專利名稱：通過發(fā)酵制備精細(xì)化學(xué)品的方法
背景技術(shù)：
氨基酸賴氨酸的工業(yè)生產(chǎn)已經(jīng)成為經(jīng)濟(jì)上重要的工業(yè)方法。賴氨酸在商業(yè)上用作動物飼料添加劑，因為它能夠通過增加其他氨基酸的吸收提高飼料質(zhì)量，還用于人類藥物中，尤其作為灌注液的成分，并且用于制藥工業(yè)中。
該賴氨酸的商業(yè)生產(chǎn)主要用革蘭氏陽性谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)和乳酸發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)進(jìn)行(Kleemann，A.，et.al.，“Amino Acids，”in ULLMANN′S ENCYCLOPEDIA OF INDUSTRIALCHEMISTRY，vol.A2，pp.57-97，WeinhamVCH-Verlagsgesellschaft(1985))。這些生物用于每年生產(chǎn)約250,000噸賴氨酸。大量研究著手分離產(chǎn)生更大量賴氨酸的突變的細(xì)菌菌株。用于氨基酸生產(chǎn)的微生物方法中的微生物分成4類野生型菌株、營養(yǎng)突變體、調(diào)節(jié)突變體和營養(yǎng)缺陷型調(diào)節(jié)突變體(K.Nakayama et al.，in Nutritional Improvement of Food and FeedProteins，M.Friedman，ed.，(1978)，pp.649-661)。棒桿菌(Corynebacterium)和相關(guān)生物的突變體使得能夠通過直接發(fā)酵從廉價碳源，例如，糖蜜、乙酸和乙醇便宜地生產(chǎn)氨基酸。此外，通過發(fā)酵產(chǎn)生的氨基酸的立體特異性(L異構(gòu)體)使得該方法與合成方法相比是有利的。
提高賴氨酸的商業(yè)生產(chǎn)的效率的另一種方法是通過研究賴氨酸產(chǎn)生和通過戊糖磷酸途徑的代謝通量之間的相關(guān)性。考慮到通過發(fā)酵方法生產(chǎn)賴氨酸的經(jīng)濟(jì)重要性，已經(jīng)深入研究了賴氨酸合成的生物化學(xué)途徑，顯然是為了增加所產(chǎn)生的賴氨酸的總量和降低生產(chǎn)成本(Sahm et al.，(1996)Ann.N.Y.Acad.Sci.78225-39綜述)。在來自葡萄糖的碳通量導(dǎo)向芳香族氨基酸形成的代謝工程中已經(jīng)取得了一定成功(Flores，N.et al.，(1996)NatureBiotechnol.14620-623)。當(dāng)細(xì)胞吸收時，葡萄糖被磷酸化，同時消耗磷酸烯醇丙酮酸(磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng))(Malin & Bourd，(1991)Journal of AppliedBacteriology 71，517-523)并可以以葡萄糖-6-磷酸提供給細(xì)胞。磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Shio et al.，(1990)Agricultural and Biological Chemistry 54，1513-1519)和轉(zhuǎn)化酶反應(yīng)(Yamamoto et al.，(1986)Journal of FermentationTechnology 64，285-291)將蔗糖轉(zhuǎn)化成果糖和葡萄糖-6-磷酸。
在葡萄糖分解代謝期間，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(EC 1.1.14.9)和葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(EC 5.3.1.9)競爭底物葡萄糖-6-磷酸。葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶催化糖酵解途徑(EMP途徑)的第一個反應(yīng)步驟，即轉(zhuǎn)化成果糖-6-磷酸。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶催化戊糖磷酸循環(huán)的氧化部分的第一個反應(yīng)步驟，即轉(zhuǎn)化成6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯。
在戊糖磷酸循環(huán)的氧化部分，葡萄糖-6-磷酸被轉(zhuǎn)化成核酮糖-5-磷酸，從而產(chǎn)生NADPH形式的還原等同物。隨著戊糖磷酸循環(huán)進(jìn)一步發(fā)展，戊糖磷酸、己糖磷酸和丙糖磷酸互變。例如在核苷酸生物合成中需要戊糖磷酸，例如，5-磷酸核糖-1-焦磷酸。5-磷酸核糖-1-焦磷酸還是芳香族氨基酸和L-組氨酸的前體。NADPH作為多種合成代謝生物合成中的還原等同物。從而，從草酰乙酸生物合成1分子賴氨酸消耗4分子NADPH。從而，向草酰乙酸(OAA)的碳通量與系統(tǒng)擾動無關(guān)而保持恒定(J.Vallino et al.，(1993)Biotechnol.Bioeng.，41，633-646)。
發(fā)明概述本發(fā)明至少部分基于發(fā)現(xiàn)了谷氨酸棒桿菌中戊糖磷酸途徑的編碼關(guān)鍵酶，例如果糖-1，6-二磷酸酶的基因，和發(fā)現(xiàn)例如，果糖-1，6-二磷酸酶的失調(diào)，例如，增加表達(dá)或者活性導(dǎo)致增加的賴氨酸產(chǎn)生。此外，發(fā)現(xiàn)在賴氨酸生產(chǎn)期間通過失調(diào)，例如增加果糖-1，6-二磷酸酶表達(dá)或者活性增加碳產(chǎn)量也導(dǎo)致增加的賴氨酸產(chǎn)生。在一個實施方案中，碳源是果糖或者蔗糖。因此，本發(fā)明提供了增加微生物，例如，谷氨酸棒桿菌產(chǎn)生賴氨酸的方法，其中果糖或者蔗糖是底物。
因此，一方面，本發(fā)明提供了增加微生物中通過戊糖磷酸途徑的代謝通量的方法，其包括在一定條件下培養(yǎng)包含失調(diào)的基因的微生物，從而通過戊糖磷酸途徑的代謝通量增加。在一個實施方案中，發(fā)酵微生物以產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸。在另一實施方案中，將果糖或蔗糖用作碳源。在再一個實施方案中，所述基因是果糖-1，6-二磷酸酶。在相關(guān)實施方案中，果糖-1，6-二磷酸酶基因來自棒桿菌，例如，谷氨酸棒桿菌。在另一實施方案中，果糖-1，6-二磷酸酶基因被過表達(dá)。在再一個實施方案中，果糖-1，6-二磷酸酶基因編碼的蛋白質(zhì)具有增加的活性。
在另一實施方案中，所述微生物還包含一種或多種額外的失調(diào)基因。所述一種或多種額外的失調(diào)基因可以包括，但不限于，ask基因、dapA基因、asd基因、dapB基因、ddh基因、lysA基因、lysE基因、pycA基因、zwf基因、pepCL基因、gap基因、zwa1基因、tkt基因、tad基因、mqo基因、tpi基因、pgk基因、和sigC基因。在另一具體實施方案中，所述基因可以過表達(dá)或者表達(dá)不足。此外，所述失調(diào)基因可以編碼選自抗反饋天冬氨酸激酶、二氫吡啶二羧酸合酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、二氨基庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶、賴氨酸輸出蛋白(exporter)、丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、RPF蛋白質(zhì)前體、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶、menaquinine氧化還原酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸激酶、和RNA-聚合酶σ因子sigC。在具體實施方案中，所述蛋白質(zhì)可以具有增加或者減小的活性。
根據(jù)本發(fā)明的方法，所述一種或多種額外的失調(diào)基因還可以包括，但不限于，pepCK基因、mal E基因、glgA基因、pgi基因、dead基因、menE基因、citE基因、mikE17基因、poxB基因、zwa2基因、和sucC基因。在特定實施方案中，至少一種基因的表達(dá)受到上調(diào)、減弱、減小、下調(diào)或者抑制。此外，所述失調(diào)的基因可以編碼選自烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、蘋果酸酶、糖原合酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、依賴ATP的RNA解旋酶、鄰-琥珀?；郊姿?CoA連接酶、檸檬酸裂合酶β鏈、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子、丙酮酸脫氫酶、RPF蛋白質(zhì)前體、琥珀酰CoA合成酶的蛋白質(zhì)。在特定實施方案中，所述蛋白質(zhì)具有減小或者增加的活性。
在一個實施方案中，用于本發(fā)明方法的微生物屬于棒桿菌屬，例如，谷氨酸棒桿菌。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的方法，其包括發(fā)酵其中果糖-1，6-二磷酸酶被失調(diào)的微生物并在培養(yǎng)基或者微生物的細(xì)胞中積累所述精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸，從而產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品。在一個實施方案中，所述方法包括回收所述精細(xì)化學(xué)品。在另一實施方案中，果糖-1，6-二磷酸酶被過表達(dá)。在再一個實施方案中，將果糖或者蔗糖用作碳源。
一方面，果糖-1，6-二磷酸酶來自谷氨酸棒桿菌并且包含SEQ ID NO1的核苷酸序列和SEQ ID NO2的氨基酸序列。
根據(jù)下面的詳細(xì)描述和權(quán)利要求，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將是顯而易見的。
附圖簡述

圖1是戊糖生物合成途徑的圖示。
圖2在用葡萄糖和果糖產(chǎn)生賴氨酸期間在谷氨酸棒桿菌ATCC 21526的追蹤實驗中通過GC/MS測量的所分泌的賴氨酸和海藻糖的相對質(zhì)量同位素異構(gòu)體(isotopomer)級分的比較。
圖3在用葡萄糖進(jìn)行賴氨酸生產(chǎn)期間谷氨酸棒桿菌ATCC 21526的中心代謝中體內(nèi)碳通量分布，對13C追蹤實驗使用組合代謝物平衡的綜合方法和同位素異構(gòu)體建模，通過GC/MS分別對分泌的賴氨酸和海藻糖進(jìn)行標(biāo)記測量，從所得實驗結(jié)果的最佳擬合估計所述體內(nèi)碳通量分布。以正方形符號給出凈通量，而對于可逆反應(yīng)，通過對應(yīng)黑框旁邊的箭頭指示凈通量的方向。轉(zhuǎn)醛酶、轉(zhuǎn)酮酶和葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶通量下面的括號中的數(shù)字表示通量可逆性。所有通量都表示為平均比葡萄糖攝入速率(1.77mmol g-1h-1)的摩爾百分?jǐn)?shù)。
圖4在用果糖進(jìn)行賴氨酸生產(chǎn)期間谷氨酸棒桿菌ATCC 21526的中心代謝中體內(nèi)碳通量分布，對13C追蹤實驗使用組合代謝物平衡的綜合方法和同位素異構(gòu)體建模，通過GC/MS分別對分泌的賴氨酸和海藻糖進(jìn)行標(biāo)記測量，從所得實驗結(jié)果的最佳擬合估計所述體內(nèi)碳通量分布。以正方形符號給出凈通量，而對于可逆反應(yīng)，通過對應(yīng)黑框旁邊的箭頭指示凈通量的方向。轉(zhuǎn)醛酶、轉(zhuǎn)酮酶和葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶通量下面的括號中的數(shù)字表示通量可逆性。所有通量都表示為平均比果糖攝入速率(1.93mmol g-1h-1)的摩爾百分?jǐn)?shù)。
圖5用葡萄糖生長的(A)和果糖生長的(B)的產(chǎn)生賴氨酸的谷氨酸棒桿菌的中心代謝的代謝網(wǎng)絡(luò)，包括運輸通量、合成代謝通量和中間代謝物庫之間的通量。
發(fā)明詳述本發(fā)明至少部分基于編碼戊糖磷酸途徑的必需酶的基因，例如，谷氨酸棒桿菌基因的鑒定。本發(fā)明描述了方法，其包括操作微生物，例如谷氨酸棒桿菌中戊糖磷酸生物合成途徑，使得碳產(chǎn)量增加并且產(chǎn)生某些所希望的精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸，例如，以增加的產(chǎn)量產(chǎn)生。具體地，本發(fā)明包括通過發(fā)酵具有失調(diào)的，例如增加的果糖-1，6-二磷酸酶表達(dá)和活性的微生物，例如，谷氨酸棒桿菌來產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品，例如賴氨酸的方法。在一個實施方案中，將果糖或蔗糖用作微生物發(fā)酵中的碳源。已經(jīng)確定果糖是從微生物產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品，例如賴氨酸的效率較低的底物。然而，本發(fā)明提供了優(yōu)化微生物，例如，谷氨酸棒桿菌的賴氨酸產(chǎn)生的方法，其中果糖或者蔗糖是底物。果糖-1，6-二磷酸酶表達(dá)和活性的失調(diào)，例如增大導(dǎo)致通過戊糖磷酸途徑的更高的通量，導(dǎo)致增加的NADPH產(chǎn)生和增加的賴氨酸產(chǎn)量。
術(shù)語“戊糖磷酸途徑”包括涉及用于生成或合成精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸的戊糖磷酸酶(例如，編碼生物合成酶的基因編碼的多肽)、化合物(例如，前體、底物、中間物或產(chǎn)物)、輔因子等等的途徑。戊糖磷酸途徑將葡萄糖分子轉(zhuǎn)化成生物化學(xué)上有用的更小的分子。
為了更容易理解本發(fā)明，此處首先定義一些術(shù)語。
術(shù)語“戊糖磷酸生物合成途徑”包括涉及用于生成和合成精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸的戊糖磷酸生物合成基因、酶(例如，編碼生物合成酶的基因編碼的多肽)、化合物(例如，前體、底物、中間物或產(chǎn)物)、輔因子等等的途徑。術(shù)語“戊糖磷酸生物合成途徑”包括導(dǎo)致在微生物中(例如，體內(nèi))合成精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸的生物合成途徑以及導(dǎo)致在體外合成精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸的生物合成途徑。術(shù)語“戊糖磷酸生物合成途徑蛋白質(zhì)”或“戊糖磷酸生物合成途徑酶”包括直接或間接涉及戊糖磷酸生物合成途徑的那些肽、多肽、蛋白質(zhì)、酶和其片段，例如，果糖-1，6-二磷酸酶。
術(shù)語“戊糖磷酸生物合成途徑基因”包括編碼直接或間接涉及戊糖磷酸生物合成途徑的肽、多肽、蛋白質(zhì)、和酶的那些基因和基因片段，例如，果糖-1，6-二磷酸酶基因。
術(shù)語“氨基酸生物合成途徑基因”意在包括編碼直接參與氨基酸合成的肽、多肽、蛋白質(zhì)、和酶，例如，果糖-1，6-二磷酸酶的那些基因和基因片段。這些基因可以與在宿主細(xì)胞中天然發(fā)生的那些基因相同并且參與該宿主細(xì)胞中任意氨基酸，尤其賴氨酸的合成。
術(shù)語“賴氨酸生物合成途徑基因”包括編碼直接參與賴氨酸合成的肽、多肽、蛋白質(zhì)、和酶，例如，果糖-1，6-二磷酸酶的那些基因和基因片段。這些基因可以與在宿主細(xì)胞中天然發(fā)生的那些基因相同并且參與該宿主細(xì)胞中賴氨酸的合成。備選地，可以存在此類基因的修飾或者突變，例如，所述基因可以含有不顯著影響所編碼的蛋白質(zhì)的生物活性的修飾或突變。例如，通過誘變或者通過導(dǎo)入或者替代一個或多個核苷酸或者通過除去基因的非必需區(qū)來修飾天然基因。此類修飾可以容易地通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行。
術(shù)語“賴氨酸生物合成途徑蛋白質(zhì)”意在包括直接參與賴氨酸合成的那些肽、多肽、蛋白質(zhì)、酶和其片段。這些蛋白質(zhì)可以與在宿主細(xì)胞中天然發(fā)生的那些蛋白質(zhì)相同并且參與該宿主細(xì)胞中賴氨酸的合成。備選地，此類蛋白質(zhì)可以存在修飾或者突變，例如，所述蛋白質(zhì)可以含有不顯著影響該蛋白質(zhì)的生物活性的修飾或突變。例如，通過誘變或者通過導(dǎo)入或者替代一個或多個氨基酸，優(yōu)選通過保守氨基酸替代，或者通過除去蛋白質(zhì)的非必需區(qū)來修飾天然蛋白質(zhì)。此類修飾可以容易地通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行。備選地，賴氨酸生物合成蛋白質(zhì)可以與特定宿主細(xì)胞異源。此類蛋白質(zhì)可以來自具有編碼具有相同或相似的生物合成作用的蛋白質(zhì)的基因的任意生物。
術(shù)語“碳通量”指相對于競爭途徑向下進(jìn)入特定代謝途徑的葡萄糖分子數(shù)。具體地，微生物內(nèi)增加的NADPH通過改變該生物的糖酵解和戊糖磷酸途徑之間的碳通量分布來實現(xiàn)。
“果糖-1，6-二磷酸酶活性”包括如根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在體內(nèi)或者體外測定的果糖-1，6-二磷酸酶蛋白質(zhì)、多肽或者核酸分子發(fā)揮的活性。果糖-1，6-二磷酸酶參與許多不同的代謝途徑并且在多數(shù)生物中發(fā)現(xiàn)。優(yōu)選地，果糖-1，6-二磷酸酶活性包括催化果糖-1，6-二磷酸水解成果糖-6-磷酸。
術(shù)語“精細(xì)化學(xué)品”是本領(lǐng)域已知的并且包括生物產(chǎn)生的分子，它們應(yīng)用于多種工業(yè)，如，但不限于，制藥工業(yè)、農(nóng)業(yè)和化妝品工業(yè)。此類化合物包括有機(jī)酸，如酒石酸、衣康酸和二氨基庚二酸、蛋白質(zhì)原性的(proteinogenic)和非蛋白質(zhì)原性的氨基酸、嘌呤和嘧啶堿基、核苷，和核苷酸(如Kuninaka，A.(1996)Nucleotides and related compounds，p.561-612，in Biotechnology vol.6，Rehm et al.，eds.VCHWeinheim，和其中引用的參考文獻(xiàn)中描述)、脂類、飽和和不飽和脂肪酸(例如，花生四烯酸)、二醇(例如，丙二醇和丁二醇)、糖(例如，透明質(zhì)酸和海藻糖)、芳香族化合物(例如，芳香族胺、香草醛和靛藍(lán))、維生素和輔因子(如Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，vol.A27，“Vitamins”，p.443-613(1996)VCHWeinheim和其中引用的參考文獻(xiàn)；和Ong，A.S.，Niki，E.& Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health，and Disease”Proceedings of theUNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations inMalaysia，and the Society for Free Radical Research-Asia，held Sept.1-3，1994at Penang，Malaysia，AOCS Press，(1995)中描述)、酶、聚酮化合物(Cane et al.(1998)Science 28263-68)，和Gutcho(1983)Chemicals byFermentation，Noyes Data Corporation，ISBN0818805086和其中引用的參考文獻(xiàn)中描述的所有其他化合物。在下面進(jìn)一步說明這些精細(xì)化學(xué)品的某一些的代謝和用途。
氨基酸代謝和用途氨基酸組成所有蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，并且同樣是所有生物中正常細(xì)胞功能必需的。術(shù)語“氨基酸”是本領(lǐng)域公知的。20種蛋白原性氨基酸作為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單位，其中它們通過肽鍵連接，而非蛋白原性氨基酸(已知數(shù)百種)不是蛋白質(zhì)中通常發(fā)現(xiàn)的(見Ulmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry，vol.A2，p.57-97VCHWeinheim(1985))。氨基酸可以是D-或者L-光學(xué)構(gòu)型，然而L-氨基酸通常是在天然發(fā)生的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的唯一類型。已經(jīng)良好表征了原核和真核細(xì)胞中20種蛋白原性氨基酸的每一種的生物合成和降解途徑(見，例如，Stryer，L.Biochemistry，3rdedition，pages578-590(1988))。“必需”氨基酸(組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸)之所以如此命名是因為它們由于它們的生物合成的復(fù)雜性而通常是營養(yǎng)需要的，容易通過簡單的生物合成途徑容易地轉(zhuǎn)化成剩余的11種“非必需”氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸和酪氨酸)。高級動物保留合成這些氨基酸中一些氨基酸的能力，但是為了進(jìn)行正常的蛋白質(zhì)合成，必須從食物提供必需氨基酸。
除了它們在蛋白質(zhì)生物合成中的功能外，這些氨基酸自身還是有趣的化學(xué)品，并且許多氨基酸已經(jīng)在食品、飼料、化學(xué)、化妝品、農(nóng)業(yè)和制藥工業(yè)中有多種應(yīng)用。賴氨酸不僅是人，而且是單胃動物如家禽和豬的營養(yǎng)中的重要氨基酸。谷氨酸最通常用作風(fēng)味添加劑(谷氨酸單鈉，MSG)并且如天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和半胱氨酸一樣廣泛用于食品工業(yè)。甘氨酸、L-甲硫氨酸和色氨酸也用于制藥工業(yè)。谷氨酰胺、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸、絲氨酸和丙氨酸用于制藥和化妝品工業(yè)。蘇氨酸、色氨酸和D/L-甲硫氨酸是常用的飼料添加劑。(Leuchtenberger，W.(1996)Amino aids-technical production and use，p.466-502 in Rehm et al.(eds.)Biotechnology vol.6，chapter 14a，VCHWeinheim)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些氨基酸可以用作合成的氨基酸和蛋白質(zhì)的合成前體，所述合成的氨基酸和蛋白質(zhì)為例如N-乙酰基半胱氨酸、S-羧基甲基-L-半胱氨酸、(S)-5-羥基色氨酸和Ulmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，vol.A2，p.57-97，VCHWeinheim，1985中描述的其他氨基酸。
已經(jīng)良好表征了能夠產(chǎn)生這些天然氨基酸的生物，如細(xì)菌中這些天然氨基酸的生物合成(細(xì)菌氨基酸生物合成和其調(diào)節(jié)的綜述見Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47533-606)。通過檸檬酸循環(huán)中的一種中間物α-酮戊二酸的還原胺化合成谷氨酸。谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸每種都隨后從谷氨酸產(chǎn)生。絲氨酸的生物合成是一個三步過程，以3-磷酸甘油酸(糖酵解中的中間物)開始，氧化、轉(zhuǎn)氨基作用、和水解步驟后產(chǎn)生該氨基酸。半胱氨酸和甘氨酸都從絲氨酸產(chǎn)生；通過高絲氨酸與絲氨酸的縮合產(chǎn)生半胱氨酸，在絲氨酸轉(zhuǎn)羥甲基酶催化的反應(yīng)中，通過將側(cè)鏈β-碳原子轉(zhuǎn)移到四氫葉酸產(chǎn)生甘氨酸。在9步生物合成途徑中從糖酵解和戊糖磷酸途徑前體赤蘚糖-4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸合成苯丙氨酸和酪氨酸，它們的差別僅在預(yù)苯酸合成后的最后兩步。色氨酸也從這兩種最初分子產(chǎn)生，但是它的合成是11步途徑。在苯丙氨酸羥化酶催化的反應(yīng)中，也可以從纈氨酸合成酪氨酸。丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸都是糖酵解的終產(chǎn)物丙酮酸的生物合成產(chǎn)物。從檸檬酸循環(huán)的中間物草酰乙酸形成天冬氨酸。天冬酰胺、甲硫氨酸、蘇氨酸和賴氨酸都通過天冬氨酸的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。異亮氨酸從蘇氨酸形成。一種復(fù)雜的9步途徑導(dǎo)致從活化的糖5-磷酸核糖-1-焦磷酸產(chǎn)生組氨酸。
細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成需求過量的氨基酸不能儲存，并且被降解以提供細(xì)胞的主要代謝途徑的中間物(綜述見Stryer，L.Biochemistry 3rded.Ch.21“Amino Acid Degradation and the Urea Cycle”p.495-516(1988))。盡管細(xì)胞能夠?qū)⒉幌胍陌被徂D(zhuǎn)化成有用的代謝中間物，但是在能量、前體分子和合成氨基酸所需的酶的方面，氨基酸產(chǎn)生是代價高昂的。從而，并不令人驚奇的是，氨基酸生物合成受到反饋抑制的調(diào)節(jié)，其中特定氨基酸的存在用于減慢或者完全停止它自身的產(chǎn)生(氨基酸生物合成途徑中的反饋機(jī)制綜述見Stryer，L.Biochemistry，3rded.Ch.24“Biosynthesis of AminoAcids and Heme”p.575-600(1988))。從而，任何特定氨基酸的輸出受到細(xì)胞中存在的氨基酸的量的限制。
維生素、輔因子和營養(yǎng)成分的代謝和用途維生素、輔因子和營養(yǎng)成分包含高等動物不能合成因此必須攝取的另一組分子，雖然它們易于被其它生物如細(xì)菌合成。這些分子自身為生物活性物質(zhì)或為在多種代謝途徑中作為電子載體或中間體的生物活性物質(zhì)的前體。除了它們的營養(yǎng)價值外，這些化合物作為著色劑、抗氧化劑和催化劑或其它操作輔助劑也具有重要的工業(yè)價值(這些化合物的結(jié)構(gòu)、活性和工業(yè)應(yīng)用的概述參見例如，Ullman’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，“Vitamins”vol.A27，p.443-613，VCHWeinheim，1996.)。術(shù)語“維生素”為本領(lǐng)域已知的，并且包括生物行使正常功能所需但是該生物自身不能合成的營養(yǎng)物。維生素組可以包含輔因子和營養(yǎng)性化合物。術(shù)語“輔因子”包括進(jìn)行正常酶促活性所需的非蛋白原性化合物。此類化合物可為有機(jī)的或無機(jī)的，本發(fā)明的輔因子分子優(yōu)選是有機(jī)的。術(shù)語“營養(yǎng)成分”包括在植物和動物尤其是人中具有健康益處的食物補充物。此類分子的實例為維生素、抗氧化劑和某些脂類(如多不飽和脂肪酸)。
已大量描述了這些分子在可產(chǎn)生它們的生物如細(xì)菌中的生物合成(Ullman’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，“Vitamins”vol.A27，p.443-613，VCHWeinheim，1996；Michal，G.(1999)Biochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，John Wiley & Sons；Ong，A.S.，Niki，E.& Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health，and Disease”Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and TechnologicalAssociations in Malaysia，and the Society for Free Radical Research-Asia，held Sept.1-3，1994 at Penang，Malaysia，AOCS PressChampaign，IL X，374S)。
硫胺素(維生素B1)由嘧啶和噻唑部分通過化學(xué)偶聯(lián)產(chǎn)生。核黃素(維生素B2)從鳥苷-5’-三磷酸(GTP)和核糖-5’-磷酸合成。核黃素又用于合成黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。合起來稱為‘維生素B6’的化合物家族(例如，吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛-5’-磷酸和商業(yè)上使用的維生素B6鹽酸鹽)均為共同結(jié)構(gòu)單位5-羥基-6-甲基吡啶的衍生物。泛酸(泛酸，(R)-(+)-N-(2，4-二羥基-3，3-二甲基-1-氧代丁基)-β-丙氨酸)可通過化學(xué)合成或發(fā)酵產(chǎn)生。泛酸生物合成的最后步驟由β-丙氨酸和泛解酸的ATP-驅(qū)動的縮合組成。負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)化為泛解酸、β-丙氨酸和泛酸縮合的生物合成步驟的酶是已知的。泛酸的代謝活性形式為輔酶A，其生物合成由5步酶促步驟進(jìn)行。泛酸、吡哆醛-5’-磷酸、半胱氨酸和ATP為輔酶A的前體。這些酶不僅催化泛酸的形成，而且催化(R)-泛解酸、(R)-pantolacton、(R)-泛醇(前維生素B5)、泛酰巰基乙胺(及其衍生物)和輔酶A的產(chǎn)生。
已詳細(xì)研究了微生物中生物素從前體分子庚二酰輔酶A的生物合成，并鑒定了幾種所涉及的基因。發(fā)現(xiàn)許多相應(yīng)的蛋白質(zhì)也參與Fe-簇合成，并且是nifS類蛋白質(zhì)的成員。硫辛酸來自辛酸，并在能量代謝中作為輔酶，在能量代謝中硫辛酸成為丙酮酸脫氫酶復(fù)合體和α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體的一部分。葉酸鹽為一組這樣的物質(zhì)，其均為葉酸衍生物，葉酸又來自L-谷氨酸、對氨基-苯甲酸和6-甲基蝶呤。已詳細(xì)研究了某些微生物中始于代謝中間物鳥苷-5’-三磷酸(GTP)、L-谷氨酸和對氨基-苯甲酸的葉酸及其衍生物的生物合成。
類咕啉(如鈷胺素且尤其是維生素B12)和卟啉屬于一組特征是四吡咯環(huán)體系的化學(xué)品。維生素B12的生物合成太復(fù)雜，目前尚未完全表征，但許多涉及的酶和底物現(xiàn)在是已知的。
煙酸(煙酸鹽)和煙酰胺為吡啶衍生物，其也稱為‘煙酸’。煙酸為重要的輔酶NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADP(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)和它們的還原形式的前體。
這些化合物的大規(guī)模生產(chǎn)很大程度上依賴于無細(xì)胞的化學(xué)合成，雖然這些化學(xué)品中的一些如核黃素、維生素B6、泛酸和生物素也已通過微生物的大規(guī)模培養(yǎng)產(chǎn)生。只有維生素B12是僅通過發(fā)酵產(chǎn)生的，因為其合成復(fù)雜。體外方法需要大量輸入材料和時間，通常成本高昂。
嘌呤、嘧啶、核苷和核苷酸的代謝和用途嘌呤和嘧啶代謝基因及它們相應(yīng)的蛋白質(zhì)為治療腫瘤疾病和病毒感染的重要靶標(biāo)。術(shù)語“嘌呤”或“嘧啶”包括構(gòu)成核酸、輔酶和核苷酸的含氮堿基。術(shù)語“核苷酸”包括核酸分子的基本結(jié)構(gòu)單位，其由含氮堿基、戊糖(對RNA而言，該糖為核糖，對DNA而言，該糖為D-脫氧核糖)和磷酸組成。術(shù)語“核苷”包括作為核苷酸前體的分子，但其缺少核苷酸所具有的磷酸部分。通過抑制這些分子的生物合成，或抑制它們形成核酸分子的動員，可抑制RNA和DNA合成；通過以靶向癌性細(xì)胞的方式抑制這種活性，可抑制腫瘤細(xì)胞分裂和復(fù)制的能力。此外，有不形成核酸分子但作為能量貯存(即AMP)或作為輔酶(即FAD和NAD)的核苷酸。
一些出版物已描述了這些化學(xué)品通過影響嘌呤和/或嘧啶代謝對這些醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥的用途(例如Christopherson，R.I.and Lyons，S.D.(1990)“Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis aschemotherapeutic agents.”Med.Res.Reviews 10505-548)。對參與嘌呤和嘧啶代謝的酶的研究集中在研發(fā)可用作例如免疫抑制劑或抗增生劑的新藥上(Smith，J.L.，(1995)“Enzymes in nucleotide synthesis.”Curr.Opin.Struct.Biol.5752-757；(1995)Biochem Soc.Transact.23877-902)。然而，嘌呤和嘧啶堿基、核苷和核苷酸具有其它應(yīng)用用作一些精細(xì)化學(xué)品(例如，硫胺素、S-腺苷-甲硫氨酸、葉酸鹽或核黃素)生物合成的中間物，作為細(xì)胞的能量載體(例如，ATP或GTP)，和本身作為化學(xué)品，通常作為增味劑(例如，IMP或GMP)或用于一些醫(yī)學(xué)應(yīng)用(參見例如，Kuninaka，A.(1996)Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology vol.6，Rehm et al.，eds.VCHWeinheim，p.561-612)。同樣，參與嘌呤、嘧啶、核苷或核苷酸代謝的酶越來越多地用作靶標(biāo)，研發(fā)了針對所述靶標(biāo)的用于作物保護(hù)的化學(xué)品，包括殺真菌劑、除草劑和殺蟲劑。
已經(jīng)表征了這些化合物在細(xì)菌中的代謝(綜述參見例如，Zalkin，H.andDixon，J.E.(1992)“de novo purine nucleotide biosynthesis”，inProgress inNucleic Acid Research and Molecular Biology，vol.42，Academic Press，p.259-287；and Michal，G.(1999)“Nucleotides and Nucleosides”，Chapter 8inBiochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistry and MolecularBiology，WileyNew York))。嘌呤代謝已是深入研究的主題，其對細(xì)胞的正常功能是必需的。高等動物中受損的嘌呤代謝可引起嚴(yán)重疾病，如痛風(fēng)。嘌呤核苷酸從核糖-5-磷酸開始合成，經(jīng)過一系列步驟，通過中間化合物肌苷-5’-磷酸(IMP)，產(chǎn)生鳥苷-5’-單磷酸(GMP)或腺苷-5’-單磷酸(AMP)，由此易于形成用作核苷酸的三磷酸形式。這些化合物也用作能量儲存，這樣它們的降解可以為細(xì)胞內(nèi)許多不同生物化學(xué)過程提供能量。嘧啶生物合成由從核糖-5-磷酸形成尿苷-5’-單磷酸(UMP)進(jìn)行。UMP又轉(zhuǎn)化為胞苷-5’-三磷酸(CTP)。所有這些核苷酸的脫氧形式在一步還原反應(yīng)中從核苷酸的二磷酸核糖形式產(chǎn)生為核苷酸的二磷酸脫氧核糖形式。磷酸化后，這些分子可參與DNA合成。
海藻糖代謝和用途海藻糖由兩個葡萄糖分子通過α，α-1，1鍵結(jié)合組成。它通常用于食品工業(yè)作為甜味劑，作為干的或冷凍食品的添加劑，和用于飲料中。然而它在制藥、化妝品和生物技術(shù)工業(yè)中也有應(yīng)用(參見例如，Nishimoto et al.，(1998)U.S.Patent No.5,759,610；Singer，M.A.and Lindquist，S.(1998)Trends Biotech.16460-467；Paiva，C.L.A.and Panek，A.D.(1996)Biotech.Ann.Rev.2293-314；and Shiosaka，M.(1997)J.Japan 17297-102)。海藻糖通過酶從許多微生物產(chǎn)生，并天然釋放入周圍培養(yǎng)基中，可用本領(lǐng)域已知的方法從培養(yǎng)基收集海藻糖。
I.重組微生物和培養(yǎng)微生物使得產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的方法本發(fā)明的方法學(xué)描述了微生物，例如，重組微生物，其優(yōu)選包括如本文描述的載體或者基因(例如，野生型和/或突變的基因)和/或以導(dǎo)致產(chǎn)生所希望的精細(xì)化學(xué)品，例如賴氨酸的方式培養(yǎng)。術(shù)語“重組的”微生物包括這樣的微生物(例如，細(xì)菌、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞等等)，其與它所來自的天然發(fā)生的微生物相比顯示出改變的、修飾的或者不同的基因型和/或表型(例如，當(dāng)遺傳修飾影響微生物的編碼核酸序列時)。優(yōu)選地，本發(fā)明的“重組”微生物已經(jīng)經(jīng)基因工程化從而它過表達(dá)如本文描述的至少一種細(xì)菌基因或者基因產(chǎn)物，優(yōu)選生物合成酶編碼基因，例如，包括在如本文描述的重組載體內(nèi)的果糖-1，6-二磷酸酶的編碼基因和/或生物合成酶，例如，從重組載體表達(dá)的果糖-1，6-二磷酸酶。技術(shù)人員將明白表達(dá)或過表達(dá)基因產(chǎn)物的微生物由于編碼所述基因產(chǎn)物的核酸序列和/或基因的表達(dá)或者過表達(dá)而產(chǎn)生或過量產(chǎn)生所述基因產(chǎn)物。在一個實施方案中，重組微生物具有增加的生物合成酶，例如，果糖-1，6-二磷酸酶活性。
在本發(fā)明的一些實施方案中，除了果糖-1，6-二磷酸酶基因或酶之外，可以調(diào)節(jié)至少一種基因或蛋白質(zhì)以便增強(qiáng)L-氨基酸的產(chǎn)生。例如，生物合成途徑，例如，糖酵解、糖回補、檸檬酸循環(huán)、戊糖磷酸循環(huán)，或者氨基酸輸出的一種基因或者酶可以被失調(diào)。此外，可以失調(diào)調(diào)節(jié)基因或者蛋白質(zhì)。
在多種實施方案中，可以增加基因的表達(dá)以增加該基因編碼的蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)活性或濃度，從而最終提高所希望的氨基酸的產(chǎn)量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用多種技術(shù)實現(xiàn)所希望的結(jié)果。例如，技術(shù)人員可以增加一種或多種基因的拷貝數(shù)、使用強(qiáng)啟動子，和/或使用編碼具有高活性的對應(yīng)酶的基因或等位基因。使用本發(fā)明的方法，例如，特定基因的過表達(dá)、相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性或濃度可以基于起始活性或濃度增加至少約10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％或2000％。
在多種實施方案中，失調(diào)的基因可以包括，但不限于，至少一種下面的基因或蛋白質(zhì)·ask基因，其編碼抗反饋天冬氨酸激酶(如國際公布號WO2004069996中公開)；·dapA基因，其編碼二氫吡啶二羧酸合酶(如在國際公布號WO200100843中分別在SEQ ID NOs55和56中公開)；·asd基因，其編碼天冬氨酸半醛脫氫酶(如在歐洲公布號1108790中分別在SEQ ID NOs3435和6935中公開)；·dapB基因，其編碼二氫吡啶二羧酸還原酶(如在國際公布號WO200100843中分別在SEQ ID NOs35和36中公開)；·ddh基因，其編碼二氨基庚二酸脫氫酶(如在歐洲公布號1108790中分別在SEQ ID NOs3444和6944中公開)；·lysA基因，其編碼二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶(如在歐洲公布號1108790中分別在SEQ ID NOs3451和6951中公開)；·lysE基因，其編碼賴氨酸輸出蛋白(如在歐洲公布號1108790中分別在SEQ ID NOs3455和6955中公開)；·pycA基因，其編碼丙酮酸羧化酶(如在歐洲公布號1108790中分別在SEQ ID NOs765和4265中公開)；·zwf基因，其編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(如在國際公布號WO200100844中分別在SEQ ID NOs243和244中公開)；·pepCL基因，其編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(如在歐洲公布號1108790中分別在SEQ ID NOs3470和6970中公開)；·gap基因，其編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶(如在國際公布號WO200100844中分別在SEQ ID NOs67和68中公開)；·zwa1基因，其編碼RPF蛋白質(zhì)前體(如在歐洲公布號1108790中分別在SEQ ID NOs917和4417中公開)；·tkt基因，其編碼轉(zhuǎn)酮酶(如在國際公布號WO200100844中分別在SEQ ID NOs247和248中公開)；·tad基因，其編碼轉(zhuǎn)醛酶(如在國際公布號WO200100844中分別在SEQ ID NOs245和246中公開)；·mqo基因，其編碼menaquinine氧化還原酶(如在國際公布號WO200100844中分別在SEQ ID NOs569和570中公開)；·tpi基因，其編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶(如在國際公布號WO200100844中分別在SEQ ID NOs61和62中公開)；·pgk基因，其編碼3-磷酸甘油酸激酶(如在國際公布號WO200100844中分別在SEQ ID NOs69和70中公開)；和·sigC基因，其編碼RNA-聚合酶σ因子sigC(如在歐洲公布號1108790中分別在SEQ ID NOs284和3784中公開)。
在特定實施方案中，可以過表達(dá)所述基因和/或增加所述蛋白質(zhì)的活性。
備選地，在其他實施方案中，可以減弱、減小或者抑制基因的表達(dá)以便減小，例如，消除該基因編碼的蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)活性或濃度，從而最終提高所希望的氨基酸的產(chǎn)量。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用弱啟動子。備選地或者組合地，技術(shù)人員可以使用編碼具有低活性的對應(yīng)酶的基因或者等位基因或者失活對應(yīng)的基因或者酶。使用本發(fā)明的方法，可以將對應(yīng)蛋白質(zhì)的活性或者濃度減小到野生型蛋白質(zhì)的活性或濃度的約0到50％、0到25％、0到10％、0到9％、0到8％、0到7％、0到6％、0到5％、0到4％、0到3％、0到2％或0到1％。
在某些實施方案中，失調(diào)的基因可以包括，但不限于，至少一種下面的基因或者蛋白質(zhì)·pepCK基因，其編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(如在國際公布號WO200100844中分別在SEQ ID NOs179和180中公開)；·malE基因，其編碼蘋果酸酶(如在歐洲公布號1108790中分別在SEQID NOs3328和6828中公開)；·glgA基因，其編碼糖原合酶(如在歐洲公布號1108790中分別在SEQID NOs1239和4739中公開)；·pgi基因，其編碼葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(如在國際公布號WO200100844中分別在SEQ ID NOs41和42中公開)；·dead基因，其編碼依賴ATP的RNA解旋酶(如在歐洲公布號1108790中分別在SEQ ID NOs1278和4778中公開)；·menE基因，其編碼鄰-琥珀?；郊姿?CoA連接酶(如在歐洲公布號1108790中分別在SEQ ID NOs505和4005中公開)；·citE基因，其編碼檸檬酸裂合酶β鏈(如在國際公布號WO200100844中分別在SEQ ID NOs547和548中公開)；·mikE17基因，其編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物(如在歐洲公布號1108790中分別在SEQ ID NOs411和3911中公開)；·poxB基因，其編碼丙酮酸脫氫酶(如在國際公布號WO200100844中分別在SEQ ID NOs85和86中公開)；·zwa2基因，其編碼RPF蛋白質(zhì)前體(在歐洲公布號1106693中公開)；和·sucC基因，其編碼琥珀酰輔酶A合成酶(如在歐洲公布號1103611中公開)。
在特定實施方案中，可以減弱、減小或者抑制所述基因和/或減小所述蛋白質(zhì)的活性。
術(shù)語“操作的微生物”包括已經(jīng)工程化(例如，基因工程化)或者修飾從而導(dǎo)致代謝途徑的破壞或者改變以導(dǎo)致碳代謝的改變的微生物。當(dāng)酶在代謝工程化的細(xì)胞中以比它在相當(dāng)?shù)囊吧图?xì)胞中表達(dá)的水平更高的水平表達(dá)時，該酶在代謝工程化的細(xì)胞中“過表達(dá)”。對于本發(fā)明，在不內(nèi)源表達(dá)特定酶的細(xì)胞中，認(rèn)為該酶在該細(xì)胞中的任何水平的表達(dá)都是該酶的“過表達(dá)”。過表達(dá)可以導(dǎo)致該基因所編碼的蛋白質(zhì)，例如，果糖-1，6-二磷酸酶的增加的活性。
此類微生物的修飾或者工程化可以根據(jù)本文描述的任意方法，包括但不限于，生物合成途徑的失調(diào)和/或至少一種生物合成酶的過表達(dá)。“經(jīng)操作的”酶(例如，“經(jīng)操作的”生物合成酶)包括這樣的酶，其表達(dá)或者產(chǎn)生已經(jīng)受到改變或者修飾從而例如與對應(yīng)的野生型或者天然發(fā)生的酶相比，該酶的至少一種上游或下游前體、底物或者產(chǎn)物受到改變或修飾，例如，具有增加的活性。
術(shù)語“過表達(dá)的”或者“過表達(dá)”包括基因產(chǎn)物(例如，戊糖磷酸生物合成酶)以高于微生物的操作前或者沒有操作的相當(dāng)?shù)奈⑸镏性摶虍a(chǎn)物的表達(dá)水平的水平表達(dá)。在一個實施方案中，可以基因操作(例如，基因工程化)微生物以過表達(dá)一定水平的基因產(chǎn)物，該水平高于微生物的操作前或者沒有操作的相當(dāng)?shù)奈⑸镏性摶虍a(chǎn)物的表達(dá)水平?；虿僮骺梢园ǎ幌抻?，改變或者修飾與特定基因的表達(dá)相關(guān)的調(diào)節(jié)序列或者位點(例如，通過加入強(qiáng)啟動子、誘導(dǎo)型啟動子或者多個啟動子或者通過除去調(diào)節(jié)序列從而表達(dá)是組成型的)，修飾特定基因的染色體位置，改變與特定基因相鄰的核酸序列，如核糖體結(jié)合位點或者轉(zhuǎn)錄終止子，增加特定基因的拷貝數(shù)，修飾涉及特定基因的轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物的翻譯的蛋白質(zhì)(例如，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、抑制子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄激活因子等等)，或者本領(lǐng)域常規(guī)的失調(diào)特定基因的表達(dá)的任何其他常規(guī)方法(包括但不限于使用反義核酸分子，例如，阻斷抑制蛋白質(zhì)的表達(dá))。
在另一實施方案中，可以在身體上或者環(huán)境上操作微生物以過表達(dá)一定水平的基因產(chǎn)物，所述水平高于微生物的操作前或者沒有操作的相當(dāng)?shù)奈⑸镏性摶虍a(chǎn)物的表達(dá)水平。例如，可以將微生物用已知或者懷疑增加特定基因的轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物的翻譯的試劑處理或者在該試劑存在下培養(yǎng)，從而增強(qiáng)或者增加轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。備選地，可以將微生物在選擇用來增加特定基因的轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物的翻譯的溫度下培養(yǎng)，從而增強(qiáng)或者增加轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
術(shù)語“失調(diào)的”或者“失調(diào)”包括改變或者修飾微生物中編碼生物合成途徑中一種酶的至少一種基因，從而該微生物中所述生物合成酶的水平或者活性受到改變或者修飾。優(yōu)選地，改變或者修飾編碼生物合成途徑中一種酶的至少一種基因從而基因產(chǎn)物受到增強(qiáng)或增加，從而增強(qiáng)或增加基因產(chǎn)物的活性。短語“失調(diào)的途徑”還可以包括生物合成途徑，其中編碼生物合成途徑中一種酶的一種以上的基因受到改變或者修飾從而一種以上的生物合成酶的水平或者活性受到改變或者修飾。“失調(diào)”微生物中途徑的能力(例如，同時失調(diào)生物合成途徑中一種以上的基因)由微生物的特定現(xiàn)象引起，其中一種以上的酶(例如，兩種或三種生物合成酶)由稱作“操縱子”的遺傳物質(zhì)的連續(xù)片段上相互相鄰的基因編碼。
術(shù)語“操縱子”包括基因表達(dá)的協(xié)調(diào)單位，其含有啟動子和可能地調(diào)節(jié)元件，該調(diào)節(jié)元件與一種或多種，優(yōu)選至少兩種結(jié)構(gòu)基因(例如，編碼酶，例如生物合成酶的基因)結(jié)合。結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)可以例如，通過結(jié)合調(diào)節(jié)元件的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)或者通過轉(zhuǎn)錄的抗終止來協(xié)調(diào)地調(diào)節(jié)?？梢赞D(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)基因得到編碼所有結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的單個mRNA。由于包括在操縱子中基因的協(xié)同調(diào)節(jié)，所以單個啟動子和/或調(diào)節(jié)元件的改變或修飾可以導(dǎo)致操縱子編碼的每種基因產(chǎn)物的改變或修飾。調(diào)節(jié)元件的改變或修飾可以包括，但不限于除去內(nèi)源啟動子和/或調(diào)節(jié)元件，加入強(qiáng)啟動子、誘導(dǎo)型啟動子或者多個啟動子或者除去調(diào)節(jié)序列，從而基因產(chǎn)物的表達(dá)受到修飾，修飾操縱子的染色體位置，改變與操縱子相鄰或者操縱子內(nèi)的核酸序列，如核糖體結(jié)合位點，增加操縱子的拷貝數(shù)，修飾參與操縱子轉(zhuǎn)錄和/或操縱子的基因產(chǎn)物翻譯的蛋白質(zhì)(例如，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、抑制子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄激活因子等等)，或者本領(lǐng)域常規(guī)的失調(diào)基因表達(dá)的任何其他常規(guī)方法(包括但不限于使用反義核酸分子，例如，阻斷抑制蛋白質(zhì)的表達(dá))。失調(diào)還可以包括改變一種或多種基因的編碼區(qū)以產(chǎn)生例如，抗反饋或者具有更高或更低比活性的酶。
本發(fā)明的特別優(yōu)選的“重組”微生物已經(jīng)遺傳工程化以過表達(dá)細(xì)菌來源的基因或者基因產(chǎn)物。術(shù)語“細(xì)菌來源的”或者“來自”例如細(xì)菌，包括在細(xì)菌中天然發(fā)現(xiàn)的基因或者細(xì)菌基因編碼的基因產(chǎn)物(例如，由果糖-1，6-二磷酸酶編碼)。
本發(fā)明的方法學(xué)還描述了過表達(dá)一種或多種基因，例如，果糖-1，6-二磷酸酶基因或者增加或增強(qiáng)果糖-1，6-二磷酸酶活性的重組微生物。本發(fā)明的特別優(yōu)選的重組微生物(例如，谷氨酸棒桿菌、Corynebacteriumacetoglutamicum，嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、和Corvnebacterium thermoaminogenes)已經(jīng)經(jīng)基因工程化來過表達(dá)生物合成酶(例如，果糖-1，6-二磷酸酶，SEQ ID NO2的氨基酸序列，或者由SEQID NO1的核酸序列編碼)。
本發(fā)明的其他優(yōu)選的“重組”微生物具有在戊糖磷酸途徑中失調(diào)的酶。短語“具有失調(diào)的戊糖磷酸途徑的微生物”包括在編碼戊糖磷酸途徑的酶的至少一種基因中具有改變或修飾或者在包括編碼戊糖磷酸途徑的酶的至少一種基因的操縱子中具有改變或修飾的微生物。優(yōu)選的“具有失調(diào)的戊糖磷酸途徑的微生物”已經(jīng)經(jīng)基因工程化來過表達(dá)棒桿菌(例如，谷氨酸棒桿菌)生物合成酶(例如，已經(jīng)工程化來過表達(dá)果糖-1，6-二磷酸酶)。
在另一優(yōu)選實施方案中，設(shè)計或工程化重組微生物從而過表達(dá)或者失調(diào)一種或多種戊糖磷酸生物合成酶。
在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的微生物過表達(dá)或者突變來自細(xì)菌的基因或者生物合成酶(例如，戊糖磷酸生物合成酶)。術(shù)語“細(xì)菌來源的“或者”來自”例如細(xì)菌包括細(xì)菌基因編碼的基因產(chǎn)物(例如，果糖-1，6-二磷酸酶)。
在一個實施方案中，本發(fā)明的重組微生物是革蘭氏陽性生物(例如，由于微生物周圍存在革蘭氏陽性細(xì)胞壁而保留堿性染料，例如，結(jié)晶紫的微生物)。在優(yōu)選實施方案中，重組微生物是屬于選自芽孢桿菌屬(Bacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒桿菌屬(Cornyebacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococci)和鏈霉菌屬(Streptomyces)的屬。在更優(yōu)選的實施方案中，重組微生物是棒桿菌屬。在另一優(yōu)選的實施方案中，重組微生物選自谷氨酸棒桿菌、嗜乙酰乙酸棒桿菌、Corynebacteriumacetoacidophilum或Corynebacterium thermoaminogenes。在尤其優(yōu)選的實施方案中，重組微生物是谷氨酸棒桿菌。
本發(fā)明的一個重要方面涉及培養(yǎng)本文描述的重組微生物，從而產(chǎn)生所希望的化合物(例如，所希望的精細(xì)化學(xué)品)。術(shù)語“培養(yǎng)”包括保持和/或生長本發(fā)明的活的微生物(例如，保持和/或生長培養(yǎng)物或者菌株)。在一個實施方案中，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。在另一實施方案中，在固體培養(yǎng)基或者半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。在優(yōu)選實施方案中，在包含對微生物的保持和/或培養(yǎng)必需或者有益的培養(yǎng)基(例如，無菌的、液體培養(yǎng)基)中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物?？梢允褂玫奶荚窗ㄌ呛吞妓衔?，例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉和纖維素，油和脂肪，如大豆油、向日葵油、花生油和椰子油，脂肪酸，如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸，醇，例如甘油和乙醇，和有機(jī)酸，如乙酸。在優(yōu)選實施方案中，為果糖或蔗糖。這些物質(zhì)可以單獨使用或者作為混合物使用。
可以使用的氮源包含含氮的有機(jī)化合物，如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麥芽膏、玉米漿、大豆粉和尿素或者無機(jī)化合物，如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。氮源可以單獨或者作為混合物使用?？梢允褂玫牧自词橇姿?、磷酸二氫鉀、或者磷酸氫二鉀或者對應(yīng)的含鈉鹽。培養(yǎng)基必須還含有生長必需的金屬鹽，如硫酸鎂或者硫酸鐵。最后，除了上面陳述的物質(zhì)，還可以使用必需的生長促進(jìn)物質(zhì)，如氨基酸和維生素。還可以向培養(yǎng)基中加入適宜的前體。所陳述的飼料物質(zhì)可以作為一批加入培養(yǎng)物或者在培養(yǎng)期間適當(dāng)加入。
優(yōu)選地，在受控的pH下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。術(shù)語“受控的pH”包括導(dǎo)致產(chǎn)生所希望的精細(xì)化學(xué)品，如賴氨酸的任意pH。在一個實施方案中，在約7的pH培養(yǎng)微生物。在另一實施方案中，在6.0到8.5的pH培養(yǎng)微生物?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意多種方法保持所希望的pH。例如，堿性化合物，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或者氨水，或者酸性化合物，如磷酸或硫酸可以用于適當(dāng)控制培養(yǎng)物的pH。
還適宜地，在受控的通氣下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。術(shù)語“受控的通氣”包括足夠的通氣(例如，氧氣)以導(dǎo)致產(chǎn)生所希望的精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸。在一個實施方案中，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)物中氧氣水平，例如，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中溶解氧的量來控制通氣。優(yōu)選地，通過攪拌培養(yǎng)物控制培養(yǎng)物的通氣。通過螺旋槳或者類似的機(jī)械攪拌設(shè)備，通過旋轉(zhuǎn)或者搖動生長容器(例如，發(fā)酵罐)或者通過多種泵動設(shè)備來提供攪拌?？梢酝ㄟ^培養(yǎng)基(例如，通過發(fā)酵混合物)通入無菌空氣或者氧氣進(jìn)一步控制通氣。還優(yōu)選地，在沒有過多泡沫形成的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物(例如，通過加入消泡劑，如脂肪酸聚乙二醇酯)。
此外，可以在受控的溫度下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。術(shù)語“受控的溫度”包括導(dǎo)致產(chǎn)生所希望的精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸的任意溫度。在一個實施方案中，受控的溫度包括15℃到95℃的溫度。在另一實施方案中，受控的溫度包括15℃到70℃的溫度。優(yōu)選的溫度為20℃到55℃，更優(yōu)選30℃到45℃或者30℃到50℃。
可以在液體培養(yǎng)基中并且優(yōu)選連續(xù)或者間歇地通過常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)(保持和/或生長)微生物，所述方法為諸如靜止培養(yǎng)、試管培養(yǎng)、搖動培養(yǎng)(例如，旋轉(zhuǎn)搖動培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)等等)、通氣旋動培養(yǎng)，或者發(fā)酵。在優(yōu)選實施方案中，在搖瓶中培養(yǎng)微生物。在更優(yōu)選的實施方案中，在發(fā)酵罐中培養(yǎng)微生物(例如，發(fā)酵方法)。本發(fā)明的發(fā)酵方法包括，但不限于分批、補料分批和連續(xù)發(fā)酵方法。短語“分批方法”或者“分批發(fā)酵”指封閉系統(tǒng)，其中在發(fā)酵開始時設(shè)置培養(yǎng)基、營養(yǎng)物、補充添加劑等等的組成并且在發(fā)酵期間它們不改變，然而，可以控制諸如pH和氧濃度的因素以防止過度培養(yǎng)基酸化和/或微生物死亡。短語“補料分批方法”或者“補料分批”發(fā)酵指分批發(fā)酵，只是隨著發(fā)酵的進(jìn)行加入(例如，以增量加入或者連續(xù)加入)一種或多種底物。短語“連續(xù)方法”或者“連續(xù)發(fā)酵”指一種系統(tǒng)，其中向發(fā)酵罐連續(xù)加入確定的發(fā)酵培養(yǎng)基并同時除去等量使用的或者“條件”培養(yǎng)基以回收所希望的精細(xì)化學(xué)品，如賴氨酸。已經(jīng)研發(fā)了多種此類方法并且它們是本領(lǐng)域公知的。
短語“在一定條件下培養(yǎng)從而產(chǎn)生所希望的精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸”包括在適于或者足夠得到產(chǎn)生所希望的精細(xì)化學(xué)品或者得到所產(chǎn)生的特定精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸的目的產(chǎn)量的條件(例如，溫度、壓力、pH、持續(xù)時間等等)下保持和/或生長微生物。例如，培養(yǎng)持續(xù)一定時間以產(chǎn)生所希望量的精細(xì)化學(xué)品(例如，賴氨酸)。優(yōu)選地，培養(yǎng)持續(xù)一定時間以足夠基本上達(dá)到該精細(xì)化學(xué)品的最大產(chǎn)量。在一個實施方案中，培養(yǎng)持續(xù)約12到24小時。在另一實施方案中，培養(yǎng)持續(xù)約24到36小時，36到48小時，48到72小時，72到96小時，96到120小時，120到144小時，或者大于144小時。在另一實施方案中，培養(yǎng)持續(xù)足夠達(dá)到精細(xì)化學(xué)品的生產(chǎn)產(chǎn)量的時間，例如，培養(yǎng)細(xì)胞使得產(chǎn)生至少約15到20g/L精細(xì)化學(xué)品，產(chǎn)生至少約20到25g/L精細(xì)化學(xué)品，產(chǎn)生至少約25到30g/L精細(xì)化學(xué)品，產(chǎn)生至少約30到35g/L精細(xì)化學(xué)品，產(chǎn)生至少約35到40g/L精細(xì)化學(xué)品，產(chǎn)生至少約40到50g/L精細(xì)化學(xué)品，產(chǎn)生至少約50到60g/L精細(xì)化學(xué)品，產(chǎn)生至少約60到70g/L精細(xì)化學(xué)品，產(chǎn)生至少約70到80g/L精細(xì)化學(xué)品，產(chǎn)生至少約80到90g/L精細(xì)化學(xué)品，產(chǎn)生至少約90到100g/L精細(xì)化學(xué)品，產(chǎn)生至少約100到110g/L精細(xì)化學(xué)品，產(chǎn)生至少約110到120g/L精細(xì)化學(xué)品，產(chǎn)生至少約120到130g/L精細(xì)化學(xué)品，產(chǎn)生至少約130到140g/L精細(xì)化學(xué)品，或產(chǎn)生至少約140到160g/L精細(xì)化學(xué)品。在再一個實施方案中，在一定條件下培養(yǎng)微生物使得在約24小時、約36小時、約40小時、約48小時、約72小時、約96小時、約108小時、約122小時、或約144小時內(nèi)產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的優(yōu)選的產(chǎn)率，例如，上面給出的范圍內(nèi)的產(chǎn)率。
本發(fā)明的方法學(xué)可以還包括回收所希望的精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸的步驟。術(shù)語“回收”所希望的精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸包括從培養(yǎng)基提取、收獲、分離或者純化所述化合物。可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的任意常規(guī)分離或者純化方法回收化合物，所述方法包括，但不限于，用常規(guī)樹脂(例如，陰離子或者陽離子交換樹脂、非離子吸附樹脂，等等)處理，用常規(guī)吸附劑(例如，活性炭、硅酸、硅膠、纖維素、礬土，等等)處理、改變pH、溶劑萃取(例如，用常規(guī)溶劑，如醇、乙酸乙酯、己烷等等)、透析、過濾、濃縮、結(jié)晶、重結(jié)晶、pH調(diào)節(jié)、凍干等等。例如，可以通過首先從培養(yǎng)物除去微生物從培養(yǎng)基回收精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸。然后將培養(yǎng)基穿過陽離子交換樹脂以除去不想要的陽離子，然后通過陰離子交換樹脂以除去不想要的有機(jī)陰離子和比目的精細(xì)化學(xué)品(例如，賴氨酸)具有更強(qiáng)酸性的有機(jī)酸。
優(yōu)選地，本發(fā)明的所希望的精細(xì)化學(xué)品是“提取的”、“分離的”或者“純化的”從而所得制備物基本上沒有其他組分(例如，沒有培養(yǎng)基組分和/或發(fā)酵副產(chǎn)物)。術(shù)語“基本上沒有其他組分”包括所希望的化合物的制備物，其中所述化合物與產(chǎn)生該化合物的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基組分或者副產(chǎn)物分離(例如，純化或者部分純化)。
在一個實施方案中，所述制備物具有大于約80％(按干重計)所希望的化合物(例如，小于約20％其他培養(yǎng)基組分或者發(fā)酵副產(chǎn)物)，更優(yōu)選地大于約90％所希望的化合物(例如，小于約10％其他培養(yǎng)基組分或者發(fā)酵副產(chǎn)物)，更優(yōu)選地大于約95％所希望的化合物(例如，小于約5％其他培養(yǎng)基組分或者發(fā)酵副產(chǎn)物)，最優(yōu)選地大于約98-99％所希望的化合物(例如，小于約1-2％其他培養(yǎng)基組分或者發(fā)酵副產(chǎn)物)。
在備選方法中，例如，當(dāng)微生物是生物學(xué)上無害(例如，安全)的時，不從微生物純化所希望的精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸。例如，完整培養(yǎng)物(或者培養(yǎng)上清液)可以用作產(chǎn)物來源(例如，粗產(chǎn)物)。在一個實施方案中，不加修飾地使用培養(yǎng)物(或者培養(yǎng)上清液)。在另一實施方案中濃縮培養(yǎng)物(或培養(yǎng)上清液)。在再一個實施方案中，干燥或者凍干培養(yǎng)物(或培養(yǎng)上清液)。
II.獨立于前體喂飼要求產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的方法取決于所操作的生物合成酶或者生物合成酶的組合，可能希望或者必須對本發(fā)明的微生物提供(例如，喂飼)至少一種戊糖磷酸途徑生物合成前體從而產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸。術(shù)語“戊糖磷酸途徑生物合成前體”或者“前體”包括試劑或者化合物，其當(dāng)提供給或者接觸微生物或者包括在微生物的培養(yǎng)基中時用于增強(qiáng)或者增加戊糖磷酸生物合成。在一個實施方案中，戊糖磷酸途徑生物合成前體或者前體是葡萄糖。在另一實施方案中，戊糖磷酸途徑生物合成前體是果糖。所加的葡萄糖或者果糖的量優(yōu)選是導(dǎo)致培養(yǎng)基中足夠增強(qiáng)微生物的生產(chǎn)力的濃度(例如，足夠增強(qiáng)精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸的濃度)的量。本發(fā)明的戊糖磷酸生物合成前體可以以濃縮的溶液或者懸浮液(例如，在適宜的溶劑，如水或者緩沖液中)的形式或者固體形式(例如，粉末形式)加入。此外，本發(fā)明的戊糖磷酸生物合成前體可以在給定時間期間內(nèi)作為一個等分試樣、連續(xù)或者間歇地加入。
例如，當(dāng)本發(fā)明的方法學(xué)用于產(chǎn)生高產(chǎn)率的精細(xì)化學(xué)品時，在本發(fā)明的戊糖磷酸生物合成方法學(xué)中提供戊糖磷酸生物合成前體導(dǎo)致高成本。因此，本發(fā)明的優(yōu)選方法學(xué)描述了這樣的微生物，它的至少一種生物合成酶或者生物合成酶的組合(例如，至少一種戊糖磷酸生物合成酶)受到操作從而以獨立于前體飼料的方式產(chǎn)生賴氨酸或者其他所希望的精細(xì)化學(xué)品。短語“獨立于前體飼料的方式”例如當(dāng)涉及產(chǎn)生所希望的化合物的方法時包括產(chǎn)生所希望的化合物的方法或者方式，其不取決或者依賴于提供(例如，喂飼)給用于產(chǎn)生所希望的化合物的微生物的前體。例如，本發(fā)明方法學(xué)中描述的微生物可以用于以不需要喂飼前體葡萄糖或者果糖的方式產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品。
本發(fā)明的備選優(yōu)選方法學(xué)描述了這樣的微生物，它的至少一種生物合成酶或者生物合成酶的組合受到操作從而以基本上獨立于前體飼料的方式產(chǎn)生L-賴氨酸或者其他精細(xì)化學(xué)品。短語“基本上獨立于前體飼料的方式”包括產(chǎn)生所希望的化合物的方法，其較低程度地取決于或者依賴于對被利用的微生物提供(例如，喂飼)的前體。例如，本發(fā)明方法學(xué)中描述的微生物可以用于以實質(zhì)性減小量的前體葡萄糖或者果糖的方式產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品。
以獨立于前體飼料或者備選地，以基本上獨立于前體飼料的方式產(chǎn)生所希望的精細(xì)化學(xué)品的優(yōu)選方法包括培養(yǎng)微生物，該微生物已經(jīng)受到操作(例如，設(shè)計的或者工程化的，例如，基因工程化的)從而至少一種戊糖磷酸生物合成酶的表達(dá)受到修飾。例如，在一個實施方案中，操作(例如，設(shè)計或者工程化)微生物使得至少一種戊糖磷酸生物合成酶的產(chǎn)生失調(diào)。在優(yōu)選實施方案中，操作(例如，設(shè)計或者工程化)微生物使得它具有失調(diào)的生物合成途徑，例如，如本文定義的失調(diào)的戊糖磷酸生物合成途徑。在另一優(yōu)選實施方案中，操作(例如，設(shè)計或者工程化)微生物使得過表達(dá)至少一種戊糖磷酸生物合成酶，例如，果糖-1，6-二磷酸酶。
III.高產(chǎn)率生產(chǎn)方法本發(fā)明的尤其優(yōu)選的實施方案是用于產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸的高產(chǎn)率生產(chǎn)方法，其包括在一定條件下培養(yǎng)所操作的微生物使得以顯著高產(chǎn)率產(chǎn)生賴氨酸。術(shù)語“高產(chǎn)率生產(chǎn)方法”例如，用于產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸的高產(chǎn)率生產(chǎn)方法包括導(dǎo)致以升高或者高于相當(dāng)?shù)纳a(chǎn)方法的通常水平的水平產(chǎn)生所希望的精細(xì)化學(xué)品。優(yōu)選地，高產(chǎn)率生產(chǎn)方法導(dǎo)致以顯著高產(chǎn)率產(chǎn)生所希望的化合物。短語“顯著高產(chǎn)率”包括生產(chǎn)水平或者產(chǎn)率，其足夠升高或者高于相當(dāng)?shù)纳a(chǎn)方法通常的水平，例如，升高到足夠商業(yè)化生產(chǎn)所希望的產(chǎn)物(例如，以商業(yè)上可行的成本產(chǎn)生產(chǎn)物)的水平。在一個實施方案中，本發(fā)明描述了產(chǎn)生賴氨酸的高產(chǎn)率生產(chǎn)方法，其包括在一定條件下培養(yǎng)受到操作的微生物使得以大于2g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L、150g/L、160g/L、170g/L、180g/L、190g/L、或200g/L的水平產(chǎn)生賴氨酸。
本發(fā)明還描述了產(chǎn)生所希望的精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸的高產(chǎn)率生產(chǎn)方法，其包括在一定條件下培養(yǎng)所操作的微生物使得在商業(yè)上希望的時間期限內(nèi)產(chǎn)生足夠升高水平的化合物。在代表性實施方案中，本發(fā)明描述了產(chǎn)生賴氨酸的高產(chǎn)率生產(chǎn)方法，其包括在一定條件下培養(yǎng)所操作的微生物使得在5小時內(nèi)以大于15-20g/L的水平產(chǎn)生賴氨酸。在另一實施方案中，本發(fā)明描述了產(chǎn)生賴氨酸的高產(chǎn)率生產(chǎn)方法，其包括在一定條件下培養(yǎng)所操作的微生物使得在10小時內(nèi)以大于25-40g/L的水平產(chǎn)生賴氨酸。在另一實施方案中，本發(fā)明描述了產(chǎn)生賴氨酸的高產(chǎn)率生產(chǎn)方法，其包括在一定條件下培養(yǎng)所操作的微生物使得在20小時內(nèi)以大于50-100g/L的水平產(chǎn)生賴氨酸。在另一實施方案中，本發(fā)明描述了產(chǎn)生賴氨酸的高產(chǎn)率生產(chǎn)方法，其包括在一定條件下培養(yǎng)所操作的微生物使得在40小時內(nèi)以大于140-160g/L，例如大于150g/L的水平產(chǎn)生賴氨酸。在另一實施方案中，本發(fā)明描述了產(chǎn)生賴氨酸的高產(chǎn)率生產(chǎn)方法，其包括在一定條件下培養(yǎng)所操作的微生物使得在40小時內(nèi)以大于130-160g/L，例如，40小時內(nèi)大于135、145或150g/L的水平產(chǎn)生賴氨酸。所包括的值和范圍和/或本文所給出的范圍內(nèi)的中間值也意在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，在40小時內(nèi)至少140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、和150g/L的水平的賴氨酸生產(chǎn)意在包括在40小時內(nèi)140-150g/L的范圍內(nèi)。在另一實例中，140-145g/L或145-150g/L的范圍意在包括在40小時內(nèi)140-150g/L的范圍內(nèi)。此外，技術(shù)人員將明白培養(yǎng)所操作的微生物以實現(xiàn)例如，“40小時內(nèi)140-150g/L”的生產(chǎn)水平包括培養(yǎng)該微生物額外的時間期限(例如，長于40小時的時間期限)，任選導(dǎo)致甚至更高產(chǎn)率的所產(chǎn)生的賴氨酸。
IV.分離的核酸分子和基因本發(fā)明的另一方面描述了用于本發(fā)明方法的分離的核酸分子，其編碼蛋白質(zhì)(例如，谷氨酸棒桿菌蛋白質(zhì))，例如，棒桿菌戊糖磷酸生物合成酶(例如，谷氨酸棒桿菌戊糖磷酸酶)。在一個實施方案中，用于本發(fā)明方法的分離的核酸分子是果糖-1，6-二磷酸酶核酸分子。
術(shù)語“核酸分子”包括DNA分子(例如，線性、環(huán)狀、cDNA或者染色體DNA)和RNA分子(例如，tRNA、rRNA、mRNA)和使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或者RNA的類似物。核酸分子可以是單鏈或者雙鏈的，但是優(yōu)選雙鏈DNA。術(shù)語“分離的”核酸分子包括這樣的核酸分子，其沒有該核酸所來源的生物的染色體DNA中天然處于該核酸分子側(cè)翼的序列(即，位于該核酸分子的5’和3’末端的序列)。在多種實施方案中，所分離的核酸分子可以含有該核酸所來源的生物的染色體DNA中天然處于該核酸分子側(cè)翼的核苷酸序列的小于約10kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、0.1kb、50bp、25bp或10bp。此外，“分離的”核酸分子，如cDNA分子當(dāng)通過重組技術(shù)產(chǎn)生時可以基本上沒有其他細(xì)胞物質(zhì)，或者當(dāng)化學(xué)合成時基本上沒有化學(xué)前體或者其他化學(xué)品。
本文所用術(shù)語“基因”包括核酸分子(例如，DNA分子或者其節(jié)段)，例如，編碼蛋白質(zhì)或者RNA的核酸分子，所述核酸分子在生物中通過基因間DNA(即，間插DNA或者間隔DNA，其天然位于該生物的染色體DNA中該基因的側(cè)翼和/或分離基因)與另一個基因或者其他基因分開?；蚩梢灾苯雍铣擅富蛘咂渌鞍踪|(zhì)分子(例如，可以包含編碼序列，例如，編碼蛋白質(zhì)的鄰接的可讀框(ORF))或者它可以自身在生物中是有功能的。生物中的基因可以在如本文定義的操縱子中聚簇，所述操縱子通過基因間DNA與其他基因和/或操縱子分開。操縱子中所含單個基因可以重疊，所述個體基因之間沒有基因間DNA。本文所用的“分離的基因”包括這樣的基因，其基本上沒有該基因所來源的生物的染色體DNA中該基因天然側(cè)翼的序列(即，沒有編碼另一種或者不同的蛋白質(zhì)或者RNA分子的相鄰編碼序列、相鄰結(jié)構(gòu)序列等等)，分離的基因任選包括5’和3’調(diào)節(jié)序列，例如，啟動子序列和/或終止子序列。在一個實施方案中，分離的基因包括蛋白質(zhì)的主要編碼序列(例如，編碼棒桿菌蛋白質(zhì)的序列)。在另一實施方案中，所分離的基因包括蛋白質(zhì)的編碼序列(例如，編碼棒桿菌蛋白質(zhì))和來自該基因所來源的生物的染色體DNA的相鄰5’和/或3’調(diào)節(jié)序列(例如，相鄰的5’和/或3’棒桿菌調(diào)節(jié)序列)。優(yōu)選地，分離的基因含有該基因所來源的生物的染色體DNA中該基因天然側(cè)翼的核苷酸序列的小于約10kb、5kb、2kb、1kb、0.5kb、0.2kb、0.1kb、50bp、25bp或10bp。
在一方面，本發(fā)明的方法描述了所分離的果糖-1，6-二磷酸酶核酸序列或者基因的用途。
在優(yōu)選實施方案中，所述核酸或者基因來自芽孢桿菌(例如，為棒桿菌來源的)。術(shù)語“來自棒桿菌”或者“棒桿菌來源的”包括在棒桿菌屬的微生物中天然發(fā)現(xiàn)的核酸或者基因。優(yōu)選地，所述核酸或者基因來自選自谷氨酸棒桿菌(Cornynebacterium glutamicium)、Corynebacteriumacetoglutamicum、嗜乙酰乙酸棒桿菌或者Corynebacteriumthermoaminogenes的微生物。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述核酸或者基因來自谷氨酸棒桿菌(例如，谷氨酸棒桿菌來源的)。在再一個優(yōu)選的實施方案中，所述核酸或者基因是棒桿菌基因同源物(例如，來自不同于棒桿菌的種但是與本發(fā)明的棒桿菌基因，例如，棒桿菌果糖-1，6-二磷酸酶基因具有顯著同源性)。
本發(fā)明的范圍內(nèi)包括細(xì)菌來源的核酸分子或基因和/或棒桿菌來源的核酸分子或者基因(例如，棒桿菌來源的核酸分子或者基因)，例如，本發(fā)明人鑒定的基因，例如，棒桿菌或者谷氨酸棒桿菌果糖-1，6-二磷酸酶基因。本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括細(xì)菌來源的核酸分子或者基因和/或棒桿菌來源的核酸分子或者基因(例如，谷氨酸棒桿菌來源的核酸分子或者基因)(例如，谷氨酸棒桿菌核酸分子或者基因)，其與天然發(fā)生的細(xì)菌和/或棒桿菌核酸分子或者基因(例如，谷氨酸棒桿菌核酸分子或者基因)不同，例如，這樣的核酸分子或者基因，其核酸發(fā)生替代、插入或者缺失但是編碼與本發(fā)明的天然發(fā)生的基因產(chǎn)物實質(zhì)上相似的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，分離的核酸分子包含SEQ ID NO1中給出的核苷酸序列，或者編碼SEQ ID NO2中給出的氨基酸序列。
在另一實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子包含與SEQ ID NO1給出的核苷酸序列具有至少約60-65％，優(yōu)選至少約70-75％，更優(yōu)選至少約80-85％，甚至更優(yōu)選至少約90-95％或者以上同一性的核苷酸序列。在另一實施方案中，所分離的核酸分子在嚴(yán)格條件下與具有SEQ ID NO1中給出的核苷酸序列的核酸分子雜交。此類嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以見Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。嚴(yán)格(例如，高嚴(yán)格性)雜交條件的非限制性實例是在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中約45℃雜交，然后在0.2X SSC，0.1％SDS中50-65℃下洗滌一次或多次。優(yōu)選地，在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1的序列雜交的本發(fā)明的分離的核酸分子對應(yīng)于天然發(fā)生的核酸分子。本文所用的“天然發(fā)生的”核酸分子指具有自然中發(fā)生的核苷酸序列的RNA或者DNA分子。
可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)和本文提供的序列信息分離本發(fā)明的核酸分子(例如，具有SEQ ID NO1的核苷酸序列的核酸分子)。例如，可以使用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)(例如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.，and Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中描述)或者通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用基于SEQ ID NO1的序列設(shè)計的合成的寡核苷酸引物分離核酸分子?？梢允褂胏DNA、mRNA或者備選地，基因組DNA作為模板和適宜的寡核苷酸引物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增本發(fā)明的核酸。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子包含與SEQ ID NO1中所示核苷酸序列互補的核酸分子。
在另一實施方案中，分離的核酸分子是或者包括果糖-1，6-二磷酸酶基因，或者其部分或片段。在一個實施方案中，分離的果糖-1，6-二磷酸酶核酸分子或者基因包含SEQ ID NO1中給出的核苷酸序列(例如，包含谷氨酸棒桿菌果糖-1，6-二磷酸酶核苷酸序列)。在另一實施方案中，分離的果糖-1，6-二磷酸酶核酸分子或者基因包含編碼SEQ ID NO2中給出的氨基酸序列的核苷酸序列(例如，編碼谷氨酸棒桿菌果糖-1，6-二磷酸酶氨基酸序列)。在再一個實施方案中，分離的果糖-1，6-二磷酸酶核酸分子或者基因編碼具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的果糖-1，6-二磷酸酶蛋白質(zhì)的同源物。本文所用術(shù)語“同源物”包括與本文描述的野生型蛋白質(zhì)或者多肽的氨基酸序列有至少約30-35％，優(yōu)選至少約35-40％，更優(yōu)選至少約40-50％，甚至更優(yōu)選至少約60％、70％、80％、90％或以上同一性并且與所述野生型蛋白質(zhì)或多肽有基本上等同的功能或者生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。例如，果糖-1，6-二磷酸酶同源物與具有SEQ ID NO2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)有至少約30-35％，優(yōu)選至少約35-40％，更優(yōu)選至少約40-50％，甚至更優(yōu)選至少約60％、70％、80％、90％或以上同一性并且與SEQ ID NO2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)有基本上等同(即，是功能等同物)的功能或者生物活性(例如，具有基本上等同的泛酸激酶活性)。在優(yōu)選實施方案中，分離的果糖-1，6-二磷酸酶核酸分子或者基因包含編碼SEQ ID NO2中給出的多肽的核苷酸序列。在另一實施方案中，分離的果糖-1，6-二磷酸酶核酸分子與具有SEQ ID NO1中給出的核苷酸序列的核酸分子的全部或者部分雜交或者與具有編碼具有SEQ ID NOs2的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的核酸分子的全部或者部分雜交。此類雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以見Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel et al.，eds.，John Wiley & Sons，Inc.(1995)，第2，4和6章。額外的嚴(yán)格條件可以見Molecular CloningA Laboratory Manual，Sambrook et al.，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)，第7、9和11章。嚴(yán)格雜交條件的非限制性實例包括在4X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，約65-70℃下雜交(或者在4XSSC加上50％甲酰胺中約42-50℃下雜交)，然后在1XSSC中，約65-70℃下洗滌一次或多次。高嚴(yán)格雜交條件的優(yōu)選的非限制性實例包括在1XSSC中，約65-70℃下雜交(或者在1XSSC加上50％甲酰胺中約42-50℃下雜交)，然后在0.3XSSC中，約65-70℃下洗滌一次或多次。較低嚴(yán)格雜交條件的優(yōu)選的非限制性實例包括在4XSSC中，約50-60℃下雜交(或者備選地在6XSSC加上50％甲酰胺中約40-45℃下雜交)，然后在2XSSC中，約50-60℃下洗滌一次或多次。上面引用值(例如，65-70℃或者42-50℃)的中間范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)。在雜交和洗滌緩沖液中可以用SSPE(1X SSPE為0.15M NaCl，10mM NaH2PO4，和1.25mM EDTA，pH7.4)代替SSC(1X SSC為0.15M NaCl和15mM檸檬酸鈉)，雜交完成后每次洗滌進(jìn)行15分鐘。預(yù)計長度小于50個堿基對的雜合分子的雜交溫度應(yīng)該低于該雜合分子的解鏈溫度(Tm)5-10℃，其中根據(jù)下面的等式確定Tm。對于長度小于18個堿基對的雜合分子，Tm(℃)＝2(A+T堿基數(shù))+4(G+C堿基數(shù))。對于長度為18到49個堿基對的雜合分子，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是雜合分子的堿基數(shù)，[Na+]是雜交緩沖液中鈉離子濃度(1XSSC的[Na+]＝0.165M)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到可以向雜交和/或洗滌緩沖液中加入額外的試劑以減小核酸分子與膜(例如，硝酸纖維素或者尼龍膜)的非特異雜交，所述試劑包括但不限于封閉劑(例如，BSA或者鮭精或鯡精載體DNA)、去污劑(例如，SDS)、螯合劑(例如，EDTA)、Ficoll、PVP等等。當(dāng)使用尼龍膜時，具體地，嚴(yán)格雜交條件的額外優(yōu)選的、非限制性實例是在0.25-0.5M NaH2PO4，7％SDS中65℃下雜交，然后在0.02M NaH2PO4，1％SDS中65℃下洗滌一次或多次，見例如，Church and Gilbert(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA811991-1995，(或備選地，0.2X SSC，1％SDS)。在另一優(yōu)選實施方案中，分離的核酸分子包含與本文給出的果糖-1，6-二磷酸酶核苷酸序列互補的核苷酸序列(例如，為SEQ ID NO1中給出的核苷酸序列的完整互補序列)。
可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)和本文提供的序列信息分離本發(fā)明的核酸分子(例如，果糖-1，6-二磷酸酶核酸分子或基因)。例如，可以使用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)(例如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.，and Maniatis，T.MolecularCloningA Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中描述)或者通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用基于本文給出的果糖-1，6-二磷酸酶核苷酸序列或者其側(cè)翼序列設(shè)計的合成的寡核苷酸引物分離核酸分子?？梢允褂胏DNA、mRNA或者備選地，染色體DNA作為模板和適宜的寡核苷酸引物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增本發(fā)明的核酸(例如，果糖-1，6-二磷酸酶核酸分子或者基因)。
本發(fā)明的再一個實施方案描述了突變的果糖-1，6-二磷酸酶核酸分子或者基因。本文所用短語“突變的核酸分子”或者“突變基因”包括核酸分子或者基因，其核苷酸序列包括至少一個改變(例如，替代、插入、缺失)使得該突變體編碼的多肽或者蛋白質(zhì)顯示出與野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白質(zhì)不同的活性。優(yōu)選地，突變核酸分子或突變基因(例如，突變的果糖-1，6-二磷酸酶基因)編碼的多肽或蛋白質(zhì)與野生型核酸分子或者基因編碼的多肽或者蛋白質(zhì)相比具有增加的活性(例如，具有增加的果糖-1，6-二磷酸酶活性)，例如，當(dāng)在相似條件下測定(例如，用相同溫度下培養(yǎng)的微生物測定)時具有增加的活性。突變基因還可以具有相比野生型多肽的產(chǎn)量增加的水平。
本文所用的“增加的或增強(qiáng)的活性”或者“增加或增強(qiáng)的酶活性”是比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或者蛋白質(zhì)的活性大至少5％，優(yōu)選比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或者蛋白質(zhì)的活性大至少10-25％以上，更優(yōu)選至少25-50％，50-75％或75-100％的活性。上面引用的值的中間范圍，例如，75-85％、85-90％、90-95％也意在被本發(fā)明包括?？梢愿鶕?jù)公認(rèn)的用于測量特定目的蛋白質(zhì)的活性的測定法測定活性?？梢灾苯訙y量或測定活性，例如，測量從細(xì)胞分離或純化的蛋白質(zhì)的活性。備選地，可以測量或測定細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞外培養(yǎng)基中的活性。
技術(shù)人員將明白核酸或者基因序列中甚至單個替代(例如，一個堿基替代，其編碼在對應(yīng)氨基酸序列中改變的氨基酸)也可以顯著影響與對應(yīng)野生型多肽或蛋白質(zhì)相比所編碼的多肽或蛋白質(zhì)的活性。本文定義的突變的核酸或者突變基因(例如，編碼突變多肽或蛋白質(zhì))可容易地與編碼如上述的蛋白質(zhì)同源物的核酸或基因相區(qū)分，因為突變核酸或突變基因編碼具有改變的活性的蛋白質(zhì)或基因，任選地可以觀察到表達(dá)所述突變基因或核酸或者產(chǎn)生所述突變蛋白質(zhì)或多肽的微生物(即，突變微生物)與對應(yīng)的表達(dá)野生型基因或核酸或者產(chǎn)生野生型蛋白質(zhì)或多肽的對應(yīng)微生物相比不同或者相異的表型。相比，蛋白質(zhì)同源物具有相同或基本上相似的活性，任選地當(dāng)在微生物中產(chǎn)生時，與表達(dá)野生型基因或核酸的對應(yīng)微生物相比在表型上是難以識別的。因此，例如，不是核酸分子、基因、蛋白質(zhì)或者多肽之間序列同一性程度用于區(qū)分同源物和突變體，而是所編碼的蛋白質(zhì)或多肽的活性區(qū)分同源物和突變體例如具有低(例如，30-50％序列同一性)序列同一性的同源物仍然具有基本上等同的功能活性，例如，具有99％序列同一性的突變體仍然具有顯著不同或者改變的功能活性。
V.重組核酸分子和載體本發(fā)明還描述了重組核酸分子(例如，重組DNA分子)，其包括本文描述的核酸分子和/或基因(例如，分離的核酸分子和/或基因)，優(yōu)選棒桿菌基因，更優(yōu)選地，谷氨酸棒桿菌基因，甚至更優(yōu)選地，谷氨酸棒桿菌果糖-1，6-二磷酸酶基因。
本發(fā)明還描述了載體(例如，重組載體)，其包括本文描述的核酸分子(例如，分離的或重組的核酸分子和/或基因)。具體地，描述了重組載體，其包括編碼本文描述的細(xì)菌基因產(chǎn)物，優(yōu)選棒桿菌基因產(chǎn)物，更優(yōu)選谷氨酸棒桿菌基因產(chǎn)物(例如，戊糖磷酸酶，例如，果糖-1，6-二磷酸酶)的核酸序列。
術(shù)語“重組核酸分子”包括核酸分子(例如，DNA分子)，其已經(jīng)經(jīng)改變、修飾或者工程化使得它在核苷酸序列上與該重組核酸分子所來源的天然核酸分子不同(例如，通過加入、缺失或替代一個或多個核苷酸)。優(yōu)選地，重組核酸分子(例如，重組DNA分子)包括有效連接調(diào)節(jié)序列的本發(fā)明的分離的核酸分子或者基因(例如，分離的果糖-1，6-二磷酸酶基因)。
術(shù)語“重組載體”包括載體(例如，質(zhì)粒、噬菌體、噬粒、病毒、粘?；蛘咂渌兓暮怂彷d體)，其已經(jīng)經(jīng)改變、修飾或者工程化使得它含有的核酸序列比該重組載體所來源的天然核酸分子中包括的核酸序列更大、更小或者與之不同。優(yōu)選地，重組載體包括果糖-1，6-二磷酸酶基因或者包括該果糖-1，6-二磷酸酶基因的重組核酸分子，其有效連接調(diào)節(jié)序列，例如，啟動子序列、終止子序列和/或人工核糖體結(jié)合位點(RBS)。
短語“有效連接調(diào)節(jié)序列”指目的核酸分子或基因的核苷酸序列以某種方式連接調(diào)節(jié)序列，所述方式允許表達(dá)(例如，增強(qiáng)的、增加的、組成性、基礎(chǔ)的、減弱的、減小的或者抑制的表達(dá))所述核苷酸序列，優(yōu)選表達(dá)所述核苷酸序列編碼的基因產(chǎn)物(例如，當(dāng)重組核酸分子包括在本文定義的重組載體并且導(dǎo)入微生物時)。
術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”包括影響(例如，調(diào)控或調(diào)節(jié))其他核酸序列的表達(dá)的核酸序列。在一個實施方案中，調(diào)節(jié)序列相對于具體目的基因以與該調(diào)節(jié)序列和目的基因在自然中所呈現(xiàn)的位置和/或方向相似或相同的位置和/或方向(例如，以天然位置和/或方向)包括在重組核酸分子或者重組載體中。例如，目的基因可以包括在重組核酸分子或者重組載體中與調(diào)節(jié)序列有效連接，該調(diào)節(jié)序列伴隨或者與天然生物中目的基因相鄰(例如，有效連接“天然”調(diào)節(jié)序列，例如，連接“天然”啟動子)。備選地，目的基因可以包括在重組核酸分子或重組載體中有效連接調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列伴隨或與天然生物中的另一種(例如，不同的)基因相鄰。備選地，目的基因可以包括在重組核酸分子或重組載體中有效連接來自另一生物的調(diào)節(jié)序列。例如，來自其他微生物的調(diào)節(jié)序列(例如，其他細(xì)菌調(diào)節(jié)序列、噬菌體調(diào)節(jié)序列等等)可以有效連接特定目的基因。
在一個實施方案中，調(diào)節(jié)序列是非天然的或者非天然發(fā)生的序列(例如，已經(jīng)修飾、突變、替代、衍生、缺失的序列，包括化學(xué)合成的序列)。優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列包括啟動子、增強(qiáng)子、終止信號、抗終止信號和其他表達(dá)控制元件(例如，阻抑物或者誘導(dǎo)物結(jié)合的序列和/或轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點，例如，在轉(zhuǎn)錄的mRNA中)。此類調(diào)節(jié)序列例如描述于Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.，and Maniatis，T.Molecular CloningALaboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989。調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)微生物中核苷酸序列的組成型表達(dá)的調(diào)節(jié)序列(例如，組成型啟動子和強(qiáng)組成型啟動子)、指導(dǎo)微生物中核苷酸序列的誘導(dǎo)型表達(dá)的調(diào)節(jié)序列(例如，誘導(dǎo)型啟動子，例如，木糖誘導(dǎo)型啟動子)和減弱或抑制微生物中核苷酸序列表達(dá)的調(diào)節(jié)序列(例如，減弱信號或抑制序列)。本發(fā)明范圍內(nèi)還包括通過除去或者缺失調(diào)節(jié)序列調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)。例如，可以除去參與轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)節(jié)的序列使得目的基因的表達(dá)得到增強(qiáng)。
在一個實施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子或者重組載體包括與啟動子或者啟動子序列有效連接的編碼至少一種細(xì)菌基因產(chǎn)物(例如，戊糖磷酸生物合成酶，例如，果糖-1，6-二磷酸酶)的核酸序列或者基因。本發(fā)明的優(yōu)選啟動子包括棒桿菌啟動子和/或噬菌體啟動子(例如，感染棒桿菌的噬菌體)。在一個實施方案中，啟動子是棒桿菌啟動子，優(yōu)選強(qiáng)棒桿菌啟動子(例如，與棒桿菌中生物化學(xué)管家基因結(jié)合的啟動子或者與棒桿菌中糖酵解途徑基因結(jié)合的啟動子)。在另一實施方案中，啟動子是噬菌體啟動子。
在另一實施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子或者重組載體包括一種或多種終止序列(例如，轉(zhuǎn)錄終止序列)。術(shù)語“終止序列”包括用于終止基因的轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列。終止序列(或者串聯(lián)轉(zhuǎn)錄終止子)還可以用于穩(wěn)定mRNA(例如，通過向mRNA加入結(jié)構(gòu))，例如，以抵抗核酸酶。
在再一個實施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子或者重組載體包括這樣的序列，其允許檢測含有所述序列的載體(即，可檢測的和/或選擇性標(biāo)記)，例如，克服營養(yǎng)缺陷性突變的序列，例如，ura3或ilvE、熒光標(biāo)記，和/或比色標(biāo)記(例如，lacZ/β-半乳糖苷酶)，和/或抗生素抗性基因(例如，amp或tet)。
在再一個實施方案中，本發(fā)明的重組載體包括抗生素抗性基因。術(shù)語“抗生素抗性基因”包括提高或者賦予宿主生物(例如，芽孢桿菌)的抗生素抗性的序列。在一個實施方案中，抗生素抗性基因選自cat(氯霉素抗性)基因、tet(四環(huán)素抗性)基因、erm(紅霉素抗性)基因、neo(新霉素抗性)基因和spec(大觀霉素抗性)基因。本發(fā)明的重組載體可以還包括同源重組序列(例如，設(shè)計用來允許目的基因重組到宿主生物的染色體的序列)。例如，amyE序列可以用作重組到宿主染色體的同源性靶標(biāo)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將還明白可以根據(jù)諸如將基因工程化的微生物的選擇、所希望的基因產(chǎn)物的表達(dá)水平等等的因素定制載體的設(shè)計。
VI.分離的蛋白質(zhì)本發(fā)明的另一方面描述了分離的蛋白質(zhì)(例如，分離的戊糖磷酸酶，例如，分離的果糖-1，6-二磷酸酶)。在一個實施方案中，蛋白質(zhì)(例如，分離的戊糖磷酸生物合成酶，例如，分離的果糖-1，6-二磷酸酶)通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生并且可以通過適宜的純化方案使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)從本發(fā)明的微生物分離。在另一實施方案中，使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)通過化學(xué)方法合成蛋白質(zhì)。
“分離的”或者“純化的”蛋白質(zhì)(例如，分離的或純化的生物合成酶)基本上無來自該蛋白質(zhì)所來源的微生物的細(xì)胞材料或者其他污染性蛋白質(zhì)，或者當(dāng)化學(xué)合成時基本上無化學(xué)前體或者其他化學(xué)品。在一個實施方案中，分離或純化的蛋白質(zhì)具有小于約30％(按干重計)污染性蛋白質(zhì)或者化學(xué)品，更優(yōu)選小于約20％污染性蛋白質(zhì)或者化學(xué)品，更優(yōu)選小于約10％污染性蛋白質(zhì)或者化學(xué)品，最優(yōu)選小于約5％污染性蛋白質(zhì)或者化學(xué)品。
在優(yōu)選實施方案中，蛋白質(zhì)或者基因產(chǎn)物來自棒桿菌(例如，棒桿菌來源的)。術(shù)語“來自棒桿菌”或者“棒桿菌來源的”包括棒桿菌基因編碼的蛋白質(zhì)或者基因產(chǎn)物。優(yōu)選地，基因產(chǎn)物來自選自谷氨酸棒桿菌、Corynebacterium acetoglutamicum、嗜乙酰乙酸棒桿菌或Corynebacteriumthermoaminogenes的微生物。在尤其優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)或者基因產(chǎn)物來自谷氨酸棒桿菌(例如，谷氨酸棒桿菌來源的)。術(shù)語“來自谷氨酸棒桿菌”或者“谷氨酸棒桿菌來源的”包括谷氨酸棒桿菌基因編碼的蛋白質(zhì)或者基因產(chǎn)物。在再一個優(yōu)選實施方案中，蛋白質(zhì)或基因產(chǎn)物由棒桿菌基因同源物(例如，來自不同于棒桿菌的物種但是與本發(fā)明的棒桿菌基因，例如，棒桿菌果糖-1，6-二磷酸酶基因具有顯著同源性的基因)編碼。
本發(fā)明的范圍內(nèi)包括細(xì)菌來源的蛋白質(zhì)或者基因產(chǎn)物和/或棒桿菌來源的蛋白質(zhì)或基因產(chǎn)物(例如，谷氨酸棒桿菌來源的基因產(chǎn)物)，其由天然發(fā)生的細(xì)菌和/或棒桿菌基因(例如，谷氨酸棒桿菌基因)編碼，例如，由本發(fā)明鑒定的基因，例如，棒桿菌或者谷氨酸棒桿菌果糖-1，6-二磷酸酶基因編碼。本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括細(xì)菌來源的蛋白質(zhì)或者基因產(chǎn)物和/或棒桿菌來源的蛋白質(zhì)或基因產(chǎn)物(例如，谷氨酸棒桿菌來源的基因產(chǎn)物)，其由細(xì)菌和/或棒桿菌基因(例如，谷氨酸棒桿菌基因)編碼，所述基因與天然發(fā)生的細(xì)菌和/或棒桿菌基因(例如，谷氨酸棒桿菌基因)不同，例如，具有突變、插入或缺失的核酸但是仍然編碼與本發(fā)明的天然發(fā)生的基因產(chǎn)物基本上相似的蛋白質(zhì)的基因。例如，公知本領(lǐng)域技術(shù)人員可以突變(替代)核酸，其由于遺傳密碼簡并性而編碼與天然發(fā)生的基因所編碼的氨基酸相同的氨基酸。此外，公知本領(lǐng)域技術(shù)人員可以突變(例如，替代)編碼保守氨基酸替代的核酸。還公知本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在一定程度上替代、加入或缺失氨基酸而與天然發(fā)生的基因產(chǎn)物相比不實質(zhì)性影響基因產(chǎn)物的功能，其每種情況都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)(例如，分離的戊糖磷酸生物合成酶，例如，分離的果糖-1，6-二磷酸酶)具有SEQ ID NO2中顯示的氨基酸序列。在其他實施方案中，本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)是如SEQ ID NO2中給出的蛋白質(zhì)的同源物(例如，包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約30-40％同一性，優(yōu)選約40-50％同一性，更優(yōu)選約50-60％同一性，甚至更優(yōu)選約60-70％，70-80％，80-90％，90-95％或以上同一性的氨基酸序列)，并且具有與SEQ ID NO2的氨基酸序列編碼的蛋白質(zhì)的活性基本上相似的活性。
為了確定兩個氨基酸序列或者兩個核酸的百分?jǐn)?shù)同源性，為了最佳比較目的比對序列(例如，可以在第一個氨基酸或核酸序列中引入缺口以與第二個氨基酸或核酸序列最佳比對)。當(dāng)?shù)谝粋€序列中的位置被第二個序列中對應(yīng)位置上相同氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，那么這兩個分子在該位置相同。兩個序列之間百分?jǐn)?shù)同一性是序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù)(即，％同一性＝相同位置數(shù)/位置總數(shù)×100)，優(yōu)選考慮產(chǎn)生最佳比對必需的缺口數(shù)和所述缺口的大小。
可以使用數(shù)學(xué)算法完成兩個序列之間序列的比較和百分?jǐn)?shù)同源性的確定。用于比較序列的數(shù)學(xué)算法的優(yōu)選的、非限制性實例是Karlin andAltschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-68，如在Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-77中改進(jìn)的算法。這種算法整合到Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)?？梢杂肗BLAST程序，得分＝100，字長＝12進(jìn)行BLAST核苷酸搜索以得到與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序，得分＝50，字長＝3進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索來得到與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了得到用于比較目的的缺口比對，可以使用如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Research25(17)3389-3402中利用的Gapped BLAST。當(dāng)利用BLAST和GappedBLAST程序時，可以使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一優(yōu)選的、非限制性實例是Myers and Miller(1988)Comput Appl Biosci.411-17的算法。這種算法整合到ALIGN程序中，該程序例如可以在GENESTREAM網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，IGH Montpellier，F(xiàn)RANCE(http//vega.igh.cnrs.fr)或在ISREC服務(wù)器(http//www.ch.embnet.org)得到。當(dāng)利用ALIGN程序比較氨基酸序列時，可以使用PAM120權(quán)重殘基表，缺口長度罰分12，和缺口罰分4。
在另一優(yōu)選實施方案中，可以使用GCG軟件包(可以在http//www.gcg.com得到)中的GAP程序，使用Blossom 62矩陣或者PAM250矩陣，和缺口權(quán)重12、10、8、6或4和長度權(quán)重2、3或4確定氨基酸序列之間的百分?jǐn)?shù)同源性。在再一個優(yōu)選實施方案中，可以使用GCG軟件包(可以在http//www.gcg.com得到)中的GAP程序，使用缺口權(quán)重50和長度權(quán)重3確定兩個核苷酸序列之間的百分?jǐn)?shù)同源性。
通過下面的實施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，不應(yīng)將這些實施例認(rèn)為是限制。在本申請全文引用的所有參考文獻(xiàn)、專利、序列表、附圖和公布的專利申請的內(nèi)容引入本文作為參考。
實施例一般方法菌株從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，USA)得到谷氨酸棒桿菌ATCC 21526。在L-蘇氨酸限制期間由于協(xié)同的天冬氨酸激酶抑制，該高絲氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株分泌賴氨酸。預(yù)培養(yǎng)物生長在含有5g L-1果糖或者葡萄糖的復(fù)合培養(yǎng)基中，對于瓊脂板，該復(fù)合培養(yǎng)基還補加12g L-1瓊脂。對于產(chǎn)生用于追蹤實驗和追蹤研究自身的接種物的細(xì)胞，使用補加1mgml-1泛酸鈣·HCl的基本培養(yǎng)基(Wittmann，C.and E.Heinzle.2002.Appl.Environ.Microbiol.685843-5859)。在該培養(yǎng)基中，碳源葡萄糖或者果糖、必需氨基酸蘇氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸和檸檬酸的濃度如下面詳細(xì)說明的改變。
培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)由三步組成，其包括(1)用來自瓊脂板的細(xì)胞作為接種物在復(fù)合培養(yǎng)基中起始培養(yǎng)，(ii)短暫培養(yǎng)以適應(yīng)基本培養(yǎng)基，和(iii)在具有升高濃度的必需氨基酸的基本培養(yǎng)基上延長培養(yǎng)。從瓊脂板接種的預(yù)培養(yǎng)物在100ml帶擋板的搖瓶中在10ml復(fù)合培養(yǎng)基上生長。通過離心(8800g，2min，30℃)收獲細(xì)胞后，將細(xì)胞接種到基本培養(yǎng)基，并生長達(dá)到2的光密度以得到適于基本培養(yǎng)基的指數(shù)生長的細(xì)胞。之后通過離心(8800g，30℃，和2min)收獲細(xì)胞，包括使用無菌0.9％NaCl的洗滌步驟。然后將它們接種到50ml帶擋板的搖瓶中6ml基本培養(yǎng)基中，最初濃度為0.30g L-1蘇氨酸、0.08g L-1甲硫氨酸、0.20g L-1亮氨酸，和0.57g L-1檸檬酸。分別加入作為碳源的70mM葡萄糖或者80mM果糖。細(xì)胞生長到耗盡必需氨基酸，其通過HPLC分析檢查。在生長期結(jié)束時，收獲細(xì)胞，用無菌NaCl(0.9％)洗滌。隨后，將它們轉(zhuǎn)移到25ml帶擋板的搖瓶中的4ml基本追蹤培養(yǎng)基中用于在產(chǎn)生賴氨酸的條件下進(jìn)行代謝通量分析。追蹤培養(yǎng)基不含有蘇氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和檸檬酸的任一種。對于每種碳源，孵育兩個平行的燒瓶，其分別含有(i)40mM[1-13C]標(biāo)記的底物，和(ii)20mM[13C6]標(biāo)記的底物加上20mM天然標(biāo)記的底物。所有培養(yǎng)都在旋轉(zhuǎn)搖床(Inova 4230，New Brunswick，Edison，NJ，USA)上30℃和150轉(zhuǎn)/分鐘下進(jìn)行。
化學(xué)品99％[1-13C]葡萄糖、99％[1-13C]果糖、99％[13C6]葡萄糖和99％[13C6]果糖從Campro Scientific(Veenendaal，Netherlands)購買。酵母提取物和胰蛋白胨從Difco Laboratories(Detroit，Michigan USA)得到。所有其他應(yīng)用的化學(xué)品分別從Sigma(St.Louis，MI USA)，Merck(Darmstadt，Germany)或Fluka(Buchs，Switzerland)得到，并且是分析級。
底物和產(chǎn)物分析通過使用光度計(Marsha Pharmacia biotech，F(xiàn)reiburg，Germany)測量660nm下的細(xì)胞密度(OD660nm)或者通過重量分析法確定細(xì)胞濃度。通過在室溫下3700g離心10分鐘從培養(yǎng)液收獲10ml細(xì)胞，包括用水的洗滌步驟，來進(jìn)行重量分析法。洗滌的細(xì)胞在80℃干燥直到重量恒定。確定干燥細(xì)胞干重和OD660nm之間的相關(guān)因子(g生物量/OD660nm)為0.353。
測定以16000g離心3分鐘得到的培養(yǎng)上清液中胞外底物和產(chǎn)物的濃度。果糖、葡萄糖、蔗糖和海藻糖衍生成肟三甲基甲硅烷基衍生物后通過GC定量。為此，應(yīng)用HP 6890氣相色譜儀(Hewlett Packard，Palo Alto，USA)與HP 5MS柱(5％苯基-甲基-硅氧烷-二苯基二甲基聚硅氧烷，30m×250μm，Hewlett Packard，Paolo Alto，CA，USA)，和在70eV具有電子碰撞電離的四極質(zhì)量選擇性檢測器(Agilent Technologies，Waldbronn，Germany)。樣品制備包括培養(yǎng)上清液的凍干，溶解在吡啶中，和隨后用羥胺和(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)(Macherey & Nagel，Düren，Germany)兩步衍生糖(13，14)。β-D-核糖用作定量的內(nèi)標(biāo)。所注射的樣品體積為0.2μl。GC分析的時間程序如下150℃(0-5min)，8℃min-1(5-25min)，310℃(25-35min)。將氦氣用作載體氣體，流速為1.5l min-1。入口溫度為310℃，檢測器溫度為320℃。通過HPLC，利用Aminex-HPX-87HBiorad柱(300×7.8mm，Hercules，CA，USA)檢測乙酸、乳酸、丙酮酸、2-酮戊二酸和二羥基丙酮，用4mM硫酸作為移動相，流速為0.8ml min-1，并在210nm進(jìn)行UV-檢測。通過酶測量(Boehringer，Mannheim，Germany)定量甘油。通過HPLC(Agilent Technologies，Waldbronn，Germany)，利用Zorbax Eclypse-AAA柱(150×4.6mm，5μm，Agilent Technologies，Waldbronn Germany)，使用自動化在線衍生(o-phtaldialdehyde+3-巰基丙酸)以2ml min-1的流速和熒光檢測來分析氨基酸。細(xì)節(jié)在使用手冊中給出。將α-氨基丁酸用作用于定量的內(nèi)標(biāo)。
13C標(biāo)記分析通過GC-MS定量培養(yǎng)上清液中賴氨酸和海藻糖的標(biāo)記位型。從而確定單一質(zhì)量同位素異構(gòu)體(isotopomer)級分。在當(dāng)前工作中，將它們定義為M0(未標(biāo)記的質(zhì)量同位素異構(gòu)體級分的相對量)，M1(單標(biāo)記的質(zhì)量同位素異構(gòu)體級分的相對量)和更高標(biāo)記的對應(yīng)的術(shù)語。如以前描述的(Rubino，F(xiàn).M.1989.J.Chromatogr.473125-133)將賴氨酸轉(zhuǎn)化成叔丁基-二甲基甲硅烷基(TBDMS)衍生物后進(jìn)行賴氨酸的GC-MS分析。對于離子群m/z 431-437以選擇性離子監(jiān)視(SIM)模式進(jìn)行質(zhì)量同位素異構(gòu)體分布的定量。該離子群對應(yīng)于片段離子，其由于從衍生殘基失去叔丁基形成，并且從而包括賴氨酸的完整碳骨架(Wittmann，C.，M.Hans and E.Heinzle.2002.Analytical Biochem.307379-382)。如以前描述的從海藻糖的三甲基甲硅烷基(TMS)衍生物確定海藻糖的標(biāo)記位型(Wittmann，C.，H.M.Kim and E.Heinzle.2003.Metabolic flux analysis at miniaturized scale.submitted)。通過m/z 361-367的離子群估計海藻糖的標(biāo)記位型，所述離子群對應(yīng)于含有海藻糖的完整單體單位的片段離子，從而等于葡萄糖6-磷酸的碳骨架。首先以掃描模式測量所有樣品，排除所分析的產(chǎn)物和其他樣品組分之間的同量異序干擾。通過SIM進(jìn)行的所有測量都以一式三份進(jìn)行。果糖上的追蹤實驗中單一質(zhì)量同位素異構(gòu)體級分的實驗誤差為對于[1-13C]果糖上的賴氨酸為0.85％(M0)，0.16％(M1)，0.27％(M2)，0.35％(M3)，0.45％(M4)，對于[1-13C]果糖上的海藻糖為0.87％(M0)，0.19％(M1)，0.44％(M2)，0.45％(M3)，0.88％(M4)，對于50％[13C6]果糖上的海藻糖為0.44％(M0)，0.54％(M1)，0.34％(M2)，0.34％(M3)，0.19％(M4)，0.14％(M5)和0.52％(M6)。葡萄糖追蹤實驗中MS測量的實驗誤差為對于[1-13C]葡萄糖上的賴氨酸為0.47％(M0)，0.44％(M1)，0.21％(M2)，0.26％(M3)，0.77％(M4)，對于[1-13C]葡萄糖上的海藻糖為0.71％(M0)，0.85％(M1)，0.17％(M2)，0.32％(M3)，0.46％(M4)，對于50％[13C6]葡萄糖上的海藻糖為1.29％(M0)，0.50％(M1)，0.83％(M2)，0.84％(M3)，1.71％(M4)，1.84％(M5)和0.58％(M6)。
代謝建模和參數(shù)估計所有代謝模擬都在個人計算機(jī)上進(jìn)行。用Matlab 6.1和Simulink 3.0(Mathworks，Inc.，Natick，MA USA)實現(xiàn)產(chǎn)生賴氨酸的谷氨酸棒桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)。軟件實現(xiàn)包括Simulink中的同位素異構(gòu)體模型用于計算網(wǎng)絡(luò)中的13C標(biāo)記分布。對于參數(shù)估計，同位素異構(gòu)體模型與Matlab中的迭代優(yōu)化算法結(jié)合。關(guān)于所應(yīng)用的計算工具的細(xì)節(jié)在Wittmann and Heinzle(Wittmann，C.and E.Heinzle.2002.Appl.Environ.Microbiol.685843-5859)中給出。
代謝網(wǎng)絡(luò)基于以前的工作并且包含糖酵解、戊糖磷酸途徑(PPP)、三羧酸(TCA)循環(huán)、丙酮酸的回補羧化、賴氨酸和其他分泌產(chǎn)生的生物合成(表1)，和中間前體向生物量的合成代謝通量。此外，葡萄糖和果糖的吸收系統(tǒng)交替實現(xiàn)。葡萄糖的吸收涉及通過PTS磷酸化成葡萄糖6-磷酸(Ohnishi，J.，S.Mitsuhashi，M.Hayashi，S.Ando，H.Yokoi，K.Ochiai and M.A.Ikeda.2002.Appl.Microbiol.Biotechnol.58217-223)。對于果糖，考慮兩種吸收系統(tǒng)(i)通過PTS果糖吸收并通過果糖1，6-二磷酸酶將果糖轉(zhuǎn)化成果糖1-磷酸和(ii)通過PTS甘露糖吸收導(dǎo)致果糖6-磷酸(Dominguez，H.，C.Rollin，A.Guyonvarch，J.L.Guerquin-Kern，M.Cocaign-Bousquet and N.D.Lindley.1998.Eur.J.Biochem.25496-102)。此外，將果糖-1，6-二磷酸酶應(yīng)用于該模型以允許在上面的糖酵解中兩個方向的碳通量。認(rèn)為可逆的反應(yīng)是PPP中的轉(zhuǎn)醛酶和轉(zhuǎn)酮酶。此外，對于用葡萄糖進(jìn)行的實驗，認(rèn)為葡萄糖6-磷酸異構(gòu)酶是可逆的，從而海藻糖標(biāo)記靈敏地反映了該酶的可逆性。相比，不能在果糖上確定葡萄糖6-磷酸酶異構(gòu)酶的可逆性。在果糖-培養(yǎng)的細(xì)胞中，葡萄糖6-磷酸僅從果糖6-磷酸形成，導(dǎo)致兩個庫的相同的標(biāo)記位型。因此，可逆的葡萄糖6-磷酸異構(gòu)酶對葡萄糖6-磷酸和果糖6-磷酸之間的互變不導(dǎo)致可以用于估計葡萄糖6-磷酸異構(gòu)酶可逆性的標(biāo)記差異。賴氨酸和海藻糖的測量標(biāo)記對于(i)磷酸烯醇丙酮酸/丙酮酸和蘋果酸/草酰乙酸的集中庫(lumped pools)之間通量的可逆性和(ii)TCA循環(huán)中蘋果酸脫氫酶和延胡索酸水合酶的可逆性不敏感。因此，認(rèn)為這些反應(yīng)是不可逆的。在該研究中不能得到來自天然標(biāo)記的和[13C6]標(biāo)記的底物混合物的丙氨酸的標(biāo)記，其對于這些通量參數(shù)是敏感的。基于以前的結(jié)果，認(rèn)為乙醛酸途徑是不活動的(Wittmann，C.and E.Heinzle.2002.Appl.Environ.Microbiol.685843-5859)。
關(guān)于谷氨酸棒桿菌的生長、產(chǎn)物形成和生物量組成的化學(xué)計量數(shù)據(jù)以及所分泌的賴氨酸和海藻糖的質(zhì)譜標(biāo)記數(shù)據(jù)用于計算代謝通量分布。給出兩個平行實驗的賴氨酸和海藻糖的實驗的(Mi，exp)和模擬的(Mi，calc)質(zhì)量同位素異構(gòu)體級分之間最小偏差的通量集合被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)通量分布的最佳估計。如在附錄中描述的，超定了葡萄糖生長的和果糖生長的細(xì)胞的兩個網(wǎng)絡(luò)。因此，至少平方方法是可能的。使用加權(quán)的最小平方和(SLS)的誤差標(biāo)準(zhǔn)，其中Si，exp是測量的標(biāo)準(zhǔn)差(Eq.1)。
SLS=Σi(Mi,exp-Mi,calc)2Si,exp2]]>(方程1)應(yīng)用多個參數(shù)初始化以研究所得通量分布是否代表總體最優(yōu)值。對于所有菌株，賴氨酸產(chǎn)生期間的葡萄糖吸收通量設(shè)為100％，并且將網(wǎng)絡(luò)中其他通量給定為對葡萄糖吸收通量歸一化的相對摩爾通量。
統(tǒng)計學(xué)估計通過以前描述的Monte-Carlo方法(Wittmann，C.and E.Heinzle.2002.Appl.Environ.Microbiol.685843-5859)進(jìn)行所得代謝通量的統(tǒng)計學(xué)分析。對于每種菌株，通過100個參數(shù)估計試驗(run)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，其中實驗數(shù)據(jù)(包含所測量的質(zhì)量同位素異構(gòu)體比率和所測量的通量)統(tǒng)計學(xué)地改變。從所得數(shù)據(jù)計算單個參數(shù)的90％置信界限。
實施例1通過谷氨酸棒桿菌用果糖和葡萄糖產(chǎn)生賴氨酸在用葡萄糖和果糖的比較性分批培養(yǎng)中分析產(chǎn)生賴氨酸的谷氨酸棒桿菌的代謝通量。為此，將預(yù)生長的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到追蹤培養(yǎng)基中并孵育約5小時。在追蹤實驗開始和結(jié)束時底物和產(chǎn)物的分析揭示兩種碳源的顯著差異。用葡萄糖共產(chǎn)生了11.1mM賴氨酸，而用果糖達(dá)到了僅8.6mM的較低濃度。在超過5小時的孵育期間，細(xì)胞濃度從3.9g L-1增加到6.0g L-1(葡萄糖)和從3.5g L-1增加到4.4g L-1(果糖)。由于蘇氨酸和甲硫氨酸不存在于培養(yǎng)基這一事實，內(nèi)部來源可能被細(xì)胞用于生物量合成。果糖上的平均比糖吸收速率(1.93mmol g-1h-1)高于葡萄糖的(1.71mmol g-1h-1)。如表1中描述的，果糖和葡萄糖之間谷氨酸棒桿菌ATCC 21526的所得產(chǎn)率顯著不同。這涉及主要產(chǎn)物賴氨酸和多種副產(chǎn)物。對于賴氨酸，果糖上的產(chǎn)率為244mmol mol-1，從而與葡萄糖上的產(chǎn)率(281mmol mol-1)相比較低。此外，碳源對生物量產(chǎn)率有顯著影響，與葡萄糖相比，使用果糖時生物量產(chǎn)率減小約50％。對二羥基丙酮、甘油和乳酸觀察到碳源對副產(chǎn)物形成的最顯著的影響。在果糖上，這些副產(chǎn)物的積累極大地增強(qiáng)。甘油的產(chǎn)率高10倍，而二羥基丙酮和乳酸分泌增加6倍。二羥基丙酮是果糖上的主要副產(chǎn)物。由于較低的生物量產(chǎn)率，果糖生長的細(xì)胞具有對合成代謝前體的顯著減小的需要(表2)。
表1谷氨酸棒桿菌ATCC 21526從葡萄糖(左)和果糖(右)產(chǎn)生賴氨酸階段中的生物量和代謝物。實驗產(chǎn)率是對(i)40mM[1-13C]標(biāo)記的底物和(ii)20mM[13C6]標(biāo)記的底物加上20mM天然標(biāo)記的底物的兩個平行孵育的平均值與兩個孵育之間的對應(yīng)偏差。所有產(chǎn)率都以(mmol產(chǎn)物)(mol)-1給出，但是生物量的產(chǎn)率除外，其以(mg干燥生物量(mmol)-1給出。
表2.谷氨酸棒桿菌ATCC 21526從葡萄糖(左)和果糖(右)產(chǎn)生賴氨酸階段對細(xì)胞內(nèi)代謝物的合成代謝需求。實驗數(shù)據(jù)是(i)[1-13C]標(biāo)記的底物和(ii)天然標(biāo)記的和[13C6]標(biāo)記的底物的1∶1混合物的兩個平行孵育的平均值與兩個孵育之間的偏差。
*)前體需求的估計基于從每種菌株所得的實驗生物量產(chǎn)率(表1)和以前對谷氨酸棒桿菌測量的生物量組成(Marx，A.，A.A.de Graaf，W.Wiechert，L.Eggeling and H.Sahm.1996.Biotechnol.Bioeng.49111-129).
**)認(rèn)為二氨基庚二酸和賴氨酸是不同的合成代謝前體。這是由于來自丙酮酸和草酰乙酸的合成代謝通量向二氨基庚二酸(細(xì)胞壁)和賴氨酸(蛋白質(zhì))的合成代謝通量除了對賴氨酸分泌通量有貢獻(xiàn)還對通過賴氨酸生物合成途徑的總的通量有貢獻(xiàn)。
實施例2手工檢查追蹤實驗中13C-標(biāo)記位型用GC-MS定量所分泌的賴氨酸和海藻糖的相對質(zhì)量同位素異構(gòu)體級分。這些質(zhì)量同位素異構(gòu)體級分對細(xì)胞內(nèi)通量是靈敏的并且因此顯示出所研究的生物系統(tǒng)的通量組(fluxome)的指紋。如圖2中所示，在谷氨酸棒桿菌的葡萄糖和果糖生長的細(xì)胞之間所分泌的賴氨酸和海藻糖的標(biāo)記位型顯著不同。對于所應(yīng)用的追蹤標(biāo)記和兩種測量的產(chǎn)物都發(fā)現(xiàn)了差異。這表明碳通量模式中實質(zhì)性差異取決于應(yīng)用的碳源。如前面顯示的，來自谷氨酸棒桿菌對[1-13C]和[13C6]葡萄糖混合物的兩個平行培養(yǎng)的質(zhì)量同位素異構(gòu)體級分幾乎相同(Wittmann，C.，H.M.Kim and E.Heinzle.2003.Metabolicflux analysis at miniaturized scale.submitted)。因此，所觀察的差異與代謝通量中底物特異差異明顯相關(guān)。
實施例3細(xì)胞內(nèi)通量的估計所進(jìn)行的研究的中心問題是在分別將葡萄糖和果糖作為碳源的賴氨酸生產(chǎn)期間谷氨酸棒桿菌的細(xì)胞內(nèi)通量的比較研究。為此，從追蹤實驗得到的實驗數(shù)據(jù)用于計算每種底物的代謝通量分布，使用如上描述的通量估計軟件。通過使實驗和理論質(zhì)量同位素異構(gòu)體級分之間的偏差最小進(jìn)行參數(shù)估計。所進(jìn)行的方法利用優(yōu)化的每步期間的代謝物平衡。這包括(i)關(guān)于產(chǎn)物分泌的化學(xué)計量數(shù)據(jù)(表2)和(ii)對生物量前體的合成代謝需求的化學(xué)計量數(shù)據(jù)(表3)。認(rèn)為給出實驗和模擬的標(biāo)記位型之間的最小偏差的細(xì)胞內(nèi)通量集合是細(xì)胞內(nèi)通量分布的最佳估計。對于兩種情況，用多個初始化值得到的相同的通量分布，提示鑒定了總體最小值。顯然，實現(xiàn)了實驗確定的和計算的質(zhì)量同位素異構(gòu)體比率之間的良好一致(表4)。
表3分別在葡萄糖和果糖上培養(yǎng)的產(chǎn)生賴氨酸的谷氨酸棒桿菌ATCC 21526的相對質(zhì)量同位素異構(gòu)體級分。對于兩種碳源，對(i)[1-13C]標(biāo)記的和(ii)天然13C標(biāo)記的和[13C6]標(biāo)記的追蹤底物進(jìn)行兩個平行的追蹤實驗。通過求解對應(yīng)于通量的優(yōu)化集合的數(shù)學(xué)模型(計算的)預(yù)測實驗GC/MS數(shù)據(jù)(實驗)和值。M0表示未標(biāo)記的質(zhì)量同位素異構(gòu)體級分的相對量，M1是單標(biāo)記的質(zhì)量同位素異構(gòu)體級分的相對量，對應(yīng)術(shù)語代表更高標(biāo)記。
實施例4賴氨酸產(chǎn)生期間果糖和葡萄糖上的代謝通量在圖(4，5)中顯示了產(chǎn)生賴氨酸的谷氨酸棒桿菌葡萄糖和果糖上所得細(xì)胞內(nèi)通量分布。顯然，取決于所用的碳源，細(xì)胞內(nèi)通量顯著不同。對于葡萄糖，62％的碳通量流向PPP，而僅36％通向糖酵解鏈(圖4)。由于該相對高的量，PPP酶葡萄糖6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡糖酸脫氫酶產(chǎn)生124％NADPH。果糖的情況完全不同(圖5)。所進(jìn)行的通量分析揭示用于果糖吸收的兩種PTS的體內(nèi)活性，而92.3％被果糖特異性PTS果糖吸收。7.7％的可比較的小級分的果糖被PTS甘露糖吸收。從而，大部分果糖在果糖1，6-二磷酸酶水平上進(jìn)入糖酵解，而僅小部分在果糖6-磷酸的上游通向糖酵解鏈。與葡萄糖生長的細(xì)胞相比，PPP顯示出僅14.4％的顯著降低的活性。葡萄糖6-磷酸異構(gòu)酶在兩種碳源上以相反的方向運行。在葡萄糖生長的細(xì)胞中，36.2％的凈通量從葡萄糖6-磷酸流向果糖6-磷酸，而關(guān)于果糖觀察到15.2％的逆向凈通量。
對于果糖，通過葡萄糖6-磷酸異構(gòu)酶和PPP的通量為通過PTS甘露糖的約兩倍高。然而，這不是由于碳從果糖-1，6-二磷酸酶向果糖6-磷酸的糖益生通量，其可以提供向PPP的額外的碳通量。實際上，通過催化該反應(yīng)的果糖1，6-二磷酸酶的通量為0。負(fù)責(zé)向PPP的額外通量的代謝反應(yīng)是PPP中可逆酶轉(zhuǎn)醛酶和轉(zhuǎn)酮酶。約3.5％的該額外通量由轉(zhuǎn)酮酶2提供，其將來自PPP的回收的碳返回到該途徑。此外，通過轉(zhuǎn)醛酶的作用，4.2％的通量朝向果糖6-磷酸和PPP。
取決于碳源，在丙酮酸節(jié)點周圍也觀察到產(chǎn)生賴氨酸的葡萄糖棒桿菌中完全不同的通量模式(圖4，5)。對于葡萄糖，向賴氨酸途徑的通量為30.0％，而對果糖發(fā)現(xiàn)25.4％的較小通量。與果糖相比葡萄糖上升高的賴氨酸產(chǎn)率是該通量差異的主要原因，但是導(dǎo)致對用于細(xì)胞壁合成的二氨基庚二酸和用于蛋白質(zhì)合成的賴氨酸合成的更高需求的更高的生物量產(chǎn)率也促進(jìn)所述通量差異。使用葡萄糖的回補通量為44.5％從而顯著高于使用果糖的通量(33.5％)。這主要是由于賴氨酸產(chǎn)生對草酰乙酸的更高的需求，而且是由于使用葡萄糖時對草酰乙酸和2-酮戊二酸的更高的合成代謝需求。另一方面，使用葡萄糖時通過丙酮酸脫氫酶的通量(70.9％)低于使用果糖的通量(95.2％)。這減小了向TCA循環(huán)的碳通量，導(dǎo)致使用葡萄糖時通過TCA循環(huán)酶減小30％以上的通量(圖3，4)。
通過Monte-Carlo方法對所得通量的統(tǒng)計學(xué)評估用于計算所確定的通量參數(shù)的90％置信區(qū)間。如表5中對多種關(guān)鍵通量所示，置信區(qū)間通常是窄的。作為實例，通過葡萄糖6-磷酸脫氫酶的通量對于葡萄糖生長的細(xì)胞僅為1.2％，對于果糖生長的細(xì)胞為3.5％。因此所選方法允許精確的通量估計?？梢酝茢鄬ζ咸烟呛凸欠謩e所觀察到的通量差異明顯是由應(yīng)用的碳源導(dǎo)致的。
必須注意到使用果糖時1.93mmol g-1h1的平均特異底物吸收稍高于對葡萄糖發(fā)現(xiàn)的1.77mmol g-1h-1。由于該原因，以mmol g-1h-1表達(dá)的絕對細(xì)胞內(nèi)通量與上面討論的相對通量關(guān)于葡萄糖稍微增加。然而，分別使用果糖和葡萄糖時產(chǎn)生賴氨酸的谷氨酸棒桿菌的通量分布如此完全不同以致上面作出的所有比較也適用于絕對碳通量。
表4通過13C追蹤研究用質(zhì)譜法和代謝物平衡對生長在果糖(左)和葡萄糖(右)上的產(chǎn)生賴氨酸的谷氨酸棒桿菌ATCC 21526的代謝通量的統(tǒng)計學(xué)評估通過包括100個獨立的參數(shù)估計試驗的Monte-Carlo方法對每種底物用統(tǒng)計學(xué)不同的實驗數(shù)據(jù)得到關(guān)鍵通量參數(shù)的90％置信區(qū)間。
*較低的置信邊界的負(fù)通量等于逆方向的正通量(通過磷酸果糖激酶)。
**將通量可逆性定義為返回通量與凈通量的比率。
實施例I-IV的討論A.底物特異培養(yǎng)物特征用果糖和葡萄糖分別培養(yǎng)產(chǎn)生賴氨酸的谷氨酸棒桿菌揭示生長和產(chǎn)物形成強(qiáng)烈依賴于所使用的碳源。以前也報導(dǎo)谷氨酸棒桿菌的另一種菌株對果糖培養(yǎng)顯著降低的賴氨酸和生物量產(chǎn)率，其中與葡萄糖相比，賴氨酸和生物量產(chǎn)率分別小30％和20％(Kiefer，P.，E.Heinzle and C.Wittmann.2002.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.28338-43)。與葡萄糖相比，在果糖上培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌和棲糖蜜棒桿菌與更高的二氧化碳產(chǎn)生速率有關(guān)(Dominguez，H.，C.Rollin，A.Guyonvarch，J.L.Guerquin-Kern，M.Cocaign-Bousquet and N.D.Lindley.1998.Eur.J.Biochem.25496-102；Kiefer，P.，E.Heinzle and C.Wittmann.2002.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.28338-43)。這與在本工作中對于該碳源觀察到的通過TCA循環(huán)的升高的通量一致。對副產(chǎn)物也觀察到底物特異性差異。與葡萄糖相比使用果糖時海藻糖的形成較低。這可能與葡萄糖和果糖進(jìn)入糖酵解的不同入口點有關(guān)(Kiefer，P.，E.Heinzle and C.Wittmann.2002.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.28338-43)?？紤]到谷氨酸棒桿菌中的吸收系統(tǒng)，葡萄糖的利用導(dǎo)致形成海藻糖前體葡萄糖6-磷酸，而果糖被轉(zhuǎn)化到果糖1，6-二磷酸酶并從而從葡萄糖6-磷酸進(jìn)入中心代謝下游(Dominguez，H.，C.Rollin，A.Guyonvarch，J.L.Guerquin-Kern，M.Cocaign-Bousquet and N.D.Lindley.1998.Eur.J.Biochem.25496-102)。當(dāng)將果糖用作碳源時，其他副產(chǎn)物，如二羥基丙酮、甘油和乳酸強(qiáng)烈增加。從賴氨酸產(chǎn)生的觀點，這不是所希望的，因為大部分碳從中心代謝撤出而形成副產(chǎn)物。使用果糖時該特定底物吸收(1.93mmol g-1h-1)高于使用葡萄糖的(1.77mmol g-1h-1)。該結(jié)果與以前對指數(shù)生長的棲糖蜜棒桿菌ATCC 17965進(jìn)行的研究不同(Dominguez，H.，C.Rollin，A.Guyonvarch，J.L.Guerquin-Kern，M.Cocaign-Bousquet and N.D.Lindley.1998.Eur.J.Biochem.25496-102)，在所述研究中觀察到對果糖和葡萄糖的類似的特異吸收速率。在我們的研究中觀察到的對果糖的較高吸收速率可能是由于所研究的菌株不同這一事實。棲糖蜜棒桿菌和谷氨酸棒桿菌是相關(guān)的種，但是在某些代謝性質(zhì)上可能不同。在當(dāng)前工作中研究的菌株以前通過經(jīng)典菌株優(yōu)化得到。這可能導(dǎo)入了影響底物吸收的突變。另一種解釋是培養(yǎng)條件的不同。在受限制的生長和賴氨酸產(chǎn)生條件下果糖可能被更有效地利用。
B.代謝通量分布在葡萄糖和果糖上產(chǎn)生賴氨酸的谷氨酸棒桿菌的所得細(xì)胞內(nèi)通量分布揭示了巨大差異。對所得通量的統(tǒng)計學(xué)評估揭示了窄的90％置信區(qū)間，從而所觀察到的通量差異可以清楚地歸因于應(yīng)用的碳源。最顯著的差異之一涉及糖酵解和PPP之間的通量分配。使用葡萄糖時，62.3％的碳通入PPP。產(chǎn)生賴氨酸的谷氨酸棒桿菌的PPP對該底物的優(yōu)勢以前已經(jīng)在不同研究中觀察到(Marx，A.，A.A.de Graaf，W.Wiechert，L.Eggeling and H.Sahm.1996.Biotechnol.Bioeng.49111-129；Wittmann，C.and E.Heinzle.2001.Eur.J.Biochem.2682441-2455；Wittmann，C.and E.Heinzle.2002.Appl.Environ.Microbiol.685843-5859)。使用果糖時，進(jìn)入PPP的通量減小到14.4％。如通過所進(jìn)行的代謝通量分析鑒定的，這主要是由于果糖在果糖1，6-二磷酸水平上的入口和果糖-1，6-二磷酸酶的失活之間的不利組合。所觀察到的果糖-1，6-二磷酸酶的失活與分別在果糖和葡萄糖上指數(shù)生長期間棲糖蜜棒桿菌ATCC 17965的酶測量非常一致(Dominguez，H.，C.Rollin，A.Guyonvarch，J.L.Guerquin-Kern，M.Cocaign-Bousquet and N.D.Lindley.1998.Eur.J.Biochem.25496-102)。
令人驚奇地，當(dāng)在果糖上培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌時，通過葡萄糖6-磷酸異構(gòu)酶和PPP的通量為通過PTS甘露糖的通量的約兩倍高。由于果糖-1，6-二磷酸酶的失活，這不是由糖異生通量導(dǎo)致的。事實上，谷氨酸棒桿菌具有通過果糖6-磷酸、葡萄糖6-磷酸和核糖5-磷酸的操作代謝循環(huán)。由轉(zhuǎn)酮酶2提供進(jìn)入PPP的額外通量，轉(zhuǎn)酮酶2將來自PPP的碳回收進(jìn)入該途徑，并且通過轉(zhuǎn)醛酶的作用(其將甘油醛3-磷酸重定向到PPP)，從而繞過糖異生。該循環(huán)活性可以幫助細(xì)胞克服使用果糖時的NADPH限制。對于生長在果糖上的谷氨酸棒桿菌，到達(dá)葡萄糖6-磷酸的顯著減小的通量也可以解釋該底物上海藻糖的形成減少(Kiefer，P.，E.Heinzle and C.Wittmann.2002.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.28338-43)。取決于碳源，葡萄糖6-磷酸異構(gòu)酶以相反方向運行。在葡萄糖上生長時，凈通量從葡萄糖6-磷酸導(dǎo)入果糖6-磷酸，而在果糖上觀察到逆的凈通量。這強(qiáng)調(diào)了谷氨酸棒桿菌中該酶的可逆性對于代謝靈活性的重要性。
C.NADPH代謝下面的計算提供了產(chǎn)生賴氨酸的谷氨酸棒桿菌在果糖和葡萄糖上NADH代謝的比較。從估計的通過葡萄糖6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、和異檸檬酸脫氫酶的通量計算NADPH的總體供應(yīng)。在葡萄糖上，PPP酶葡萄糖6-磷酸脫氫酶(62.0％)和果糖6-磷酸脫氫酶(62.0％)提供了主要部分的NADPH。異檸檬酸脫氫酶(52.9％)僅有小程度的貢獻(xiàn)。在果糖上觀察到PPP和TCA循環(huán)對NADPH供應(yīng)的完全不同的貢獻(xiàn)，其中異檸檬酸脫氫酶(83.3％)是NADPH的主要來源。在果糖上葡萄糖6-磷酸脫氫酶(14.4％)和果糖6-磷酸脫氫酶(14.4％)產(chǎn)生較少的NADPH。NADPH是生長和形成賴氨酸所需的。從11.51mmol NADPH(g生物量)-1的化學(xué)計量需求和本工作的實驗生物量產(chǎn)率(表1)計算生長所需的NADPH，認(rèn)為所述化學(xué)計量需求對于葡萄糖和果糖是相同的(Dominguez，H.，C.Rollin，A.Guyonvarch，J.L.Guerquin-Kern，M.Cocaign-Bousquet and N.D.Lindley.1998.Eur.J.Biochem.25496-102)。對于在葡萄糖上生物量產(chǎn)生，谷氨酸棒桿菌消耗了62.3％的NADPH，其與作為碳源的果糖(32.8％)相比高得多。從所估計的向賴氨酸的通量(表1)和4mol(mol賴氨酸)-1的對應(yīng)的化學(xué)計量NADPH需求確定產(chǎn)物合成所需的NADPH的量。該量對于從葡萄糖產(chǎn)生賴氨酸為112.4％，對于從果糖產(chǎn)生賴氨酸為97.6％。與果糖相比(112.1％)，葡萄糖上總體NADPH供應(yīng)顯著更高(176.9％)，這可能主要規(guī)因于葡萄糖上增加的PPP通量。葡萄糖上NADPH平衡接近關(guān)閉。相比，在果糖上觀察到NADPH的非常明顯的缺乏(18.3％)。這對除了上面提到的葡萄糖6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶之外，還對催化可以提供NADPH的代謝反應(yīng)的酶帶來了問題。可能的候選者似乎是依賴NADPH的蘋果酸酶。與葡萄糖生長的細(xì)胞相比，以前在果糖上生長的棲糖蜜棒桿菌上檢測到該酶增加的比活性(Dominguez，H.，C.Rollin，A.Guyonvarch，J.L.Guerquin-Kern，M.Cocaign-Bousquet and N.D.Lindley.1998.Eur.J.Biochem.25496-102)。然而，通過該特定酶的通量不能通過本工作中的實驗設(shè)置解決。假設(shè)蘋果酸酶作為遺漏的產(chǎn)生NADPH的酶，那么18.3％的通量將足夠提供似乎遺漏的NADPH。用葡萄糖作為碳源對谷氨酸棒桿菌的詳細(xì)通量研究沒有揭示蘋果酸酶的顯著活性。(Petersen，S.，A.A.de Graaf，L.Eggeling，M.Mllney，W.Wiechertand H.Sahm.2000.J.Biol.Chem.7535932-35941)。然而，對果糖的情況可能與該酶的升高的體內(nèi)活性關(guān)聯(lián)。
D.NADH代謝在果糖上，谷氨酸棒桿菌揭示了形成NADH的酶的增加的活性。在果糖上，甘油醛3-磷酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、2-酮戊二酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶形成421.2％NADH。在葡萄糖上，NADH產(chǎn)生僅為322.4％。此外，在果糖上合成代謝的NADH需求顯著低于葡萄糖上的。與減小的代謝需求偶聯(lián)的顯著增強(qiáng)的NADH產(chǎn)生可以導(dǎo)致增加的NADH/NAD比率。對于棲糖蜜棒桿菌，以前表明與葡萄糖相比果糖導(dǎo)致增加的NADH/NAD比率(Dominguez，H.，C.Rollin，A.Guyonvarch，J.L.Guerquin-Kern，M.Cocaign-Bousquet and N.D.Lindley.1998.Eur.J.Biochem.25496-102)。這對果糖上賴氨酸產(chǎn)生期間NADH產(chǎn)生機(jī)制帶來了問題。果糖生長的細(xì)胞顯示出二羥基丙酮、甘油和乳酸的增強(qiáng)的分泌。二羥基丙酮和甘油的增加的形成可以是由于較高的NADH/NAD比率。以前表明NADH抑制甘油醛脫氫酶，從而二羥基丙酮和甘油的過剩可能與該酶的通量能力的減小有關(guān)。二羥基丙酮向甘油的還原可以還受到高NADH/NAD比率的支持并且從而促進(jìn)過量NADH的再生。需要NADH的從丙酮酸形成乳酸也具有與甘油生成相似的背景。與指數(shù)生長相比，在賴氨酸產(chǎn)生條件下NADH過量可能甚至更高，所述NADH過量的特征是相對高的TCA循環(huán)活性和減小的生物量產(chǎn)率。
E.果糖上產(chǎn)生賴氨酸的谷氨酸棒桿菌優(yōu)化的潛在靶標(biāo)基于所得通量圖式，可以確定用于果糖上產(chǎn)生賴氨酸的谷氨酸棒桿菌優(yōu)化的一些潛在靶標(biāo)。中心點是NADPH的提供。果糖-1，6-二磷酸酶是增加NADPH供應(yīng)的一個靶標(biāo)。它的活性的失調(diào)，例如，增加導(dǎo)致通過PPP的更高的通量，導(dǎo)致增加的NADPH產(chǎn)生和增加的賴氨酸產(chǎn)率。通過果糖1，6-二磷酸酶的擴(kuò)增增加通過PPP的通量對于芳香族氨基酸產(chǎn)生也是有益的(Ikeda，M.2003.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.791-36)。從賴氨酸產(chǎn)生的觀點，在果糖上生長期間果糖1，6-二磷酸酶的失活是有害的但是不是令人驚奇的，因為在糖上生長期間不需要該糖異生酶并且其可能受到抑制。在原核生物中，該酶處于例如，果糖1，6-二磷酸酶、果糖-2，6二磷酸酶、金屬離子和AMP的有效代謝控制下(Skrypal，I.G.and O.V.Iastrebova.2002.Mikrobiol Z.6482-94)。已知谷氨酸棒桿菌可以生長在乙酸上(Wendisch，V.F.，A.A.de Graaf，H.Sahm H.and B.Eikmans.2000.J.Bacteriol.1823088-3096)，而該酶對于保持糖異生是必需的。增加通過PPP的通量的另一個潛在靶標(biāo)對于果糖吸收是PTS。修飾PTS果糖和PTS甘露糖之間的通量分配可以產(chǎn)生更高比例的果糖，其在果糖6-磷酸水平上進(jìn)入并從而導(dǎo)致增加的PPP通量?？赡軐巧螻ADPH供應(yīng)有很大貢獻(xiàn)的蘋果酸酶的額外擴(kuò)增可以是有趣的靶標(biāo)。
另一個瓶頸包含二羥基丙酮、甘油和乳酸的強(qiáng)烈分泌。二羥基丙酮和甘油的形成可以受到對應(yīng)酶的失調(diào)(例如，缺失)的阻斷。二羥基丙酮磷酸向二羥基丙酮的轉(zhuǎn)化可以由對應(yīng)的磷酸酶催化。然而在谷氨酸棒桿菌中還沒有注解二羥基丙酮磷酸酶(見National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)Taxonomy websitehttp//www3.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/)。該反應(yīng)還可以由激酶，例如，甘油激酶催化。當(dāng)前谷氨酸棒桿菌的基因組數(shù)據(jù)庫中的兩個條目涉及二羥基丙酮激酶(見National Center for Biotechnology Information(NCBI)Taxonomy websitehttp//www3.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/)。
還可以通過乳酸脫氫酶的失調(diào)，例如，敲除來避免乳酸分泌。因為甘油和乳酸形成對于NADH再生是重要的，所以不能排除對該生物的總體性能的負(fù)影響。對于如以前推測的通過下游糖酵解鏈的碳通量受到甘油醛3-磷酸脫氫酶的能力的限制的情況(Dominguez，H.，C.Rollin，A.Guyonvarch，J.L.Guerquin-Kern，M.Cocaign-Bousquet and N.D.Lindley.1998.Eur.J.Biochem.25496-102)，二羥基丙酮和甘油產(chǎn)生的抑制可以最終導(dǎo)致果糖-1，6-二磷酸酶的激活和通過PPP的碳通量的再定向。應(yīng)該注意在谷氨酸棒桿菌的培養(yǎng)期間二羥基丙酮沒有被再利用并且從而關(guān)于產(chǎn)物合成表現(xiàn)出浪費的碳，而對于乳酸不是這樣的情況(Cocaign-Bousquet，M.and N.D.Lindley.1995.Enz.Microbiol.Technol.17260-267)。
在一個實施方案中，一種或多種上面的基因組合的失調(diào)可用于產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品，例如，賴氨酸。
此外，蔗糖也可以用作通過谷氨酸棒桿菌產(chǎn)生賴氨酸的碳源，例如，結(jié)合使用本發(fā)明的方法。蔗糖是糖蜜中的主要碳源。如以前表明的，蔗糖的果糖單位在果糖1，6-二磷酸酶水平進(jìn)入糖酵解(Dominguez，H.and N.D.Lindley.1996.Appl.Environ.Microbiol.623878-3880)。因此，該部分蔗糖分子-假定無活性的果糖-1，6-二磷酸酶-可能不進(jìn)入PPP，從而可以限制產(chǎn)生賴氨酸的菌株中NADPH供應(yīng)。
實施例5構(gòu)建質(zhì)粒pCIS lysC菌株構(gòu)建的第一步要求谷氨酸棒桿菌ATCC13032中l(wèi)ysC野生型基因的等位基因置換。在等位基因置換中，進(jìn)行l(wèi)ysC基因中的核苷酸置換，從而通過Ile置換311位中的氨基酸Thr。使用來自ATCC13032的染色體DNA作為模板開始并使用寡核苷酸引物SEQ ID NO3和SEQ ID NO4進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過使用Pfu Turbo PCR系統(tǒng)(Stratagene USA)按照生產(chǎn)商的使用說明擴(kuò)增lysC。根據(jù)Tauch et al.(1995)Plasmid 33168-179或Eikmanns et al.(1994)Microbiology 1401817-1828從谷氨酸棒桿菌ATCC13032制備染色體DNA。所擴(kuò)增的片段的5’末端是SalI限制性切割位點，3’末端是MluI限制性切割位點?？寺∏埃瑢U(kuò)增的片段通過這兩種限制酶消化并使用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)純化。
SEQ ID NO35‘-GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC-3‘
SEQ ID NO45‘-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3‘將所得多核苷酸克隆到整合SacB的pCLIK5MCS中的SalI和MluI限制性切割位點中并且在下文中稱作pCIS(SEQ ID NO5)并且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-1 blue中。通過在含有卡那霉素(20μg/mL)-的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上平板接種得到一組攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。分離質(zhì)粒并通過測序驗證預(yù)期的核苷酸序列。根據(jù)Qiagen公司的方法并使用該公司的材料進(jìn)行質(zhì)粒DNA的制備。根據(jù)Sanger et al.(1977)Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 745463-5467進(jìn)行測序反應(yīng)。通過ABIPrism 377(PE Applied Biosystems，Weiterstadt)分離測序反應(yīng)物并分析。所得質(zhì)粒pCIS lysC列出為SEQ ID NO6。
實施例6來自谷氨酸棒桿菌的lysC基因的誘變使用QuickChange試劑盒(公司Stratagene/USA)按照生產(chǎn)商的使用說明進(jìn)行來自谷氨酸棒桿菌的lysC基因的定向誘變。用質(zhì)粒pCIS lysC，SEQ ID NO6進(jìn)行誘變。合成下面的寡核苷酸引物用于通過使用QuickChange方法(Stratagene)用311ile替代thr 311SEQ ID NO75‘-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG-3‘SEQ ID NO85‘-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG-3‘QuickChange反應(yīng)中這些寡核苷酸引物的使用導(dǎo)致lysC基因(SEQ IDNO9)中932位核苷酸的替代(從C到T)。在大腸桿菌XL1-blue中轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒制備后，通過[a]測序反應(yīng)證實了lysC基因中所得氨基酸替代Thr311Ile。將該質(zhì)粒命名為pCIS lysC thr311ile并列出為SEQ ID NO10。
通過如Liebl，et al.(1989)FEMS Microbiology Letters 53299-303中描述的電穿孔將質(zhì)粒pCIS lysC thr311ile在谷氨酸棒桿菌ATCC13032中轉(zhuǎn)化。在DE 10046870中描述了該方案的修改。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過如Sambrook et al.(1989)，Molecular Cloning.A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor中描述的DNA印跡和雜交檢查個體轉(zhuǎn)化體的lysC基因座的染色體排列。從而確定所涉及的轉(zhuǎn)化體是通過在lysC基因座通過同源重組整合所轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。在不含抗生素的培養(yǎng)基中過夜生長這些菌落后，將細(xì)胞在蔗糖CM瓊脂培養(yǎng)基(10％蔗糖)上平板接種并在30℃孵育24小時。因為載體pCIS lysC thr311ile中所含sacB基因?qū)⒄崽寝D(zhuǎn)化成毒性產(chǎn)物，所有只有通過在野生型lysC基因和突變基因lysC thr311ile之間第二次同源重組步驟缺失sacB基因的那些菌落可以生長。在同源重組期間，所述野生型基因或者突變的基因與sacB基因一起可以被缺失。如果sacB基因與野生型一起被除去，那么得到突變的轉(zhuǎn)化體。
挑選生長的菌落并檢查卡那霉素敏感表型。具有缺失的SacB基因的克隆必須同時顯示出卡那霉素敏感生長行為。在搖瓶中研究此類卡那霉素敏感克隆的賴氨酸生產(chǎn)力(見實施例6)。為了比較，采用未處理的谷氨酸棒桿菌ATCC13032。選擇與對照相比具有升高的賴氨酸產(chǎn)量的克隆，回收染色體DNA，并通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增lysC基因的對應(yīng)區(qū)并測序。將具有升高的賴氨酸合成和在932位檢測到lysC中突變的性質(zhì)的一個此類克隆稱作ATCC13032 lysCfbr。
實施例7制備質(zhì)粒pK19 mob sacB Peftu果糖-1，6-二磷酸酶根據(jù)Tauch et al.(1995)Plasmid 33168-179或Eikmanns et al.(1994)Microbiology 1401817-1828從谷氨酸棒桿菌ATCC 13032制備染色體DNA。
PCR1使用寡核苷酸引物SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 12，染色體DNA作為模板，和Pfu Turbo聚合酶(公司Stratagene)，通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)根據(jù)如Innis et al.(1990)PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，Academic Press中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增位于延伸因子TU的起始密碼子上游的區(qū)域。
SEQ ID NO 115’-TGGCCGTTACCCTGCGAATG-3’和SEQ ID NO 125’-TGTATGTCCTCCTGGACTTC-3’使用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明純化約200bp大小的所得DNA片段。
PCR2使用寡核苷酸引物SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14，染色體DNA作為模板，和Pfu Turbo聚合酶(公司Stratagene)，通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)根據(jù)如Innis et al.(1990)PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，Academic Press中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增果糖-1，6-二磷酸酶的基因的5’區(qū)。
SEQ ID NO 135’-GAAGTCCAGGAGGACATACAATGAACCTAAAGAACCCCGA-3’和SEQ ID NO 145’-ATCTACGTCGACCCAGGATGCCCTGGATTTC-3’使用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明純化約740bp大小的所得DNA片段。
PCR3使用寡核苷酸引物SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 16，染色體DNA作為模板，和Pfu Turbo聚合酶(公司Stratagene)，通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)根據(jù)如Innis et al.(1990)PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，Academic Press中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增果糖-1，6-二磷酸酶的起始密碼子的上游區(qū)。
SEQ ID NO 155’-TATCAACGCGTTCTTCATCGGTAGCAGCACC-3’和SEQ ID NO 165’-CATTCGCAGGGTAACGGCCACTGAAGGGCCTCCTGGG-3’使用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明純化約720bp大小的所得DNA片段。
PCR4使用寡核苷酸引物SEQ ID NO 17和SEQ ID NO 14，來自PCR1和2的PCR產(chǎn)物作為模板，和Pfu Turbo聚合酶(公司Stratagene)，通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)根據(jù)如Innis et al.(1990)PCR Protocols.AGuide to Methods and Applications，Academic Press中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行融合PCR。使用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明純化約920bp大小的所得DNA片段。
PCR5使用寡核苷酸引物SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 14，來自PCR3和4的PCR產(chǎn)物作為模板，和Pfu Turbo聚合酶(公司Stratagene)，通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)根據(jù)如Innis et al.(1990)PCR Protocols.AGuide to Methods and Applications，Academic Press中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行融合PCR。
使用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明純化約1640bp大小的所得DNA片段。之后，將其使用限制酶MluI和SalI(Roche Diagnostics，Mannheim)切割并使用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit純化DNA片段。
將載體pCIS用限制酶MluI和SalI切割并且電泳分離后通過使用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit分離4.3kb大小的片段。
通過使用Rapid DNA Ligation Kit(Roche Diagnostics，Mannheim)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明將載體片段與來自PCR5的PCR片段連接在一起，并且根據(jù)如Sambrook et al.(Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，(1989))中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法在感受態(tài)大腸桿菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，USA)中轉(zhuǎn)化連接批。通過在含有卡那霉素(20μg/mL)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上平板接種選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
根據(jù)Qiagen公司的方法并使用該公司的材料進(jìn)行質(zhì)粒DNA的制備。根據(jù)Sanger et al.(1977)Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 745463-5467進(jìn)行測序反應(yīng)。通過ABI Prism 377(PE AppliedBiosystems，Weiterstadt)分離測序反應(yīng)物并分析。
所得質(zhì)粒pCIS Peftu果糖-1，6-二磷酸酶列出為SEQ ID NO17。
實施例8賴氨酸的產(chǎn)生通過如Liebl，et al.(1989)FEMS Microbiology Letters 53299-303中描述的電穿孔將質(zhì)粒pCIS Peftu果糖-1，6-二磷酸酶在谷氨酸棒桿菌ATCC13032中轉(zhuǎn)化。在DE 10046870中描述了該方案的修改方案。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過如Sambrook et al.(1989)，Molecular Cloning.ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor中描述的DNA印跡和雜交檢查個體轉(zhuǎn)化體的果糖-1，6-二磷酸酶基因座的染色體排列。從而確定轉(zhuǎn)化體包括在果糖-1，6-二磷酸酶基因座通過同源重組整合所轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。在不含抗生素的培養(yǎng)基中過夜生長這些菌落后，將細(xì)胞在蔗糖CM瓊脂培養(yǎng)基(10％蔗糖)上平板接種并在30℃孵育24小時。
因為載體pCIS Peftu果糖-1，6-二磷酸酶中所含sacB基因?qū)⒄崽寝D(zhuǎn)化成毒性產(chǎn)物，所有只有通過在野生型果糖-1，6-二磷酸酶基因和Peftu果糖-1，6-二磷酸酶融合之間通過第二次同源重組步驟缺失sacB基因的那些菌落可以生長。在同源重組期間，所述野生型基因或者融合物與sacB基因一起可以被缺失。如果sacB基因與野生型一起被除去，那么得到突變的轉(zhuǎn)化體。
挑選生長的菌落并檢查卡那霉素敏感表型。具有缺失的SacB基因的克隆必須同時顯示出卡那霉素敏感生長行為。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢查是否已經(jīng)發(fā)生了所希望的Peftu啟動子對天然啟動子的替代。對于該分析，從起始菌株和所得克隆分離染色體DNA。為此，用牙簽從瓊脂板除去各自克隆并將其懸浮在100μL H2O中并在95℃沸騰長達(dá)10分鐘。在每種情況中，10μL所得溶液用作PCR中的模板。將與Peftu啟動子和果糖-1，6-二磷酸酶基因同源的寡核苷酸用作引物。如下選擇PCR條件最初變性95℃5分鐘；95℃變性30秒；55℃雜交30秒；72℃擴(kuò)增2分鐘；30個循環(huán)；72℃下最后延伸5分鐘。在使用起始菌株的DNA的批中，由于寡核苷酸的選擇，不能形成PCR產(chǎn)物。僅通過Peftu通過第二次重組完成天然啟動子的替代的4個克隆具有所預(yù)期的大小為340bp的帶。總之，在所測試的克隆中，2個克隆是陽性的。將所述克隆命名為ATCC13032lysCfbr Peftu果糖-1，6-二磷酸酶1和2。
為了研究Peftu果糖-1，6-二磷酸酶構(gòu)建體對賴氨酸產(chǎn)生的影響，將菌株ATCC13032，ATCC13032 lysCfbr，和ATCC13032 lysCfbr Peftu果糖-1，6-二磷酸酶1培養(yǎng)在CM板(10.0g/L D-葡萄糖，2.5g/L NaCl，2.0g/L尿素，10.0g/L細(xì)菌用蛋白胨(Difco)，5.0g/L酵母提取物(Difco)，5.0g/L牛肉膏(Difco)，22.0g/L瓊脂(Difco)，高壓滅菌(20min.121℃))上在30℃培養(yǎng)2天。隨后，從平板刮除細(xì)胞并重懸浮在鹽水中。對于主要培養(yǎng)物，將10mL培養(yǎng)基I和0.5g高壓滅菌的CaCO3(Riedel de Haen)與細(xì)胞懸浮物接種在100mL錐形瓶中直到OD600為1.5并在Infors AJ118型(公司Infors，Bottmingen，Switzerland)[搖動培養(yǎng)箱]上以220轉(zhuǎn)/分鐘孵育39小時。隨后，確定培養(yǎng)基中分離的賴氨酸濃度。
培養(yǎng)基I40g/L 蔗糖60g/L 糖蜜(相對于1000％糖含量計算)10g/L(NH4)2SO40.4g/L MgSO4*7H2O0.6g/L KH2PO40.3mg/L 硫胺素*HCl1mg/L 生物素(來自用NH4OH調(diào)節(jié)到pH 8.0的1mg/mL無菌過濾的貯存液)2mg/LFeSO42mg/LMnSO4用NH4OH調(diào)節(jié)到pH 7.8，高壓滅菌(121℃，20min)。
此外，將來自貯存液(200μg/mL無菌過濾)的維生素B12(羥鈷氨素，Sigma Chemicals)加入直到終濃度為100μg/L。
在Agilent 1100 Series LC System HPLC系統(tǒng)上根據(jù)Agilent的高壓液相層析進(jìn)行氨基酸濃度的測定。用鄰苯二醛進(jìn)行柱前衍生允許定量所形成的氨基酸；用Hypersil AA柱(Agilent)進(jìn)行氨基酸混合物的分離。
實施例9制備質(zhì)粒pCIS Psod果糖-1，6-二磷酸酶根據(jù)Tauch et al.(1995)Plasmid 33168-179和Eikmanns et al.(1994)Microbiology 1401817-1828從谷氨酸棒桿菌ATCC 13032制備染色體DNA。
PCR1使用寡核苷酸引物SEQ ID NO 18和SEQ ID NO 19，染色體DNA作為模板，和Pfu Turbo聚合酶(公司Stratagene)，通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)根據(jù)如Innis et al.(1990)PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，Academic Press中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增位于超氧化物歧化酶的起始密碼子上游的區(qū)域。
SEQ ID NO 185’-TAGCTGCCAATTATTCCGGG-3’和SEQ ID NO 195’-GGGTAAAAAATCCTTTCGTA-3’使用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明純化約200bp大小的所得DNA片段。
PCR2使用寡核苷酸引物SEQ ID NO 20和SEQ ID NO 21，染色體DNA作為模板，和Pfu Turbo聚合酶(公司Stratagene)，通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)根據(jù)如Innis et al.(1990)PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，Academic Press中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增果糖-1，6-二磷酸酶的基因的5’區(qū)。
SEQ ID NO 205’-CCCGGAATAATTGGCAGCTACTGAAGGGCCTCCTGGG-3’和SEQ ID NO 215’-TATCAACGCGTTCTTCATCGGTAGCAGCACC-3’使用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明純化約720bp大小的所得DNA片段。
PCR3使用寡核苷酸引物SEQ ID NO 22和SEQ ID NO 23，染色體DNA作為模板，和Pfu Turbo聚合酶(公司Stratagene)，通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)根據(jù)如Innis et al.(1990)PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，Academic Press中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增果糖-1，6-二磷酸酶的起始密碼子上游的區(qū)域。
SEQ ID NO 225’-TACGAAAGGATTTTTTACCCATGAACCTAAAGAACCCCGA-3’和SEQ ID NO 235’-ATCTACGTCGACCCAGGATGCCCTGGATTTC-3’使用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明純化約740bp大小的所得DNA片段。
PCR4使用寡核苷酸引物SEQ ID NO 18和SEQ ID NO 23，來自PCR1和3的PCR產(chǎn)物作為模板，和Pfu Turbo聚合酶(公司Stratagene)，通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)根據(jù)如Innis et al.(1990)PCR Protocols.AGuide to Methods and Applications，Academic Press中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行融合PCR。使用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明純化約930bp大小的所得DNA片段。
PCR5使用寡核苷酸引物SEQ ID NO 21和SEQ ID NO 23，來自PCR2和4的PCR產(chǎn)物作為模板，和Pfu Turbo聚合酶(公司Stratagene)，通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)根據(jù)如Innis et al.(1990)PCR Protocols.AGuide to Methods and Applications，Academic Press中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行融合PCR。
使用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明純化約1650bp大小的所得DNA片段。之后，將其使用限制酶MluI和SalI(Roche Diagnostics，Mannheim)切割并使用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit純化DNA片段。
將載體pCIS用限制酶MluI和SalI切割并且電泳分離后通過使用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit分離4.3kb大小的片段。
通過使用Rapid DNA Ligation Kit(Roche Diagnostics，Mannheim)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明將載體片段與來自PCR5的PCR片段連接在一起，并且根據(jù)如Sambrook et al.(Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，(1989))中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法在感受態(tài)大腸桿菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，USA)中轉(zhuǎn)化連接批。通過在含有卡那霉素(20μg/mL)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上平板接種篩選攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
根據(jù)Qiagen公司的方法并使用該公司的材料進(jìn)行質(zhì)粒DNA的制備。根據(jù)Sanger et al.(1977)Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 745463-5467進(jìn)行測序反應(yīng)。通過ABI Prism 377(PE AppliedBiosystems，Weiterstadt)分離測序反應(yīng)物并分析。
所得質(zhì)粒pCIS Psod果糖-1，6-二磷酸酶列出為SEQ ID NO24。
實施例10賴氨酸的產(chǎn)生通過如Liebl，et al.(1989)FEMS Microbiology Letters 53299-303中描述的電穿孔將質(zhì)粒pCIS Psod果糖-1，6-二磷酸酶在谷氨酸棒桿菌ATCC13032中轉(zhuǎn)化。在DE 10046870中描述了該方案的改進(jìn)方案。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過如Sambrook et al.(1989)，Molecular Cloning.ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor中描述的DNA印跡和雜交檢查個體轉(zhuǎn)化體的果糖-1，6-二磷酸酶基因座的染色體排列。從而確定轉(zhuǎn)化體包含在果糖-1，6-二磷酸酶基因座通過同源重組整合所轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。在不含抗生素的培養(yǎng)基中過夜生長這些菌落后，將細(xì)胞在蔗糖CM瓊脂培養(yǎng)基(10％蔗糖)上平板接種并在30℃孵育24小時。
因為載體pCIS Psod果糖-1，6-二磷酸酶中所含sacB基因?qū)⒄崽寝D(zhuǎn)化成毒性產(chǎn)物，所有只有在野生型果糖-1，6-二磷酸酶基因和Psod果糖-1，6-二磷酸酶融合之間通過第二次同源重組步驟缺失sacB基因的那些菌落可以生長。在同源重組期間，所述野生型基因或者融合物與sacB基因一起可以被缺失。如果sacB基因與野生型一起被除去，那么得到突變的轉(zhuǎn)化體。
挑選生長的菌落并檢查卡那霉素敏感表型。具有缺失的SacB基因的克隆必須同時顯示出卡那霉素敏感生長行為。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢查是否已經(jīng)發(fā)生了所希望的Psod啟動子對天然啟動子的替代。對于該分析，從起始菌株和所得克隆分離染色體DNA。為此，用牙簽從瓊脂板除去各自克隆并將其懸浮在100μL H2O中并在95℃沸騰長達(dá)10分鐘。在每種情況中，10μL所得溶液用作PCR中的模板。將與Psod啟動子和果糖-1，6-二磷酸酶基因同源的寡核苷酸用作引物。如下選擇PCR條件最初變性95℃5分鐘；95℃變性30秒；55℃雜交30秒；72℃擴(kuò)增2分鐘；30個循環(huán)；72℃下最后延伸5分鐘。在使用起始菌株的DNA的批中，由于寡核苷酸的選擇，不能形成PCR產(chǎn)物。僅通過Psod通過第二次重組完成天然啟動子的替代的3個克隆具有所預(yù)期的大小為350bp的帶。總之，在所測試的克隆中，3個克隆是陽性的。將所述克隆命名為ATCCl3032 lysCfbrPsod果糖-1，6-二磷酸酶1、2，和3。
為了研究Psod果糖-1，6-二磷酸酶構(gòu)建體對賴氨酸生產(chǎn)的影響，將菌株ATCCl3032，ATCCl3032 lysCfbr，和ATCCl3032 lysCfbr Psod果糖-1，6-二磷酸酶1培養(yǎng)在CM板(10.0g/L D-葡萄糖，2.5g/L NaCl，2.0g/L尿素，10.0g/L細(xì)菌用蛋白胨(Difco)，5.0g/L酵母提取物(Difco)，5.0g/L牛肉膏(Difco)，22.0g/L瓊脂(Difco)，高壓滅菌(20min.121℃))上在30℃培養(yǎng)2天。隨后，從平板刮除細(xì)胞并重懸浮在鹽水中。對于主要培養(yǎng)物，將10mL培養(yǎng)基I和0.5g高壓滅菌的CaCO3(Riedel de Haen)與細(xì)胞懸浮物接種在100mL錐形瓶中直到OD600為1.5并在Infors AJ118型(公司Infors，Bottmingen，Switzerland)[搖動培養(yǎng)箱]上以220轉(zhuǎn)/分鐘孵育39小時。隨后，確定培養(yǎng)基中分離的賴氨酸濃度。
培養(yǎng)基I40g/L 蔗糖60g/L 糖蜜(相對于1000％糖含量計算)10g/L(NH4)2SO40.4g/L MgSO4*7H2O0.6g/L KH2PO40.3mg/L 硫胺素*HCl1mg/L 生物素(來自用NH4OH調(diào)節(jié)到pH 8.0的1mg/mL無菌過濾的貯存液)2mg/LFeSO42mg/LMnSO4用NH4OH調(diào)節(jié)到pH 7.8，高壓滅菌(121℃，20min)。
此外，將來自貯存液(200μg/mL無菌過濾)的維生素B12(羥鈷氨素，Sigma Chemicals)加入直到終濃度為100μg/L。
在Agilent 1100 Series LC System HPLC系統(tǒng)上根據(jù)Agilent的高壓液相層析進(jìn)行氨基酸濃度的測定。用鄰苯二醛進(jìn)行柱前衍生允許定量所形成的氨基酸；用Hypersil AA柱(Agilent)進(jìn)行氨基酸混合物的分離。
等同方案本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到或者使用不過僅僅一種常規(guī)實驗方法就能夠確定本文描述的本發(fā)明的特定實施方案的許多等同方案。此類等同方案意在被下面的權(quán)利要求書包括。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>通過發(fā)酵制備精細(xì)化學(xué)品的方法<130>BGI-158PC2<150>PCT/IB2003/006456<151>2003-12-18<160>24<170>FastSEQ for Windows版本4.0<210>1<211>1070<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>CDS<222>(22)…(1029)<400>1gtgccccagg aggcccttca g atg aac cta aag aac ccc gaa acg cca gac51Met Asn Leu Lys Asn Pro Glu Thr Pro Asp1 5 10cgt aac ctt gct atg gag ctg gtg cga gtt acg gaa gca gct gca ctg99Arg Asn Leu Ala Met Glu Leu Val Arg Val Thr Glu Ala Ala Ala Leu15 20 25gct tct gga cgt tgg gtt gga cgt ggc atg aag aat gaa ggc gac ggt147Ala Ser Gly Arg Trp Val Gly Arg Gly Met Lys Asn Glu Gly Asp Gly30 35 40gcc gct gtt gac gcc atg cgc cag ctc atc aac tca gtg acc atg aag195Ala Ala Val Asp Ala Met Arg Gln Leu Ile Asn Ser Val Thr Met Lys45 50 55ggc gtc gtt gtt atc ggc gag ggc gaa aaa gac gaa gct cca atg ctg243Gly Val Val Val Ile Gly Glu Gly Glu Lys Asp Glu Ala Pro Met Leu60 65 70tac aac ggc gaa gag gtc gga acc ggc ttt gga cct gag gtt gat atc291Tyr Asn Gly Glu Glu Val Gly Thr Gly Phe Gly Pro Glu Val Asp Ile75 80 85 90gca gtt gac cca gtt gac ggc acc acc ctg atg gct gag ggt cgc ccc339Ala Val Asp Pro Val Asp Gly Thr Thr Leu Met Ala Glu Gly Arg Pro95 100 105aac gca att tcc att ctc gca gct gca gag cgt ggc acc atg tac gat387Asn Ala Ile Ser Ile Leu Ala Ala Ala Glu Arg Gly Thr Met Tyr Asp110 115 120cca tcc tcc gtc ttc tac atg aag aag atc gcc gtg gga cct gag gcc435Pro Ser Ser Val Phe Tyr Met Lys Lys Ile Ala Val Gly Pro Glu Ala
125 130 135gca ggc aag atc gac atc gaa gct cca gtt gcc cac aac atc aac gcg483Ala Gly Lys Ile Asp Ile Glu Ala Pro Val Ala His Asn Ile Asn Ala140 145 150gtg gca aag tcc aag gga atc aac cct tcc gac gtc acc gtt gtc gtg531Val Ala Lys Ser Lys Gly Ile Asn Pro Ser Asp Val Thr Val Val Val155 160 165 170ctt gac cgt cct cgc cac atc gaa ctg atc gca gac att cgt cgt gca579Leu Asp Arg Pro Arg His Ile Glu Leu Ile Ala Asp Ile Arg Arg Ala175 180 185ggc gca aag gtt cgt ctc atc tcc gac ggc gac gtt gca ggt gca gtt627Gly Ala Lys Val Arg Leu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ala Gly Ala Val190 195 200gca gca gct cag gat tcc aac tcc gtg gac atc atg atg ggc acc ggc675Ala Ala Ala Gln Asp Ser Asn Ser Val Asp Ile Met Met Gly Thr Gly205 210 215gga acc cca gaa ggc atc atc act gcg tgc gcc atg aag tgc atg ggt723Gly Thr Pro Glu Gly Ile Ile Thr Ala Cys Ala Met Lys Cys Met Gly220 225 230ggc gaa atc cag ggc atc ctg gcc cca atg aac gat ttc gag cgc cag771Gly Glu Ile Gln Gly Ile Leu Ala Pro Met Asn Asp Phe Glu Arg Gln235 240 245 250aag gca cac gac gct ggt ctg gtt ctt gat cag gtt ctg cac acc aac819Lys Ala His Asp Ala Gly Leu Val Leu Asp Gln Val Leu His Thr Asn255 260 265gat ctg gtg agc tcc gac aac tgc tac ttc gtg gca acc ggt gtg acc867Asp Leu Val Ser Ser Asp Asn Cys Tyr Phe Val Ala Thr Gly Val Thr270 275 280aac ggt gac atg ctc cgt ggc gtt tcc tac cgc gca aac ggc gca acc915Asn Gly Asp Met Leu Arg Gly Val Ser Tyr Arg Ala Asn Gly Ala Thr285 290 295acc cgt tcc ctg gtt atg cgc gca aag tca ggc acc atc cgc cac atc963Thr Arg Ser Leu Val Met Arg Ala Lys Ser Gly Thr Ile Arg His Ile300 305 310gag tct gtc cac cag ctg tcc aag ctg cag gaa tac tcc gtg gtt gac1011Glu Ser Val His Gln Leu Ser Lys Leu Gln Glu Tyr Ser Val Val Asp315 320 325 330tac acc acc gcg acc taa gagctcttag ttcgaaaaac cgccggccat 1059Tyr Thr Thr Ala Thr *335tgtggtcggc g 1070<210>2<211>335<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌
<400>2Met Asn Leu Lys Asn Pro Glu Thr Pro Asp Arg Asn Leu Ala Met Glu1 5 10 15Leu Val Arg Val Thr Glu Ala Ala Ala Leu Ala Ser Gly Arg Trp Val20 25 30Gly Arg Gly Met Lys Asn Glu Gly Asp Gly Ala Ala Val Asp Ala Met35 40 45Arg Gln Leu Ile Asn Ser Val Thr Met Lys Gly Val Val Val Ile Gly50 55 60Glu Gly Glu Lys Asp Glu Ala Pro Met Leu Tyr Asn Gly Glu Glu Val65 70 75 80Gly Thr Gly Phe Gly Pro Glu Val Asp Ile Ala Val Asp Pro Val Asp85 90 95Gly Thr Thr Leu Met Ala Glu Gly Arg Pro Asn Ala Ile Ser Ile Leu100 105 110Ala Ala Ala Glu Arg Gly Thr Met Tyr Asp Pro Ser Ser Val Phe Tyr115 120 125Met Lys Lys Ile Ala Val Gly Pro Glu Ala Ala Gly Lys Ile Asp Ile130 135 140Glu Ala Pro Val Ala His Asn Ile Asn Ala Val Ala Lys Ser Lys Gly145 150 155 160Ile Asn Pro Ser Asp Val Thr Val Val Val Leu Asp Arg Pro Arg His165 170 175Ile Glu Leu Ile Ala Asp Ile Arg Arg Ala Gly Ala Lys Val Arg Leu180 185 190Ile Ser Asp Gly Asp Val Ala Gly Ala Val Ala Ala Ala Gln Asp Ser195 200 205Asn Ser Val Asp Ile Met Met Gly Thr Gly Gly Thr Pro Glu Gly Ile210 215 220Ile Thr Ala Cys Ala Met Lys Cys Met Gly Gly Glu Ile Gln Gly Ile225 230 235 240Leu Ala Pro Met Asn Asp Phe Glu Arg Gln Lys Ala His Asp Ala Gly245 250 255Leu Val Leu Asp Gln Val Leu His Thr Asn Asp Leu Val Ser Ser Asp260 265 270Asn Cys Tyr Phe Val Ala Thr Gly Val Thr Asn Gly Asp Met Leu Arg275 280 285Gly Val Ser Tyr Arg Ala Asn Gly Ala Thr Thr Arg Ser Leu Val Met290 295 300Arg Ala Lys Ser Gly Thr Ile Arg His Ile Glu Ser Val His Gln Leu305 310 315 320Ser Lys Leu Gln Glu Tyr Ser Val Val Asp Tyr Thr Thr Ala Thr325 330 335<210>3<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的構(gòu)建體<400>3gagagagaga cgcgtcccag tggctgagac gcatc 35<210>4<211>34<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成的構(gòu)建體<400>4ctctctctgt cgacgaattc aatcttacgg cctg34<210>5<211>4323<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<400>5tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gactagttcg gacctaggga 60tatcgtcgac atcgatgctc ttctgcgtta attaacaatt gggatcctct agacccggga 120tttaaatcgc tagcgggctg ctaaaggaag cggaacacgt agaaagccag tccgcagaaa 180cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga aaacgcaagc 240gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga ctgggcggtt 300ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag 360ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca 420agatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac 480gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca 540atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt 600gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg 660tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga 720agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct 780cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg 840gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg 900gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc 960gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat 1020ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac 1080tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt 1140gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct 1200cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg agcgggactc 1260tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca 1320ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga 1380tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca cgctagcggc gcgccggccg 1440gcccggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc 1500gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 1560cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 1620tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 1680cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 1740aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 1800cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 1860gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 1920ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 1980cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 2040aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 2100tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 2160ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 2220tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 2280ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 2340agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaagg ccggccgcgg ccgccatcgg 2400cattttcttt tgcgttttta tttgttaact gttaattgtc cttgttcaag gatgctgtct 2460ttgacaacag atgttttctt gcctttgatg ttcagcagga agctcggcgc aaacgttgat 2520tgtttgtctg cgtagaatcc tctgtttgtc atatagcttg taatcacgac attgtttcct 2580ttcgcttgag gtacagcgaa gtgtgagtaa gtaaaggtta catcgttagg atcaagatcc 2640atttttaaca caaggccagt tttgttcagc ggcttgtatg ggccagttaa agaattagaa 2700acataaccaa gcatgtaaat atcgttagac gtaatgccgt caatcgtcat ttttgatccg 2760cgggagtcag tgaacaggta ccatttgccg ttcattttaa agacgttcgc gcgttcaatt 2820tcatctgtta ctgtgttaga tgcaatcagc ggtttcatca cttttttcag tgtgtaatca 2880
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<223>合成的構(gòu)建體<400>23atctacgtcg acccaggatg ccctggattt c 31<210>24<211>5920<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的構(gòu)建體<400>24cgcgttcttc atcggtagca gcacccgaga ccatgacgcg ggcatcgccc agatccatca 60cacgcagatc acgcacatca gattcctgtg aggtgtaaat tcccacgtcg tggccatcaa 120gatcataaga ctcagaaaga tcacgccagc gagtatcata accagccaca gcatcctcaa 180cggtttcacc agtttgagtg agctgaatat agccctcatc tgcggtgaca tatccaacta 240
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權(quán)利要求
1.增加微生物中通過戊糖磷酸途徑的代謝通量的方法，其包括在一定條件下培養(yǎng)包含經(jīng)失調(diào)的基因的微生物使得通過戊糖磷酸途徑的代謝通量增加。
2.權(quán)利要求1的方法，其中將果糖或蔗糖用作碳源。
3.權(quán)利要求1的方法，其中將果糖用作碳源。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述基因是果糖-1，6-二磷酸酶。
5.權(quán)利要求4的方法，其中果糖-1，6-二磷酸酶基因來自棒桿菌。
6.權(quán)利要求4的方法，其中過表達(dá)果糖-1，6-二磷酸酶基因。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述基因編碼果糖-1，6-二磷酸酶。
8.權(quán)利要求7的方法，其中果糖-1，6-二磷酸酶具有增加的活性。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物是革蘭氏陽性微生物。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物屬于棒桿菌屬。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒桿菌。
12.權(quán)利要求1的方法，其中發(fā)酵所述微生物以產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物還包含一種或多種額外的失調(diào)的基因。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述一種或多種額外的失調(diào)的基因選自ask基因、dapA基因、asd基因、dapB基因、ddh基因、lysA基因、lysE基因、pycA基因、zwf基因、pepCL基因、gap基因、zwa1基因、tkt基因、tad基因、mqo基因、tpi基因、pgk基因、和sigC基因。
15.權(quán)利要求14的方法，其中過表達(dá)所述一種或多種額外的失調(diào)的基因。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述一種或多種額外的失調(diào)的基因編碼選自抗反饋天冬氨酸激酶、二氫吡啶二羧酸合酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、二氨基庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶、賴氨酸輸出蛋白、丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、RPF蛋白質(zhì)前體、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶、menaquinine氧化還原酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸激酶、和RNA-聚合酶σ因子sigC的蛋白質(zhì)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述蛋白質(zhì)具有增加的活性。
18.權(quán)利要求13的方法，其中所述一種或多種額外的失調(diào)的基因選自pepCK基因、mal E基因、glgA基因、pgi基因、dead基因、menE基因、citE基因、mikE17基因、poxB基因、zwa2基因、和sucC基因。
19.權(quán)利要求18的方法，其中減弱、減小或抑制所述一種或多種額外的失調(diào)的基因。
20.權(quán)利要求13的方法，其中所述一種或多種額外的失調(diào)的基因編碼選自烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、蘋果酸酶、糖原合酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、依賴ATP的RNA解旋酶、鄰-琥珀酰基苯甲酸-CoA連接酶、檸檬酸裂合酶β鏈、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子、丙酮酸脫氫酶、RPF蛋白質(zhì)前體、和琥珀酰CoA合成酶的蛋白質(zhì)。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述蛋白質(zhì)具有減小的活性。
22.產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的方法，其包括a)培養(yǎng)其中果糖-1，6-二磷酸酶被失調(diào)的微生物；和b)在培養(yǎng)基或者微生物的細(xì)胞中積累所述精細(xì)化學(xué)品，從而產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品。
23.產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的方法，其包括在一定條件下培養(yǎng)其中至少一種戊糖磷酸生物合成途徑基因或酶被失調(diào)的微生物從而產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述生物合成途徑基因是果糖-1，6-二磷酸酶。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述生物合成途徑酶是果糖-1，6-二磷酸酶。
26.權(quán)利要求22或24的方法，其中果糖-1，6-二磷酸酶表達(dá)增加。
27.權(quán)利要求22或25的方法，其中果糖-1，6-二磷酸酶活性增加。
28.權(quán)利要求22或23的方法，其還包括回收所述精細(xì)化學(xué)品。
29.權(quán)利要求22或23的方法，其中失調(diào)一種或多種額外的基因。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述一種或多種額外的失調(diào)的基因選自ask基因、dapA基因、asd基因、dapB基因、ddh基因、lysA基因、lysE基因、pycA基因、zwf基因、pepCL基因、gap基因、zwa1基因、tkt基因、tad基因、mqo基因、tpi基因、pgk基因、和sigC基因。
31.權(quán)利要求30的方法，其中過表達(dá)所述一種或多種額外的失調(diào)的基因。
32.權(quán)利要求29的方法，其中所述一種或多種額外的失調(diào)的基因編碼選自抗反饋天冬氨酸激酶、二氫吡啶二羧酸合酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、二氨基庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶、賴氨酸輸出蛋白、丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、RPF蛋白質(zhì)前體、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶、menaquinine氧化還原酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸激酶、和RNA-聚合酶σ因子sigC的蛋白質(zhì)。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述蛋白質(zhì)具有增加的活性。
34.權(quán)利要求29的方法，其中所述一種或多種額外的失調(diào)的基因選自pepCK基因、mal E基因、glgA基因、pgi基因、dead基因、menE基因、citE基因、mikE17基因、poxB基因、zwa2基因、和sucC基因。
35.權(quán)利要求34的方法，其中減弱、減小或抑制所述一種或多種額外的失調(diào)的基因。
36.權(quán)利要求29的方法，其中所述一種或多種額外的失調(diào)的基因編碼選自烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、蘋果酸酶、糖原合酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、依賴ATP的RNA解旋酶、鄰-琥珀?；郊姿?CoA連接酶、檸檬酸裂合酶β鏈、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子、丙酮酸脫氫酶、RPF蛋白質(zhì)前體、和琥珀酰CoA合成酶的蛋白質(zhì)。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述蛋白質(zhì)具有減小的活性。
38.權(quán)利要求22或23的方法，其中所述微生物是革蘭氏陽性微生物。
39.權(quán)利要求22或23的方法，其中所述微生物屬于棒桿菌屬。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒桿菌。
41.權(quán)利要求22或23的方法，其中所述精細(xì)化學(xué)品是賴氨酸。
42.權(quán)利要求41的方法，其中以至少100g/L的產(chǎn)率產(chǎn)生賴氨酸。
43.權(quán)利要求41的方法，其中以至少150g/L的產(chǎn)率產(chǎn)生賴氨酸。
44.權(quán)利要求22或23的方法，其中將果糖或者蔗糖用作碳源。
45.權(quán)利要求22或23的方法，其中將果糖用作碳源。
46.權(quán)利要求22或24的方法，其中果糖-1，6-二磷酸酶包含SEQ IDNO1的核苷酸序列。
47.權(quán)利要求22或24的方法，其中果糖-1，6-二磷酸酶編碼包含SEQID NO2的氨基酸序列的多肽。
48.重組微生物，其具有失調(diào)的戊糖磷酸生物合成途徑。
49.重組微生物，包含失調(diào)的戊糖磷酸生物合成基因。
50.權(quán)利要求49的重組微生物，其中所述失調(diào)的基因是果糖-1，6-二磷酸酶。
51.權(quán)利要求50的重組微生物，其中果糖-1，6-二磷酸酶表達(dá)增加。
52.權(quán)利要求50的重組微生物，其中所述果糖-1，6-二磷酸酶基因編碼具有增加的活性的果糖-1，6-二磷酸酶蛋白質(zhì)。
53.權(quán)利要求49的重組微生物，其中所述微生物屬于棒桿菌屬。
54.權(quán)利要求53的重組微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒桿菌。
55.SEQ ID NO1的核苷酸序列編碼的多肽，其中所述多肽具有果糖-1，6-二磷酸酶活性。
全文摘要
本發(fā)明描述了通過失調(diào)酶編碼基因，即果糖－1，6－二磷酸酶編碼基因增加從微生物，例如棒桿菌產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品，例如賴氨酸的方法。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了通過增加果糖－1，6－二磷酸酶活性增加谷氨酸棒桿菌中賴氨酸產(chǎn)量的方法。本發(fā)明還提供了通過調(diào)節(jié)朝向草酰乙酸(OAA)的碳通量產(chǎn)生賴氨酸的新方法。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了通過利用果糖或蔗糖作為碳源產(chǎn)生賴氨酸的方法。
文檔編號C12P13/08GK1890372SQ200480036372
公開日2007年1月3日 申請日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月18日
發(fā)明者O·策爾德爾, C·克洛普羅格, H·施羅德, S·哈夫納, B·克勒格爾, P·基弗, E·海因茨勒, C·維特曼 申請人:巴斯福股份公司