專利名稱：修飾的抗cd52抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具體給予人類并具體用于治療的多肽。該多肽是經(jīng)修飾的多肽，通過(guò)這種修飾可導(dǎo)致其潛在的T細(xì)胞表位數(shù)減少，從而使該多肽在給予人后引發(fā)免疫應(yīng)答的傾向降低。本發(fā)明具體涉及能與人白細(xì)胞CD52抗原反應(yīng)從而使其潛在T細(xì)胞的表位數(shù)減少但保留結(jié)合CD52能力的抗CD52抗體的修飾。
背景技術(shù)：
有許多例子表明，治療蛋白的效率會(huì)受到不希望有的與該治療蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)的限制。一些小鼠單克隆抗體有望作為許多人類疾病的治療劑，但在某些情況下由于誘導(dǎo)了顯著的人抗鼠抗體(HAMA)應(yīng)答而失效[Schroff等，(1985)Cancer Res.45879-885；Shawler等，(1985)J.Immunol.1351530-1535]。就單克隆抗體而言，已經(jīng)開發(fā)了許多技術(shù)以試圖降低這種HAMA應(yīng)答[WOA8909622；EPA0239400；EPA0438310；WOA9106667；EPA0699755]。這些重組DNA方法通常是減少最終抗體構(gòu)建物中的小鼠遺傳成分同時(shí)增加最終構(gòu)建物中的人遺傳成分。但在一些情況下，所得“人源化”抗體仍會(huì)引起患者的免疫應(yīng)答[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2449，456；Rebello等，(1999)Transplantation 681417-1420]。
抗體不是唯一的一類作為治療劑給予后可對(duì)其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的多肽分子。人來(lái)源的蛋白質(zhì)以及具有與人體內(nèi)產(chǎn)生的氨基酸序列相同的序列的蛋白質(zhì)甚至也可誘導(dǎo)人的免疫應(yīng)答。著名的例子包括治療用的粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子[Wadhwa等，(1999)Clin.Cancer Res.51353-1361]和干擾素α2[Russo等，(1996)Bri.J.Haem.94300-305；Stein等，(1988)New Engl.J.M編，3181409-1413]。
誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵是蛋白質(zhì)內(nèi)存在可通過(guò)在MHC II類分子上呈遞而激活T細(xì)胞的肽，即所謂的“T細(xì)胞表位”。這種T細(xì)胞表位通常定義為能夠結(jié)合MHC II類分子的氨基酸殘基序列。含蓄地說(shuō)，“T細(xì)胞表位”指當(dāng)結(jié)合MHC分子時(shí)可被T細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別的表位，這種表位至少?gòu)脑瓌t上說(shuō)可通過(guò)與TCR結(jié)合而活化這些T細(xì)胞從而促進(jìn)T細(xì)胞應(yīng)答。
MHC II類分子是一組高度多態(tài)性的蛋白質(zhì)，它們?cè)谳o助T細(xì)胞選擇和活化中起著核心作用。人白細(xì)胞抗原DR組(HLA-DR)是這組蛋白質(zhì)優(yōu)勢(shì)同種型，然而，同種型HLA-DQ和HLA-DP也具有類似功能。在人群中，各個(gè)體帶有2-4個(gè)DR等位基因、2個(gè)DQ和2個(gè)DP等位基因。已經(jīng)揭示了許多DR分子的結(jié)構(gòu)，它們的結(jié)構(gòu)顯示是具有多個(gè)疏水口袋的兩端不封閉的肽結(jié)合槽，這些口袋可以容納肽的疏水殘基(口袋殘基)[Brown等，Nature(1993)36433；Stern等，(1994)Nature 368215]。多態(tài)性可區(qū)分II類分子的不同同種異型，構(gòu)成了肽結(jié)合槽內(nèi)不同肽結(jié)合表面的廣泛多樣性，并在群體水平上確保了能識(shí)別外源蛋白質(zhì)及產(chǎn)生對(duì)病原生物免疫應(yīng)答的最大靈活性。
對(duì)治療蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答通過(guò)MHC II類肽呈遞途徑而發(fā)生。此途徑中外源蛋白質(zhì)被內(nèi)吞加工以與MHC II類分子的DR、DQ或DP類一起呈遞。MHC II類分子通過(guò)巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞等專職性抗原呈遞細(xì)胞(APC)表達(dá)。T細(xì)胞表面的同源T細(xì)胞受體與MHC II類肽復(fù)合體以及CD4分子等其它協(xié)同受體的交叉結(jié)合可誘導(dǎo)T細(xì)胞活化狀態(tài)。活化導(dǎo)致釋放細(xì)胞因子，這進(jìn)一步激活B細(xì)胞等其它淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體或活化的T殺傷細(xì)胞組成了全面的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
如WO98/52976和WO00/34317所述，鑒定T細(xì)胞表位是表位消除的第一個(gè)步驟。在這些教導(dǎo)中，通過(guò)利用感興趣蛋白質(zhì)內(nèi)的明智氨基酸取代來(lái)除去預(yù)測(cè)的T細(xì)胞表位。除了計(jì)算機(jī)技術(shù)，還有測(cè)定合成肽結(jié)合MHC II類分子的能力的體外方法。一種示例性的方法采用MHC同種異型明確的B細(xì)胞系作為MHC II類結(jié)合表面的來(lái)源并且可用于MHC II類配體鑒定[Marshall等，(1994)J.Immunol.1524946-4956；O′Sullivan等，(1990)J.Immunol.1451799-1808；Robadey等，(1997)J.Immunol 1593238-3246]。然而，由于MHC同種異型的廣泛多樣性，這種技術(shù)不適合篩選多個(gè)潛在表位，而且它們也不能證實(shí)其結(jié)合性肽是否能作為T細(xì)胞表位。
近年已開始采用混有合成肽的重組MHC分子的可溶性復(fù)合物技術(shù)[Kern等，(1998)Nature Medicine 4975-978；Kwok等，(2001)TRENDS in Immunol.22583-588]。這些試劑和方法可用來(lái)鑒定人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物外周血樣品中是否存在的能夠結(jié)合特定MHC-肽復(fù)合體的T細(xì)胞克隆但不適合篩選MHC同種異型廣泛多樣性的多個(gè)潛在表位。
如上文所述以及作為其推論，希望鑒定并除去或至少減少某給定的從原理上說(shuō)有治療價(jià)值但最初具有免疫原性的肽、多肽或蛋白質(zhì)中潛在的T細(xì)胞表位。這些有治療價(jià)值的分子之一是能特異性結(jié)合人白細(xì)胞CD52抗原的單克隆抗體。本發(fā)明的優(yōu)選單克隆抗體是稱為“CAMPATH”的大鼠抗體的修飾形式。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供除去了一個(gè)或多個(gè)潛在T細(xì)胞表位的CAMPATH抗體的修飾形式。
CD52分子的分子量為21-28kDa，成熟蛋白質(zhì)包含一12個(gè)氨基酸的肽，其N-連接的寡糖通過(guò)其糖磷脂酰肌醇錨結(jié)合于細(xì)胞膜。至少95％的人外周血淋巴細(xì)胞以及除精子之外的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系細(xì)胞上存在該抗原。它在紅細(xì)胞、血小板、組織樹突細(xì)胞或骨髓干細(xì)胞上不存在(Hale等，(1990)Tissue Antigens 35873；Buggins等，(2002)Blood，1001715)。
第一種CD52抗體是來(lái)用人淋巴細(xì)胞免疫大鼠而產(chǎn)生以嘗試獲得能活化補(bǔ)體可用于移植前去除供體骨髓中的T細(xì)胞的抗體[Hale等，(1983)Blood 62873-882]。主要的溶細(xì)胞抗體是抗CD52 IgM抗體。雖然可離體應(yīng)用，但CD52 IgM(CAMPATH-1M)介導(dǎo)的補(bǔ)體活化在體內(nèi)不能有效消除T細(xì)胞。通過(guò)同種型轉(zhuǎn)換從IgG2a抗體克隆獲得的大鼠IgG2b單克隆抗體CAMPATH-1G能結(jié)合人Fc受體、通過(guò)抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCCD)引起細(xì)胞死亡在體內(nèi)有效消除細(xì)胞[Friend等，(1991)Transplant.Proc.232253-2254；Hale等，(1998)Blood 924581-4590]。然而，CAMPATH-IG的應(yīng)用受到患者體內(nèi)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的限制[Cobbold，J.S.(1990)J.Immunol.Methods 12719-24；Dyer，M.J.S.(1989)Blood 731431-1439]。為降低免疫原性，通過(guò)將Kabat超變區(qū)克隆入人NEW和Rei骨髓瘤蛋白提供的框架構(gòu)建了一種人源化IgG1抗體-CAMPATH-1H[Riechmann等，(1988)Nature 332323-327]。雖然與CAMPTH-1G相比其免疫原性降低，但這種人源化抗體仍能引發(fā)一些患者的免疫應(yīng)答。在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的早期報(bào)道中，經(jīng)靜脈注射(i.v.)給藥治療一個(gè)療程的8名患者未報(bào)道有抗球蛋白應(yīng)答，但接受2個(gè)療程CAMPATH-1H治療的4名患者中3名出現(xiàn)了抗球蛋白抗體(Issacs等，(1992)Lancet，211103-06)。在隨后類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中進(jìn)行的升高單劑量i.v.研究中，有63％的病人產(chǎn)生抗球蛋白應(yīng)答，這是最初的抗獨(dú)特型應(yīng)答[Weinblatt等，(1995)Arthritis.Rheum.381589-1594]。所有10名接受皮下給予升高劑量CAMPATH-1H的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者也報(bào)道有抗球蛋白應(yīng)答(Schnitzer等，J.Rheumatol.(1997)241031-36)。
因此，需要提供能減少潛在的T細(xì)胞表位數(shù)而降低或消除病人中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答潛能的抗CD52抗體。預(yù)計(jì)這種蛋白質(zhì)在病人中能顯示循環(huán)時(shí)間增加，能提高對(duì)非修飾抗體的免疫應(yīng)答，并且可能對(duì)慢性或復(fù)發(fā)性疾病如許多CAMPATH適應(yīng)證病理特別有益。因此，本發(fā)明提供能減少潛在T細(xì)胞表位數(shù)的抗CD52抗體的修飾形式，預(yù)計(jì)其可顯示免疫原性降低但仍基本保留了與親代非修飾抗體效力相關(guān)的有益治療特征。
本發(fā)明公開了在抗CD52抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)序列中鑒定的序列，這些序列是具有MHC II類結(jié)合能力的潛在T細(xì)胞表位。
盡管其它文獻(xiàn)也提供了抗CD52抗體分子，包括其“人源化”形式[美國(guó)專利5846543；6120766；6569430；WO0230460]，但這些描述都沒有認(rèn)識(shí)到T細(xì)胞表位對(duì)于蛋白質(zhì)免疫原性的重要性，也沒有考慮按照本發(fā)明的方案以特異性可控方式來(lái)直接影響其所述性能。
附圖簡(jiǎn)述

圖1描述了經(jīng)修飾重鏈“camp VH”的一種示例性載體。dhfr是二氫葉酸還原性選擇；CMV pro是CMVIE啟動(dòng)子；pA是多聚A；Amp R是氨芐青霉素抗性。
圖2描述了經(jīng)修飾重鏈“camp VL”的一種示例性載體。Neo是新霉素(G148)選擇；CMV pro是CMV IE啟動(dòng)子；pA是多聚A；Amp R是氨芐青霉素抗性。
圖3描述了修飾的重鏈可變區(qū)DIVHv1的DNA和氨基酸序列。
圖4描述了修飾的重鏈可變區(qū)DIVHv2的DNA和氨基酸序列。
圖5描述了修飾的重鏈可變區(qū)DIVHv3的DNA和氨基酸序列。
圖6描述了修飾的重鏈可變區(qū)DIVHv4的DNA和氨基酸序列。
圖7描述了修飾的重鏈可變區(qū)DIVHv5的DNA和氨基酸序列。
圖8描述了修飾的輕鏈可變區(qū)DIVKv1的DNA和氨基酸序列。
圖9描述了修飾的輕鏈可變區(qū)DIVKv2的DNA和氨基酸序列。
圖10描述了修飾的輕鏈可變區(qū)DIVKv3的DNA和氨基酸序列。
圖11描述了修飾的輕鏈可變區(qū)DIVKv4的DNA和氨基酸序列。
圖12描述了修飾的輕鏈可變區(qū)DIVKv5的DNA和氨基酸序列。
圖13描述了人IgG1恒定區(qū)的DNA和氨基酸序列。
圖14描述了人κ恒定區(qū)的DNA和氨基酸序列。
圖15小結(jié)了采用另一種樹突細(xì)胞T細(xì)胞方案以修飾的DIVHv5/DIVKv2抗體進(jìn)行初步研究的結(jié)果。
圖16小結(jié)了人源化的CAMPATH 1H和修飾的DIVHv5/DIVKv2抗體的T細(xì)胞免疫原性(樹突細(xì)胞T細(xì)胞測(cè)定)比較。用斯氏T檢測(cè)比較了(*)和未處理對(duì)照的Cpm值(p＜0.05)。
發(fā)明概述和描述本發(fā)明提供了一種修飾的抗體，其能減少潛在的T細(xì)胞表位數(shù)而修飾免疫特性。本發(fā)明公開了在CAMPATH-1G重鏈和輕鏈可變區(qū)序列中鑒定到的可與MHC II類分子結(jié)合的潛在的T細(xì)胞表位。本發(fā)明公開了在人類中可能具有免疫原性的抗體可變區(qū)序列中的主要區(qū)域以及可消除或減少這些位點(diǎn)潛在免疫原性效力的修飾的序列。
一方面，本發(fā)明提供了對(duì)大鼠抗體CAMPATH-1G所識(shí)別的CD52抗原具有特異性的修飾的抗體分子，該分子中，CAMPATH-1G抗體可變區(qū)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代而降低了MHC II類分子對(duì)該區(qū)域衍生肽的識(shí)別。當(dāng)用于本發(fā)明的修飾抗體時(shí)，術(shù)語(yǔ)“抗CD52抗體”和“CAMPATH抗體”表示這種修飾的抗體保留了與CD52結(jié)合能力的能力。本發(fā)明的實(shí)施方案包括一種抗CD52抗體，其重鏈可變區(qū)包含具有一個(gè)或多個(gè)表1所列取代的SEQ ID NO1的取代變體，該變體中的氨基酸殘基編號(hào)即是它們?cè)赟EQ ID NO1中的編號(hào)，其輕鏈可變區(qū)包含具有一個(gè)或多個(gè)表2所列取代的SEQ ID NO2的取代變體，該變體中的氨基酸殘基編號(hào)即是它們?cè)赟EQ ID NO1中的編號(hào)。一些實(shí)施方案中，所述抗CD52抗體的重鏈還包含人IgG1恒定區(qū)，其輕鏈還包含人κ恒定區(qū)。
表1-CAMPATH-1G重鏈可變區(qū)中潛在T細(xì)胞表位的取代(SEQ ID NQ1)
表2-CAMPATH-1G輕鏈中潛在T細(xì)胞表位的取代(SEQ ID NO2)
在各種實(shí)施方案中，在重鏈和/或輕鏈中產(chǎn)生了2個(gè)以上，或3個(gè)以上，或4個(gè)以上，或5個(gè)以上，或6個(gè)以上，或7個(gè)以上，或8個(gè)以上，或9個(gè)以上，或10個(gè)以上，或11個(gè)以上，或12個(gè)以上的氨基酸取代。一些實(shí)施方案中，在重鏈和/或輕鏈中產(chǎn)生了5-20個(gè)，或7-14個(gè)氨基酸取代。
一些實(shí)施方案中，所述抗CD52抗體的重鏈可變區(qū)包含具有一個(gè)或多個(gè)下述取代的SEQ ID NO1的取代變體，其中，氨基酸殘基編號(hào)即是它們?cè)赟EQ ID NO1中的編號(hào)用Gln取代氨基酸殘基3上的Lys；用Ala、Cys、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸殘基5上的Leu；用Arg、Gly、Pro、Leu取代氨基酸殘基18上的Met；用Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Asn、Asp、Met、Gln、Glu、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代氨基酸殘基20上的Leu；用Asp、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser、Thr取代氨基酸殘基23上的Ala；用Val取代氨基酸殘基37上的Ile；用Ala取代氨基酸殘基40上的Pro；用Pro取代氨基酸殘基41上的Ala；用Gly、His、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Trp、Tyr取代氨基酸殘基44上的Ala；用Leu取代氨基酸殘基45上的Pro用Ile或Val取代氨基酸殘基48上的Leu用Ala、His、Ile、Pro或Ser取代氨基酸殘基77上的Thr；用Lys取代氨基酸殘基78上的Gln；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr或Ser取代氨基酸殘基80上的Met；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser或Thr取代氨基酸殘基82上的Tyr；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser或Thr取代氨基酸殘基85上的Met；用Ser取代氨基酸殘基87上的Thr；用Val取代氨基酸殘基95上的Thr；用Thr取代氨基酸殘基115上的Val；用Thr、Phe、Ile、Leu、Pro、Val、Trp或Tyr取代氨基酸殘基116上的Met；且其輕鏈可變區(qū)包含具有一個(gè)或多個(gè)下述取代的SEQ ID NO2的取代變體，該變體中，氨基酸殘基編號(hào)即是它們?cè)赟EQ ID NO2中的編號(hào)用Gln取代氨基酸殘基3上的Lys；用Ala、Asp、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸殘基10上的Phe；用Pro或Ile取代氨基酸殘基21上的Leu用Thr取代氨基酸殘基22上的Asn用Arg取代氨基酸殘基24上的Lys；用Asp、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸殘基40上的Leu；用Lys取代氨基酸殘基42上的Glu；用Ala取代氨基酸殘基43上的Ser；
用Ser取代氨基酸殘基46上的Leu；用Ala、Phe、Gly、Ile、Met、Pro、Ser、Trp或Tyr取代氨基酸殘基56上的Thr；用Ala、Gly、Met、Pro或Val取代氨基酸殘基58上的Ile；用Ala、Asp、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Iys、Pro、Arg、Ser、Thr取代氨基酸殘基83上的Val；用Tyr取代氨基酸殘基87上的Phe。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，該抗CD52抗體的重鏈可變區(qū)包含具有一個(gè)或多個(gè)下述取代的SEQ ID NO1的取代變體，該變體中的氨基酸殘基編號(hào)即是它們?cè)赟EQID NO1中的編號(hào)用Gln取代氨基酸殘基3上的Lys；用Gln取代氨基酸殘基5上的Leu；用Leu取代氨基酸殘基18上的Met；用Ile取代氨基酸殘基20上的Leu；用Ser取代氨基酸殘基23上的Ala；用Val取代氨基酸殘基37上的Ile；用Ala取代氨基酸殘基40上的Pro；用Pro取代氨基酸殘基41上的Ala；用Gly取代氨基酸殘基44上的Ala；用Leu取代氨基酸殘基45上的Pro；用Ile或Val取代氨基酸殘基48上的Leu；用Ala或Ser取代氨基酸殘基77上的Thr；用Lys取代氨基酸殘基78上的Gln；用Thr或Ser取代氨基酸殘基80上的Met用His取代氨基酸殘基82上的Tyr；用Ala取代氨基酸殘基85上的Met；用Ser取代氨基酸殘基87上的Thr；用Val取代氨基酸殘基95上的Thr；用Thr取代氨基酸殘基115上的Val；用Leu取代氨基酸殘基116上的Met；且其輕鏈可變區(qū)包含具有一個(gè)或多個(gè)下述取代的SEQ ID NO2的取代變體，該變體中的氨基酸殘基編號(hào)即是它們?cè)赟EQ ID NO2中的編號(hào)
用Gln取代氨基酸殘基3上的Lys；用Ser取代氨基酸殘基10上的Phe；用Ile取代氨基酸殘基21上的Leu；用Thr取代氨基酸殘基22上的Asn；用Arg取代氨基酸殘基24上的Lys；用Pro取代氨基酸殘基40上的Leu用Lys取代氨基酸殘基42上的Glu；用Ala取代氨基酸殘基43上的Ser；用Ser取代氨基酸殘基46上的Leu；用Ser取代氨基酸殘基56上的Thr；用Val取代氨基酸殘基58上的Ile；用Ile取代氨基酸殘基83上的Val；用Tyr取代氨基酸殘基87上的Phe。
在本發(fā)明的再一方面，提供能減少潛在T細(xì)胞表位數(shù)的變體單克隆抗體，所述變體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的組合，所述重鏈可變區(qū)包含選自從SEQ ID NO3到SEQ ID NO7或從SEQ ID NO13到SEQ ID NO40的序列，所述輕鏈可變區(qū)包含選自從SEQ ID NO8到SEQ ID NO12或從SEQ ID NO41到SEQ ID NO70的序列。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了能減少潛在T細(xì)胞表位數(shù)的變體單克隆抗體，所述變體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的組合，所述重鏈可變區(qū)包含選自從SEQ ID NO3到SEQ ID NO7的序列，所述輕鏈可變區(qū)包含選自從SEQ ID NO8到SEQ ID NO12的序列。一些實(shí)施方案中，所述抗CD52抗體還包含人IgG1恒定區(qū)和人κ恒定區(qū)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述包含人IgG1恒定區(qū)和人κ恒定區(qū)的抗CD52抗體的重鏈可變區(qū)含SEQ ID NO4，而其輕鏈可變區(qū)含SEQ ID NO12，或重鏈可變區(qū)含SEQ ID NO7而輕鏈可變區(qū)含SEQ ID NO12，或重鏈可變區(qū)含SEQID NO7而輕鏈可變區(qū)含SEQ ID NO10，或重鏈可變區(qū)含SEQ ID NO3而輕鏈可變區(qū)含SEQ ID NO10，或重鏈可變區(qū)含SEQ ID NO6而輕鏈可變區(qū)含SEQ ID NO10。
本發(fā)明還包括一種上述特定分子，該分子中所述氨基酸殘基的改變是特定位置上用其它氨基酸殘基取代、加入或刪除原本存在的氨基酸殘基；一種上述特定分子中，如果需要，通常通過(guò)對(duì)特定氨基酸進(jìn)行取代、加入或刪除來(lái)進(jìn)行其它改變以恢復(fù)所述分子的生物活性；一種上述特定分子中的改變是在一個(gè)或多個(gè)殘基上進(jìn)行的，所述殘基是以下序列(A)-(S)的任何一種或所有的連續(xù)殘基串，其中所述序列衍生自該分子的CAMPATH-1G抗體可變區(qū)序列，序列用單字母代碼；A.＝KLLESGGGLVQPG；B.＝GLVQPGGSMRLSC；C.＝GSMRLSCAGSGFT；D.＝DFYMNWIRQPAGK；E.＝MNWIRQPAGKAPE；F.＝FTISRDNTQNMLY；G.＝QNMLYLQMNTLRA；H.＝MLYLQMNTLRAED；I.＝LQMNTLRAEDTAT；J.＝NTLRAEDTATYYC；K.＝DYWGQGVMVTVSS；L.＝PSFLSASVGDRVT；M.＝ASVGDRVTLNCKA；N.＝DRVTLNCKASQNI；O.＝KYLNWYQQKLGES；P.＝QKLGESPKLLIYN；Q.＝TGIPSRFSGSGSG；R.＝SSLQPEDVATYFC；S.＝EDVATYFCLQHIS。
本發(fā)明的一個(gè)方面是含有經(jīng)修飾而潛在的T細(xì)胞表位數(shù)減少并具有結(jié)合CD52能力的修飾的CAMPATH-1G分子的藥物組合物，該組合物中含有藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的另一方面是含有編碼本發(fā)明經(jīng)修飾的重鏈或輕鏈的核酸序列的表達(dá)載體。一些實(shí)施方案中，該表達(dá)載體包含編碼重鏈可變區(qū)的核酸序列，所述可變區(qū)包含潛在T細(xì)胞表位數(shù)減少并操作性連接于表達(dá)控制序列的SEQ ID NO1的取代變體。在不同實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包含選自SEQ ID NO71至SEQ ID NO75以及SEQ ID NO81至SEQ ID NO108或其簡(jiǎn)并變體的核酸序列。與多核苷酸有關(guān)的簡(jiǎn)并是指本領(lǐng)域所熟知的許多氨基酸的遺傳密碼可由一個(gè)以上密碼子來(lái)確定的這一事實(shí)。簡(jiǎn)并造成20種不同氨基酸可由四個(gè)不同堿基的64種可能的三聯(lián)序列來(lái)編碼。一些實(shí)施方案中，該表達(dá)載體包含編碼輕鏈可變區(qū)的核酸序列，所述可變區(qū)包含潛在T細(xì)胞表位數(shù)減少并操作性連接于表達(dá)控制序列的SEQ ID NO2的取代變體。在不同的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包含選自SEQ ID NO76至SEQ ID NO80以及SEQ ID NO109至SEQ ID NO138或其簡(jiǎn)并變體的核酸序列。本發(fā)明重鏈的合適表達(dá)載體的一個(gè)例子見圖1，本發(fā)明輕鏈的合適表達(dá)載體的一個(gè)例子見圖2。本發(fā)明的另一方面是含有一種或多種上述載體的培養(yǎng)細(xì)胞。本發(fā)明的再一方面是制備免疫球蛋白的方法，該方法在合適的表達(dá)控制序列的控制之下允許表達(dá)的條件下培養(yǎng)上述細(xì)胞，并從所述細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化免疫球蛋白。
本發(fā)明的其它方面是治療方法。其實(shí)施方案包括治療惡性淋巴瘤的方法，該方法包括給予患者有效量的本發(fā)明所述的修飾抗體。一些實(shí)施方案中，所述惡性淋巴瘤是白血病或淋巴瘤。其它實(shí)施方案包括治療患者自身免疫病的方法，該方法包括給予有效量的本發(fā)明所述的修飾抗體。在不同的實(shí)施方案中，所述自身免疫病是多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性血管炎(systemic vasiculitis)、葡萄膜炎、炎性腸病或硬皮病。
實(shí)施方案還包括在器官移植之前或之后免疫抑制患者的方法，該方法包括給予所述患者有效量的本發(fā)明所述的抗體。一些實(shí)施方案中，所述器官移植是腎移植。
當(dāng)提及“基本上無(wú)免疫原性”或“降低的免疫原性潛能”時(shí)包括與親代抗體，即非修飾的鼠類或嵌合性(鼠類可變區(qū)，人恒定區(qū))單克隆抗體或人源化單克隆抗體CAMPATH-1H相比，其免疫原性降低。術(shù)語(yǔ)“免疫原性”包括能夠在宿主動(dòng)物中引起、誘導(dǎo)或促進(jìn)體液應(yīng)答和/或T細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答，這里所述的“宿主動(dòng)物”具體指人，或者能夠在本文所述的樹突細(xì)胞/T細(xì)胞試驗(yàn)等合適的體外試驗(yàn)中引發(fā)應(yīng)答反應(yīng)。
本發(fā)明的修飾抗體的一個(gè)優(yōu)選特征是它們基本上保留了非修飾或“親代”抗體CAMPATH-1G或人源化抗體CAMAPATH-1H的功能活性。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案包含的修飾抗體具有一個(gè)或多個(gè)與CAMPATH-1H或親代非修飾抗體的治療效率有關(guān)的有益治療特征。這種修飾抗體可用于人類的許多重要疾病，具體包括白血病和淋巴瘤等惡性淋巴瘤，包括但不限于多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性血管炎、葡萄膜炎、炎性腸病和硬皮病等自身免疫病，也可用于移植。
因此，本發(fā)明的修飾抗體顯示能結(jié)合CD52，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與其靶抗原CD52的親和力在數(shù)量級(jí)上高于或低于單克隆抗體CAMPATH-1H所顯示的親和力。
據(jù)信，親代分子的治療效率也是由該抗體能夠誘導(dǎo)依賴于抗體的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性(ADCC)和依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)所介導(dǎo)的。ADCC和CDC現(xiàn)象是由完整抗體分子的重鏈恒定區(qū)所介導(dǎo)，本發(fā)明打算制造完整的抗體分子，其中包含與ADCC和CDC誘導(dǎo)相容的恒定區(qū)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述修飾的抗體包含人IgG1恒定區(qū)和人κ恒定區(qū)。
“抗體”指免疫球蛋白家族中的一種蛋白質(zhì)，它能夠與抗原組合、相互作用或者締合。術(shù)語(yǔ)“抗原”在本文中指一種能夠與抗體相互作用的物質(zhì)，在本發(fā)明中指CD52。
術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”在本文用來(lái)表示一種由一個(gè)或多個(gè)由免疫球蛋白基因編碼的多肽組成的蛋白質(zhì)。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、σ、ε和μ恒定區(qū)基因以及天然的多種免疫球蛋白可變區(qū)基因。免疫球蛋白的一種天然形式是含有兩對(duì)相同的四聚體，其中每一對(duì)具有一條輕鏈和一條重鏈。在每一對(duì)中，重鏈和輕鏈可變區(qū)一起提供能與抗原相互作用的結(jié)合表面。術(shù)語(yǔ)Vh本文用來(lái)表示重鏈可變區(qū)，術(shù)語(yǔ)Vk本文用來(lái)表示輕鏈可變區(qū)，此時(shí)和多數(shù)單克隆抗體一樣，輕鏈?zhǔn)恰唉省毙玩湣?br> 文中，Vh指長(zhǎng)度約為110-125個(gè)氨基酸殘基的多肽，其序列與這里的任何特定Vh鏈相一致，Vh與Vk組合而能結(jié)合CD52抗原。類似地，Vk指長(zhǎng)度約為95-130個(gè)氨基酸殘基的多肽，其序列與這里的任何特定Vk鏈相一致，Vk與Vh組合而能結(jié)合Cd52抗原。全長(zhǎng)免疫球蛋白重鏈的分子量約為50kDa，由N-末端Vh基因和C-末端一個(gè)恒定區(qū)基因(例如，γ)編碼。類似地，全長(zhǎng)輕鏈的分子量約為25kDa，由N-末端可變區(qū)基因和C-末端κ或λ恒定區(qū)基因編碼。
除了完整抗體(四聚體)，免疫球蛋白可以用重組DNA技術(shù)或蛋白質(zhì)生物化學(xué)技術(shù)衍生的多種其它形式存在。這些形式包括，例如，F(xiàn)v、Fab、Fab’和(Fab)2分子都含有本發(fā)明的任何一種Vh或Vk序列。進(jìn)一步的例子可包括“雙特異性”抗體，該抗體含有本發(fā)明的Vh/Vk組合與具有不同抗原特異性的第二種Vh/Vk組合的組合。
按本發(fā)明的理解，術(shù)語(yǔ)″潛在的T細(xì)胞表位″指具有結(jié)合MHC II類分子潛能的氨基酸序列。這種序列可刺激T細(xì)胞和/或結(jié)合(無(wú)需具有可測(cè)活性)含MHC II類分子復(fù)合物的T細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“肽”在文中和附加的權(quán)利要求中用來(lái)表示一種含有兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的化合物。氨基酸通過(guò)肽鍵(在下文定義)連接在一起。有20種不同的天然氨基酸參與肽的生物合成，它們中的任何一些可以任何順序連接在一起形成肽鏈或肽環(huán)。用于肽的生物合成的天然氨基酸都具有L-構(gòu)型?？刹捎贸Ｒ?guī)合成方法用L-氨基酸、D-氨基酸或兩種不同構(gòu)型氨基酸的不同組合來(lái)制備合成肽。一些肽僅含有少數(shù)氨基酸單元。短肽，例如氨基酸單元數(shù)小于10，有時(shí)稱為“寡肽”。其它的肽含有大量氨基酸殘基，例如多達(dá)100個(gè)或更多，它們稱為“多肽”。常規(guī)上，″多肽″可認(rèn)為是含有三個(gè)或更多氨基酸的任何肽鏈，而“寡肽”通常認(rèn)為是特定類型的“短”多肽。因此在本文中，當(dāng)提及“多肽”時(shí)應(yīng)理解為也包括寡肽。此外，當(dāng)提及“肽”時(shí)包括多肽、寡肽和蛋白質(zhì)。氨基酸的各種不同排列形成了不同的多肽或蛋白質(zhì)?？尚纬傻亩嚯臄?shù)目實(shí)際是無(wú)限的，因此不同蛋白質(zhì)的數(shù)目亦是如此。
本發(fā)明形成修飾的抗CD52抗體的通用方法包括以下步驟(a)測(cè)定該多肽或其一部分的氨基酸序列。
(b)用各種方法鑒定蛋白質(zhì)氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)潛在的T細(xì)胞表位，包括采用體外或計(jì)算機(jī)技術(shù)或者生物測(cè)定法確定該肽能夠與MHC分子結(jié)合。
(c)設(shè)計(jì)含有所鑒定的潛在T細(xì)胞表位中經(jīng)修飾的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的新序列變體，通過(guò)體外或計(jì)算機(jī)技術(shù)或生物測(cè)定法測(cè)定，這種修飾大大減少或消除了該肽與MHC分子的結(jié)合能力。可用這種方法產(chǎn)生此類序列變體以避免用序列變化形成新的潛在T細(xì)胞表位，除非此類新的潛在T細(xì)胞表位又經(jīng)這種方式修飾而大大減少或消除該肽與MHC II類分子的結(jié)合能力。
(d)通過(guò)重組DNA技術(shù)構(gòu)建這類序列變體并檢測(cè)所述變體以鑒定具有所需特性的一種或多種變體。
可按照本領(lǐng)域已述的方法來(lái)鑒定步驟(b)所述的潛在T細(xì)胞表位。合適的方法描述在WO98/59244；WO00/34317；美國(guó)申請(qǐng)20030153043，所有文獻(xiàn)納入本文作為參考。
實(shí)踐中可制造許多抗CD52變體抗體和檢測(cè)它們是否具有所需的免疫和功能特征。當(dāng)改變蛋白質(zhì)序列時(shí)特別重要的是要考慮這些變化是否會(huì)引入新的免疫原性表位。在實(shí)踐中可通過(guò)采用合適的方法再檢測(cè)所考慮的序列中是否存在表位和/或MHCII類配體。
在不同的實(shí)施方案中，可通過(guò)表達(dá)本文所述Vh和Vk基因的不同組合來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的修飾抗體。重鏈和輕鏈的所有這種組合都包括在本發(fā)明之內(nèi)。
本發(fā)明涉及一種抗CD52抗體，其中該分子可變區(qū)內(nèi)的諸位置上已經(jīng)有至少一個(gè)氨基酸殘基取代，而導(dǎo)致該蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)潛在的T細(xì)胞表位消除。最宜提供其中的氨基酸修飾(例如，取代)是在親代分子免疫原性最強(qiáng)的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行修飾的抗體分子。本發(fā)明的不同實(shí)施方案包括修飾的抗體分子，對(duì)該分子的任何MHC II類配體都已改變從而消除了該肽的結(jié)合或者減少該肽可結(jié)合的MHC同種異型數(shù)目。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)并在本文中公開了人CAMPATH抗體分子的免疫原性區(qū)域。應(yīng)理解，在某些情況下，除了本文所公開的序列區(qū)域，其它區(qū)域也可變?yōu)槊庖咴员砦?，例如?dāng)受到能表達(dá)具有與所述情況類似序列的蛋白質(zhì)或肽的病原體感染時(shí)。
MHC II類表位的去除包括氨基酸取代而產(chǎn)生潛在T細(xì)胞表位缺失的修飾變體。預(yù)計(jì)在該肽序列內(nèi)的合適位點(diǎn)上進(jìn)行氨基酸取代可大大減少或消除不需要的潛在T細(xì)胞表位活性。表1和2提供了關(guān)于這方面來(lái)特別有用的取代的例子，其中表1涉及Vh區(qū)取代而表2涉及Vk區(qū)取代。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，為除去不需要的表位可進(jìn)行多組可選的取代。然而，所產(chǎn)生的序列應(yīng)廣泛保留與本文所述特定組合物的同源性，因此仍在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。就其最小同源性區(qū)域而言，這些序列與特定序列的同源性約為70％，或約90％，或約95％，或約99％或更高，因此在操作上仍是等價(jià)的。這種序列也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
應(yīng)理解，某給定的潛在T細(xì)胞表位內(nèi)的單個(gè)氨基酸取代是最優(yōu)選的消除該表位的方法。可考慮在單個(gè)表位內(nèi)進(jìn)行取代組合，例如，當(dāng)各確定的表位相互重疊時(shí)這將特別適合。此外，就MHC II類結(jié)合槽而言，可在“口袋殘基”之外的位置上進(jìn)行某給定表位內(nèi)的單個(gè)氨基酸取代或單個(gè)表位內(nèi)氨基酸的組合取代，但在肽序列內(nèi)的任何位點(diǎn)上。所有這種取代都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
只要在本發(fā)明涉及的經(jīng)修飾的抗CD52抗體內(nèi)，含有這種修飾抗體或修飾抗體片段的組合物和相關(guān)組合物也應(yīng)認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明考慮可采用和生產(chǎn)例如抗體的Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2片段。這種片段可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法制備[例如Coligan等，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons 1991-1997，納入本文作為參考]。本發(fā)明還考慮從本領(lǐng)域熟知的抗體分子種類衍生的各種重組形式的抗體。所述種類包括穩(wěn)定的Fv片段，其中包括含有連接Vh和Vk區(qū)域的肽接頭的單鏈Fv形式(例如，scFv)，或通過(guò)鏈間二硫鍵而穩(wěn)定的Fv(dsFv)以及經(jīng)工程構(gòu)而含有額外半胱氨酸殘基有利于Vh和Vk區(qū)域結(jié)合的Fv片段。同樣，其它組合物也是本領(lǐng)域熟悉的可包括稱為“微體”的和單個(gè)單可變區(qū)“dAbs”的抗體。其它種類也包括能提高修飾的抗體可變區(qū)效價(jià)的方法，即具有多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體，例如通過(guò)構(gòu)建二聚結(jié)構(gòu)域(例如“亮氨酸拉鏈”)或者化學(xué)修飾方法。
在本發(fā)明的方案下提供了許多不同的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)序列。本發(fā)明公開的內(nèi)容對(duì)可用來(lái)構(gòu)建完全抗體分子的重鏈和輕鏈可能組合沒有任何限制?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域熟知的重組DNA技術(shù)以及純化和操作抗體分子的方法來(lái)構(gòu)建完全的抗體分子。以下文獻(xiàn)中闡述了必需的技術(shù)“Molecular CloningALaboratory Manual”，第二版，(Sambrook等，1989)；″Oligonucleotide Synthesis″(M.J.Gait編，1984)；″Animal CellCulture″(R.I.Freshney編，1987)；″Methods in Enzymology″(Academic Press，Inc.)；″Handbook of Experimental Immunology″(D.M.Weir & C.C.Blackwell編)；″GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells″(J.M.Miller & M.P.Calos編，1987)；″CurrentProtocols in Molecular Biology″(Ausubel等編，1987)；″PCRThe Polymerase ChainReaction，″(Mullis等編，1994)；″Current Protocols in Immunology″(Coligan等編，1991)。
可用幾種方法之一制備本發(fā)明的優(yōu)選分子，但最優(yōu)選用常規(guī)的重組方法來(lái)制備。較容易的方法是利用本文提供的蛋白質(zhì)序列和信息來(lái)推導(dǎo)編碼任何優(yōu)選抗體可變區(qū)的多核苷酸(DNA)序列。例如，這可用DNAstar成套軟件[DNAstar Inc，Madison，WI，USA]或類似的計(jì)算機(jī)軟件工具來(lái)完成。任何能編碼本發(fā)明優(yōu)選多肽或其重要同源物的DNA序列都應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的實(shí)施方案。
一種通用方法是通過(guò)基因合成制備Vh或Vk鏈基因之一將它們克隆入合適的表達(dá)載體中。然后將該表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞并選擇和培養(yǎng)細(xì)胞。不難從培養(yǎng)基中純化抗體分子并將其配制成適合治療給藥的制品。
一個(gè)非限制性的例子是，一種這樣的方法包括采用一組合成的寡核苷酸進(jìn)行基因合成。通過(guò)連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)裝配這些基因，其中，使具有互補(bǔ)末端的多核苷酸退火，然后用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增并補(bǔ)平。加入濃度升高的側(cè)翼寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR。將通過(guò)PCR從含有5’和3’免疫球蛋白基因側(cè)翼區(qū)域的載體產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物裝配成全長(zhǎng)抗體基因亞克隆入表達(dá)載體中表達(dá)完整的抗體。裝配的Vh和Vk基因可作為模板進(jìn)行誘變和構(gòu)建多個(gè)變體抗體序列，如本文所述的任何序列。采用Higuchi等描述的“重疊衍生PCR”法特別方便[1988，Nucleic Acids Res.167351]，雖然也可容易地使用其它方法和系統(tǒng)。
最方便的是用重疊PCR來(lái)裝配含有可變區(qū)盒的全長(zhǎng)免疫球蛋白基因，將其亞克隆入含有所需免疫球蛋白恒定區(qū)的表達(dá)載體中。例如可采用電穿孔技術(shù)將所述表達(dá)載體引入哺乳動(dòng)物或其它宿主細(xì)胞中。NS0細(xì)胞系是一種獲自動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物歐洲保藏所(European Collection of Animal Cell Cultures，ECACC)的不產(chǎn)生免疫球蛋白的小鼠骨髓瘤，是特別合適的宿主細(xì)胞系例子。增殖分泌抗體的細(xì)胞系，例如，可采用蛋白A親和層析方便地純化抗體[Harlow & Lane，同上]?？捎妹嘎?lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)感興趣抗體的人κ恒定區(qū)從而確定純化的抗體的濃度。
本發(fā)明的其它方面涉及用所述修飾抗體組合物治療病人的方法。為了個(gè)體給藥，應(yīng)制備純度宜至少為80％無(wú)熱原及其它雜質(zhì)的任何修飾的抗體組合物。還應(yīng)理解，所述修飾抗體蛋白的治療組合物可與藥學(xué)上可接受的賦形劑聯(lián)用。本發(fā)明的藥物組合物可用常規(guī)方法制備，包括藥物學(xué)上常用的物質(zhì)，例如，Remington′s PharmaceuticalSciences(Alfonso R.Gennaro編，第18版，1990)所述，包括賦形劑、載體、佐劑和緩沖劑。所述組合物可通過(guò)以下途徑給藥，例如腸胃外、腸內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)或可實(shí)現(xiàn)療效的其它途徑。例如，抗CD52抗體可靜脈內(nèi)給予(Cloes等，(1999)Ann.Neurol.，46296-304；Moreau等，(1996)Multiple Sclerosis，1357-65；Moreau等，(1994)Lancet，344298-301，所有文獻(xiàn)被納入本文作為參考)及皮下給予(Schnitzer等，(1997)J.Rheumatol.，241031-6；Bowen等，(1997)Br.J.Hematol.，96617-9，這兩份文獻(xiàn)被納入本文作為參考)。常規(guī)賦形劑包括藥學(xué)上可接受的適合腸胃外、腸內(nèi)和其它途徑給藥的不含與該制劑發(fā)生有害反應(yīng)的有機(jī)或無(wú)機(jī)載體。就腸胃外應(yīng)用而言，特別合適的是可注射的無(wú)菌溶液，優(yōu)選油性或水性溶液，以及懸浮液、乳液或植入物，包括栓劑。安瓿也是常用的單位劑量。所述藥物制品可以是無(wú)菌的，如果需要，可以和不會(huì)與該活性化合物發(fā)生有害反應(yīng)的穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩沖劑或其它物質(zhì)混合。
在本發(fā)明的方法中，本發(fā)明所用的抗CD52抗體的確切劑量取決于各種因素，包括待治療疾病的類型和嚴(yán)重程度以及所選擇的其它治療方法。關(guān)于劑量方案的指導(dǎo)可從本領(lǐng)域已知的CAMPATH-1H的劑量獲得。
示例性實(shí)施例實(shí)施例1-抗CD52抗體VH和VK基因的構(gòu)建從進(jìn)入數(shù)據(jù)庫(kù)衍生得到大鼠抗CD52抗體的重鏈可變區(qū)(VH)序列為RNIGHCC1G，輕鏈可變區(qū)(VK)序列為RNIGKCC1G。略微修飾這兩個(gè)序列除去內(nèi)部HindIII和BamHI位點(diǎn)但不改變氨基酸序列。通過(guò)基因合成制備VH和VK基因。簡(jiǎn)言之，設(shè)計(jì)并合成了一組合成的寡核苷酸。通過(guò)連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)裝配此二基因，其中，使具有互補(bǔ)末端的寡核苷酸退火，然后用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增并補(bǔ)平。加入濃度升高的側(cè)翼寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR。將通過(guò)PCR從含有5’和3’免疫球蛋白基因側(cè)翼區(qū)域的載體產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物裝配成全長(zhǎng)抗體基因，亞克隆入表達(dá)載體以表達(dá)完整抗體。裝配Vh和Vk基因可作為模板進(jìn)行誘變和構(gòu)建已除去潛在T細(xì)胞表位的多個(gè)變體抗體序列。
為裝配VH基因，使用了表3詳細(xì)列出的寡核苷酸VH1-VH20。為裝配VK基因，使用了表4詳細(xì)列出的寡核苷酸VK1-VK20。對(duì)于這兩種基因，將20μl磷酸化的寡核苷酸和1μl Pfu DNA連接酶(Stratagene，Amsterdam，NL)、10μl 10X反應(yīng)緩沖液(補(bǔ)充了酶)和69μl水混合進(jìn)行LCR。將反應(yīng)混合物置于熱循環(huán)儀中95℃培育2分鐘，然后進(jìn)行25輪循環(huán)，每輪95℃ 30秒，漸冷至50℃，50℃培育30秒，然后55℃ 20分鐘，最后55℃培育3小時(shí)。用1％瓊脂糖凝膠電泳分析LCR樣品得到的膠能看到正確大小的暗條帶。所有的寡核苷酸都購(gòu)自Sigma-Genosys(Pampisford，UK)并在體外用T4DNA激酶(Promega，Southampton，UK)按照供應(yīng)商推薦的方法磷酸化。LCR之后將5μL反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到PCR混合物中以擴(kuò)增該裝配的片段。用寡核苷酸VH1和VH20來(lái)驅(qū)動(dòng)VH反應(yīng)，用寡核苷酸VK1和VK20來(lái)驅(qū)動(dòng)VK反應(yīng)。PCR的總體積為50μl，用1μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，Amsterdam，NL)總共進(jìn)行30輪循環(huán)。用1％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR樣品得到380bp的VH條帶和377bp的VK條帶。
用重疊PCR裝配可變區(qū)盒。簡(jiǎn)言之，用衍生自載體M13-VHPCR1和M13-VKPCR1[Orlandi等，(1989)，PNAS，893833-7]的DNA作為模板來(lái)制造各VH和VK鏈的其它兩個(gè)重疊的PCR片段，該片段中含有編碼前導(dǎo)信號(hào)肽的5’側(cè)翼序列和包含剪切位點(diǎn)和內(nèi)含子序列的3’側(cè)翼序列。通過(guò)PCR，用獲得全長(zhǎng)DNA序列所需的側(cè)翼引物使如此制備的VH和VK的DNA片段相結(jié)合。用于這些“連接”反應(yīng)的引物對(duì)為，寡核苷酸VHVK5’CHO/VHVK3’SIG和VH19/VH12用于VH基因，寡核苷酸VHVK5’CHO/VHVK3’SIG和VK19/VK3’CHO用于VK基因。
用Qiagen(Crawley，UK)PCR PREP試劑盒純化后用HindIII和BamHI(Promega，Southampton，UK)切割PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上跑電泳。切取所需條帶并用Qiagen(Crawley，UK)DNA提取試劑盒純化。將產(chǎn)物克隆入用HindIII和BamHI切割的pUC19載體中并確認(rèn)DNA序列。
表3-合成VH基因的寡核苷酸
表4-合成VK基因的寡核苷酸
構(gòu)建了由連接于人IgG1[Takahshi等，(1982)Cell 29671]或κ[Heiter等，(1980)Cell 22197]恒定區(qū)的大鼠抗CD52可變區(qū)組成的嵌合性重鏈和輕鏈表達(dá)載體。然后將這些組合抗體基因轉(zhuǎn)移到表達(dá)載體中以制造重組抗體。所述抗體基因在人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子控制之下。所述重鏈載體包含dhfr基因而輕鏈載體包含neo基因可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)選擇。證實(shí)這種嵌合表達(dá)載體中VH和VK的DNA序列是正確的。
實(shí)施例2-修飾抗體VH和VK基因的構(gòu)建用實(shí)施例1中產(chǎn)生的大鼠抗CD52可變區(qū)盒作為模板通過(guò)PCR誘變構(gòu)建了修飾的VH和VK基因。表5列出了用于制造修飾的VH的寡核苷酸。以下突變用殘基的Kabat數(shù)和括號(hào)中的與分別鑒定的多肽酸序列有關(guān)的線性數(shù)表示。DIVHv1(多肽SEQ ID NO3；多核苷酸SEQ ID NO71)包括突變K3Q(3)、M18L(18)、I37V(37)、P40A(40)、A41P(41)、A44G(44)、P45L(45)、L48V(48)、T74S(77)、Q75K(78)、M77T(80)、T82bS(87)、T89V(95)、V107T(115)、M108L(116)，使用寡核苷酸VHVK5’CHO、DIVH1、DIVH2、DIVH3、DIVH4、DIVH5、DIVH6、DIVH7、DIVH8、DIVH9、DIVH10和VH12。DIVHv2(多肽SEQ ID NO4；多核苷酸SEQ ID NO72)包括突變K3Q(3)、M18L(18)、A41P(41)、L48I(48)、T74S(77)、Q75K(78)、M77T(80)、T82bS(87)、T89V(95)、V107T(115)、M108L(116)，使用寡核苷酸VHVK5’CHO、DIVH1、DIVH2、DIVH3、DIVH4、DIVH5A、DIVH6A、DIVH7、DIVH8、DIVH9、DIVH10和VH12。DIVHv3(多肽SEQ ID NO5；多核苷酸SEQ ID NO73)包括突變L5Q(5)、L20I(20)、A23S(23)、A41P(41)、A44G(44)、L48I(48)、M77T(80)、Y79H(82)、M82A(85)、T89V(95)、V107T(115)、M108T(106)，使用寡核苷酸VHVK5’CHO、DIVH11、DIVH12、DIVH13、DIVH14、DIVH15、DIVH16、DIVH17、DIVH18、DIVH19、DIVH20和VH12。DIVHv4(多肽SEQ ID NO6；多核苷酸SEQ ID NO74)包括突變K3Q(3)、M18L(18)、I37V(37)、P40A(40)、A41P(41)、A44G(44)、P45L(45)、L48V(48)、T74A(77)、Q75K(78)、M77S(80)、T82bS(87)、T89V(95)、V107T(115)、M108L(116)，使用寡核苷酸VHVK5’CHO、DIVH1、DIVH2、DIVH3、DIVH4、DIVH5、DIVH6、DIVH7、DIVH8、DIVH9、DIVH10、DIVH21、DIVH22和VH12。DIVHv5(多肽SEQ ID NO7；多核苷酸SEQ ID NO75)包括突變K3Q(3)、M18L(18)、A41P(41)、T74S(77)、Q75K(78)、M77T(80)、T82bS(87)、T89V(95)、V107T(115)、M108L(116)，使用寡核苷酸VHVK5’CHO、DIVH1、DIVH2、DIVH3、DIVH4、DIVH23、DIVH6A、DIVH7、DIVH8、DIVH9、DIVH10和VH12。
表5-用于構(gòu)建修飾的抗CD52VH的寡核苷酸
表6列出了用于制造修飾的VK的寡核苷酸。以下突變用殘基的Kabat數(shù)表示，與分別鑒定的多肽序列的線性數(shù)相同。DIVKv1(多肽SEQ ID NO8；多核苷酸SEQ IDNO76)包括突變K3Q、F10S、L21I、N22T、K24R、L40P、E42K、S43A、L46S、T56S、I58V、V83I、F87Y，使用寡核苷酸VHVK5’CHO、DIVK1、DIVK2、DIVK3A、DIVK4A、DIVK5B、DIVK6、DIVK7、DIVK8A、DIVK9、DIVK10和VK3’CHO。DIVKv2(多肽SEQ ID NO9；多核苷酸SEQ ID NO77)包括突變K3Q、F10S、L21I、N22T、L40P、E42K、S43A、I58V、V83I、F87Y，使用寡核苷酸VHVK5’CHO、DIVK1、DIVK2、DIVK3、DIVK4、DIVK5、DIVK6、DIVK7、DIVK8、DIVK9、DIVK10和VK3’CHO。DIVKv3(多肽SEQ ID NO10；多核苷酸SEQ ID NO78)包括突變K3Q、F10S、L21I、N22T、K24R、L40P、E42K、S43A、T56S、I58V、V83I、F87Y，使用寡核苷酸VHVK5’CHO、DIVK1、DIVK2、DIVK3A、DIVK4A、DIVK5、DIVK6、DIVK7、DIVK8A、DIVK9、DIVK10和VK3’CHO。DIVKv4(多肽SEQ ID NO11；多核苷酸SEQ ID NO79)包括突變K3Q、F10S、L21I、N22T、L40P、E42K、S43A、L46S、I58V、V83I、F87Y，使用寡核苷酸VHVK5’CHO、DIVK1、DIVK2、DIVK3、DIVK4、DIVK5B、DIVK6、DIVK7、DIVK8、DIVK9、DIVK 10和VK3’CHO。DIVKv5(多肽SEQ ID NO12；多核苷酸SEQ ID NO80)包括突變K3Q、F10S、L21I、N22T、L40P、E42K、I58V、V83I、F87Y，使用寡核苷酸VHVK5’CHO、DIVK1、DIVK2、DIVK3、DIVK4、DIVK5A、DIVK6A、DIVK7、DIVK8、DIVK9、DIVK 10和VK3’CHO。
表6-用于構(gòu)建修飾的抗CD52VK的寡核苷酸
將制得的修飾的VH和VK表達(dá)盒作為從HindIII到BamHI的片段(分別將DIVHYv1-DIVHv5的DNA和氨基酸序列示于圖3-圖7，DIVKv1-DIVKv5的DNA和氨基酸序列示于圖8-圖12)克隆入質(zhì)粒載體pUC19中，證實(shí)每個(gè)修飾的VH和VK的完整DNA序列是正確的。
將修飾的VH和VK表達(dá)盒分別連接于人IgG1(SEQ ID NO139；圖13)[Takahashi等，(1982)Cell 29671]和κ(SEQ ID NO140；圖14)[Heiter等，(1980)Cell 22197]的恒定區(qū)。然后將這些組合抗體基因轉(zhuǎn)移到表達(dá)載體中以制造重組抗體。所述抗體基因在人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子控制之下。所述重鏈載體包含dhfr基因而輕鏈載體包含neo基因可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)選擇。證實(shí)該表達(dá)載體中VH和VK的DNA序列是正確的。
實(shí)施例3-抗CD52抗體的表達(dá)、純化和定量用于抗體表達(dá)的宿主細(xì)胞系獲自英國(guó)Porton的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物歐洲保藏所的CHO dhFr-(ECACC No 94060607)。通過(guò)電穿孔將重鏈和輕鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞中。在不含核苷但添加有10％經(jīng)滲析的胎牛血清和400μg/ml遺傳霉素(G-418硫酸鹽)(都購(gòu)自Gibco，Paisley，UK)的Iscove改進(jìn)的Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM)中培養(yǎng)選擇表達(dá)neo和dhfr基因的菌落。用ELISA篩選轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆以制造人IgG的人抗體[Tempest等，(1991)BioTechnology 9266]。擴(kuò)增分泌抗體的細(xì)胞系，選擇最高生產(chǎn)細(xì)胞凍存在液氮中。所述抗CD52抗體用Prosep-A(Bioprocessing Ltd)按照制造商的說(shuō)明純化。用ELISA測(cè)定人IgG1κ抗體的濃度。
測(cè)定在96孔板上進(jìn)行，所有測(cè)定一式兩份。對(duì)于ELISA測(cè)定，平板(DynatechImmulon 2)用每孔100μl碳酸鹽/碳酸氫鹽包被緩沖液pH9.6(Sigma，Poole，UK)1250稀釋的羊抗人κ抗體(The Binding Site，Birmingham，UK)包被。37℃包被1小時(shí)，各孔用PBST(含有0.05％ Tween 20的PBS)洗滌三次。在每個(gè)孔中加入100μL PBST并設(shè)置對(duì)照和測(cè)試抗體的稀釋液。陰性對(duì)照僅用PBST不加抗體。標(biāo)準(zhǔn)抗體(人IgG1/κ純化的骨髓瘤蛋白，The Binding Site，UK)用PBST稀釋成2μg/ml。在第一列的復(fù)孔中加入100μL(最終濃度為1μg/ml)并在平板上作二倍稀釋。測(cè)試抗體制品也進(jìn)行二倍系列稀釋。將平板室溫培育1小時(shí)并如上洗滌各孔。用與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗人IgGγ鏈特異性試劑(The Binding Site，Birmingham，UK)檢測(cè)結(jié)合的抗體。第二抗體用PBST作1∶1000稀釋平板各孔中加入100μl。將平板室溫再培育1小時(shí)并如上洗滌。用鄰苯二胺(OPD)底物進(jìn)行檢測(cè)。將1片(20mg)OPD(Sigma，Poole，UK)溶于45ml過(guò)氧化物酶緩沖液(Sigma，Poole，UK)中，臨用前加入10μL 30％(w/w)過(guò)氧化氫(Sigma，Poole，UK)。各孔中加入100μL底物液室溫培育5分鐘或需要的時(shí)間。加入25μL 12.5％ H2SO4終止顯色并在492nm檢測(cè)結(jié)果。將抗體濃度與A492繪圖，與標(biāo)準(zhǔn)抗體曲線比較確定樣品抗體的濃度。
實(shí)施例4-用結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)修飾的抗CD52抗體人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系HUT-78是CD52陽(yáng)性用于評(píng)價(jià)本發(fā)明修飾抗體的結(jié)合性能。在該實(shí)施例中，將不同濃度的測(cè)試抗體與細(xì)胞一起培育并在培育后用熒光標(biāo)記的報(bào)告分子試劑評(píng)價(jià)結(jié)合抗體的量。報(bào)告分子用熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)測(cè)定。
簡(jiǎn)言之，在試驗(yàn)中，將106個(gè)HUT-78細(xì)胞與測(cè)試抗體和人源化抗體(CAMPATH-1H)以及作為對(duì)照的嵌合性抗CD52抗體的系列稀釋液一起培育。用ng/ml表示的抗體濃度為40000、20000、10000、5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、39.06、19.53和0。所有的培育在96孔板上進(jìn)行，最終體積為100μl PBS/2％ FBS。
將抗體和細(xì)胞的混合物在冰上黑暗中培育1小時(shí)，用200μl冰冷的PBS/2％ FBS洗滌兩次。
檢測(cè)時(shí)，將細(xì)胞與FITC-標(biāo)記的抗人IgG Fc結(jié)構(gòu)域的1∶1000稀釋液冰上培育1小時(shí)。試劑為購(gòu)自Sigma(Poole，UK)的羊抗人IgG(Fc特異性)。細(xì)胞按上文所述洗滌，重懸于100μl PBS/2％ FBS中，然后轉(zhuǎn)移到含有900μl PBS/2％ FBS/碘化丙錠(1∶1000)的4ml FACS試管(Becton Dickinson)。用常規(guī)Becton Dickenson FACS Calibur裝置分析細(xì)胞。
用熒光中值確定測(cè)試抗體和對(duì)照抗體的結(jié)合性能。從熒光中值-0抗體熒光中值和抗體濃度繪出的圖確定抗體的飽和濃度。用SigmaPlot將結(jié)合曲線與4參數(shù)S曲線邏輯方程擬合，得到置信水平為95％的極佳擬合。效價(jià)，即產(chǎn)生50％最大結(jié)合的濃度，見圖7。結(jié)果表明，本發(fā)明的許多抗體與嵌合性CAMPATH-1G抗體和人源化CAMPATH-1H抗體的性能結(jié)合幾乎相等。
表7
實(shí)施例5-用競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)測(cè)試修飾的抗CD52抗體用本發(fā)明的修飾抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)。在這些試驗(yàn)中評(píng)價(jià)了測(cè)試抗體與人源化CAMPATH-1H試劑競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD52的能力。在該實(shí)施例中，將HUT-78細(xì)胞與亞飽和量的生物素化CAMPATH-1H和不同濃度的未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)試抗體共同培育。與細(xì)胞結(jié)合的生物素化參考抗體的量在與抗生物素蛋白-FITC報(bào)告分子進(jìn)一步培育后測(cè)定，熒光按實(shí)施例4所述用FACS裝置測(cè)定。
簡(jiǎn)言之，在競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)中，將106個(gè)HUT-78細(xì)胞與2μg生物素化人CAMPATH-1H一起培育。已用生物素化CAMPATH-1H和未標(biāo)記的CAMPATH-1H進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)以確定隨后在各試驗(yàn)中需要加入的生物素化的抗體的最佳量。
將測(cè)試抗體和對(duì)照抗體在96孔板中作系列稀釋，終體積為100μl PBS/2％ FBS。設(shè)置測(cè)試抗體的濃度為0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100、500和1000μg/106細(xì)胞。
將細(xì)胞和抗體混合物在冰上黑暗中培育1小時(shí)，用200μl冰冷的PBS/2％ FBS洗滌兩次。通過(guò)與1∶200稀釋的抗生物素蛋白-FITC試劑(Sigma，Poole，UK)一起培育檢測(cè)結(jié)合的生物素化抗體。冰上培育1小時(shí)后按上文所述洗滌2輪。將細(xì)胞重懸于100μl PBS/2％ FBS中轉(zhuǎn)移到含有900μl PBS/2％ FBS/碘化丙錠(1∶1000稀釋)的4ml試管中。用常規(guī)的Becton Dickenson FACS Calibur裝置分析細(xì)胞。
測(cè)試和對(duì)照抗體的結(jié)合性能表示為與生物素標(biāo)記的對(duì)照抗體最大結(jié)合的抑制百分比。
抑制百分值可用下式確定
用SigmaPlot將結(jié)合曲線與4參數(shù)S曲線邏輯方程擬合，得到置信水平為95％的極佳擬合。計(jì)算出的EC50值見表8。結(jié)果表明，本發(fā)明的抗體與HUT-78細(xì)胞上CD52的結(jié)合與嵌合性CAMPATH-1G抗體和人源化CAMPATH-1H抗體等效。
表8
實(shí)施例6-T細(xì)胞免疫原性分析從培養(yǎng)在添加有L-谷氨酰胺和抗生素-抗真菌素(Gibco/Invitrogen Cat No15240-062)的無(wú)CHO蛋白無(wú)動(dòng)物組分的培養(yǎng)基(Sigma Cat NoG7513)中的CHO CAMPATH-1G DIVH2/DIVK5細(xì)胞系制備修飾的抗體CAMPATH-1G DIVHv2/DIVKv5。通過(guò)PROSEP-A層析(Millipore)純化抗體，用0.1M甘氨酸pH3.0洗脫，中和并用磷酸緩沖鹽水(PBS)透析，最后過(guò)濾除菌。
用陽(yáng)離子交換層析和尺寸排阻層析2階段純化DIVH2/DIVK5修飾的抗體和人源化CAMPATH對(duì)照抗體。當(dāng)為Sephadex G25(PD10柱)上的緩沖液交換50mM MES pH6后，使蛋白質(zhì)通過(guò)陽(yáng)離子交換柱(Mono-S 10/10)用氯化鈉梯度(0-0.5M)洗脫。然后將洗脫的含蛋白質(zhì)組分加到Superdex 200制備柱(XK16/60)上，用PBS洗脫。合并峰組分4℃保存。用ELISA測(cè)定人IgG的抗體濃度。
實(shí)驗(yàn)推測(cè)抗CD52 CAMPATH抗體本身將抑制T細(xì)胞，將干擾標(biāo)準(zhǔn)T細(xì)胞測(cè)定中對(duì)免疫原性的分析。進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)來(lái)測(cè)試CAMPATH抗CD52抗體對(duì)T細(xì)胞的作用。制備3個(gè)健康正常供體的血PBMC。將它們與人源化CAMPATH-1H(由Ilex提供)單獨(dú)培育，與匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)單獨(dú)培育，與KLH和CAMPATH-1H抗體一起培育并設(shè)置了未處理對(duì)照。結(jié)果顯示，由于該抗體對(duì)T細(xì)胞的作用，所有3個(gè)供體都競(jìng)爭(zhēng)性抑制了對(duì)對(duì)照抗原KLH的應(yīng)答反應(yīng)。
為分析完整抗CD52抗體的免疫原性，使用了更加復(fù)雜的T細(xì)胞測(cè)定法，該實(shí)驗(yàn)中，洗滌除去加載有完整抗CD52抗體和外源(未處理的)抗原的樹突細(xì)胞(DC)，然后加入自體T細(xì)胞。用這種方法可避免抗CD52抗體的抑制作用和獲得對(duì)KLH的正常應(yīng)答反應(yīng)。該方法總共采用了10個(gè)健康供體，用人源化CAMPATH-1H作為測(cè)試對(duì)照抗原。
簡(jiǎn)言之，將PBMC用作單核細(xì)胞來(lái)源，通過(guò)附著于組織培養(yǎng)塑料板(＞90％ CD14+)上分離單核細(xì)胞。在含有3％熱滅活的人AB血清(Autogen Bioclear)(生長(zhǎng)培養(yǎng)基)的AIM V培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)單核細(xì)胞至密度約為每孔1×106個(gè)細(xì)胞(24孔板)。為誘導(dǎo)APC樣表型(CD40+、CD80hi、CD83hi、CD86hi、MHC II類hi)，在含有人IL-4(Peprotech)和GM-CSF(Peprotech)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)單核細(xì)胞4天。在第4天加入50μg/ml的測(cè)試抗原(人源化CAMPATH-1H或修飾的CAMPATH-1G DIVHv2/DIVKv5抗體)。對(duì)照孔僅加入培養(yǎng)基。24小時(shí)后除去生長(zhǎng)培養(yǎng)基和抗原洗滌細(xì)胞一次，然后加入新鮮的含有TNFα(Peprotech)、GM-CSF和IL-4的生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)4天。收獲并計(jì)數(shù)粘附和不粘附的樹突細(xì)胞(DC)。以1×104/孔的密度將DC分布到96孔圓底板的每個(gè)孔中，每個(gè)供體的每種處理一式六份(人源化CAMPATH-1H或修飾的CAMPATH-1GDIVHv2/DIVKv5抗體或?qū)φ?。用4000rads的γ射線照射DC，然后以1×105/孔的密度加入從PBMC陰性分離的(Dynal Human CD4+Negative Isolation Kit)自體CD4+T細(xì)胞。將平板培育7天通過(guò)氚化胸腺嘧啶的摻入測(cè)定細(xì)胞增殖(用3H-胸腺嘧啶以1μCi/孔脈沖6小時(shí))。
這些數(shù)據(jù)表示為刺激指數(shù)，如下 陽(yáng)性結(jié)果定義為刺激指數(shù)(SI)大于2。預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果(圖15)顯示，10個(gè)供體中有2個(gè)對(duì)CAMPATH-1H有應(yīng)答反應(yīng)，其中一個(gè)有非常高的刺激指數(shù)。
CAMPATH-1H和修飾的DIVHv5/DIVKv2抗體的比較根據(jù)HLA-DR類型選擇一組20個(gè)健康供體(見表9)在T細(xì)胞測(cè)定中篩選人源化抗體和修飾抗體。這樣能夠篩選出抗80％以上在全世界人群中表達(dá)的DR等位基因的抗體。
表9-用來(lái)檢測(cè)人源化CAMPATH抗體和修飾的CAMPATH抗體免疫原性的一組20個(gè)健康供體的HLADR單元型
圖16顯示，人源化CAMPATH 1H在三個(gè)健康個(gè)體(供體14、17和19)中誘導(dǎo)了顯著的(p＜0.05)增殖性應(yīng)答(與未處理對(duì)照相比的cpm)。然而，只有供體14和17的T細(xì)胞產(chǎn)生了分別為4.2和2.5的明顯較高(SI＞2)的刺激指數(shù)。供體19的應(yīng)答反應(yīng)被排除，因?yàn)槠浯碳ぶ笖?shù)低于該實(shí)驗(yàn)設(shè)定的域值(SI約1.5)。對(duì)于供體8，未處理對(duì)照產(chǎn)生了低于400cpm的結(jié)果因此被排除。重要的是，沒有供體對(duì)修飾的DIVHv5/DIVKv2抗體有應(yīng)答反應(yīng)。
因此，人源化CAMPATH 1H抗體在一些具有某種MHC II類同種異型的病人中具有誘導(dǎo)依賴于T細(xì)胞的體液免疫應(yīng)答的潛能(表現(xiàn)為親和力成熟的、同種型轉(zhuǎn)換的抗CAMPATH 1H抗體)。該觀察結(jié)果得到離體T細(xì)胞測(cè)定的支持，該測(cè)定中，至少有2個(gè)健康個(gè)體(供體14和17)在對(duì)用抗原加工的CAMPATH 1H處理的應(yīng)答中發(fā)生了T細(xì)胞活化(表現(xiàn)為成熟的DC)。與用抗原加工修飾的DIVHv5/DIVKv2抗體的離體T細(xì)胞應(yīng)答相比，顯示其在任何測(cè)試的供體中都完全不誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖。這些數(shù)據(jù)證明，當(dāng)人源化CAMPATH-1H被代替時(shí)，特別是當(dāng)用于需要重復(fù)劑量的適應(yīng)證時(shí)，這種修飾抗體可能提供了一種改進(jìn)的治療分子。
序列表<110>F.J.卡爾(Carr，F(xiàn)rancis J.)A.A.漢米爾頓(Hamilton，Anita A.)<120>修飾的抗CD52抗體<130>ILEX095WO<140>PCT/IB2004/003879<141>2004-10-29<150>60/516,210<151>2003-11-01<160>231<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>121<212>PRT<213>大鼠(Rattus norvegicus)<400>1Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe20 25 30Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu35 40 45Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Gln Asn Met65 70 75 80Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr85 90 95Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser115 120<210>2<211>107<212>PRT<213>大鼠(Rattus norvegicus)<400>2Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asp Lys Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ser Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45
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<223>突變重組體<400>4Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 510 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe20 25 30Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Ile35 40 45
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<223>突變重組體<400>5Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Met Arg Ile Ser Cys Ser Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe20 25 30Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile35 40 45Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Gln Asn Thr65 70 75 80Leu His Leu Gln Ala Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr85 90 95Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>6<211>121<212>PRT<213>人工的<220>
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1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe20 25 30Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser65 70 75 80Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr85 90 95Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>21<211>121<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>MR
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<220>
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<223>合成的<400>220attctgactt gctctgcagg tgatagtgac tctgt 35<210>221<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成的
<400>221cccggaaaag ctcccaaact cctgatatat aatac 35<210>222<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成的<400>222cccggaaaat ctcccaaact cctgatatat aatac 35<210>223<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成的<400>223cccggaaaag ctcccaaatc cctgatatat aatac 35<210>224<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成的<400>224tttgggagct tttccgggct tttgctgata cc 32<210>225<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成的<400>225tttgggagat tttccgggct tttgctgata cc 32<210>226<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成的<400>226cgtcccatca aggttcagtg gcagtgg27<210>227<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
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<400>227gccactgaac cttgatggga cgcccgtttg c 31<210>228<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成的<400>228cactgaacct tgatgggacg ccagattgca aattg 35<210>229<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成的<400>229gcctgaagat attgccacat attactgctt gcagc 35<210>230<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成的<400>230tgcaagcagt aatatgtggc aatatcttca ggctg 35<210>231<211>36<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成的<400>231gcgatagctg gactgaatgg atccagtcga cgaagc 3權(quán)利要求
1.一種抗CD52抗體，該抗體重鏈的重鏈可變區(qū)包含具有一個(gè)或多個(gè)下述取代的SEQ ID NO1的取代變體，其中，氨基酸殘基編號(hào)即是它們?cè)赟EQ ID NO1中的編號(hào)用Gln取代氨基酸殘基3上的Lys；用Ala、Cys、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸殘基5上的Leu；用Asn、Asp、Glu、His、Lys、Pro、Gln、Arg、Ser或Thr取代氨基酸殘基12上的Val；用Ala、Phe、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr取代氨基酸殘基13上的Gln；用Asp、His、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr取代氨基酸殘基15上的Gly；用Gly、Met、Pro或Trp取代氨基酸殘基17上的Ser；用Arg、Gly、Pro、Leu取代氨基酸殘基18上的Met；用Ala、Cys、Phe、Gly、Ile、Leu、Met、Pro、Val、Trp或Tyr取代氨基酸殘基19上的Arg；用Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Asn、Asp、Met、Gln、Glu、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代氨基酸殘基20上的Leu；用Pro取代氨基酸殘基21上的Ser；用Asp、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser、Thr取代氨基酸殘基23上的Ala；用Phe、Gly、Leu、Pro、Trp或Tyr取代氨基酸殘基25上的Ser；用Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Pro、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr取代氨基酸殘基26上的Gly；用Ala、Phe、Gly、Ile、Met、Pro、Val、Trp或Tyr取代氨基酸殘基31上的Asp；用Ala、Gly、Met或Pro取代氨基酸殘基33上的Tyr；用Pro取代氨基酸殘基35上的Asn；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser或The取代氨基酸殘基36上的Trp；用Val取代氨基酸殘基37上的Ile；用Phe、His、Pro或Tyr取代氨基酸殘基38上的Arg；用Ala取代氨基酸殘基40上的Pro；用Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Pro、Arg、Ser、The或Trp取代氨基酸殘基41上的Ala；用Ile、Pro、Thr、Tyr取代氨基酸殘基42上的Gly；用Gly、His、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Trp、Tyr取代氨基酸殘基44上的Ala；用Leu取代氨基酸殘基45上的Pro；用Ile或Val取代氨基酸殘基48上的Leu；用Phe、Leu、Pro、Trp或Tyr取代氨基酸殘基71上的Thr；用Asp、Glu、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser或Thr取代氨基酸殘基72上的Ile；用Ala、Gly或Pro取代氨基酸殘基73上的Ser；用Ala、Phe、Gly、Ile、Met、Pro、Trp或Tyr取代氨基酸殘基74上的Arg；用Ala、Gly、Met、Pro、Trp或Tyr取代氨基酸殘基76上的Asn；用Ala、His、Ile、Pro或Ser取代氨基酸殘基77上的Thr；用Lys取代氨基酸殘基78上的Gln；用Ala、Phe、Gly、Ile、Met、Pro、Val、Trp或Tyr取代氨基酸殘基79上的Asn；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr或Ser取代氨基酸殘基80上的Met；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser或Thr取代氨基酸殘基82上的Tyr；用Ala、Phe、Gly、Ile、Leu、Met、Pro、Val、Trp或Tyr取代氨基酸殘基84上的Gln；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser或Thr取代氨基酸殘基85上的Met；用Ser取代氨基酸殘基87上的Thr；用Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr取代氨基酸殘基88上的Leu；用Phe、Pro、Trp、Tyr取代氨基酸殘基89上的Arg；用Asn、Asp、Glu、Gln、His、Lys、Pro、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr取代氨基酸殘基90上的Ala；用Pro取代氨基酸殘基91上的Glu；用Ala、Phe、Gly、Ile、Leu、Met、Pro、Val、Trp、Tyr取代氨基酸殘基92上的Asp；用Val取代氨基酸殘基95上的Thr；用Ala、Phe、Gly、Ile、Leu、Met、Pro、Val、Trp或Tyr取代氨基酸殘基109上的Asp；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser或Thr取代氨基酸殘基111上的Trp；用His、Pro、Ser或Thr取代氨基酸殘基114上的Gly；用Thr取代氨基酸殘基115上的Val；用Thr、Phe、Ile、Leu、Pro、Val、Trp或Tyr取代氨基酸殘基116上的Met；用Ala、Phe、Gly、Ile、Met、Pro、Trp或Tyr取代氨基酸殘基117上的Val；該抗體輕鏈的輕鏈可變區(qū)包含具有一個(gè)或多個(gè)下述取代的SEQ ID NO2的取代變體，其中，氨基酸殘基編號(hào)即是它們?cè)赟EQ ID NO2中的編號(hào)用Gln取代氨基酸殘基3上的Lys；用Ala、Asp、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸殘基10上的Phe；用Ala、Gly、His或Pro取代氨基酸殘基15上的Val；用Pro取代氨基酸殘基17上的Asp；用Pro或Trp取代氨基酸殘基19上的Val；用Pro或Ile取代氨基酸殘基21上的Leu；用Thr取代氨基酸殘基22上的Asn；用Arg取代氨基酸殘基24上的Lys；用Ala、Asp、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸殘基33上的Leu；用Asp、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸殘基40上的Leu；用Lys取代氨基酸殘基42上的Glu；用Ala取代氨基酸殘基43上的Ser；用Ser取代氨基酸殘基46上的Leu；用Ala、Phe、Gly、Ile、Met、Pro、Ser、Trp或Tyr取代氨基酸殘基56上的Thr；用Ala、Gly、Met、Pro或Val取代氨基酸殘基58上的Ile；用Ala、Phe、Gly、Ile、Met、Pro、Trp或Tyr取代氨基酸殘基60上的Ser；用Pro取代氨基酸殘基上的Arg；用Phe、Leu、Pro、Trp或Tyr取代氨基酸殘基63上的Ser；用Asp、Asn、Gln、Glu、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸殘基64上的Gly；用Asp、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser、Thr取代氨基酸殘基78上的Leu；用Ala、Asp、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Pro、Arg、Ser、Thr取代氨基酸殘基83上的Val；用Tyr取代氨基酸殘基87上的Phe。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體，其重鏈可變區(qū)包含具有一個(gè)或多個(gè)下述取代的SEQID NO1的取代變體，其中，氨基酸殘基編號(hào)即是它們?cè)赟EQ ID NO1中的編號(hào)用Gln取代氨基酸殘基3上的Lys；用Ala、Cys、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸殘基5上的Leu；用Arg、Gly、Pro、Leu取代氨基酸殘基18上的Met；用Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Asn、Asp、Met、Gln、Glu、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代氨基酸殘基20上的Leu；用Asp、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser、Thr取代氨基酸殘基23上的Ala；用Val取代氨基酸殘基37上的Ile；用Ala取代氨基酸殘基40上的Pro；用Pro取代氨基酸殘基41上的Ala；用Gly、His、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Trp、Tyr取代氨基酸殘基44上的Ala；用Leu取代氨基酸殘基45上的Pro；用Ile或Val取代氨基酸殘基48上的Leu；用Ala、His、Ile、Pro或Ser取代氨基酸殘基77上的Thr；用Lys取代氨基酸殘基78上的Gln；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr或Ser取代氨基酸殘基80上的Met；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser或Thr取代氨基酸殘基82上的Tyr；用Ala、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser或Thr取代氨基酸殘基85上的Met；用Ser取代氨基酸殘基87上的Thr；用Val取代氨基酸殘基95上的Thr；用Thr取代氨基酸殘基115上的Val；用Thr、Phe、Ile、Leu、Pro、Val、Trp或Tyr取代氨基酸殘基116上的Met；且其輕鏈可變區(qū)包含具有一個(gè)或多個(gè)下述取代的SEQ ID NO2的取代變體，其中，氨基酸殘基編號(hào)即是它們?cè)赟EQ ID NO2中的編號(hào)用Gln取代氨基酸殘基3上的Lys；用Ala、Asp、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸殘基1O上的Phe；用Pro或Ile取代氨基酸殘基21上的Leu；用Thr取代氨基酸殘基22上的Asn；用Arg取代氨基酸殘基24上的Lys；用Asp、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Pro、Arg、Ser或Thr取代氨基酸殘基40上的Leu；用Lys取代氨基酸殘基42上的Glu；用Ala取代氨基酸殘基43上的Ser；用Ser取代氨基酸殘基46上的Leu；用Ala、Phe、Gly、Ile、Met、Pro、Ser、Trp或Tyr取代氨基酸殘基56上的Thr；用Ala、Gly、Met、Pro或Val取代氨基酸殘基58上的Ile；用Ala、Asp、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Pro、Arg、Ser、Thr取代氨基酸殘基83上的Val；用Tyr取代氨基酸殘基87上的Phe。
3.如權(quán)利要求1所述的抗體，其重鏈可變區(qū)包含具有一個(gè)或多個(gè)下述取代的SEQID NO1的取代變體，其中，氨基酸殘基編號(hào)即是它們?cè)赟EQ ID NO1中的編號(hào)用Gln取代氨基酸殘基3上的Lys；用Gln取代氨基酸殘基5上的Leu；用Leu取代氨基酸殘基18上的Met；用Ile取代氨基酸殘基20上的Leu用Ser取代氨基酸殘基23上的Ala；用Val取代氨基酸殘基37上的Ile；用Ala取代氨基酸殘基40上的Pro；用Pro取代氨基酸殘基41上的Ala；用Gly取代氨基酸殘基44上的Ala；用Leu取代氨基酸殘基45上的Pro；用Ile或Val取代氨基酸殘基48上的Leu；用Ala或Ser取代氨基酸殘基77上的Thr；用Lys取代氨基酸殘基78上的Gln；用Thr或Ser取代氨基酸殘基80上的Met；用His取代氨基酸殘基82上的Tyr；用Ala取代氨基酸殘基85上的Met；用Ser取代氨基酸殘基87上的Thr；用Val取代氨基酸殘基95上的Thr；用Thr取代氨基酸殘基115上的Val；用Leu取代氨基酸殘基116上的Met；且其輕鏈可變區(qū)包含具有一個(gè)或多個(gè)下述取代的SEQ ID NO2的取代變體，其中，氨基酸殘基編號(hào)即是它們?cè)赟EQ ID NO2中的編號(hào)用Gln取代氨基酸殘基3上的Lys；用Ser取代氨基酸殘基10上的Phe；用Ile取代氨基酸殘基21上的Leu；用Thr取代氨基酸殘基22上的Asn；用Arg取代氨基酸殘基24上的Lys；用Pro取代氨基酸殘基40上的Leu；用Lys取代氨基酸殘基42上的Glu；用Ala取代氨基酸殘基43上的Ser；用Ser取代氨基酸殘基46上的Leu；用Ser取代氨基酸殘基56上的Thr；用Val取代氨基酸殘基58上的Ile；用Ile取代氨基酸殘基83上的Val；用Tyr取代氨基酸殘基87上的Phe。
4.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，在所述重鏈和所述輕鏈中至少有7個(gè)氨基酸殘基被取代。
5.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，在所述重鏈和所述輕鏈中有7-14個(gè)氨基酸殘基被取代。
6.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述重鏈還包含人IgG1恒定區(qū)。
7.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述輕鏈還包含人κ恒定區(qū)。
8.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述重鏈包含選自以下的氨基酸序列SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7、所述輕鏈包含選自以下的氨基酸序列SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11和SEQ ID NO12。
9.如權(quán)利要求8所述的抗體，其特征在于，所述重鏈含SEQ ID NO4而所述輕鏈含SEQ ID NO12，或其中所述重鏈含SEQ ID NO7而所述輕鏈含SEQ ID NO12，或所述重鏈含SEQ ID NO7而所述輕鏈含SEQ ID NO10，或所述重鏈含SEQ ID NO3而所述輕鏈含SEQ ID NO10，或所述重鏈含SEQ ID NO6而所述輕鏈含SEQ IDNO10。
10.如權(quán)利要求9所述的抗體，其特征在于，所述重鏈含SEQ ID NO4而所述輕鏈含SEQ ID NO12。
11.如權(quán)利要求9所述的抗體，其特征在于，所述重鏈還包含人IgG1恒定區(qū)而所述輕鏈還包含人κ恒定區(qū)。
12.一種含有如權(quán)利要求1所述抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
13.一種含有如權(quán)利要求11所述抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
14.一種治療惡性淋巴瘤的方法，所述方法包括給予患者有效量的如權(quán)利要求1所述的抗體。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述抗體的所述重鏈含SEQ ID NO4和人IgG1恒定區(qū)，而所述抗體的所述輕鏈含SEQ ID NO12和人κ恒定區(qū)。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述惡性淋巴瘤是白血病或淋巴瘤。
17.一種治療患者的自身免疫病的方法，所述方法包括施用有效量的如權(quán)利要求1所述的抗體。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述抗體的所述重鏈含SEQ ID NO4和人IgG1恒定區(qū)，而所述抗體的所述輕鏈含SEQ ID NO12和人κ恒定區(qū)。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述自身免疫病是多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性血管炎、葡萄膜炎、炎性腸病或硬皮病。
20.一種在器官移植之前或之后免疫抑制患者的方法，所述方法包括給予所述患者有效量的如權(quán)利要求1所述的抗體。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述抗體的所述重鏈含SEQ ID NO4和人IgG1恒定區(qū)，而所述抗體的所述輕鏈含SEQ ID NO12和人κ恒定區(qū)。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述器官移植是腎移植。
23.一種包含核酸序列的表達(dá)載體，所述核酸序列編碼如權(quán)利要求1所述的包含SEQ ID NO1取代變體的重鏈可變區(qū)，且所述核酸序列操作性連接于表達(dá)控制序列。
24.如權(quán)利要求23所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述編碼如權(quán)利要求1所述的包含SEQ ID NO1取代變體的重鏈可變區(qū)的序列是SEQ ID NO71、SEQ ID NO72、SEQ ID NO73、SEQ ID NO74或SEQ ID NO75，或是其簡(jiǎn)并變體。
25.如權(quán)利要求24所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述編碼如權(quán)利要求1所述含有SEQ ID NO1取代變體的重鏈可變區(qū)的序列是SEQ ID NO72。
26.如權(quán)利要求23所述的表達(dá)載體，還包含編碼人IgG1恒定區(qū)的核酸序列。
27.一種含有如權(quán)利要求23所述載體的培養(yǎng)的細(xì)胞。
28.一種包含核酸序列的表達(dá)載體，所述核酸序列編碼如權(quán)利要求1所述的包含SEQ ID NO2取代變體的輕鏈可變區(qū)，且所述核酸序列操作性連接于表達(dá)控制序列。
29.如權(quán)利要求28所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述編碼如權(quán)利要求1所述的包含SEQ ID NO2取代變體的輕鏈可變區(qū)的序列是SEQ ID NO76、SEQ ID NO77、SEQ ID NO78、SEQ ID NO79或SEQ ID NO80，或是其簡(jiǎn)并變體。
30.如權(quán)利要求29所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述編碼如權(quán)利要求1所述包含SEQ ID NO2取代變體的輕鏈可變區(qū)的序列是SEQ ID NO80。
31.如權(quán)利要求28所述的表達(dá)載體，還包含編碼人κ恒定區(qū)的核酸序列。
32.一種含有如權(quán)利要求28所述載體的培養(yǎng)的細(xì)胞。
33.一種用權(quán)利要求23所述載體和權(quán)利要求28所述載體轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)的細(xì)胞。
34.一種制備免疫球蛋白的方法，所述方法包括在允許在表達(dá)控制序列的控制之下進(jìn)行表達(dá)的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求33所述的細(xì)胞，并從所述細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化得到免疫球蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供含有的潛在T細(xì)胞表位數(shù)減少因而預(yù)計(jì)免疫原性降低的抗CD52抗體的修飾形式。
文檔編號(hào)C12N5/06GK1898267SQ200480036043
公開日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2004年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月1日
發(fā)明者F·J·卡爾, A·A·漢米爾頓 申請(qǐng)人:生物維新有限公司