專利名稱：突變微生物和利用該類微生物合成肽的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及突變微生物和利用該類微生物合成肽的方法、具體而言、涉及可以高效地合成肽的突變微生物和利用所述微生物合成肽的方法。
背景技術：
肽已廣泛應用于醫(yī)藥、食品等領域。例如，與L-谷氨酰胺相比，L-丙氨酰-谷氨酰胺的穩(wěn)定性和水溶性高、因而廣泛地作為輸液和無血清培養(yǎng)基成分使用。
目前已知的肽制造方法通常是化學合成法，但該方法不能完全滿足簡單、高效的要求。
此外，還開發(fā)了利用酶來合成肽的方法。但是，以前的利用酶來合成肽的方法，由于肽的合成速度極慢、生成的肽的回收率低等原因存在改善余地。。在這樣的背景下，人們期待著開發(fā)一種可以在工業(yè)上高效地生產肽的方法。
作為利用微生物高效生產目的產物的方法，有通過構建破壞以產物為底物的酶的基因的突變株和利用該突變株來生產目的產物的方法。(例如專利文獻1)。
專利文獻1特開2003-189863。

發(fā)明內容
發(fā)明解決的問題如果不適當地破壞從出發(fā)物質到產物間的反應體系中相關的、作為促使生成副產物的因子以及能分解產物的因子的酶，則通過制備破壞菌株進行生產的方法因為回收率低不能進行有效地生產。
但是，利用微生物的反應體系有很多復雜的情況，根據原料、目的產物、利用來生產的微生物種類等條件、也不易發(fā)現適宜被破壞的基因。
基于上述情況，本發(fā)明提供了利用破壞株進行高效肽合成的方法。
解決上述問題的手段為了解決上述問題發(fā)明人銳意研究，發(fā)現了利用微生物來高效的生產肽時應破壞掉的基因，由此完成了本發(fā)明。
即本發(fā)明提供了下述的突變微生物、突變微生物的構建方法和肽的制造方法。
一種突變微生物，其染色體上的一種或兩種以上基因被破壞，所述基因選自編碼氨?；M氨酸二肽酶、亮氨酰氨肽酶、異天冬氨酰二肽酶的基因。
[1]中所述的微生物，其染色體上編碼α-天冬氨酰二肽酶的基因被破壞。
[1]或[2]所述的微生物，其中所述的細菌是埃希氏菌屬的細菌。
一種微生物，其染色體上的基因被破壞，所述基因選自編碼氨?；M氨酸二肽酶的基因、編碼亮氨酰氨肽酶的基因、編碼異天冬氨酰氨肽酶的基因中的一種或兩種以上；并且所述微生物被含有編碼具有肽合成活性的蛋白的多核苷酸的重組DNA轉化。
[4]中所述的微生物，其染色體上編碼α-天冬氨酰二肽酶的基因被破壞。
[4]或[5]中所述的微生物，其中，所述的微生物是埃希氏菌屬的細菌。
[4]至[6]中任意一項所述的微生物，其中所述的具有肽合成活性的蛋白是來自穩(wěn)桿菌屬或鞘氨醇桿菌屬的細菌的蛋白質。
[4]至[6]中任意一項所述的微生物，其中所述的具有肽合成活性的蛋白是下述(A)或(B)中所示的蛋白質(A)具有SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列的蛋白質(B)具有在SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列中引入了一個或幾個氨基酸取代、缺失、插入、附加、和/或倒位所得的氨基酸序列，并且具有肽合成活性的蛋白質。
[4]至[6]中任意一項所述的微生物，其中所述的具有肽合成活性的蛋白是下述(C)或(D)所示的蛋白質(C)具有SEQ ID NO 20所示的氨基酸序列的蛋白質(D)具有在SEQ ID NO 20的氨基酸序列中引入一個或幾個氨基酸取代、缺失、插入、附加、和/或倒位所得的氨基酸序列，并且具有肽合成活性的蛋白質。
一種微生物的制備方法，所述微生物染色體上的基因被破壞，所述基因選自編碼氨?；M氨酸二肽酶的基因、編碼亮氨酰氨肽酶的基因、編碼異天冬氨酰氨肽酶的基因中的一種或兩種以上。
[10]中所述的微生物的制備方法，其中所述微生物染色體上編碼α-天冬氨酰二肽酶的基因被破壞。
一種微生物的制備方法，其中，所述微生物染色體上的基因被破壞，所述基因選自編碼氨?；M氨酸二肽酶的基因、編碼亮氨酰氨肽酶的基因、編碼異天冬氨酰氨肽酶的基因中的一種或兩種以上；并且所述微生物被含有編碼具有肽合成活性的蛋白的多核苷酸的重組DNA轉化。
[12]中所述的微生物的制備方法，其中所述微生物染色體上編碼α-天冬氨酰二肽酶的基因被破壞。
一種肽的制備方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，將所培養(yǎng)的微生物和所述微生物的細胞破碎物中的至少一種與羧基組分和胺組分混合來合成肽，所述微生物染色體上的基因被破壞，所述基因選自編碼氨酰基組氨酸二肽酶的基因、編碼亮氨酰氨肽酶的基因、編碼異天冬氨酰氨肽酶的基因中的一種或兩種以上；并且所述微生物被含有編碼具有肽合成活性的蛋白的多核苷酸的重組DNA轉化。
[14]中所述的肽的制備方法，其中所述的微生物是染色體上編碼α-天冬氨酰二肽酶的基因被破壞的微生物。
發(fā)明的效果本發(fā)明提供了高效的肽的制造方法。
本發(fā)明的最佳實施方案以下的實施方案是對本發(fā)明的最佳實施方案的說明。下述各種基因工程實驗技術記載在分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)、細胞遺傳學手冊，黑木登志夫等編，羊土社(1992)、新基因工程學手冊修訂第3版，村松等編，羊土社(1999)等多種標準實驗手冊中，這些文獻的內容引入本發(fā)明的說明書中。
1本發(fā)明的突變微生物及其制備方法本發(fā)明中的突變微生物是已將妨礙肽高效合成的基因破壞的微生物。被破壞的基因是存在于染色體上的編碼氨?；M氨酸二肽酶(以下稱作“pepD基因”)的基因、編碼亮氨酰氨肽酶(以下稱作“pepA”基因)的基因、異天冬氨酰二肽酶(以下稱作iadA基因)的基因。可以破壞這些基因中的一個或多個。
并且，與存在于染色體上的α-天冬氨酰二肽酶基因(以下稱為pepE基因)被破壞的突變株相比，本發(fā)明提供的突變株顯示為一種更優(yōu)選的方式。
使用選至上述中的一個或多個基因被破壞的突變株、可以比使用這些基因能表達的微生物更高效的合成肽。達到高效的合成肽的目的，主要是由于上述操作可以使作為產物的肽的分解活性降低以至于消失。
本說明書中所述的基因，是遺傳信息的載體，例如其包含編碼蛋白質的堿基序列的多核苷酸。
本說明書中所述的將基因破壞是指，使蛋白等基因產物的表達受抑制或不表達。更具體地，是指通過使編碼對作為目的產物的肽有分解活性的肽酶的基因發(fā)生突變，和使該基因發(fā)生缺失等手段破壞該基因。基因破壞的具體方法在下述內容中進行詳細說明。
本說明書中所述的“肽”指含有肽鍵的多聚體，即所謂的二肽、三肽、寡肽等多肽。
本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案是在這些基因中至少pepD基因被破壞。因為pepD基因被破壞，肽合成效率大幅改善，特別是在天冬氨酰苯基丙氨酸、丙氨酰谷氨酰胺的生產中極其有效。此外，本發(fā)明一個更優(yōu)選的實施方式是pepD基因、pepA基因、iadA基因、pepE基因全部被破壞。在四個基因全部被破壞的情況下，在合成各種肽時，可以最大限度地抑制最終合成的肽的分解消失。
本發(fā)明對微生物種類沒有特別的限定，只要其能合成肽即可。本說明書所涉及的微生物包括真核微生物、原核微生物以及病毒等。從適合于工業(yè)生產的觀點來，優(yōu)選便于操作的細菌等，更優(yōu)選腸桿菌，特別優(yōu)選例如以大腸桿菌為代表的埃希氏屬的細菌。
基因破壞株的制備方法以微生物中的丙氨酰谷氨酰胺以及天冬氨酰苯基丙氨酸分解活性降低以至消失為例來具體說明。通過使編碼細胞內作用于丙氨酰谷氨酰胺和天冬氨酰苯基丙氨酸以及它們的衍生物的肽酶的基因突變或者缺失，使上述肽酶的分解活性降低以至消失，從而實現丙氨酰谷氨酰胺以及天冬氨酰苯基丙氨酸分解活性降低以至消失。肽酶基因失活可以是由紫外線照射和亞硝基呱誘變處理、位點特異性誘變、同源重組及/或稱為[Red-driven整合]的插入-缺失誘變(Datsenko K.A.and Wanner B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，Vol 97(12)p6640-45)等通常的基因破壞方法來實行。
分解丙氨酰谷氨酰胺和天冬氨酰苯基丙氨酸以及它們的衍生物的肽酶是pepD基因編碼的氨酰基組氨酸二肽酶、pepE基因編碼的α-天冬酰氨二肽酶、pepA基因編碼的亮氨酰氨肽酶、以及iadA基因編碼的異天冬氨酰二肽酶。已知pepD基因、pepE基因、pepA基因以及iadA基因存在于，例如大腸桿菌中。(pepD基因，J.Bacteriol.172(8)，4641-4651(1990)、pepE基因，JP-A-2003-189863、pepA基因，J.Mol.Biol.2000 Sep 15；302(2)411-26、iadA基因，J.Biol.Chem.1995 Feb 24；270(8)4076-87)。各肽酶基因的缺失突變株可以通過包含各基因的一部分的DNA片段與微生物染色體上各基因間發(fā)生同源重組而獲得的。
具體而言，例如用其中含有因肽酶基因的一部分缺失，不能產生行使正常功能的肽酶的缺失型肽酶基因的DNA轉化，例如大腸桿菌，誘導缺失型肽酶基因和染色體上的肽酶基因間發(fā)生同源重組，由此使染色體上的肽酶基因變?yōu)槿笔碗拿富?。通過同源重組引起的基因缺失的技術已經確立，例如可以使用線性DNA以及含有溫度敏感的復制起點的質粒及/或稱為[Red-driven整合]的插入-缺失誘變使基因缺失。以下說明使用含有溫度敏感的復制起點的質粒的方法以及稱為[Red-driven整合]的插入-缺失誘變的方法。
大腸桿菌的各肽酶基因pepD基因、pepE基因、pepA基因以及iadA基因在國際堿基序列數據庫DDBJ/EMBL/GeneBank登陸的索引號分別是AE000132、AE000475、AE000496、AE000503?；谶@些堿基序列合成引物以埃希氏屬菌，例如大腸桿菌W3110等的染色體DNA為模板進行PCR(PCRpolymerase chain reaction；White，T.J.等.，Trends Genet.，5，18，5，1998)擴增，就可能獲得各基因的片斷。
以所得的肽酶基因為材料，構建包含因基因內部缺失不能產生正常功能的肽酶的改變型的基因(缺失型肽酶基因)的DNA。用這樣的缺失型肽酶基因去置換染色體上的肽酶基因可通過如下的方式進行。即制備插入有溫度敏感的復制起點、突變的肽酶基因、氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素等抗生素抗性的標記基因的重組DNA，用這樣的重組DNA轉化微生物，在使溫度敏感的復制起點不起作用的溫度下培養(yǎng)株轉化子后，在含有抗生素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，就可以獲得重組DNA交換染色體DNA的重組子。
所述染色體上整合有重組DNA菌株的正常肽酶基因被置換，由2個融合基因偶聯的位于染色體上的肽酶基因和缺失型肽酶基因之間，包含有重組DNA的其它部分(載體部分、溫度敏感的復制起點以及抗性標記基因)。然后，由于在這種狀態(tài)下，正常的肽酶基因處于顯性而在轉化子里能表達。
此后，通過2個肽酶基因的重組使1個拷貝的肽酶、和載體部分(包括溫度敏感的復制起點以及抗性標記基因)從染色體上脫落下來，由此在染色體上僅殘留有缺失型肽酶基因。正常的肽酶基因留在染色體上、缺失型肽酶基因被切除的情況，反之，缺失型肽酶基因留在染色體上、正常的肽酶基因被切除的情況均可能發(fā)生。無論哪種情況，在溫度敏感的復制起點有功能的溫度下培養(yǎng)時，切除下來的DNA以質粒的形式保持在細胞內。在溫度敏感的復制起點喪失功能的溫度下培養(yǎng)時，在缺失型肽酶基因殘留在染色體上，含有正常的肽酶基因的質粒從細胞內脫落的情況下，肽酶活性降低以至于消失。在正常型肽酶基因殘留在染色體上的情況下，細胞顯示有肽酶活性。從侯選菌株的染色體DNA中通過PCR擴增肽酶基因片斷，利用限制性內切酶分析來確證肽酶基因是否為缺失，由此篩選目的菌株。
目標肽酶基因也可以通過Red-driven整合法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，Vol 97(12)p6640-6645)缺失。即參考文獻的方法，設計分別與肽酶基因以及模板質粒上的抗性標記基因附近區(qū)域互補的引物。比如，肽酶基因以及模板質粒上的氯霉素抗性基因的各相臨區(qū)域，分別使用互補的引物，以質粒pACYC184(NBL Gene SciencesLtd，英國產。GenBank/EMBL索引號X06403)為模板進行PCR。制備在缺失的肽酶基因內部插入有氯霉素抗性基因的基因。得到的PCR產物用瓊脂糖凝膠純化。電穿孔轉化包含具有復制溫度敏感特性的質粒pKD46的大腸桿菌。質粒pKD46(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，Vol 97(12)p6640-6645)含有阿拉伯糖誘導的受ParaB啟動子調控的λRed同源重組系統(tǒng)的基因(λ、β、exo基因)、即含有2154堿基長度的λ噬菌體DNA片斷(GenBank/EMBL索引號J02459，第31088～第33241)。質粒pKD46是PCR產物重組到大腸桿菌染色體中所必需的。
電轉化用的感受態(tài)細胞按如下方法制備。大腸桿菌在含有100mg/氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)過夜。用5ml含有氨芐青霉素和L-阿拉伯糖(1mM)的SOB(分子克隆，第2版，Sambrook等，冷泉港出版社(1989))培養(yǎng)基100倍稀釋。所得稀釋物在30℃無通氣培養(yǎng)至OD600約0.6后，濃縮100倍，用冰冷的去離子水洗滌3次就可以用于電轉化。用70μL感受態(tài)細胞和約100ng PCR產物進行電轉化。在含氯霉素的L-瓊脂培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)后選擇氯霉素抗性的轉化子。通過插入-缺失突變可獲得肽酶基因缺失突變株。隨后，在含氯霉素的L-瓊脂培養(yǎng)基平板上，在42℃培養(yǎng)2代后，選擇氨芐青霉素抗性丟失的菌落就是消除了質粒pKD46的菌落。
這樣得到根據氯霉素抗性基因識別的肽酶缺失突變株。通過對侯選菌株的染色體DNA進行PCR，擴增含肽酶基因的片斷，再通過限制性內切酶分析來確證肽酶基因是否為缺失型，由此確認目的菌株。通過上述方法可以構建基因破壞株。
本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案可以獲得，利用含有編碼具有肽合成活性的蛋白的多核苷酸的重組DNA分子轉化通過上述方法構建的基因破壞株所得的重組微生物。更為優(yōu)選的實施方案是具有肽合成活性的蛋白是來源于短穩(wěn)桿菌屬和鞘氨醇桿菌屬的細菌的蛋白質。具體而言，優(yōu)選使用選至下述(A)～(D)蛋白的1種或2種以上。下述(A)～(D)蛋白有優(yōu)良的肽合成活性。并且下述(A)～(D)蛋白適宜合成天冬氨酰苯基丙氨酸、丙氨酰谷氨酰胺等肽。
(A)具有SEQ ID NO 14所示氨基酸序列中第23～616位的氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白質。
(B)包含在具有SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列中23～616位氨基酸殘基中的序列中一個或幾個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入、附加、和/或倒位的氨基酸序列，且具有肽合成活性的蛋白質。
(C)具有SEQ ID NO 20所示的氨基酸序列中第21～619位的氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白質。
(D)包含在具有SEQ ID NO 20所示的氨基酸序列中21～616位氨基酸殘基中的序列中一個或幾個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入、附加、和/或倒位的氨基酸序列，且具有肽合成活性的蛋白質。
SEQ ID NO 14記載的氨基酸全序列包含前導肽和成熟蛋白區(qū)域。1～22位氨基酸是前導肽，23～616位是成熟蛋白區(qū)域。
SEQ ID NO 20記載的氨基酸全序列包含前導肽和成熟蛋白區(qū)域。第1～20位氨基酸是前導肽，21～619位是成熟蛋白區(qū)域。
這里，“幾個”氨基酸殘基，在蛋白質的立體構造中，其位置和種類各不相同。這些氨基酸殘基位于對蛋白質的立體構造中與活性沒有大的損傷的范圍內。具體說來，是2～50個，優(yōu)選2～30個，更優(yōu)選2～10個。但是，在(B)和(D)所述蛋白的氨基酸序列包含一個或幾個氨基酸被取代、缺失、插入、附加、和/或倒位的氨基酸序列情況下，希望在50℃、pH8條件下，具有非突變的蛋白質的一半以上、優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上的酶活性。以(B)情況為例來說明，(B)含序列表SEQ ID NO 6的氨基酸序列中一個或幾個氨基酸被取代、缺失、插入、附加、和/或倒位的氨基酸序列情況下，在50℃、pH8條件下，期望具有序列表SEQ ID NO 6的氨基酸序列的蛋白質的一半以上、優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上的酶活性。
上述(B)所示氨基酸變異、是通過如位點特異性誘變法使該酶基因的特定部位的氨基酸被取代、缺失、插入、附加使氨基酸序列發(fā)生改變所得的。并且，上述含有改變的堿基序列多聚核苷酸以前也可以由誘變處理得到。誘變處理方法，例如用羥胺等對編碼(A)以及(C)的DNA進行體外處理的方法，以及對帶有(A)以及(C)的埃希氏菌屬細菌用紫外線或亞硝基呱及亞硝酸等常用人工誘變的誘變劑處理。
上述堿基發(fā)生取代、缺失、插入、附加、和/或倒位時，由于微生物的種以及菌株的差異，也包含有自發(fā)的突變。含有上述突變的DNA在適當的細胞里表達來研究表達產物的活性時，可以得到和編碼序列表中SEQ ID NO 14以及SEQ ID NO 20的蛋白質基本上同一的蛋白質的DNA。
上述(A)蛋白質含有氨基酸序列，例如可以是由序列SEQ ID NO13所示的堿基序列編碼的。SEQ ID NO 13中第61～1908位的堿基序列組成的DNA是從短穩(wěn)桿菌(Empedobacter brevis)FERM BP-8113株(保藏單位獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所，國際專利微生物保藏中心，保藏單位地址日本茨城縣筑波市東1-1-1，中央第6，國際保藏移管日，2002年7月8日)分離來的。
SEQ ID NO 13中第61～1908位堿基序列組成的DNA是編碼序列部分(CDS)。堿基編號61～1908的堿基序列包括信號肽序列部分和成熟蛋白質序列部分。堿基編號61～126的堿基序列是信號肽序列部分，堿基編號127～1908的堿基序列是成熟蛋白質序列部分。即，本發(fā)明提供帶有信號肽的肽酶蛋白質基因和作為成熟蛋白質的肽酶蛋白質基因。SEQ ID NO 13中記載的序列包括信號序列屬于前導序列類。推定前導序列編碼的前導肽的主要功能與從細胞內向細胞外分泌相關。堿基編號127～1908編碼的蛋白質、即除了前導肽外的其余部分是成熟蛋白質，推定其顯示高的肽合成活性。
上述(C)蛋白質含有氨基酸序列，例如可以是由序列SEQ ID NO19的堿基序列編碼的。SEQ ID NO 19中第61～1917位的堿基序列是從鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium sp)FERM BP-8124株(保藏單位獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所，國際專利微生物保藏中心，保藏單位地址日本茨城縣筑波市東1-1-1，中央第6，國際保藏移管日，2002年7月22日)分離來的。SEQ ID NO 11中第61～1917位的堿基序列是編碼序列部分(CDS)。
第61～1917位的堿基序列包括信號肽序列部分和成熟蛋白質序列部分。堿基編號61～120的堿基序列是信號肽序列部分，堿基編號127～1917的堿基序列是成熟蛋白質序列部分。即，本發(fā)明提供帶有信號肽的肽酶蛋白質基因和作為成熟蛋白質的肽酶蛋白質基因。SEQ IDNO 19中記載的序列包括信號序列屬于前導序列類。推定前導序列編碼的前導肽的主要功能與從細胞內向細胞外分泌相關。堿基編號127～1917編碼的蛋白質、即除了前導肽外的其余部分是成熟蛋白質，推定其顯示高的肽合成活性。
SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 19的DNA序列是分別從短穩(wěn)桿菌和鞘氨醇桿菌的染色體DNA中或DNA文庫中通過PCR(polymerase chainreaction；White，T.J.等.，Trends Genet.，5，18，5，1998)或雜交獲得的。PCR使用的引物，可以根據例如基于提純的有肽酶活性的蛋白質的已被測定的內部氨基酸序列來設計的?？梢愿鶕EQ ID NO13和SEQ ID NO 19的DNA序列來設計引物和雜交用的探針，也可以使用探針分離上述DNA序列。作為PCR用的引物，可以含有對應于5’非翻譯區(qū)域和3’非翻譯區(qū)域的序列的引物擴增本蛋白的全長編碼區(qū)域。例如擴增SEQ ID NO 13記載的編碼包括前導肽序列和成熟蛋白質區(qū)域的情況下，作為5’引物，可以是具有SEQ ID NO 13中第61位堿基上游區(qū)域中的序列的引物，作為3’引物，例如可以是具有與第1908位下游區(qū)域的堿基互補序列的引物。
引物合成采用Applied Biosystems公司的380B型DNA合成儀，用ホスホアミダイト法(參考Tetrahedron Letters(1981)，22，1859)來合成。PCR反應使用Gene Amp PCR System 9600(PERKIN ELMER公司產)及TaKaRa LA PCR體外克隆試劑盒(寶酒造公司產)，實驗按照生產廠商設定的方法進行。
此外，SEQ ID NO 13所示的DNA堿基序列中，無論其是否含有前導肽均含有與序列表中SEQ ID NO 13所述CDS的DNA基本上同一的DNA。和SEQ ID NO 13所述CDS的DNA基本上同一的DNA可以通過下述方式獲得，即從含有突變的編碼該酶的DNA或含有該突變DNA的細胞中，分離可與由含SEQ ID NO 13所示的CDS互補的堿基序列或由該堿基序列制備的探針在嚴緊條件下雜交，且編碼具有肽酶合成活性的蛋白質的DNA。
此外，SEQ ID NO 19所示的DNA堿基序列中，無論其是否含有前導肽均含有與序列表中SEQ ID NO 19所述CDS的DNA基本上同一的DNA。和SEQ ID NO 19所述CDS的DNA基本上同一的DNA可以通過下述方式獲得，即從含有突變的編碼該酶的DNA或含有該突變DNA的細胞中，分離可與由含SEQ ID NO 19所示的CDS互補的堿基序列或由該堿基序列制備的探針在嚴緊條件下雜交，且編碼具有肽酶合成活性的蛋白質的DNA。
例如根據SEQ ID NO 19的DNA堿基序列按常規(guī)方法制備探針。用探針釣能和該探針雜交的DNA，以及靶DNA的分離方法都可以按照常規(guī)的方法進行。關于DNA探針的制備可以通過如下方式進行，例如擴增克隆于質粒、噬菌體載體的堿基序列，再用限制性內切酶切出用作探針的堿基序列。酶切位點根據目的DNA進行調整。
嚴謹條件即所謂可以形成特異性雜交，而不形成非特異性雜交的條件。該條件很難明確的數值化。舉例來說，同源性高的DNA之間，比如50％以上、優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上同源性的DNA之間雜交、同源性低的DNA之間不雜交的條件。或使用通常Southern雜交的洗滌條件60℃、1XSSC、0.1％SDS，優(yōu)選0.1XSSC、0.1％SDS條件下的鹽濃度。在該條件下雜交的基因中包括基因內有終止密碼、活性中心發(fā)生突變而喪失活性的基因，但使用市售的表達載體和適當的表達宿主，用后述方法測定表達產物的酶活性可容易地將其排除。
但是，上述嚴緊條件下可雜交的堿基序列中，期望在50℃、pH8條件下，上述堿基序列所編碼的蛋白質具有相當于含有原堿基序列編碼的氨基酸序列的蛋白質一半以上、優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上的酶活性。例如，以含有可以和下述堿基序列在嚴謹條件下雜交的堿基序列為例進行說明，所述堿基序列是與序列表中SEQ ID NO 9所示DNA堿基序列中第127～1908位堿基序列互補的DNA堿基序列。即，在50℃、pH8條件下，保有含序列表中SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列中第23～616位氨基酸序列的蛋白質大約一半以上、優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上的酶活性。
下面以示例的方式說明能表達上述(A)以及(C)的蛋白質的微生物轉化子的構建方法。對于能表達上述(A)以及(C)的蛋白質的轉化子，可以將含有SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 19的DNA堿基序列，導入適當的宿主，通過表達生成有肽酶活性的蛋白質。
使含有SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 19的DNA堿基序列編碼的蛋白質表達的適宜宿主可以是例如大腸桿菌等埃希氏菌屬的細菌，穩(wěn)桿菌屬，鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)，以及黃桿菌屬(Flavobacterium)以及枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等原核細胞、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、畢赤氏酵母(Pichiastipitis)、米曲霉(Aspergillus oryzae)等真核細胞。
通過將DNA以其可表達的形式插入到根據用于表達宿主種類所選擇的載體中制備用于將含有SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 19堿基序列的DNA導入宿主的重組DNA。作為使蛋白表達的啟動子，可以使用短穩(wěn)桿菌所固有的肽酶合成基因的啟動子，只要其能在宿主細胞中行使功能即可。此外，根據需要也可以將在宿主中有功能的其它啟動子連接到SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 19的DNA上，控制所述DNA的表達。
將重組DNA導入宿主細胞的轉化方法采用D.M.Morrison(酶學方法68，326(1979))用氯化鈣處理受體菌提高DNA通透性的方法(Mandel，M.and Higa，A.，J.M1.Biol.，53，159(1970))。
應用重組DNA技術來大量生產蛋白時，該蛋白會在生產該蛋白的轉化子里聚集，形成蛋白質包涵體也可以作為優(yōu)選實施方案。該表達方法在生產上的有利點是可保護靶蛋白存在于菌體里不被蛋白酶消化以及可以通過菌體破碎和后繼的離心分離操作而簡單的純化靶蛋白。
蛋白質包涵體可用蛋白質變性劑溶解、再通過去除主要的蛋白質變性劑的蛋白復性處理，可變換成正確折疊的有生理活性的蛋白。例如，參見白介素-2的復性(特開昭61-257931)等。
蛋白質包涵體轉變成有活性的蛋白必須經過可溶化、復性等一系列必要步驟、比直接生產有活性的蛋白的操作煩雜。但是，當需要在菌體內大量合成影響菌體生長的蛋白時，使所述蛋白在菌體內以非活性的包涵體的形式積累可以抑制這種的影響。
作為大量生產靶蛋白質包涵體的方法，已知除了有在強啟動子控制下，單獨表達靶蛋白質的方法外、還有與已知可以大量表達的蛋白質形成融合蛋白的表達方法。
下面以制備經轉化的大腸桿菌，隨后使用該大腸桿菌制備肽合成酶的方法為例具體說明。以大腸桿菌等微生物來合成肽酶時，作為編碼蛋白質的序列，可以結合編碼包含前導肽的蛋白質前體的DNA，也可以只結合不包含前導肽的成熟蛋白質區(qū)域，所述表達方法可以根據制備條件、形態(tài)、使用條件等進行適宜的選擇。
作為使編碼有肽酶活性的蛋白的DNA表達的啟動子，可以使用在大腸桿菌來合成異源蛋白質時通常使用的啟動子，例如T7啟動子、lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、tac啟動子、λ噬菌體PR啟動子、PL啟動子等強啟動子。此外，作為載體，可以使用pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等等。也可以使用其它的噬菌體DNA為載體。此外，也可以使用含有啟動子和插入DNA序列的表達載體。
為了得到肽酶合成酶的融合蛋白包涵體，優(yōu)選在肽酶合成酶基因的上游或下游連接其它蛋白質，優(yōu)選編碼親水性的肽的基因，形成融合蛋白。最好是能增加融合蛋白的積累、在變性、復性步驟后能提高融合蛋白溶解性的編碼其它蛋白的基因。例如，T7基因10、β-半乳糖苷酶基因、脫氫葉酸還原酶基因(dehydrofolate reductase)γ-干擾素基因、IL-2基因、凝乳酶原基因等。
上述基因和編碼肽酶合成酶的基因連接時，為了使密碼子閱讀框一致，可以適當地選擇的限制性內切酶的位點連接，或使用適當的序列合成DNA。
并且為了增加產量，優(yōu)選在融合蛋白的下游連接使翻譯終止的T7終止子、fd噬菌體終止子、T4終止子、四環(huán)素抗性基因終止子、大腸桿菌trpA基因終止子序列。
將編碼有肽合成活性的蛋白以及編碼具有肽合成活性的蛋白和其它蛋白的融合蛋白的基因導入大腸桿菌時所用的載體，優(yōu)選所謂多拷貝型，含有來源于ColE1復制起點的質粒。例如pUC和pBR322系列質粒及其衍生物。此處衍生物指實施了堿基的取代、缺失、插入、附加、和/或倒位等改變的質粒，這里的改變指經過誘變劑和紫外線誘變處理、也包含有自發(fā)突變。
為了篩選轉化子，優(yōu)選該載體上帶有氨芐青霉素等抗性標記基因。市售的帶有強啟動子的表達載體有pUC系列(寶酒造(株)產)、pPROK(Clonetech產)、pKK233-2(Clonetech產)等。
編碼含啟動子和肽酶合成活性的蛋白以及編碼有肽酶合成活性的蛋白和其它蛋白的融合蛋白的基因，根據不同情況還可以制備在載體上依次連接有終止子的重組DNA。
用該重組DNA轉化大腸桿菌，培養(yǎng)大腸桿菌可表達肽合成酶以及有肽酶合成活性的蛋白和其它蛋白的融合蛋白。轉化的宿主菌株可以使用通常用于表達異源基因的菌株，優(yōu)選大腸桿菌K12亞種JM109。轉化方法以及轉化子的篩選方法參見分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)。
表達融合蛋白時，優(yōu)選血液凝固因子Xa、激肽釋放酶等肽合成酶序列內不存在的序列作為識別序列的限制蛋白酶來切除出肽合成酶。
生產用的培養(yǎng)基使用培養(yǎng)大腸桿菌常用的M9-酪蛋白氨基酸培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基。根據使用的載體的標記基因、啟動子、宿主菌種類對應選擇合適的培養(yǎng)條件、生產的誘導條件。
用以下方法回收肽合成酶以及有肽酶合成活性的蛋白和其它蛋白的融合蛋白。肽合成酶以及有肽酶合成活性的蛋白和其它蛋白的融合蛋白能溶解在菌體中時，可在回收菌體后，破碎或溶菌后，使用所制備的粗酶液。如果必要，也可能使用常規(guī)的沉淀、過濾、柱層析來純化肽合成酶以及有肽酶合成活性的蛋白和其它蛋白的融合蛋白。這些情況下可利用肽合成酶以及有肽酶合成活性的蛋白和其它蛋白的融合蛋白的抗體。
蛋白形成包涵體的情況用變性劑使其溶解。菌體蛋白也隨之溶解，考慮到后續(xù)純化，優(yōu)選分離出包涵體后再使其溶解。從菌體中回收包涵體的方法可以采用熟知的方法，例如，破碎菌體離心分離回收包涵體。蛋白包涵體溶解變性試劑，例如胍基鹽酸(6M，pH5～8)尿素(8M)。
透析去除變性劑可再生出有活性的蛋白質。作為透析用的透析液，可以使用Tris鹽酸緩沖液或磷酸緩沖液等，濃度例如為20mM～0.5M，pH例如為5～8。
復性步驟的蛋白濃度優(yōu)選在500μg/ml或以下。為了抑制復性后的肽合成酶蛋白自交聯，透析溫度優(yōu)選5℃或以下。作為去除變性劑的方法除透析法之外，還可以使用稀釋法、超濾法等任何可以使活性再生的方法。
按上述轉化方法轉化pepD基因、pepA基因、iadA基因、pepE基因被破壞的微生物，可構建氨基酸酯轉肽酶高表達、丙氨酰谷氨酰胺和天冬氨酰苯基丙氨酸分解活性降低以至消失的微生物。
2.本發(fā)明的肽合成方法本發(fā)明的肽合成方法是利用上述的微生物等來合成肽。該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)被含有編碼具有肽合成活性的蛋白的多核苷酸的重組DNA轉化的微生物，，所述微生物染色體上選自編碼氨酰基組氨酸二肽酶的基因、編碼亮氨酰氨肽酶的基因、編碼異天冬氨酰氨肽酶的基因中的一種或兩種以上的基因被破壞，將所培養(yǎng)的微生物和所述微生物的細胞破碎物中的至少一種與羧基組分和胺組分混合來合成肽。更優(yōu)選的實施方式中，所述微生物是染色體上編碼α-天冬氨酰二肽酶的基因被破壞的微生物。
作為本發(fā)明使用的微生物作用于羧基組分和胺組分的方法，是把上述的微生物或微生物的細胞破碎物和羧基組分和胺組分混合。具體而言，可以是把所指定的微生物添加到含有羧基組分和胺組分的混合溶液中使之反應的方法。也可以是培養(yǎng)具有合成目的肽能力的微生物、微生物以及微生物的培養(yǎng)液中合成、積累該酶、向培養(yǎng)液中添加羧基組分和胺組分的方法。合成的肽，按常規(guī)方法回收，根據需要進行純化。
本發(fā)明所述微生物破碎物指微生物的細胞膜被破壞后得到的微生物的細胞內容物的混合物、除通過物理方法破壞細胞膜所得的物質之外，也可以含有用化學方法溶解細胞膜后所得的物質。
所用的微生物指本發(fā)明中所述基因被破壞后的微生物。用于肽合成的微生物，不僅限于微生物菌體，也可使用丙酮處理后的菌體、冷凍干燥菌體等菌體處理物。亦可使用經共價結合法、吸附法、包埋法等固定化的菌體及固定化菌體處理物。此外，經常存在與肽合成無關的，可分解所生成的肽的酶，此時優(yōu)選添加EDTA等金屬蛋白酶抑制劑。添加量在0.1mM至300mM的范圍，優(yōu)選1mM到100mM。
作為羧基組分可以是任一一種能和作為另一種底物的胺組分縮合成肽的物質。作為羧基組分可以是L-氨基酸酯、D-氨基酸酯、L-氨基酸酰胺、D-氨基酸酰胺以及沒有氨基的有機酸酯。并且，氨基酸酯不僅僅局限于天然氨基酸對應的氨基酸酯，也可以是例如相應于非天然氨基酸及其衍生物的氨基酸酯。作為氨基酸酯、除α-氨基酸酯外，因氨基酸基團位置的不同也可以是例如β-氨基酸酯、γ-氨基酸酯、ω-氨基酸酯。代表性的氨基酸酯是氨基酸的甲酯、乙酯、正丙酯、異丙酯、正丁酯、異丁酯、叔丁酯。
作為胺組分可以是能和作為另一種底物的羧基組分縮合成肽的任一物質。作為胺可以是例如L-氨基酸、C保護L-氨基酸、D-氨基酸、C保護D-氨基酸、胺。并且，胺不僅僅局限于天然胺，也可以是例如非天然胺及其衍生物。氨基酸也不僅僅局限于天然氨基酸，也可以是例如非天然氨基酸及其衍生物。除α-氨基酸外，因氨基位置的不同也可以是例如β-、γ-、ω-氨基酸等。
起始原料的羧基組分和胺組分分別在1mM～10M的范圍，優(yōu)選0.05M～2M。有時候最好添加與羧基組分等量以上的胺組分。并且，在高濃度基質對反應有抑制作用時，按對反應無抑制的濃度逐漸添加。
肽合成的可能溫度是0～60℃，優(yōu)選5～40℃。肽合成的可能pH是6.5～10.5，優(yōu)選pH是7.0～10.0。
實施例以下說明本方法的實施例，但本發(fā)明不僅限于此實施例。
實施例1各肽酶基因缺失菌株的天冬氨酰苯基丙氨酸分解活性的測定以下顯示的操作中大腸桿菌ATCC8739作為親株，該親株的氨?；M氨酸二肽酶(pepD)、異天冬氨酰二肽酶(idaA)、α-天冬氨酰二肽酶基因(pepE基因)、亮氨酰氨肽酶(pepA)被依次中斷，構建pepD基因缺失菌株、pepD iadA雙重缺失菌株，pepD iadA pepE三重缺失菌株、pepD iadA pepE pepA四重缺失菌株后測定了其天冬氨酰苯基丙氨酸分解活性。
(1)氨?；M氨酸二肽酶基因的(pepD基因)缺失基于在堿基序列數據庫(DDBJ/EMBL/GeneBank登陸的索引號分別是AE000132)里pepD基因的序列信息合成引物5’-GATCTGGCGCACTAAAAACC(序列號1)5’-GGGATGGCTTTTATCGAAGG(序列號2)利用該引物以大腸桿菌ATCC8739的染色體DNA為模板，PCR(94℃，1min、54℃，2min、72℃，3min、30個循環(huán))擴增SD-ATG和翻譯終止密碼間覆蓋的1.6Kbp基因區(qū)域。PCR產物用SureCloneLIgation Kit(Amersham Pharmacia Biotech)試劑盒連接到pUC18(寶酒造)載體的SmaI位點，構建了pUC18-pepD。該質粒轉化大腸桿菌JM109(寶酒造)感受態(tài)細胞后，在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板(胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、氯化鈉0.5％、瓊脂1.5％、pH7.0)培養(yǎng)。轉化子在含50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、氯化鈉0.5％、瓊脂1.5％)37℃培養(yǎng)16小時、收集菌體從轉化子中制備質粒。pUC18-pepD用NruI和HpaI(含有pepD基因的1.6Kbp插入片斷中的限制酶切位點)雙酶切后自連接。該連接混合物轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞后，從含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)出的轉化子制備質粒。這樣選擇的含有1.4Kbp插入片斷的質粒DNA為pUCΔpepD。該質粒DNA上連接的pepD基因缺失了NruI-HpaI區(qū)域，推測其編碼的酶沒有功能。
pUCΔpepD用EcoRI-SalI雙酶切，制備含缺失型pepD基因的1.4Kbp DNA片斷。該DNA片斷和含有溫度敏感復制起點(tsori)的同源交換載體pMAN997的EcoRI-SalI位點連接、構建了用于缺失pepD基因的pMANΔpepD。pMANΔpepD轉化大腸桿菌K12亞種JM109感受態(tài)細胞后，在含50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)16小時、收集菌體從轉化子里制備pMANΔpepD。
用于pepD基因缺失的質粒pMANΔpepD電轉化大腸桿菌ATCC8739后，涂布于含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板、30℃培養(yǎng)。(ATCC編號記載的菌株為美國標準培養(yǎng)物保藏中心，P.O.Box 1549 Manassas，VA 20110，USA)保藏，根據保藏編號分發(fā)的菌株)取若干轉化子于含50μg/ml氨芐青霉素的4ml(直徑1.4cm×18cm試管)LB液體培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)16小時。該培養(yǎng)物用生理鹽水稀釋后，涂布于含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板、42℃培養(yǎng)10小時后，得單菌落。所得單菌落依照上述方法培養(yǎng)后再分離單菌落，篩選整個質粒經同源重組入染色體的克隆。在含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組交換株后抽提質粒，以確證該菌株的細胞質液中無質粒。
選取上述整個質粒經同源重組入染色體的克隆中的10個，在M9基本液體培養(yǎng)基(4ml、1L包含磷酸氫二鈉6.8g，磷酸二氫鉀3g，氯化鈉0.5g，氯化銨1g，七水硫酸鎂0.5g，二水氯化鈣15mg，ThiaminHCl 2mg，葡萄糖0.2g，pH7.0)中30℃培養(yǎng)24小時。取該培養(yǎng)物100μl接種于4ml同樣培養(yǎng)基，42℃繼續(xù)培養(yǎng)24小時。該培養(yǎng)物用生理鹽水稀釋后，涂布于M9瓊脂平板，42℃繼續(xù)培養(yǎng)12小時得單菌落。所得單菌落分別接種LB瓊脂平板和含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，30℃培養(yǎng)12小時。篩選發(fā)生雙交換后的，僅僅在LB瓊脂平板生長的氨芐青霉素敏感的交換株。以雙交換株染色體為模板，用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的引物PCR擴增pepD片斷。擴增出的pepD片斷為缺失了NruI-HpaI區(qū)域的缺失型pepD基因(約1.4kb)。確證該菌株pepD基因被缺失型pepD基因置換而獲得了pepD基因的缺失菌株。
(2)獲取異天冬氨酰二肽酶(iadA)基因缺失突變株基于在堿基序列數據庫(DDBJ/EMBL/GeneBank登陸的索引號分別是AE000503)中iadA基因的序列信息合成引物5’-CAAGGAGTTCCATGATTGA(序列號3)5’-AACCGTTTAAGCCGTTTCAA(序列號4)利用該引物以大腸桿菌ATCC8739的染色體DNA為模板，PCR(94℃，1min、54℃，2min、72℃，3min、30個循環(huán))擴增SD-ATG和翻譯終止密碼間覆蓋的1.7Kbp基因區(qū)域。PCR產物用SureCloneLigation Kit(Amersham Pharmacia Biotech)試劑盒連接到pUC18載體的SmaI位點，構建了pUC18-iadA。該質粒轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞后，轉化子在含50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16小時、收集菌體從轉化子里制備質粒。pUC18-iadA用HpaI酶切(含iadA基因的1.7Kbp插入片斷中的限制內切酶位點)后和EcoRI-NotI-BamHI接頭連接。得到的質粒再用NotI酶切后自連接。該連接混合物轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞后，從含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)出的轉化子制備質粒。這樣篩選的能被NotI切斷的質粒DNA就是pUCΔiadA。該質粒DNA含有的iadA基因從HpaI位點開始發(fā)生移碼突變，推測其編碼的酶沒有功能。
pUCΔiadA用EcoRI-SalI雙酶切，制備含缺失型iadA基因的1.7Kbp DNA片斷。該DNA片斷和含有溫度敏感復制起點(tsori)的同源交換載體pMAN997的EcoRI/SalI位點連接、構建了用于缺失iadA基因的pMANΔiadA。pMANΔiadA轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞后，在含50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16小時、收集菌體從轉化子里制備pMANΔiadA。
用于iadA基因缺失的質粒pMANΔiadA電轉化上述大腸桿菌ATCC8739 pepD缺失突變株。繼續(xù)按同樣操作，用缺失型iadA基因置換iadA基因得到氨芐青霉素敏感的雙交換株。以雙交換株染色體為模板，用SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的引物PCR擴增iadA片斷。擴增出的iadA片斷能被NotI切斷，確證該菌株iadA基因被缺失型iadA基因置換而獲得了pepD iadA基因的雙重缺失菌株。
(3)獲取α-天冬氨酰二肽酶基因(pepE基因)缺失突變株基于在堿基序列數據庫(DDBJ/EMBL/GeneBank登陸的索引號分別是AE000475)里pepE基因的序列信息合成引物5’-TATTTGTTATTTCCATTGGC(序列號5)5’-AATGTCGCTCAACCTTGAAC(序列號6)使用該引物以大腸桿菌ATCC8739的染色體DNA為模板，PCR(94℃，1min、54℃，2min、72℃，3min、30個循環(huán))擴增SD-ATG和翻譯終止密碼間覆蓋的1.4Kbp基因區(qū)域。PCR產物用SureCloneLigation試劑盒連接到pUC18載體的SmaI位點，構建了pUC18-pepE。該質粒轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞后，轉化子在含50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)16小時、收集菌體從轉化子里制備質粒。pUC18-pepE用NruI酶切(含pepE基因的1.4Kbp插入片斷中的限制內切酶位點)后和EcoRI-NotI-BamHI接頭連接。得到的質粒再用NotI酶切后自連接。該連接混合物轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞后，從含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)出的轉化子制備質粒。這樣篩選能被NotI切斷的質粒DNA就是pUCΔpepE。該質粒DNA含有的pepE基因從NruI位點開始發(fā)生移碼突變，推測其編碼的酶沒有功能。
pUCΔpepE用EcoRI-SalI雙酶切，制備含缺失型pepE基因的1.4Kbp DNA片斷。該DNA片斷和含有溫度敏感復制起點(tsori)的同源交換載體pMAN997的EcoRI-SalI位點連接、構建了用于缺失pepE基因的pMANΔpepE。pMANΔpepE轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞后，在50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)16小時、收集菌體從轉化子里制備pMANΔpepE。
用于pepE基因缺失的質粒pMANΔpepE電轉化上述大腸桿菌ATCC8739 pepD iadA雙重缺失突變株。繼續(xù)按同樣操作，用缺失型pepE基因置換pepE基因得到氨芐青霉素敏感的雙交換株。以雙交換株染色體為模板，用SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6的引物PCR擴增pepE片斷。擴增出的pepE片斷能被NotI切斷，確證該菌株pepE基因被缺失型pepE基因置換而獲得了pepD iadA pepE基因的三重缺失菌株。
(4)獲取亮氨酰氨肽酶(pepA)缺失突變株基于在堿基序列數據庫(DDBJ/EMBL/GeneBank登陸的索引號分別是AE000496)里pepA基因的序列信息合成引物
5’-ACAGCGGACATGAGTTACGA(序列號7)5’-CCCGCTAAATTATGCGGAAC(序列號8)使用該引物以大腸桿菌ATCC8739的染色體DNA為模板，PCR(94℃，1min、54℃，2min、72℃，3min、30個循環(huán))擴增SD-ATG和翻譯終止密碼間覆蓋的1.9Kbp基因區(qū)域。PCR產物用SureCloneLigation試劑盒連接到pUC18載體的SmaI位點，構建了pUC18-pepA。該質粒轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞后，轉化子在含50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)16小時、收集菌體從轉化子里制備質粒。pUC18-pepA用HpaI酶切(含pepA基因的1.9Kbp插入片斷中的限制內切酶位點)后自連接。該連接混合物轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞后，從含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)出的轉化子制備質粒。這樣篩選出的能被HpaI切斷的質粒DNA就是pUCΔpepA。該質粒DNA上連接的pepA基因缺失了HpaI-HpaI區(qū)域，推測其編碼的酶沒有功能。pUCΔpepA用SacI-SphI雙酶切，制備含缺失型pepA基因的1.9Kbp DNA片斷。該DNA片斷和含有溫度敏感復制起點(tsori)的同源交換載體pMAN997的SacI-SphI連接、構建了用于缺失pepA基因的pMANΔpepA。pMANΔpepA轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞后，在含50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)16小時、收集菌體從轉化子里制備pMANΔpepA。用于pepA基因缺失的質粒pMANΔpepA電轉化上述大腸桿菌ATCC8739 pepD iadApepE三重缺失突變株。繼續(xù)按同樣操作，用缺失型pepE基因置換pepE基因得到氨芐青霉素敏感的雙交換株。以雙交換株染色體為模板，用SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8的引物PCR擴增pepA片斷。擴增出的pepA片斷能被MulI切斷生成849bp和1039bp的DNA片斷，確證該×菌株pepA基因被缺失型pepA基因置換而獲得了pepD iadA pepEpepA基因的四重缺失菌株。
實施例2各肽酶基因缺失菌株的天冬氨酰苯基丙氨酸分解活性的測定親本菌株和各基因缺失菌株分別接種4ml LB培養(yǎng)基，30℃、16小時振蕩培養(yǎng)。把4ml培養(yǎng)物于2200×g15分鐘離心分離得菌體沉淀。向該菌體沉淀添加4ml生理鹽水，2200×g15分鐘離心分離得洗凈菌體。把洗凈菌體懸浮于1ml超聲波破碎溶液(含1mM DTT的20mMMOPS-KOH緩沖液(pH7.0))。菌體懸液經超聲波破碎(Bioruptor產，7.5分鐘)后，12000×g10分鐘離心分離得無細胞抽提液。使用蛋白分析CBB溶液(ナカライテスク公司產)，按Bradford法對蛋白質定量。使用Sigma公司的牛血清白蛋白作標準蛋白。
無細胞抽提液100μl添加底物溶液100μl(100mM天冬氨酰苯基丙氨酸、2mM MnCl2、100mM MOPS-KOH緩沖液，pH7.0)置30℃反應2小時。反應后的反應液置95℃熱處理5分鐘后，用蒸餾水稀釋5倍、取反應稀釋液10μl上氨基酸分析儀(日立產L-8500型)分析生成的天冬氨酸和苯基苯丙氨酸的含量。
親本菌株和各基因缺失菌株天冬氨酰苯基丙氨酸分解活性如表1所示。1酶活單位定義為置30℃1分鐘生成1摩爾Phe的酶量。從親本菌株可檢測出強的天冬氨酰苯基丙氨酸分解活性、各基因缺失菌株天冬氨酰苯基丙氨酸分解活性降低。pepD iadA pepE pepA基因的四重缺失菌株的天冬氨酰苯基丙氨酸分解活性低至親本的1.6％。
表1

實施例3各肽酶基因缺失菌株的天冬氨酰苯基丙氨酸分解活性的測定親本菌株和各基因缺失菌株分別接種于3ml LB(Bacto公司胰蛋白胨1.0％、Bacto公司酵母提取物1.0％、氯化鈉1.0％、pH7.0)培養(yǎng)基，置37℃、振蕩培養(yǎng)16小時。取1ml培養(yǎng)物2200×g15分鐘離心分離得菌體沉淀。向該菌體沉淀添加1ml生理鹽水，2200×g15分鐘離心分離得洗凈菌體。向洗凈菌體中添加底物溶液0.1ml(100mM丙氨酰谷氨酰胺、100mM硼酸-NaOH緩沖液，pH9.0)置30℃反應6小時。
反應液中的丙氨酰谷氨酰胺按下述條件用HPLC定量而求出丙氨酰谷氨酰胺的分解量。柱Inertsil ODS-2(4.6×250mm，GL Science公司)。流動相5mM鈉1-辛基磺酸鹽∶甲醇＝10∶1.5(pH2.1濃縮的磷酸)流速1.0/分鐘，40℃，紫外檢測波長210nm。
親本菌株和各基因缺失菌株天冬氨酰苯基丙氨酸分解活性如下表所示。親本菌株反應6小時能完全分解100mM的丙氨酰谷氨酰胺，pepD缺失突變株的丙氨酰谷氨酰胺分解活性很低。pepE、pepA突變株的丙氨酰谷氨酰胺分解活性更低。
表2

參考例1來源于短穩(wěn)桿菌E的肽合成酶基因的分離以下說明從短穩(wěn)桿菌FERM BP-8113中分離肽合成酶基因。分離該基因用大腸桿菌JM109為宿主、pUC118為載體。
(1)基于內部氨基酸序列而制備PCR引物基于來源于短穩(wěn)桿菌FERM BP-8113的肽合成酶基因用肽酶消化后，經Edman降解法測定得到的氨基酸序列(序列號9及10)，設計了含有序列號11及12分別所示堿基序列的混合引物。
(2)菌體制備短穩(wěn)桿菌FERM BP-8113在CM2G瓊脂培養(yǎng)基上置30℃培養(yǎng)24小時。所得菌體接種一接種環(huán)入盛有50ml CM2G培養(yǎng)液(上述培養(yǎng)基不含瓊脂)的500ml平口燒瓶、30℃振蕩培養(yǎng)。
(3)從菌體制備染色體DNA50ml培養(yǎng)液離心(12000rpm，4℃，15分鐘)分離收集菌體。按QIAGEN Genomic-tip system說明書所示方法從該菌體制備染色體DNA。
(4)用PCR法來制備含有部分肽合成酶基因的DNA片斷使用寶酒造公司的LA-Taq酶來PCR擴增獲得了含來源于短穩(wěn)桿菌的部分肽合成酶基因。使用對應于制備的短穩(wěn)桿菌的染色體DNA、含有序列號11和12所示堿基序列的引物進行PCR反應。
PCR反應使用寶酒造Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL，按下述條件反應30個循環(huán)。
94℃ 30秒52℃ 1分鐘72℃ 1分鐘反應完成后，取3μl PCR反應產物在0.8％瓊脂糖電泳，證實擴增產物為1.5kb的DNA片斷。
(5)從基因文庫克隆肽合成酶基因為獲得全長的肽酶合成基因，使用上述PCR產物為探針來Southern雜交。Southern雜交步驟說明見分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)。
上述PCR擴增的1.5kbDNA片斷，經0.8％瓊脂糖電泳分離，切出目的片斷后提純。該DNA片斷按Boehringer公司DIG High Primer試劑盒說明書提示的方法作地高辛探針標記。
本參考例1(3)得到的短穩(wěn)桿菌的染色體DNA用限制性內切酶HindIII在37℃16小時完全消化后，在0.8％瓊脂糖電泳。電泳后瓊脂糖凝膠印漬轉移至尼龍膜上(正電荷尼龍膜，Roche Diagnostics產)、經堿變性、中和、固定化處理。雜交使用Boehringer-Mannheim公司的EASY HYB。尼龍膜先在50℃預雜交1小時。添加上述制備的地高辛標記的探針，50℃雜交16小時。然后，用含有0.1％SDS的2×SSC室溫洗滌20分鐘，優(yōu)選用含有0.1％SDS的0.1×SSC 65℃15分鐘洗滌2回。
探針和與之雜交的帶的檢測按Boehringer公司DIG NucleotideDetection檢測試劑盒說明書提示的方法進行。檢出了和探針雜交的4kb的帶。
本參考例1(3)制備的染色體DNA 5μg用限制性內切酶HindIII完全消化后，經0.8％瓊脂糖電泳分離約4kb的DNA片斷后用フナコシ公司Gene Clean II試劑盒純化后，溶解于10μl TE。取4μl和經HindIII/BAP處理過的pUC118混合，用寶酒造公司的DNALigation Kit Ver 2試劑盒連接。連接混合物5μl轉化100μl大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞(Toyobo產)。所得轉化子涂布于適當固體培養(yǎng)基上構建染色體DNA文庫。
為了獲得全長的肽合成酶，用上述探針通過菌落雜交從染色體DNA文庫中來篩選。菌落雜交依照分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)的說明。
將染色體DNA文庫的菌落轉移到尼龍膜上(菌落和噬菌斑雜交用尼龍膜，Roche Diagnostics產)、經堿變性、中和、固定化處理。雜交使用Boehringer公司的EASY HYB。尼龍膜先在37℃預雜交1小時。添加上述制備的地高辛標記的探針，50℃雜交16小時。然后，用含有0.1％SDS的2XSSC室溫洗滌20分鐘，優(yōu)選用含有0.1％SDS的0.1XSSC 65℃15分鐘洗滌2回。
探針和于之雜交的菌落的檢測按Boehringer公司DIGNucleotide Detection檢測試劑盒說明書提示的方法進行。檢出了和標記的探針雜交的2個菌落。
(6)來源于短穩(wěn)桿菌的肽合成酶基因從確證的和標記的探針雜交的2個菌落出發(fā)，從JM109宿主中使用Promega公司的Wizard Plus Minipreps DNA purification system試劑盒制備質粒、用于測定和探針雜交的臨近的堿基序列。按貝克曼(Beckman-Coulter)公司CEQ DTCS-Quick Start試劑盒說明提示的方法進行測序反應。電泳使用貝克曼公司CEQ 2000-XL。
測序結果顯示在編碼含肽合成酶內部氨基酸序列(序列號9和10)的蛋白的寡核苷酸中存在開放閱讀框，證實了存在編碼肽合成酶的基因。肽合成酶的基因全長堿基序列和與其對應的氨基酸序列如序列號13所示。用BLASTP程序分析所得開放閱讀框的同源型，發(fā)現和其它2個蛋白有同源性。即和巴氏醋桿菌(Acetobacterpasteurianus)的α-氨基酸酯水解酶(Appl.Environ.Microbiol.68(1)，211-218(2002))的氨基酸序列34％同源。和Brebibacilluslac戊二酰-7ACA?；D移酶(J.Bacteriol.173(24)，7848-7855(1991))的氨基酸序列26％同源。
(7) 來源于短穩(wěn)桿菌的肽合成酶基因在大腸桿菌中表達大腸桿菌W3110染色體DNA上的trp調控元的啟動子區(qū)域是用序列號15及16所示寡核苷酸作為引物經PCR擴增出的目的基因區(qū)域，所得DNA片斷連接至Promega公司的載體pGEM-Teasy。該連接混合物轉化大腸桿菌JM109。在氨芐青霉素抗性株中篩選trp啟動子方向和lac啟動子方向相反的質粒。用EcoO109I/EcoRI處理含有trp啟動子的DNA片斷后，將其與經EcoO109I/EcoRI處理過的pUC19(寶酒造)連接。該連接混合物轉化大腸桿菌JM109，在氨芐青霉素抗性株中篩選含有目的質粒的克隆。目的質粒經HindIII/PvuII處理后所得的DNA片斷和用HindIII/HincII處理pKK223-3(Amersham Pharmacia公司)所得的帶有rrnB終止手DNA片斷連接。該連接混合物轉化大腸桿菌JM109，在氨芐青霉素抗性株中篩選含有目的質粒的克隆，該質粒命名為pTrpT。
以短穩(wěn)桿菌FERM BP-8113的染色體DNA為模板，利用序列號17、18所示寡核苷酸作為引物經PCR擴增出目的基因區(qū)域。擴增片斷經NdeI/PstI處理后所得的DNA片斷與經NdeI/PstI處理的pTrpT連接。該連接混合物轉化大腸桿菌JM109，在氨芐青霉素抗性株中篩選含有目的質粒的克隆，該質粒命名為pTrpT-Gtg2。
將帶有pTrpT-Gtg2的大腸桿菌JM109在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于30℃下預培養(yǎng)24小時。接種1ml培養(yǎng)物至盛有50ml培養(yǎng)基(2g/l-葡萄糖，10g/l酵母提取物，10g/l酪蛋白氨基酸、5g/l硫酸氨、3g/l磷酸二氫鉀、1g/l磷酸氫二鉀、0.5g/l七水硫酸鎂、100mg/l氨芐青霉素)的500ml平口燒瓶中、25℃、培養(yǎng)24小時。每1ml培養(yǎng)液含有0.11單位的α-L-天冬氨酰-L-苯基丙氨酸-β-甲酯生成活性，證實了克隆的基因在大腸桿菌里能表達。同時作為對照的含pTrpT的轉化子無活性檢出。
(信號序列預測)用SignalP V1.1程序(Protein Engineering，vol12，no.1，pp.3-9，1999)分析序列號6的氨基酸序列。推測第1-22位氨基酸是有分泌到細胞周質功能的信號肽，成熟蛋白為23位氨基酸下游。
(分泌的證實)將帶有pTrpT-Gtg2的大腸桿菌JM109在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于30℃下預培養(yǎng)24小時。接種1ml培養(yǎng)物至盛有50ml培養(yǎng)基(2g/1-葡萄糖，10g/l酵母提取物，10g/l酪蛋白氨基酸、5g/l硫酸氨、3g/l磷酸二氫鉀、1g/l磷酸氫二鉀、0.5g/l七水硫酸鎂、100mg/l氨芐青霉素)的500ml平口燒瓶中、25℃、培養(yǎng)24小時。
上述菌體培養(yǎng)物利用20g/dl的蔗糖溶液采用滲透壓Shock法來分離成周質組分和胞質組分。20g/dl的蔗糖溶液浸潤的菌體加入5mM硫酸鎂溶液。該溶液離心后的上清為周質組分(Pe)。并且，該溶液離心后的沉淀再懸浮后，經超聲波破碎后為胞質組分(Cy)。為了確證分離到了胞質組分，用已知存在于胞質中的葡萄糖-6磷酸脫氫酶作為指示存在胞質組分的指標。測定方法是在30℃時向1mM葡萄糖-6磷酸、0.4mM NADP 10mM MgSO450mM Tris-Cl(pH8)的反應液中添加適量酶，然后測定340nm的吸光度來測定NADPH的合成。
以另外制備的無細胞抽提液的活性為100％，測定周質組分和胞質組分的酶含量。周質組分中無葡萄糖-6磷酸脫氫酶酶活性表示周質組分中沒有混入胞質組分。發(fā)現周質組分中存在60％的α-L-天冬氨酰-L-苯基丙氨酸-β-甲酯(α-AMP)生成活性。且用上述SignalPV1.1程序分析所用氨基酸序列來預測，α-AMP合成酶分泌到周質組分中。
參考例2來源于鞘氨醇桿菌的肽合成酶基因的分離以下說明從鞘氨醇桿菌FERM BP-8124分離肽合成酶基因。分離該基因用大腸桿菌DH5α為宿主、pUC118為載體。
(1)菌體制備鞘氨醇桿菌FERM BP-8124在CM2G(50g/1-葡萄糖，10g/l酵母提取物，10g/l蛋白胨、5g/l氯化鈉、20g/l瓊脂、pH7.0)瓊脂培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)24小時。所得菌體接種一接種環(huán)入盛有50ml CM2G培養(yǎng)液的500ml平口燒瓶、25℃振蕩培養(yǎng)。
(2)從菌體制備染色體DNA50ml培養(yǎng)液離心(12000rpm，4℃，15分鐘)分離收集菌體。按QIAGEN Genomic-tip system說明書所示方法從該菌體制備染色體DNA。
(3)用PCR法來制備含有部分肽合成酶基因的DNA片斷。
使用寶酒造公司的LA-Taq酶來PCR擴增了來源于鞘氨醇桿菌FERM BP-8124的肽合成酶基因。使用對應于制備的鞘氨醇桿菌FERMBP-8124的染色體DNA，用含有序列號11和12所示堿基序列作為引物進行PCR反應。
PCR反應使用寶酒造Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL，按下述條件反應30個循環(huán)。
94℃ 30秒52℃ 1分鐘72℃ 1分鐘取3μl PCR反應產物在0.8％瓊脂糖電泳，證實擴增產物為1.5kb的DNA片斷。
(4)從基因文庫克隆肽合成酶基因為獲得全長的肽酶合成基因，使用上述PCR產物為探針來Southern雜交。Southern雜交步驟說明見分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)。
上述PCR擴增的1.5kbDNA片斷，經0.8％瓊脂糖電泳分離，切出目的片斷后提純。該DNA片斷按Boehringer公司DIG High Primer試劑盒說明書提示的方法作地高辛探針標記。
本參考例2(2)得到的鞘氨醇桿菌的染色體DNA用限制性內切酶SacI在37℃16小時完全消化后，在0.8％瓊脂糖電泳。電泳后瓊脂糖凝膠印漬轉移至尼龍膜上(正電荷尼龍膜，Roche產)、經堿變性、中和、固定化處理。雜交使用Boehringer公司的EASY HYB。尼龍膜先在37℃預雜交1小時。添加上述制備的地高辛標記的探針，37℃雜交16小時。然后，用含有0.1％SDS的1XSSC 60℃洗滌2回。
探針和與之雜交的帶的檢測按Boehringer公司DIG NucleotideDetection檢測試劑盒說明書提示的方法進行。檢出了和探針雜交的3kb的帶。
本參考例2(2)制備的染色體DNA 5μg用限制性內切酶SacI完全消化后，經0.8％瓊脂糖電泳分離約3kb的DNA片斷后用フナコシ公司Gene Clean II試劑盒純化，溶解于10μl TE。取4μl和經SacI37℃16小時完全消化、堿性磷酸化酶(E.coli C75)37℃、30分鐘，50℃、30分鐘處理過的pUC118混合，用寶酒造公司的DNA LigationKit Ver 2試劑盒連接。連接混合物5μl轉化100μl大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞(東洋紡織產)。所得轉化子涂布于適當固體培養(yǎng)基上構建染色體DNA文庫。
為了獲得全長的肽合成酶，用上述探針通過菌落雜交從染色體DNA文庫中來篩選。菌落雜交依照分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)的說明。
將染色體DNA文庫的菌落轉移到尼龍膜上(菌落和噬菌斑用尼龍膜，Roche產)、經堿變性、中和、固定化處理。雜交使用Boehringer公司的EASY HYB。尼龍膜先在37℃預雜交1小時。添加上述制備的地高辛標記的探針，37℃雜交16小時。然后，用含有0.1％SDS的1XSSC60℃洗膜2回。
探針和與之雜交的菌落的檢測按Boehringer公司DIGNucleotide Detection檢測試劑盒說明書提示的方法進行。檢出了和標記的探針雜交的6個菌落。
(5)來源于鞘氨醇桿菌的肽合成酶基因的堿基序列從與標記的探針雜交確證的6個菌落出發(fā)，從DH5α宿主中使用Promega公司的Wizard Plus Minipreps DNA purification system試劑盒制備質粒、用于測定和探針雜交的臨近的堿基序列。按貝克曼公司CEQ DTCS-Quick Start試劑盒說明提示的方法進行測序反應。電泳使用貝克曼公司CEQ 2000-XL。
測序結果顯示存在編碼含肽合成酶的開放閱讀框。來源于鞘氨醇桿菌的肽合成酶的基因全長堿基序列和與其對應的氨基酸序列如序列號19所示。用BLASTP程序分析，發(fā)現來源于鞘氨醇桿菌的肽合成酶的基因和來源于短穩(wěn)桿菌的肽合成酶的基因的氨基酸序列有63.5％的同源性。
(6)來源于鞘氨醇桿菌的肽合成酶基因在大腸桿菌中表達以鞘氨醇桿菌FERM BP-8124的染色體DNA為模板，序列號21、22所示寡核苷酸作為引物經PCR擴增出目的基因區(qū)域。NdeI/XbaI處理擴增所得的該片斷所得后的DNA片斷，其與經NdeI/XbaI處理后pTrpT連接。該連接混合物轉化大腸桿菌JM109，在氨芐青霉素抗性株中篩選含有目的質粒的克隆，該質粒命名為pTrpT-Sm-aet。
在盛有3ml培養(yǎng)基(2g/1-葡萄糖，10g/l酵母提取物，10g/l酪蛋白氨基酸、5g/l硫酸氨、3g/l磷酸二氫鉀、1g/l磷酸氫二鉀、0.5g/l七水硫酸鎂、100μg/ml氨芐青霉素)的普通試管中接種一環(huán)，25℃，20小時培養(yǎng)帶有pTrpT-Sm-aet的大腸桿菌JM109。每1ml培養(yǎng)液含有0.53單位的α-AMP生成活性，證實了克隆的基因在大腸桿菌里能表達。同時作為對照的含pTrpT的轉化子無活性檢出。
(信號序列預測)用SignalP V1.1程序(Protein Engineering，vol12，no.1，pp.3-9，1999)分析序列號20的氨基酸序列。推測氨基酸序列中第1-20位氨基酸是向周質中分泌功能的信號肽，成熟蛋白為21位氨基酸下游。
(信號序列的證實)在盛有50ml培養(yǎng)基(2g/l-葡萄糖，10g/l酵母提取物，10g/l酪蛋白氨基酸、5g/l硫酸氨、3g/l磷酸二氫鉀、1g/l磷酸氫二鉀、0.5g/l七水硫酸鎂、100mg/l氨芐青霉素)的普通試管中接種一環(huán)帶有pTrpT-Sm-aet的大腸桿菌JM109、25℃、培養(yǎng)24小時。
下述離心以后的操作在冰上或4℃進行。培養(yǎng)完成后把培養(yǎng)液離心分離菌體，加100mM磷酸緩沖液(pH7)洗滌后，用同種緩沖液懸浮。195W、20分鐘超聲波破碎。超聲波破碎物離心分離(12000rpm，30分鐘)去處菌體碎片后得到可溶性部分?？扇苄圆糠稚蠘佑诮?00mM磷酸緩沖液(pH7)預平衡過的CHT-II柱。以500mM磷酸緩沖液的線性濃度梯度洗脫出酶?；钚圆糠?fraction)和5倍體積的2M硫酸氨、100mM磷酸緩沖液混合后，上樣于經2M硫酸氨、100mM磷酸緩沖液預平衡過的Resource-PHE柱(Amersham公司)。經上述步驟純化的肽合成酶可由電泳的單組分得到確證。
用Edman降解法測定上述肽合成酶的氨基酸序列為序列號15所示。用SignalP V1.1程序來預測，可確證成熟蛋白在21號氨基酸下游。
實施例4宿主中各肽酶基因缺失、含來源于Empedobaceraerogenes的氨基酸酯轉移酶的高表達菌株來生成丙氨酰谷氨酰胺把來源于短穩(wěn)桿菌的氨基酸酯轉移酶表達質粒pTrp-aet電轉化入實例1中構建的大腸桿菌JM109 pepD pepE雙缺陷菌株以及pepDpepE pepA三重缺陷菌株。在含氨芐青霉素100μ/ml的L-瓊脂培養(yǎng)基上20℃培養(yǎng)48小時。取1/4平板的細胞接入50ml L-培養(yǎng)基(蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化鈉10g/l)在22℃振蕩搖床(140rpm)培養(yǎng)16小時。取3ml培養(yǎng)物(OD610＝0.15，26倍稀釋)接種300ml下述成分的培養(yǎng)基，于1升實驗室用發(fā)酵罐、700rpm攪拌、通氣(1/1vvm)批式培養(yǎng)。糖耗盡后的培養(yǎng)物15ml(OD610＝0.60，51倍稀釋)接種300ml相同組成的培養(yǎng)基，于同樣發(fā)酵罐、通氣(1/1vvm)、20℃補糖培養(yǎng)。使用氨氣自動調節(jié)pH7.0。
培養(yǎng)基組成(g/L)葡萄糖 25.0MgSO4·7H2O 1.0(NH4)2SO45.0H3PO43.5FeSO40.05MnSO4·5H2O 0.05Mameno(TN) 0.45GD113 0.1氨芐青霉素 0.1葡萄糖和硫酸錳單獨滅菌。其它組分用氫氧化鉀調節(jié)pH至5.0。
補糖溶液的組成(g/L)葡萄糖500.0pH不調節(jié)培養(yǎng)液2ml離心分離(2200Xg15min)后取菌體沉淀。向菌體沉淀中添加2ml生理鹽水后，離心分離(2200Xg15min)后，得洗凈菌體。向洗凈菌體中添加10ml含有L-丙氨酸-0-甲酯氫氯化物100mM(14.0mg/ml)、L-Gln 200mM(14.0mg/ml)(0.2M)、硼酸-NaOH緩沖液(pH9.0)100mM的反應液進行丙氨酰谷氨酰胺合成反應。結果如

圖1。
反應的初速度幾乎完全相同，使用大腸桿菌JM109菌株作為宿主菌株來進行。反應時間不長時生成的丙氨酰谷氨酰胺不會被分解。使用pepD pepE雙重缺失株以及pepD pepE pepA三重缺失株可以延長反應時間同時可以抑制丙氨酰谷氨酰胺被分解。在實際的生產反應中，確立反應的終點而迅速終止反應很困難。依照此結果，值得期待的生產丙氨酰谷氨酰胺的宿主是pepD pepE雙重缺失株以及pepD pepEpepA三重缺失株。
本發(fā)明對在工業(yè)上生產肽極其有用。
附圖簡述圖1顯示丙氨酰谷氨酰胺的產量序列表SEQ ID NO 1 PCR引物SEQ ID NO 2 PCR引物SEQ ID NO 3 PCR引物SEQ ID NO 4 PCR引物SEQ ID NO 5 PCR引物SEQ ID NO 6 PCR引物SEQ ID NO 7 PCR引物SEQ ID NO 8 PCR引物SEQ ID NO 9來源于短穩(wěn)桿菌的酶由Edman降解法確定的氨基酸序列SEQ ID NO 10來源于短穩(wěn)桿菌的酶由Edman降解法確定的氨基酸序列SEQ ID NO 11混合引物SEQ ID NO 12混合引物SEQ ID NO 13來源于短穩(wěn)桿菌的肽合成酶SEQ ID NO 14來源于短穩(wěn)桿菌的肽合成酶SEQ ID NO 15制備pTrpT用的引物SEQ ID NO 16制備pTrpT用的引物SEQ ID NO 17制備pTrpT_Gtg2用的引物SEQ ID NO 18制備pTrpT_Gtg2用的引物SEQ ID NO 19來源于鞘氨醇桿菌的肽合成酶
SEQ ID NO 20來源于鞘氨醇桿菌的肽合成酶SEQ ID NO 21制備pTrpT_Sm_aet用的引物SEQ ID NO 22制備pTrpT_Sm_aet用的引物序列表<110>Ajinomoto Co.，Inc.
<120>突變微生物和利用該類微生物合成肽的方法<130>PAMA-15895<160>22<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工的<150>
<151>InventorKIRA，IkuoInventorYOKOZEKI，KenzoInventorSUZUKI，SonokoInventorMIHARA，YasuhiroInventorHIRAO，Yoshinori<220>
<223>PCR引物<400>1gatctggcgc actaaaaacc 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>2gggatggctt ttatcgaagg 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR primer<400>3caaggagtta ccatgattga 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>4aaccgtttaa gccgtttcaa 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>5tatttgttat ttccattggc 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>6aatgtcgctc aaccttgaac 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物
<400>7acagcggaca tgagttacga 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>8cccgctaaat tatgcggaac 20<210>9<211>9<212>PRT<213>短穩(wěn)桿菌<400>9Leu Phe Thr Ala Ile Tyr Gln Pro Lys1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>短穩(wěn)桿菌<400>10Thr Asn Val Thr Tyr Thr Met Pro Asp1 5<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述混合引物<400>11ttyacngcna thtaycarcc 20
<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述混合引物<400>12tcnggcatng trtangtnac rtt 23<210>13<211>2024<212>DNA<213>短穩(wěn)桿菌<220>
<221>CDS<222>(61)..(1908)<223>編碼肽形成酶的基因<400>13atttcttaat aaaaactgaa atcttaatac atttatacta tcgtaaaatt tattgaacac 60gtg aaa aaa tta aca tta aaa gta act cta ctt aca ctt ttg ttg gga108Val Lys Lys Leu Thr Leu Lys Val Thr Leu Leu Thr Leu Leu Leu Gly1 5 10 15agt aca gtt gga ttt gcg caa gat gca aaa gca gat tct gct tat gtg156Ser Thr Val Gly Phe Ala Gln Asp Ala Lys Ala Asp Ser Ala Tyr Val20 25 30cgc gac aat tac gaa aaa ata gaa caa gta att ccg atg cgc gat ggt204Arg Asp Asn Tyr Glu Lys Ile Glu Gln Val Ile Pro Met Arg Asp Gly35 40 45aca aag tta ttt aca gct att tat cag cca aaa gat aaa aca aaa caa252Thr Lys Leu Phe Thr Ala Ile Tyr Gln Pro Lys Asp Lys Thr Lys Gln50 55 60tat ccc gtt ttg tta aat cgt acg cct tat aca gtt gcg cct tat ggt300Tyr Pro Val Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Thr Val Ala Pro Tyr Gly65 70 75 80gta aat gaa tac aag aaa tcg tta gga aat ttt cct aca gaa atg cgc348Val Asn Glu Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asn Phe Pro Thr Glu Met Arg85 90 95
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<223>人工序列描述為制備pTrpT所合成的引物<400>15gtatcacgag gccctagctg tggtgtcatg gtcggtgatc40<210>16<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述為制備pTrpT所合成的引物<400>16ttcggggatt ccatatgata ccctttttac gtgaacttgc40<210>17<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述為制備pTrpT_Gtg2所合成的引物<400>17gggaattcca tatgaaaaaa ttaacattaa aagtaact 38<210>18<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述為制備pTrpT_Gtg2所合成的引物<400>18gggggctgca gtacttgtac ggtttcgccc gataaa36<210>19<211>1935<212>DNA<213>鞘氨醇桿菌<220>
<221>CDS<222>(61)..(1917)<223>肽形成酶基因<400>19gaaaccaagt gtaaaattat aatttacacc aaagaatgta ctgaacaaat aattatctga 60atg aaa aat aca att tcg tgc cta act tta gcg ctt tta agc gca agc 108Met Lys Asn Thr Ile Ser Cys Leu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Ala Ser1 5 10 15cag tta cat gct caa aca gct gcc gac tcg gct tat gtt aga gat cat 156Gln Leu His Ala Gln Thr Ala Ala Asp Ser Ala Tyr Val Arg Asp His20 25 30tat gaa aag acc gaa gta gca att ccc atg cga gat ggg aaa aaa tta 204Tyr Glu Lys Thr Glu Val Ala Ile Pro Met Arg Asp Gly Lys Lys Leu35 40 45ttt act gcg atc tac agt cca aaa gac aaa tcc aag aaa tat cca gtt 252Phe Thr Ala Ile Tyr Ser Pro Lys Asp Lys Ser Lys Lys Tyr Pro Val50 55 60
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<223>人工序列描述為制備pTrpT_Sm_aet所合成的引物<400>21gggaattcca tatgaaaaat acaatttcgt 30<210>22<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述為制備pTrpT_Sm_aet所合成的引物<400>22gctctagact aatctttgag gacagaaaa29
權利要求
1.一種突變微生物，其染色體上的基因被破壞，所述基因選自編碼氨酰基組氨酸二肽酶的基因、編碼亮氨酰氨肽酶的基因、編碼異天冬氨酰二肽酶的基因中一種或兩種以上。
2.權利要求1所述的微生物，其染色體上編碼α-天冬氨酰二肽酶的基因被破壞。
3.權利要求1或2所述的微生物，其中，所述的細菌是埃希氏菌屬的細菌。
4.一種微生物，其染色體上的基因被破壞，所述基因選自編碼氨?；M氨酸二肽酶的基因、編碼亮氨酰氨肽酶的基因、編碼異天冬氨酰氨肽酶的基因中的一種或兩種以上；并且所述微生物被含有編碼具有肽合成活性的蛋白的多核苷酸的重組DNA轉化。
5.權利要求4所述的微生物，其染色體上編碼α-天冬氨酰二肽酶的基因被破壞。
6.權利要求4或5中所述的微生物，其中，所述的微生物是埃希氏菌屬的細菌。
7.權利要求4或5中所述的微生物，其中所述的具有肽合成活性的蛋白是來自穩(wěn)桿菌屬或鞘氨醇桿菌屬的細菌的蛋白質。
8.權利要求4或5中所述的微生物，其中所述的具有肽合成活性的蛋白是下述(A)或(B)中所示的蛋白質(A)具有SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列的蛋白質(B)具有在SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列中引入了一個或幾個氨基酸取代、缺失、插入、附加、和/或倒位后所得的氨基酸序列，并且具有肽合成活性的蛋白質。
9.權利要求4或5中所述的微生物，其中所述的具有肽合成活性的蛋白是下述(C)或(D)所示的蛋白質(C)具有SEQ ID NO 20所示的氨基酸序列的蛋白質(D)具有在SEQ ID NO 20的氨基酸序列中引入一個或幾個氨基酸取代、缺失、插入、附加、和/或倒位后所得的氨基酸序列，并且具有肽合成活性的蛋白質。
10.一種微生物的制備方法，所述微生物染色體上的基因被破壞，所述基因選自編碼氨酰基組氨酸二肽酶的基因、編碼亮氨酰氨肽酶的基因、編碼異天冬氨酰氨肽酶的基因中的一種或兩種以上。
11.權利要求10所述的微生物的制備方法，其中所述微生物染色體上編碼α-天冬氨酰二肽酶的基因被破壞。
12.一種微生物的制備方法，其中，所述微生物染色體上的基因被破壞，所述基因選自編碼氨?；M氨酸二肽酶的基因、編碼亮氨酰氨肽酶的基因、編碼異天冬氨酰氨肽酶的基因中的一種或兩種以上；并且所述微生物被含有編碼具有肽合成活性的蛋白的多核苷酸的重組DNA轉化。
13.權利要求12中所述的微生物的制備方法，其中所述微生物染色體上編碼α-天冬氨酰二肽酶的基因被破壞。
14.一種肽的制備方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，將所培養(yǎng)的微生物和所培養(yǎng)微生物的細胞破碎物中的至少一種與羧基組分和胺組分混合來合成肽，所述微生物染色體上的基因被破壞，所述基因選自編碼氨?；M氨酸二肽酶的基因、編碼亮氨酰氨肽酶的基因、編碼異天冬氨酰氨肽酶的基因中的一種或兩種以上；并且所述微生物被含有編碼具有肽合成活性的蛋白的多核苷酸的重組DNA轉化。
15.權利要求14中所述的肽的制備方法，其中所述的微生物是染色體上編碼α-天冬氨酰二肽酶的基因被破壞的微生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及肽的制備方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，將所培養(yǎng)的微生物和所述微生物的細胞破碎物中的至少一種與羧基組分和胺組分混合來合成肽，所述微生物染色體上的基因被破壞，所述基因選自編碼氨?；M氨酸二肽酶的基因、編碼亮氨酰氨肽酶的基因、編碼異天冬氨酰氨肽酶的基因中的一種或兩種以上；并且所述微生物被含有編碼具有肽合成活性的蛋白的多核苷酸的重組DNA轉化。
文檔編號C12P21/00GK1657603SQ200510007909
公開日2005年8月24日 申請日期2005年2月5日 優(yōu)先權日2004年2月5日
發(fā)明者吉良郁夫, 橫關健三, 鈴木園子, 三原康博, 平尾吉德 申請人:味之素株式會社