專利名稱：一種大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，特別涉及該熱激轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因，與它們在培育耐熱性增強(qiáng)大豆等植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自從Wu等1987年首先克隆了果蠅(Drosophila melanogaster)熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcriptional factor，HSF)以來，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、雞、番茄、人、水稻、大豆、小鼠、黑猩猩(Pantroglodytes)、海藻(Guillardia theta)、非洲爪蟾(Xenopus Laevis)等的HSF被相繼克隆。盡管熱脅迫元件(heat shock elements，HSEs)在所有的生物體中表現(xiàn)出極強(qiáng)的保守性，但它的反式作用因子HSF卻有很大差別。不同種屬生物體中HSF的相對分子質(zhì)量有較大的區(qū)別，各HSF之間也沒有明顯的抗體交叉反應(yīng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在許多高等真核生物中存在兩種以上的HSFs。由低等生物中一種HSF所擔(dān)負(fù)的多種生理功能在高等真核生物中被共同存在的多種HSFs分擔(dān)，幾種不同的HSFs可以分別參與持續(xù)或短暫激活熱激或熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)基因的表達(dá)，表現(xiàn)出組成性或誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性。
HSFs在傳遞環(huán)境脅迫的相關(guān)信息方面起非常重要的作用，HSFs結(jié)合到熱脅迫元件上激活熱脅迫反應(yīng)的基因，從而誘導(dǎo)熱激反應(yīng)。不同組織的HSFs包含以下幾個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域DNA結(jié)合域(DNA binding domain，DBD)、寡聚域(oligmerization domain，OD)、核定位信號(nuclear localization signal，NLS)及激活域(C-terminalactivation domain，CTAD)。其中DBD是高度保守的結(jié)構(gòu)域。植物HSFs的DBD之間的保守性高于動(dòng)物和酵母或其他高等真核生物。植物HSFs的DBD與酵母、哺乳動(dòng)物以及果蠅DBD的主要區(qū)別是67到68之間缺少了11到12個(gè)氨基酸。OD由2個(gè)疏水七肽重復(fù)區(qū)域A和B(HR-A/B)組成。區(qū)域A包含5-6組疏水的七肽重復(fù)序列，而區(qū)域B是由2個(gè)互相交疊的七肽重復(fù)序列組成。目前認(rèn)為，OD是3股α-螺旋通過卷曲螺旋型α-螺旋(α-helical coiled-coil)結(jié)構(gòu)形成一種HSF的同源三聚體構(gòu)型。在高等真核生物中，HSF三聚體的形成需要熱激誘導(dǎo)。在非熱激條件下，HSF三聚化被抑制。研究表明，在HSF的C端存在另一個(gè)疏水7肽重復(fù)序列(HR-C)。該區(qū)域與動(dòng)物HSF三聚化的調(diào)節(jié)有關(guān)。HR-C突變可導(dǎo)致一種組成型的HSF三聚化和DNA結(jié)合活性。在正常生長條件下，HR-A/B和C之間通過分子內(nèi)的卷曲螺旋型α-螺旋相互作用，來抑制HSF三聚體的形成。由于在植物HSF的HR-C中含有較多的脯氨酸和甘氨酸，形成α螺旋的潛能很低，因此植物HSF的HR-C的功能目前還不清楚。
已報(bào)道擬南芥中有21個(gè)HSFs，番茄中已發(fā)現(xiàn)16種以上的HSFs，大豆中也發(fā)現(xiàn)了15種以上的HSFs。大豆中已經(jīng)克隆3個(gè)全長的cDNAGmHSF5、GmHSF21、GmHSF34。在動(dòng)、植物中發(fā)現(xiàn)大量的HSFs表明HSF基因可能特異性對不同的脅迫起作用，或是在發(fā)育中起不同的作用。大部分的HSF基因是受熱誘導(dǎo)的，一些基因的表達(dá)因氯化鈣脅迫而增強(qiáng)。大豆HSF基因即有組成型表達(dá)的，也有誘導(dǎo)表達(dá)的。大豆HSF基因組成型的表達(dá)量低于熱誘導(dǎo)型的，番茄LpHSF8(即LpHSF A1)是組成型表達(dá)的，其表達(dá)量也低于它的兩個(gè)熱誘導(dǎo)型的HSFs。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子，名稱為GmHSF8，來源于大豆屬大豆(Glycinemax L.)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過1至10個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)節(jié)耐熱相關(guān)基因功能的蛋白質(zhì)。
其中，序列表中的序列2由510個(gè)氨基酸殘基組成，自序列2的氨基端第28位-122位氨基酸殘基為GmHSF8的DBD；GmHSF8的OD由HR-A(自序列2的氨基端第142位-172位氨基酸殘基)和HR-B(自序列2的氨基端第200位-208位氨基酸殘基)組成；自序列2的氨基端第225位-239位氨基酸殘基為GmHSF8的NLS；GmHSF8的CTAD由AHA1(IDFDSISPE，自序列2的氨基端第434位-442位氨基酸殘基)和AHA2(NPHFWDDILRT，自序列2的氨基端第451位-461位氨基酸殘基)組成。
上述大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因(GmHSF8)，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。它可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID №1由1781個(gè)堿基組成，該cDNA包括1533bp的開放讀碼框(自序列1的5′端第142位-1674位堿基)。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增GmHSF8中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
GmHSF8基因在正常條件下的不同植物組織中都有表達(dá)，多種逆境如熱、鹽等脅迫均可使其表達(dá)量增加，促進(jìn)相關(guān)耐逆基因的表達(dá)，提高植物對環(huán)境的耐逆性。
利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明的GmHSF8基因轉(zhuǎn)入植物(特別是大豆)中，植物的耐熱能力增強(qiáng)。
本發(fā)明的GmHSF8基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素，卡那霉素等)。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如大豆、水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。攜帶有本發(fā)明的GmHSF8基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物經(jīng)組織培養(yǎng)成植株。
本發(fā)明的大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因?qū)⒃谂嘤蜔嵝栽鰪?qiáng)的植物(如大豆)中起到重要作用。


圖1為RACE法克隆得到的GmHSF8基因PCR產(chǎn)物電泳圖譜圖2為GmHSF8分子結(jié)構(gòu)示意3為GmHSF8 5’非翻譯區(qū)熱激元件圖4為150mM NaCl和42℃熱激處理對大豆的葉、根和下胚軸中GmHSF8基因表達(dá)的影響圖5為pCAMBIA2300-GmHSF8的物理圖譜圖6為轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測圖7A為常溫條件下轉(zhuǎn)GmHSF8基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的GmHSF8基因表達(dá)情況圖7B為常溫條件下轉(zhuǎn)GmHSF8基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的HSP70基因表達(dá)情況圖7C為熱激條件下轉(zhuǎn)GmHSF8基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的HSP70基因表達(dá)情況圖8為轉(zhuǎn)GmHSF8基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株對熱脅迫的反應(yīng)具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、GmHSF8及其編碼基因的獲得大豆(Glycine max L.Merr.)播種在蛭石中，在溫室中培養(yǎng)，以生長2-3周的幼苗作實(shí)驗(yàn)材料。用Trizol試劑盒(GIBCO-BRL)從大豆幼苗中提取總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)合成第一鏈cDNA。為了分離全長基因，根據(jù)大豆EST數(shù)據(jù)庫中不連續(xù)的HSF8 cDNA片段的EST序列設(shè)計(jì)上游和下游引物，分離基因的3′末端、5′末端。GSPs(基因特異引物)和NGSPs(嵌套基因特異引物)序列如下5’RACEGSP1，5’-TGAACAGCCTTTGCAAGGAATGACATC-3’；NGSP1，5’-CTCTGCAGCTGGTTATCAGTAGCCTG-3’；3’RACEGSP2，5’-GCGCCTTCAAGGAATGGAGCAACGACAGC-3’；NGSP2，5’-GATGTCATTCCTTGCAAAGGCTGTTCA-3’。結(jié)果如圖1所示，用cDNA末端快速擴(kuò)增法(GIBCO-BRL)得到含熱激轉(zhuǎn)錄因子8(HSF8)的cDNA3′末端序列(1041bp)和5′末端序列(695bp)。圖1，泳道M為DNA marker，DL2000；1，2為3’RACE產(chǎn)物；3，4為5’RACE產(chǎn)物)。
按照常規(guī)方法對該3’RACE產(chǎn)物和5’RACE產(chǎn)物進(jìn)行測序，利用DNAMAN軟件將中間片段(兩次擴(kuò)增產(chǎn)物重疊序列)與兩次RACE獲得的末端序列進(jìn)行拼接，得到一個(gè)全長1781bp大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子8的cDNA(序列1)。該cDNA包括1533bp的開放讀碼框(自序列1的5′端第142位-1674位堿基)、141個(gè)堿基的5′非翻譯區(qū)(自序列1的5′端第1位-141位堿基)、107個(gè)堿基的3′非翻譯區(qū)(自序列1的5′端第1675位-1781位堿基)。在5′非翻譯區(qū)+102位置(自序列1的5′端第37位-39位堿基，圖3中 部分)有一個(gè)終止密碼子(TAG)，且與編碼區(qū)的讀碼框一致，說明不存在其它更靠前的起始密碼子，表明所克隆片段是全長cDNA，將其命名為GmHSFS。此cDNA編碼一段510個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(序列2)，名稱為GmHSF8，推測分子量為56.2KD。
利用BLAST進(jìn)行序列比對，用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性分析，結(jié)果表明GmHSF8與番茄熱激轉(zhuǎn)錄因子(LpHSFA1)的氨基酸序列同源性較高(52.46％)，說明它們屬于同一類熱激轉(zhuǎn)錄因子。GmHSF8的DBD與LpHSFA1的DBD同源性高達(dá)90.43％。GmHSF8疏水七肽重復(fù)區(qū)域A(HR-A)的N末端前有19個(gè)氨基酸(自序列2的氨基端第123位-141位氨基酸殘基，而LpHSFA1和擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子(AtHSFA1)分別有30和19個(gè)氨基酸。HR-A/B功能域(自序列2的氨基端第142-208位氨基酸殘基)在GmHSF8和LpHSFA1之間完全保守，只是在氨基酸組成上有4處不同(自序列2的氨基端157位Arg→Ile、178位Ser→Ala、185位Gly→Ser、195位Leu→Gln)；GmHSF8的NLS是雙元結(jié)構(gòu)SRR-5aa-KKRRLKQ(自序列2的氨基端第225位-239位氨基酸殘基)；GmHSF8的CTAD由AHA1(IDFDSISPE)和AHA2(NPHFWDDILRT)組成，該結(jié)構(gòu)域保守性最差(圖2)。這說明GmHSF8是一個(gè)新的熱激轉(zhuǎn)錄因子。圖2中，insert-HR-A與HR-B之間的插入序列，H2-螺旋結(jié)構(gòu)2，H3-螺旋結(jié)構(gòu)3，T-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。
如圖3所示，在GmHSF8基因5’端非翻譯區(qū)(141bp)可以找到6個(gè)HSE響應(yīng)元件[A(G，T，C)GAAn或A(G，T，C)GnAn或A(G，T，C)GAnn](用下劃線 表示)和13個(gè)(注圖3中最前面的“6個(gè)堿基”是2個(gè)HSE響應(yīng)尾部元件)HSE響應(yīng)尾部元件[nTTCt(A，G，C)或nTnCT(A，G，C)或nnTCT(A，G，C)](用下劃線“_”表示)。盡管該5’端非翻譯區(qū)較短，但有19個(gè)熱激響應(yīng)元件，說明熱激轉(zhuǎn)錄因子GmHSF8與其編碼基因之間存在著復(fù)雜的互作調(diào)節(jié)關(guān)系。在該基因的5’端非翻譯區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)TAAT盒，說明這些熱激響應(yīng)元件位于TAAT盒的下游。
實(shí)施例2、高溫和高鹽脅迫對GmHSF8基因表達(dá)的影響大豆(Glycine max L.Merr.)播種在蛭石中，在溫室中培養(yǎng)，以生長2-3周的幼苗作實(shí)驗(yàn)材料。
將幼苗放在42℃下分別培養(yǎng)3，6，9和18小時(shí)，對照組在24℃下培養(yǎng)。將幼苗根系置于150mM NaCl溶液中處理3，6，9和18小時(shí)。
分別從不同處理的幼苗的葉片、根和下胚軸提取總RNA。用定量RT-PCR方法分析GmHSF8基因在大豆不同組織的表達(dá)。以O(shè)ligodT15為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用定量RT-PCR方法分析GmHSF8基因在大豆不同組織的表達(dá)。PCR用的特異引物為正向引物P15’-CTTCTCCAGCTTCGTTCGCC’-3’；反向引物P25’-TACCCTCCTGCTTAAGCCGG-3’。
用GmACTIN(Accession No.V00450)定量模板cDNA的濃度，所用引物為正向引物5’-GGTGATGGTGTGAGTCACACTGTACC-3’；反向引物5’-GTGGACAATGGATGGGCCAGACTC-3’。
PCR反應(yīng)在eppendorf型擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)總體積為25ul，含有cDNA 200ng，正向引物10pM，反向引物10pM，1U Taq DNA聚合酶(TaKara公司)，2.5μl 10×緩沖液(200mM Tris-HCl，pH8.8，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgSO4，1％Triton X-100，1mg ml-1nuclease-free BSA和0.2mM dNTPs)。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)入循環(huán)94℃變性30s，60℃復(fù)性30s，72℃延伸90s，共30個(gè)循環(huán)，最后再72℃延伸10min。結(jié)果表明，高溫和高鹽脅迫對大豆不同組織中GmHSF8基因表達(dá)有不同的影響。葉片中GmHSF8基因的表達(dá)受高溫的影響不明顯，但受高鹽脅迫的抑制(而150mM NaCl處理9h例外)；高溫對下胚軸中GmHSF8基因表達(dá)有輕微的抑制作用，而高鹽對下胚軸中該基因的表達(dá)則有輕微的誘導(dǎo)作用；根中GmHSF8基因的表達(dá)受高溫和鹽的明顯誘導(dǎo)作用，該基因的表達(dá)量均隨兩種脅迫因子的持續(xù)處理時(shí)間延長而增加(但150mM NaCl處理3h例外)，高溫處理的這種變化趨勢更明顯(圖4)。總之，大豆葉、下胚軸和根中的GmHSF8基因在正常條件(42℃0h即24℃培養(yǎng))下都有表達(dá)(為組成性表達(dá)類型)，而高溫或高鹽脅迫能使其表達(dá)量增加，在根系中尤其如此。圖4中，LH表示葉片中GmHSF8基因的表達(dá)，LA表示葉片中肌動(dòng)蛋白基因的表達(dá)；HH表示下胚軸中GmHSF8基因的表達(dá)，HA表示下胚軸中肌動(dòng)蛋白基因的表達(dá)；RH表示根中GmHSF8基因的表達(dá)，RA表示根中肌動(dòng)蛋白基因的表達(dá)。泳道1，2，3，4和5分別表示處理0，3，6，9和18小時(shí)。
實(shí)施例3、培育耐熱能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因大豆pCAMBIA2300載體購自CABIA中心。Taq DNA Polymerase，SmaI和ScaI購自Takara公司。6-BA、IBA、頭孢霉素Cef、卡那霉素Kanamycin(Kan)和乙酰丁香酮(AS)等購自北京鼎國生物技術(shù)公司。
1、植物表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶SmaI和SacI酶切載體pCAMBIA2300，以引物P1CCCGGGATGGACGGAAGAGC和P2TTAAGAAAACCGTAGTCT(含有SmaI識別位點(diǎn)CCCGGG和SacI識別位點(diǎn)GAGCTC)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的GmHSF8基因，用T4DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，在X-gal平板上篩選具有卡那霉素抗性的菌落，進(jìn)行PCR鑒定，得到含有植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-GmHSF8的陽性菌落。提取陽性菌落中的質(zhì)粒，得到植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-GmHSF8(圖5)。
2、大豆遺傳轉(zhuǎn)化大豆轉(zhuǎn)化受體品種為科新3號。
用植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-HSF8轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，在含有鏈霉素25mg/L和卡那霉素50mg/L的YEB培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，并挑取單克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到陽性克隆，4℃保存。從4℃保存的平板上挑取含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌單菌落接入含有50mg/L Kan、25mg/L利福平、25mg/L鏈霉素的YEB培養(yǎng)基，28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)12-14h左右至對數(shù)期，在4℃、8000rpm離心10min，去上清液，用同體積的液體分化培養(yǎng)基(MS+1.6mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+500mg/L Cef，pH5.4)，添加100μmol/L AS重懸后備用。
挑選籽粒飽滿的大豆種子按Zhang等(1999，Plant Cell，Tissue，and OrganCulture，5637-46)的方法進(jìn)行消毒。將飽滿的干種子單層平鋪于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿敞開將其放置于干燥器中，將100ml的燒杯放置于干燥器內(nèi)，加入50ml的飽和次氯酸鈉，再加入2ml濃鹽酸，立即蓋上干燥器蓋子，放置通風(fēng)廚內(nèi)過夜(14-16h)。消毒后的種子接種于萌發(fā)培養(yǎng)基MSO(pH5.8)上，25℃的溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，光16h/暗8h，5-6d后獲得無菌苗。
取無菌苗的子葉節(jié)為外植體，用解剖刀在子葉節(jié)部位劃網(wǎng)狀裂紋，將其浸沒在農(nóng)桿菌重懸液中侵染30min后，置于暗處共培養(yǎng)3d后，轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基MS+1.6mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+500mg/L Cef；待長出叢生芽后，將其接種于篩選培養(yǎng)基MS+1.6mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+50mg/L kan+500mg/L Cef，每2周繼代1次，獲得了一批抗卡那霉素(Kan)的轉(zhuǎn)化苗，篩選的不定芽長至0.5-1cm時(shí)接于伸長培養(yǎng)基MS+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+50mg/L kan+500mg/L Cef；約2周后一些叢生芽抽出主莖并長成3-4cm的小苗，將其移入生根培養(yǎng)基MS+1.5mg/L IBA，待長出健壯的根系后移栽到花盆中。最后得到13株轉(zhuǎn)化植株。
3、轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR檢測選取經(jīng)Kan篩選的抗性移栽成活植株，每株剪取1-2片葉，按照Edwards等(1991，Nucleic Acids Res.，191349)描述的方法提取基因組DNA，以其為模板，采用植物體內(nèi)無同源序列的35s啟動(dòng)子引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物由上海生工合成。引物序列分別為F5-GGGTCTTGCGAAGGATAG-3，R5-GCTTACGCAGCAGGTCTC-3。PCR反應(yīng)在PTC-100型PCR儀上進(jìn)行，94℃預(yù)變性5min后按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)94℃變性1min、50℃退火1min、72℃延伸1min，后續(xù)30個(gè)同樣的循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。以pCAMBIA2300質(zhì)粒為陽性對照，科新3號的非轉(zhuǎn)基因再生苗為陰性對照。PCR檢測結(jié)果如圖6所示，表明13株轉(zhuǎn)化植株中有9株擴(kuò)增出830bp的DNA條帶，而陰性對照未擴(kuò)增出相應(yīng)的片段(圖6)。證明GmHSF8基因已整合入這9株的基因組中，實(shí)際轉(zhuǎn)化率為2.39％。圖6中，1非轉(zhuǎn)基因親本植株(陰性對照)；2pCAMBIA2300-GmHSF8(陽性對照)；3-15轉(zhuǎn)化植株；MDNA marker(DL2000)。
4、轉(zhuǎn)基因植株Northern檢測分別提取常溫(24℃)下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)GmHSF8基因大豆植株與非轉(zhuǎn)基因大豆植株的葉片總RNA，以GmHSF8 cDNA的一段保守序列(以質(zhì)粒pCAMBIA2300-GmHSF8 DNA為模板，在引物F5-GGGTCTTGCGAAGGATAG-3和R5-GCTTACGCAGCAGGTCTC-3的引導(dǎo)下PCR得到的DNA片段)為探針，通過Northern方法檢測GmHSF8基因的表達(dá)。結(jié)果如圖7A所示，表明在常溫下轉(zhuǎn)GmHSF8基因植株的GmHSF8基因表達(dá)量顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株(少量表達(dá))。圖7A中，1為非轉(zhuǎn)基因植株，2為轉(zhuǎn)GmHSF8基因植株。
將轉(zhuǎn)GmHSF8基因大豆植株與非轉(zhuǎn)基因大豆植株的3周齡的幼苗分別在常溫(24℃)下培養(yǎng)和42℃熱激3小時(shí)/天(連續(xù)處理3天)，分別提取轉(zhuǎn)GmHSF8基因大豆植株與非轉(zhuǎn)基因大豆植株的葉片總RNA，以HSP70 cDNA的一段保守序列(以科新3號大豆植株基因組DNA為模板，在引物P1CATAGGCATCGATCTCGGCAC和P2GAAGACGGTGTTCTGCGGG的引導(dǎo)下PCR得到的DNA片段)為探針，通過Northern方法檢測HSP70基因的表達(dá)。結(jié)果表明，在常溫(24℃)條件下轉(zhuǎn)GmHSF8基因植株的HSP70基因表達(dá)量明顯高于幾乎不表達(dá)的非轉(zhuǎn)基因植株(如圖7B所示)；在熱激(42℃)條件下轉(zhuǎn)GmHSF8基因植株的HSP70基因超表達(dá)，其表達(dá)量顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株(有一定量表達(dá))(如圖7C所示)。圖7B和圖7C中，1為非轉(zhuǎn)基因植株，2為轉(zhuǎn)GmHSF8基因植株。
5、轉(zhuǎn)基因植株熱脅迫實(shí)驗(yàn)為了驗(yàn)證過量表達(dá)GmHSF8基因的植株是否提高了耐熱性，將轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行高溫(熱激)處理實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明在常溫(28-30℃培養(yǎng)6h)下供試植株的所有葉片都是平展的(圖8中A，B)；當(dāng)溫度升至38-40℃，培養(yǎng)40min時(shí)，非轉(zhuǎn)基因植株的嫩葉片開始向內(nèi)卷曲(圖8中C-左、D-左)，在42-45℃，培養(yǎng)40min時(shí)內(nèi)卷曲表現(xiàn)較為明顯(圖8中E-左、F-左)，在42-48℃，培養(yǎng)40min時(shí)內(nèi)卷曲程度隨溫度升高逐漸明顯(圖8中E-左、F-左、G-左、H-左)，而轉(zhuǎn)基因植株的嫩葉片未出現(xiàn)內(nèi)卷曲。在52℃培養(yǎng)15分鐘后，非轉(zhuǎn)基因植株的頂部葉片開始萎焉(圖8中I-左)，而轉(zhuǎn)基因植株的嫩葉片只是略有卷曲(圖8中I-右)。說明轉(zhuǎn)GmHSF8基因的大豆植株比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓瓯憩F(xiàn)出較強(qiáng)的耐熱能力(提高8-10℃)，本發(fā)明所提供的GmHSF8基因具有激活耐熱相關(guān)基因的功能。圖8中，A-I中的左側(cè)植株為非轉(zhuǎn)基因植株、右側(cè)植株為轉(zhuǎn)GmHSF8基因植株。
序列表<160>2<210>1<211>1781<212>DNA<213>大豆屬大豆(Glycine max L.)<400>1tctttcacta ctccccatct gttaaatttc gaacactagg gttcaatttt ctccaacaat 60gaccctcact ctattcctct gacttcccat agaccacaat acactcaccc caggcaaaaa 120atttcgtttc aaaattgtga tatggacgga agagcgagca gcagcgtggg cggagaagca 180tcgccagctc cagcaccggt gccgataacg aatgcgaacg cgccgccgcc tttcttgagc 240aagacatacg agatggtaga ggacccttcg acggactcga tagtgtcgtg gagtccaacg 300aacaacagtt tcgtggtttg gaaccctccc gagttcgcca gagatctctt gcccaaacac 360ttcaagcaca acaacttctc cagcttcgtt cgccaattaa acacctacgg atttaggaag 420gtagatccag atcgctggga atttgcaaat gagggatttt tgaggggtca aaagcacttg 480cttaagacta taactcggcg gaaacctgcc catggtcata atcaacaggc acagcaagca 540catggacaga gttcatctgt tggggcttgt gttgaagttg ggaagtttgg acttgaggaa 600gaggttgaga ttctcaagag agataagaat gtgctcatgc aagagcttgt gagattgagg 660cagcagcaac aggctactga taaccagctg cagagtatgg ttcagcgcct tcaaggaatg 720gagcaacgac agcaacaaat gatgtcattc cttgcaaagg ctgttcagag tcctggtttt 780ttagctcaat ttgtacaaca gcaaaatgag agtagtagac gcataacgga ggcaaataaa 840aaacgccggc ttaagcagga gggtattggt gaaatggaac atactgctgc ttctgatggc 900caaattgtta aatatcaacc tctgataaat gaagcagcaa aagcaatgct gaggcaaatg 960atgaaattgg atacttctcg actagaatct tttagtaata acgctgataa ttacttgatt1020ggtgatcatt catcatcatc cggtgcaacg gacaggggaa actctttgag ccggacttct1080ggagtaacac ttcaagtggt ccctctgact acaatccagt cttctcacat tccatctgca1140acggggatag gggatgaccc ttcaacagga aaatctgaga ttctatctac tcctcaagtt1200gtagcctgtg atgaagttac gaaagctcag tactctaatg taaatgtttc ggttggagaa1260tctaatgcac ctgctatccc tgctactcaa acagatgaaa tcatgcggga cctctctaca1320
ataccagaca tagtggcagg aaatattctt gatattcctc aagaaaatta tatggcacct1380gagacaggcg gtgaaggata tatggatcct acttcatttg gagtgaatgt gtcattgccc1440attgattttg atagtatttc acctgaagca gacattgatg atttgttgaa caatcctcac1500ttttgggatg atattttgcg aactccagtg tcagaggaga ttgatacgaa tgatgctgaa1560gtattcaagg agaatgaggt gcagccaatg gaaaatggat tggacgaatc acaaaatatg1620gaccaactta ctgagcagat gggcctactt tcttctgatg ccaaaagaat ttgagtgtat1680tatgaaagtg tacattatta atatttcata ttgtgcaagg taaccttagc ctagacaatg1740ggttatgttg ttttagttaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a1781<210>2<211>510<212>PRT<213>大豆屬大豆(Glycine max L.)<400>2Met Asp Gly Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Gly Glu Ala Ser Pro Ala1 5 10 15Pro Ala Pro Val Pro Ile Thr Asn Ala Asn Ala Pro Pro Pro Phe Leu20 25 30Ser Lys Thr Tyr Glu Met Val Glu Asp Pro Ser Thr Asp Ser Ile Val35 40 45Ser Trp Ser Pro Thr Asn Asn Ser Phe Val Val Trp Asn Pro Pro Glu50 55 60Phe Ala Arg Asp Leu Leu Pro Lys His Phe Lys His Asn Asn Phe Ser65 70 75 80Ser Phe Val Arg Gln Leu Asn Thr Tyr Gly Phe Arg Lys Val Asp Pro85 90 95Asp Arg Trp Glu Phe Ala Asn Glu Gly Phe Leu Arg Gly Gln Lys His100 105 110Leu Leu Lys Thr Ile Thr Arg Arg Lys Pro Ala His Gly His Asn Gln115 120 125Gln Ala Gln Gln Ala His Gly Gln Ser Ser Ser Val Gly Ala Cys Val
130 135 140Glu Val Gly Lys Phe Gly Leu Glu Glu Glu Val Glu Ile Leu Lys Arg145 150 155 160Asp Lys Asn Val Leu Met Gln Glu Leu Val Arg Leu Arg Gln Gln Gln165 170 175Gln Ala Thr Asp Asn Gln Leu Gln Ser Met Val Gln Arg Leu Gln Gly180 185 190Met Glu Gln Arg Gln Gln Gln Met Met Ser Phe Leu Ala Lys Ala Val195 200 205Gln Ser Pro Gly Phe Leu Ala Gln Phe Val Gln Gln Gln Asn Glu Ser210 215 220Ser Arg Arg Ile Thr Glu Ala Asn Lys Lys Arg Arg Leu Lys Gln Glu225 230 235 240Gly Ile Gly Glu Met Glu His Thr Ala Ala Ser Asp Gly Gln Ile Val245 250 255Lys Tyr Gln Pro Leu Ile Asn Glu Ala Ala Lys Ala Met Leu Arg Gln260 265 270Met Met Lys Leu Asp Thr Ser Arg Leu Glu Ser Phe Ser Asn Asn Ala275 280 285Asp Asn Tyr Leu Ile Gly Asp His Ser Ser Ser Ser Gly Ala Thr Asp290 295 300Arg Gly Asn Ser Leu Ser Arg Thr Ser Gly Val Thr Leu Gln Val Val305 310 315 320Pro Leu Thr Thr Ile Gln Ser Ser His Ile Pro Ser Ala Thr Gly Ile325 330 335Gly Asp Asp Pro Ser Thr Gly Lys Ser Glu Ile Leu Ser Thr Pro Gln340 345 350Val Val Ala Cys Asp Glu Val Thr Lys Ala Gln Tyr Ser Asn Val Asn355 360 365Val Ser Val Gly Glu Ser Asn Ala Pro Ala Ile Pro Ala Thr Gln Thr370 375 380Asp Glu Ile Met Arg Asp Leu Ser Thr Ile Pro Asp Ile Val Ala Gly
385 390 395 400Asn Ile Leu Asp Ile Pro Gln Glu Asn Tyr Met Ala Pro Glu Thr Gly405 410 415Gly Glu Gly Tyr Met Asp Pro Thr Ser Phe Gly Val Asn Val Ser Leu420 425 430Pro Ile Asp Phe Asp Ser Ile Ser Pro Glu Ala Asp Ile Asp Asp Leu435 440 445Leu Asn Asn Pro His Phe Trp Asp Asp Ile Leu Arg Thr Pro Val Ser450 455 460Glu Glu Ile Asp Thr Asn Asp Ala Glu Val Phe Lys Glu Asn Glu Val465 470 475 480Gln Pro Met Glu Asn Gly Leu Asp Glu Ser Gln Asn Met Asp Gln Leu485 490 495Thr Glu Gln Met Gly Leu Leu Ser Ser Asp Ala Lys Arg Ile500 505 510
權(quán)利要求
1.一種大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過1至10個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)節(jié)耐熱相關(guān)基因功能的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子編碼基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述的大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的表達(dá)載體。
5.含有權(quán)利要求2或3所述的大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的細(xì)胞系。
6.含有權(quán)利要求2或3所述的大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的宿主菌。
7.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述的大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子編碼基因中任一片段的引物對。
8.權(quán)利要求2或3所述的大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因在培育耐熱性增強(qiáng)植物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為大豆、水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草或苜宿。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。該大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過1至10個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)節(jié)耐熱相關(guān)基因功能的蛋白質(zhì)。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將該大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子編碼基因轉(zhuǎn)入植物中，植物的耐熱能力增強(qiáng)。本發(fā)明的大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因?qū)⒃谂嘤蜔嵝栽鰪?qiáng)的植物(如大豆)中起到重要作用。
文檔編號C12N15/82GK1824779SQ20051000875
公開日2006年8月30日 申請日期2005年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月25日
發(fā)明者朱保葛, 呂慧穎, 陳建南, 張利明, 陳曉軍, 柴國華 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所