專利名稱：定形內胚層的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥和細胞生物學領域。特別是，本發(fā)明涉及組合物，包括哺乳動物定形內胚層細胞及制備、分離及使用這些細胞的方法。
背景技術：
在1994年，首次在不具有成纖維細胞滋養(yǎng)物的培養(yǎng)物中分離了人多能干細胞，例如胚胎干(ES)細胞和胚胎生殖(EG)細胞(Bongso et al.，1994)，然后在具有成纖維細胞滋養(yǎng)物的培養(yǎng)物中分離了這些干細胞(Hogan，1997)。后來，Thomson、Reubinoff和Shamblott使用使有絲分裂失活的小鼠滋養(yǎng)層建立了人ES和EG細胞的連續(xù)培養(yǎng)物(Reubinoff et al.，2000；Shamblott et al.，1998；Thomson et al.，1998)。
人ES和EG細胞(hESCs)為研究人的早期發(fā)育和對一些諸如糖尿病和帕金森氏病的疾病治療干預提供了新的機會。例如，使用源于hESCs的產生胰島素的細胞將對目前的利用供體胰腺細胞的細胞治療方法提供巨大的改善。然而，目前還不了解怎樣從hESCs產生生成胰島素的β細胞。同樣地，目前對糖尿病的利用來自供體胰腺的胰島細胞的細胞治療受到了移植所需的高質量胰島細胞短缺的限制。對一個I型糖尿病患者的細胞治療需要移植大約8×108的胰腺胰島細胞(Shapiro et al.，2000；Shapiro et al.，2001a；Shapiro et al.，2001b)。同樣地，就需要至少兩個健康供體器官以獲得足夠的胰島細胞進行成功的移植。HESCs提供了一種起始材料的來源，從該材料發(fā)展出基本量的高質量的分化細胞用于人細胞治療。
使hESCs非常適于細胞治療應用的兩種特性是多能性和在長期的培養(yǎng)中保持這些細胞的能力，不會發(fā)生遺傳變化的積累。多能性是指hESCs分化為所有3種原始生殖細胞層(內胚層、中胚層、外胚層)的衍生物的能力，隨后這些原始生殖細胞層形成成體的所有體細胞類型和胚外組織(如，胎盤)以及生殖細胞。雖然多能性賦予了hESCs特別的有用性，但這種特性也給研究和操作這些細胞及其衍生物帶來了特殊的挑戰(zhàn)。由于在分化的hESC培養(yǎng)物中可能產生大量細胞類型，因此，絕大多數(shù)細胞類型產生的效率很低。此外，成功評價任何既定細胞類型的產生關鍵依賴于確定合適的標志物。實現(xiàn)高效率的定向分化對于hESCs的治療應用非常重要。
為了將hESCs作為起始材料用來產生可用于細胞治療應用的細胞，克服前述問題是有益的。例如，為了達到胰島細胞移植治療需要的細胞材料水平，在分化的最早期，將hESCs高效率地定向分化為胰島/β細胞系是有利的。
除分化過程的高效定向分化以外，沿著分化途徑向胰島/β細胞系分化的中間細胞類型的分離和定性，并且將這種細胞作為合適的譜系前體用于分化中的其它步驟，也是有益的。
發(fā)明概述本發(fā)明的一些實施方案涉及包括定形內胚層細胞的細胞培養(yǎng)物，其中所述的定形內胚層細胞為多能細胞，能分化成腸管細胞或衍生于腸管的器官。根據(jù)一些實施方案，定形內胚層細胞為哺乳動物細胞，以及在優(yōu)選實施方案中，定形內胚層細胞為人細胞。在本發(fā)明的一些實施方案中，定形內胚層細胞表達或不顯著表達特定的標志物。在一些實施方案中，定形內胚層細胞表達一或多種標志物，所述標志物選自SOX17、CXCR4、MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1及CRIP1。在其它實施方案中，定形內胚層細胞不顯著表達一或多種標志物，該標志物選自OCT4、α-胎蛋白(AFP)、凝血調節(jié)蛋白(TM)、SPARC及SOX7。
根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，描述了從多能細胞產生定形內胚層的方法。在一些實施方案中，多能細胞衍生于桑椹胚。在一些實施方案中，多能干細胞為干細胞。用于這些方法的干細胞可包括，但不局限于胚胎干細胞。胚胎干細胞可衍生于胚胎內細胞團或胚胎性腺嵴。胚胎干細胞可起源于各種動物種類，這些種類包括，但不局限于各種哺乳動物種類，包括人。在優(yōu)選實施方案中，將人胚胎干細胞用于產生定形內胚層。
在本發(fā)明的一些實施方案中，將一種或多種生長因子用于從多能細胞至定形內胚層細胞的分化過程中。這些用于分化過程的一種或多種生長因子可包括來自TGFβ超家族的生長因子。在這些實施方案中，所述一種或多種生長因子包括Nodal/活化素和/或生長因子TGFβ超家族的BMP亞群。在一些實施方案中，所述一種或多種生長因子選自Nodal、活化素A，活化素B、BMP4、Wnt3a或任何這些生長因子的組合。
本發(fā)明實施方案還涉及富集于定形內胚層細胞中的細胞群。在某些實施方案中，將所述定形內胚層細胞分離或基本純化。在一些實施方案中，所述分離或基本純化的定形內胚層細胞表達SOX17和/或CXRC4標志物，其表達程度高于OCT4、AFP、TM、SPARC和/或SOX7標志物。
還提供了富集具有定形內胚層的細胞群的方法。在一些實施方案中，可將定形內胚層細胞從混合細胞群體中分離或基本純化，通過將所述細胞與一種試劑接觸，該試劑與一種分子結合，該分子位于定形內胚層細胞表面，而不是混合細胞群體中的其它細胞表面，然后分離與試劑結合的細胞。在某些實施方案中，位于所述定形內胚層細胞表面的分子為CXCR4。
本發(fā)明的其它實施方案還涉及CXCR4抗體，SDF-1配體或CXCR4的其它配體，其用于獲得富集的、分離的或基本純化形式的定形內胚層細胞。例如，可將CXCR4抗體、SDF-1配體或CXCR4的另一種配體用作諸如親和分離或磁分離的方法中的試劑，以富集、分離或基本純化與所述試劑結合的定形內胚層細胞。
本文所述的本發(fā)明的其它實施方案涉及諸如細胞培養(yǎng)物的組合物，其包括多能細胞和定形內胚層細胞。在某些實施方案中，細胞培養(yǎng)物同時包括干細胞和定形內胚層細胞。這些培養(yǎng)物中的干細胞數(shù)目可大于、等于或小于該培養(yǎng)物中的定形內胚層細胞數(shù)目。在一些實施方案中，干細胞為人胚胎干細胞。在某些實施方案中，將hESCs保持在滋養(yǎng)層上。在這些實施方案中，所述滋養(yǎng)層細胞可為從人、小鼠或其它合適生物獲得的諸如成纖維細胞的細胞。
在本發(fā)明的一些實施方案中，包括定形內胚層細胞和hESCs的所述組合物還包括一種或多種生長因子。這些生長因子可包括來自TGFβ超家族的生長因子。在這些實施方案中，所述一種或多種生長因子包括Nodal/活化素和/或生長因子TGFβ超家族的BMP亞群。在一些實施方案中，所述一種或多種生長因子選自Nodal、活化素A、活化素B、BMP4、Wnt3a或任何這些生長因子的組合。
本發(fā)明的其它實施方案參考下述編號段落進行描述1.包括人細胞的細胞培養(yǎng)物，其中至少約10％的所述人細胞為定形內胚層細胞，所述的定形內胚層細胞為能分化成腸管細胞或衍生于腸管的器官的多能細胞。
2.段落1所述的細胞培養(yǎng)物，其中至少約50％的所述人細胞為定形內胚層細胞。
3.段落1所述的細胞培養(yǎng)物，其中至少約80％的所述人細胞為定形內胚層細胞。
4.段落1所述的細胞培養(yǎng)物，其中所述的定形內胚層細胞表達選自SOX17和CXCR4的標志物。
5.段落4所述的細胞培養(yǎng)物，其中在所述定形內胚層細胞中，選自SOX17和CXCR4的所述標志物的表達高于選自OCT4、α-胎蛋白(AFP)、凝血調節(jié)蛋白(TM)、SPARC及SOX7的標志物的表達。
6.段落4所述的細胞培養(yǎng)物，其中所述定形內胚層細胞不表達選自OCT4、AFP、TM、SPARC和SOX7的標志物。
7.段落4所述的細胞培養(yǎng)物，其中所述定形內胚層細胞表達選自MIXL1、GATA4和HNF3b的標志物。
8.段落4所述的細胞培養(yǎng)物，其中所述定形內胚層細胞表達選自FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1的標志物。
9.段落1所述的細胞培養(yǎng)物，其中所述定形內胚層細胞表達SOX17和CXCR4。
10.段落9所述的細胞培養(yǎng)物，其中在所述的定形內胚層細胞中，所述SOX17和CXCR4的表達高于OCT4、AFP、TM、SPARC和SOX7的表達。
11.段落9所述的細胞培養(yǎng)物，其中所述定形內胚層細胞不表達OCT4、AFP、TM、SPARC和SOX7。
12.段落9所述的細胞培養(yǎng)物，其中所述定形內胚層細胞表達MIXL1、GATA4和HNF3b。
13.段落9所述的細胞培養(yǎng)物，其中所述定形內胚層細胞表達選自FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1的標志物。
14.段落1所述的細胞培養(yǎng)物，其中在所述的細胞培養(yǎng)物中，對應每一種多能細胞存在至少約2個定形內胚層細胞。
15.段落14所述的細胞培養(yǎng)物，其中所述多能細胞包括胚胎干細胞。
16.段落15所述的細胞培養(yǎng)物，其中所述的胚胎干細胞衍生于選自自桑椹胚、胚胎的內細胞團(ICM)和胚胎的性腺嵴的組織。
17.段落1所述的細胞培養(yǎng)物進一步包括培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包含少于約10％的血清。
18.段落1所述的細胞培養(yǎng)物進一步包括TGFβ超家族的Nodal/活化素亞群的生長因子。
19.段落1所述的細胞培養(yǎng)物，進一步包括選自Nodal、活化素A、活化素B及其組合的生長因子。
20.包括細胞的細胞群，其中至少約90％的所述細胞為人定形內胚層細胞，所述的人定形內胚層細胞為多能細胞，該多能細胞能分化成腸管細胞或衍生于腸管的器官。
21.段落20所述的細胞群，其中至少約95％的所述細胞為人定形內胚層細胞。
22.段落20所述的細胞群，其中至少約98％的所述細胞為人定形內胚層細胞。
23.段落20所述的細胞群，其中所述人定形內胚層細胞表達選自SOX17和CXCR4的標志物。
24.段落23所述的細胞群，其中在所述人定形內胚層細胞中，選自SOX17和CXCR4的所述標志物的表達高于選自OCT4、AFP、TM、SPARC和SOX7的標志物的表達。
25.段落23所述的細胞群，其中所述人定形內胚層細胞不表達選自OCT4、AFP、TM、SPARC和SOX7的標志物。
26.段落23所述的細胞群，其中所述人定形內胚層細胞表達選自MIXL1、GATA4和HNF3b的標志物。
27.段落23所述的細胞群，其中所述定形內胚層細胞表達選自FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1的標志物。
28.段落20所述的細胞群，其中所述人定形內胚層細胞表達SOX17和CXCR4。
29.段落28所述的細胞群，其中在所述的人定形內胚層細胞中，SOX17和CXCR4的表達高于OCT4、AFP、TM、SPARC和SOX7的表達。
30.段落28所述的細胞群，其中所述人定形內胚層細胞不表達OCT4、AFP、TM、SPARC和SOX7。
31.段落28所述的細胞群，其中所述的人定形內胚層細胞表達MIXL1、GATA4和HNF3b。
32.段落28所述的細胞群，其中所述定形內胚層細胞表達選自FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1的標志物。
33.段落20所述的細胞群，其中在所述的細胞群體中，對應每一種多能細胞存在至少約2個定形內胚層細胞。
34.段落33所述的細胞群，其中所述多能細胞包括胚胎干細胞。
35.段落34所述的細胞群，其中所述的胚胎干細胞衍生于選自桑椹胚、胚胎的ICM和胚胎的性腺嵴的組織。
36.產生定形內胚層細胞的方法，所述的方法包括下述步驟獲得包括人多能細胞的細胞群；為所述的細胞群提供至少一種TGFβ超家族生長因子，所述生長因子的量足以促進所述多能細胞分化成定形內胚層細胞，所述的定形內胚層細胞為能分化成腸管細胞或衍生于腸管的器官的多能細胞；以及給予足夠的時間來形成定形內胚層細胞，其中所述的形成定形內胚層細胞的足夠時間以檢測所述細胞群體中定形內胚層細胞的存在來確定。
37.段落36所述的方法，其中至少約10％的所述多能細胞分化成定形內胚層細胞。
38.段落36所述的方法，其中至少約50％的所述多能細胞分化成定形內胚層細胞。
39.段落36所述的方法，其中至少約70％的所述多能細胞分化成定形內胚層細胞。
40.段落36所述的方法，其中至少約80％的所述多能細胞分化成定形內胚層細胞。
41.段落36所述的方法，其中檢測定形內胚層細胞在所述細胞群體中的存在包括在所述細胞群細胞中檢測至少一種選自SOX17和CXCR4的標志物的表達，以及至少一種選自OCT4、AFP、TM、SPARC和SOX7的標志物的表達，其中在所述定形內胚層細胞中，選自SOX17和CXCR4的所述標志物的表達高于選自OCT4、AFP、TM、SPARC和SOX7的所述標志物的表達。
42.段落36所述的方法，其中檢測定形內胚層細胞在所述的細胞群中的存在包括在所述細胞群細胞中檢測至少一種選自SOX17和CXCR4的標志物的表達，以及至少一種選自AFP、TM和SOX7的標志物的表達，其中在所述定形內胚層細胞中，選自SOX17和CXCR4的所述標志物的表達高于選自AFP、TM和SOX7的所述標志物的表達。
43.段落42所述的方法，其中至少一種所述的標志物的表達以Q-PCR來測定。
44.段落42所述的方法，其中至少一種所述的標志物的表達以免疫細胞化學來測定。
45.段落36所述的方法，其中檢測在所述的細胞群體中定形內胚層細胞的存在包括在所述細胞群體細胞中檢測至少一種選自VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1的標志物的表達，以及至少一種選自OCT4、AFP、TM、SPARC和SOX7的標志物的表達，其中在所述的定形內胚層細胞中，選自FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1和CRIP1的標志物的表達高于選自OCT4、AFP、TM、SPARC和SOX7的標志物的表達。
46.段落36所述的方法，其中所述的至少一種生長因子為TGFβ超家族的Nodal/活化素亞群。
47.段落46所述的方法，其中所述的至少一種生長因子選自Nodal、活化素A、活化素B及其組合。
48.段落47所述的方法，其中所述的至少一種生長因子為Nodal。
49.段落47所述的方法，其中所述的至少一種生長因子為活化素A。
50.段落47所述的方法，其中所述的至少一種生長因子為活化素B。
51.段落36所述的方法，其中提供了TGFβ超家族的多種生長因子。
52.段落51所述的方法，其中所述的多種生長因子包括Nodal、活化素A及活化素B。
53.段落36所述的方法，其中所述至少一種生長因子的濃度為至少約10ng/ml。
54.段落36所述的方法，其中所述至少一種生長因子的濃度為至少約100ng/ml。
55.段落36所述的方法，其中所述至少一種生長因子的濃度為至少約500ng/ml。
56.段落36所述的方法，其中所述至少一種生長因子的濃度為至少約1000ng/ml。
57.段落36所述的方法，其中所述至少一種生長因子的濃度為至少約5000ng/ml。
58.段落36所述的方法，其中所述細胞群體生長于包括少于約10％血清的培養(yǎng)基中。
59.段落36所述的方法，其中所述多能細胞包括干細胞。
60.段落59所述的方法，其中所述的多能細胞包括胚胎干細胞。
61.段落60所述的方法，其中所述的胚胎干細胞衍生于選自桑椹胚、胚胎的ICM和胚胎的性腺嵴的組織。
62.以段落36的方法產生的定形內胚層細胞。
63.產生富集的定形內胚層細胞的細胞群方法，包括下述步驟分化多能人細胞群體中的細胞，以產生定形內胚層細胞，所述的定形內胚層細胞為多能細胞，該多能細胞能分化成腸管細胞或衍生于腸管的器官；向所述的細胞群提供試劑，所述試劑與標志物結合，所述標志物表達于所述的定形內胚層細胞中而基本上不表達于所述細胞群中的其它細胞類型中；及將與所述試劑結合的所述定形內胚層細胞與位于所述細胞群中所述其它細胞類型分離，從而產生富集的定形內胚層細胞的細胞群。
64.段落63所述的方法，其中分化步驟進一步包括，獲得包括多能人細胞的細胞群，向所述細胞群體提供所述至少一種TGFβ超家族生長因子，該生長因子的量足以促進將所述多能細胞分化成定形內胚層細胞，所述的定形內胚層細胞為多能細胞，該多能細胞能分化成腸管細胞或衍生于腸管的器官，并給予足夠的時間形成定形內胚層細胞，其中所述的形成定形內胚層細胞的足夠時間以檢測所述細胞群體中定形內胚層細胞的存在來確定。
65.段落63所述的方法，其中檢測包括，在所述細胞群體的細胞中檢測至少一種選自SOX17和CXCR4的標志物的表達，以及至少一種選自OCT4、AFP、TM、SPARC和SOX7的標志物的表達，其中在所述的定形內胚層細胞中，選自SOX17和CXCR4的標志物的表達高于選自OCT4、AFP、TM、SPARC和SOX7的標志物的表達。
66.段落63所述的方法，其中檢測包括，在所述細胞群體的細胞中檢測至少一種選自SOX17和CXCR4的標志物的表達，以及至少一種選自AFP、TM和SOX7的標志物的表達，其中在所述的定形內胚層細胞中，選自SOX17和CXCR4的標志物的表達高于選自AFP、TM和SOX7的標志物的表達。
67.段落63所述的方法，其中檢測包括，在所述細胞群體的細胞中檢測至少一種選自FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1的標志物的表達，以及至少一種選自OCT4、AFP、TM、SPARC和SOX7的標志物的表達，其中在所述的定形內胚層細胞中，選自FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1的標志物的表達高于選自OCT4、AFP、TM、SPARC和SOX7的標志物的表達。
68.段落63所述的方法，其中至少約95％的所述細胞為定形內胚層細胞。
69.段落63所述的方法，其中至少約98％的所述細胞為定形內胚層細胞。
70.段落63所述的方法，其中所述的標志物為CXCR4。
71.段落63所述的方法，其中所述的試劑為抗體。
72.段落71所述方法，其中所述的抗體對CXCR4具有親和性。
73.段落63所述的方法產生的富集定形內胚層細胞的細胞群。
74.段落4或9的任一項所述的細胞培養(yǎng)物，其中所述的定形內胚層細胞不顯著表達選自OCT4、AFP、TM、SPARC和SOX7的標志物。
75.段落23或28的任一段落的細胞群，其中所述的定形內胚層細胞不顯著表達選自OCT4、AFP、TM、SPARC和SOX7的標志物。
應當了解，上述的方法和組合物涉及體外細胞培養(yǎng)。然而，上述的體外分化細胞組合物可于體內應用。
本發(fā)明的其它實施方案還可發(fā)現(xiàn)于下述美國臨時專利申請中，即2003年12月23日提交的美國臨時專利申請第60/532,004號，名為《定形內胚層》；2004年7月9日提交的美國臨時專利申請第60/586,566號，名為《用于分離定形內胚層的趨化因子細胞表面受體》；以及2004年7月14日提交的美國臨時專利申請第60/587,942號，名為《用于分離定形內胚層的細胞表面受體》，本文將這些公開全部引入，以供參考。
附圖簡述

圖1為提出的從hESCs產生β-細胞的分化途徑的示意圖。該途徑中的第一步為將ES細胞轉變?yōu)槎ㄐ蝺扰邔蛹毎担浯磉M一步將ES細胞分化為胰腺內胚層、內分泌腺內胚層或胰島/β-細胞最早的已知步驟之一?？捎糜诮閷Т宿D變的一些因子為TGFβ家族的成員，這些成員包括，但不局限于活化素、nodals和BMPs。確定定形內胚層靶細胞的代表性標志物為SOX17、GATA4、HNF3b、MIX1和CXCR4。
圖2為人SOX17 cDNA圖解，其顯示了保守基序的位置并突出了用于GENOVAC的免疫方法的區(qū)域。
圖3為一種相關性樹狀圖，表明SOX17與SOX7的相關性最強，與SOX18的相關性稍弱。在同源物種中的SOX17蛋白質比相同物種中的SOX群F亞族的其它成員的相關性強得多。
圖4為以大鼠抗SOX17抗體為探針的蛋白質雜交(Western blot)。該雜交證明了該抗體對成纖維細胞中過量表達的人SOX17蛋白質的特異性(泳道1)，以及對EGFP(泳道2)或最相關的SOX家族成員SOX7(泳道3)缺少免疫反應性。
圖5A-B為顯示SOX17+細胞簇的顯微照片，顯示大量的共標記的AFP+細胞(A)。這與其它SOX17+細胞簇(B)觀察到少量AFP+細胞或未觀察到AFP+細胞形成鮮明對比。
圖6A-C為顯示體壁內胚層和SOX17的顯微照片。嵌圖A顯示對人凝血調節(jié)蛋白(TM)的免疫細胞化學，該蛋白質位于隨機分化的hES細胞培養(yǎng)物中的體壁內胚層細胞的細胞表面。嵌圖B為TM和SOX17雙重標志顯示的與嵌圖A相同的區(qū)域。嵌圖C為以DAPI標記核的相同區(qū)域的相差圖像。注意DAPI標記核與SOX17標記完全相關。
圖7A-B為顯示定量PCR(Q-PCR)的SOX17基因表達和SOX17特異性抗體的抗SOX17陽性細胞的直方圖。相對于非分化的對照培養(yǎng)基(SR20)而言，嵌圖A顯示活化素A增加SOX17基因表達，而視黃酸(RA)強烈抑制SOX17表達。嵌圖B表明，相同模式和相似程度的變化反應在SOX17+細胞數(shù)目上，表明SOX17基因表達的Q-PCR測試對單細胞水平的變化是非常敏感的。
圖8A為直方圖，顯示在活化素A存在下分化的hESCs培養(yǎng)物保持低水平的AFP基因表達，而在10％的胎牛血清(FBS)中，細胞隨機分化，顯示AFP嚴重上調。表達水平上的差異大約為7倍。
圖8B-C為兩張顯微照片圖像，顯示了活化素A對AFP表達抑制在單細胞水平也很明顯，相對于僅用10％的FBS(頂部)而言，在活化素A處理的條件中(底部)觀察到的AFP+細胞簇很少而且很小。
圖9A-B為對照圖，顯示使用流式細胞儀定量AFP+細胞數(shù)。該圖表明，在存在(右嵌圖)或不存在(左嵌圖)活化素A時AFP基因表達變化幅度(圖8A)與AFP+細胞數(shù)非常一致，進一步表明Q-PCR分析對顯示在單細胞水平上出現(xiàn)的變化的實用性。
圖10A-F為顯微照片，顯示將hESCs暴露于nodal、活化素A和活化素B(NAA)，在5天時間產生了細胞數(shù)的顯著增加(A-C)。通過比較SOX17+細胞與該區(qū)域存在的細胞總量的相對量，如DAPI顯色核(D-F)所示，可以看出約30-50％的所有細胞在以NAA處理5天后對SOX17具有免疫反應性。
圖11為直方圖，顯示活化素A(0、10、30或100ng/mL)劑量依賴性地增加分化的hESCs的SOX17基因表達。在對粘附培養(yǎng)物處理3天后，繼續(xù)再懸浮培養(yǎng)3～5天，表達增加已經很明顯。
圖12A-C為直方圖，證實了活化素A對MIXL1(嵌圖A)、GATA4(嵌圖B)及HNF3b(嵌圖C)表達的作用。在其它三個定形內胚層標志物MIXL1、GATA4及HNF3b中也觀察到了對活化素呈劑量依賴性的增加。對活化素劑量依賴性增加的表達幅度與SOX17的極其相似，強烈顯示了活化素A特異作用于共表達所有四個基因(SOX17+，MIXL1+，GATA4+andHNF3b+)的細胞群。
圖13A-C為直方圖，證實了活化素A對AFP(嵌圖A)、SOX7(嵌圖B)及SPARC(嵌圖C)表達中的作用?；罨谹劑量依賴性地降低內臟內胚層標志物AFP的表達。原始內胚層(SOX7)及體壁內胚層(SPARC)標志物仍然不變或僅在某些點顯示抑制，表明活化素A并不特異作用于這些胚外內胚層細胞類型。這進一步支持SOX17、MIXL1、GATA4及HNF3b的表達增加是由于活化素A引起定形內胚層細胞數(shù)量的增加。
圖14A-B為直方圖，表明了活化素A對ZIC1(嵌圖A)及Brachyury(嵌圖B)表達的作用。神經標志物ZIC1的持續(xù)表達顯示活化素A對神經分化無劑量依賴性的效果。從brachyury表達降低可以看出，100ng/mL活化素A處理對中胚層的分化有顯著的抑制。這可能是來自中內胚層前體的定形內胚層特異性增加的結果。與無處理的空白對照培養(yǎng)物相比，低水平的活化素A處理(10及30ng/mL)在分化后期時間點保持了brachyury表達。
圖15A-B為顯微照片，活化素處理引起體壁內胚層分化降低。在僅以血清分化的培養(yǎng)物(A)內發(fā)現(xiàn)TMhi體壁內胚層區(qū)域，然而當包括活化素(B)時很少分化為TM+細胞及總免疫反應性的強度較低。
圖16A-D為顯微照片，表明活化素A及活化素B處理引起的標志物表達。連續(xù)以活化素A及活化素B處理hESCs4天，以SOX17、AFP及TM抗體進行三標記。嵌圖A-SOX17；嵌圖B-AFP；嵌圖C-TM；及嵌圖D-Phase/DAPI。注意當完全無AFP(B)及TM(C)免疫反應性時可見大量的SOX17陽性細胞(A)。
圖17是顯微圖片，表明在體外自hESCs出現(xiàn)定形內胚層及內臟內胚層。內臟內胚層區(qū)域以AFPhi/SOX17lo/-鑒定，然而定形內胚層顯示了完全相反的特征，SOX17hi/AFPlo/-。選擇該域是由于這兩個區(qū)域彼此接近，然而，有多次在完全分離的AFPhi細胞區(qū)域觀察到SOX17hi/AFPlo/-區(qū)域，表明部分定形內胚層細胞衍生于內臟內胚層細胞。
圖18為描述TGFβ家族配體及受體的圖表?；罨疉R-Smads及BR-Smads的因子有利于從人胚胎干細胞產生定形內胚層(參見，J CellPhysiol.187265-76)。
圖19為直方圖，表明以單一或多種TGF-β因子處理誘導的SOX17隨時間表達。
圖20為直方圖，表明以多種TGF-β因子處理引起SOX17+細胞數(shù)量隨時間的增加。
圖21為直方圖，表明以多種TGF-β因子處理誘導的SOX17隨時間表達。
圖22為直方圖，表明活化素A劑量依賴性地增加SOX17+細胞數(shù)量。
圖23為直方圖，顯示Wnt3a加入至活化素A及活化素B處理的培養(yǎng)物中增加SOX17表達，高于活化素A及活化素B單獨使用誘導的水平。
圖24A-C為直方圖，表明在低FBS條件下，分化為定形內胚層增加。在包括2％FBS(2AA)的培養(yǎng)基中以活化素A及B處理hESCs與在10％FBS(10AA)(嵌圖A)中同樣條件下處理比，SOX17表達水平高2-3倍。定形內胚層標志物MIXL1(嵌圖B)也以相同的方式受到影響，而且2％FBS對AFP(內臟內胚層)(嵌圖C)的抑制比在10％FBS條件下高。
圖25A-D為顯微照片，顯示培養(yǎng)中的SOX17+細胞分裂。SOX17免疫反應性細胞處于hESC克隆分化邊緣(C，D)，以增殖細胞細胞核抗原(PCNA)(嵌圖B)標記，而不以OCT4(嵌圖C)共標志。此外，以DAPI標記核，在SOX17+細胞(箭頭)及OCT4+，未分化的hESCs(箭頭)(D)中可清晰看見有絲分裂圖片。
圖26為直方圖，顯示在各種培養(yǎng)基中，CXCR4在正在分化的hESCs中的相對表達水平。
圖27A-D為直方圖，通過與圖26相同處理，顯示一系列定形內胚層標志物如何具有非常相似的CXCR4表達模式。
圖28A-E為直方圖，顯示中胚層(BRACHYURY，MOX1)、外胚層(SOX1，ZIC1)及內臟內胚層(SOX7)標志物如何通過與圖26相同處理具有相反的CXCR4表達。
圖29A-F為顯微照片，顯示在圖26-28三種培養(yǎng)基條件下SOX17免疫反應性細胞的相對差異。
圖30A-C為流式細胞儀點圖，證實隨著加入至分化培養(yǎng)基中的活化素A的濃度增加，CXCR4+細胞數(shù)量增加。
圖31A-D為直方圖，顯示高劑量活化素A處理(A100-CX+)后分離的CXCR4+細胞的定形內胚層標志物數(shù)量較其母體細胞群(A100)更為豐富。
圖32為直方圖，顯示使用熒光活化細胞分選器(FACS)分離的CXCR4+及CXCR4-細胞及母體細胞群的基因表達。這證實CXCR4+細胞基本包括所有的在各母體細胞群上存在的CXCR4基因表達，CXCR4-則包括很少或不包括CXCR4基因表達。
圖33A-D為直方圖，證實高劑量活化素A處理的CXCR4+細胞的中胚層(BRACHYURY，MOX1)、外胚層(SOX1，ZIC1)及內臟內胚層(SOX7)基因表達缺失，這些非定形內胚層標志物的表達被抑制。
圖34A-M為直方圖，表明標志物基因表達模式，其可用于鑒定定形內胚層細胞。定形內胚層標志物FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1及CRIP1的表達分析分別如嵌圖G-L所示。前述譜系標志基因SOX17、SOX7、SOX17/SOX7、TM、ZIC1及MOX1分別如嵌圖A-F所示。嵌圖M顯示CXCR4的表達分析。關于嵌圖A-M，標記hESC一欄顯示純化的人胚胎干細胞基因表達；2NF顯示以2％FBS處理的細胞，不加活化素；0.1A100顯示以0.1％FBS、100ng/ml活化素A處理的細胞；1A100顯示以1％FBS、100ng/ml活化素A處理的細胞；2A100顯示以2％FBS、100ng/ml活化素A處理的細胞。
發(fā)明詳述人早期發(fā)育的一個關鍵階段，即術語原腸胚形成發(fā)生在受精2-3周后。原腸胚形成極端重要，因為在此期三個原始胚首先專一化和有序化(Lu et al.，2001；Schoenwolf and Smith，2000)。外胚層負責身體外層及全部神經系統(tǒng)的形成，然而，心臟、血液、骨骼、骨骼肌及其它結締組織均衍生于中胚層。定形內胚層定義為負責全部腸管形成的胚層，該全部的腸管包括食道、胃、小腸及大腸，以及從腸道衍生的器官，如肺、肝、胸腺、甲狀旁腺及甲狀腺、膽囊及胰(Grapin-Botton and Melton，2000；Kimelman and Griffin，2000；Tremblay et al.，2000；Wells and Melton，1999；Wells and Melton，2000)。定形內胚層與稱為原始內胚層的完全分離的細胞系之間有著非常明顯的不同。原始內胚層主要形成胚外組織，主要是胎盤卵黃囊的體壁及內臟內胚層部分及Reichert′s膜的細胞外基質材料。
在原腸胚形成過程中，定形內胚層形成過程始于細胞遷徙事件，其中，中內胚層細胞(能夠形成中胚層或內胚層的細胞組分)穿過一個稱做原線的結構。定形內胚層衍生于穿過原線前部及結(一個位于原線最前面部分的特定結構)的細胞。當遷徙發(fā)生時，定形內胚層首先形成腸管的最前面部分直至形成腸管后端時結束。
定形內胚層形成的體內分析，如Conlon et al.，1994；Feldman et al.，1998；Zhou et al.，1993；Aoki et al.，2002；Dougan et al.，2003；Tremblay etal.，2000；Vincent et al.，2003；Alexander et al.，1999；Alexander and Stainier，1999；Kikuchi et al.，2001；Hudson et al.，1997及小鼠Kanai-Azuma et al.，2002進行的斑馬魚及非洲蟾蜍的研究，這些研究為如何在培養(yǎng)皿中使用人胚胎干細胞完成特定胚層細胞類型的發(fā)育奠定了基礎。與體外ESC培養(yǎng)相關的兩個方面構成了在培養(yǎng)皿中重啟發(fā)育的主要瓶頸。首先，不會產生有序的胚層或器官結構。在正在分化的hESC培養(yǎng)系統(tǒng)中，大部分胚層及器官的特異遺傳標志物會以異源的形式來表達。因此，由于缺乏器官特異性界限，很難估計特異性組織或細胞類型的形成。在一個具體胚層的細胞類型或組織類型中表達的幾乎所有基因也在其它胚層的細胞類型或組織類型中表達。沒有特異的界限，很難以1-3個基因樣本賦予基因表達的特異性。因而，必須仔細檢測相當多的基因，有些基因應當也可在不感興趣器官或組織的具體細胞類型上表達。其次，基因表達類型的時機對沿特定通道發(fā)育的活動至關重要。
至于更復雜的事件，應當指出，體外干細胞分化是相當不同步的且可能比體內要顯著得多。這樣，一組細胞可能在表達與原腸胚形成有關的基因時，而另一組可能正在開始最終的分化。而且，在具有或不具有外源因素參與時，處理hESC單層或胚狀體(EBs)可能導致全部基因表達模式或分化狀態(tài)的顯著差異。因而，為了有效地沿特定的分化通道前進，根據(jù)異質細胞混合物的基因表達模式，外源因子的使用必須進行時間控制。在培養(yǎng)容器里考慮這些細胞的形態(tài)學關系也是有益的。與在培養(yǎng)基容器中成長或分化為單層和/或hESC克隆時能力相比，均一影響形成所謂胚狀體時的hESCs的能力遠非最理想。
作為處理上述異質和不同步的一個有效方法，本發(fā)明的一些實施方案考慮將分化細胞的方法與富集、分離和/或純化分化通道中的中間細胞類型的方法聯(lián)合。
本發(fā)明實施方案涉及在培養(yǎng)物中生成定形內胚層細胞的新的確定方法，其通過將諸如干細胞的多能細胞分化為多能定形內胚層細胞。本文使用的“多能”或“多能細胞”指能產生有限數(shù)量的其它具體細胞類型的細胞類型。如上所述，定形內胚層細胞并不分化為源于外胚層或中胚層的組織，然而，可分化為腸管及源于腸管的器官。在一些優(yōu)選的實施方案中，定形內胚層細胞衍生于hESCs。這些方法提供了有效生成人內胚層衍生的組織，如胰、肝、肺、胃、腸及甲狀腺的基礎。例如，定形內胚層的生成第一步可分化干細胞為功能性的產生胰島素的β細胞。為了獲得有用量的產生胰島素的β細胞，在達到胰島/β細胞前，期望每個分化步驟都是高效的分化步驟。因為干細胞分化為定形內胚層細胞也許代表著生成功能性胰島/β細胞的最初步驟(如圖1所示)，特別需要此步分化高效。
鑒于分化多能細胞至定形內胚層細胞的需要，本發(fā)明一些方面涉及體外方法學，將約50-80％的多能細胞轉變?yōu)槎ㄐ蝺扰邔蛹毎?。典型地，這些方法包括已定義及暫時指定的方式使用培養(yǎng)物及生長因子。使用可與定形內胚層細胞特異結合的試劑，從細胞群中將定形內胚層細胞與其它細胞分離和/或純化，可獲得定形內胚層細胞群的更多富集。這樣，本發(fā)明涉及定形內胚層細胞及制備分離和/或純化這些細胞的方法。
為了確定細胞培養(yǎng)物或細胞群內定形內胚層細胞的數(shù)量，需要從培養(yǎng)物或細胞群中區(qū)分這類細胞與其它細胞的方法。因此，本發(fā)明實施方案涉及細胞標志物，其存在、缺失和/或相對表達水平對定形內胚層是特異的，以及檢測確定這些標志物表達的方法。此處使用的“表達”指材料或物質的產生，或者材料或物質產生的水平或含量。因而，確定特異標志物的表達指檢測表達的標志物的相對或絕對含量，或僅檢測標志物是否存在。此處使用的“標志物”指能夠被觀察或檢測到的任何分子。例如，標志物可包括但不局限于核酸，如特異基因的轉錄本、基因的多肽產物、非基因多肽產物、糖蛋白、糖、糖脂、脂質、脂蛋白或小分子。
在本發(fā)明的一些實施方案，標志物表達的存在與否和/或其水平由定量PCR(Q-PCR)確定。例如，一些遺傳標志物產生的轉錄本量，例如SOX17、CXCR4、OCT4、AFP、TM、SPARC、SOX7、MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1、CRIP1及本文所述的其它標志物，由定量Q-PCR確定。在其它實施方案中，Q-PCR及免疫組化技術用于識別及確定這些標志物的量或相對比例。
通過使用如上述確定的一種或多種合適的標志物表達的方法，在細胞培養(yǎng)物或細胞群內識別定形內胚層細胞以及確定定形內胚層細胞的比例是可能的。例如，在本發(fā)明的一些實施方案中，產生的定形內胚層細胞或細胞群表達SOX17和/或CXCR4基因的水平比非定形內胚層細胞類型或細胞群高約2個數(shù)量級。在其它實施方案中，產生的定形內胚層細胞或細胞群表達SOX17和/或CXCR4基因的水平比非定形內胚層細胞類型或細胞群高2個以上數(shù)量級。在另一些其它實施方案中，產生的定形內胚層細胞或細胞群表達一種或多種選自SOX17、CXCR4、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1及CRIP1的標志物，比非定形內胚層細胞類型或細胞群的表達高約2個或2個以上的數(shù)量級。
本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)物，包括具有大量定形內胚層及包含富集的定形內胚層細胞的細胞群。由此，一些實施方案涉及包括定形內胚層細胞的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中至少約50-80％的細胞為定形內胚層細胞。一個優(yōu)選實施方案涉及包括人細胞的細胞培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物中至少約50-80％人細胞為定形內胚層細胞。由于分化方法的效果可以通過改變一些參數(shù)調節(jié)，包括但不限于細胞生長條件、生長因子濃度及培養(yǎng)步驟的時間，本發(fā)明所述的分化方法可使約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、或大于95％的多能細胞轉化為定形內胚層。在本發(fā)明其它實施方案中，將諸如干細胞群體的多能細胞群轉化為基本純的定形內胚層細胞。
本發(fā)明所述的組合物及方法具有幾個有用的特征。例如，包括定形內胚層的細胞培養(yǎng)物及細胞群，以及制備這些細胞培養(yǎng)物及細胞群的方法可用于模建人發(fā)育的早期階段。此外，本發(fā)明所述的組合物及方法也可用于如糖尿病的疾病的干預治療。例如，由于定形內胚層僅為有限數(shù)量的組織來源，因而其可用于發(fā)育純的組織或細胞類型。
從多能細胞制備定形內胚層包括本文所述的定形內胚層細胞的定形內胚層細胞培養(yǎng)物及組合物可自如胚胎干細胞的多能細胞中制備。本文使用的“胚胎”指有機體發(fā)育階段范圍，其自單個的受精卵開始至除發(fā)育的配子細胞以外不再包含多能或全能細胞的多細胞結構結束。除衍生于配偶子融合的胚胎，術語“胚胎”指衍生于體細胞核轉移的胚胎。優(yōu)選的衍生定形內胚層細胞的方法利用人胚胎干細胞作為制備定形內胚層的起始材料。該方法使用的胚胎干細胞可以是衍生于桑椹胚、胚胎內細胞團或從胚胎性腺嵴獲得的細胞。使用現(xiàn)有技術方法，人干細胞可在培養(yǎng)基中保持多能狀態(tài)而基本不分化。所述的方法，例如，美國專利第5,670，5,690,9265,843，6,200,806及6,251,671號中公開的方法，本文全部引入，以供參考。
在本發(fā)明所述方法的一些實施方案中，hESCs保持在滋養(yǎng)層。在這些實施方案中，任何能夠使hESCs保持在多能狀態(tài)的滋養(yǎng)層可用于本發(fā)明所述的方法中。一個常用的培養(yǎng)人胚胎干細胞的滋養(yǎng)層為一層小鼠成纖維細胞。最近，人成纖維細胞滋養(yǎng)層也已開發(fā)出來用于培養(yǎng)hESCs(參見美國專利申請?zhí)?002/0072117中公開的方法，本文全部引入，以供參考)。本發(fā)明所述方法的其它實施方案允許不使用滋養(yǎng)層保持多能hESCs。這些方法如美國專利申請?zhí)?003/0175956所述，其公開在此全部引入，以供參考。
本發(fā)明所述的人胚胎干細胞可以保持在具有或不具有血清的培養(yǎng)基中。在一些實施方案中，使用血清替代品。在其它實施方案，無血清的培養(yǎng)基技術，如美國專利申請?zhí)?003/0190748所述，其公開在此全部引入，以供參考。
在培養(yǎng)基中保持多能狀態(tài)的干細胞按照常規(guī)傳代，直到分化為定形內胚層。在一些實施方案中，分化至定形內胚層的完成是通過向干細胞培養(yǎng)基中加入TGFβ超家族生長因子，其加入的量足以促進分化至定形內胚層。用于制備定形內胚層的TGFβ超家族生長因子選自Nodal/活化素或BMP亞群。在本發(fā)明所述分化方法的一些實施方案中，生長因子選自Nodal、活化素A、活化素B及BMP4。此外，生長因子Wnt3a及其它Wnt家族成員可用于制備定形內胚層細胞。在本發(fā)明的一些實施方案中，可以使用上述提及的任何生長因子。
在本發(fā)明所述分化方法的一些實施方案中，向細胞中加入的上述生長因子，其在培養(yǎng)基中的濃度足以促進至少部分干細胞分化至定形內胚。在本發(fā)明的一些實施方案中，培養(yǎng)基中上述生長因子的濃度至少約5ng/ml、至少約10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約300ng/ml、至少約400ng/ml、至少約500ng/ml、至少約1000ng/ml、至少約2000ng/ml、至少約3000ng/ml、至少約4000ng/ml、至少約5000ng/ml或大于5000ng/ml。
在本發(fā)明一些實施方案中，上述生長因子加入培養(yǎng)基后需要從細胞培養(yǎng)物除去。例如，生長因子的除去時間約在加入后1天、約2天、約3天、約4、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天或約10天。在一個優(yōu)選實施方案中，生長因子的除去時間約在加入后4天。
定形內胚層細胞的培養(yǎng)可在包含少量血清或無血清的培養(yǎng)基中。在本發(fā)明的一些實施方案中，血清的濃度范圍為約0.05％v/v至約20％v/v。例如，在一些實施方案中，培養(yǎng)基中血清的濃度可以低于約0.05％(v/v)、低于約0.1％(v/v)、低于約0.2％(v/v)、低于約0.3％(v/v)、低于約0.4％(v/v)、低于約0.5％(v/v)、低于約0.6％(v/v)、低于約0.7％(v/v)、低于約0.8％(v/v)、低于約0.9％(v/v)、低于約1％(v/v)、低于約2％(v/v)、低于約3％(v/v)、低于約4％(v/v)、低于約5％(v/v)、低于約6％(v/v)、低于約7％(v/v)、低于約8％(v/v)、低于約9％(v/v)、低于約10％(v/v)、低于約15％(v/v)或低于約20％(v/v)。在一些實施方案中，定形內胚層細胞在無血清下生長。在其它實施方案中，定形內胚層細胞在血清替代品存在下生長。在其它實施方案中，定形內胚層細胞在B27存在下生長。在這些實施方案中，B27添加物的濃度范圍為約0.2％至約20％v/v。
hESC培養(yǎng)至定形內胚層可以通過確定定形內胚層的標志物特征表達監(jiān)測。在一些實施方案中，一些標志物的表達可通過是否存在標志物來確定?？蛇x擇地，一些標志物的表達可通過測定標志物在細胞培養(yǎng)物或細胞群細胞中的水平來確定。在這些實施方案中，可以定性或定量測定標志物的表達。定量標志物基因產生的表達標志物的方法可以使用定量PCR(Q-PCR)。開展Q-PCR的方法為現(xiàn)有技術?，F(xiàn)有技術的其它方法也可用于定量標志物基因的表達。例如，標志物基因產物的表達可以通過使用針對感興趣的特異標志物基因產物的抗體來檢測。在本發(fā)明的一些實施方案中，確定了具有定形內胚層的標志物特征基因的表達，及缺乏顯著表達的hESCs及其它細胞類型的標志物特征基因的表達。
如下述實施例的進一步所述，定形內胚層的一個可靠標志物為SOX17基因。這樣，本發(fā)明所述方法制備的定形內胚層細胞表達SOX17標志物基因，由此產生SOX17基因產物。其它定形內胚層的標志物為MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1。在本發(fā)明的一些實施方案中，定形內胚層細胞表達SOX17標志物基因的水平高于SOX7標志物基因的水平，其具有原始及內臟內胚層特征(參見表1)。此外，在一些實施方案中，SOX17標志物基因表達高于OCT4標志物基因的表達，其具有hESCs的特征。在本發(fā)明其它實施方案中，定形內胚層細胞表達SOX17標志物基因的水平高于AFP、SPARC或凝血調節(jié)蛋白(TM)標志物基因的水平。在本發(fā)明的一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述方法表達SOX17的定形內胚層細胞不表達顯著水平或量的PDX1(PDX1-陰性)。
定形內胚層的其它標志物為CXCR4基因。CXCR4基因編碼細胞表面趨化因子受體，其配體為趨化物SDF-1。成年人中包含CXCR4受體的細胞的主要作用據(jù)信為遷移造血細胞至骨髓、運載淋巴細胞、分化各種B細胞及巨噬血細胞系[Kim，C.，and Broxmeyer，H.J.LeukocyteBiol.65，6-15(1999)]。CXCR4受體也起著HIV-1進入T細胞中的共受體作用[Feng，Y.，et al.Science，272，872-877(1996)]。在一系列[McGrath，K.E.etal.Dev.Biology213，442-456(1999)]開展的研究中，描述了在成年小鼠及其早期發(fā)育中趨化因子受體CXCR4及其獨特配體SDF-1的表達[Kim，C.，andBroxmyer，H.，J.Leukocyte Biol.65，6-15(1999)]。CXCR4/SDF1在發(fā)育中的相互作用已經清楚，在轉基因小鼠中，當其中任一基因破壞[Nagasawa et al.Nature，382，635-638(1996)]，Ma，Q.，et alImmunity，10，463-471(1999)]都導致晚期胚胎死亡。McGrath等使用核糖核酸酶保護及原位雜交方法證實，在形成原腸胚的早期(E7.5)，CXCR4為最豐富的趨化因子受體信使RNA。處于原腸胚階段，CXCR4/SDF-1信號似乎主要誘導原線細胞的遷移，并表達在此時存在的定形內胚層、中胚層及外胚層上。在E7.2-7.8小鼠胚胎中，CXCR4及α胎蛋白互相排斥，顯示在內臟內胚層缺乏表達[McGrath，K.E.et al.Dev.Biology 213，442-456(1999)]。
在本發(fā)明的一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述方法制備的定形內胚層細胞表達CXCR4標志物基因。其它實施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述方法制備的定形內胚層細胞表達CXCR4標志物基因及其它定形內胚層標志物，包括但不限于SOX17、MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1及CRIP1。在本發(fā)明一些實施方案中，定形內胚層細胞表達CXCR4標志物基因的水平高于SOX7標志物基因。此外，在一些實施方案中，CXCR4標志物基因表達高于OCT4標志物基因表達的水平。在本發(fā)明其它實施方案中，定形內胚層細胞表達CXCR4標志物基因的水平高于AFP、SPARC或凝血調節(jié)蛋白(TM)標志物基因的水平。在本發(fā)明一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的方法制備表達CXCR4的定形內胚層細胞不表達顯著水平或量的PDX1(PDX1-陰性)。
應當理解，在內胚層細胞中CXCR4的表達并不排斥SOX17的表達。相應地，在本發(fā)明一些實施方案中，定形內胚層細胞表達SOX17和CXCR4標志物基因的水平均高于SOX7標志物基因的水平。此外，在一些實施方案中，SOX17及CXCR4標志物基因的表達均高于OCT4標志物基因的表達。在本發(fā)明的其它實施方案中，定形內胚層細胞表達SOX17及CXCR4標志物基因的水平高于AFP、SPARC或凝血調節(jié)蛋白(TM)標志物基因的水平。在本發(fā)明一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的方法制備表達SOX17/CXCR4的定形內胚層細胞不表達顯著水平或量的PDX1(PDX1-陰性)。
應當理解，根據(jù)分化條件，在定形內胚層細胞內誘導不同水平范圍的SOX17和/或CXCR4標志物表達。這樣，在本發(fā)明一些實施方案中，SOX17標志物和/或CXCR4標志物在定形內胚層細胞或細胞群的表達比SOX17標志物和/或CXCR4標志物在諸如多能干細胞的非定形內胚層細胞或細胞群中的表達至少高約2倍至至少約10,000倍。在本發(fā)明其它實施方案中，SOX17標志物和/或CXCR4標志物在定形內胚層細胞或細胞群的表達比SOX17標志物和/或CXCR4標志物在諸如多能干細胞的非定形內胚層細胞或細胞群表達高至少約4倍、至少約6倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約40倍、至少約80倍、至少約100倍、至少約150倍、至少約200倍、至少約500倍、至少約750倍、至少約1000倍、至少約2500倍、至少約5000倍、至少約7500倍或至少約10,000倍。在一些實施方案中，SOX17標志物和/或CXCR4標志物在定形內胚層細胞或細胞群的表達無限制地高于SOX17標志物和/或CXCR4標志物在諸如多能干細胞的非定形內胚層細胞或細胞群表達。
應當理解，在本發(fā)明一些實施方案中，與在非定形內胚層細胞或細胞群中的GATA4、MIXL1、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1及CRIP1標志物的表達相比，在定形內胚層細胞或細胞群體中的GATA4、MIXL1、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1及CRIP1標志物的表達增加。
也應當理解，在定形內胚層細胞內，SOX17標志物的表達水平與OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物表達水平存在差異范圍。類似地，在定形內胚層細胞內，CXCR4標志物的表達水平與OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物表達水平存在差異范圍。類似地，在本發(fā)明一些實施方案中，SOX17標志物或CXCR4標志物的表達比OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達高至少約2倍至至少約10,000倍。在本發(fā)明其它實施方案中，SOX17標志物或CXCR4標志物的表達比OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達高至少約4倍、至少約6倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約40倍、至少約80倍、至少約100倍、至少約150倍、至少約200倍、至少約500倍、至少約750倍、至少約1000倍、至少約2500倍、至少約5000倍、至少約7500倍或至少約10,000倍。在一些實施方案中，OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物在定形內胚層細胞表達不顯著。
應當理解，在本發(fā)明一些實施方案中，在定形內胚層細胞內，與OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7相比，選自GATA4、MIXL1、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1及CRIP1的標志物的表達增加。
包括定形內胚層的組合物本發(fā)明一些方面涉及諸如細胞群體及細胞培養(yǎng)物的組合物，其包括諸如干細胞的多能細胞及定形內胚層細胞。例如，使用本發(fā)明所述的方法，可以制備包括hESCs混合物及定形內胚層細胞的組合物。在一些實施方案中，制備的組合物中每包括95個多能細胞就包括至少約5個定形內胚層細胞。在其它實施方案中，每包括5個多能細胞就包括至少約95個定形內胚層細胞。此外，組合物包括其它比例的定形內胚層細胞與多能細胞。例如，在組合物中，每包括1,000,000個多能細胞就包括至少約1個定形內胚層細胞、每包括100,000個多能細胞就包括至少約1個定形內胚層細胞、每包括100,000個多能細胞就包括至少約1個定形內胚層細胞、每包括10,000個多能細胞就包括至少約1個定形內胚層細胞、每包括1,000個多能細胞就包括至少約1個定形內胚層細胞、每包括500個多能細胞就包括至少約1個定形內胚層細胞、每包括100個多能細胞就包括至少約1個定形內胚層細胞、每包括10個多能細胞就包括至少約1個定形內胚層細胞、每包括5個多能細胞就包括至少約1個定形內胚層細胞、每包括2個多能細胞就包括至少約1個定形內胚層細胞、每包括1個多能細胞就包括至少約2個定形內胚層細胞、每包括1個多能細胞就包括至少約5個定形內胚層細胞、每包括1個多能細胞就包括至少約10個定形內胚層細胞、每包括1個多能細胞就包括至少約20個定形內胚層細胞、每包括1個多能細胞就包括至少約50個定形內胚層細胞、每包括1個多能細胞就包括至少約100個定形內胚層細胞、每包括1個多能細胞就包括至少約1,000個定形內胚層細胞、每包括1個多能細胞就包括至少約10,000個定形內胚層細胞、每包括1個多能細胞就包括至少約100,000個定形內胚層細胞、每包括1個多能細胞就包括至少約1,000,000個定形內胚層細胞。在本發(fā)明一些實施方案中，多能細胞為人多能干細胞。在一些實施方案中，干細胞衍生于桑椹胚、胚胎內細胞團或胚胎的性腺嵴。在一些其它實施方案中，多能細胞衍生于已經過胚胎階段發(fā)育的多細胞結構的性腺或生殖組織。
本發(fā)明一些方面涉及細胞培養(yǎng)物或細胞群，包括至少約5％定形內胚層細胞至至少約95％定形內胚層細胞。在一些實施方案中，細胞培養(yǎng)物或細胞群包括哺乳動物細胞。在優(yōu)選實施方案中，細胞培養(yǎng)物或細胞群包括人細胞。例如，一些具體實施方案中涉及細胞培養(yǎng)物，包括人細胞，其中至少約5％至至少約95％人細胞為定形內胚層細胞。本發(fā)明其它實施方案涉及細胞培養(yǎng)物，包括人細胞，其中至少約5％、至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％或大于90％的人細胞為定形內胚層細胞。
本發(fā)明其它實施方案涉及諸如細胞培養(yǎng)物或細胞群體的組合物，其包括諸如人定形內胚層細胞的人細胞，其中在至少在約5％的人細胞中SOX17或CXCR4標志物的表達均大于OCT4、SPARC、α胎蛋白(AFP)、凝血調節(jié)蛋白(TM)和/或SOX7標志物的表達。在其它實施方案中，其中在至少在約10％的人細胞中、至少約15％的人細胞中、至少約20％的人細胞中、至少約25％的人細胞中、至少約30％的人細胞中、至少約35％的人細胞中、至少約40％的人細胞中、至少約45％的人細胞中、至少約50％的人細胞中、至少約55％的人細胞中、至少約60％的人細胞中、至少約65％的人細胞中、至少約70％的人細胞中、至少約75％的人細胞中、至少約80％的人細胞中、至少約85％的人細胞中、至少約90％的人細胞中、至少約95％人細胞中或大于95％人細胞中，SOX17或CXCR4標志物的表達均大于OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達。
應當理解，本發(fā)明一些實施方案涉及諸如細胞培養(yǎng)物或細胞群的組合物，其包括如人定形內胚層細胞的人細胞，其中在至少約5％至大于至少約95％人細胞中，其中選自GATA4、MIXL1、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1及CRIP1的一種或多種標志物的表達高于OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達。
本發(fā)明其它實施方案涉及如細胞培養(yǎng)物或細胞群的組合物，其包括如人定形內胚層細胞的人細胞，其中在至少約5％的人細胞中SOX17及CXCR4標志物的表達均高于OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物表達。在其它實施方案中，在至少約10％人細胞中、至少約15％的人細胞中、在至少約20％人細胞中、在至少約25％人細胞中、在至少約30％人細胞中、在至少約40％人細胞中、在至少約50％人細胞中、在至少約55％人細胞中、在至少約60％人細胞中、在至少約65％人細胞中、在至少約70％人細胞中、在至少約75％人細胞中、在至少約80％人細胞中、在至少約85％人細胞中、在至少約90％人細胞中、在至少約95％人細胞中或大于95％人細胞中，SOX17及CXCR4標志物的表達均高于OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達。
應當理解，本發(fā)明一些實施方案涉及如細胞培養(yǎng)物或細胞群的組合物，其包括如人定形內胚層細胞的人細胞，在至少約5％至大于至少約95％人細胞中，其中GATA4、MIXL1、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1及CRIP1的標志物的表達高于OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達。
本發(fā)明其它實施方案涉及諸如細胞培養(yǎng)物或細胞群的組合物，包括諸如人定形內胚層細胞的哺乳動物內胚層細胞，其中在至少在約5％的內胚層細胞中SOX17或CXCR4標志物的表達均大于OCT4、SPARC、α胎蛋白(AFP)、凝血調節(jié)蛋白(TM)和/或SOX7標志物的表達。在其它實施方案中，其中在至少在約10％的內胚層細胞中、至少約15％的內胚層細胞中、至少約20％的內胚層細胞中、至少約25％的內胚層細胞中、至少約30％的內胚層細胞中、至少約35％的內胚層細胞中、至少約40％的內胚層細胞中、至少約45％的內胚層細胞中、至少約50％的內胚層細胞中、至少約55％的內胚層細胞中、至少約60％的內胚層細胞中、至少約65％的內胚層細胞中、至少約70％的內胚層細胞中、至少約75％的內胚層細胞中、至少約80％的內胚層細胞中、至少約85％的內胚層細胞中、至少約90％的內胚層細胞中、至少約95％的內胚層細胞中或大于95％的內胚層細胞中，SOX17或CXCR4標志物的表達均大于OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達。
應當明白，本發(fā)明一些實施方案涉及如細胞培養(yǎng)物或細胞群的組合物，其包括哺乳動物內胚層細胞，其中在至少約5％至大于至少約95％所述內胚層細胞中，一種或多種選自GATA4、MIXL1、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1及CRIP1的標志物的表達高于OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達。
本發(fā)明其它進一步實施方案涉及如細胞培養(yǎng)物或細胞群的組合物，包括諸如人定形內胚層細胞的哺乳動物內胚層細胞，其中在至少在約5％的所述內胚層細胞中SOX17及CXCR4標志物的表達均大于OCT4、SPARC、α胎蛋白(AFP)、凝血調節(jié)蛋白(TM)和/或SOX7標志物的表達。在其它實施方案中，其中在至少約10％的內胚層細胞中、至少約15％的內胚層細胞中、至少約20％的內胚層細胞中、至少約25％的內胚層細胞中、至少約30％的內胚層細胞中、至少約35％的內胚層細胞中、至少約40％的內胚層細胞中、至少約45％的內胚層細胞中、至少約50％的內胚層細胞中、至少約55％的內胚層細胞中、至少約60％的內胚層細胞中、至少約65％的內胚層細胞中、至少約70％的內胚層細胞中、至少約75％的內胚層細胞中、至少約80％的內胚層細胞中、至少約85％的內胚層細胞中、至少約90％的內胚層細胞中、至少約95％的內胚層細胞中或大于95％的內胚層細胞中，SOX17及CXCR4標志物的表達均大于OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達。
應當理解，本發(fā)明一些實施方案涉及諸如細胞培養(yǎng)物或細胞群的組合物，包括哺乳動物內胚層細胞，其中在至少約5％至大于至少約95％內胚層細胞中，GATA4、MIXL1、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1及CRIP1的標志物的表達高于OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達。
使用本發(fā)明所述的方法，可以制備基本不含其它細胞類型的包括定形內胚層細胞的組合物。關于細胞培養(yǎng)物或細胞群里的細胞，術語“基本不含”指在細胞培養(yǎng)物或細胞群里的特定的細胞不存在、或小于細胞培養(yǎng)物或細胞群里總細胞數(shù)的約5％。在本發(fā)明的一些實施方案中，使用本發(fā)明所述的方法制備的定形內胚層細胞群或細胞培養(yǎng)物基本不含特異顯著表達OCT4、SOX7、AFP、SPARC、TM、ZIC1或BRACH標志物基因的細胞。
在本發(fā)明一個實施方案中，基于標志物基因的表達，定形內胚層細胞的描述為SOX17高、MIXL1高、AFP低、SPARC低、凝血調節(jié)蛋白低、SOX7低、CXCR4高。
定形內胚層的富集、分離和/或純化關于本發(fā)明的其它方面，定形內胚層細胞可使用特異針對這些細胞的親和標記來富集、分離和/或純化。特異針對定形內胚層細胞的親和標記的實例為抗體、配體或其它特異針對如多肽的標志物分子的結合試劑，該標志物分子存在于細胞定形內胚層細胞的表面，但基本不存在于根據(jù)本發(fā)明所述的方法制備的細胞培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的其它細胞類型中。在一些實施方案中，與CXCR4結合的抗體用于定形內胚層的富集、分離和/或純化的親和標記。在其它實施方案中，趨化因子SDF-1或其它基于SDF-1的分子也可用于親和標記。這些分子包括，但不限于SDF-1片斷，SDF-1融合物或SDF-1模擬物。
制備抗體及其用于細胞分離的方法在本技術領域已知，這些方法可利用本發(fā)明所述的抗體及細胞來實施。在一個實施方案中，將結合CXCR4的抗體與磁珠結合，然后在細胞培養(yǎng)基中與定形內胚層細胞結合，經酶處理后降低了細胞間及與底物的粘附。將細胞/抗體/磁珠復合物暴露于移動磁場中以將磁珠結合的定形內胚層細胞與未結合的細胞分開。一旦定形內胚層細胞在培養(yǎng)基中與其它細胞物理分開，破壞結合的抗體，將細胞重新置于合適的組織培養(yǎng)基中。
本發(fā)明實施方案考慮了其它定形內胚層細胞培養(yǎng)物或細胞群的富集、分離和/或純化方法。例如，在一些實施方案中，CXCR4抗體在包含定形內胚層的細胞培養(yǎng)物中孵育，經處理后降低細胞間及與底物的粘附。然后將細胞洗滌、離心及再懸浮。細胞懸浮物然后再與第二抗體，如能夠與第一抗體結合的FITC軛合抗體孵育。然后再將細胞洗滌、離心及再懸浮緩沖液中。隨后分析細胞懸浮物，使用熒光活化細胞分選器(FACS)分選。將CXCR4-陰性細胞分離，收集CXCR4-陽性細胞，由此分離了該類型細胞。需要時，分離的細胞組合物可進一步使用替代的親和方法或增加分選數(shù)次，使用特異針對定形內胚層的相同或不同標志物。
在本發(fā)明其它實施方案中，使用與CXCR4結合的配體或其它分子富集、分離和/或純化定形內胚層。在一些實施方案中，所述分子為SDF-1或其片段、融合物或其模擬物。
在優(yōu)選實施方案中，當干細胞培養(yǎng)物被誘導向定形內胚層系分化后，自其它非定形內胚層細胞中富集、分離和/或純化定形內胚層細胞。應當明白，上述富集、分離和/或純化方法可利用任何分化階段的這種培養(yǎng)物。
除上述的方法，定形內胚層細胞也可以其它細胞分離技術分離。此外，定形內胚層細胞也可以在生長條件下通過一系列再培養(yǎng)的方法富集或分離，該生長條件有利于所述的定形內胚層細胞選擇性存活或選擇性擴增。
使用本發(fā)明所述的方法，可體外自至少經過一些分化的如干細胞培養(yǎng)物或細胞群的多能細胞培養(yǎng)物或細胞群中富集、分離和/或純化定形內胚層細胞。在一些實施方案中，所述細胞進行隨機分化。然而，在一些優(yōu)選實施方案，所述細胞主要分化為定形內胚層。一些優(yōu)選的富集、分離和/或純化方法涉及體外自人胚胎干細胞制備定形內胚層。使用本發(fā)明所述的方法，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，定形內胚層中富集的細胞群或細胞培養(yǎng)物為至少約2倍至約1000倍。在一些實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，富集的定形內胚層至少約5倍至約500倍。在其它實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，富集的定形內胚層為至少約10倍至約200倍。在其它實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，富集的定形內胚層為至少約20倍至約100倍。在其它實施方案中，與未處理的細胞群體或細胞培養(yǎng)物相比，富集的定形內胚層為至少約40倍至約80倍。在某些實施方案中，與未處理的細胞群體或細胞培養(yǎng)物相比，富集的定形內胚層為至少約2倍至約20倍。
已經對本發(fā)明進行了一般性描述，參考一些具體實施例可進一步理解本發(fā)明，本發(fā)明的這些實施例僅為示例性說明的目的，而非意在限制本發(fā)明。
實施例下述許多實施例描述了多能人細胞的使用。制備多能人細胞的方法為本領域一般技術人員熟知，大量科技出版物，包括美國專利號5,453,357、5,670,372、5,690,926、6,090,622、6,200,806及6,251,671及美國專利申請
發(fā)明者凱文·艾倫·德阿姆爾, 艾蘭·D·奧戈爾尼克, 埃馬紐埃爾·E·拜特格 申請人:賽瑟拉公司