκBsd”)。IκBsd突變體包含人IκBa的兩個(gè)點(diǎn)突變，即絲氨酸32和絲氨酸36都變成了丙氨酸。從而，IκBsd突變體不能由IκB激酶-b磷酸化。這樣，IκBsd突變體能夠通過防止蛋白酶體介導(dǎo)的IκBa降解而阻斷NFκB信號(hào)傳遞路徑。在沒有NFκB信號(hào)傳遞路徑的情況下，例如當(dāng)其被超顯性IκB突變體所阻斷時(shí)，TNF-α處理誘導(dǎo)包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的凋亡。
本實(shí)施例中，骨髓巨噬細(xì)胞由AdV:GFP感染作為對(duì)照，或由AdV:IκBsd感染。然后用10nM的TNF-α處理兩組巨噬細(xì)胞。通過碘化丙錠(“PI”)染色測量細(xì)胞凋亡，PI在不出現(xiàn)細(xì)胞通透的情況下對(duì)DNA進(jìn)行染色。
如圖2所示，NFκB信號(hào)傳遞路徑保持完好無損的對(duì)照組AdV:GFP表現(xiàn)出最低的細(xì)胞凋亡誘發(fā)率，低于總細(xì)胞數(shù)的5％(未感染的對(duì)照細(xì)胞和未經(jīng)TNF-α處理的感染細(xì)胞也表現(xiàn)出低于5％的細(xì)胞凋亡誘發(fā)率)。相比之下，AdV:IκBsd細(xì)胞顯示了高于75％的細(xì)胞凋亡誘發(fā)率。從而證明AdV:IκBsd有效地阻斷了巨噬細(xì)胞中的NFκB信號(hào)傳遞路徑。
實(shí)施例用AdV:IκBsd阻斷樹突細(xì)胞中的NFκB信號(hào)傳遞路徑本實(shí)施例中，測定了在體外分化的人類樹突細(xì)胞(“iDCs”)中的NFκB信號(hào)傳遞路徑的阻斷效應(yīng)。圖3A為表示經(jīng)脂多糖(“LPS”)或CD40配體(“CD40L”)激活的iDC的信號(hào)傳遞路徑的示意圖，其中NFκB信號(hào)傳遞路徑為IκBsd所阻斷。LPS激活TLR4；CD40L激活CD40。
本實(shí)施例中，iDC如下獲得首先，通過密度梯度離心獲得外周血單核細(xì)胞(“PBMCs”)。一種密度梯度離心介質(zhì)為FICOLL PAQUE，可從Amersham Biosciences商購獲得。然后通過磁去分選(magnetic depletion)非單核細(xì)胞而從PBMCs中分離出單核細(xì)胞。最后，利用IL4和GM-GSF對(duì)單核細(xì)胞處理6天，從單核細(xì)胞中分離出iDCs。
本實(shí)施例中，隨之對(duì)分離iDCs的靜息培養(yǎng)物(1)進(jìn)行模擬感染，(2)用AdV:GFP以100的感染復(fù)數(shù)進(jìn)行感染作為對(duì)照，或(3)用AdV:IκBsd以100的感染復(fù)數(shù)進(jìn)行感染(就本發(fā)明的目的來說，“感染復(fù)數(shù)”(“MOI”)是指感染單位與被感染細(xì)胞的比率。除非另有說明，感染復(fù)數(shù)均表達(dá)為感染單位與HEK293T細(xì)胞的比率)。經(jīng)過16-24小時(shí)的孵育期后，隨之對(duì)每組iDCs(1)進(jìn)行模擬激活，(2)用濃度為1μg/ml的LPS激活，或(3)用濃度為1μg/ml的CD40L激活。在iDC成熟期間，NFκB激活的抑制對(duì)炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響通過對(duì)選擇性細(xì)胞因子和趨化因子的實(shí)時(shí)PCR分析以及對(duì)多種細(xì)胞因子分泌的血細(xì)胞計(jì)數(shù)珠分析法進(jìn)行。激活后4-8小時(shí)，提取RNA，并通過TaqMan實(shí)時(shí)PCR測量多種細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)水平。同樣，在激活后8小時(shí)收集上清液，并通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)珠分析法檢查細(xì)胞因子的分泌。
圖3B為表示相對(duì)于AdV:GFP感染細(xì)胞的AdV:IκBsd感染細(xì)胞中選定細(xì)胞因子的表達(dá)的圖表。本實(shí)施例中，證明AdV:IκBsd有效地阻斷了激活的樹突細(xì)胞中的NFκB信號(hào)傳遞路徑。具體來說，該圖顯示IL-12、IL-10、IL-8和IL-6的表達(dá)顯著降低。
實(shí)施例AdV:IκRsd與S0101627的比較本實(shí)施例中，利用超顯性IkB的表達(dá)或已知的IkB激酶β抑制劑化合物S0101627的抑制作用的并行比較，全面研究了在LPS或CD40配體激活樹突細(xì)胞期間NFkB信號(hào)傳遞路徑的抑制。本實(shí)施例中，對(duì)iDCs(1)進(jìn)行模擬感染，(2)用AdV:GFP感染作為對(duì)照，或(3)用AdV:IkBsd感染12個(gè)小時(shí)，接著用LPS或CD40L進(jìn)行激活。激活時(shí)，對(duì)沒有感染的iDC用S0101627進(jìn)行處理。激活后8小時(shí)，收集上清和細(xì)胞，進(jìn)一步處理，并分別進(jìn)行炎性細(xì)胞因子的血細(xì)胞計(jì)數(shù)珠分析以及選擇性細(xì)胞因子/趨化因子表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR對(duì)分析。細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)分別示于表1和表2中。
表1.化學(xué)抑制劑(cmpd)或利用腺病毒(AdV:IkB)通過生化抑制NFkB信號(hào)傳遞路徑時(shí)選擇性細(xì)胞因子的表達(dá)
表2.化學(xué)抑制劑(cmpd)或利用腺病毒(AdV:IkB)通過生化抑制NFkB信號(hào)傳遞路徑時(shí)選擇性趨化因子的表達(dá)
這些結(jié)果表明了與S0101627化合物相當(dāng)?shù)母咿D(zhuǎn)染效率和對(duì)NFκB信號(hào)傳遞路徑的高抑制效率。
實(shí)施例產(chǎn)生能夠表達(dá)處于與炎癥相關(guān)的選擇性順式元件的控制之下的報(bào)告基因或調(diào)節(jié)基因的重組腺病毒本實(shí)施例舉例說明了用于對(duì)與炎癥相關(guān)的信號(hào)傳遞路徑進(jìn)行圖譜繪制的重組腺病毒構(gòu)建體的構(gòu)建。后面的實(shí)施例將對(duì)其使用進(jìn)行說明。本實(shí)施例中，基于可由BD Biosciences Clontech商購獲得的BD ADENO-X多核苷酸構(gòu)建了重組腺病毒。也考慮使用其它重組腺病毒，故ADENO-X的使用不應(yīng)視為是限制性的。ADENO-X病毒DNA長度大約為33kb。其衍生自5型腺病毒基因組，并已通過缺失大部分的腺病毒E1和E3區(qū)而被改變。圖4提供了重組腺病毒載體以及其中插入的啟動(dòng)子/報(bào)告基因系統(tǒng)的示意圖。
如圖4所示，插入物包含位于順式作用增強(qiáng)子元件上游的轉(zhuǎn)錄阻遏物，其有效地連接于熒光素酶報(bào)告基因。圖4中所示的6個(gè)順式元件僅為示例而非限制。除了所列出的以外，也考慮使用其它的順式元件。也考慮可以使用其它報(bào)告基因來代替熒光素酶。同樣也考慮插入物含有調(diào)節(jié)基因，如IκBsd超顯性突變體來代替報(bào)告基因。
如圖4所示，插入物被克隆到重組腺病毒的E1區(qū)。通過將該重組腺病毒構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中而進(jìn)行拯救，然后進(jìn)行擴(kuò)增以制備高滴度的腺病毒貯液。經(jīng)過兩個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增后，通常能夠在HEK293中獲得大約1×109pfu/ml的病毒滴度。
實(shí)施例利用報(bào)告基因重組腺病毒對(duì)初級(jí)人類免疫細(xì)胞進(jìn)行感染本實(shí)施例利用能夠表達(dá)處于特定順式元件的控制之下的報(bào)告基因的重組腺病毒來對(duì)特定的信號(hào)傳遞路徑進(jìn)行圖譜繪制。表3列出了用來產(chǎn)生這些重組腺病毒的與炎癥相關(guān)的順式元件及其相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)傳遞路徑。
表3.與炎癥相關(guān)的信號(hào)傳遞路徑
在本實(shí)施例中，利用前一實(shí)施例的報(bào)告基因重組腺病毒感染初級(jí)人類免疫細(xì)胞。然后對(duì)感染的細(xì)胞進(jìn)行刺激，并觀察響應(yīng)該刺激的報(bào)告基因活性。
施加給感染細(xì)胞的刺激取決于感染細(xì)胞的類型。例如，CD4+T細(xì)胞用PMA/離子霉素(“PI”)或在蛋白質(zhì)G的存在下用抗CD3和CD28的抗體刺激?；蛘?，巨噬細(xì)胞如衍生自從CD14+單核細(xì)胞的附著在板上的巨噬細(xì)胞用脂多糖(“LPS”)來刺激。類似地，樹突細(xì)胞如體外分化的樹突細(xì)胞用LPS刺激。
刺激后經(jīng)過一定的時(shí)間，收集細(xì)胞并測量熒光素酶活。熒光素酶活可通過酶分析法使用產(chǎn)生光子的底物并利用光度計(jì)測量光子來測量。
本實(shí)施例中，CD4+T細(xì)胞是如下制備的首先，通過密度梯度離心獲得外周血單核細(xì)胞(“PBMCs”)。一種密度梯度離心介質(zhì)為FICOLLPAQUE，可從Amersham Biosciences商購獲得。然后通過磁去分選CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞以及單核細(xì)胞而將CD4+T細(xì)胞從PBMCs中分離出來。
本實(shí)施例中，分離的CD4+T細(xì)胞的靜息培養(yǎng)物隨之用含在特定順式元件控制之下轉(zhuǎn)錄的熒光素酶基因的重組腺病毒感染。本實(shí)施例中，利用4種重組腺病毒構(gòu)建體感染4種不同的靜息CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)物，每個(gè)構(gòu)建體包含以下四種順式元件之一CRE、AP-1、NFκB和ISRE。感染后再孵育16個(gè)小時(shí)后，隨之對(duì)細(xì)胞(1)進(jìn)行模擬刺激(“C”)，(2)用20ng/ml的PMA和0.5ug/ml的離子霉素(“PI”)刺激，或(3)用10ng/ml的抗-CD3mAb、5ug/ml的抗-CD28mAb和10ug/ml的蛋白質(zhì)G(“3-28”)刺激。然后在刺激后8小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)收集細(xì)胞并測量熒光素酶活。熒光素酶活可用光度計(jì)測量。圖5A為表示用含CRE順式元件的重組腺病毒感染的CD4+T細(xì)胞的熒光素酶活的圖表。圖5B為表示用含AP-1順式元件的重組腺病毒感染的CD4+T細(xì)胞的熒光素酶活的圖表。圖5C為表示用含NFκB順式元件的重組腺病毒感染的CD4+T細(xì)胞的熒光素酶活的圖表。圖5D為表示用含ISRE順式元件的重組腺病毒感染的CD4+T細(xì)胞的熒光素酶活的圖表。這些圖顯示，在PI刺激后48小時(shí)，CRE和AP-1順式元件顯著活化，而其它順式元件和刺激組合未見明顯活化。
對(duì)CD14+結(jié)合在板上的巨噬細(xì)胞也進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)。本實(shí)施例中，巨噬細(xì)胞如下獲得首先，通過密度梯度離心獲得外周血單核細(xì)胞(“PBMCs”)。一種密度梯度離心介質(zhì)為FICOLL PAQUE，可從AmershamBiosciences商購獲得。然后通過磁去分選非單核細(xì)胞而從PBMCs中分離出單核細(xì)胞。最后，通過在無胎牛血清(“FBS”)存在時(shí)將單核細(xì)胞附著到組織培養(yǎng)板上而將巨噬細(xì)胞從單核細(xì)胞中分離出來。
本實(shí)施例中，分離的巨噬細(xì)胞的靜息培養(yǎng)物隨之用含在特定順式元件控制之下轉(zhuǎn)錄的熒光素酶基因的重組腺病毒感染。本實(shí)施例中，使用4種重組腺病毒構(gòu)建體感染4種不同的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物，每個(gè)構(gòu)建體含有以下四種順式元件之一CRE、AP-1、NFκB和ISRE。巨噬細(xì)胞以每個(gè)細(xì)胞100的感染復(fù)數(shù)進(jìn)行感染。感染后再孵育16個(gè)小時(shí)后，隨之對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行模擬刺激(“對(duì)照“)或用濃度1μg/ml的脂多糖(“LPS”)刺激。在刺激后24小時(shí)收集細(xì)胞并用光度計(jì)測量熒光素酶活。圖6A為顯示四組巨噬細(xì)胞熒光素酶活的圖表，它們分別為四種重組腺病毒之一感染，每種重組腺病毒分別含AP-1順式元件、CRE順式元件、ISRE順式元件和NFκB順式元件。該圖顯示，AP-1和CRE順式元件具有顯著的基底水平活化和顯著的刺激活化。
對(duì)體外分化的樹突細(xì)胞(“iDCs”)也進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)。本實(shí)施例中，iDCs如下獲得首先，通過密度梯度離心法得外周血單核細(xì)胞(“PBMCs”)。一種密度梯度離心介質(zhì)為FICOLL PAQUE，可從Amersham Biosciences商購獲得。然后通過磁去分選非單核細(xì)胞而從PBMCs中分離出單核細(xì)胞。最后，利用IL4和GM-GSF對(duì)單核細(xì)胞處理6天，從單核細(xì)胞中分離出iDCs。
本實(shí)施例中，分離的iDCs的靜息培養(yǎng)物隨之用含在特定順式元件控制之下轉(zhuǎn)錄的熒光素酶基因的重組腺病毒感染。本實(shí)施例中，使用3種重組腺病毒構(gòu)建體感染3種不同的iDCs培養(yǎng)物，每個(gè)構(gòu)建體含以下三種順式元件之一AP-1、NFκB和ISRE。iDCs以每個(gè)細(xì)胞100的感染復(fù)數(shù)進(jìn)行感染。感染后再孵育16小時(shí)后，隨之對(duì)iDCs進(jìn)行模擬刺激(“C”)或用濃度1μg/ml的脂多糖(“LPS”)刺激。在刺激后2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)和24小時(shí)收集細(xì)胞并用光度計(jì)測量熒光素酶活。圖6B包含三個(gè)圖表，分別表示AP-1、NFκB和ISRE刺激的時(shí)間曲線。這些圖表證明了所有三種順式元件的顯著刺激。這些圖表還顯示了不同的活化時(shí)間曲線。
實(shí)施例在藥物開發(fā)過程中使用腺病毒報(bào)告基因系統(tǒng)來進(jìn)行靶標(biāo)確認(rèn)和體外化合物激活前面的實(shí)施例證明了初級(jí)人類免疫細(xì)胞在受到特定刺激后轉(zhuǎn)錄因子的選擇性活化以及活化時(shí)間曲線。這些觀察結(jié)果使得人們能夠利用這些基于腺病毒的轉(zhuǎn)錄因子激活報(bào)告基因系統(tǒng)在藥物開發(fā)過程中來進(jìn)行靶標(biāo)確認(rèn)和化合物激活。圖7A和7B為說明這一過程的示意圖。
本實(shí)施例中，靶細(xì)胞用不同的重組腺病毒報(bào)告基因感染，如圖7A和7B第一至六列所示。然后向培養(yǎng)物中加入刺激。孵育了特定的時(shí)間后，再測量熒光素酶活。實(shí)心圓代表假定的熒光素酶活。沒有刺激處理，則可能記錄到?jīng)]有或不可檢測的熒光素酶活。如果刺激激活了轉(zhuǎn)錄因子與其應(yīng)答元件的結(jié)合，如c-jun與AP-1增強(qiáng)子元件的結(jié)合，則會(huì)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，并能夠檢測到熒光素酶活。圖7A中A和B行所代表的不同刺激物可能激活不同的信號(hào)傳遞路徑。
一旦確立了這一點(diǎn)，則可聯(lián)合報(bào)告基因腺病毒實(shí)現(xiàn)靶基因的顯性負(fù)突變?nèi)鏘κBsd的共感染。靶標(biāo)所潛在涉及到的特定信號(hào)傳遞路徑的激活可能降低其經(jīng)特定刺激后的激活作用(記錄為降低的熒光素酶活)。圖7B為表示存在和不存在顯性負(fù)突變共感染時(shí)重組腺病毒報(bào)告基因的活性示意圖。
權(quán)利要求
1.一種確定刺激是否能夠激活免疫細(xì)胞中的候選順式作用調(diào)節(jié)元件的方法，其中所述順式作用調(diào)節(jié)元件受至少一種轉(zhuǎn)錄因子或增強(qiáng)子的調(diào)節(jié)，且其中所述刺激已知能夠調(diào)控信號(hào)傳遞路徑的表達(dá)，所述方法包括步驟(a)用重組腺病毒轉(zhuǎn)染所述免疫細(xì)胞，所述重組腺病毒含有有效地連接于所述候選順式作用調(diào)節(jié)元件的報(bào)告基因；(b)測量報(bào)告基因活性的基底水平；(c)對(duì)所述免疫細(xì)胞施加所述刺激；和(d)測量響應(yīng)所述刺激的報(bào)告基因的活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述刺激包括調(diào)控調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，并且所述施加步驟(c)包括調(diào)控所述調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)。
3.權(quán)利要求2的方法，還包括用所述調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染所述免疫細(xì)胞的步驟。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述施加步驟(c)包括引入候選調(diào)節(jié)化合物。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述報(bào)告基因選自熒光素酶、綠色熒光蛋白(“GFP”)、β-半乳糖激酶(“GAL”)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(“CAT”)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述報(bào)告基因?yàn)橐种苹颉?br> 7.權(quán)利要求6的方法，其中所述抑制基因?yàn)镮κBsd。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述順式作用調(diào)節(jié)元件受與炎癥相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白調(diào)控。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述順式作用調(diào)節(jié)元件選自AP-1、CRE、ISRE、NFAT、NFκB和SRE。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫細(xì)胞選自巨噬細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞以及未成熟樹突細(xì)胞。
11.一種抑制免疫細(xì)胞中信號(hào)傳遞路徑表達(dá)的方法，包括步驟(a)用重組腺病毒轉(zhuǎn)染所述免疫細(xì)胞，其中所述重組腺病毒含有有效地連接于順式作用調(diào)節(jié)元件的抑制基因，其中所述順式作用調(diào)節(jié)元件屬于所述信號(hào)傳遞路徑；和(b)誘導(dǎo)所述抑制基因表達(dá)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述信號(hào)傳遞路徑為NFκB信號(hào)傳遞路徑。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述抑制基因?yàn)镮κBsd。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述免疫細(xì)胞選自巨噬細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和未成熟樹突細(xì)胞。
全文摘要
用含有有效地連接于順式元件的報(bào)告基因的載體轉(zhuǎn)染初級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)物。在該細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)候選調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，并分析其對(duì)順式元件的影響作用。
文檔編號(hào)C12N15/861GK1886515SQ200480034585
公開日2006年12月27日 申請日期2004年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月1日
發(fā)明者韓昌洙, 李黎 申請人:安萬特藥物公司