專利名稱：用擴增zwf基因制備L－氨基酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用棒桿菌制備L-氨基酸，特別是L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-色氨酸的方法，其中至少zwf基因編碼的間酶(Zwischenferment)蛋白被擴增。
現(xiàn)有技術L-氨基酸用于動物營養(yǎng)，用于人類醫(yī)藥及制藥工業(yè)。
已知氨基酸是通過棒狀細菌菌株，尤其是谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)的發(fā)酵而生產(chǎn)的。由于其極其重要，持續(xù)進行著改良生產(chǎn)方法的嘗試。所述方法的改良可涉及發(fā)酵措施。如攪拌和供氧，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如發(fā)酵期間的糖濃度，或產(chǎn)物形式的純化方法，例如通過離子交換層析，或微生物本身的固有生產(chǎn)性質。
為改良這些微生物的生產(chǎn)性質，可使用誘變、選擇及突變體選擇等方法。以此方式可獲得對抗代謝物例如蘇氨酸類似物α-氨基-β-羥基戊酸(AHV)、賴氨酸類似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)有抗性的菌株，或者對于調節(jié)重要性代謝物是營養(yǎng)缺陷的并產(chǎn)生L-氨基酸例如蘇氨酸或賴氨酸的菌株。
一段時間以來，重組DNA技術的方法也已經(jīng)用于生產(chǎn)L-氨基酸的谷氨酸棒桿菌菌株的改良。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供使用棒狀細菌經(jīng)發(fā)酵制備L-氨基酸的新的改良方法。
發(fā)明概述L-氨基酸用于人類醫(yī)藥及制藥工業(yè)、食品業(yè)，特別用于動物營養(yǎng)。因此需要提供制備氨基酸的新的改良方法。
本發(fā)明提供了使用棒狀細菌制備L-氨基酸，特別是L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸和L-色氨酸的方法，所用棒狀細菌中由zwf基因的核苷酸序列編碼的間酶蛋白(Zwf蛋白)被擴增，尤其是過表達。
縮寫詞“zwf”是間酶的代號(Jeffrey H.MillerA Short Course InBacterial Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，USA，1992)，也稱作葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶催化葡萄糖-6-磷酸氧化為-6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯，伴隨NADP還原為NADPH。其活性被NADPH及多種其它代謝物抑制(Sugimoto and Shiio，Agricultural and Biological Chemistry 51(1)，pp.101-108(1987))。
發(fā)明詳述優(yōu)選應用的菌株是在zwf基因擴增之前已經(jīng)生產(chǎn)L-氨基酸的菌株。
優(yōu)選的實施方案見權利要求書。
文中術語“擴增”描述了微生物中由相應的DNA編碼的一或多種酶或蛋白質的胞內(nèi)活性的增加，例如通過增加所述一或多種基因的拷貝數(shù)、使用強力啟動子或者使用編碼具有高活性的相應酶或蛋白質的基因或等位基因進行，任選組合這些措施。
通過擴增措施，特別是過表達，相應酶或蛋白質的活性基于野生型酶或蛋白質或者起始微生物中所述酶或蛋白質的活性或濃度一般增加至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，直至最大1000％或2000％。
本發(fā)明提供的微生物可以從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素或者從甘油和乙醇中制備L-氨基酸。所述微生物是棒狀細菌的代表物，特別是棒狀桿菌(Corynebacterium)屬。對于棒狀桿菌屬，特別可以提及的是谷氨酸棒桿菌，本領域技術人員已知其生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
合適的棒狀桿菌屬菌株，特別是谷氨酸棒桿菌，是例如已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC 13032醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC 15806嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869叉開短桿菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020，及從中制備的生產(chǎn)L-氨基酸的突變體，例如生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC21649黃色短桿菌BB69黃色短桿菌DSM5399乳糖發(fā)酵短桿菌FERM-BP 269乳糖發(fā)酵短桿菌TBB-10，及例如生產(chǎn)L-異亮氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC 14309
谷氨酸棒桿菌ATCC 14310谷氨酸棒桿菌ATCC 14311谷氨酸棒桿菌ATCC 15168產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)ATCC 6871，及例如生產(chǎn)L-色氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC21850谷氨酸棒桿菌KY9218(pKW9901)，及例如生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌FERM-P 1709黃色短桿菌FERM-P 1708乳糖發(fā)酵短桿菌FERM-P 1712谷氨酸棒桿菌FERM-P 6463谷氨酸棒桿菌FERM-P 6464谷氨酸棒桿菌ATCC 13032谷氨酸棒桿菌DM58-1谷氨酸棒桿菌DSM12866。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)棒狀細菌在分別編碼Zwf蛋白或Zwf多肽的zwf基因過表達之后以改良的方式生產(chǎn)L-氨基酸，特別是L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-色氨酸。
JP-A-09224661揭示了黃色短桿菌MJ-223(FERM BP-1497)的zwf基因的核苷酸序列，并指出由zwf基因編碼的蛋白質是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。JP-A-09224661揭示的序列信息示于SEQ ID NO7和8。JP-A-09224661描述了Zwf多肽的N末端氨基酸序列為Met Val Ile PheGly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu(SEQ ID NO8)。
然而，還不能證實確實如此。相反已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如下N末端氨基酸序列Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp(SEQ ID NO10)。包括編碼序列在內(nèi)的相應的zwf基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO9。N位的甲硫氨酸殘基可以在翻譯后修飾中被分裂，獲得Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp的N末端氨基酸序列。
因此，本發(fā)明提供了如SEQ ID NO9的第538-2079位核苷酸示出的棒狀細菌的新zwf基因的核苷酸序列。
可任選使用編碼革蘭氏陰性細菌例如大腸桿菌(Escherichiacoli)或其它革蘭氏陽性細菌例如鏈霉菌屬或芽孢桿菌屬的Zwf蛋白的基因。
另外可以使用得自遺傳密碼簡并或者中性功能的有義突變的zwf基因的等位基因。
優(yōu)選使用內(nèi)源基因，特別是來自棒狀細菌的內(nèi)源基因?！皟?nèi)源基因”或者“內(nèi)源核苷酸序列”是指在一個種群中可獲得的基因和核苷酸序列。
為了實現(xiàn)擴增(例如過表達)，可提高相應基因的拷貝數(shù)，或者可突變位于結構基因上游的啟動子和調節(jié)區(qū)或核糖體結合位點。摻入結構基因上游的表達盒以同樣方式起作用。也可以通過可誘導型啟動子，在L-氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)期間增強表達。延長mRNA壽命的措施也可改良表達。另外，通過防止酶蛋白的降解也可提高酶活性?；蚧蚧驑嫿w可以不同拷貝數(shù)存在于質粒中，或可在染色體中整合與擴增?；蛘?，通過改變培養(yǎng)基的組分和培養(yǎng)程序，也可獲得被研究的基因的過表達。
本領域熟練技術人員從以下文獻中可發(fā)現(xiàn)對此的描述，Martin etal.(Bio/Technology 5，137-146(1987))，Guerrero et al.(Gene 138，35-41(1994))，Tsuchiya and Morinaga(Bio/Technology 6，428-430(1988))，Eikmanns et al.(Gene 102，93-98(1991))，歐洲專利說明書EPS 0 472 869，美國專利4,601,893，Schwarzer and Puehler(Bio/Technology 9，84-87(1991)，Reinscheid et al.(Applied andEnvironmental Microbiology 60，126-132(1994))，LaBarre et al.(Journal of Bacteriology 175，1001-1007(1993))，專利申請WO96/15246，Malumbres et al.(Gene 134，15-24(1993))，日本特許公開說明書JP-A-10-229891，Jensen and Hammer(Biotechnology andBioengineering 58，191-195(1998))，及已知的遺傳學和分子生物學教科書。
例如，Zwf蛋白借助于質粒過表達。為此使用

圖1所示的大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-T18mob2。在將zwf基因摻入pEC-T18mob2的KpnI/SalI切割位點之后，形成圖2所示質粒pEC-T18mob2zwf。
能在谷氨酸棒桿菌中復制的其它質粒載體例如pEKEx1(Eikmannset al.，Gene 10293-98(1991))或pZ8-1(EP-B-0 375 889)可以相同方式使用。
在本發(fā)明的另一方面中，發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO10所示的zwf基因產(chǎn)物的氨基酸序列的第369和373位和/或第241和246位之間片段中的氨基酸置換能擴增其葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性，特別是其對NADPH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，還原形式)抑制的抗性，及改良分別包含相應的zwf基因或zwf等位基因或者其編碼的Zwf蛋白的棒狀細菌的氨基酸尤其是賴氨酸的生產(chǎn)。N末端位置的甲硫氨酸殘基可以在翻譯后修飾期間通過宿主的甲硫氨酸氨肽酶除去。
因此，本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO10氨基酸序列的Zwf蛋白，其中至少在第369-373位的一或多個氨基酸和/或在第241-246位的一或多個氨基酸由另外的蛋白質氨基酸(proteinogenic aminoacid)置換。
因此，本發(fā)明進一步提供了編碼包含SEQ ID NO10氨基酸序列的蛋白質的分離的多核苷酸，其中至少在第369-373位的一或多個氨基酸和/或在第241-246位的一或多個氨基酸由另外的蛋白質氨基酸置換。
特別地，Zwf蛋白的氨基酸序列中的置換包含選自如下一組的至少一或多個氨基酸置換在SEQ ID NO10第370位的L-精氨酸由任何其它蛋白質氨基酸例如L-甲硫氨酸置換，在SEQ ID NO10第372位的L-纈氨酸由任何其它蛋白質氨基酸例如L-丙氨酸置換，在SEQID NO10第242位的L-甲硫氨酸由任何其它蛋白質氨基酸例如L-亮氨酸或L-絲氨酸置換，在SEQ ID NO10第243位的L-丙氨酸由任何其它蛋白質氨基酸例如L-蘇氨酸置換，在SEQ ID NO10第244位的L-谷氨酸由任何其它蛋白質氨基酸置換，及在SEQ ID NO10第245位的L-天冬氨酸由任何其它蛋白質氨基酸例如L-絲氨酸置換。
極特別地，(SEQ ID NO10)第243位的L-丙氨酸由L-蘇氨酸置換，如SEQ ID NO22所示。這個蛋白質也稱作Zwf(A243T)蛋白，編碼所述蛋白質的等位基因稱作zwf(A243T)。見SEQ ID NO21。
另外，(SEQ ID NO10)第370位的L-精氨酸可以由L-甲硫氨酸置換，如SEQ ID NO29所示。這個蛋白質也稱作Zwf(R370M)蛋白，編碼所述蛋白質的等位基因稱作zwf(R370M)。見SEQ ID NO28。
另外，(SEQ ID NO10)第372位的L-纈氨酸可以由L-丙氨酸置換，如SEQ ID NO31所示。這個蛋白質也稱作Zwf(V372A)蛋白，編碼所述蛋白質的等位基因稱作zwf(V372A)。見SEQ ID NO30。
另外，(SEQ ID NO10)第242位的L-甲硫氨酸可以由L-亮氨酸置換，如SEQ ID NO33所示。這個蛋白質也稱作Zwf(M242L)蛋白，編碼所述蛋白質的等位基因稱作zwf(M242L)。見SEQ ID NO32。
另外，(SEQ ID NO10)第242位的L-甲硫氨酸可以由L-絲氨酸置換，如SEQ ID NO35所示。這個蛋白質也稱作Zwf(M242S)蛋白，編碼所述蛋白質的等位基因稱作zwf(M242S)。見SEQ ID NO34。
另外，(SEQ ID NO10)第245位的L-天冬氨酸可以由L-絲氨酸置換，如SEQ ID NO37所示。這個蛋白質也稱作Zwf(D245S)蛋白，編碼所述蛋白質的等位基因稱作zwf(D245S)。見SEQ ID NO36。
本發(fā)明的Zwf蛋白可進一步含有一或多個氨基酸的取代、缺失或插入，其基本不改變所述Zwf蛋白變體的酶學性質。
本領域已知對蛋白質功能具有中性或幾乎中性作用的氨基酸取代是保守氨基酸置換。在芳香族氨基酸的情況中，苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸可以彼此置換。在疏水性氨基酸的情況中，亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸可以彼此置換。在極性氨基酸的情況中，谷氨酰胺和天冬酰胺可以彼此置換。在堿性氨基酸的情況中，精氨酸、賴氨酸和組氨酸可以彼此置換。在酸性氨基酸的情況中，天冬氨酸和谷氨酸可以彼此置換。在含有羥基基團的氨基酸的情況中，絲氨酸和蘇氨酸可彼此置換。
例如，在存在抑制劑NADPH時，酶活性改變小于大約2.5-3.5％或者2.5-4.5％可以認為是基本上無差異。在其它參數(shù)情況中，例如Michaelis常數(shù)(KM)或最大速率(Vmax)或者其它結合常數(shù)差異如小于大約5、10、25、50、100、150或200％或者甚至更大差異如300或400％可以認為是基本上無差異。
因此，Zwf(A243T)蛋白包含選自如下的至少一個氨基酸序列相應于SEQ ID NO22的第241-246位氨基酸的Thr Met Thr Glu Asp Ile序列，優(yōu)選相應于SEQ ID NO22的第230-250位氨基酸的氨基酸序列，更優(yōu)選相應于SEQ ID NO22的第225-260位氨基酸的氨基酸序列，更優(yōu)選相應于SEQ ID NO22的第210-270位氨基酸的氨基酸序列。
相似地，Zwf蛋白變體Zwf(M242L)、Zwf(M242S)和Zwf(D245)包含選自如下的至少一個氨基酸序列SEQ ID No33、35和37的第237-250位氨基酸的氨基酸序列，優(yōu)選SEQ ID No33、35和37的第227-260位氨基酸的氨基酸序列，更優(yōu)選SEQ ID No33、35和37的第217-270位氨基酸的氨基酸序列，更優(yōu)選SEQ ID No33、35和37的第202-285位氨基酸的氨基酸序列。
相似地，Zwf蛋白變體Zwf(R370M)和Zwf(V372A)包含選自如下的至少一個氨基酸序列SEQ ID No29和31的第365-377位氨基酸的氨基酸序列，SEQ ID No29和31的第355-387位氨基酸的氨基酸序列，SEQ ID No29和31的第345-397位氨基酸的氨基酸序列，及SEQ ID No29和31的第325-417位氨基酸的氨基酸序列。
另外，Zwf蛋白變體可包含選自如下氨基酸序列的N末端氨基酸序列相應于SEQ ID NO10的第1-10位氨基酸的氨基酸序列，相應于SEQ ID NO10的第1-16位氨基酸的氨基酸序列，相應于SEQID NO10第1-20位氨基酸的氨基酸序列，及相應于SEQ ID NO10的第1-30位氨基酸的氨基酸序列。
另外，通過缺失和表達分析發(fā)現(xiàn)相應于一或多種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶蛋白的30個N末端氨基酸的核苷酸序列的缺失分別導致酶活性喪失。這30個N末端氨基酸相應于例如SEQ ID NO10或者SEQ IDNO22、29、31、33、35或37的第1-30位。
術語蛋白質氨基酸是指在微生物、植物、動物和人體天然發(fā)生的蛋白質中發(fā)現(xiàn)的那些氨基酸。這些氨基酸包括L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸和L-硒代半胱氨酸。
第243位的L-丙氨酸由L-蘇氨酸取代可優(yōu)選通過將SEQ ID NO9第1264位的核堿基鳥嘌呤由腺嘌呤取代而實現(xiàn)。這種鳥嘌呤腺嘌呤轉換也示于SEQ ID NO21的第1034位。SEQ ID NO9的第1264位和SEQ ID NO21的第1034位均相應于zwf基因和zwf(A243T)等位基因編碼序列的第727位(在這種情況中起始密碼子GTG的第一個G在第1位)。
zwf(A243T)等位基因的內(nèi)部片段示于SEQ ID NO23。其相應于SEQ ID NO21的第898-1653位。
與野生型蛋白質相比，本發(fā)明這一方面的Zwf蛋白的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性對NADPH抑制作用較不易受影響或者有抗性。與在包含所述突變蛋白的菌株中在未加入NADPH時的活性相比，在暴露于大約260μM(μ表示微)濃度的NADPH時殘余活性為至少30％或35％，優(yōu)選至少40％、45％或50％。與在未加入NADPH時的活性相比，在暴露于大約400μM濃度的NADPH時殘余活性為至少20％，優(yōu)選至少25％。
誘導所述突變或等位基因的誘變可以通過針對細菌細胞的常規(guī)誘變方法進行，使用誘變劑例如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍或者紫外光，如Manual of Methods for General Bacteriology(Gerhard et al.(Eds.)，American Society for Microbiology，Washington，DC，USA，1981)所述。然后分離適當?shù)耐蛔凅w并通過例如測序方法或者通過測定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性進行鑒別。
因此，本發(fā)明提供了包含多核苷酸的分離的棒狀細菌或突變體，所述多核苷酸編碼包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的Zwf蛋白，其中至少在第369-373位的一或多個氨基酸和/或在第241-246位的一或多個氨基酸由另外的蛋白質氨基酸置換。
谷氨酸棒桿菌DM658是這種棒狀細菌的例子。其是在進行多次誘變、選擇和篩選循環(huán)后獲得的，在其染色體中含有編碼具有SEQID NO10的氨基酸序列的Zwf蛋白(Zwf(A243T))的zwf等位基因(zwf(A243T))，其中在第243位的L-丙氨酸由L-蘇氨酸取代，如SEQID NO22所示。
誘變也可以通過使用針對多核苷酸的體外方法進行，例如用羥胺處理(Molecular and General Genetics 145，101 pp.(1978))，或者用誘變寡核苷酸處理(T.A.BrownGentechnologie fuer Einsteiger，SpektrumAkademischer Verlag，Heidelberg，1993)，或者用聚合酶鏈反應(PCR)處理，如Newton和Graham(PCR，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，1994)所著手冊或者通過Papworth等(Strategies 9(3)，3-4(1996))所述方法使用Stratagene(La Jolla，California，USA)的QuikChange定向誘變試劑盒進行，或者使用本領域已知的相似方法進行。
對相應的等位基因或突變進行測序并通過基因取代方法通過重組導入合適菌株的染色體中，如Schwarzer和Puehler(Bio/Technology9，84-87(1991)對于谷氨酸棒桿菌lysA基因所述的方法或者Peters-Wendisch等(Microbiology 144，915-927(1998))對于谷氨酸棒桿菌的pyc基因所述的方法進行。
因此，本發(fā)明提供了包含編碼本發(fā)明Zwf蛋白的多核苷酸的重組棒狀細菌，所述蛋白質例如包含SEQ ID NO10的氨基酸序列，其中至少在第369-373位的一或多個氨基酸和/或在第241-246位的一或多個氨基酸由另外的蛋白質氨基酸置換。
谷氨酸棒桿菌DSM5715zwf2_A243T是這種菌株的例子。其染色體中包含菌株DM658的zwf等位基因突變，即zwf(A243T)。
谷氨酸棒桿菌菌株DM1697_zwfD245S是這種菌株的另一個例子。其染色體中包含通過體外誘變獲得的zwf等位基因zwf(D245S)突變。
相應的等位基因也可以通過基因重復方法導入合適的菌株的染色體中，例如Reinscheid等(Applied and Environmental Microbiology60(1)，126-132(1994))對于hom-thrB操縱子所述方法，或者通過Jetten等(Applied Microbiology and Biotechnology 43，76-82(1995))對于ask基因所述方法進行。
因此，本發(fā)明進一步提供了包含分離的多核苷酸的棒狀細菌，所述多核苷酸編碼包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的Zwf蛋白，其中至少在第369-373位的一或多個氨基酸和/或第241-246位的一或多個氨基酸由另外的蛋白質氨基酸置換。
谷氨酸棒桿菌DSM5715∷pK18mobsacB_zwf(A243T)是這種菌株的例子。其染色體中包含含有zwf(A243T)等位基因的分離的DNA。
等位基因也可以通過上述任何方法過表達，例如使用質粒、可誘導型啟動子或者本領域已知的任何其它方法。
由此獲得的菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸。因此，本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的棒狀細菌生產(chǎn)L-氨基酸的方法。
另外，除了擴增本發(fā)明的zwf基因或等位基因之外，擴增特殊生物合成途徑、糖酵解、添補反應、磷酸戊糖途徑、糖攝取或者氨基酸輸出的一或多種酶對于生產(chǎn)L-氨基酸是有益的。
因此，例如特別對于制備L-蘇氨酸而言，選自如下的一或多個基因可以同時被擴增，特別是被過表達●hom基因，其編碼高絲氨酸脫氫酶(Peoples et al.，MolecularMicrobiology 2，63-72(1988))，或者homdr等位基因，其編碼“反饋抗性”高絲氨酸脫氫酶(Archer et al.，Gene 107，53-59(1991)，●gap基因，其編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶(Eikmanns et al.，Journal of Bacteriology 1746076-6086(1992))，●pyc基因，其編碼丙酮酸羧化酶(Peters-Wendisch et al.，Microbiology 144915-927(1998))，●mqo基因，其編碼蘋果酸醌氧化還原酶(Molenaar et al.，European Journal of Biochemistry 254，395-403(1998))，●tkt基因，其編碼轉羥乙醛酶(歐洲分子生物學實驗室數(shù)據(jù)庫(European Molecular Biologies Laboratories databank)(EMBL，Heidelberg，Germany)登錄號AB023377)，●gnd基因，其編碼-6-磷酸葡糖酸脫氫酶(JP-A-9-224662)，●thrE基因，其編碼蘇氨酸輸出蛋白(DE 199 41 478.5；DSM12840)，●zwa1基因(DE 199 59 328.0；DSM 13115)，●eno基因，其編碼烯醇化酶(DE199 41 478.5)。
因此，例如特別對于制備L-賴氨酸而言，選自如下的一或多個基因可以被同時擴增，特別是被過表達●dapA基因，其編碼二氫吡啶二羧酸合酶(EP-B 0 197 335)，●lysC基因，其編碼反饋抗性天冬氨酸激酶(Kalinowski et al.(1990)，Molecular and General Genetics 224317-324)，●gap基因，其編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶(Eikmanns(1992)，Journal of Bacteriology 1746076-6086)，●pyc基因，其編碼丙酮酸羧化酶(DE-A-198 31 609)，●tkt基因，其編碼轉羥乙醛酶(歐洲分子生物學實驗室數(shù)據(jù)庫(EMBL，Heidelberg，Germany)登錄號AB023377)，
●gnd基因，其編碼-6-磷酸葡糖酸脫氫酶(JP-A-9-224662)，●lysE基因，其編碼賴氨酸輸出蛋白(DE-A-195 48 222)，●zwa1基因(DE 199 59 328.0；DSM 13115)，●eno基因，其編碼烯醇化酶(DE 199 47 791.4)。
優(yōu)選使用內(nèi)源基因。
除了擴增、特別是過表達本發(fā)明的zwf基因或等位基因之外，同時弱化特別是缺失選自如下的一或多個基因對于L-氨基酸的生產(chǎn)也是有益的●pck基因，其編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(DE 199 50 409.1；DSM 13047)，●pgi基因，其編碼葡萄糖-6-磷酸異構酶(US 09/396,478，DSM12969)，●poxB基因，其編碼丙酮酸氧化酶(DE 199 51 975.7；DSM13114)，●zwa2基因(DE199 59 327.2；DSM 13113)。
文中術語“弱化”是指降低或抑制微生物中一或多種酶或蛋白質的胞內(nèi)活性或濃度，所述酶或蛋白質是由相應的DNA編碼的，例如使用弱啟動子或者編碼具有低活性的相應酶或蛋白質的基因或等位基因或者使相應的酶或蛋白質失活及任選組合這些措施進行。
通過弱化措施，相應酶或蛋白質的活性或濃度與野生型酶或蛋白質或者與起始微生物中所述酶或蛋白質的活性或濃度相比一般降低到0-75％，0-50％，0-25％，0-10％或者0-5％。
除了Zwf蛋白的擴增、特別是過表達之外，消除非所需的副反應對于L-氨基酸的生產(chǎn)也是有益的(Nakayama″Breeding of Amino AcidProducing Micro-organisms″，inOverproduction of Microbial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds.)，Academic Press，London，UK，1982)。
根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物可連續(xù)或非連續(xù)通過分批法(分批培養(yǎng))，補料分批法(補料方法)或重復補料分批法(重復補料方法)培養(yǎng)，以生產(chǎn)L-氨基酸。已知培養(yǎng)方法由Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik[Bioprocess Technology 1.Introduction to Bioprocess Technology(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)]所述或者由Storhas(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen[Bioreactors and Peripheral Equipment](Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))所著教材中所述。
所用培養(yǎng)基必須以適當方式符合特定微生物的要求。關于多種微生物培養(yǎng)基的闡述見于美國細菌學會的手冊“Manual of Methods forGeneral Bacteriology”(Washington D.C.，USA，1981)。可使用的碳源是糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機酸如乙酸。這些物質可單獨或混合使用?？墒褂玫牡词怯袡C含氮化合物，如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或無機化物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。
氮源可單獨或混合使用?？墒褂玫牧自窗姿岫溻浕蛄姿釟涠?，或相應的含鈉鹽。培養(yǎng)基另外還必須含有為生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質之外，可使用生長必需物質如氨基酸和維生素。此外，可將適當前體加入培養(yǎng)基中。上述起始物質可以單批形式或在培養(yǎng)期間以適當形式加入到培養(yǎng)物中。
可以適當方式應用堿性化合物如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氨，或酸性化合物如磷酸或硫酸控制pH?？古菽瓌├缰舅峋垡叶减タ捎糜诳刂婆菽a(chǎn)生。具有選擇性作用的適當物質例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中以保持質粒的穩(wěn)定性。氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在20℃～45℃，優(yōu)選25℃-40℃。持續(xù)培養(yǎng)直至L-氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小時范圍內(nèi)達到。
因此，本發(fā)明進一步提供了通過發(fā)酵棒狀細菌制備氨基酸的方法，所述方法包括如下步驟a)發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的細菌，其中至少編碼間酶蛋白的zwf基因是過表達的，及b)濃縮培養(yǎng)基或細菌細胞中的氨基酸，其中所述間酶蛋白包含至少相應于SEQ ID NO22第241-246位氨基酸的氨基酸序列，及任選SEQ ID NO10的第1-10位氨基酸或者SEQ ID NO10的第2-10位氨基酸的N末端序列。
本發(fā)明進一步提供了通過發(fā)酵分離的棒狀細菌制備氨基酸的方法，所述方法包括如下步驟a)發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的細菌，所述細菌包含編碼具有SEQ ID NO10的氨基酸序列的Zwf蛋白的多核苷酸，其中至少第369-373位的一或多個氨基酸和/或第241-246位的一或多個氨基酸由另外的蛋白質氨基酸置換，及b)濃縮培養(yǎng)基或細菌細胞中的氨基酸。
本發(fā)明進一步提供了通過發(fā)酵棒狀細菌制備氨基酸的方法，所述方法包括如下步驟a)發(fā)酵包含一種分離的或重組多核苷酸的、生產(chǎn)氨基酸的細菌，所述多核苷酸編碼包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的Zwf蛋白，其中至少在第369-373位的一或多個氨基酸和/或在第241-246位的一或多個氨基酸由另外的蛋白質氨基酸置換，及
b)濃縮培養(yǎng)基或細菌細胞中的氨基酸。
然后從培養(yǎng)基或者細菌細胞中分離所述氨基酸。
使用本發(fā)明的措施，所述細菌或發(fā)酵方法的性能在產(chǎn)物濃度(產(chǎn)物/體積)、產(chǎn)物產(chǎn)量(形成的產(chǎn)物/消耗的碳源)、產(chǎn)物形成(形成的產(chǎn)物/體積和時間)或其它工藝參數(shù)及其組合中均可改良至少0.5％，至少1％或至少2％。
L-氨基酸的分析可以通過陰離子交換層析隨后茚三酮衍生化作用進行，如Spackman等(Analytical Chemistry，30，(1958)，1190)所述，或者可以通過反相HPLC進行，如Lindroth等(AnalyticalChemistry(1979)51.1167-1174)所述。
如下微生物作為純培養(yǎng)物保藏在德國微生物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)●大腸桿菌K-12 DH5α/pEC-T18mob2根據(jù)布達佩斯條約于2000年1月20日保藏，保藏號DSM 13244。
●谷氨酸棒桿菌DM658于1993年1月27日長期保藏，保藏號DSM 7431；這個保藏物于2002年10月17日轉為根據(jù)布達佩斯條約的保藏物。
●谷氨酸棒桿菌DSM5715zwf2_A243T根據(jù)布達佩斯條約于2002年10月11日保藏，保藏號為DSM 15237。
●谷氨酸棒桿菌DM1697_zwfD245S根據(jù)布達佩斯條約于2003年5月23日保藏，保藏號為DSM 15632。
附圖簡述圖1質粒pEC-T18mob2圖譜圖2質粒pEC-T18mob2zwf圖譜圖3質粒pAMC1圖譜圖4質粒pMC1圖譜圖5質粒pCR2.1poxBint圖譜圖6質粒pK18mobsacB_zwf(A243T)圖譜圖7質粒pK18mobsacB_zwf圖譜圖8質粒pK18mobsacB_zwf(D245S)圖譜圖9質粒pCRBluntII_AB1CD1圖譜圖10質粒pK18mobsacB_zwfdelta90bp圖譜圖11質粒pCRBluntII_zwfL圖譜圖12質粒pCRBluntII_zwfS圖譜圖13質粒pZ8-1zwfL圖譜圖14質粒pZ8-1zwfS圖譜堿基對數(shù)目是根據(jù)再現(xiàn)性獲得的大約值。
圖1和2所用縮寫具有如下含義Tet四環(huán)素抗性基因OriV大腸桿菌的質粒編碼的復制起點RP4mob移動質粒的mob區(qū)域rep谷氨酸棒桿菌質粒pGA1的質粒編碼的復制起點per控制pGA1拷貝數(shù)的基因lacZ-alphaβ-半乳糖苷酶基因的lacZα基因片段(N-末端)lacZalpha′lacZα基因片段的5′末端′lacZalphalacZα基因片段的3′末端圖3和4所用縮寫具有如下含義Neor新霉素/卡那霉素抗性ColE1 ori質粒ColE1的復制起點
CMV巨細胞病毒啟動子lacP乳糖啟動子pgi磷酸葡萄糖異構酶基因lacZβ-半乳糖苷酶基因的一部分SV403′splice猿猴病毒40的3′剪接位點SV40polyA猿猴病毒40的聚腺苷酸化位點f1(-)ori絲狀噬菌體f1的復制起點SV40 ori猿猴病毒40的復制起點kan r卡那霉素抗性pgi insertpgi基因的內(nèi)部片段ori質粒pBGS8的復制起點圖5所用縮寫具有如下含義ColE1 ori質粒ColE1的復制起點lacZlacZα基因片段的克隆殘余物fl ori噬菌體f1的復制起點KmR卡那霉素抗性ApR氨芐青霉素抗性PoxBintpoxB基因的內(nèi)部片段圖6所用縮寫具有如下含義RP4mob具有用于轉移的復制起點(oriT)的mob區(qū)域KanR卡那霉素抗性基因oriV復制起點Vzwf(A243T)zwf(A243T)等位基因sacBsacB基因圖7和8所用縮寫具有如下含義zwfzwf基因zwf(D245S)zwf(D245S)等位基因oriV復制起點VRP4mob具有用于轉移的復制起點(oriT)的mob區(qū)域KanR卡那霉素抗性基因sacBsacB基因XbaI限制酶XbaI的切割位點PstI限制酶PstI的切割位點圖9和10所用縮寫具有如下含義deltazwf90含有zwf等位基因90bp缺失的克隆的DNA片段Kan卡那霉素抗性基因pUC ori復制起點sacBsacB基因RP4mob具有用于轉移的復制起點(oriT)的mob區(qū)域oriV復制起點VXbaI限制酶XbaI的切割位點圖11和12所用縮寫具有如下含義zwfLzwf等位基因的克隆的DNA片段zwfS含有zwf等位基因90bp缺失的克隆的DNA片段Km卡那霉素抗性基因pUC origin復制起點SalI限制酶SalI的切割位點圖13和14所用縮寫具有如下含義zwfLzwf等位基因的克隆的DNA片段zwfS含有zwf等位基因90bp缺失的克隆的DNA片段Km卡那霉素抗性基因rrnB-Terminator轉錄終止Ptac啟動子rep復制起點SalI限制酶SalI的切割位點。
本領域已知多種限制酶的縮寫的含義(例如BamHI，EcoRI等等)，例如由Kessler和Hoeltke(Gene 47，1-153(1986))或者Roberts等(Nucleic Acids Research 27，312-313(1999))所概述。
如下實施例進一步例證了本發(fā)明。本發(fā)明使用的分子生物學技術例如質粒DNA分離、限制酶處理、連接、大腸桿菌的標準轉化等，(除非特別說明)均由Sambrook等(Molecular Cloning.A LaboratoryManual(1989)Cold Spring Harbor Laboratories，USA)所描述。
實施例1Zwf蛋白的表達1.1質粒pEC-T18mob2的制備根據(jù)現(xiàn)有技術構建大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-T18mob2。該載體含有質粒pGA1的復制區(qū)rep，包括復制效應子per(US-A-5,175,108；Nesvera et al.，Journal of Bacteriology 179，1525-1532(1997))，質粒pAG1的授予四環(huán)素抗性的tetA(Z)基因(US-A-5,158,891；gene library entry at the National Center for BiotechnologyInformation(NCBI，Bethesda，MD，USA)，登錄號AF121000)，質粒pMB1的復制區(qū)oriV(Sutcliffe，Cold Spring Harbor Symposium onQuantitative Biology 43，77-90(1979))，lacZα基因片段，其包括lac啟動子和一個多克隆位點(mcs)(Norrander et al.Gene 26，101-106(1983))，及質粒RP4的mob區(qū)(Simon et al.，(1983)Bio/Technology1784-791)。將構建的載體轉化大腸桿菌菌株DH5α(Brown(ed.)Molecular Biology Labfax，BIOS Scientific Publishers，Oxford，UK，1991)。通過將轉化批次物鋪板在補加了5mg/l四環(huán)素的LB瓊脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)上，選擇攜帶質粒的細胞。借助于Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉化體中分離質粒DNA，并通過用限制酶EcoRI和HindIII限制隨后進行瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)進行檢測。
所述質粒稱為pEC-T18mob2，如圖1所示。其以大腸桿菌K-12菌株DH5αpEC-T18mob2形式保藏在DSMZ(德國微生物保藏中心，Braunschweig，Germany)，保藏號為DSM 13244。
1.2質粒pEC-T18mob2zwf的制備首先將來自谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因通過聚合酶鏈反應(PCR)利用如下寡核苷酸引物首先進行擴增zwf-正向(SEQ ID NO11)5′-TCG ACG CGG TTC TGG AGC AG-3′zwf-反向(SEQ ID NO12)5′-CTA AAT TAT GGC CTG CGC CAG-3′
所述PCR反應在存在200μM脫氧核苷酸三磷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)的情況下進行30次循環(huán)，每次于熱循環(huán)儀(Thermocycler，PTC-100，MJ Research，Inc.，watertown，USA)中使用1μM相應的寡核苷酸，100納克(ng)谷氨酸棒桿菌ATCC13032染色體DNA，1/10體積的10倍反應緩沖液和2.6單位的熱穩(wěn)定Taq-/Pwo-DNA聚合酶混合物(Expand High Fidelity PCR System，RocheDiagnostics，Mannheim，Germany)，在如下條件下進行反應94℃30秒，64℃1分鐘及68℃3分鐘。
隨后借助于SureClone連接試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)，根據(jù)廠商指導將大約1.8kb的擴增片段連接進載體pUC18的SmaI切割位點。將大腸桿菌菌株DH5αmcr(Grant etal.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America USA(1990)874645-4649)用全部的連接批次物轉化。借助于其羧芐青霉素抗性在含有50μg/mL羧芐青霉素的LB瓊脂平板上鑒別轉化體。從7個轉化體中制備質粒，并通過限制分析檢測作為插入體的1.8kb PCR片段的存在情況。以這種方式形成的重組質粒在下文稱作pUC18zwf。
為了構建pEC-T18mob2zwf，將pUC18zwf用KpnI和SalI消化，并借助于Macherey-Nagel(Dueren，Germany)的NucleoSpin提取試劑盒根據(jù)廠商指導分離產(chǎn)物，然后將其與已經(jīng)用KpnI和SalI切割并去磷酸化的載體pEC-T18mob2連接。將大腸桿菌菌株DH5αmcr(Grantet al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America USA(1990)874645-4649)用全部的連接批次物轉化。借助于轉化體的四環(huán)素抗性在含有5μg/mL四環(huán)素的LB瓊脂平板上鑒別轉化體。從12個轉化體中制備質粒并通過限制分析檢測作為插入體的1.8kb PCR片段的存在情況。以這種方式分離的重組質粒稱作pEC-T18mob2zwf(圖2)。
實施例2具有擴增的zwf基因的氨基酸生產(chǎn)株的制備生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌DSM5715在EP-B-0435132中描述，生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株黃色短桿菌DSM5399在EP-B-0385940中描述。這兩個菌株均根據(jù)布達佩斯條約保藏在Braunschweig的德國微生物保藏中心(德國)。
2.1菌株DSM5715/pEC-T18mob2zwf和DSM5399/pEC-T18mob2zwf的制備將菌株DSM5715和DSM5399用質粒pEC-T18mob2zwf使用Liebl等(FEM S Microbiology Letters，53299-303(1989))所述電穿孔方法轉化。在補加了5mg/l四環(huán)素、包含18.5g/l腦心肉浸汁，0.5M山梨糖醇，5g/l Bacto-胰化蛋白胨，2.5g/l Bacto-酵母提取物，5g/l NaCl和18g/l Bacto瓊脂的LBHIS瓊脂上選擇轉化體。在33℃保溫2天。
每次通過常規(guī)方法從轉化體中分離質粒DNA(Peters-Wendisch etal.，1998，Microbiology 144，915-927)，用限制性核酸內(nèi)切酶XbaI和KpnI切割，隨后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒。以這種方式獲得的菌株稱為DSM5715/pEC-T18mob2zwf和DSM5399/pEC-T18mob2zwf。
2.2L-蘇氨酸的制備將在實施例2.1中獲得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5399/pEC-T18mob2zwf在適于蘇氨酸產(chǎn)生的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，確定培養(yǎng)上清中蘇氨酸含量。
為此，首先將菌株在具有相應抗生素的瓊脂平板(具有四環(huán)素(5mg/l)的腦心瓊脂)上在33℃保溫24小時。從這個瓊脂平板培養(yǎng)物開始，接種預培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶中)。完全培養(yǎng)基CgIII用作預培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。
培養(yǎng)基Cg IIINaCl2.5g/lBacto-胨10g/lBacto-酵母提取物10g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌)2％(w/v)將pH調節(jié)為pH7.4向其中加入四環(huán)素(5mg/l)。將此預培養(yǎng)物在33℃以240rpm在搖床上保溫16小時。從這個預培養(yǎng)物中接種主培養(yǎng)物，由此主培養(yǎng)物的起始OD(660nm)為0.1。培養(yǎng)基MM用于主培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基MMCSL(玉米浸液) 5g/lMOPS(嗎啉代丙烷磺酸)20g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌)50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4*7H2O 1.0g/lCaCl2*2H2O 10mg/lFeSO4*7H2O 10mg/lMnSO4*H2O5.0mg/l生物素(過濾滅菌)0.3mg/l硫胺素*HCl(過濾滅菌)0.2mg/lL-亮氨酸(過濾滅菌) 0.1g/lCaCO325g/l
用氨水將CSL，MOPS和所述鹽溶液的pH調節(jié)為7，并高壓滅菌。然后加入無菌底物和維生素溶液，以及在干燥狀態(tài)下高壓滅菌的CaCO3。
在具有擋板的100ml錐形瓶中以10ml體積進行培養(yǎng)。加入四環(huán)素(5mg/l)。在33℃和80％濕度下進行培養(yǎng)。
72小時后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm測定波長下測定OD。用Eppendorf-Bio Tronik公司的氨基酸分析儀(Hamburg，Germany)經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定形成的蘇氨酸量。
實驗結果示于表1。
表1
2.3L-賴氨酸的制備將在實施例2.1中獲得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715/pEC-T18mob2zwf在適于賴氨酸產(chǎn)生的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，確定培養(yǎng)上清中賴氨酸含量。
為此，首先將該菌株在具有相應抗生素的瓊脂平板(具有四環(huán)素(5mg/l)的腦心瓊脂)上在33℃保溫24小時。從這個瓊脂平板培養(yǎng)物開始，接種預培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶中)。完全培養(yǎng)基CgIII用作預培養(yǎng)的培養(yǎng)基。
培養(yǎng)基Cg IIINaCl 2.5g/lBacto-胨 10g/lBacto-酵母提取物 10g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 2％(w/v)pH 7.4向其中加入四環(huán)素(5mg/l)。將此預培養(yǎng)物在33℃以240rpm在搖床上保溫16小時。從這個預培養(yǎng)物中接種主培養(yǎng)物，由此主培養(yǎng)物的起始OD(660nm)為0.1。培養(yǎng)基MM用于主培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基MMCSL(玉米浸液)5g/lMOPS(嗎啉代丙烷磺酸) 20g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 58g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4*7H2O1.0g/lCaCl2*2H2O10mg/lFeSO4*7H2O10mg/lMnSO4*H2O 5.0mg/l生物素(過濾滅菌) 0.3mg/l硫胺素*HCl(過濾滅菌) 0.2mg/lL-亮氨酸(過濾滅菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水將CSL，MOPS和所述鹽溶液的pH調節(jié)為7，并高壓滅菌。然后加入無菌底物和維生素溶液，以及在干燥狀態(tài)下高壓滅菌的CaCO3。
在具有擋板的100ml錐形瓶中以10ml體積進行培養(yǎng)。加入四環(huán)素(5mg/l)。在33℃和80％濕度下進行培養(yǎng)。
72小時后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm測定波長下測定OD。用Eppendorf-Bio Tronik公司的氨基酸分析儀(Hamburg，Germany)經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定形成的賴氨酸量。
實驗結果示于表2。
表2
實施例3谷氨酸棒桿菌菌株ASO19的基因文庫的構建谷氨酸棒桿菌菌株ASO19(Yoshihama et al.，Journal ofBacteriology 162，591-597(1985))的DNA文庫使用λZap ExpressTM系統(tǒng)(Short et al.，(1988)Nucleic Acids Research，167583-7600)構建，如O′Donohue(O′Donohue，M.(1997).The Cloning and MolecularAnalysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes fromCorynebacterium glutamicum.Ph.D.Thesis，National University ofIreland，Galway)所述。λZap ExpressTM試劑盒購自Stratagene(Stratagene，11011 North Torrey Pines Rd.，La Jolla，California 92037)并根據(jù)廠商指導使用。將AS019-DNA用限制酶Sau3A消化并連接進BamHI處理并去磷酸化的λZap ExpressTM臂中。
實施例4pgi基因的克隆與測序4.1克隆將如Kupor和Fraenkel(Journal of Bacteriology 1001296-1301(1969))所述具有pgi和pg1基因突變的大腸桿菌菌株DF1311用實施例3所述的大約500ng的AS019λZap ExpressTM質粒文庫轉化。在含有50mg/l濃度卡那霉素的M9基本培養(yǎng)基(Sambrook et al.，(1989).Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratories，USA)上選擇轉化體，并在37℃保溫48小時。根據(jù)Birnboim和Doly(Nucleic Acids Research 71513-1523(1979))所述從一個轉化體中分離質粒DNA，稱作pAMC1(圖3)。
4.2測序為了對pAMC1克隆的插入體進行序列分析，應用Sanger等(Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74，5463-5467(1977))所述方法，使用經(jīng)有色熒光標記不同標記的引物進行分析。使用Perkin Elmer Applied Biosystems(Perkin Elmer Corporation，Norwalk，Connecticut，U.S.A)的ABI prism 310遺傳分析儀和PerkinElmer的ABI prism Big DyeTMTerminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit進行。
起始序列分析使用得自Pharmacia Biotech(St.Albans，Herts，AL13AW，UK)的通用正向和M13反向引物進行通用正向引物GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C(SEQ ID NO13)M13反向引物GGA AAC AGC TAT GAC CAT G(SEQ ID NO14)
隨后從獲得的序列中設計內(nèi)在引物，由此可以推導全部的pgi基因。內(nèi)在引物的序列如下內(nèi)在引物1(SEQ ID NO15)GGA AAC AGG GGA GCC GTC內(nèi)在引物2(SEQ ID NO16)TGC TGA GAT ACC AGC GGT然后使用DNA Strider程序(Marck，(1988).Nucleic Acids Research161829-1836)，1.0版本在Apple Macintosh計算機上分析獲得的序列。這個程序可以分析如限制位點使用，開放讀框分析和密碼子使用確定。獲得的DNA序列與EMBL和Genbank數(shù)據(jù)庫中的那些序列之間的搜索使用BLAST程序(Altschul et al.，(1997).Nucleic AcidsResearch，253389-3402)進行。DNA和蛋白質序列使用Clustal V和Clustal W程序(Higgins and Sharp，1988 Gene 73237-244)排列對比。
由此獲得的序列示于SEQ ID NO1。獲得的核苷酸序列分析顯示一個1650堿基對的開放讀框，稱作pgi基因，其編碼具有550個氨基酸的蛋白質，如SEQ ID NO2所示。
實施例5整合誘變pgi基因的整合載體的制備pgi基因的內(nèi)部片段通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增，使用分離自谷氨酸棒桿菌AS019(Heery and Dunican，(1993)Applied andEnvironmental Microbiology 59791-799)的基因組DNA作為模板。使用的pgi引物是正向引物ATG GAR WCC AAY GGH AA(SEQ ID NO17)反向引物YTC CAC GCC CCA YTG RTC(SEQ ID NO18)其中R＝A+G；Y＝C+T；W＝A+T；H＝A+T+C。
PCR參數(shù)如下35次循環(huán)
94℃1分鐘47℃1分鐘72℃30秒1.5mM MgCl2大約150-200ng DNA模板將獲得的PCR產(chǎn)物克隆進商購自Promega公司(Promega UK，Southampton.)的pGEM-T載體中，使用大腸桿菌菌株JM109，(Yanisch-Perron et al.，1985.Gene，33103-119)為宿主。該PCR產(chǎn)物的序列示于SEQ ID NO3。然后將克隆的插入體切割為EcoRI片段并與用EcoRI預處理的質粒pBGS8(Spratt et al.，Gene 41337-342(1986))連接。使用的限制酶得自Boehringer Mannheim UK Ltd.，(BellLane，Lewes East Sussex BN7 1LG，UK.)，根據(jù)廠商指導使用。然后將大腸桿菌JM109用這個連接混合物轉化，并在補加了濃度分別為1mM、0.02％和50mg/l的IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)、XGAL(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖吡喃糖苷)和卡那霉素的Luria瓊脂上選擇電轉化體。
將瓊脂平板在37℃保溫12小時。從一個轉化體中分離質粒DNA，使用EcoRI、BamHI和SalI通過限制酶分析鑒定，稱作pMC1(圖4)。
質粒pMC1以大腸桿菌菌株DH5α/pMC1的形式根據(jù)布達佩斯條約保藏在德國微生物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)，保藏號DSM 12969。
實施例6在賴氨酸生產(chǎn)株DSM 5715中pgi基因的整合誘變將實施例5所述的載體pMC1通過Tauch等(FEMSMicrobiological Letters，123343-347(1994))所述電穿孔方法電穿孔進谷氨酸棒桿菌DSM 5715中。菌株DSM 5715是一種AEC-抗性賴氨酸生產(chǎn)菌株。載體pMC1在DSM5715中不能獨立復制，只有整合進DSM 5715染色體中時才能保留在細胞中。通過將電穿孔批次物鋪板在補加15mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)上選擇pMC1整合進染色體中的克隆。
為了檢測整合，將內(nèi)在pgi片段(實施例5)使用得自BoehringerMannheim的Dig雜交試劑盒標記，通過Boehringer Mannheim GmbH的“The DIG System Users Guide for Filter Hybridization”的方法(Mannheim，Germany，1993)進行標記。轉化體的染色體DNA通過Eikmanns等的方法(Microbiology 1401817-1828(1994))分離，并且每次用限制酶SalI、SacI和HindIII切割。形成的片段通過瓊脂糖凝膠分離，在68℃用得自Boehringer的Dig雜交試劑盒雜交。在這種方式中發(fā)現(xiàn)質粒pMC1插入在菌株DSM5715的染色體pgi基因中。這個菌株稱作DSM5715∷pMC1。
實施例7zwf基因過表達及同時pgi基因消除對賴氨酸制備的作用7.1菌株DSM5715∷pMC1/pEC-T18mob2zwf的制備將實施例1.2所述的載體pEC-T18mob2zwf通過Tauch等(1994，F(xiàn)EMS Microbiological Letters，123343-347)所述電穿孔方法電穿孔進谷氨酸棒桿菌DSM 5715∷pMC1中。通過將電穿孔批次物鋪板在補加了15mg/l卡那霉素和5mg/l四環(huán)素的LB瓊脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)上選擇攜帶質粒的細胞。通過常規(guī)方法(Peters-Wendisch et al.，1998，Microbiology144，915-927)從轉化體中分離質粒DNA，并通過用限制酶KpnI和SalI處理及隨后的瓊脂糖凝電泳檢測。所述菌株稱作DSM5715∷pMC1/pEC-T18mob2zwf。
7.2賴氨酸的制備將實施例7.1中獲得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715∷pMC1/pEC-T18mob2zwf在適于賴氨酸產(chǎn)生的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，確定培養(yǎng)上清中賴氨酸含量。
為此，首先將菌株在具有相應抗生素的瓊脂平板(具有四環(huán)素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)的腦心瓊脂)上在33℃保溫24小時。根據(jù)其對抗生素的抗性補加對比菌株的培養(yǎng)物。從這個瓊脂平板培養(yǎng)物開始，接種預培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶中)。完全培養(yǎng)基CgIII用作預培養(yǎng)的培養(yǎng)基。
培養(yǎng)基Cg IIINaCl2.5g/lBacto-胨10g/lBacto-酵母提取物10g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌)2％(w/v)pH7.4向其中加入四環(huán)素(5mg/l)和卡那霉素(5mg/l)。將此預培養(yǎng)物在33℃以240rpm在搖床上保溫16小時。從這個預培養(yǎng)物中接種主培養(yǎng)物，由此主培養(yǎng)物的起始OD(660nm)為0.1。培養(yǎng)基MM用于主培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基MMCSL(玉米浸液) 5g/lMOPS(嗎啉代丙烷磺酸) 20g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4*7H2O 1.0g/lCaCl2*2H2O 10mg/lFeSO4*7H2O 10mg/lMnSO4*H2O 5.0mg/l生物素(過濾滅菌) 0.3mg/l硫胺素*HCl(過濾滅菌) 0.2mg/lL-亮氨酸(過濾滅菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水將CSL、MOPS和所述鹽溶液的pH調節(jié)為7，并高壓滅菌。然后加入無菌底物和維生素溶液，以及在干燥狀態(tài)下高壓滅菌的CaCO3。
在具有擋板的100ml錐形瓶中以10ml體積進行培養(yǎng)。加入四環(huán)素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％濕度下進行培養(yǎng)。
72小時后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm測定波長下測定OD。用Eppendorf-Bio Tronik公司的氨基酸分析儀(Hamburg，Germany)經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定形成的賴氨酸量。
實驗結果示于表3。
表3
實施例8從谷氨酸棒桿菌ATCC 13032制備基因組粘?；蛭膸旃劝彼岚魲U菌ATCC 13032的染色體DNA如Tauch等(1995，Plasmid 33168-179)所述進行分離，并用限制酶Sau3AI(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，Germany，Product Description Sau3AI，Code no.27-0913-02)部分切割。將該DNA片段用蝦堿性磷酸酶(RocheMolecular Biochemicals，Mannheim，Germany，Product DescriptionSAP，Code no.1758250)去磷酸化。將得自Stratagene(La Jolla，USA，Product Description SuperCosl Cosmid Vektor Kit，Code no.251301)的粘粒載體SuperCosl(Wahl et al.(1987)Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 842160-2164)的DNA用限制酶XbaI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，Germany，Product DescriptionXbaI，Code no.27-0948-02)切割，并同樣用蝦堿性磷酸酶去磷酸化。
然后將粘粒DNA用限制酶BamHI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，Germany，Product Description BamHI，Code no.27-0868-04)切割。將以此方式處理的粘粒DNA與處理的ATCC13032 DNA混合，并將該批次物用T4 DNA連接酶(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，Germany，Product Description T4-DNA-Ligase，Code no.27-0870-04)處理。然后將連接混合物借助于Gigapack II XL PackingExtracts(Stratagene，La Jolla，USA，Product Description Gigapack IIXL Packing Extract，Code no.200217)在噬菌體中包裝。為了感染大腸桿菌菌株NM554(Raleigh et al.1988，Nucleic Acid Res.161563-1575)，將細胞置于10mM MgSO4中并與噬菌體懸浮液等份混合。如Sambrook等(1989，Molecular CloningA laboratory Manual，ColdSpring Harbor)所述對粘粒文庫進行感染和滴定，將細胞鋪板在LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)+100μg/ml氨芐青霉素上。在37℃保溫過夜后，選擇重組的各個克隆。
實施例9poxB基因的分離與測序各個菌落的粘粒DNA(實施例7)使用Qiaprep Spin Miniprep試劑盒(Product No.27106，Qiagen，Hilden，Germany)根據(jù)廠商指導進行分離，并使用限制酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，Germany，Product Description Sau3AI，Product No.27-0913-02)部分切割。將該DNA片段用蝦堿性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany，Product Description SAP，Product No.1758250)去磷酸化。通過凝膠電泳分離后，將大小在1500-2000bp范圍的粘粒片段使用QiaExII凝膠提取試劑盒(Product No.20021，Qiagen，Hilden，Germany)分離。得自Invitrogen的測序載體pZero-1的DNA(Groningen，Holland，Product Description Zero Background CloningKit，Product No.K2500-01)用限制酶BamHI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，Germany，Product Description BamHI，Product No.27-0868-04)切割。通過Sambrook等(1989，Molecular CloningA laboratoryManual，Cold Spring Harbor)所述方法在測序載體pZero-1中連接所述粘粒片段，將DNA混合物與T4連接酶(Pharmacia Biotech，F(xiàn)reiburg，Germany)一起保溫過夜。
然后將此連接混合物電穿孔(Tauch et al.1994，F(xiàn)EMS MicrobiolLetters，123343-7)進大腸桿菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.，874645-4649)中，并鋪板于具有50μg/ml zeocin的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上。重組克隆的質粒制備使用Biorobot 9600(ProductNo.900200，Qiagen，Hilden，Germany)進行。測序通過Zimmermann等(1990，Nucleic Acids Research，181067)修改的Sanger等(1977，Proceedings of the National Academies of Sciences U.S.A.，745463-5467)的雙脫氧鏈終止方法進行。使用PE Applied Biosystems的“RRdRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit”(Product No.403044，Weiterstadt，Germany)。在具有PE Applied Biosystems(Weiterstadt，Germany)的測序儀的ABI Prism 377測序儀的Rotiphoresis NFAcrylamide/Bisacrylamide″Gel(291)(Product No.A 124.1，Roth，Karlsruhe，Germany)上進行凝膠電泳分離及測序反應的分析。
然后將獲得的原始序列數(shù)據(jù)使用Staden程序包(1986，NucleicAcids Research，14217-231)版本97-0處理。pZero1衍生物的各個序列被裝配成連續(xù)重疊群(contig)。用XNIP程序(Staden，1986，Nucleic Acids Research，14217-231)進行計算機輔助的編碼區(qū)分析。另外使用BLAST搜索程序(Altschul et al.，1997，Nucleic AcidsResearch，253389-3402)對國立生物技術信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余數(shù)據(jù)庫進行分析。
所得核苷酸序列示于SEQ ID NO4。核苷酸序列分析示出一個1737堿基對的開放讀框，將其稱作poxB基因。poxB基因編碼579個氨基酸的多肽(SEQ ID NO5)。
實施例10進行poxB基因整合誘變的整合載體的制備從菌株ATCC 13032中通過Eikmanns等(Microbiology 1401817-1828(1994))所述方法分離染色體DNA。基于從實施例8中已知的谷氨酸棒桿菌的poxB基因的序列，選擇如下寡核苷酸進行聚合酶鏈反應poxBint1(SEQ ID NO19)5`TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG 3`poxBint2(SEQ ID NO20)5`GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3`所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成，PCR反應通過Innis等(PCR protocols.A guide to methods and applications，1990，Academic Press)的標準PCR方法進行，使用Boehringer的Pwo聚合酶。借助于聚合酶鏈反應，分離一個大小大約0.9kb的DNA片段，其攜帶poxB基因的內(nèi)部片段，如SEQ ID NO6所示。
將擴增的DNA片段與Invitrogen公司的TOPO TA克隆試劑盒(Carlsbad，CA，USA；Catalogue Number K4500-01)在載體pCR2.1-TOPO(Mead at al.(1991)Bio/Technology 9657-663)中連接。然后將大腸桿菌菌株DH5α用連接批次物電穿孔(Hanahan，InDNA cloning.APractical Approach.Vol.I，IRL-Press，Oxford，Washington DC，USA，1985)。將轉化批次物鋪板在補加25mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)上，選擇攜帶質粒的細胞。質粒DNA借助于Qiagen的QIAprep SpinMiniprep試劑盒從轉化體中分離，并通過用限制酶EcoRI限制及隨后的瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)進行檢測。這個質粒稱作pCR2.1poxBint(圖5)。
質粒pCR2.1poxBint以大腸桿菌菌株DH5α/pCR2.1poxBint形式根據(jù)布達佩斯條約保藏在德國微生物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)，保藏號為DSM 13114。
實施例11在賴氨酸生產(chǎn)菌株DSM 5715中poxB基因的整合誘變將實施例10所述的載體pCR2.1poxBint通過Tauch等的電穿孔方法(FEMS Microbiological Letters，123343-347(1994))電穿孔進谷氨酸棒桿菌DSM 5715中。菌株DSM 5715是AEC抗性賴氨酸生產(chǎn)菌株。載體pCR2.1poxBint在DSM5715中不能獨立復制，只有整合進DSM5715的染色體中才能保留在細胞中。將電穿孔批次物鋪板在補加了15mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.)上，選擇pCR2.1poxBint整合進染色體中的克隆。為了檢測整合，通過Boehringer Mannheim GmbH(Mannheim，Germany，1993)的“The DIG System Users Guide for FilterHybridization”的方法將poxBint片段用Boehringer的Dig雜交試劑盒標記。
潛在整合體的染色體DNA通過Eikmanns等(Microbiology 1401817-1828(1994))所述的方法分離，并每次用限制酶SalI、SacI和HindIII切割。形成的片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離，在68℃用Boehringer的Dig雜交試劑盒雜交。實施例9所述的質粒pCR2.1poxBint插入DSM5715染色體的poxB基因中。該菌株稱作DSM5715∷pCR2.1poxBint。
實施例12zwf基因過表達同時poxB基因消除對賴氨酸生產(chǎn)的作用12.1菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf的制備使用Liebl等所述電穿孔方法(FEMS Microbiology Letters，53299-303(1989))，將菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint用質粒pEC-T18mob2zwf進行轉化。在包含18.5g/l腦心肉浸汁、0.5M山梨糖醇，5g/l Bacto-胰化蛋白胨、2.5g/l Bacto-酵母提取物、5g/l NaCl和18g/lBacto-瓊脂并補加了5mg/l四環(huán)素和25mg/l卡那霉素的LBHIS瓊脂上選擇轉化體。在33℃保溫2天。
通過常規(guī)方法(Peters-Wendisch et al.，1998，Microbiology 144，915-927)每次從轉化體中分離質粒DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶XbaI和KpnI切割，并將質粒通過隨后的瓊脂糖凝膠電泳檢測。以這種方式獲得的菌株稱作DSM5715pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf。
12.2L-賴氨酸的制備將實施例12.1中獲得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint/EC-T18mob2zwf在適于賴氨酸生產(chǎn)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，確定培養(yǎng)上清中的賴氨酸含量。
為此，首先將菌株在具有相應抗生素的瓊脂平板(具有四環(huán)素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)的腦心瓊脂)上在33℃保溫24小時。根據(jù)其抗生素抗性補加對比菌株。從這個瓊脂平板培養(yǎng)物開始，接種預培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶中)。完全培養(yǎng)基Cg III用作預培養(yǎng)的培養(yǎng)基。
培養(yǎng)基Cg IIINaCl 2.5g/lBacto-胨 10g/lBacto-酵母提取物 10g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 2％(w/v)pH 7.4向其中加入四環(huán)素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。將此預培養(yǎng)物在33℃以240rpm在搖床上保溫16小時。從這個預培養(yǎng)物中接種主培養(yǎng)物，由此主培養(yǎng)物的起始OD(660nm)為0.1。培養(yǎng)基MM用于主培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基MMCSL(玉米浸液) 5g/lMOPS(嗎啉代丙烷磺酸) 20g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 58g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4*7H2O 1.0g/lCaCl2*2H2O 10mg/lFeSO4*7H2O 10mg/lMnSO4*H2O 5.0mg/l生物素(過濾滅菌) 0.3mg/l硫胺素*HCl(過濾滅菌) 0.2mg/lL-亮氨酸(過濾滅菌)0.1g/lCaCO325g/l
用氨水將CSL、MOPS和所述鹽溶液的pH調節(jié)為7，并高壓滅菌。然后加入無菌底物和維生素溶液，以及在干燥狀態(tài)下高壓滅菌的CaCO3。
在具有擋板的100ml錐形瓶中以10ml體積進行培養(yǎng)。加入四環(huán)素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％濕度下進行培養(yǎng)。
72小時后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm測定波長下測定OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(Hamburg，Germany)經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定形成的賴氨酸量。
實驗結果示于表4。
表4
實施例13zwf等位基因zwf(A243T)分離與測序谷氨酸棒桿菌菌株DM658通過從谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中經(jīng)過多重、非定向誘變、突變體選擇及篩選而制備。該菌株對L-賴氨酸類似物S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)具有抗性，并且具有對L-賴氨酸、L-賴氨酸類似物S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)和L-蘇氨酸的混合物不敏感的反饋抗性天冬氨酸激酶。菌株DM658保藏在德國微生物保藏中心(DSMZ)，保藏號為DSM7431。
通過常規(guī)方法(Eikmanns et al.，Microbiology 1401817-1828(1994))，從菌株DM658中分離染色體DNA。借助于聚合酶鏈反應(PCR)，擴增攜帶zwf基因或等位基因的DNA片段?；诠劝彼岚魲U菌的zwf基因的序列，選擇如下實施例1.2中的引物寡核苷酸進行PCRzwf-正向(SEQ ID NO11)5′-TCG ACG CGG TTC TGG AGC AG-3′zwf-反向(SEQ ID NO12)5′-CTA AAT TAT GGC CTG CGC CAG-3′所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成，通過Innis等(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)的標準PCR方法進行PCR。所述引物擴增出長度為大約1.85kb的、攜帶zwf等位基因的DNA片段。
通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳鑒別攜帶菌株DM658的zwf等位基因的、長度為大約1.85kb的擴增的DNA片段，從凝膠中分離并通過常規(guī)方法(QIAquick Gel Extraction Kit，Qiagen，Hilden，Germany)純化。
擴增的DNA片段或PCR產(chǎn)物的核苷酸序列通過MWG Biotech(Ebersberg，Germany)測序而確定。該PCR產(chǎn)物的序列示于SEQ IDNO21。借助于Patentin程序獲得的間酶蛋白(Zwf蛋白)的氨基酸序列示于SEQ ID NO22。
菌株DM658的zwf等位基因的編碼區(qū)的核苷酸序列在第727位具有堿基腺嘌呤。zwf等位基因編碼區(qū)的核苷酸序列中第727位相應于SEQ ID NO21所示核苷酸序列的第1034位。
在野生型基因編碼區(qū)的核苷酸序列的第727位核苷酸是堿基鳥嘌呤。野生型基因編碼區(qū)的核苷酸序列的第727位相應于SEQ ID NO9的第1264位。
菌株DM658的間酶蛋白(Zwf(A243T))的氨基酸序列在第243位具有氨基酸蘇氨酸(SEQ ID NO22)。在野生型蛋白的相應位置是氨基酸丙氨酸(SEQ ID NO10)。因此，所述等位基因稱作zwf(A243T)。
SEQ ID NO23示出包含鳥嘌呤腺嘌呤轉換(見SEQ ID NO23的第137位)的zwf(A243T)等位基因的編碼序列的一個內(nèi)部節(jié)段。
實施例14zwf等位基因zwf(A243T)的轉移14.1攜帶zwf(A243T)等位基因的DNA片段的分離通過常規(guī)方法(Eikmanns et al.，Microbiology 1401817-1828(1994))，從菌株DM658中分離染色體DNA。借助于聚合酶鏈反應擴增攜帶zwf(A243T)等位基因的DNA區(qū)域，所述等位基因在編碼區(qū)(CDS)的第727位含有堿基腺嘌呤代替野生型基因在此位置含有的堿基鳥嘌呤。基于谷氨酸棒桿菌的zwf基因的序列，選擇如下引物寡核苷酸引物進行聚合酶鏈反應zwf_XL-A1(SEQ ID NO24)5`gatct aga-agc tcg cct gaa gta gaa tc 3`zwf_XL-E1(SEQ ID NO25)5`gatct aga-gat tca cgc agt cga gtt ag 3`所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成，通過Innis等(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)標準PCR方法進行PCR反應。所述引物擴增出攜帶zwf(A243T)等位基因的、長度為大約1.75kb的一個DNA片段(SEQ IDNO26)。所述引物另外含有限制性核酸內(nèi)切酶XbaI的切割位點的序列，其在上述核苷酸序列中以下劃線標明。
攜帶zwf(A243T)等位基因的、長度為大約1.75kb的擴增的DNA片段用限制性核酸內(nèi)切酶XbaI切割，通過在0.8％瓊脂糖凝膠中進行電泳進行鑒別，然后通過常規(guī)方法從凝膠中分離并純化(QIAquick GelExtraction Kit，Qiagen，Hilden)。
14.2置換載體的構建將含有zwf(A243T)等位基因的長度為大約1.75kb的XbaI DNA片段(見實施例14.1)摻入谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715的染色體中，通過Schaefer等所述的sacB系統(tǒng)(Gene，14，69-73(1994))進行置換誘變。這個系統(tǒng)通過同源重組可以制備并選擇發(fā)生的等位基因置換。
將可移動的克隆載體pK18mobsacB用限制酶XbaI消化，并將末端用堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，Boehringer Mannheim，Germany)去磷酸化。將以這種方式制備的載體與大約1.75kb大小的zwf(A243T)片段混合，將混合物用T4 DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，Germany)處理。
然后將大腸桿菌菌株S17-1(Simon et al.，Bio/Technologie 1784-791，1993)用該連接批次物轉化(Hanahan，In.DNA cloning.APractical Approach.Vol.1，ILR-Press，Cold Spring Harbor，NewYork，1989)。將轉化批次物鋪板在補加了25mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring Harbor，New York，1989)上，選擇攜帶質粒的細胞借助于Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉化體中分離質粒DNA，通過用酶PstI限制性切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。該質粒稱作pK18mobsacB_zwf(A243T)，示于圖6。
14.3等位基因的轉移將實施例14.2中所述的載體pK18mobsacB_zwf(A243T)通過接合移至谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715中，通過Schaefer等所述方法(Journal of Microbiology 1721663-1666(1990))進行。該載體在DSM5715中不能獨立復制，只有通過重組事件整合進染色體中才保留在細胞中。將接合批次物鋪板在補加了15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB瓊脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA LaboratoryManual.2ndEd.，Cold Spring Harbor，New York，1989)上，選擇轉接合子，即具有整合的pK18mobsacB_zwf(A243T)的克隆。將卡那霉素抗性轉接合子鋪板在含有25mg/l卡那霉素的LB瓊脂平板上，在33℃保溫24小時?？敲顾乜剐赞D接合子稱作DSM5715∷pK18mobsacB_zwf(A243T)。作為質粒載體pK18mobsacB_zwf(A243T)整合進菌株DSM5715染色體中的結果，獲得的菌株即DSM5715∷pK18mobsacB_zwf(A243T)含有zwf野生型基因和zwf(A243T)等位基因。
為了選擇其中由于二次重組事件所致的切除了所述質粒的突變體，將菌株DSM5715∷pK18mobsacB_zwf(A243T)的細胞在LB液體培養(yǎng)基中非選擇性培養(yǎng)24小時，然后鋪板在具有10％蔗糖的LB瓊脂上，保溫30小時。
質粒pK18mobsacB_zwf(A243T與起始質粒pK18mobsacB一樣，除了卡那霉素抗性基因之外，還含有編碼枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的果聚糖蔗糖酶的sacB基因拷貝?？捎烧崽钦T導的表達導致果聚糖蔗糖酶形成，其催化對于谷氨酸棒桿菌是毒性的產(chǎn)物果聚糖的合成。只有其中由于二次重組事件而切除了整合的質粒pK18mobsacB_zwf(A243T)的那些克隆在含有蔗糖的LB瓊脂上生長。依賴于關于突變位點的二次重組事件的位置，發(fā)生等位基因置換(即摻入突變)或者原始拷貝(即野生型基因)保留在宿主的染色體中。
對大約40-50個菌落測試“在存在蔗糖時的生長”和“在存在卡那霉素時的不生長”的表型。在示出“在存在蔗糖時的生長”和“在存在卡那霉素時的不生長”的表型的4個菌落中，對跨越zwf(A243T)突變的zwf基因的一個區(qū)域測序，從測序引物zf_1(SEQID NO27)(GATC Biotech AG，Konstanz，Germany制備)開始，以論證染色體中存在zwf(A243T)等位基因突變。引物zf_1的核苷酸序列如下zf_1(SEQ ID NO27)5`ggc tta cta cct gtc cat tc 3`以這種方式鑒別在zwf基因編碼區(qū)(CDS)第727位含有堿基腺嘌呤并因此在其染色體中具有zwf(A243T)等位基因的克隆。這個克隆稱作菌株DSM5715zwf2_A243T。
菌株DSM5715zwf2_A243T根據(jù)布達佩斯條約保藏在德國微生物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)，保藏號為DSM15237。
實施例15葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的鑒定和確定15.1菌株DM658的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的確定為了鑒定zwf等位基因zwf(A243T)編碼的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性，將菌株DM658在LB培養(yǎng)基(Merck KG，Darmstadt，Germany)中保溫24小時。培養(yǎng)是以25ml體積在具有檔板的250ml錐形瓶中在33℃以200rpm在搖床上進行的。為了進行對比，平行培養(yǎng)野生型菌株ATCC 13032。通過離心收集生物量并隨后在pH7.8的Tris-HCl(100mM)緩沖液中洗滌。使用Ribolyser系統(tǒng)(Hybaid AG，Heidelberg，Germany)使細胞溶解。通過這種方法，使用1.6g玻璃珠(直徑0.2μm)和含有上述細胞的pH 7.8的、0.6g Tris-HCl(100mM)/NaCl緩沖液(520mM)對細胞進行機械化溶解。離心后，分離上清并用作粗提物。通過比色BCA方法(Pierce，Rockford，IL，USA，Order No.23235ZZ)，使用等份上清確定總蛋白質濃度。將另一等份用于確定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性。
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(EC 1.1.1.49)催化如下反應葡萄糖-6-磷酸+NADP+6-磷酸葡糖酸-δ-內(nèi)酯+NADPH確定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的分析系統(tǒng)含有100mM Tris-HCl(pH 7.8)，10mM MgCl2和260μM NADP+。加入葡萄糖-6-磷酸至終濃度為7mM葡萄糖-6-磷酸開始反應。NADPH的吸收在25℃在340nm使用Hitachi U3200分光光度計(Nissei Sangyo，Duesseldorf，Germany)監(jiān)測。
為了計算單位/毫升的容量酶活性，使用如下公式
為了計算單位/毫克總蛋白的酶比活性(U/mg；mU＝毫單位/mg)，將酶活性除以粗提物的蛋白質濃度。
在存在NADPH時葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的測定在含有100mM Tris-HCl(pH7.8)、10mM MgCl2、260μM NADP+和260μMNADPH的分析系統(tǒng)中進行。加入葡萄糖-6-磷酸至終濃度為7mM開始反應。在存在NADPH時酶活性的計算以如前述相同方式進行。
實驗結果示于表5。
表5
15.2菌株DSM5715zwf2_A243T的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的確定為了確定菌株DSM5715zwf2_A243T中含有的、zwf等位基因zwf(A243T)編碼的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性，將該菌株在LB培養(yǎng)基(Merck KG，Darmstadt，Germany)中保溫24小時。培養(yǎng)是以25ml體積在250ml具有檔板的錐形瓶中，在33℃以200rpm在搖床上進行。為了進行對比，平行保溫具有野生型zwf基因的親代菌株DSM5715。生物量的制備如實施例15.1所述進行。
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性在存在其反應終產(chǎn)物NADPH的情況中的測定在含有100mM Tris-HCl(pH7.8)、10mM MgCl2、260μMNADP+、7mM葡萄糖-6-磷酸和400μM NADPH的分析系統(tǒng)中進行。在存在NDDPH時的酶活性以前述相同方式計算。
實驗結果示于表6。
表6
實施例16L-賴氨酸的生產(chǎn)將在實施例14中獲得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715和DSM5715zwf2_A243T在適于賴氨酸產(chǎn)生的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，確定培養(yǎng)上清中賴氨酸含量。
為此，首先將菌株在33℃在瓊脂平板上保溫24小時。從這個瓊脂平板培養(yǎng)物開始，每次接種預培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶中)。培養(yǎng)基MM用作預培養(yǎng)的培養(yǎng)基。將預培養(yǎng)物在33℃以240rpm在搖床上保溫24小時。在所有情況下，從這些預培養(yǎng)物中接種主培養(yǎng)物，由此主培養(yǎng)物的起始OD(660nm)為0.1。培養(yǎng)基MM也用于主培養(yǎng)。
培養(yǎng)基MMCSL 5g/lMOPS 20g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 50g/l鹽(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4*7H2O1.0g/lCaCl2*2H2O10mg/lFeSO4*7H2O10mg/lMnSO4*H2O 5.0mg/l生物素(過濾滅菌) 0.3mg/l硫胺素*HCl(過濾滅菌) 0.2mg/lL-亮氨酸(過濾滅菌) 0.1g/lCaCO325g/l
用氨水將CSL(玉米浸液)、MOPS(嗎啉代丙烷磺酸)和所述鹽溶液的pH調節(jié)為7，并高壓滅菌。然后加入無菌底物和維生素溶液，以及在干燥狀態(tài)下高壓滅菌的CaCO3。
在具有擋板的100ml錐形瓶中以10ml體積進行培養(yǎng)。在33℃和80％濕度下進行培養(yǎng)。
72小時后，用Biomek1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm測定波長下測定OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(Hamburg，Germany)經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定形成的賴氨酸量。
實驗結果示于表7。
表7
實施例17菌株DM1697的zwf野生型基因被zwf(D245S)等位基因置換17.1攜帶zwf基因的DNA片段的分離谷氨酸棒桿菌菌株DM1697通過從谷氨酸棒桿菌ATCC21527中經(jīng)多次非定向誘變、選擇和突變體選擇而產(chǎn)生。ATCC21527對于L-亮氨酸和L-高絲氨酸是營養(yǎng)缺陷的。相反，菌株DM1697對于L-亮氨酸和L-高絲氨酸是原養(yǎng)型的，對賴氨酸類似物S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸有抗性，并且具有對S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸和蘇氨酸(在所有情況中均為25mM)混合物的抑制作用不敏感的反饋抗性天冬氨酸激酶。
通過常規(guī)方法(Eikmanns et al.，Microbiology 1401817-1828(1994))從菌株DM1697中分離染色體DNA。攜帶zwf基因的DNA片段借助于聚合酶鏈反應擴增?；趶膶嵤├?中已知的谷氨酸棒桿菌zwf基因序列，選擇如下寡核苷酸引物進行聚合酶鏈反應zwf_XL-Al(SEQ ID NO24)5`gatctagaagc tcg cct gaa gta gaa tc 3`zwf_XL-E1(SEQ ID NO25)5`gatctagagat tca cgc agt cga gtt ag 3`所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成，PCR反應通過Innis等的標準PCR方法進行(PCR Protocols.A Guide to Methodsand Applications，1990，Academic Press)。引物可以擴增長度為大約1.75kb的、攜帶zwf基因的DNA片段(SEQ ID NO38)。所述引物另外含有限制性核酸內(nèi)切酶XbaI的切割位點的序列，在如上所示核苷酸序列中以下劃線標示。
將攜帶zwf基因的、長度為大約1.75kb的擴增的DNA片段用限制性核酸內(nèi)切酶XbaI切割，通過在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳鑒別，然后通過常規(guī)方法從凝膠中分離和純化(QIAquick Gel Extraction Kit，Qiagen，Hilden)。
17.2置換載體pK18mobsacB_zwf的構建將可移動的克隆載體pK18mobsacB用限制酶XbaI消化，并將末端用堿性磷酸酶去磷酸化(Alkaline Phosphatase，BoehringerMannheim，Germany)。將以這種方式制備的載體與大小大約1.75kb的zwf片段混合，并將混合物用T4 DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，Germany)處理。
然后將大腸桿菌菌株DH5α(Brown(ed.)Molecular BiologyLabfax，BIOS Scientific Publishers，Oxford，UK，1991)用連接批次物轉化(Hanahan，In.DNA cloning.A Practical Approach.Vol.1，ILR-Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)。將轉化批次物鋪板在補加了50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring Harbor，New York，1989)上，選擇攜帶質粒的細胞。
借助于Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉化體中分離質粒DNA，通過用酶XbaI限制性切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。該質粒稱作pK18mobsacB_zwf，示于圖7。
17.3通過野生型zwf基因的定點誘變構建zwf(D245S)等位基因使用QuikChange Site-Directed誘變試劑盒(Stratagene，La Jolla，USA)進行定點誘變。在SEQ ID NO38所示zwf野生型基因的核苷酸序列中導入三個點突變(取代)。這些取代是核苷酸序列第861位的鳥嘌呤由胸腺嘧啶取代、第862位的腺嘌呤由胞嘧啶取代及第863位的胸腺嘧啶由腺嘌呤取代。以這種方式產(chǎn)生的核苷酸序列示于SEQID NO39，其編碼在其氨基酸序列第245位由絲氨酸代替天冬氨酸的變體Zwf蛋白。
該等位基因稱作zwf(D245S)。為了產(chǎn)生所述突變，選擇如下寡核苷酸引物進行線性擴增DM_D245Sa(SEQ ID NO40)5′AGATCACCATGGCTGAA(TCA)ATTGGCTTGGGTGGAC 3′DM_D245Sb(SEQ ID NO41)5′GCACGTCCACCCAAGCCAAT(TGA)TTCAGCCATGGTG 3′所示引物由MWG Biotech合成。在衍生自zwf基因的氨基酸序列第245位取代天冬氨酸的絲氨酸密碼子在上述核苷酸序列中以括號標示。將實施例17.2所述的質粒pK18mobsacB_zwf和與質粒的鏈均互補的兩個引物一起應用，通過Pfu Turbo DNA聚合酶進行線性擴增。通過這種引物延長，形成了具有斷續(xù)的環(huán)形鏈的突變質粒。將線性擴增的產(chǎn)物用DpnI處理-這種內(nèi)切酶特異性切割甲基化和半甲基化的模板DNA。新合成的、斷續(xù)的、突變的載體DNA轉化大腸桿菌菌株XL1 Blue(Bullock，F(xiàn)ernandez and Short，BioTechniques(5)376-379(1987))。轉化后，XL1 Blue細胞修復突變質粒中的缺口。在具有50mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基上選擇轉化體。獲得的質粒通過在分離DNA之后限制性切割而檢測，并通過電泳鑒別。突變的DNA片段的DNA序列通過測序檢測。PCR產(chǎn)物的序列相應于SEQ ID NO39所示核苷酸序列。所得質粒稱作pK18mobsacB_zwf(D245S)。質粒的圖譜示于圖8。
17.4菌株DM1697的zwf野生型基因由zwf(D245S)等位基因置換將實施例實施例17.3所述的質粒pK18mobsacB_zwf(D245S)如實施例14.3所述通過接合移至谷氨酸棒桿菌菌株DM1697中。如實施例14.3所述針對谷氨酸棒桿菌DM1697染色體中的靶定重組事件進行選擇。依賴于質粒切割期間二次重組事件的位置，含有突變的zwf等位基因出現(xiàn)在染色體zwf基因座中，或者保留宿主原始的zwf基因座。
對大約40-50個菌落測試“在存在蔗糖時生長”和“在存在卡那霉素時不生長”的表型。在示出“在存在蔗糖時生長”和“在存在卡那霉素時不生長”的表型的6個菌落中，對跨越zwf(D245S)突變的zwf基因的一個區(qū)域測序，從測序引物zf_2(SEQ ID NO42)(GATCBiotech AG，Konstanz，Germany制備)開始，以論證染色體中存在zwf(D245S)等位基因突變。引物zf_2的核苷酸序列如下zf_2(SEQ ID NO42)5`TTC TGT GTT CCG CAT CGA CC 3`以這種方式鑒別了在zwf基因編碼區(qū)(CDS)第733、734和735位分別含有堿基胸腺嘧啶、胞嘧啶和腺嘌呤并因此在其染色體中具有zwf(D245S)等位基因(SEQ ID NO36)的克隆。zwf等位基因編碼區(qū)的核苷酸序列的第733、734和735位相應于SEQ ID No39的第861、862和863位。這個克隆稱作菌株DM1697_zwf(D245S)。
菌株DM1697_zwf(D245S)根據(jù)布達佩斯條約保藏在德國微生物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)，保藏號為DSM15632。
17.5菌株DSM15632的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的確定為了確定由菌株DSM15632中含有的zwf(D245S)等位基因編碼的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性，將該菌株在LB培養(yǎng)基(Merck KG，Darmstadt，Germany)中保溫24小時。培養(yǎng)是以25ml體積在具有檔板的250ml錐形瓶中在33℃以200rpm在搖床上進行的。為了進行對比，平行保溫具有野生型zwf基因的親代菌株DM1697。生物量的制備如實施例15.1所述制備。
在存在其反應終產(chǎn)物NADPH的情況中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的測定是在含有100mM Tris-HCl(pH 7.8)、10mM MgCl2，260μMNADP+、7mM葡萄糖-6-磷酸和400μM NADPH的分析系統(tǒng)中進行。在存在NADPH的情況中的酶活性以前述相同方式計算。
實驗結果示于表8。
表8
17.6L-賴氨酸的制備將在瓊脂平板(腦心瓊脂)上在33℃生長24小時的實施例17.4中獲得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM15632的細胞接種于在500ml具有檔板的錐形瓶中50ml的LSS1培養(yǎng)基(Ohnishi et al.，Applied Microbiologyand Biotechnology 58217-223(2002))中，培養(yǎng)基中5％蔗糖用5％葡萄糖代替。在最初加入的糖全部消耗之后的早期穩(wěn)定階段停止在33℃在旋轉搖床上的培養(yǎng)。使用4ml種子肉湯接種含有1000ml LPG1培養(yǎng)基(Ohnishi et al.，Applied Microbiology and Biotechnology 58217-223(2002))的2L發(fā)酵罐(Biostat B reactor，B.Braun，Melsungen，Germany)。
在最初加入的糖消耗之后，持續(xù)加入含有50％(w/v)葡萄糖和3.5％(w/v)(NH4)2SO4的溶液，直至發(fā)酵罐中總培養(yǎng)體積達到2000ml。培養(yǎng)在pO2＞20％，充氣＞0.51/分鐘，和33℃下進行。pH保持在7.0。用Eppendorf-BioTronik公司(Hamburg，Germany)的氨基酸分析儀經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定形成的賴氨酸量。
實驗結果示于表9。
表9
實施例18谷氨酸棒桿菌DM1698的構建谷氨酸棒桿菌菌株DM1698基于實施例17.1所述的谷氨酸棒桿菌DM1697構建。其攜帶使用實施例14.2構建的置換載體pK18mobsacB_zwf(A243T)導入菌株DM1697中的zwf(A243T)等位基因。zwf(A243T)等位基因如實施例14.3所述通過接合、置換和選擇移至DM1697中。所得菌株稱作DM1698，在這個實施例中使用。
如實施例16對于菌株DSM5715和DSM5715zwf2_A243T所描述，突變zwf(A243T)整合進zwf基因改良了L-賴氨酸的生產(chǎn)。這同樣也用于攜帶zwf(A243T)等位基因的菌株DM1698，結果是比親代菌株DM1697更好的L-賴氨酸生產(chǎn)株。
實施例19在菌株DM1697的zwf野生型基因中導入90個堿基對缺失并確定編碼的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性設計實施例19和實施例20的實驗以論證谷氨酸棒桿菌的zwf基因編碼序列的5’末端的90個堿基對(見例如SEQ ID NO9所示的zwf野生型基因或者SEQ ID NO21所示的zwf(A243T)等位基因)是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性所必需的，所述90個堿基對未包括在JP-A-092244661所述的zwf基因的編碼序列中(見SEO ID NO7)。
在實施例19，論證了野生型基因(SEQ ID NO9)和編碼的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(SEQ ID NO10)。在實施例20中，論證了實施例13所述的zwf(A243T)等位基因(SEQ ID NO21)和編碼的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(SEQ ID NO22)。
在這個實施例中，谷氨酸棒桿菌菌株DM1697(見實施例17.1)的zwf野生型基因缺失90個堿基對，以比較在90個堿基對缺失前后野生型等位基因編碼的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性。
19.1zwf缺失片段克隆進載體pCRBluntII TOPO中通過Tauch等所述方法(1995，Plasmid 33168-179)從菌株ATCC13032中分離染色體DNA。基于從實施例1已知的谷氨酸棒桿菌zwf基因的序列，選擇下述寡核苷酸通過聚合酶鏈反應(PCR)產(chǎn)生zwf缺失片段，通過基因SOEing方法(Gene Splicing by OverlapExtension，Horton，Molecular Biotechnology 393-98(1995))進行。
zwfA(SEQ ID NO43)5′-ATTCTAGACAC CTT GAT CTT CTC CGT TG-3′zwfB(SEQ ID NO44)5′-GAT GGT AGT GTC ACG ATC CT-3′zwfC(SEQ ID NO45)5′-AGG ATC GTG ACA CTA CCA TCA TGG TGA TCT TCG GTG TCA C-3′zwfD(SEQ ID NO46)5′-ATTCTAGAGCG GAG GTT TTA TCC AAT GG-3′所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成，PCR通過Innis等的標準PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications，1990，Academic Press)進行，使用NewEnglandBiolabs的Vent DNA聚合酶(Germany，Product Description Vent DNAPolymerase)。
在所有情況中，引物zwfA和zwfD均含有限制酶XbaI的一個插入的切割位點，在上述核苷酸序列中以下劃線標示。引物zwfC的前20個堿基含有引物zwfB的反向互補序列。
借助于聚合酶鏈反應，引物zwfA和zwfB使得一個710bp的DNA片段擴增，引物zwfC和zwfD使得一個850bp的DNA片段擴增。擴增物隨后通過在0.8％瓊脂糖凝膠中的瓊脂糖凝膠電泳而檢測，使用High Pure PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Deutschland)從瓊脂糖凝膠中分離，并在使用引物zwfA和zwfD的另一個PCR反應中一起用作DNA模板。這樣導致zwf缺失片段產(chǎn)生，大小為1560bp(見SEQ ID NO47所示)。
擴增的產(chǎn)物隨后在0.8％瓊脂糖凝膠中檢測。
將獲得的PCR產(chǎn)物克隆進載體pCRBluntII TOPO(Zero BluntTOPO PCR Cloning Kit，Invitrogen，Deutschland)中，然后根據(jù)廠商指導將大腸桿菌菌株TOP10(Grant et al.，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)用該連接批次物轉化。將轉化批次物鋪板在補加了50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring Harbor，New York，1989)上，選擇攜帶質粒的細胞。
借助于High Pure質粒分離試劑盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)從轉化體中分離質粒DNA，并通過用限制酶XbaI限制及隨后的瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)進行檢測。該質粒稱作pCRBluntII_AB1CD1，示于圖9。
19.2取代載體pK18mobsacB_zwfdelta90bp的構建圖9和10中稱作“deltazwf90”的zwf缺失片段是通過用限制酶XbaI對實施例19.1中獲得的載體pCRBluntII_AB1CD1進行完全切割而分離的。在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離后，將大約1600bp的zwf缺失片段借助于High Pure PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，Germany)從瓊脂糖凝膠中分離。
以這種方式處理的zwf缺失片段用于與可移動的克隆載體pK18mobsacB(Schfer et al.，Gene 1469-73(1994))連接。所述載體預先用限制酶XbaI切開，然后用蝦堿性磷酸酶(Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，Germany)去磷酸化。將該載體DNA與zwf缺失片段混合，并將混合物用T4 DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，Germany)處理。
然后將大腸桿菌菌株S17-1(Simon et al.，Bio/Technologie 1784-791，1993)用該連接批次物轉化。將轉化批次物鋪板在補加了50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA LaboratoryManual.2ndEd.，Cold Spring Harbor，New York，1989)上，選擇攜帶質粒的細胞。
借助于High Pure質粒分離試劑盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Deutschland)從轉化體中分離質粒，并通過用限制酶XbaI限制及隨后的瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)進行檢測。另外，克隆的zwf缺失片段通過GATC Biotech AG(Konstanz，Germany)測序核實。該質粒稱作pK18mobsacB_zwfdelta90bp，示于圖10。
19.3在菌株DM1697的zwf野生型基因中導入90堿基對缺失菌株DM1697在實施例17.1中描述，其攜帶zwf野生型基因。
將實施例19.2中描述的質粒pK18mobsacB_zwfdelta90bp如實施例14.3所述通過接合移至谷氨酸棒桿菌菌株DM1697中(Schifer etal.，Applied and Environmental Microbiology 60，756-759(1994))。如實施例14.3所述針對谷氨酸棒桿菌DM1697染色體中靶定重組事件進行選擇。依賴于二次重組事件的位置，在質粒切除后，攜帶90bp缺失的zwf等位基因出現(xiàn)在染色體zwf基因座，或者保留宿主原始的zwf基因座。
對大約40-50個菌落測試“在存在蔗糖時生長”和“在存在卡那霉素時不生長”的表型。在示出“在存在蔗糖時生長”和“在存在卡那霉素時不生長”的表型的30個菌落中，對跨越zwf缺失的zwf基因的一個區(qū)域通過聚合酶鏈反應擴增，使用Taq DNA聚合酶(Qiagen，Hilden，Germany)通過Innis等所述標準PCR方法(PCRprotocols.A guide to methods and applications，1990，Academic Press)進行，以論證染色體中存在zwf等位基因中90bp缺失。
PCR反應使用下述寡核苷酸(由MWG Biotech，Ebersberg合成)進行zwfi1(SEQ ID NO48)5`-GGC GTT GAC TTG GCA GAT GT-3`zwfi2(SEQ ID NO49)5`-GCA GAC CGC TGT GAA GGA AT-3`這導致581bp大小的PCR片段擴增，表示存在90bp缺失，或者671bp大小的PCR片段擴增，表示存在zwf野生型序列。
擴增產(chǎn)物隨后在0.8％瓊脂糖凝膠中檢測。
因此鑒別了含有zwf缺失等位基因的谷氨酸棒桿菌菌株，分離并將其稱作DM1697deltazwf90bp。
19.4菌株DM1697deltazwf90bp的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的確定為了確定菌株DM1697deltazwf90bp中含有的zwf缺失等位基因編碼的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性，將該菌株在LB培養(yǎng)基(MerckKG，Darmstadt，Germany)中保溫24小時。培養(yǎng)是以25ml體積在具有檔板的250ml錐形瓶中在33℃以200rpm在搖床上進行的。為了進行比較，將親代菌株DM1697平行保溫。生物量的制備如實施例15.1所述進行。
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的測定在含有100mM Tris-HCl(pH 7.5)+1mM DTT、15mM MgCl2、1.5mM NADP+和10mM葡萄糖-6-磷酸的分析系統(tǒng)中進行。以如前述相同方式計算酶活性。
實驗結果示于表10。
表10
實施例20在菌株DM1698的zwf(A243T)等位基因中導入90個堿基對缺失并確定編碼的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性20.1在菌株DM1698的zwf(A243T)等位基因中導入90個堿基對缺失將實施例19.2所述的質粒pK18mobsacB_zwfdelta90bp如實施例14.3所述通過接合(Schfer et al.，Applied and EnvironmentalMicrobiology 60，756-759(1994))移至谷氨酸棒桿菌菌株DM1698(見實施例18)。如實施例14.3所述針對谷氨酸棒桿菌DM1698染色體中的二次重組事件進行選擇。依賴于二次重組事件的位置，在質粒切除后，攜帶90個堿基對缺失的zwf等位基因出現(xiàn)在染色體zwf基因座，或者保留宿主原始的zwf基因座。
對大約40-50個菌落測試“在存在蔗糖時生長”和“在存在卡那霉素時不生長”的表型。在示出“在存在蔗糖時生長”和“在存在卡那霉素時不生長”的表型的30個菌落中，對跨越zwf缺失的zwf基因的一個區(qū)域通過聚合酶鏈反應擴增，使用Taq DNA聚合酶(Qiagen，Hilden，Germany)通過Innis等所述標準PCR方法(PCRprotocols.A guide to methods and applications，1990，Academic Press)進行，以論證染色體中存在zwf等位基因中的缺失。
使用如下所述寡核苷酸(由MWG Biotech，Ebersberg合成)進行PCRzwfi1(SEQ ID NO48)5`-GGC GTT GAC TTG GCA GAT GT-3`zwfi2(SEQ ID NO49)5`-GCA GAC CGC TGT GAA GGA AT-3`
這導致攜帶90bp缺失、581bp大小的DNA片段形成，或者攜帶相應的zwf野生型序列、671bp大小的DNA片段形成。
擴增產(chǎn)物隨后在0.8％瓊脂糖凝膠中檢測。
分離含有zwf缺失等位基因的谷氨酸棒桿菌菌株，并將其稱作DM1698deltazwf90bp(A243T)。
將實施例19.2的質粒pK18mobsacB_zwfdelta90bp用于將90個堿基對缺失整合進菌株DM1698的zwf(A243T)等位基因。該質粒中含有的zwf缺失片段的核苷酸序列從其核苷酸序列(SEQ ID NO47)的第711-1554位具有野生型基因編碼序列(SEQ ID NO9)的第91-934位核苷酸。它們編碼zwf野生型蛋白質(SEQ ID NO10)的第31-311位氨基酸，包括在氨基酸序列第243位的野生型序列。接合的結果可能是菌株DM1698的zwf(A243T)突變在接合中由取代載體pK18mobsacB_zwfdelta90bp的zwf野生型等位基因取代。
為了核實突變zwf(A243T)仍存在于菌株DM1698deltazwf90bp(A243T)的染色體中，借助于LightCycler(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany)檢測突變。
LightCycler組合了熱循環(huán)儀和熒光檢測設備。
通過Tauch等所述方法(1995，Plasmid 33168-179)從菌株DM1698deltazwf90bp(A243T)中分離染色體DNA。在第一階段，借助于PCR反應(Innis et al.，PCR protocols.A guide to methods andapplications，1990，Academic Press)擴增DM 1698deltazwf90bp(A243T)染色體的大約0.3kb的DNA片段，其含有zwf(A243T)突變。PCR反應使用如下寡核苷酸(由MWG Biotech，Ebersberg合成)進行LC-zwfl(SEQ ID NO50)5′-tccgcatcgaccactatttg-3′LC-zwf2(SEQ ID NO51)
5′-cgctggcacgaaagaaattg-3′在第二階段，使用兩種不同大小的、用不同熒光標記物標記的寡核苷酸(LightCycler(LC)-Red640和熒光素)。在序列內(nèi)發(fā)生雜交，突變zwf(A243T)位于其中。借助于“熒光共振能量轉移(FluorescenceResonance Energy Transfer)”方法(FRED)，可以檢測突變的存在。用于雜交的如下寡核苷酸由TIB MOLBIOL(Berlin，Germany)合成zwf243-C(SEQ ID No52)5`-LC-Red640-tatcttcagtcatggtgatc-(P)3`zwf243-A(SEQ ID No53)5`-gtcgtagtaaccagcacgtccacccaagcc-熒光素3`這樣證實了菌株DM1698deltazwf90bp(A243T)仍含有突變zwf(A243T)。其攜帶zwf等位基因zwfdelta90bp(A243T)，示于SEQID NO54；編碼的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的相應氨基酸序列示于SEQID NO55。
20.2菌株DM1698deltazwf90bp(A243T)的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的確定為了確定菌株DM1698deltazwf90bp(A243T)中含有的zwfdelta90bp(A243T)等位基因編碼的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性，將該菌株在LB培養(yǎng)基(Merck KG，Darmstadt，Germany)中保溫24小時。培養(yǎng)是以25ml體積在具有檔板的250ml錐形瓶中在33℃以200rpm在搖床上進行。為了進行比較，將具有zwf(A243T)等位基因的親代菌株DM1698平行保溫。生物量的制備如實施例15.1所述進行。
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的測定在含有100mM Tris-HCl(pH 7.5)+1mM DTT、15mM MgCl2、1.5mM NADP+和10mM葡萄糖-6-磷酸的分析系統(tǒng)中進行。酶活性如前述相同方式計算。
實驗結果示于表10。
表10
實施例21兩個質粒編碼zwf等位基因的表達的確定在這個實施例中，構建表達兩個不同zwf等位基因的兩個質粒，并測試在實施例20.1中獲得的菌株DM1698zwfdelta90bp(A243T)失活的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶活性的恢復。測試的zwf等位基因是zwfL和zwfS，其中L是長的縮寫，S是短的縮寫。等位基因zwfL攜帶突變zwf(A243T)，包括zwf基因編碼序列的5’區(qū)域的90個堿基對(如SEQ ID NO9所示野生型基因及SEQ ID NO21所示zwf(A243T)等位基因所示)。等位基因zwfS也攜帶突變zwf(A243T)，但是缺失zwf基因編碼序列的5’區(qū)域的90個堿基對(如SEQ ID NO7所示野生型基因所示)。
21.1等位基因zwfS和zwfL的擴增zwf等位基因zwfS和zwfL使用聚合酶鏈反應(PCR)及如下述合成的寡核苷酸進行擴增。通過Tauch等所述方法(1995，Plasmid 33168-179)從菌株DM658中分離攜帶等位基因zwf(A243T)的染色體DNA?；趶膶嵤├?已知的谷氨酸棒桿菌zwf基因的序列，選擇引物以便擴增片段含有zwf等位基因的編碼區(qū)及其上游區(qū)域的25個堿基對，而非可能的啟動子區(qū)域。另外，插入使得可以克隆進靶載體中的適當?shù)南拗泼肝稽c。PCR引物和插入的限制酶SalI切割位點(下劃線序列)的序列如下所述zwfRBS1(SEQ ID NO56)5′-ATGTCGACAAG AAA GGA TCG TGA CAC TAC-3′zwfRBS2(SEQ ID NO57)5′-ATGTCGACCCC CCG CAT CGC TGG CC-3′zwfRBSE(SEQ ID NO58)5′-ATGTCGACATC GCT TTC GGA GTC AGT GA-3′示出的引物由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成，通過Innis等所述標準PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications，1990，Academic Press)使用NewEnglandBiolabs(Germany，Product Description Vent DNA Polymerase)的Vent DNA聚合酶進行PCR反應。
借助于聚合酶鏈反應，引物zwfRBS1和zwfRBSE擴增出稱作zwfL(SEQ ID NO60)的1732bp DNA片段(SEQ ID NO59)，其包括表達由514個氨基酸組成的Zwf蛋白質的編碼序列。引物zwfRBS2和zwfRBSE擴增稱作zwfS(SEQ ID NO62)的1642bp DNA片段(SEQ IDNO61)，其包括表達由484個氨基酸組成的Zwf蛋白質的編碼序列。擴增物通過隨后在0.8％瓊脂糖凝膠中的瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用High Pure PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)從瓊脂糖凝膠中分離。
將獲得的PCR產(chǎn)物克隆進載體pCRBluntII TOPO(Zero BluntTOPO PCR Cloning Kit，Invitrogen，Germany)中，然后將大腸桿菌菌株TOP 10(Grant et al.，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA，87(1990)4645-4649)根據(jù)廠商指導用該連接批次物轉化。將轉化批次物鋪板于補加了50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2naEd.，Cold Spring Harbor，New York，1989)上，選擇攜帶質粒的細胞。
借助于High Pure質粒分離試劑盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)從轉化體中分離質粒DNA，通過用限制酶SalI限制及隨后瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)進行檢測。獲得的質粒稱作pCRBluntII_zwfL(示于圖11)和pCRBluntII_zwfS(示于圖12)。
21.2等位基因zwfS和zwfL在載體pZ8-1中的克隆應用大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表達載體pZ8-1(EP 0 375 889)作為在谷氨酸棒桿菌以及在大腸桿菌中表達的基本載體。這個質粒的DNA用限制酶SalI(Invitrogen，Germany)完全切割，然后用蝦堿性磷酸酶(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)去磷酸化。
zwfL等位基因通過用限制酶SalI對實施例21.1中獲得的載體pCRBluntII_zwfL進行完全切割而分離。zwfS等位基因通過用限制酶SalI對實施例21.2中獲得的載體pCRBluntII_zwfS進行完全切割而分離。在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離后，借助于High Pure PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)從瓊脂糖凝膠中分離大小大約1.7kb的zwfL片段和大小大約1.6kb的zwfS片段。
將分離自瓊脂糖凝膠的zwfL片段和zwfS片段與如上述制備的載體pZ8-1混合，將批次物用T4DNA連接酶(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，Germany)處理。
將連接批次物轉化進大腸桿菌菌株DH5α(Hanahan，InDNAcloning.A Practical Approach.Vol.I.IRL-Press，Oxford，WashingtonDC，USA)中。將轉化批次物鋪板于補加了50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上選擇攜帶質粒的細胞。在37℃保溫過夜后，選擇重組的各個克隆。借助于High Pure質粒分離試劑盒t(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)根據(jù)廠商指導從轉化體中分離質粒DNA，通過用限制酶SalI限制及隨后的瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)進行檢測。另外，使用如下引物通過GATC Biotech AG(Konstanz，Germany)測序核實克隆的zwf等位基因GATC-R1neu-29234(SEQ ID NO63)5`-GGAACACAGAAGATTCTG-3`GATC-F1_neu-29233(SEQ ID NO64)5`-CCGTGTTACTGAGATTGC-3`GATC-zwf_int-27334(SEQ ID NO65)5`-TGGCTGAATCCACCGAAGAA-3`所得質粒稱作pZ8-1_zwfL(示于圖13)和pZ8-1_zwfS(示于圖14)。
21.3制備菌株DM1698/pZ8-1、DM1698zwfdelta90bp(A243T)/pZ8-1、DM1698zwfdelta90bp(A243T)/pZ8-1_zwfL和DM1698zwfdelta90bp(A243T)/pZ8-1_zwfS將沒有插入片段的載體pZ8-1通過Tauch等所述電穿孔方法(1994，F(xiàn)EMS Microbiological Letters，123343-347)電穿孔進谷氨酸棒桿菌DM 1698中。
將實施例21.2所述的載體pZ8-1_zwfL和pZ8-1_zwfS及沒有插入片段的載體pZ8-1通過Tauch等所述的電穿孔方法(FEMSMicrobiological Letters，123(1994)343-347)電穿孔進實施例20所述的谷氨酸棒桿菌DM1698zwfdelta90bp(A243T)中。
將電穿孔批次物鋪板在補加了15mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)上選擇攜帶質粒的細胞。在所有情況中，通過常規(guī)方法(Peters-Wendisch et al.，1998，Microbiology 144，915-927)從轉化體中分離質粒DNA，通過用限制酶SalI限制和隨后的瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)檢測。
菌株稱作DM1698/pZ8-1、DM1698zwfdelta90bp(A243T)/pZ8-1、DM1698zwfdelta90bp(A243T)/pZ8-1_zwfL和DM1698zwfdelta90bp(A243T)/pZ8-1_zwfS。
21.4獲得的菌株的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的確定為了確定菌株DM1698deltazwf90bp(A243T)/pZ8-1_zwfL和DM1698deltazwf90bp(A243T)/pZ8-1_zwfS中含有的不同zwf等位基因編碼的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性，將菌株在補加了25mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基(Merck KG，Darmstadt，Germany)中保溫24小時。培養(yǎng)是以25ml體積在具有檔板的250ml錐形瓶中在33C以200rpm在搖床上進行。
為了進行對比，將親代菌株DM1698和如實施例20所述在染色體中具有兩個不同zwf等位基因的菌株DM1698zwfdelta90bpA243T及具有載體pZ8-1的菌株DM1698/pZ8-1和DM1698zwfdelta90bp(A243T)/pZ8-1平行保溫。由于DM1698和DM1698zwfdelta90bpA243T不含有任何質粒，因此它們用未加入卡那霉素的培養(yǎng)基保溫。
生物量的制備如實施例15.1所述進行。
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的測定在含有100mM Tris-HCl(pH 7.5)+1mM DTT、15mM MgCl2、1.5mM NADP+和10mM葡萄糖-6-磷酸的分析系統(tǒng)中進行。酶活性以如前述相同方式計算。
這個實驗的結果示于表11。
表11
原始保藏的接受按照細則7.1由頁底所示國際保藏單位公布
1應用細則6.4(d)，所述日期是國際保藏機構獲得的日期。
表格DSMZ-BP/4(單頁)0196
存活證明按照細則10.2由頁底所示國際保藏單位公布
1表示原始保藏、進行新的保藏或轉移日期、最近相關日期(新保藏日期或轉移日期)2根據(jù)細則12.2(a)(i)利(ii)，指最近存活日期3符合的位置用叉號表示4信息已被要求并且測試結果為陰性表格DSMZ-BP/4(單頁)0196
原始保藏的接受按照細則7.1由頁底所示國際保藏單位公布
1應用細則6.4(d)，所述日期是國際保藏機構獲得的日期。
表格DSMZ-BP/4(單頁)12/2001
存活證明按照細則10.2由頁底所示國際保藏單位公布
1表示原始保藏、進行新的保藏或轉移日期、最近相關日期(新保藏日期或轉移日期)2根據(jù)細則12.2(a)(i)和(ii)，指最近存活日期3符合的位置用叉號表示4信息已被要求并且測試結果為陰性表格DSMZ-BP/4(單頁)12/2001
原始保藏的接受按照細則7.1由頁底所示國際保藏單位公布
1應用細則6.4(d)，所述日期是國際保藏機構獲得的日期。
表格DSMZ-BP/4(單頁)12/2001
存活證明按照細則10.2由頁底所示國際保藏單位公布
1表示原始保藏、進行新的保藏或轉移日期、最近相關日期(新保藏日期或轉移日期)2根據(jù)細則12.2(a)(i)利(ii)，指最近存活日期3符合的位置用叉號表示4信息已被要求并且測試結果為陰性表格DSMZ-BP/4(單頁)12/2001
原始保藏的接受按照細則7.1由頁底所示國際保藏單位公布
1應用細則6.4(d)，所述日期是國際保藏機構獲得的日期。
表格DSMZ-BP/4(單頁)12/2001
存活證明按照細則10.2由頁底所示國際保藏單位公布
1表示原始保藏、進行新的保藏或轉移日期、最近相關日期(新保藏日期或轉移日期)2根據(jù)細則12.2(a)(i)利(ii)，指最近存活日期3符合的位置用義號表示4信息已被要求并且測試結果為陰性表格DSMZ-BP/4(單頁)12/2001
序列表<110>德古薩股份公司<120>用擴增zwf基因制備L-氨基酸的方法<130>990239BT<160>65<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2811<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>CDS<222>(373)..(2022)<223>pgi<400>1aaaacccgag gggcgaaaat tccaccctaa cttttttggg atcccctttt tccggggaat 60taattggttt gggtttcaat gggaaaacgg gaaacaatgg gccaaaggtt caaaaacccc120aaaagggggc cgggttcaaa ttcccaaaaa aaatggcaaa aaaggggggg ccaaaaccaa180gttggccccc aaaccaccgg ggcaacggcc cacccacaaa ggggttgggt taaaggaagg240acgcccaaag taagcccgga atggcccacg ttcgaaaaag caggccccaa ttaaacgcac300cttaaatttg tcgtgtttcc cactttgaac actcttcgat gcgcttggcc acaaaagcaa360gctaacctga ag atg tta ttt aac gac aat aaa gga gtt ttc atg gcg gac411Met Leu Phe Asn Asp Asn Lys Gly Val Phe Met Ala Asp
1 5 10att tcg acc acc cag gtt tgg caa gac ctg acc gat cat tac tca aac459Ile Ser Thr Thr Gln Val Trp Gln Asp Leu Thr Asp His Tyr Ser Asn15 20 25ttc cag gca acc act ctg cgt gaa ctt ttc aag gaa gaa aac cgc gcc507Phe Gln Ala Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu Asn Arg Ala30 35 40 45gag aag tac acc ttc tcc gcg gct ggc ctc cac gtc gac ctg tcg aag555Glu Lys Tyr Thr Phe Ser Ala Ala Gly Leu His Val Asp Leu Ser Lys50 55 60aat ctg ctt gac gac gcc acc ctc acc aag ctc ctt gca ctg acc gaa603Asn Leu Leu Asp Asp Ala Thr Leu Thr Lys Leu Leu Ala Leu Thr Glu65 70 75gaa tct ggc ctt cgc gaa cgc att gac gcg atg ttt gcc ggt gaa cac651Glu Ser Gly Leu Arg Glu Arg Ile Asp Ala Met Phe Ala Gly Glu His80 85 90ctc aac aac acc gaa gac cgc gct gtc ctc cac acc gcg ctg cgc ctt699Leu Asn Asn Thr Glu Asp Arg Ala Val Leu His Thr Ala Leu Arg Leu95 100 105cct gcc gaa gct gat ctg tca gta gat ggc caa gat gtt gct gct gat747Pro Ala Glu Ala Asp Leu Ser Val Asp Gly Gln Asp Val Ala Ala Asp110 115 120 125gtc cac gaa gtt ttg gga cgc atg cgt gac ttc gct act gcg ctg cgc795Val His Glu Val Leu Gly Arg Met Arg Asp Phe Ala Thr Ala Leu Arg130 135 140tca ggc aac tgg ttg gga cac acc ggc cac acg atc aag aag atc gtc843Ser Gly Asn Trp Leu Gly His Thr Gly His Thr Ile Lys Lys Ile Val145 150 155aac att ggt atc ggt ggc tct gac ctc gga cca gcc atg gct acg aag891Asn Ile Gly Ile Gly Gly Ser Asp Leu Gly Pro Ala Met Ala Thr Lys160 165 170gct ctg cgt gca tac gcg acc gct ggt atc tca gca gaa ttc gtc tcc939Ala Leu Arg Ala Tyr Ala Thr Ala Gly Ile Ser Ala Glu Phe Val Ser175 180 185aac gtc gac cca gca gac ctc gtt tct gtg ttg gaa gac ctc gat gca987Asn Val Asp Pro Ala Asp Leu Val Ser Val Leu Glu Asp Leu Asp Ala190 195 200 205gaa tcc aca ttg ttc gtg atc gct tcg aaa act ttc acc acc cag gag 1035Glu Ser Thr Leu Phe Val Ile Ala Ser Lys Thr Phe Thr Thr Gln Glu210 215 220acg ctg tcc aac gct cgt gca gct cgt gct tgg ctg gta gag aag ctc 1083Thr Leu Ser Asn Ala Arg Ala Ala Arg Ala Trp Leu Val Glu Lys Leu225 230 235ggt gaa gag gct gtc gcg aag cac ttc gtc gca gtg tcc acc aat gct 1131Gly Glu Glu Ala Val Ala Lys His Phe Val Ala Val Ser Thr Asn Ala
240 245 250gaa aag gtc gca gag ttc ggt atc gac acg gac aac atg ttc ggc ttc1179Glu Lys Val Ala Glu Phe Gly Ile Asp Thr Asp Asn Met Phe Gly Phe255 260 265tgg gac tgg gtc gga ggt cgt tac tcc gtg gac tcc gca gtt ggt ctt1227Trp Asp Trp Val Gly Gly Arg Tyr Ser Val Asp Ser Ala Val Gly Leu270 275 280 285tcc ctc atg gca gtg atc ggc cct cgc gac ttc atg cgt ttc ctc ggt1275Ser Leu Met Ala Val Ile Gly Pro Arg Asp Phe Met Arg Phe Leu Gly290 295 300gga ttc cac gcg atg gat gaa cac ttc cgc acc acc aag ttc gaa gag1323Gly Phe His Ala Met Asp Glu His Phe Arg Thr Thr Lys Phe Glu Glu305 310 315aac gtt cca atc ttg atg gct ctg ctc ggt gtc tgg tac tcc gat ttc1371Asn Val Pro Ile Leu Met Ala Leu Leu Gly Val Trp Tyr Ser Asp Phe320 325 330tat ggt gca gaa acc cac gct gtc cta cct tat tcc gag gat ctc agc1419Tyr Gly Ala Glu Thr His Ala Val Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Leu Ser335 340 345cgt ttt gct gct tac ctc cag cag ctg acc atg gag acc aat ggc aag1467Arg Phe Ala Ala Tyr Leu Gln Gln Leu Thr Met Glu Thr Asn Gly Lys350 355 360 365tca gtc cac cgc gac ggc tcc cct gtt tcc act ggc act ggc gaa att1515Ser Val His Arg Asp Gly Ser Pro Val Ser Thr Gly Thr Gly Glu Ile370 375 380tac tgg ggt gag cct ggc aca aat ggc cag cac gct ttc ttc cag ctg1563Tyr Trp Gly Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gln His Ala Phe Phe Gln Leu385 390 395atc cac cag ggc act cgc ctt gtt cca gct gat ttc att ggt ttc gct1611Ile His Gln Gly Thr Arg Leu Val Pro Ala Asp Phe Ile Gly Phe Ala400 405 410cgt cca aag cag gat ctt cct gcc ggt gag cgc acc atg cat gac ctt1659Arg Pro Lys Gln Asp Leu Pro Ala Gly Glu Arg Thr Met His Asp Leu415 420 425ttg atg agc aac ttc ttc gca cag acc aag gtt ttg gct ttc ggt aag1707Leu Met Ser Asn Phe Phe Ala Gln Thr Lys Val Leu Ala Phe Gly Lys430 435 440 445aac gct gaa gag atc gct gcg gaa ggt gtc gca cct gag ctg gtc aac1155Asn Ala Glu Glu Ile Ala Ala Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Val Asn450 455 460cac aag gtc gtg cca ggt aat cgc cca acc acc acc att ttg gcg gag1803His Lys Val Val Pro Gly Asn Arg Pro Thr Thr Thr Ile Leu Ala Glu465 470 475gaa ctt acc cct tct att ctc ggt gcg ttg atc gct ttg tac gaa cac1851Glu Leu Thr Pro Ser Ile Leu Gly Ala Leu Ile Ala Leu Tyr Glu His
480 485 490acc gtg atg gtt cag ggc gtg att tgg gac atc aac tcc ttc gac caa 1899Thr Val Met Val Gln Gly Val Ile Trp Asp Ile Asn Ser Phe Asp Gln495 500 505tgg ggt gtt gaa ctg ggc aaa cag cag gca aat gac ctc gct ccg gct 1947Trp Gly Val Glu Leu Gly Lys Gln Gln Ala Asn Asp Leu Ala Pro Ala510 515 520 525gtc tct ggt gaa gag gat gtt gac tcg gga gat tct tcc act gat tca 1995Val Ser Gly Glu Glu Asp Val Asp Ser Gly Asp Ser Ser Thr Asp Ser530 535 540ctg att aag tgg tac cgc gca aat agg tagtcgcttg cttatagggt2042Leu Ile Lys Trp Tyr Arg Ala Asn Arg545 550caggggcgtg aagaatcctc gcctcatagc actggccgct atcatcctga cctcgttcaa2102tctgcgaaca gctattactg ctttagctcc gctggtttct gagattcggg atgatttagg2162ggttagtgct tctcttattg gtgtgttggg catgatcccg actgctatgt tcgcggttgc2222tgcgtttgcg cttccgtcgt tgaagaggaa gttcactact tcccaactgt tgatgtttgc2282catgctgttg actgctgccg gtcagattat tcgtgtcgct ggacctgctt cgctgttgat2342ggtcggtact gtgttcgcga tgtttgcgat cggagttacc aatgtgttgc ttccgattgc2402tgttagggag tattttccgc gtcacgtcgg tggaatgtcg acaacttatc tggtgtcgtt2462ccagattgtt caggcacttg ctccgacgct tgccgtgccg atttctcagt gggctacaca2522tgtggggttg accggttgga gggtgtcgct cggttcgtgg gcgctgctgg ggttggttgc2582ggcgatttcg tggattccgc tgttgagttt gcagggtgcc agggttgttg cggcgccgtc2642gaaggtttct cttcctgtgt ggaagtcttc ggttggtgtg gggctcgggt tgatgtttgg2702gtttacttcg tttgcgacgt atatcctcat gggttttatg ccgcagatgg taggtgatcc2762aaagaattca aaaagcttct cgagagtact tctagagcgg ccgcgggcc2811<210>2<211>550<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum<400>2Met Leu Phe Asn Asp Asn Lys Gly Val Phe Met Ala Asp Ile Ser Thr1 5 10 15
Thr Gln Val Trp Gln Asp Leu Thr Asp His Tyr Ser Asn Phe Gln Ala20 25 30Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu Asn Arg Ala Glu Lys Tyr35 40 45Thr Phe Ser Ala Ala Gly Leu His Val Asp Leu Ser Lys Asn Leu Leu50 55 60Asp Asp Ala Thr Leu Thr Lys Leu Leu Ala Leu Thr Glu Glu Ser Gly65 70 75 80Leu Arg Glu Arg Ile Asp Ala Met Phe Ala Gly Glu His Leu Asn Asn85 90 95Thr Glu Asp Arg Ala Val Leu His Thr Ala Leu Arg Leu Pro Ala Glu100 105 110Ala Asp Leu Ser Val Asp Gly Gln Asp Val Ala Ala Asp Val His Glu115 120 125Val Leu Gly Arg Met Arg Asp Phe Ala Thr Ala Leu Arg Ser Gly Asn130 135 140Trp Leu Gly His Thr Gly His Thr Ile Lys Lys Ile Val Asn Ile Gly145 150 155 160Ile Gly Gly Ser Asp Leu Gly Pro Ala Met Ala Thr Lys Ala Leu Arg165 170 175Ala Tyr Ala Thr Ala Gly Ile Ser Ala Glu Phe Val Ser Asn Val Asp180 185 190Pro Ala Asp Leu Val Ser Val Leu Glu Asp Leu Asp Ala Glu Ser Thr195 200 205Leu Phe Val Ile Ala Ser Lys Thr Phe Thr Thr Gln Glu Thr Leu Ser210 215 220Asn Ala Arg Ala Ala Arg Ala Trp Leu Val Glu Lys Leu Gly Glu Glu225 230 235 240Ala Val Ala Lys His Phe Val Ala Val Ser Thr Asn Ala Glu Lys Val245 250 255
Ala Glu Phe Gly Ile Asp Thr Asp Asn Met Phe Gly Phe Trp Asp Trp260 265 270Val Gly Gly Arg Tyr Ser Val Asp Ser Ala Val Gly Leu Ser Leu Met275 280 285Ala Val Ile Gly Pro Arg Asp Phe Met Arg Phe Leu Gly Gly Phe His290 295 300Ala Met Asp Glu His Phe Arg Thr Thr Lys Phe Glu Glu Asn Val Pro305 310 315 320Ile Leu Met Ala Leu Leu Gly Val Trp Tyr Ser Asp Phe Tyr Gly Ala325 330 335Glu Thr His Ala Val Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Leu Ser Arg Phe Ala340 345 350Ala Tyr Leu Gln Gln Leu Thr Met Glu Thr Asn Gly Lys Ser Val His355 360 365Arg Asp Gly Ser Pro Val Ser Thr Gly Thr Gly Glu Ile Tyr Trp Gly370 375 380Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gln His Ala Phe Phe Gln Leu Ile His Gln385 390 395 400Gly Thr Arg Leu Val Pro Ala Asp Phe Ile Gly Phe Ala Arg Pro Lys405 410 415Gln Asp Leu Pro Ala Gly Glu Arg Thr Met His Asp Leu Leu Met Ser420 425 430Asn Phe Phe Ala Gln Thr Lys Val Leu Ala Phe Gly Lys Asn Ala Glu435 440 445Glu Ile Ala Ala Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Val Asn His Lys Val450 455 460Val Pro Gly Asn Arg Pro Thr Thr Thr Ile Leu Ala Glu Glu Leu Thr465 470 475 480Pro Ser Ile Leu Gly Ala Leu Ile Ala Leu Tyr Glu His Thr Val Met485 490 495
Val Gln Gly Val Ile Trp Asp Ile Asn Ser Phe Asp Gln Trp Gly Val500 505 510Glu Leu Gly Lys Gln Gln Ala Asn Asp Leu Ala Pro Ala Val Ser Gly515 520 525Glu Glu Asp Val Asp Ser Gly Asp Ser Ser Thr Asp Ser Leu Ile Lys530 535 540Trp Tyr Arg Ala Asn Arg545 550<210>3<211>462<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<400>3atggagacca atggcaagtc agtccaccgc gacggctccc ctgtttccac tggcactggc 60gaaatttact ggggtgagcc tggcacaaat ggccagcacg ctttcttcca gctgatccac120cagggcactc gccttgttcc agctgatttc attggtttcg ctcgtccaaa gcaggatctt180cctgccggtg agcgcaccat gcatgacctt ttgatgagca acttcttcgc acagaccaag240gttttggctt tcggtaagaa cgctgaagag atcgctgcgg aaggtgtcgc acctgagctg300gtcaaccaca aggtcgtgcc aggtaatcgc ccaaccacca ccattttggc ggaggaactt360accccttcta ttctcggtgc gttgatcgct ttgtacgaac acaccgtgat ggttcagggc420gtgatttggg acatcaactc cttcgaccaa tggggcgtgg aa 462<210>4<211>2160<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>CDS
<222>(327)..(2063)<223>poxB<400>4ttagaggcga ttctgtgagg tcactttttg tggggtcggg gtctaaattt ggccagtttt 60cgaggcgacc agacaggcgt gcccacgatg tttaaatagg cgatcggtgg gcatctgtgt120ttggtttcga cgggctgaaa ccaaaccaga ctgcccagca acgacggaaa tcccaaaagt180gggcatccct gtttggtacc gagtacccac ccgggcctga aactccctgg caggcgggcg240aagcgtggca acaactggaa tttaagagca caattgaagt cgcaccaagt taggcaacac300aatagccata acgttgagga gttcag atg gca cac agc tac gca gaa caa tta 353Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu1 5att gac act ttg gaa gct caa ggt gtg aag cga att tat ggt ttg gtg 401Ile Asp Thr Leu Glu Ala Gln Gly Val Lys Arg Ile Tyr Gly Leu Val10 15 20 25ggt gac agc ctt aat ccg atc gtg gat gct gtc cgc caa tca gat att 449Gly Asp Ser Leu Asn Pro Ile Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp Ile30 35 40gag tgg gtg cac gtt cga aat gag gaa gcg gcg gcg ttt gca gcc ggt 497Glu Trp Val His Val Arg Asn Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly45 50 55gcg gaa tcg ttg atc act ggg gag ctg gca gta tgt gct gct tct tgt 545Ala Glu Ser Leu Ile Thr Gly Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys60 65 70ggt cct gga aac aca cac ctg att cag ggt ctt tat gat tcg cat cga 593Gly Pro Gly Asn Thr His Leu Ile Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg75 80 85aat ggt gcg aag gtg ttg gcc atc gct agc cat att ccg agt gcc cag 641Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala Ile Ala Ser His Ile Pro Ser Ala Gln90 95 100 105att ggt tcg acg ttc ttc cag gaa acg cat ccg gag att ttg ttt aag 689Ile Gly Ser Thr Phe Phe Gln Glu Thr His Pro Glu Ile Leu Phe Lys110 115 120gaa tgc tct ggt tac tgc gag atg gtg aat ggt ggt gag cag ggt gaa 737Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu125 130 135cgc att ttg cat cac gcg att cag tcc acc atg gcg ggt aaa ggt gtg 785Arg Ile Leu His His Ala Ile Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val140 145 150tcg gtg gta gtg att cct ggt gat atc gct aag gaa gac gca ggt gac 833Ser Val Val Val Ile Pro Gly Asp Ile Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp
155 160 165ggt act tat tcc aat tcc act att tct tct ggc act cct gtg gtg ttc 881Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr Ile Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe170 175 180 185ccg gat cct act gag gct gca gcg ctg gtg gag gcg att aac aac gct 929Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala Ala Leu Val Glu Ala Ile Asn Asn Ala190 195 200aag tct gtc act ttg ttc tgc ggt gcg ggc gtg aag aat gct cgc gcg 977Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala205 210 215cag gtg ttg gag ttg gcg gag aag att aaa tca ccg atc ggg cat gcg1025Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu Lys Ile Lys Ser Pro Ile Gly His Ala220 225 230ctg ggt ggt aag cag tac atc cag cat gag aat ccg ttt gag gtc ggc1073Leu Gly Gly Lys Gln Tyr Ile Gln His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly235 240 245atg tct ggc ctg ctt ggt tac ggc gcc tgc gtg gat gcg tcc aat gag1121Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu250 255 260 265gcg gat ctg ctg att cta ttg ggt acg gat ttc cct tat tct gat ttc1169Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe270 275 280ctt cct aaa gac aac gtt gcc cag gtg gat atc aac ggt gcg cac att1217Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala Gln Val Asp Ile Asn Gly Ala His Ile285 290 295ggt cga cgt acc acg gtg aag tat ccg gtg acc ggt gat gtt gct gca1265Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala300 305 310aca atc gaa aat att ttg cct cat gtg aag gaa aaa aca gat cgt tcc1313Thr Ile Glu Asn Ile Leu Pro His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser315 320 325ttc ctt gat cgg atg ctc aag gca cac gag cgt aag ttg agc tcg gtg1361Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val330 335 340 345gta gag acg tac aca cat aac gtc gag aag cat gtg cct att cac cct1409Val Glu Thr Tyr Thr His Asn Val Glu Lys His Val Pro Ile His Pro350 355 360gaa tac gtt gcc tct att ttg aac gag ctg gcg gat aag gat gcg gtg1457Glu Tyr Val Ala Ser Ile Leu Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val365 370 375ttt act gtg gat acc ggc atg tgc aat gtg tgg cat gcg agg tac atc1505Phe Thr Val Asp Thr Gly Met Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr Ile380 385 390gag aat ccg gag gga acg cgc gac ttt gtg ggt tca ttc cgc cac ggc1553Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly
395 400 405acg atg gct aat gcg ttg cct cat gcg att ggt gcg caa agt gtt gat1601Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro His Ala Ile Gly Ala Gln Ser Val Asp410 415 420 425cga aac cgc cag gtg atc gcg atg tgt ggc gat ggt ggt ttg ggc atg1649Arg Asn Arg Gln Val Ile Ala Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met430 435 440ctg ctg ggt gag ctt ctg acc gtt aag ctg cac caa ctt ccg ctg aag1697Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys445 450 455gct gtg gtg ttt aac aac agt tct ttg ggc atg gtg aag ttg gag atg1745Ala Val Val Phe Asn Asn Ser Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met460 465 470ctc gtg gag gga cag cca gaa ttt ggt act gac cat gag gaa gtg aat1793Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn475 480 485ttc gca gag att gcg gcg gct gcg ggt atc aaa tcg gta cgc atc acc1841Phe Ala Glu Ile Ala Ala Ala Ala Gly Ile Lys Ser Val Arg Ile Thr490 495 500 505gat ccg aag aaa gtt cgc gag cag cta gct gag gca ttg gca tat cct1889Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro510 515 520gga cct gta ctg atc gat atc gtc acg gat cct aat gcg ctg tcg atc1937Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser Ile525 530 535cca cca acc atc acg tgg gaa cag gtc atg gga ttc agc aag gcg gcc1985Pro Pro Thr Ile Thr Trp Glu Gln Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala540 545 550acc cga acc gtc ttt ggt gga gga gta gga gcg atg atc gat ctg gcc2033Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly Gly Val Gly Ala Met Ile Asp Leu Ala555 560 565cgt tcg aac ata agg aat att cct act cca tgatgattga tacacctgct 2083Arg Ser Asn Ile Arg Asn Ile Pro Thr Pro570 575gttctcattg accgcgagcg cttaactgcc aacatttcca ggatggcagc tcacgccggt 2143gcccatgaga ttgccct 2160<210>5<211>579<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum
<400>5Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Asp Thr Leu Glu Ala Gln1 5 10 15Gly Val Lys Arg Ile Tyr Gly Leu Val Gly Asp Ser Leu Asn Pro Ile20 25 30Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp Ile Glu Trp Val His Val Arg Asn35 40 45Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly Ala Glu Ser Leu Ile Thr Gly50 55 60Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys Gly Pro Gly Asn Thr His Leu65 70 75 80Ile Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala85 90 95Ile Ala Ser His Ile Pro Ser Ala Gln Ile Gly Ser Thr Phe Phe Gln100 105 110Glu Thr His Pro Glu Ile Leu Phe Lys Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu115 120 125Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu Arg Ile Leu His His Ala Ile130 135 140Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val Ser Val Val Val Ile Pro Gly145 150 155 160Asp Ile Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr165 170 175Ile Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala180 185 190Ala Leu Val Glu Ala Ile Asn Asn Ala Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys195 200 205Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu210 215 220Lys Ile Lys Ser Pro Ile Gly His Ala Leu Gly Gly Lys Gln Tyr Ile
225 230 235 240Gln His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr245 250 255Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu260 265 270Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala275 280 285Gln Val Asp Ile Asn Gly Ala His Ile Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys290 295 300Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala Thr Ile Glu Asn Ile Leu Pro305 310 315 320His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys325 330 335Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val Val Glu Thr Tyr Thr His Asn340 345 350Val Glu Lys His Val Pro Ile His Pro Glu Tyr Val Ala Ser Ile Leu355 360 365Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val Phe Thr Val Asp Thr Gly Met370 375 380Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr Ile Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg385 390 395 400Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro405 410 415His Ala Ile Gly Ala Gln Ser Val Asp Arg Asn Arg Gln Val Ile Ala420 425 430Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr435 440 445Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys Ala Val Val Phe Asn Asn Ser450 455 460
Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu465 470 475 480Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn Phe Ala Glu Ile Ala Ala Ala485 490 495Ala Gly Ile Lys Ser Val Arg Ile Thr Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu500 505 510Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile515 520 525Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser Ile Pro Pro Thr Ile Thr Trp Glu530 535 540Gln Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly545 550 555 560Gly Val Gly Ala Met Ile Asp Leu Ala Arg Ser Asn Ile Arg Asn Ile565 570 575Pro Thr Pro<210>6<211>875<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<400>6tgcgagatgg tgaatggtgg tgagcagggt gaacgcattt tgcatcacgc gattcagtcc 60accatggcgg gtaaaggtgt gtcggtggta gtgattcctg gtgatatcgc taaggaagac120gcaggtgacg gtacttattc caattccact atttcttctg gcactcctgt ggtgttcccg180gatcctactg aggctgcagc gctggtggag gcgattaaca acgctaagtc tgtcactttg240ttctgcggtg cgggcgtgaa gaatgctcgc gcgcaggtgt tggagttggc ggagaagatt300aaatcaccga tcgggcatgc gctgggtggt aagcagtaca tccagcatga gaatccgttt360gaggtcggca tgtctggcct gcttggttac ggcgcctgcg tggatgcgtc caatgaggcg420gatctgctga ttctattggg tacggatttc ccttattctg atttccttcc taaagacaac480gttgcccagg tggatatcaa cggtgcgcac attggtcgac gtaccacggt gaagtatccg540
gtgaccggtg atgttgctgc aacaatcgaa aatattttgc ctcatgtgaa ggaaaaaaca600gatcgttcct tccttgatcg gatgctcaag gcacacgagc gtaagttgag ctcggtggta660gagacgtaca cacataacgt cgagaagcat gtgcctattc accctgaata cgttgcctct720attttgaacg agctggcgga taaggatgcg gtgtttactg tggataccgg catgtgcaat780gtgtggcatg cgaggtacat cgagaatccg gagggaacgc gcgactttgt gggttcattc840cgccacggca cgatggctaa tgcgttgcct catgc 875<210>7<211>2260<212>DNA<213>Brevibacterium flavum MJ-233<220>
<221>CDS<222>(629)..(2080)<223>Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase(EC 1.1.1.49)；JP-A-09-22461<400>7gatccgatga ggctttggct ctgcgtggca aggcaggcgt tgccaacgct cagcgcgctt 60acgctgtgta caaggagctt ttcgacgccg ccgagctgcc tgtaaggcgc caacactcag120cgcccactgt gggcatccac cggcgtgaag aaccctgcgt acgctgcaac tctttacgtt180tccgagctgg ctggtccaaa caccgtcaac accatgccag aaggcaccat cgacgctgtt240ctggaactgg gcaacctgca cggtgacaac ctgtccaact ccgcggcaga agctgacgct300gtgttctccc agcttgaggc tctgggcgtt gacttggcag atgtcttcca ggtcctggag360accgaggccg tggacaagtt cgttgcttct tggagcgaac tgcttgagtc catggaagct420cgcctgaagt agaatcagca cgctgcatca gtaacggcga catgaaatcg aattagttcg480atcttatgtg gccgttacac atctttcatt aaagaaagga tcgtgacgct taccatcgtg540agcacaaaac acgaccccct ccagctggac aaacccactg cgcgacccgc aggataaacg600actcccccgc atcgctggcc cttccggc atg gtg atc ttc ggt gtc act ggc 652Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly1 5gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc att tat gat cta gca aac 700
Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala Asn10 15 20cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg gta ggt tac ggc cgc cgc 748Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg25 30 35 40gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac gta cgc gat gcc gca agt 796Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser45 50 55gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat gtt tgg gag cgc ctc gcc 844Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala60 65 70gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt gat gat gat gca gct ttc 892Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe75 80 85gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc gac aaa acc cgc ggc acc 940Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr90 95 100gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att cca cca gat tcc ttc gca 988Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Ala105 110 115 120gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc atg gct gaa tcc acc gaa1036Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu125 130 135gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag cct ttc ggc cac aac ctc1084Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys Pro Phe Gly His Asn Leu140 145 150gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc aac gca gtc ttc cca gaa1132Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val Asn Ala Val Phe Pro Glu155 160 165tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg ggc aag gaa aca gtt caa1180Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln170 175 180aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag ctg ttt gag cca ctg tgg1228Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp185 190 195 200aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc acc atg gct gaa gat att1276Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile Thr Met Ala Glu Asp Ile205 210 215ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac ggc atc ggc gca gcc cgc1324Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg220 225 230gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc ttg gct ctg gtt gcc atg1372Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met235 240 245gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag ctg cag gca gaa aag atc1420
Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile250 255 260aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac cca ttg gat aaa acc tcc1468Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr Ser265 270 275 280gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag ggc tct gag tta gtc aag1516Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val Lys285 290 295gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct gag tcc acc act gag act1564Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu Thr300 305 310ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct cgt cgc tgg gct ggt gtg1612Phe Ala Ala CVs Thr Leu Glu Ile Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly Val315 320 325ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt ggt cgc cgt gtt act gag1660Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr Glu330 335 340att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac cag cct ttc gac ggc gac1708Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His Gln Pro Phe Asp Gly Asp345 350 355 360atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc gtg att cgc gtg cag cct1756Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile Val Ile Arg Val Gln Pro365 370 375gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc aag gtt cca ggt tct gcc1804Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser Ala380 385 390atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc tcc tac tca gaa tcc ttc1852Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser Phe395 400 405act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc ctt atc ttg gat gcg ctg1900Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala Leu410 415 420ttg gat gaa tcc agc ctt ttc cct acc aac gag gaa gtg gaa ctg agc1948Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu Ser425 430 435 440tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca tgg gat gcc gat gga gaa1996Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly Glu445 450 455cca gag gat tac cca gca ggt acg tgg ggt cca aag agc gct gat gaa2044Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp Glu460 465 470atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc agg cca taatttaggg 2090Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg Arg Pro475 480gcaaaaaatg atctttgaac ttccggatac caccacccag caaatttcca agaccctaac 2150
tcgactgcgt gaatcgggca cccaggtcac caccggccga gtgctcaccc tcatcgtggt2210cactgactcc gaaagcgatg tcgctgcagt taccgagtcc accaatgaag 2260<210>8<211>484<212>PRT<213>Brevibacterium flavum MJ-233<400>8Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu1 5 10 15Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe20 25 30Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu35 40 45Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg50 55 60Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly65 70 75 80Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys85 90 95Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu100 105 110Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Ala Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg115 120 125Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile130 135 140Glu Lys Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln145 150 155 160Leu Val Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His
165 170 175Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala180 185 190Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val195 200 205Gln Ile Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr210 215 220Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile225 230 235 240Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro245 250 255Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro260 265 270Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly275 280 285Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe290 295 300Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile305 310 315 320Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys325 330 335Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala340 345 350Pro His Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn355 360 365Ala Ile Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe370 375 380Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met385 390 395 400Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr
405 410 415Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro420 425 430Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu435 440 445Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr450 455 460Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr465 470 475 480Trp Arg Arg Pro<210>9<211>2259<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>CDS<222>(538)..(2079)<223>Zwf-Protein<220>
<221>nucleotide guanine<222>(1264)..(1264)<223>corresponds to position 727 of the coding sequence<400>9gatccgatga ggctttggct ctgcgtggca aggcaggcgt tgccaacgct cagcgcgctt 60acgctgtgta caaggagctt ttcgacgccg ccgagctgcc tgtaaggcgc caacactcag120cgcccactgt gggcatccac cggcgtgaag aaccctgcgt acgctgcaac tctttacgtt180
tccgagctgg ctggtccaaa caccgtcaac accatgccag aaggcaccat cgacgctgtt240ctggaactgg gcaacctgca cggtgacaac ctgtccaact ccgcggcaga agctgacgct300gtgttctccc agcttgaggc tctgggcgtt gacttggcag atgtcttcca ggtcctggag360accgaggccg tggacaagtt cgttgcttct tggagcgaac tgcttgagtc catggaagct420cgcctgaagt agaatcagca cgctgcatca gtaacggcga catgaaatcg aattagttcg480atcttatgtg gccgttacac atctttcatt aaagaaagga tcgtgacgct taccatc 537gtg agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac 585Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15ccg cag gat aaa cga ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg 633Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc 681Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg 729Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac 777Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat 825Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt 873Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc 921Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att 969Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140cca cca gat tcc ttc gca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc 1017Pro Pro Asp Ser Phe Ala Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag 1065Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc 1113Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190
aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg1161Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag1209Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc1257Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240acc atg gct gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac1305Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc1353Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag1401Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac1449Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag1497Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct1545Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct1593Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt1641Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365ggt cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac1689Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc1737Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc1785Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc1833Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430
tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc1881Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445ctt atc ttg gat gcg ctg ttg gat gaa tcc agc ctt ttc cct acc aac1929Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca1977Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gca ggt acg tgg ggt2025Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc2073Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510agg cca taatttaggg gcaaaaaatg atctttgaac ttccggatac caccacccag 2129Arg Procaaatttcca agaccctaac tcgactgcgt gaatcgggca cccaggtcac caccggccga 2189gtgctcaccc tcatcgtggt cactgactcc gaaagcgatg tcgctgcagt taccgagtcc 2249accaatgaag 2259<210>10<211>514<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum<400>10Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Aspl 5 10 15Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60
Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140Pro Pro Asp Ser Phe Ala Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300
Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510Arg Pro<210>11<211>20
<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer zwf-forward<400>11tcgacgcggt tctggagcag 20<210>12<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer zwf reverse<400>12ctaaattatg gcctgcgcca g 21<210>13<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Universal forward Primer<400>13gtaatacgac tcactatagg gc 22<210>14<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence
<220>
<223>M13 reverse primer<400>14ytccacgccc caytgrtc 18<210>15<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Internal Primer 1<400>15ggaaacaggg gagccgtc 18<210>16<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Internal Primer 2<400>16tgctgagata ccagcggt 18<210>17<211>17<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>fwd.primer<400>17
atggarwcca aygghaa17<210>18<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>rev.primer<400>18ytccacgccc caytgrtc 18<210>19<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer poxBint1<220>
<221>misc_feature<223>Primer poxBint1<400>19tgcgagatgg tgaatggtgg 20<210>20<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer poxBint2
<400>20gcatgaggca acgcattagc 20<210>21<211>1857<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>CDS<222>(308)..(1849)<223>
<220>
<221>mutation<222>(1034)..(1034)<223>corresponds to position 727 of the coding sequence<220>
<221>nucleotide adenine<222>(1034)..(1034)<223>corresponds to position 727 of the coding sequence<400>21tcgacgcggt tctggagcag ggcaacctgc acggtgacac cctgtccaac tccgcggcag 60aagctgacgc tgtgttctcc cagcttgagg ctctgggcgt tgacttggca gatgtcttcc120aggtcctgga gaccgagggt gtggacaagt tcgttgcttc ttggagcgaa ctgcttgagt180ccatggaagc tcgcctgaag tagaatcagc acgctgcatc agtaacggcg acatgaaatc240gaattagttc gatcttatgt ggccgttaca catctttcat taaagaaagg atcgtgacac300taccatc gtg agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg 349Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu1 5 10
cgc gac ccg cag gat aaa cga ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc397Arg Asp Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly15 20 25 30atg gtg atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc445Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu35 40 45ccc gcc att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc493Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe50 55 60tcg ttg gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa541Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu65 70 75aaa tac gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt589Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg80 85 90gaa aat gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc637Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly95 100 105 110aac ttt gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag685Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys115 120 125cgc atc gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg733Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu130 135 140tcc att cca cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt781Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg145 150 155tcc ggc atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc829Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile160 165 170gag aag cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag877Glu Lvs Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln175 180 185 190ctg gtc aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac925Leu Val Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His195 200 205tat ttg ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct973Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala210 215 220aac cag ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc 1021Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val225 230 235cag atc acc atg act gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac 1069Gln Ile Thr Met Thr Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr240 245 250
tac gac ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc1117Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile255 260 265 270cag ctc ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca1165Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro275 280 285gcg cag ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg1213Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro290 295 300tgc tac cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt1261Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly305 310 315tgg cag ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc1309Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe320 325 330aac cct gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc1357Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile335 340 345 350acg tct cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag1405Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys355 360 365cgt ctt ggt cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca1453Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala370 375 380cca cac cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac1501Pro His Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn385 390 395gcc atc gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc1549Ala Ile Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe400 405 410ggt tcc aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg1597Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met415 420 425 430gac ttc tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac1645Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr435 440 445gag cgc ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct1693Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro450 455 460acc aac gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt1741Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu465 470 475gaa gca tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg1789Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr480 485 490
tgg ggt cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc1837Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr495 500 505 510tgg cgc agg cca taatttag 1857Trp Arg Arg Pro<210>22<211>514<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum<400>22Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160
Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240Thr Met Thr Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400
Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510Arg Pro<210>23<211>756<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(756)<223>Internal segment of the coding sequence of the zwf(A243T) allele<220>
<221>nucleotide adenine<222>(137)..(137)
<223>Corresponding to position 727 of the coding sequence of the zwf(A243T)allele<400>23agaatcttct gtgttccgca tcgaccacta tttgggcaag gaaacagttc aaaacatcct 60ggctctgcgt tttgctaacc agctgtttga gccactgtgg aactccaact acgttgacca120cgtccagatc accatgactg aagatattgg cttgggtgga cgtgctggtt actacgacgg180catcggcgca gcccgcgacg tcatccagaa ccacctgatc cagctcttgg ctctggttgc240catggaagaa ccaatttctt tcgtgccagc gcagctgcag gcagaaaaga tcaaggtgct300ctctgcgaca aagccgtgct acccattgga taaaacctcc gctcgtggtc agtacgctgc360cggttggcag ggctctgagt tagtcaaggg acttcgcgaa gaagatggct tcaaccctga420gtccaccact gagacttttg cggcttgtac cttagagatc acgtctcgtc gctgggctgg480tgtgccgttc tacctgcgca ccggtaagcg tcttggtcgc cgtgttactg agattgccgt540ggtgtttaaa gacgcaccac accagccttt cgacggcgac atgactgtat cccttggcca600aaacgccatc gtgattcgcg tgcagcctga tgaaggtgtg ctcatccgct tcggttccaa660ggttccaggt tctgccatgg aagtccgtga cgtcaacatg gacttctcct actcagaatc720cttcactgaa gaatcacctg aagcatacga gcgcct 756<210>24<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer zwf_XL-Al<400>24gatctagaag ctcgcctgaa gtagaatc28<210>25<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer zwf_XL-E1<400>25gatctagaga ttcacgcagt cgagttag28<210>26<211>1763<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>PCR product<222>(1)..(1763)<223>
<400>26gatctagaag ctcgcctgaa gtagaatcag cacgctgcat cagtaacggc gacatgaaat 60cgaattagtt cgatcttatg tggccgttac acatctttca ttaaagaaag gatcgtgaca120ctaccatcgt gagcacaaac acgaccccct ccagctggac aaacccactg cgcgacccgc180aggataaacg actcccccgc atcgctggcc cttccggcat ggtgatcttc ggtgtcactg240gcgacttggc tcgaaagaag ctgctccccg ccatttatga tctagcaaac cgcggattgc300tgcccccagg attctcgttg gtaggttacg gccgccgcga atggtccaaa gaagactttg360aaaaatacgt acgcgatgcc gcaagtgctg gtgctcgtac ggaattccgt gaaaatgttt420gggagcgcct cgccgagggt atggaatttg ttcgcggcaa ctttgatgat gatgcagctt480tcgacaacct cgctgcaaca ctcaagcgca tcgacaaaac ccgcggcacc gccggcaact540gggcttacta cctgtccatt ccaccagatt ccttcacagc ggtctgccac cagctggagc600gttccggcat ggctgaatcc accgaagaag catggcgccg cgtgatcatc gagaagcctt660tcggccacaa cctcgaatcc gcacacgagc tcaaccagct ggtcaacgca gtcttcccag720aatcttctgt gttccgcatc gaccactatt tgggcaagga aacagttcaa aacatcctgg780ctctgcgttt tgctaaccag ctgtttgagc cactgtggaa ctccaactac gttgaccacg840tccagatcac catggctgaa gatattgact tgggtggacg tgctggttac tacgacggca900
tcggcgcagc ccgcgacgtc atccagaacc acctgatcca gctcttggct ctggttgcca 960tggaagaacc aatttctttc gtgccagcgc agctgcaggc agaaaagatc aaggtgctct1020ctgcgacaaa gccgtgctac ccattggata aaacctccgc tcgtggtcag tacgctgccg1080gttggcaggg ctctgagtta gtcaagggac ttcgcgaaga agatggcttc aaccctgagt1140ccaccactga gacttttgcg gcttgtacct tagagatcac gtctcgtcgc tgggctggtg1200tgccgttcta cctgcgcacc ggtaagcgtc ttggtcgccg tgttactgag attgccgtgg1260tgtttaaaga cgcaccacac cagcctttcg acggcgacat gactgtatcc cttggccaaa1320acgccatcgt gattcgcgtg cagcctgatg aaggtgtgct catccgcttc ggttccaagg1380ttccaggttc tgccatggaa gtccgtgacg tcaacatgga cttctcctac tcagaatcct1440tcactgaaga atcacctgaa gcatacgagc gcctcatttt ggatgcgctg ttagatgaat1500ccagcctctt ccctaccaac gaggaagtgg aactgagctg gaagattctg gatccaattc1560ttgaagcatg ggatgccgat ggagaaccag aggattaccc agcgggtacg tggggtccaa1620agagcgctga tgaaatgctt tcccgcaacg gtcacacctg gcgcaggcca taatttaggg1680gcaaaaaatg atctttgaac ttccggatac caccacccag caaatttcca agaccctaac1740tcgactgcgt gaatctctag atc1763<210>27<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer zf_1<400>27ggcttactac ctgtccattc 20<210>28<211>1545<212>DNA<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Obtained by in-vitro mutagenesis<220>
<221>CDS<222>(1)..(1542)<223>zwf(R370M)allele<400>28gtg agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac 48Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15ccg cag gat aaa cga ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg 96Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc144Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg192Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac240Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat288Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt336Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc384Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att432Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140cca cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc480Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag528Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175
cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc 576Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg 624Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag 672Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc 720Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240acc atg gct gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac 768Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc 816Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag 864Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac 912Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag 960Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct1008Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct1056Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt1104Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365ggt atg cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac1152Gly Met Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc1200Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc1248Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415
aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc1296Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc1344Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac1392Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca1440Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt1488Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc1536Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510agg cca taa1545Arg Pro<210>29<211>514<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Obtained by in-Vitro mutagenesis<400>29Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60
Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300
Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365Gly Met Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510Arg Pro<210>30
<211>1545<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Obtained by in-vitro mutagenesis<220>
<221>CDS<222>(1)..(1542)<223>zwf(V372A)allele<400>30gtg agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac 48Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15ccg cag gat aaa cga ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg 96Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc144Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg192Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac240Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat288Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt336Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc384Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att432Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140cca cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc480
Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag 528Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc 576Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg 624Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag 672Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc 720Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240acc atg gct gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac 768Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc 816Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag 864Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac 912Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag 960Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct1008Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct1056Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt1104Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365ggt cgc cgt gca act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac1152Gly Arg Arg Ala Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc1200
Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc1248Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc1296Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc1344Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac1392Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca1440Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt1488Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc1536Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510agg cca taa1545Arg Pro<210>31<211>514<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Obtained by in-vitro mutagenesis<400>31Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30
Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gin Ile225 230 235 240Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270
Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365Gly Arg Arg Ala Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510
Arg Pro<210>32<211>1545<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Obtained by in-vitro mutagenesis<220>
<221>CDS<222>(1)..(1542)<223>zwf(M242L)allele<400>32gtg agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac 48Met Ser Thr Ash Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15ccg cag gat aaa cga ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg 96Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc144Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg192Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac240Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat288Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt336Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc384
Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att432Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140cca cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc480Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag528Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc576Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg624Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag672Gly LVs Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc720Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240acc ctt gct gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac768Thr Leu Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc816Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag864Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac912Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag960Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct 1008Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct 1056Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt 1104
Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365ggt cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac1152Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc1200Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc1248Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc1296Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc1344Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac1392Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca1440Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt1488Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc1536Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510agg cca taa1545Arg Pro<210>33<211>514<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Obtained by in-vitro mutagenesis<400>33
Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240
Thr Leu Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480
Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510Arg Pro<210>34<211>1545<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Obtained by in-vitro mutagenesis<220>
<221>CDS<222>(1)..(1542)<223>zwf(M242S)allele<400>34gtg agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac 48Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15ccg cag gat aaa cga ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg 96Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc144Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg192Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac240Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat288Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn
85 90 95gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt336Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc384Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att432Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140cca cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc480Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag528Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc576Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg624Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag672Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc720Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240acc tca gct gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac768Thr Ser Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc816Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag864Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac912Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag960Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct 1008Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro
325 330 335gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct1056Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt1104Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365ggt cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac1152Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc1200Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc1248Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc1296Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc1344Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac1392Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca1440Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt1488Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc1536Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510agg cca taa1545Arg Pro<210>35<211>514<212>PRT<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Obtained by in-vitro mutagenesis<400>35Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205
Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240Thr Ser Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445
Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510Arg Pro<210>36<211>1545<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Obtained by in-vitro mutagenesis<220>
<221>CDS<222>(1)..(1542)<223>zwf(D245S)allele<400>36gtg agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac 48Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15ccg cag gat aaa cga ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg 96Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc144Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg192Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu
50 55 60gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac240Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat288Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt336Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc384Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att432Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140cca cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc480Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag528Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc576Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg624Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag672Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc720Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240acc atg gct gaa tca att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac768Thr Met Ala Glu Ser Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc816Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag864Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac912
Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag 960Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct1008Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct1056Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt1104Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365ggt cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac1152Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc1200Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc1248Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc1296Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc1344Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac1392Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca1440Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt1488Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc1536Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510agg cca taa1545Arg Pro
<210>37<211>514<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Obtained by in-vitro mutagenesis<400>37Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175
Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240Thr Met Ala Glu Ser Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser
405 410 415Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510Arg Pro<210>38<211>1763<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>PCR-Product<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1763)<223>PCR-product<400>38gatctagaag ctcgcctgaa gtagaatcag cacgctgcat cagtaacggc gacatgaaat 60cgaattagtt cgatcttatg tggccgttac acatctttca ttaaagaaag gatcgtgaca120
ctaccatcgt gagcacaaac acgaccccct ccagctggac aaacccactg cgcgacccgc180aggataaacg actcccccgc atcgctggcc cttccggcat ggtgatcttc ggtgtcactg240gcgacttggc tcgaaagaag ctgctccccg ccatttatga tctagcaaac cgcggattgc300tgcccccagg attctcgttg gtaggttacg gccgccgcga atggtccaaa gaagactttg360aaaaatacgt acgcgatgcc gcaagtgctg gtgctcgtac ggaattccgt gaaaatgttt420gggagcgcct cgccgagggt atggaatttg ttcgcggcaa ctttgatgat gatgcagctt480tcgacaacct cgctgcaaca ctcaagcgca tcgacaaaac ccgcggcacc gccggcaact540gggcttacta cctgtccatt ccaccagatt ccttcacagc ggtctgccac cagctggagc600gttccggcat ggctgaatcc accgaagaag catggcgccg cgtgatcatc gagaagcctt660tcggccacaa cctcgaatcc gcacacgagc tcaaccagct ggtcaacgca gtcttcccag720aatcttctgt gttccgcatc gaccactatt tgggcaagga aacagttcaa aacatcctgg780ctctgcgttt tgctaaccag ctgtttgagc cactgtggaa ctccaactac gttgaccacg840tccagatcac catggctgaa gatattggct tgggtggacg tgctggttac tacgacggca900tcggcgcagc ccgcgacgtc atccagaacc acctgatcca gctcttggct ctggttgcca960tggaagaacc aatttctttc gtgccagcgc agctgcaggc agaaaagatc aaggtgctct 1020ctgcgacaaa gccgtgctac ccattggata aaacctccgc tcgtggtcag tacgctgccg 1080gttggcaggg ctctgagtta gtcaagggac ttcgcgaaga agatggcttc aaccctgagt 1140ccaccactga gacttttgcg gcttgtacct tagagatcac gtctcgtcgc tgggctggtg 1200tgccgttcta cctgcgcacc ggtaagcgtc ttggtcgccg tgttactgag attgccgtgg 1260tgtttaaaga cgcaccacac cagcctttcg acggcgacat gactgtatcc cttggccaaa 1320acgccatcgt gattcgcgtg cagcctgatg aaggtgtgct catccgcttc ggttccaagg 1380ttccaggttc tgccatggaa gtccgtgacg tcaacatgga cttctcctac tcagaatcct 1440tcactgaaga atcacctgaa gcatacgagc gcctcatttt ggatgcgctg ttagatgaat 1500ccagcctctt ccctaccaac gaggaagtgg aactgagctg gaagattctg gatccaattc 1560ttgaagcatg ggatgccgat ggagaaccag aggattaccc agcgggtacg tggggtccaa 1620agagcgctga tgaaatgctt tcccgcaacg gtcacacctg gcgcaggcca taatttaggg 1680gcaaaaaatg atctttgaac ttccggatac caccacccag caaatttcca agaccctaac 1740tcgactgcgt gaatctctag atc 1763<210>39<211>1763
<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>PCR-Product<220>
<221>mutation<222>(861)..(861)<223>nucleotide thymine，corresponding to position 733 of the codingsequence of the zwf(D245S)allele<220>
<221>mutation<222>(862)..(862)<223>nucleotide cytosine，corresponding to position 734 of the codingsequence of the zwf(D245S)-Allele<220>
<221>mutation<222>(863)..(863)<223>nucleotide adenine，corresponiding to position 735 of the codingsequence of the zwf(D245S)-Allele<400>39gatctagaag ctcgcctgaa gtagaatcag cacgctgcat cagtaacggc gacatgaaat 60cgaattagtt cgatcttatg tggccgttac acatctttca ttaaagaaag gatcgtgaca120ctaccatcgt gagcacaaac acgaccccct ccagctggac aaacccactg cgcgacccgc180aggataaacg actcccccgc atcgctggcc cttccggcat ggtgatcttc ggtgtcactg240gcgacttggc tcgaaagaag ctgctccccg ccatttatga tctagcaaac cgcggattgc300tgcccccagg attctcgttg gtaggttacg gccgccgcga atggtccaaa gaagactttg360aaaaatacgt acgcgatgcc gcaagtgctg gtgctcgtac ggaattccgt gaaaatgttt420gggagcgcct cgccgagggt atggaatttg ttcgcggcaa ctttgatgat gatgcagctt480
tcgacaacct cgctgcaaca ctcaagcgca tcgacaaaac ccgcggcacc gccggcaact 540gggcttacta cctgtccatt ccaccagatt ccttcacagc ggtctgccac cagctggagc 600gttccggcat ggctgaatcc accgaagaag catggcgccg cgtgatcatc gagaagcctt 660tcggccacaa cctcgaatcc gcacacgagc tcaaccagct ggtcaacgca gtcttcccag 720aatcttctgt gttccgcatc gaccactatt tgggcaagga aacagttcaa aacatcctgg 780ctctgcgttt tgctaaccag ctgtttgagc cactgtggaa ctccaactac gttgaccacg 840tccagatcac catggctgaa tcaattggct tgggtggacg tgctggttac tacgacggca 900tcggcgcagc ccgcgacgtc atccagaacc acctgatcca gctcttggct ctggttgcca 960tggaagaacc aatttctttc gtgccagcgc agctgcaggc agaaaagatc aaggtgctct1020ctgcgacaaa gccgtgctac ccattggata aaacctccgc tcgtggtcag tacgctgccg1080gttggcaggg ctctgagtta gtcaagggac ttcgcgaaga agatggcttc aaccctgagt1140ccaccactga gacttttgcg gcttgtacct tagagatcac gtctcgtcgc tgggctggtg1200tgccgttcta cctgcgcacc ggtaagcgtc ttggtcgccg tgttactgag attgccgtgg1260tgtttaaaga cgcaccacac cagcctttcg acggcgacat gactgtatcc cttggccaaa1320acgccatcgt gattcgcgtg cagcctgatg aaggtgtgct catccgcttc ggttccaagg1380ttccaggttc tgccatggaa gtccgtgacg tcaacatgga cttctcctac tcagaatcct1440tcactgaaga atcacctgaa gcatacgagc gcctcatttt ggatgcgctg ttagatgaat1500ccagcctctt ccctaccaac gaggaagtgg aactgagctg gaagattctg gatccaattc1560ttgaagcatg ggatgccgat ggagaaccag aggattaccc agcgggtacg tggggtccaa1620agagcgctga tgaaatgctt tcccgcaacg gtcacacctg gcgcaggcca taatttaggg1680gcaaaaaatg atctttgaac ttccggatac caccacccag caaatttcca agaccctaac1740tcgactgcgt gaatctctag atc1763<210>40<211>36<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer DM_zwfD245Sa
<400>40agatcaccat ggctgaatca attggcttgg gtggac 36<210>41<211>36<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer DM_D245Sb<400>41gcacgtccac ccaagccaat tgattcagcc atggtg 36<210>42<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Primer zf_2<400>42ttctgtgttc cgcatcgacc 20<210>43<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer zwfA
<400>43attctagaca ccttgatctt ctccgttg28<210>44<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Primer zwfB<400>44gatggtagtg tcacgatcct 20<210>45<211>39<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer zwfC<400>45aggatcgtga cactaccatc atggtgatct tcggtgtca39<210>46<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer zwfD
<400>46attctagagc ggaggtttta tccaatgg28<210>47<211>1560<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>PCR-Productzwf deletion fragment<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(710)<223>upstream region of the zwf-gene<220>
<221>misc_feature<222>(711)..(1560)<223>Internal segment of the coding sequence of the zwf-gene(SEQ ID NO9)，starting from nucleotide 91 of the zwf gene.Nucleotide 711 is identically to nucleotide 1 of the coding sequence of the zwf-gene mentioned in JP-A-09-22461 as shown in SEQ ID NO7).
<400>47attctagaca ccttgatctt ctccgttgct cgctaccgcg aggtcatcgc tgcgttcatc 60gagggcatca agcaggctgc tgcaaacggc cacgacgtct ccaagatcca ctctgtggct120tccttcttcg tctcccgcgt cgacgttgag atcgacaagc gcctcgaggc aatcggatcc180gatgaggctt tggctctgcg cggcaaggca ggcgttgcca acgctcagcg cgcttacgct240gtgtacaagg agcttttcga cgccgccgag ctgcctgaag gtgccaacac tcagcgccca300ctgtgggcat ccaccggcgt gaagaaccct gcgtacgctg caactcttta cgtttccgag360ctggctggtc caaacaccgt caacaccatg ccagaaggca ccatcgacgc ggttctggag420cagggcaacc tgcacggtga caccctgtcc aactccgcgg cagaagctga cgctgtgttc480tcccagcttg aggctctggg cgttgacttg gcagatgtct tccaggtcct ggagaccgag540
ggtgtggaca agttcgttgc ttcttggagc gaactgcttg agtccatgga agctcgcctg 600aagtagaatc agcacgctgc atcagtaacg gcgacatgaa atcgaattag ttcgatctta 660tgtggccgtt acacatcttt cattaaagaa aggatcgtga cactaccatc atggtgatct 720tcggtgtcac tggcgacttg gctcgaaaga agctgctccc cgccatttat gatctagcaa 780accgcggatt gctgccccca ggattctcgt tggtaggtta cggccgccgc gaatggtcca 840aagaagactt tgaaaaatac gtacgcgatg ccgcaagtgc tggtgctcgt acggaattcc 900gtgaaaatgt ttgggagcgc ctcgccgagg gtatggaatt tgttcgcggc aactttgatg 960atgatgcagc tttcgacaac ctcgctgcaa cactcaagcg catcgacaaa acccgcggca1020ccgccggcaa ctgggcttac tacctgtcca ttccaccaga ttccttcaca gcggtctgcc1080accagctgga gcgttccggc atggctgaat ccaccgaaga agcatggcgc cgcgtgatca1140tcgagaagcc tttcggccac aacctcgaat ccgcacacga gctcaaccag ctggtcaacg1200cagtcttccc agaatcttct gtgttccgca tcgaccacta tttgggcaag gaaacagttc1260aaaacatcct ggctctgcgt tttgctaacc agctgtttga gccactgtgg aactccaact1320acgttgacca cgtccagatc accatggctg aagatattgg cttgggtgga cgtgctggtt1380actacgacgg catcggcgca gcccgcgacg tcatccagaa ccacctgatc cagctcttgg1440ctctggttgc catggaagaa ccaatttctt tcgtgccagc gcagctgcag gcagaaaaga1500tcaaggtgct ctctgcgaca aagccgtgct acccattgga taaaacctcc gctctagaat1560<210>48<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Primer zwfi1<400>48ggcgttgact tggcagatgt 20
<210>49<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Primer zwfi2<400>49gcagaccgct gtgaaggaat 20<210>50<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Primer LC-zwf1<400>50tccgcatcga ccactatttg 20<210>51<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Primer LC-zwf2<400>51cgctggcacg aaagaaattg 20<210>52<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Oligonucleotide zwf243-C<400>52tatcttcagt catggtgatc 20<210>53<211>30<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>Oligonucleotide zwf243-A<400>53gtcgtagtaa ccagcacgtc cacccaagcc 30
<210>54<211>1455<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>allele<222>(1)..(1455)<223>zwfdelta90bp(A243T)allele<220>
<221>CDS<222>(1)..(1452)<223>zwfdelta90bp(A243T)allele<400>54atg gtg atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc 48Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu1 5 10 15ccc gcc att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc 96Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe20 25 30tcg ttg gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa144Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu35 40 45aaa tac gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt192Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg50 55 60gaa aat gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc240Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly65 70 75 80aac ttt gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag288Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys85 90 95cgc atc gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg336Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu100 105 110tcc att cca cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt384
Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg115 120 125tcc ggc atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc 432Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile130 135 140gag aag cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag 480Glu Lys Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln145 150 155 160ctg gtc aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac 528Leu Val Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His165 170 175tat ttg ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct 576Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala180 185 190aac cag ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc 624Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val195 200 205cag atc acc atg act gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac 672Gln Ile Thr Met Thr Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr210 215 220tac gac ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc 720Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile225 230 235 240cag ctc ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca 768Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro245 250 255gcg cag ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg 816Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro260 265 270tgc tac cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt 864Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly275 280 285tgg cag ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc 912Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe290 295 300aac cct gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc 960Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile305 310 315 320acg tct cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag1008Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys325 330 335cgt ctt ggt cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca1056Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala340 345 350cca cac cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac1104
Pro His Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn355 360 365gcc atc gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc1152Ala Ile Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe370 375 380ggt tcc aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg1200Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met385 390 395 400gac ttc tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac1248Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr405 410 415gag cgc ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct1296Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro420 425 430acc aac gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt1344Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu435 440 445gaa gca tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg1392Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr450 455 460tgg ggt cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc1440Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr465 470 475 480tgg cgc agg cca taa1455Trp Arg Arg Pro<210>55<211>484<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum<400>55Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu1 5 10 15Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe20 25 30Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu35 40 45
Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg50 55 60Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly65 70 75 80Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys85 90 95Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu100 105 110Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg115 120 125Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile130 135 140Glu Lys Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln145 150 155 160Leu Val Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His165 170 175Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala180 185 190Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val195 200 205Gln Ile Thr Met Thr Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr210 215 220Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile225 230 235 240Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro245 250 255Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro260 265 270Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly275 280 285
Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe290 295 300Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile305 310 315 320Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys325 330 335Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala340 345 350Pro His Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn355 360 365Ala Ile Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe370 375 380Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met385 390 395 400Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr405 410 415Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro420 425 430Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu435 440 445Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr450 455 460Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr465 470 475 480Trp Arg Arg Pro<210>56<211>29<212>DNA<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer zwfRBS1<400>56atgtcgacaa gaaaggatcg tgacactac 29<210>57<211>25<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer zwfRBS2<400>57atgtcgaccc cccgcatcgc tggcc 25<210>58<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer zwfRBSE<400>58atgtcgacat cgctttcgga gtcagtga28<210>59<211>1732<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>PCR-Product zwfL
<220>
<221>CDS<222>(34)..(1575)<223>zwf-allele zwfL<400>59atgtcgacaa gaaaggatcg tgacactacc atc gtg agc aca aac acg acc ccc54Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro1 5tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac ccg cag gat aaa cga ctc ccc102Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro10 15 20cgc atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg atc ttc ggt gtc act ggc gac150Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp25 30 35ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc att tat gat cta gca aac cgc198Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg40 45 50 55gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg gta ggt tac ggc cgc cgc gaa246Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu60 65 70tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac gta cgc gat gcc gca agt gct294Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala75 80 85ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat gtt tgg gag cgc ctc gcc gag342Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu90 95 100ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt gat gat gat gca gct ttc gac390Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp105 110 115aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc gac aaa acc cgc ggc acc gcc438Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala120 125 130 135ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att cca cca gat tcc ttc aca gcg486Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala140 145 150gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc atg gct gaa tcc acc gaa gaa534Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu155 160 165gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag cct ttc ggc cac aac ctc gaa582Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys Pro Phe Gly His Asn Leu Glu170 175 180tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc aac gca gtc ttc cca gaa tct630
Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val Asn Ala Val Pne Pro Glu Ser185 190 195tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg ggc aag gaa aca gtt caa aac 678Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn200 205 210 215atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag ctg ttt gag cca ctg tgg aac 726Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn220 225 230tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc acc atg act gaa gat att ggc 774Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile Thr Met Thr Glu Asp Ile Gly235 240 245ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac ggc atc ggc gca gcc cgc gac 822Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp250 255 260gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc ttg gct ctg gtt gcc atg gaa 870Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met Glu265 270 275gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag ctg cag gca gaa aag atc aag 918Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys280 285 290 295gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac cca ttg gat aaa acc tcc gct 966Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala300 305 310cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag ggc tct gag tta gtc aag gga1014Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly315 320 325ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct gag tcc acc act gag act ttt1062Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe330 335 340gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg1110Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro345 350 355ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt ggt cgc cgt gtt act gag att1158Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile360 365 370 375gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac cag cct ttc gac ggc gac atg1206Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met380 385 390act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc gtg att cgc gtg cag cct gat1254Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile Val Ile Arg Val Gln Pro Asp395 400 405gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc aag gtt cca ggt tct gcc atg1302Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser Ala Met410 415 420gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc tcc tac tca gaa tcc ttc act1350
Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr425 430 435gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc ctc att ttg gat gcg ctg tta1398Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu440 445 450 455gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac gag gaa gtg gaa ctg agc tgg1446Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp460 465 470aag att ctg gat cca att ctt gaa gca tgg gat gcc gat gga gaa cca1494Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro475 480 485gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt cca aag agc gct gat gaa atg1542Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met490 495 500ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc agg cca taatttaggg gcaaaaaatg 1595Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg Arg Pro505 510atctttgaac ttccggatac caccacccag caaatttcca agaccctaac tcgactgcgt 1655gaatcgggca cccaggtcac caccggccga gtgctcaccc tcatcgtggt cactgactcc 1715gaaagcgatg tcgacat 1732<210>60<211>514<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>PCR-Product zwfL<400>60Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60
Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240Thr Met Thr Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300
Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510Arg Pro<210>61
<211>1642<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>PCR-Product zwfS<220>
<221>CDS<222>(34)..(1485)<223>zwf-allele zwfS<400>61atgtcgaccc cccgcatcgc tggcccttcc ggc atg gtg atc ttc ggt gtc act54Met Val Ile Phe Gly Val Thr1 5ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc att tat gat cta gca102Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala10 15 20aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg gta ggt tac ggc cgc150Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg25 30 35cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac gta cgc gat gcc gca198Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala40 45 50 55agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat gtt tgg gag cgc ctc246Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu60 65 70gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt gat gat gat gca gct294Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala75 80 85ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc gac aaa acc cgc ggc342Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly90 95 100acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att cca cca gat tcc ttc390Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe105 110 115aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc atg gct gaa tcc acc438Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr120 125 130 135gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag cct ttc ggc cac aac486
Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys Pro Phe Gly His Asn140 145 150ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc aac gca gtc ttc cca534Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val Asn Ala Val Phe Pro155 160 165gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg ggc aag gaa aca gtt582Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val170 175 180caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag ctg ttt gag cca ctg630Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu185 190 195tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc acc atg act gaa gat678Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile Thr Met Thr Glu Asp200 205 210 215att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac ggc atc ggc gca gcc726Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala220 225 230cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc ttg gct ctg gtt gcc774Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala235 240 245atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag ctg cag gca gaa aag822Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys250 255 260atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac cca ttg gat aaa acc870Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr265 270 275tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag ggc tct gag tta gtc918Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val280 285 290 295aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct gag tcc acc act gag966Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu300 305 310act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct cgt cgc tgg gct ggt 1014Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly315 320 325gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt ggt cgc cgt gtt act 1062Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr330 335 340gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac cag cct ttc gac ggc 1110Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His Gln Pro Phe Asp Gly345 350 355gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc gtg att cgc gtg cag 1158Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile Val Ile Arg Val Gln360 365 370 375cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc aag gtt cca ggt tct 1206
Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser380 385 390gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc tcc tac tca gaa tcc1254Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser395 400 405ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc ctc att ttg gat gcg1302Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala410 415 420ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac gag gaa gtg gaa ctg1350Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu425 430 435agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca tgg gat gcc gat gga1398Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly440 445 450 455gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt cca aag agc gct gat1446Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp460 465 470gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc agg cca taatttaggg 1495Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg Arg Pro475 480gcaaaaaatg atctttgaac ttccggatac caccacccag caaatttcca agaccctaac 1555tcgactgcgt gaatcgggca cccaggtcac caccggccga gtgctcaccc tcatcgtggt 1615cactgactcc gaaagcgatg tcgacat 1642<210>62<21l>484<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>PCR-Product zwfS<400>62Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu1 5 10 15Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe20 25 30Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu35 40 45
Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg50 55 60Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly65 70 75 80Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys85 90 95Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu100 105 110Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg115 120 125Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile130 135 140Glu Lys Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln145 150 155 160Leu Val Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His165 170 175Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala180 185 190Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val195 200 205Gln Ile Thr Met Thr Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr210 215 220Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile225 230 235 240Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro245 250 255Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro260 265 270Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly
275 280 285Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe290 295 300Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile305 310 315 320Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys325 330 335Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala340 345 350Pro His Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn355 360 365Ala Ile Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe370 375 380Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met385 390 395 400Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr405 410 415Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro420 425 430Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu435 440 445Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr450 455 460Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr465 470 475 480Trp Arg Arg Pro<210>63<211>18<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(18)<223>Primer GATC-R1_neu-29234<400>63ggaacacaga agattctg 18<210>64<211>18<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(18)<223>Primer GATC-F1_neu-29233<400>64ccgtgttact gagattgc 18<210>65<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(18)
<223>Primer GATC-zwf_int-27334<400>65tggctgaatc caccgaagaa 20
權利要求
1.一種分離的多核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白質，其中至少在第369-373位的一或多個氨基酸和/或在第241-246位的一或多個氨基酸由另外的蛋白質氨基酸置換。
2.權利要求1的分離的多核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白質，其中至少選自如下一組的一或多個氨基酸由任何其它蛋白質氨基酸置換第370位的L-精氨酸、第372位的L-纈氨酸、第242位的L-甲硫氨酸、第243位的L-丙氨酸、第244位的L-谷氨酸和第245位的L-天冬氨酸。
3.權利要求1的分離的多核苷酸，其編碼選自如下一組的一種蛋白質包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白質，其中至少第243位的L-丙氨酸由L-蘇氨酸置換；包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白質，其中至少第242位的L-甲硫氨酸由L-亮氨酸置換；包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白質，其中至少第242位的L-甲硫氨酸由L-絲氨酸置換；包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白質，其中至少第245位的L-天冬氨酸由L-絲氨酸置換；包含SEQ IDNO10的氨基酸序列的蛋白質，其中至少第370位的L-精氨酸由L-甲硫氨酸置換及包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白質，其中至少第372位的L-纈氨酸由L-丙氨酸置換。
4.權利要求1的分離的多核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO22的氨基酸序列的至少第241-246位氨基酸及任選地SEQ ID NO10的氨基酸序列的第1-10位氨基酸的蛋白質。
5.權利要求3的分離的多核苷酸，其包含SEQ ID NO21的核苷酸序列的第308-1849位核苷酸。
6.權利要求1的分離的多核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO33、35和37的氨基酸序列之一的至少第237-250位氨基酸及任選地SEQ IDNO10的氨基酸序列的第1-10位氨基酸的蛋白質。
7.權利要求3的分離的多核苷酸，其包含SEQ ID NO32、34和36的核苷酸序列之一的第1-1542位核苷酸。
8.權利要求1-7任一項的分離的多核苷酸，其中所述編碼的蛋白質具有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性。
9.權利要求8的分離的多核苷酸，其中所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性對NADPH的抑制作用有抗性。
10.權利要求5或6的分離的多核苷酸，其由SEQ ID NO21、33、35和37之一的序列或其編碼具有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的蛋白質的片段組成。
11.權利要求10的分離的多核苷酸，其編碼具有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的蛋白質，其中所述蛋白質包含至少SEQ ID NO10的N末端序列的第1-10位氨基酸。
12.一種包含權利要求1-11任一項的分離的多核苷酸的細菌。
13.權利要求12的細菌，其中所述分離的多核苷酸包含在所述細菌的染色體中。
14.權利要求13的細菌，其中所述細菌是棒狀細菌或大腸桿菌。
15.一種包含權利要求1-11任一項的分離的多核苷酸的載體。
16.權利要求15的載體，其中所述載體是質粒。
17.一種分離的細菌，其包含編碼包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白質的多核苷酸，其中至少第369-373位的一或多個氨基酸和/或第241-246位的一或多個氨基酸由另外的蛋白質氨基酸置換。
18.權利要求17的分離的細菌，其包含編碼包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白質的多核苷酸，其中選自如下一組的至少一或多個氨基酸由任何其它的蛋白質氨基酸置換第370位的L-精氨酸、第372位的L-纈氨酸、第242位的L-甲硫氨酸、第243位的L-丙氨酸、第244位的L-谷氨酸及第245位的L-天冬氨酸。
19.權利要求17的分離的細菌，其包含編碼包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白質的多核苷酸，其中至少第243位的L-丙氨酸由L-蘇氨酸置換。
20.權利要求17的分離的細菌，其包含編碼一種蛋白質的多核苷酸，其中所述蛋白質包含至少SEQ ID NO22氨基酸序列的第241-246位氨基酸。
21.權利要求17的分離的細菌，其包含編碼一種蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質包含至少SEQ ID NO10氨基酸序列的第1-10位氨基酸及SEQ ID NO22氨基酸序列的第241-246位氨基酸。
22.權利要求17的分離的細菌，其包含一種多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO22核苷酸序列的第308-1849位核苷酸。
23.權利要求17的分離的細菌，其包含編碼包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白質的多核苷酸，其中至少第245位的L-天冬氨酸由L-絲氨酸置換。
24.權利要求17的分離的細菌，其包含編碼一種蛋白質的多核苷酸，其中所述蛋白質包含至少SEQ ID NO33、35和37氨基酸序列之一的第237-250位氨基酸。
25.權利要求17的分離的細菌，其包含編碼一種蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質包含至少SEQ ID NO10氨基酸序列的第1-10位氨基酸及SEQ ID NO33、35和37氨基酸序列之一的第237-250位氨基酸。
26.權利要求17的分離的細菌，其包含一種多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO32、34和36序列之一的第1-1542位核苷酸。
27.權利要求17-26任一項的分離的細菌，其包含編碼一種蛋白質的多核苷酸，其中所述蛋白質具有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性。
28.權利要求27的分離的細菌，其中所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性對NADPH的抑制作用有抗性。
29.權利要求17-26任一項的分離的細菌，其包含編碼一種蛋白質的多核苷酸，其中所述蛋白質的N末端甲硫氨酸在所述細菌中進行加工期間被除去。
30.權利要求17-26任一項的分離的細菌，其中所述細菌是棒狀細菌。
31.谷氨酸棒桿菌DM658，保藏號為DSM7431。
32.谷氨酸棒桿菌DSM5715zwf2_A243T，保藏號為DSM15237。
33.谷氨酸棒桿菌DSM1697_zwfD245S，保藏號為DSM15632。
34.一種通過發(fā)酵分離的棒狀細菌制備氨基酸的方法，包括a)發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的細菌，該細菌包含編碼包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白質的多核苷酸，其中至少第369-373位的一或多個氨基酸和/或第241-246位的一或多個氨基酸由另外的蛋白質氨基酸置換；和b)濃縮培養(yǎng)基中或細菌細胞中的氨基酸。
35.權利要求28的方法，其中所述細菌包含編碼包含SEQ IDNO22的氨基酸序列的蛋白質的多核苷酸。
36.權利要求34的方法，其中所述細菌包含編碼包含SEQ IDNO33、35和37氨基酸序列之一的蛋白質的多核苷酸。
37.一種通過發(fā)酵棒狀細菌制備氨基酸的方法，包括如下步驟a)發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的細菌，該細菌包含編碼包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白質的分離的或重組的多核苷酸，其中至少第369-373位的一或多個氨基酸和/或第241-246位的一或多個氨基酸由另外的蛋白質氨基酸置換；及b)濃縮培養(yǎng)基中或細菌細胞中的氨基酸。
38.權利要求32的方法，其中所述分離的多核苷酸編碼包含SEQID NO22的氨基酸序列的蛋白質。
39.權利要求37的方法，其中所述分離的多核苷酸編碼包含SEQID NO33、35和37氨基酸序列之一的蛋白質。
40.一種通過發(fā)酵分離的棒狀細菌制備氨基酸的方法，包括a)發(fā)酵包含一種多核苷酸的生產(chǎn)氨基酸的細菌，所述多核苷酸編碼具有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性、包含至少SEQ ID NO22的第241-246位氨基酸或者SEQ ID NO33、35和37的第237-250位氨基酸的蛋白質；b)濃縮培養(yǎng)基中或細菌細胞中的氨基酸。
41.一種通過發(fā)酵棒狀細菌制備氨基酸的方法，包括如下步驟a)發(fā)酵包含一種分離或重組的多核苷酸的生產(chǎn)氨基酸的細菌，所述多核苷酸編碼具有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性、包含至少SEQ IDNO22的第241-246位氨基酸或者SEQ ID NO33、35和37的第237-250位氨基酸的蛋白質；和b)濃縮培養(yǎng)基中或細菌細胞中的氨基酸。
42.權利要求34-41任一項的方法，其中所述氨基酸選自L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸和L-色氨酸。
43.權利要求34-42任一項的方法，其包含分離所述L-氨基酸。
44.權利要求40-41任一項的方法，其中所述蛋白質進一步包含SEQ ID NO10的N末端序列的第1-10位氨基酸。
45.權利要求34-41任一項的方法，其中由poxB基因編碼的丙酮酸氧化酶的胞內(nèi)活性額外地被降低或關閉。
46.權利要求34-41任一項的方法，其中由pgi基因編碼的葡萄糖-6-磷酸異構酶的胞內(nèi)活性額外地被降低或關閉。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過發(fā)酵棒狀細菌制備L－氨基酸的方法，所述方法包括進行如下步驟a)發(fā)酵生產(chǎn)L－氨基酸的細菌，其中至少zwf基因是擴增的；b)濃縮培養(yǎng)基或者細菌細胞中的L－氨基酸，及c)分離產(chǎn)生的L－氨基酸。
文檔編號C12N15/77GK1906291SQ200480041034
公開日2007年1月31日 申請日期2004年1月29日 優(yōu)先權日2004年1月29日
發(fā)明者斯特凡·漢斯, 布里吉特·巴斯, 亞歷山大·雷特, 格奧爾格·蒂爾巴赫, 卡羅琳·克羅伊策, 貝蒂娜·黑德里希 申請人:德古薩股份公司