專利名稱：一種CpG DNA新型佐劑及其制造方法和含有該佐劑的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種CpG DNA新型佐劑。更具體地說，涉及一種含有SEQ ID NO1的CpG DNA基序序列，該CpG DNA基序序列是安全、高效、廉價(jià)的DNA分子新型佐劑，特別是用作豬疫苗中的DNA分子佐劑。本發(fā)明還涉及利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)上述含SEQ ID NO1的CpG DNA基序序列的方法，以及包含所述CpG DNA基序序列的新型疫苗組合物。
背景技術(shù)：
自從上世紀(jì)20年代以來，許多物質(zhì)被嘗試作為免疫佐劑，但只有鋁膠佐劑獲得了人類疫苗的許可，并大量用于動(dòng)物疫苗。它作為抗原的儲(chǔ)存庫和載體，緩慢釋放抗原從而延長誘導(dǎo)機(jī)體的體液免疫反應(yīng)，但缺點(diǎn)是僅誘導(dǎo)Th2體液免疫反應(yīng)，抗體以IgG1型為主，無TCL反應(yīng)。油佐劑和弗氏完全佐劑雖能明顯提高免疫應(yīng)答能力，但在實(shí)際應(yīng)用中常出現(xiàn)不良反應(yīng)，如注射部位腫脹、疼痛、發(fā)燒，或發(fā)生過敏等，僅限用于實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物試驗(yàn)。206佐劑是目前商品化的高效動(dòng)物疫苗油佐劑，已廣泛使用于動(dòng)物疫苗中，實(shí)踐證實(shí)是可靠的、有效的和安全的，但需要進(jìn)口，價(jià)格較高。
非甲基化CpG基序的免疫增強(qiáng)作用已被許多研究所證實(shí)含非甲基化的CpG寡核苷酸序列(簡稱CpG ODN)能使B、T細(xì)胞激活，同時(shí)增強(qiáng)機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫，它能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的Th1型反應(yīng)，以IgG2a型為主，有TCL反應(yīng)，同時(shí)能與鋁膠等其他佐劑配伍使用，有較好的協(xié)同作用(Risini D.W，M J.McCluskie，Yu Xu，等人.CpGDNA induces stronger immune responses with less toxicity thanother adjuvant.Vaccine，2000，181755-1762)。
目前在國內(nèi)外已有用人工合成且進(jìn)行硫代修飾的CpG ODN或從其他低等生物中提取含CpG基序的基因組DNA作為疫苗新型佐劑，證明免疫增強(qiáng)效果好，具有替代傳統(tǒng)佐劑的優(yōu)勢。但存在的問題是人工合成的CpG ODN很容易降解，而硫代修飾的序列費(fèi)用太高，不能被生產(chǎn)所接受(Mannon R B，Natara C，Pisetsky D S.Stimulation ofthymocyte by phosphorothioate DNA oligonucleotide.CellImmunol，2000，201(1)14-21)；低等生物的基因組DNA雖含有未甲基化的CpG基序，但有可能引入有害基因或物質(zhì)到機(jī)體，盲目性較大。
我國是養(yǎng)豬大國。我國生豬飼養(yǎng)量在11億頭以上，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中占有較大的比重，同時(shí)養(yǎng)豬業(yè)也是我國部分省區(qū)的主要生產(chǎn)支柱和新的經(jīng)濟(jì)增長點(diǎn)。但面對(duì)當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)重大疫病發(fā)生和流行愈加復(fù)雜的形勢——舊病未除，新病又起，疫情不斷，這就要求我們必須運(yùn)用新的科學(xué)理論和生產(chǎn)技術(shù)來發(fā)展豬用安全、高效疫苗，預(yù)防和控制各種疫病的發(fā)生和流行，而佐劑研制是疫苗研究的主要組成部分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)和理論的缺陷，提供一種基于非甲基化CpG基序的安全、高效、廉價(jià)的新型疫苗佐劑以及其生產(chǎn)方法。
為達(dá)到該目的，本發(fā)明人依據(jù)非甲基化CpG基序激發(fā)脊椎動(dòng)物的先天性免疫保護(hù)機(jī)制的原理，按照其空間結(jié)構(gòu)效應(yīng)和宿主特異性，設(shè)計(jì)合成多種CpG基序序列，在小鼠、家兔和豬體上進(jìn)行重要疫病疫苗(口蹄疫、豬瘟和豬囊蟲病)的配伍試驗(yàn)，篩選出具有良好佐劑效應(yīng)的CpGODN，即5’-T CGT CGT TTG TCG TTT TGT CGT T-3’，將其命名為SEQID NO1。
將上述CpG ODN克隆入質(zhì)粒DNA后，得到CpG DNA(即含有CpG ODN的重組質(zhì)粒)。該CpG DNA具有較高的穩(wěn)定性，并且該CpG DNA具有明顯的免疫增強(qiáng)效果，可以用作多種疫苗的佐劑，特別是用于預(yù)防和/或治療常見豬疫病的疫苗佐劑。本發(fā)明CpG DNA的佐劑效應(yīng)具體表現(xiàn)在(1)能增強(qiáng)小鼠抗豬囊尾蚴免疫反應(yīng)，同時(shí)具有較高的體液免疫和細(xì)胞免疫即Th1反應(yīng)，CpG DNA誘導(dǎo)的抗體水平比鋁膠、206佐劑均較高，可持續(xù)120天以上，與鋁膠、206佐劑配伍均有協(xié)同作用，其中與206佐劑配伍效果最好；(2)能明顯增強(qiáng)豬口蹄疫滅活疫苗的免疫效果，其免疫后45天的抗體滴度可達(dá)134，是標(biāo)準(zhǔn)疫苗的4倍以上。具有使用劑量小，毒性低的特性。20μg CpG DNA的小鼠免疫劑量可達(dá)到比鋁膠、206佐劑標(biāo)準(zhǔn)劑量更好的免疫效果，在1000μg劑量也未發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠的毒副作用。
因此，在一方面，本發(fā)明提供了含有SEQ ID NO1的DNA基序序列，其中SEQ ID NO1是非甲基化的，并且該DNA基序序列中除SEQID NO1之外的其它序列不應(yīng)干擾SEQ ID NO1的佐劑效應(yīng)。
另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)CpG ODN與較大的DNA序列相連可以顯著提高CpG ODN的穩(wěn)定性和安全性，而又保持其佐劑效應(yīng)和低毒性。所述較大的DNA序列優(yōu)選為質(zhì)粒載體，如基因工程中常用的質(zhì)粒載體。優(yōu)選為puc18載體。
在另一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)和擴(kuò)增上述含有SEQ ID NO1的DNA序列的方法，包括下列步驟(1)人工合成兩端添加酶切位點(diǎn)部分堿基的SEQ ID NO1及其互補(bǔ)序列，采用DNA變性、復(fù)性技術(shù)使其成為雙鏈形式的DNA序列；(2)采用基因工程重組技術(shù)，將其克隆入質(zhì)粒載體；(3)用步驟(2)所得的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化原核宿主菌，挑選陽性克隆，測序鑒定后，再進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；和(4)大量提取和純化含有目的DNA序列的重組質(zhì)粒DNA。
其中步驟(2)中的質(zhì)粒載體可以是基因工程中常用的載體，用于使插入的DNA序列得到擴(kuò)增，并增加該DNA序列的穩(wěn)定性，同時(shí)保持其佐劑效應(yīng)，例如puc18質(zhì)粒載體。這類載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。添加酶切位點(diǎn)和克隆的方法是現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)手段，酶切位點(diǎn)例如可以是EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)。
步驟(3)中的原核宿主菌也是基因工程領(lǐng)域中常用的，其不具有甲基化的能力，例如大腸桿菌。宿主的轉(zhuǎn)化、陽性克隆的篩選、序列測定、宿主菌株的培養(yǎng)以及核酸序列的提取純化都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如描述于Sambrook等人的《Molecular CloningALaboratory Manual》(紐約，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，2001年)。
本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有明顯的特點(diǎn)和優(yōu)勢按本發(fā)明方法制造的豬疫苗用CpG DNA新型佐劑，其中的CpG基序佐劑序列具有在原核中不被甲基化的特性，而保持了其非特異性的免疫刺激作用；能使CpG基序佐劑序列在大腸桿菌等原核宿主菌中簡單易行地得到擴(kuò)增和大量提取，成本比合成方法低得多；該制造方法制備的CpG DNA新型佐劑含量可達(dá)2.5-4.0g/L，純度可達(dá)1.78-1.85(OD260/OD280)。
再一方面，本發(fā)明還提供了含有有效量的本發(fā)明DNA序列作為佐劑的動(dòng)物疫苗組合物，特別是豬重要疫病疫苗組合物。具體地，當(dāng)疫苗組合物為豬囊尾蚴蟲體抗原疫苗組合物時(shí)，本發(fā)明CpG DNA在所述疫苗組合物中的含量(以疫苗組合物總體積為基礎(chǔ)計(jì)算)可以為25-2500μg/ml，特別優(yōu)選的是25-500μg/ml。當(dāng)疫苗組合物為豬口蹄疫滅活病毒顆?？乖呙缃M合物時(shí)，本發(fā)明CpG DNA在所述疫苗組合物中的含量(以疫苗組合物總體積為基礎(chǔ)計(jì)算)可以為200μg/3ml。所述疫苗組合物中的免疫原選自豬囊尾蚴蟲體抗原和豬口蹄疫滅活病毒顆?？乖?。在該疫苗組合物中，本發(fā)明CpG DNA序列還可與其他商品化佐劑如206、鋁膠佐劑配伍使用，其中與206佐劑配伍效果最好。
附圖簡述

圖1重組CpG-DNA質(zhì)粒與不同佐劑配伍時(shí)對(duì)豬囊尾蚴抗原的免疫增強(qiáng)效果。Ag代表豬囊尾蚴抗原；CpG代表重組CpG-DNA質(zhì)粒；Al代表鋁膠佐劑；206代表206佐劑；control代表接種不含抗原的疫苗稀釋液。橫軸代表接種后天數(shù)，縱軸代表ELISA法檢測抗體的OD值。
圖2不同劑量的重組CpG-DNA質(zhì)粒對(duì)豬囊尾蚴抗原的免疫增強(qiáng)效果。Ag代表豬囊尾蚴抗原；CpG代表重組CpG-DNA質(zhì)粒；Al代表鋁膠佐劑；206代表206佐劑；control代表接種不含抗原的疫苗稀釋液；縱軸代表ELISA法檢測抗體的OD值。
圖3不同劑量的重組CpG-DNA質(zhì)粒對(duì)豬囊尾蚴抗原免疫增強(qiáng)IgG2a含量(即Th1反應(yīng))的作用。Ag代表豬囊尾蚴抗原；CpG代表重組CpG-DNA質(zhì)粒；Al代表鋁膠佐劑；206代表206佐劑；control代表接種不含抗原的疫苗稀釋液；縱軸表示IgG2a含量。
圖4重組CpG-DNA質(zhì)粒對(duì)豬囊尾蚴抗原誘導(dǎo)免疫脾細(xì)胞產(chǎn)生γ-IFN的能力(即Th1反應(yīng))的作用。Ag代表豬囊尾蚴抗原；CpG代表重組CpG-DNA質(zhì)粒；206代表206佐劑；control代表接種不含抗原的疫苗稀釋液；縱軸代表脾細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的γ-IFN的含量。
圖5重組CpG-DNA質(zhì)粒對(duì)豬口蹄疫滅活疫苗的免疫抗體滴度增強(qiáng)作用。F-V代表豬口蹄疫滅活疫苗；puc18代表不具有SEQ ID NO1的空載體；F-V+CpG DNA代表含有本發(fā)明CpG DNA質(zhì)粒的豬口蹄疫滅活疫苗；control代表接種不含抗原的疫苗稀釋液。橫軸代表接種后天數(shù)，縱軸代表抗體滴度。
通過下面的實(shí)施例，本發(fā)明將得到更充分的理解。這些實(shí)施例只是用來說明本發(fā)明，而不應(yīng)解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1制備含有SEQ ID NO1的本發(fā)明DNA序列1、CpG基序序列的合成與篩選依據(jù)CpG基序的空間效應(yīng)和動(dòng)物宿主特異性，設(shè)計(jì)、合成多種CpG基序，為防止很快降解將其進(jìn)行全鏈硫代修飾，在小鼠、家兔和豬體上進(jìn)行重要疫病疫苗(口蹄疫、豬瘟和豬囊蟲病)的配伍試驗(yàn)，從中篩選出豬用最佳佐劑核心序列SEQ ID NO1。
2、CpG基序序列的重組克隆人工再合成含CpG基序的非硫代的、非甲基化的上述SEQ ID NO1最佳佐劑核心序列，同時(shí)在其末端分別設(shè)計(jì)EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)的部分堿基，生成AAT TCT CGT CGT TTG TCG TTT TGT CGT TG及其互補(bǔ)序列，采用控溫變性、復(fù)性技術(shù)使其成為雙鏈DNA，通過基因工程重組技術(shù)，定向?qū)⑵淇寺∪雙uc18載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒測序鑒定，確認(rèn)已將含有CpG基序序列的SEQ ID NO1克隆到質(zhì)粒載體中。將正確插入了SEQ ID NO1的puc18重組質(zhì)粒命名為重組CpG-DNA質(zhì)粒。
3、重組CpG-DNA質(zhì)粒的大量擴(kuò)增、提取和純化選擇高拷貝的陽性菌株，接種到1000ml含氨芐的LB培養(yǎng)基中，在220rpm搖床中37℃培養(yǎng)12～14小時(shí)后，用SDS堿裂解法大量提取重組CpG-DNA質(zhì)粒。粗提取的質(zhì)粒經(jīng)5M冰冷的LiCl分離后，其上清液用等體積異丙醇沉淀，再用70％乙醇洗滌沉淀，離心除去上清；將沉淀用含RNase的TE緩沖液溶解，室溫處理30分鐘后，再用酚氯仿抽提2次，2倍無水乙醇沉淀離心；用1ml滅菌水溶解沉淀后，加入0.5ml PEG-MgCl2溶液(30mM MgCl2中加入40％PEG 8000)，充分混勻后放置15分鐘，13000rpm離心20分鐘，沉淀用70％的乙醇洗滌2次，再用TE緩沖液或無菌水溶解沉淀，用核酸蛋白檢測儀測定其含量和純度，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2含CpG-DNA質(zhì)粒的豬囊尾蚴疫苗將實(shí)施例1中提取純化的重組CpG-DNA質(zhì)粒單獨(dú)(100μg/只)或與其他佐劑配伍(鋁膠135μg/只；206佐劑100μl/只)，作為豬囊尾蚴抗原(200μg/只)的佐劑，制備疫苗免疫小鼠(200μl/只)，在免疫后不同時(shí)間剪尾采血分離血清，測定血清中的抗體、抗體亞型和免疫脾細(xì)胞分泌γ-IFN和IL-4的含量。試驗(yàn)證明能增強(qiáng)小鼠抗豬囊尾蚴的體液免疫和細(xì)胞免疫。重組CpG-DNA質(zhì)粒誘導(dǎo)的抗體水平，比鋁膠、206佐劑均較高，可持續(xù)120天以上，與鋁膠、206佐劑配伍均有協(xié)同作用，其中與206佐劑配伍效果最好(見圖1)。
實(shí)施例3含CpG-DNA質(zhì)粒的豬口蹄疫滅活疫苗將實(shí)施例1中提取純化的重組CpG-DNA質(zhì)粒200μg作為豬口蹄疫滅活疫苗(普通苗)免疫增強(qiáng)劑，共同免疫試驗(yàn)豬(3ml/頭)，并用該單獨(dú)疫苗(3ml/頭)作為陽性標(biāo)準(zhǔn)疫苗，用間接血凝和液相阻斷ELISA法檢測其抗體滴度，免疫后45天的抗體滴度可達(dá)134，是標(biāo)準(zhǔn)疫苗的4倍以上(見圖5)。
實(shí)施例4本發(fā)明CpG-DNA質(zhì)粒的毒副作用及使用劑量將實(shí)施例1中提取純化的重組CpG-DNA質(zhì)粒按10、20、100、200和1000μg/400μl/只的劑量(即CpG-DNA質(zhì)粒含量分別為25、50、250、500、2500μg/ml疫苗)作為小鼠的免疫佐劑，進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該佐劑具有劑量小，毒性低等特性。20μg重組CpG-DNA質(zhì)粒的小鼠免疫劑量可達(dá)到比鋁膠、206佐劑標(biāo)準(zhǔn)劑量更好的免疫效果，隨著劑量的增加Th1型反應(yīng)更明顯(見圖3，4)，在200μg、1000μg劑量也未發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠的毒副作用(見圖2)。
序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究院<120>一種CpG DNA新型佐劑及其制造方法和含有該佐劑的疫苗<160>1<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>1tcgtcgtttg tcgttttgtc gtt2權(quán)利要求
1.一種DNA序列，其特征在于該DNA序列中含有未甲基化的SEQID NO1，并且該DNA序列中除SEQ ID NO1之外的其它序列不干擾SEQ ID NO1的佐劑效應(yīng)，前提是所述DNA序列不為SEQ ID NO1。
2.權(quán)利要求1的DNA序列，其為質(zhì)粒和SEQ ID NO1的融合序列。
3.權(quán)利要求2的DNA序列，其中所述質(zhì)粒為puc18質(zhì)粒載體。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的DNA序列的制造和擴(kuò)增方法，包括以下步驟(1)人工合成兩端添加酶切位點(diǎn)部分堿基的所述單鏈DNA序列及其互補(bǔ)序列，采用DNA變性、復(fù)性技術(shù)使其成雙鏈形式；(2)采用基因工程重組技術(shù)，將其克隆入質(zhì)粒載體；(3)用步驟(2)所得的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化原核宿主菌，挑選陽性克隆，測序鑒定后，再進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；和(4)大量提取和純化含有所述DNA序列的重組質(zhì)粒DNA。
5.權(quán)利要求4的DNA序列的制造和擴(kuò)增方法，其中步驟(2)中的質(zhì)粒載體為puc18質(zhì)粒載體，步驟(3)中的原核宿主菌為大腸桿菌。
6.一種豬疫苗組合物，其特征在于該疫苗組合物含有有效量的權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的DNA序列作為佐劑。
7.權(quán)利要求6的豬疫苗組合物，其為豬囊尾蚴蟲體抗原疫苗組合物，其中以組合物總體積為基礎(chǔ)計(jì)算，所述DNA序列的濃度為25-2500μg/ml。
8.權(quán)利要求7的豬疫苗組合物，其中以組合物總體積計(jì)算，所述DNA的濃度為25-500μg/ml。
9.權(quán)利要求6的豬疫苗組合物，其為豬口蹄疫滅活病毒顆?？乖呙缃M合物，其中以組合物總體積為基礎(chǔ)計(jì)算，所述DNA序列的含量為200μg/3ml。
10.權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)的豬疫苗組合物，其還含有選自鋁膠和206佐劑的佐劑作為配伍佐劑。
11.權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)的豬疫苗組合物，其含有選自豬口蹄疫滅活病毒顆?？乖拓i囊尾蚴蟲體抗原的免疫原。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種CpG DNA新型佐劑。具體地，本發(fā)明提供了一種包含SEQ ID NO1的CpG基序序列，其是安全、高效、廉價(jià)的DNA分子新型佐劑，特別可用于豬疫病疫苗。本發(fā)明也提供了生產(chǎn)所述CpG DNA新型佐劑的具體方法，以及含有該新型佐劑的疫苗。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1814757SQ20051000913
公開日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2005年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月3日
發(fā)明者景志忠, 才學(xué)鵬, 蒙學(xué)蓮, 王佩雅, 竇永喜, 駱學(xué)農(nóng), 李輝, 鄭亞東 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所