專利名稱：從粗水解產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸的方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域這個(gè)發(fā)明涉及生產(chǎn)琥珀酸的發(fā)酵方法，更具體而言，這個(gè)發(fā)明涉及產(chǎn)生能夠利用多種糖生產(chǎn)琥珀酸作為主要發(fā)酵產(chǎn)物的細(xì)菌菌株的方法。
2.發(fā)明背景羧酸類(lèi)有希望作為許多化學(xué)品的潛在前體。例如，琥珀酸可以用作塑料前體如1，4丁二醇(BDO)、四氫呋喃和γ-丁內(nèi)酯(gamma-butyroactone)的原料。從琥珀酸衍生的新產(chǎn)品正在開(kāi)發(fā)中，這些中最值得注意的是通過(guò)連接琥珀酸和BDO而制造的聚酯。一般地，琥珀酸的酯類(lèi)具有成為可以代替更有害溶劑的新的、“綠色”溶劑的潛力?？傮w上，琥珀酸可以用作每年總市場(chǎng)價(jià)值超過(guò)十億美元的幾百萬(wàn)磅化學(xué)品的前體。與琥珀酸一起，其它4-碳二羧酸，例如馬來(lái)酸和延胡索酸也具有原料潛力。
這些來(lái)自可再生原料(在這個(gè)情況下通過(guò)發(fā)酵方法)的羧酸的生產(chǎn)是代替能源消耗量更大的從不可再生來(lái)源得到這樣酸的方法的途徑。琥珀酸鹽是通過(guò)產(chǎn)丙酸鹽細(xì)菌厭氧發(fā)酵的中間體，但是那些方法導(dǎo)致低收率和濃度。
厭氧瘤胃細(xì)菌如棲瘤胃普雷沃氏菌(Bacteroides ruminicola)和嗜淀粉瘤胃桿菌(Bacteroides amylophilus)也生產(chǎn)琥珀酸鹽。然而，瘤胃生物在發(fā)酵過(guò)程中在特性上是不穩(wěn)定的。
早已經(jīng)知道，從E.coli發(fā)酵生產(chǎn)酸的混合物，如Stokes，J.L.1949″Fermentation of glucose by suspensions of Escherichia coli″J.Bacteriol.57147-158中所詳述。然而，對(duì)于每摩爾發(fā)酵的葡萄糖，僅生產(chǎn)1.2摩爾甲酸、0.1-0.2摩爾乳酸和0.3-0.4摩爾琥珀酸。因而，發(fā)酵生產(chǎn)羧酸的努力已導(dǎo)致相對(duì)大量的生長(zhǎng)底物如葡萄糖還未轉(zhuǎn)化成所希望的產(chǎn)品。
一些細(xì)菌，例如在發(fā)酵方法中使用的產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌(A.succiniciproducens)，如在授予Glassner等美國(guó)專利號(hào)5,143,834中所概述，在適度的數(shù)升中自然生產(chǎn)琥珀酸僅達(dá)到約35-40克每升(g/L)。產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌宿主菌株已表現(xiàn)出不是高耐滲透的，因?yàn)樗荒苣褪芨邼舛塞}并且還受中等濃度的產(chǎn)物抑制。最后，產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌存在操作問(wèn)題，因?yàn)樽鳛閷Ｐ詤捬蹙?，使用所述生物的過(guò)程必須在不存在氧的情況下進(jìn)行。并且，用于接種的培養(yǎng)基的制備需要加入色氨酸。
本發(fā)明人早期的生產(chǎn)琥珀酸的努力導(dǎo)致了突變體細(xì)菌的分離和利用。所述突變體，作為ATCC序號(hào)202021可得到，是美國(guó)專利再頒發(fā)申請(qǐng)?zhí)?9/429,693的主題。通過(guò)參考結(jié)合于此的再頒發(fā)申請(qǐng)?zhí)?9/429,693教導(dǎo)了一種從其前身自發(fā)突變的生產(chǎn)琥珀酸的細(xì)菌菌株(stain)(AFP 111)。所述突變體能夠在葡萄糖上發(fā)酵生長(zhǎng)以高收率生產(chǎn)琥珀酸，而它的前身做不到這樣。然而，利用這個(gè)方法的琥珀酸生產(chǎn)的明顯缺點(diǎn)是它限于單一突變體。
本發(fā)明人的其它努力(美國(guó)專利號(hào)6,159,738)導(dǎo)致了構(gòu)建具有增加的琥珀酸產(chǎn)量的細(xì)菌菌株的方法。所述方法教導(dǎo)大腸桿菌(E.coli)磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的改變引起所述細(xì)菌生產(chǎn)更多的琥珀酸。這個(gè)方法的缺點(diǎn)是它限于單一的改變。
發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸方法的需要存在于本技術(shù)領(lǐng)域中，由此所述方法不歸類(lèi)于單一突變體或基因。應(yīng)當(dāng)由任何具有特定并且容易確定的基因型的生物使所述方法可行。所述方法應(yīng)當(dāng)能夠在使用魯棒(robust)生物(即，具有高反饋抑制閾的那些)的相對(duì)惰性條件下進(jìn)行，并且也以便消除復(fù)雜環(huán)境控制測(cè)量的需要。所述方法應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生利用從木質(zhì)纖維素原料水解得到的糖混合物的結(jié)果，因?yàn)檫@些底物提供較便宜的糖的來(lái)源，并且同樣地，它們的使用可以減少琥珀酸的生產(chǎn)成本。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供生產(chǎn)琥珀酸的方法，所述方法克服了許多現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供生產(chǎn)高收率琥珀酸的發(fā)酵方法。本發(fā)明的一個(gè)特征是利用含有多個(gè)突變基因的細(xì)菌基因組使所述方法可行。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以容易地操作細(xì)菌以生產(chǎn)多個(gè)突變體。備選地，不用進(jìn)一步的操作就可以利用已含有多個(gè)突變的細(xì)菌。
本發(fā)明的再另一個(gè)目的是提供操作細(xì)菌以生產(chǎn)大量琥珀酸的方法。本發(fā)明的一個(gè)特征是中斷細(xì)菌中糖代謝的正常調(diào)節(jié)。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是具有操作多種細(xì)菌以促進(jìn)用于生產(chǎn)琥珀酸的發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)高的產(chǎn)物對(duì)生長(zhǎng)底物比(即，在1∶1或之上)的能力。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是具有利用成為葡萄糖代謝者和非葡萄糖代謝者的細(xì)菌的能力。
本發(fā)明還有另一個(gè)目的是發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸。本發(fā)明的一個(gè)特征是含改變的磷酸轉(zhuǎn)移酶(pts)體系、丙酮酸甲酸裂合酶(pyruvate formate lyase)(pfl)體系和乳酸脫氫酶(ldh)體系的利用。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是所述細(xì)菌可以從使用這些酶體系用于糖發(fā)酵的許多屬得到。
簡(jiǎn)言之，提供了從工業(yè)級(jí)水解產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸的方法，該方法包含供應(yīng)含有基因ptsG、pflB和ldhA突變的生物；容許所述生物累積生物量；并且容許所述生物體代謝水解產(chǎn)物。
也提供了細(xì)菌突變體，其特征在于它以琥珀酸對(duì)底物在0.6∶1和1.3∶1之間的比例(舉例來(lái)說(shuō)，在0.6和1.3克琥珀酸/克總耗糖之間)從工業(yè)級(jí)水解產(chǎn)物中含有的底物生產(chǎn)琥珀酸。
附圖簡(jiǎn)述從下面在附圖中說(shuō)明的本發(fā)明實(shí)施方案的詳細(xì)描述可以最好地理解本發(fā)明以及上面的和其它目的和優(yōu)點(diǎn)，其中

圖1是描述根據(jù)本發(fā)明的特征在含突變基因菌株的轉(zhuǎn)化之后琥珀酸提高的產(chǎn)量的曲線圖；圖2是描述根據(jù)本發(fā)明的特征經(jīng)由三重突變生物的工業(yè)水解產(chǎn)物發(fā)酵的曲線圖；和圖3是描述根據(jù)本發(fā)明的特征經(jīng)由三重突變生物的合成糖發(fā)酵的曲線圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明人已開(kāi)發(fā)了發(fā)酵生產(chǎn)高收率琥珀酸的方法。所述方法開(kāi)發(fā)了所選生物的改變的分解代謝物抑制機(jī)理以便使所述生物能夠利用葡萄糖和非葡萄糖原料生產(chǎn)琥珀酸。
在詳細(xì)地建立本發(fā)明之前，提供了下面的倘若在這里出現(xiàn)的定義“載體”是另一個(gè)DNA區(qū)段可以連接到的復(fù)制子，例如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，以便產(chǎn)生并連區(qū)段的復(fù)制。
“復(fù)制子”是作為體內(nèi)DNA復(fù)制的自主單元即能夠在其自身控制下復(fù)制而起作用的任何遺傳因子(例如，質(zhì)粒、染色體、病毒)。
“盒”指的是能夠在特定的限制酶切位點(diǎn)插入到載體中的DNA區(qū)段。DNA的區(qū)段編碼目的多肽，并且設(shè)計(jì)所述盒和限制酶切位點(diǎn)以確保所述盒插入在正確的讀框中用于轉(zhuǎn)錄和翻譯。
細(xì)胞已經(jīng)被外源或異源DNA“轉(zhuǎn)染”，那時(shí)這樣的DNA已被引入所述細(xì)胞。
細(xì)胞已經(jīng)被外源或異源DNA“轉(zhuǎn)化”，那時(shí)所述轉(zhuǎn)染的DNA產(chǎn)生表型改變。
“異源的”DNA指的是非自然定位于所述細(xì)胞中或者所述細(xì)胞染色體位點(diǎn)中的DNA。優(yōu)選地，所述異源DNA包括和所述細(xì)胞無(wú)關(guān)的基因。
“核酸分子”指的是磷酸酯多聚形式的核糖核苷(腺苷、鳥(niǎo)苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥(niǎo)苷、脫氧胸腺嘧啶核苷或脫氧胞苷；“DNA分子”)，或者其任何磷酸酯類(lèi)似物，例如以單鏈形式或者以雙鏈螺旋的硫代磷酸酯和硫代酸酯?？梢允请p鏈的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。所述術(shù)語(yǔ)核酸分子，并且特別是DNA或RNA分子，僅指的是所述分子的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，并且不限制它為任何特殊的三級(jí)形式。因而，這個(gè)術(shù)語(yǔ)包括雙鏈DNA，特別是在線狀或環(huán)狀DNA分子(例如限制酶切片段)、質(zhì)粒和染色體中發(fā)現(xiàn)的。在討論特殊的雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)中，可以在這里根據(jù)正常的慣例僅沿著DNA的非轉(zhuǎn)錄鏈(即，具有與mRNA序列同源性的鏈)給出5′至3′方向的序列描述序列?！爸亟M體DNA分子”是已經(jīng)經(jīng)歷過(guò)分子生物學(xué)操作的DNA分子。
當(dāng)單鏈形式的核酸分子可以在適當(dāng)?shù)臏囟群腿芤弘x子強(qiáng)度條件(參見(jiàn)Sambrook等，見(jiàn)上)下退火到其它核酸分子，核酸分子對(duì)另一種核酸分子是“可雜交的”，例如cDNA、基因組DNA或RNA。溫度和離子強(qiáng)度條件確定所述雜交的“嚴(yán)格性”。對(duì)于同源核酸的初步篩選，可以使用低嚴(yán)格性的雜交條件，對(duì)應(yīng)于Tm為55℃，例如，5×SSC、0.1％SDS、0.25％奶、并且無(wú)甲酰胺；或30％甲酰胺、5×SSC、0.5％SDS)。中等嚴(yán)格性的雜交條件對(duì)應(yīng)于更高的Tm，例如40％甲酰胺、5×或6×SCC。高嚴(yán)格性的雜交條件對(duì)應(yīng)于最高的Tm，例如，50％甲酰胺、5×或6×SCC。雜交需要兩種核酸含有互補(bǔ)的序列，盡管依賴于所述雜交的嚴(yán)格性，但是堿基間的錯(cuò)配是可能的。用于雜交核酸的適當(dāng)嚴(yán)格性依賴于所述核酸的長(zhǎng)度和互補(bǔ)程度，本領(lǐng)域中眾所周知的變量。兩個(gè)核苷酸序列之間相似或相同的程度越大，具有那些序列的核酸的雜交Tm的值越大。核酸雜交的相對(duì)穩(wěn)定性(對(duì)應(yīng)于更高的Tm)以下列順序減少RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。對(duì)于在長(zhǎng)度上大于100個(gè)核苷酸的雜交，已經(jīng)得到了計(jì)算Tm的方程式(參見(jiàn)Sambrook等，見(jiàn)上，9.50-0.51)。對(duì)于用更短核酸的雜交，即，寡核苷酸，錯(cuò)配的位置變得更重要，并且所述寡核苷酸的長(zhǎng)度決定其特異性(參見(jiàn)Sambrook等，見(jiàn)上，11.7-11.8)。優(yōu)選可雜交的核酸的最小長(zhǎng)度是至少約12個(gè)核苷酸；優(yōu)選至少約18個(gè)核苷酸并且更優(yōu)選所述長(zhǎng)度是至少約27個(gè)核苷酸；并且最優(yōu)選約36個(gè)核苷酸。
“同源重組”指的是在染色體中載體的外源DNA序列的插入。優(yōu)選地，所述載體將特定的染色體位點(diǎn)作為目標(biāo)用于同源重組。對(duì)于特定的同源重組，所述載體將對(duì)于所述染色體含有足夠長(zhǎng)的同源區(qū)域以使所述載體能夠互補(bǔ)結(jié)合并且摻入到所述染色體中。同源的區(qū)域越長(zhǎng)，序列相似程度越大，可以增加同源重組的效率。
DNA“編碼序列”是當(dāng)置于適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列的控制下時(shí)在體外或體內(nèi)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽的雙鏈DNA序列。編碼序列的邊界由5′(氨基)末端的起始密碼子和3′(羧基)末端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列可以包括，但不限于，原核序列、來(lái)自真核MRNA的cDNA、來(lái)自真核(例如，哺乳動(dòng)物)DNA的基因組DNA，并且甚至是合成的DNA序列。如果意欲將所述編碼序列在真核細(xì)胞中表達(dá)，那么聚腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列將通常位于所述編碼序列的3′。
轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列是DNA調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子等，其提供宿主細(xì)胞中編碼序列的表達(dá)。在真核細(xì)胞中，聚腺苷酸化信號(hào)是控制序列。
“啟動(dòng)子序列”是細(xì)胞中能夠結(jié)合RNA聚合酶和啟動(dòng)下游(3′方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)節(jié)區(qū)域。例如，所述啟動(dòng)子序列在它的3′末端被轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)位點(diǎn)所限制并且向上游(5′方向)延伸以包括在背景上可檢測(cè)水平啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄所必需的最小數(shù)目的堿基或元件。在所述啟動(dòng)子序列中不僅將發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)位點(diǎn)(例如，便利地通過(guò)用核酸酶S1圖譜定義)，也將發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)結(jié)合RNA聚合酶的蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)(共有序列)。
在細(xì)胞中，當(dāng)RNA聚合酶將所述編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA時(shí)，編碼序列在轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列的“控制下”，然后將所述mRNA反式RNA(trans-RNA)剪接并翻譯成由所述編碼序列編碼的蛋白質(zhì)。
如這里所用，在全部其語(yǔ)法形式中的術(shù)語(yǔ)“序列同源性”指的是具有“共同進(jìn)化起源”的蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，包括來(lái)自超家族的蛋白質(zhì)(例如免疫球蛋白超家族)和來(lái)自不同種的同源蛋白質(zhì)(例如，肌球蛋白輕鏈等)[Reeck et al.，Cell，50667(1987)]。
因此，在全部其語(yǔ)法形式中的術(shù)語(yǔ)“序列相似性”指的是在不共享共同進(jìn)化起源的核酸或蛋白質(zhì)的氨基酸序列之間的同一性或一致性的程度[參見(jiàn)Reeck et al.，1987，見(jiàn)前]。然而，在通常用法中和目前的申請(qǐng)中，當(dāng)所述術(shù)語(yǔ)“同源的”用一個(gè)副詞“高度地”修飾時(shí)，可以指的是序列相似性并且不是共同進(jìn)化起源。
當(dāng)至少約50％(優(yōu)選至少約75％并且最優(yōu)選至少約90％、95％或99.9％)的核酸與限定長(zhǎng)度的DNA序列相配時(shí)，兩種DNA序列是“基本同源的”或“基本相似的”。基本同源的序列可以通過(guò)利用在序列數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的標(biāo)準(zhǔn)軟件比較所述序列而確認(rèn)，或者例如在對(duì)那個(gè)特定體系限定的嚴(yán)格條件下在Southern雜交實(shí)驗(yàn)中確認(rèn)。限定適當(dāng)?shù)碾s交條件是在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。例如，參見(jiàn)，Maniatis等，見(jiàn)前；DNA Cloning，Vols.I&II，見(jiàn)前；Nucleic Acid Hybridization，見(jiàn)前。
類(lèi)似地，當(dāng)大于30％的氨基酸是相同的或者大于約60％是相似的(功能上相同)時(shí)，兩種氨基酸序列是“基本同源的”或“基本相似的”。優(yōu)選地，例如，利用GCG(Genetics Computer Group，Program Manual for theGCG Package，第7版，麥迪遜，威斯康星)堆積程序通過(guò)序列比對(duì)確認(rèn)相似或同源序列。
術(shù)語(yǔ)“對(duì)應(yīng)于”在這里用于指相似的或同源的序列，不論確切的位置是相同的或者不同于測(cè)量相似性或同源性的分子。因而，所述術(shù)語(yǔ)“對(duì)應(yīng)于”指的是序列相似性，而不是所述氨基酸殘基或核苷酸堿基的編號(hào)。
得到的突變體和方案導(dǎo)致琥珀酸根對(duì)原料的比例高達(dá)1.3∶1，并且典型地是0.9∶1。實(shí)現(xiàn)了琥珀酸根的積累在60g/L和75g/L之間。典型方案的持續(xù)時(shí)間是大于70小時(shí)，并且通常在120和170小時(shí)之間。例如在160小時(shí)后獲得了70g/L的收率。所述方法在25℃和45℃之間是可行的，優(yōu)選的范圍是約30至39℃。約5和9之間的pH是適合的，更優(yōu)選的范圍是約6.1和7.2。
本發(fā)明的突變體是發(fā)酵方案的特別能生存的成分，因?yàn)樗鼈兙哂性黾拥陌l(fā)酵產(chǎn)物耐受性。例如，在不產(chǎn)生反饋抑制的情況下，72g/L琥珀酸根、22g/L乙酸根、14g/L乙醇和8g/L乳酸根的濃度是可實(shí)現(xiàn)的。
原料詳請(qǐng)本發(fā)明的方法和突變體的突出特征是工業(yè)原料的直接利用?？梢岳枚喾N原料，包括，但不限于輕質(zhì)浸泡水(light steep water)、通過(guò)多種水解方法產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物、玉米來(lái)源的糖溶液(例如玉米漿)、來(lái)自乳清的乳糖和其它工業(yè)級(jí)糖類(lèi)。例如，通過(guò)濃酸水解或稀酸水解、酶水解產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物或通過(guò)這些方法的組合產(chǎn)生的水解產(chǎn)物都是適合的。玉米來(lái)源的糖溶液也是適合的。
工業(yè)原料一般是葡萄糖和其它糖的混合物，最普通的非葡萄糖的糖是木糖。圖2通過(guò)本發(fā)明突變體之一描繪了葡萄糖和木糖的利用。
根據(jù)前述的，任何含有葡萄糖和/或非葡萄糖的糖的原料是適合的。同樣地，含有葡萄糖、山梨糖醇、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、乳糖、葡糖醛酸、半乳糖、果糖和它們的組合的原料是適當(dāng)?shù)摹?br> 生物詳請(qǐng)本發(fā)明的方法利用含有生物的分解代謝產(chǎn)物抑制體系中改變的生物。具體而言，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)當(dāng)改變存在于細(xì)菌的磷酸轉(zhuǎn)移酶(pts)體系、丙酮酸甲酸裂合酶(pfl)體系和乳酸脫氫酶(ldh)體系時(shí)，這些細(xì)菌適于用在本發(fā)明的琥珀酸生產(chǎn)方法中。pflAB和ldhA是分別編碼丙酮酸甲酸裂合酶和發(fā)酵的乳酸脫氫酶的基因。
因而，在本發(fā)明發(fā)酵方法中利用的生物類(lèi)型的唯一局限性是所述生物必須原本具有這些體系。可以利用天然包含這些體系的改變的生物(即，自發(fā)的突變體)，或者是特定改變的生物。
在所述細(xì)菌是變異的情況下，沒(méi)有或具有低琥珀酸成品收率(即，小于0.5摩爾/1摩爾供給的生長(zhǎng)底物)的發(fā)酵的細(xì)菌被轉(zhuǎn)化成具有高琥珀酸成品收率的細(xì)菌(即，大于或等于1摩爾/1摩爾供給的生長(zhǎng)底物)。
能夠發(fā)酵制造任何琥珀酸的任何細(xì)菌是特別適合的轉(zhuǎn)導(dǎo)候選者，包括但不限于革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性的發(fā)酵細(xì)菌。優(yōu)選地，適合的菌株包括但不限于大腸桿菌(E.coli)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、歐文氏菌(Erwinia)和乳桿菌(Lactobacilus)。
利用噬菌體P1通過(guò)連續(xù)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)修飾要改變成包括所述三個(gè)敲除的生物。利用標(biāo)準(zhǔn)的P1轉(zhuǎn)導(dǎo)方案，一個(gè)例舉性的方案公開(kāi)在J.H.Miller，ed.Experimeiits in Molecular Genetics 1972(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)中，并且通過(guò)參考結(jié)合于此。使用這個(gè)方法，可以使用野生型或接近野生型的細(xì)菌菌株(例如，E.coli的C600菌株；ATTC序號(hào)23724)產(chǎn)生缺少一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自pfl、ldh、ptsG功能基因的突變亞株。
“基因敲除”指沉默細(xì)胞中特定基因表達(dá)的方法。所述沉默方法可以包括，例如，基因靶技術(shù)或反義阻斷?；虬屑夹g(shù)指將核酸構(gòu)造引入到細(xì)胞中與目的基因特異性重組。所述核酸構(gòu)造使所述目的基因失活?？梢酝ㄟ^(guò)將終止密碼子引入到編碼區(qū)中或者通過(guò)將阻遏位點(diǎn)引入到調(diào)節(jié)序列中實(shí)現(xiàn)失活。反義阻斷指將指導(dǎo)反義RNA合成的表達(dá)序列結(jié)合到細(xì)胞中而阻斷目的基因的表達(dá)。反義RNA雜交到目的基因的mRNA以抑制表達(dá)。
包含三種可以用在本發(fā)明中的突變的E.coli菌株的一個(gè)實(shí)例命名為AFP 184(ATCC序號(hào)PTA 5132，2003年4月9日保藏)(AFP＝備選原料規(guī)劃)。AFP 184具有特意插入到接近野生型E.coli菌株中的pfl缺失、ldh敲除和不同的ptsG突變體形式。也可以使用另一個(gè)稱為APP 415的菌株。APP 415只在具有ptsG的敲除方面不同于APP 184。它表現(xiàn)類(lèi)似于APP184。
令人驚奇并出乎意料地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)APP 184和APP 415的代謝速率和滴度優(yōu)于美國(guó)專利號(hào)5,770,435(現(xiàn)在是再頒發(fā)申請(qǐng)?zhí)?9/429,693)和6,159,738中公開(kāi)的W1485的衍生細(xì)胞。
表1提供了由AFP 184和W1485衍生細(xì)胞(APP 111)的琥珀酸產(chǎn)量的比較。值得注意的是盡管W1485衍生細(xì)胞利用相當(dāng)精細(xì)的原料，但是APP184仍然用工業(yè)級(jí)水解產(chǎn)物提供更高的值。
也可以利用已經(jīng)含有一種或兩種基因異常的細(xì)菌并且然后誘導(dǎo)剩余的敲除而產(chǎn)生含有全部三種敲除的突變。在這個(gè)情況下，能生存的起始生物是W1485，ATCC序列號(hào)12435。APP 400(ATCC序號(hào)PTA 5583，2003年10月10日保藏)是特意制造的三重敲除。它含有由August Bock進(jìn)行的pfl缺失并且由伊利諾斯大學(xué)的David Clark插入到W1485中而產(chǎn)生FMJ123。依據(jù)P.K.Bunch et al.(1997)Microbiology 143，187-195中獲得的方案產(chǎn)生FMJ123并通過(guò)參考結(jié)合于此。AFP 400也含有l(wèi)dhA敲除，并且插入到FMJ123而產(chǎn)生DC1327。依據(jù)Chatterjee et al，Appl.Environ.Microbial.67，ppl48-l54中獲得的方案產(chǎn)生DC1327并通過(guò)參考結(jié)合于此。APP 400含有ptsG敲除，如Chatterjee參考中所述。
表1不同E.Coli譜系的琥珀酸生產(chǎn)的比較
也通過(guò)將三種敲除引入到菌株C600構(gòu)建了三重敲除的AFP404(ATCC序號(hào)PTA 5133，2003年4月9日保藏)。APP404類(lèi)似于APP184但是具有ptsG的敲除而不是所述基因的點(diǎn)突變。它也以大約1mol/mol葡萄糖的收率生產(chǎn)琥珀酸。
也在R Chatterjee等中獲得了從野生菌株的三重突變開(kāi)發(fā)的方案。指示每一個(gè)所述敲除存在的典型抗生素標(biāo)記包括，但不限于，Cam、Tet和Kan。因而產(chǎn)生了含有所述敲除和所述抗生素標(biāo)記的新E.coli菌株APP 400和APP 404。那個(gè)方案如下插入失活ptsG基因的構(gòu)建和引入利用靶向所述蛋白質(zhì)的N-和C-末端的引物通過(guò)PCR從W1485制備的基因組DNA克隆E.coli的天然ptsG基因，不擴(kuò)增另外的基因組序列。將所述基因克隆在載體pFJ118EH中而得到pJ7FptsG。通過(guò)將用EcoRI切除的pUC-4K的卡那霉素抗性盒(Pharmacia)插入到pJFptsG中ptsG基因的MfeI位點(diǎn)中來(lái)破壞所述基因，從而得到質(zhì)粒pTSGK。因?yàn)镹ZN111已經(jīng)包括卡那霉素抗性標(biāo)記，所以通過(guò)從菌株SE1752將Tn10-失活的ldhA基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到FMJ123中構(gòu)建等效菌株。得到的菌株DC1327在其生理學(xué)上與NZN111是不能區(qū)別的。通過(guò)用pTSGK轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞將被破壞的ptsG基因轉(zhuǎn)移在DC1327中，在卡那霉素存在并且氨芐青霉素不存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞約30世代，然后將培養(yǎng)物在含有葡萄糖的LB平板上平板接種并厭氧培養(yǎng)。將能夠發(fā)酵生長(zhǎng)的菌落純化并篩查它們對(duì)兩種抗生素的敏感性，如下面的實(shí)施例中所詳細(xì)描述。
將菌株AFP400分離作為穩(wěn)定的卡那霉素抗性的、氨芐青霉素敏感的菌株，其將葡萄糖發(fā)酵成琥珀酸鹽、乙酸鹽和乙醇。通過(guò)PCR證實(shí)破壞的ptsG基因的正確整合。利用在所述基因的編碼區(qū)外匹配旁側(cè)序列大約110個(gè)堿基對(duì)的引物從AFP400 DNA擴(kuò)增破壞的基因。這些序列不存在于整合載體中。得到的產(chǎn)物大小是3.0kb，如從已知的序列ptsG、它的旁側(cè)區(qū)和卡那霉素插入片段所預(yù)測(cè)。將產(chǎn)物用ClaI(卡那霉素盒中的位點(diǎn))和AgeI(ptsG中的位點(diǎn))消化，并產(chǎn)生用于將所述盒插入到ptsG的MfeJ位點(diǎn)所期望的片段(ClaI的1.95和1.05kb，和Agel的2.3和0.7kb)。
利用與上述相同的方案從接近野生型E.coli K12菌株C600得到了另一株包含所述三種敲除的菌株APP 404。
從如上討論的本發(fā)明人的在前研究(美國(guó)專利號(hào)6,159,738，和Chatteijee等)已經(jīng)知道所述敲除的定位。利用具有抗性標(biāo)記的敲除基因的拷貝引入所述敲除用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞。通過(guò)宿主酶使同源重組容易發(fā)生。然后選擇含有所述標(biāo)記的染色體。這樣引入ptsG敲除。經(jīng)由PCR，在前面通過(guò)參考結(jié)合的Chatteijee等中詳述了它插入的證據(jù)。
生長(zhǎng)詳請(qǐng)由本發(fā)明人生產(chǎn)的三重突變體生物不是專性厭氧菌。因而，生物量的初始累積可以需氧地發(fā)生，其后建立發(fā)酵條件。這個(gè)兩階段方法(即，需氧的-然后厭氧的)方案的優(yōu)點(diǎn)圖解于圖2中，其中相比圖1的單階段厭氧方案生長(zhǎng)曲線，琥珀酸生產(chǎn)率更大。
一般地，當(dāng)生物量達(dá)到約等于108至1011細(xì)胞/毫升(或者約2至5克細(xì)胞干重/升)的點(diǎn)時(shí)，使發(fā)酵罐成為厭氧的。在實(shí)驗(yàn)室中，在大約6小時(shí)后達(dá)到這個(gè)濃度點(diǎn)。
在工業(yè)方案中，用輕質(zhì)浸泡水加上木質(zhì)纖維水解產(chǎn)物填充發(fā)酵罐。如必要以下列濃度包括抗生素100μg羧芐青霉素/ml、30μg卡那霉素/ml、10μg四環(huán)素/ml和30μg氯霉素/ml。豐富液體培養(yǎng)基含有(/升)，10g胰蛋白胨、5g的NaCl和1g酵母提取物。用于平板的固體培養(yǎng)基含有1.5％(重量/體積)的Difco Bacto-Agar。如Vogel，H.J.1956 Acetylornithinasein E.coli，.Biol.Chem.21897-103中所描述制備基本培養(yǎng)基E，并且通過(guò)參考結(jié)合于此。
發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)室條件如下在含有10ml用0.5g的MgCO3(為了在發(fā)酵過(guò)程中維持培養(yǎng)基的pH而加入)、抗生素和大約10g/L葡萄糖補(bǔ)加的LB培養(yǎng)基的密閉血清試管中進(jìn)行發(fā)酵生長(zhǎng)。可以利用多種生長(zhǎng)底物，包括但不限于糖類(lèi)、糖醇類(lèi)、糖酸類(lèi)和它們的組合。在厭氧生長(zhǎng)中下列糖以5g/L的濃度代替葡萄糖進(jìn)行試驗(yàn)海藻糖、甘露糖、果糖、山梨糖醇和葡糖醛酸。
通過(guò)在補(bǔ)加抗生素的LB培養(yǎng)基中需氧培養(yǎng)過(guò)夜而制備厭氧液體培養(yǎng)的接種體。將過(guò)夜培養(yǎng)物的樣品在新鮮培養(yǎng)基中稀釋100倍并使其需氧生長(zhǎng)到A600約為1；用1ml接種體接種厭氧生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
在適當(dāng)時(shí)間從密閉的試管無(wú)氧取樣用于殘留的葡萄糖(或備選的糖底物)和形成的發(fā)酵產(chǎn)物的水平分析。對(duì)于固體培養(yǎng)基上的厭氧生長(zhǎng)，瓊脂平板在37℃接種在通過(guò)使用Gas-Pak產(chǎn)生的H2-CO2氣氛的厭氣瓶中。
β-半乳糖苷酶活性的平板測(cè)定(plate assay)用于檢驗(yàn)菌株中正常分解代謝產(chǎn)物抑制的存在。LB或培養(yǎng)基E-瓊脂是可以利用的數(shù)種培養(yǎng)基的兩種。培養(yǎng)基E-瓊脂是Vogel，H.J.，1956 Acetylornithase in E.coli，J.Biol.Chem 21897-103中使用和討論的基本營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基并且通過(guò)參考結(jié)合于此。在例舉的方案中，LB或培養(yǎng)基E-瓊脂是用4g/L葡萄糖、4g/L乳糖、3mg/L的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(Xgal)和抗生素補(bǔ)加的。這些培養(yǎng)基在上下文中稱為X-gal/葡萄糖瓊脂。藍(lán)色菌落的形成指示在葡萄糖存在下β-半乳糖苷酶的表達(dá)，原因在于沒(méi)有正常的分解代謝產(chǎn)物抑制。相反地，白色菌落的形成指示正常的分解代謝產(chǎn)物抑制存在，并因此不存在裂解二糖乳糖的酶。
本發(fā)明人也已經(jīng)設(shè)計(jì)了在連續(xù)過(guò)程中利用所述突變體的方法。在這個(gè)連續(xù)過(guò)程中，進(jìn)行了重復(fù)實(shí)驗(yàn)，其中在培養(yǎng)物已經(jīng)生產(chǎn)約50g/L琥珀酸后，將1毫升的混合物加入到含有LB培養(yǎng)基、葡萄糖和MgCO3的新鮮封入物(enclosure)。這個(gè)新的接種體繼續(xù)有效地生產(chǎn)琥珀酸。重復(fù)這個(gè)過(guò)程3-4次，在所有情況下導(dǎo)致琥珀酸的有效生產(chǎn)。
實(shí)施例1-利用工業(yè)水解產(chǎn)物的琥珀酸生產(chǎn)將APP 184置于含有來(lái)自稻草的真正水解產(chǎn)物的發(fā)酵罐中。例舉的水解產(chǎn)物是從Mission Viejo，CA的Arkenol Inc.經(jīng)由其濃酸水解方法在商業(yè)上制備和制造的。所述稻草培養(yǎng)基含有大約600g/L葡萄糖和169g/L木糖作為兩種主要糖組分，加上較少量的其它糖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以在表2和圖2中找到。
下面是基于AFP 184發(fā)酵方法的方案發(fā)酵培養(yǎng)基含有下列組分Difco酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L、(NH4)2SO42g/L、MgSO4-7H2O0.2g/L、NaCl 10g/L、K2HPO47g/L、KH2PO43g/L、Arkenol’s水解產(chǎn)物16.5mg/L和卡那霉素30mg/L。工業(yè)水解產(chǎn)物含有600g/L葡萄糖和169g/L木糖作為兩種主要糖組分，加上較少量的其它糖。含有除抗生素之外的全部組分的培養(yǎng)基在121℃高壓滅菌20分鐘。當(dāng)冷卻時(shí)加入卡那霉素。將這個(gè)培養(yǎng)基用于種子培養(yǎng)物燒瓶和1-升的發(fā)酵罐。對(duì)于接種物，將50mg培養(yǎng)基置于250-mg搖瓶中并用0.2mg保存在30％甘油中和-70℃下的AFP184儲(chǔ)用培養(yǎng)物接種。將所述搖瓶在37℃和250rpm的搖床中過(guò)夜(約16小時(shí))培養(yǎng)。然后將全部搖瓶含量用于接種維持在37℃的發(fā)酵罐。將發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基通氣以使所述生物快速生長(zhǎng)。六小時(shí)后當(dāng)達(dá)到所需的細(xì)胞量，進(jìn)行下列操作1.關(guān)閉空氣以運(yùn)用厭氧條件，其將引起琥珀酸的生產(chǎn)；2.將二氧化碳?xì)怏w以0.03mg/分鐘的速率鼓泡到培養(yǎng)基中；和3.向發(fā)酵罐中加入用水稀釋到總葡萄糖加上木糖的濃度為500g/L的含有Arkenol的水解產(chǎn)物的補(bǔ)料溶液而實(shí)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖濃度為50g/L。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，當(dāng)發(fā)酵罐中糖濃度低時(shí)，加入更多的補(bǔ)料為琥珀酸的生產(chǎn)提供充足的底物。當(dāng)細(xì)胞生產(chǎn)琥珀酸時(shí)，pH下降。通過(guò)經(jīng)由自動(dòng)pH控制器的操作加入1.5M Na2CO3溶液將其保持在pH6.5。每隔一段時(shí)間取樣并分析光密度、葡萄糖、木糖、琥珀酸、乙酸、乳酸和乙醇。
表2用含有異常ptsG、ldh和pfl的突變體從Arkenol生產(chǎn)琥珀酸、乙酸和乙醇
實(shí)施例2-從合成糖混合物生產(chǎn)琥珀酸利用AFP 184與合成糖原料的組合開(kāi)發(fā)了發(fā)酵方案?？梢栽趫D3中注意到，直到80小時(shí)琥珀酸鹽的生產(chǎn)是快速的，并且稍微達(dá)到穩(wěn)定水平，之后在大約140小時(shí)后達(dá)到最終的高水平為60g/L。
發(fā)酵培養(yǎng)基含有下列組分Difco酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L、(NH4)2SO42g/L、MgSO4-7H2O 0.2g/L、NaCl 10g/L、K2HPO47g/L、KH2PO43g/L、葡萄糖7.6g/L、木糖1.85g/L和卡那霉素30mg/L。含有除抗生素之外的全部組分的培養(yǎng)基在121℃高壓滅菌20分鐘。當(dāng)冷卻時(shí)加入卡那霉素。將這個(gè)培養(yǎng)基用于種子培養(yǎng)物燒瓶和1-升的發(fā)酵罐。對(duì)于接種物，將50mg培養(yǎng)基置于250-mg搖瓶中并用0.2mg保存在30％甘油中和-700℃下的AFP184儲(chǔ)用培養(yǎng)物接種。將所述搖瓶在370℃和250rpm的搖床中過(guò)夜(約16小時(shí))培養(yǎng)。然后將全部搖瓶含量用于接種維持在370℃的發(fā)酵罐。
將發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基通氣以使所述生物快速生長(zhǎng)。六小時(shí)后當(dāng)達(dá)到所需的細(xì)胞量，進(jìn)行下列操作1.關(guān)閉空氣以運(yùn)用厭氧條件，其將引起琥珀酸的生產(chǎn)；2.將二氧化碳?xì)怏w以0.03mg/分鐘的速率鼓泡到培養(yǎng)基中；和3.將含有400g/L葡萄糖和84g/L木糖的補(bǔ)料溶液加入到發(fā)酵罐中而實(shí)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖濃度為50g/L。
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，當(dāng)發(fā)酵罐中糖濃度低時(shí)，加入更多的補(bǔ)料為琥珀酸的生產(chǎn)提供充足的底物。當(dāng)細(xì)胞生產(chǎn)琥珀酸時(shí)，pH下降。通過(guò)經(jīng)由自動(dòng)pH控制器的作用加入1.5M Na2CO3溶液將其保持在pH6.5。每隔一段時(shí)間取樣并分析光密度、葡萄糖、木糖、琥珀酸、乙酸、乳酸和乙醇。
以下，表3和圖3圖解了由所述合成糖混合物的利用而引起的琥珀酸生產(chǎn)。
在實(shí)施例1和實(shí)施例2的比較中可以注意到，當(dāng)使用工業(yè)水解產(chǎn)物時(shí)相比使用合成原料時(shí)，所述突變體的琥珀酸鹽生產(chǎn)是相等的(分別參見(jiàn)表2和表3的時(shí)間點(diǎn)120和122)。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明了本發(fā)明方案的魯棒性，因?yàn)楣I(yè)級(jí)水解產(chǎn)物固有的任何有毒原料不降低收率。
表3利用合成糖的發(fā)酵方案中的琥珀酸生產(chǎn)
雖然根據(jù)圖解實(shí)施方案的細(xì)節(jié)已描述了本發(fā)明，但是這些細(xì)節(jié)無(wú)意限制后附權(quán)利要求中所限定的本發(fā)明的范圍。
PCT/RO/134表的中文譯文PCT/US2004/0l3605
涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細(xì)則13bis)
PCT/RO/134表的中文譯文PCT/US2004/013605
涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細(xì)則13bis)
PCT/RO/134表的中文譯文PCT/US2004/013605
涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細(xì)則13bis)
權(quán)利要求
1.一種從工業(yè)級(jí)水解產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸的方法，該方法包含a)提供含有基因ptsG、pflB、和ldhA突變的生物；b)容許所述生物累積生物量；和c)容許所述生物代謝所述水解產(chǎn)物。
2.如權(quán)利要求1中所述方法，其中所述生物是來(lái)自選自由大腸桿菌(Escherichia.coli)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、歐文氏菌(Erwinia)和乳桿菌(Lactobacillus)組成的組的屬。
3.如權(quán)利要求1中所述方法，其中所述生物量累積到大約108至1011細(xì)胞/毫升之間。
4.如權(quán)利要求1中所述方法，其中所述工業(yè)級(jí)水解產(chǎn)物是木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物或玉米來(lái)源的糖溶液。
5.如權(quán)利要求1中所述方法，其中所述溫度在約25℃和45℃之間選擇。
6.如權(quán)利要求1中所述方法，其中所述生物量在需氧氣氛下累積。
7.如權(quán)利要求1中所述方法，其中所述pH在約5和9之間選擇。
8.如權(quán)利要求1中所述方法，其中所述水解產(chǎn)物是以第一原料量包含的并且所述方法在外加第二原料量的情況下被制成連續(xù)的。
9.如權(quán)利要求1中所述方法，其中當(dāng)琥珀酸濃度大約是50g/L時(shí)加入所述第二原料量。
10.一種細(xì)菌突變體，其特征在于它從工業(yè)級(jí)水解產(chǎn)物中含有的底物生產(chǎn)琥珀酸，琥珀酸對(duì)底物的比例在0.6∶1和1.3∶1之間。
11.如權(quán)利要求10中所述突變體，其中所述底物是選自由葡萄糖、乳糖、山梨糖醇、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡糖醛酸、半乳糖、果糖或它們的組合組成的組的糖。
12.如權(quán)利要求10中所述突變體，其中所述突變體含有無(wú)效的磷酸轉(zhuǎn)移酶體系、無(wú)效的丙酮酸甲酸裂合酶體系和無(wú)效的乳酸脫氫酶體系。
13.如權(quán)利要求12中所述突變體，其中所述無(wú)效的磷酸轉(zhuǎn)移酶體系是點(diǎn)突變的結(jié)果。
14.如權(quán)利要求10中所述突變體，其中所述突變體同時(shí)利用一種以上的底物同時(shí)生產(chǎn)琥珀酸。
全文摘要
一種從工業(yè)級(jí)水解產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸的方法，使用含有基因ptsG、pflB、和ldhA突變的生物并且使所述生物能夠累積生物量，并且使所述生物能夠代謝所述水解產(chǎn)物。細(xì)菌突變體從工業(yè)級(jí)水解產(chǎn)物中含有的底物生產(chǎn)琥珀酸，琥珀酸對(duì)底物的比例在0.6∶1和1.3∶1之間。
文檔編號(hào)C12P7/64GK101018866SQ200480043506
公開(kāi)日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2004年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月3日
發(fā)明者N·P·恩吉埃姆, M·唐納利, C·Y·圣維利－米勒德 申請(qǐng)人:Ut巴特勒有限公司, 尤芝加哥阿爾貢有限公司