專利名稱：枯草芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌制備方法及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種微生物。本發(fā)明還涉及這種微生物的制備方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及這種微生物的應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
目前還沒(méi)有關(guān)于此微生物的報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種可以將植物大分子蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子植物蛋白活性肽的枯草孢芽桿菌。本發(fā)明的目的還在于提供這種微生物的制備方法及其應(yīng)用方法。
本發(fā)明的菌種是一種具有下列特性，命名為枯草孢芽桿菌(Bacillus subtilis)的菌種。
本發(fā)明的產(chǎn)品是采用這樣的方法來(lái)制備的1.采樣將采樣工具及各種采樣容器進(jìn)行滅菌，在豆腐生產(chǎn)工廠附近下水道的淤泥中進(jìn)行多點(diǎn)采樣，將采集的樣品密封帶回實(shí)驗(yàn)室。
2.稀釋將采集的樣品混合均勻，稱取10克樣品，溶解于100mL無(wú)菌水中，其中裝有80-100粒玻璃珠，用力搖動(dòng)10分鐘，靜止一分鐘。用1mL無(wú)菌吸管吸取1mL上清液，移入9mL無(wú)菌水試管中，徹底搖勻。然后再?gòu)?mL的稀釋樣中取出1mL樣品再移入9mL無(wú)菌試管中，徹底搖勻。如此依次進(jìn)行稀釋，直至稀釋到10-9。
3.分離從上述稀釋的樣品中用0.1mL無(wú)菌吸管分別取出0.1mL樣品，移入瓊脂平板培養(yǎng)基中，用無(wú)菌三角刮棒，涂布均勻，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)重復(fù)。瓊脂平板培養(yǎng)基的配方大豆分離蛋白6.0g、葡萄糖3.0g、氯化鈉0.5g、脫脂乳粉4.0g、瓊脂粉1.5g、加入1.6％的溴甲酚綠乙醇溶液1mL、pH7.0，121℃滅菌20分鐘。
4.培養(yǎng)將涂布的平板置于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24小時(shí)，觀察挑菌。
5.挑菌將菌落周圍有透明圈的菌落挑入試管斜面中，挑取50個(gè)菌落，然后再進(jìn)行二次分離純化，最后得到純培養(yǎng)。從上述50株菌種中選出兩株透明圈最大者，進(jìn)行紫外線照射誘變。
6.紫外線誘變初篩將其中兩株菌分別在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)12小時(shí)，取出離心，用無(wú)菌水洗滌兩次，再用生理鹽水稀釋，用玻璃珠搖勻打碎，使細(xì)胞數(shù)達(dá)到107。在30W紫外燈下，距離10cm照射6分鐘，紅光下操作，然后涂布于上述瓊脂平板上，避光培養(yǎng)36小時(shí)。挑取菌落，移入試管斜面中，挑取50株菌株。
7.復(fù)篩將50株菌種逐個(gè)進(jìn)行培養(yǎng)、性能測(cè)試，從其中篩選出2株性能最佳者，再進(jìn)行誘變篩選，反復(fù)進(jìn)行3次。最后得到最優(yōu)良菌種L-B-05進(jìn)行菌種鑒定。
用本發(fā)明的枯草孢芽桿菌制取植物蛋白活性肽的方法以植物蛋白為原料，原料先進(jìn)行預(yù)處理，加水配制成重量百分比濃度為6-18％，調(diào)整PH值為6.0-7.0，然后在121℃高溫下進(jìn)行滅菌處理，冷卻至30-35℃，按重量百分比為5.0-10.0％接入培養(yǎng)成熟的枯草芽孢桿菌L-B-05菌種，通入無(wú)菌空氣，進(jìn)行攪拌發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)保持溫度在35℃±2℃，發(fā)酵周期為24-48小時(shí)；發(fā)酵結(jié)束在121℃溫度下進(jìn)行高溫滅活，先進(jìn)行過(guò)濾分離或精制，濃縮至25-40Bx，噴霧干燥制成產(chǎn)品。
用本發(fā)明的枯草孢芽桿菌制取植物蛋白活性肽的方法還可以包括1、高溫滅活后，先進(jìn)行過(guò)濾分離或精制，上清液再濃縮至25-40Bx，噴霧干燥制成產(chǎn)品。
2、所述的預(yù)處理是將原料進(jìn)行粉碎、配料、滅菌。
3、枯草芽孢桿菌L-B-05菌種的培養(yǎng)方法為斜面培養(yǎng)基牛肉膏5克，蛋白胨10克，NaCl 5克，瓊脂15克，水1000mL，pH 7.0，121℃滅菌20分鐘，擺成斜面冷卻，接種后35℃培養(yǎng)24小時(shí)，備用。
三角瓶液體培養(yǎng)基和液體擴(kuò)大種子培養(yǎng)基稱取100g豆粕粉，加1000mL水，使之徹底溶解，pH自然，121℃滅菌20分鐘，冷卻至35℃，接入種子，35℃溫度下進(jìn)行通風(fēng)培養(yǎng)12-16小時(shí)，培養(yǎng)成熟后接入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵。
對(duì)本發(fā)明的菌種進(jìn)行鑒定結(jié)果細(xì)胞形態(tài)為桿狀、能形成芽孢、芽孢不膨大、芽孢呈卵圓或短桿狀、不形成伴孢晶體、革蘭氏染色陽(yáng)性、接觸酶、VP試驗(yàn)＜pH6、甲基紅試驗(yàn)均呈陽(yáng)性、氧化酶、VP＞pH7試驗(yàn)呈陰性，好氧生長(zhǎng)，能夠利用葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇產(chǎn)酸，利用葡萄糖不產(chǎn)氣，能利用檸檬酸鹽、能還原硝酸鹽、能水解淀粉和干酪素，在pH5.7和7％NaCl培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)，50℃溫度下不能生長(zhǎng)，不能液化明膠。該菌株L-B-05保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏單位地址為北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2005年05月08日，其分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC NO.1367。
以枯草芽孢桿菌L-B-05為菌種，以大豆分離蛋白，大豆粉、大豆粕、豆餅、玉米蛋白粉、花生蛋白、花生餅、小麥谷朊蛋白粉、豌豆蛋白粉、棉籽蛋白、棉籽餅、油菜籽蛋白、菜籽餅中的任何一種或一種以上混合為主要原料進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，經(jīng)發(fā)酵將原料中的大分子蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)的植物蛋白活性肽。
通過(guò)生物發(fā)酵的方法，將植物中含有的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)化成植物蛋白活性肽。其產(chǎn)品的分子量范圍在200-10000道爾頓之間，而分子量在2000道爾頓以下的分子占總肽含量的90％以上。小分子植物蛋白活性肽不僅具有很好的溶解性、低粘度、高濃度優(yōu)良的流動(dòng)性，而且在體內(nèi)吸收快、利用率高。植物蛋白肽除了營(yíng)養(yǎng)豐富、容易吸收外，還具有抗高血壓，抗膽固醇，抗血栓形成，改善脂質(zhì)代謝，消除過(guò)多脂肪，防止動(dòng)脈硬化，增強(qiáng)人體體能和肌肉力量，促進(jìn)肌紅細(xì)胞復(fù)原，幫助恢復(fù)疲勞，促進(jìn)鈣磷和其它微量元素吸收、可以形成螯合鈣直接進(jìn)入血液沉積在骨骼中、不需要VD的參與。植物蛋白肽還有清除自由基、抗氧化性，起血液清道夫作用。植物蛋白活性肽還能促進(jìn)大腦和神經(jīng)發(fā)育、提高記憶力。植物蛋白活性肽還具有增強(qiáng)吞噬細(xì)胞和B細(xì)胞活力，增強(qiáng)免疫功能、抗癌、抗衰老、保護(hù)表皮細(xì)胞、防止黑色素沉淀、促進(jìn)細(xì)胞繁殖。保護(hù)肝臟、并有助于肝功能恢復(fù)，對(duì)糖尿病人具有預(yù)防和治療作用，可預(yù)防老年性癡呆、老年性骨質(zhì)疏松和膽結(jié)石的發(fā)生。
植物蛋白活性肽的粗制品如果應(yīng)用于動(dòng)物飼養(yǎng)可以促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、提高動(dòng)物的免疫力，增強(qiáng)抗病能力，降低料肉比，增進(jìn)和誘發(fā)動(dòng)物食欲。用于斷奶仔豬和保育豬可防止紅白痢的發(fā)生，減少死亡率，促進(jìn)動(dòng)物腸道絨毛細(xì)胞的發(fā)育。用于蝦的養(yǎng)殖可促進(jìn)蝦的快速生長(zhǎng)，防治蝦病的發(fā)生。用于奶牛的養(yǎng)殖可增加奶牛的產(chǎn)奶量和奶的質(zhì)量。用于毛皮動(dòng)物的養(yǎng)殖可使毛皮更加光亮。植物蛋白活性肽還可以用于花卉、煙草、中草藥、人參等經(jīng)濟(jì)作物的種植，提高產(chǎn)量和品質(zhì)。
根據(jù)這些功能植物蛋白活性肽可以作為添加劑或者是強(qiáng)化劑，添加到食品或飲料中，制成嬰幼兒特制大豆肽奶粉，孕婦、中老年保健大豆肽粉劑、沖劑、片劑、膠囊，大豆肽兒童食品、飲品，學(xué)生早餐增智食品、飲品，大豆肽運(yùn)動(dòng)員專用增強(qiáng)體能飲料，大豆肽咖啡、提神、醒腦、健腦、抗疲勞飲品，病人康復(fù)食品、飲品，婦女抗衰駐顏飲品、食品，肽護(hù)肝、保腎、抗癌、減肥、抗血栓、防動(dòng)脈硬化防糖尿病食品、飲品，肽強(qiáng)力補(bǔ)鈣、磷、微量元素吸收劑，肽保健白酒、啤酒、黃酒等酒類，肽養(yǎng)顏擴(kuò)膚化妝品，優(yōu)質(zhì)微生物培養(yǎng)基等。
植物蛋白活性肽主要應(yīng)用于食品、化妝品、保健品，其粗制品可用于發(fā)酵工業(yè)的微生物培養(yǎng)基、飼料強(qiáng)化劑、植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑等等。
(四)具體實(shí)施方案上述方案，也是本發(fā)明的最佳實(shí)施方案。
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌，其特征是它是具有如下特性
2.一種枯草芽孢桿菌的制備方法，其特征是(1)采樣將采樣工具及各種采樣容器進(jìn)行滅菌，在豆腐生產(chǎn)工廠附近下水道的淤泥中進(jìn)行多點(diǎn)采樣；(2)稀釋將采集的樣品混合均勻，稱取10克樣品，溶解于100mL無(wú)菌水中，其中裝有80-100粒玻璃珠，用力搖動(dòng)10分鐘，靜止一分鐘，用1mL無(wú)菌吸管吸取1mL上清液，移入9mL無(wú)菌水試管中，徹底搖勻，然后再?gòu)?mL的稀釋樣中取出1mL樣品再移入9mL無(wú)菌試管中，徹底搖勻，如此依次進(jìn)行稀釋，直至稀釋到10-9；(3)分離從上述稀釋的樣品中用0.1mL無(wú)菌吸管分別取出0.1mL樣品，移入瓊脂平板培養(yǎng)基中，用無(wú)菌三角刮棒，涂布均勻，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)重復(fù)，瓊脂平板培養(yǎng)基的配方大豆分離蛋白6.0g、葡萄糖3.0g、氯化鈉0.5g、脫脂乳粉4.0g、瓊脂粉1.5g、加入1.6％的溴甲酚綠乙醇溶液1mL、pH7.0，121℃滅菌20分鐘；(4)培養(yǎng)將涂布的平板置于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24小時(shí)，觀察挑菌；(5)挑菌將菌落周圍有透明圈的菌落挑入試管斜面中，挑取50個(gè)菌落，然后再進(jìn)行二次分離純化，最后得到純培養(yǎng)，從上述50株菌種中選出兩株透明圈最大者，進(jìn)行紫外線照射誘變；(6)紫外線誘變初篩將其中兩株菌分別在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)12小時(shí)，取出離心，用無(wú)菌水洗滌兩次，再用生理鹽水稀釋，用玻璃珠搖勻打碎，使細(xì)胞數(shù)達(dá)到107，在30W紫外燈下，距離10cm照射6分鐘，紅光下操作，然后涂布于上述瓊脂平板上，避光培養(yǎng)36小時(shí)。挑取菌落，移入試管斜面中，挑取50株菌株；(7)復(fù)篩將50株菌種逐個(gè)進(jìn)行培養(yǎng)、性能測(cè)試，從其中篩選出2株性能最佳者，再進(jìn)行誘變篩選，反復(fù)進(jìn)行3次，最后得到最優(yōu)良菌種L-B-05進(jìn)行菌種鑒定。
3.一種枯草芽孢桿菌的應(yīng)用方法，其特征是以植物蛋白為原料，原料先進(jìn)行預(yù)處理，加水配制成重量百分比濃度為6-18％，調(diào)整PH值為6.0-7.0，然后在121℃高溫下進(jìn)行滅菌處理，冷卻至30-35℃，按重量百分比為5.0-10.0％接入培養(yǎng)成熟的枯草芽孢桿菌L-B-05菌種，通入無(wú)菌空氣，進(jìn)行攪拌發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)保持溫度在35℃±2℃，發(fā)酵周期為24-48小時(shí)；發(fā)酵結(jié)束在121℃溫度下進(jìn)行高溫滅活，先進(jìn)行過(guò)濾分離或精制，濃縮至25-40Bx，噴霧干燥制成產(chǎn)品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用方法，其特征是高溫滅活后，先進(jìn)行過(guò)濾分離或精制，上清液再濃縮至25-40Bx，噴霧干燥制成產(chǎn)品。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用方法，其特征是所述的預(yù)處理是將原料進(jìn)行粉碎、配料、滅菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用方法，其特征是枯草芽孢桿菌L-B-05菌種的培養(yǎng)方法為斜面培養(yǎng)基牛肉膏5克，蛋白胨10克，NaCl5克，瓊脂15克，水1000mL，pH7.0，121℃滅菌20分鐘，擺成斜面冷卻，接種后35℃培養(yǎng)24小時(shí)，備用。三角瓶液體培養(yǎng)基和液體擴(kuò)大種子培養(yǎng)基稱取100g豆粕粉，加1000mL水，使之徹底溶解，pH自然，121℃滅菌20分鐘，冷卻至35℃，接入種子，35℃溫度下進(jìn)行通風(fēng)培養(yǎng)12-16小時(shí)，培養(yǎng)成熟后接入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用方法，其特征是枯草芽孢桿菌L-B-05菌種的培養(yǎng)方法為斜面培養(yǎng)基牛肉膏5克，蛋白胨10克，NaCl5克，瓊脂15克，水1000mL，pH7.0，121℃滅菌20分鐘，擺成斜面冷卻，接種后35℃培養(yǎng)24小時(shí)，備用。三角瓶液體培養(yǎng)基和液體擴(kuò)大種子培養(yǎng)基稱取100g豆粕粉，加1000mL水，使之徹底溶解，pH自然，121℃滅菌20分鐘，冷卻至35℃，接入種子，35℃溫度下進(jìn)行通風(fēng)培養(yǎng)12-16小時(shí)，培養(yǎng)成熟后接入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵。
全文摘要
本發(fā)明提供的是一種枯草芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌制備方法及其應(yīng)用方法。該菌種具有細(xì)胞形態(tài)為桿狀、能形成芽孢、芽孢不膨大、芽孢呈卵圓或短桿狀、不形成伴孢晶體、革蘭氏染色陽(yáng)性、接觸酶、VP試驗(yàn)＜pH6、甲基紅試驗(yàn)均呈陽(yáng)性、氧化酶、VP＞pH7試驗(yàn)呈陰性，好氧生長(zhǎng)，能夠利用葡萄糖、木糖、L－阿拉伯糖、甘露醇產(chǎn)酸，利用葡萄糖不產(chǎn)氣，能利用檸檬酸鹽、能還原硝酸鹽、能水解淀粉和干酪素，在pH5.7和7％NaCl培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)，50℃溫度下不能生長(zhǎng)，不能液化明膠的特性。以植物蛋白為主要原料，用本發(fā)明的菌種進(jìn)行發(fā)酵，可將原料中的大分子蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)的植物蛋白活性肽。
文檔編號(hào)C12R1/125GK1782068SQ20051001022
公開日2006年6月7日 申請(qǐng)日期2005年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月27日
發(fā)明者梁金鐘 申請(qǐng)人:樂(lè)能生物工程股份有限公司