專(zhuān)利名稱(chēng)：快速分析抗腫瘤中藥作用機(jī)理的dna芯片及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能夠快速分析抗腫瘤中藥作用機(jī)理的DNA芯片及其工藝。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是危害人類(lèi)健康的主要疾病，已成為繼心血管疾病之后居各類(lèi)疾病死亡率的第二致死病因。在我國(guó)，每年約有90萬(wàn)腫瘤病人死亡，并且近年來(lái)死亡人數(shù)呈逐年遞增的趨勢(shì)。因此，世界各國(guó)都投入巨資研究開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物。很明顯抗腫瘤藥物市場(chǎng)前景廣闊。盡管到目前為止已有數(shù)十種化療或輔助抗腫瘤藥物可以用于臨床治療，但大多數(shù)藥物只能使病情緩解，無(wú)法達(dá)到治愈的目的。尤其是大多數(shù)死亡率很高而又很常見(jiàn)的癌癥，如胃癌、食道癌、肺癌等仍缺乏有效的抗癌藥物。因此，迫切需要新的、具有明顯療效的抗癌藥物的研究和開(kāi)發(fā)。目前，中藥正逐步為世界所認(rèn)識(shí)、接受是不可否認(rèn)的事實(shí)與潮流，特別是中藥在抗癌、治癌方面有著明顯的優(yōu)勢(shì)，得到國(guó)際的公認(rèn)。有統(tǒng)計(jì)表明，歐美大藥廠研制一種新的合成藥物需要7～10年的時(shí)間和0.8～3.5億美元，而有些藥物如抗腫瘤藥，篩選命中率更低至萬(wàn)分之一。而我國(guó)的瑰寶中藥有數(shù)千年輝煌歷史、深入系統(tǒng)的理論和豐富寶貴的治療經(jīng)驗(yàn)，中藥材資源及相關(guān)方劑數(shù)不勝數(shù)，更有各種抗癌的古方、驗(yàn)方、秘方。應(yīng)該能夠大有所為，但如何讓中國(guó)已知抗癌功效的中藥進(jìn)入規(guī)范嚴(yán)格的國(guó)際市場(chǎng)，其瓶頸就是分析出成分復(fù)雜的中藥復(fù)方、單方的分子作用機(jī)理。這需要發(fā)明一種全新的系統(tǒng)。這種系統(tǒng)的特點(diǎn)必須是①能夠快速的大規(guī)模分析藥物作用原理；②通用性強(qiáng)；③適用范圍廣；④不局限于一種或一類(lèi)藥物。DNA芯片(DNA Microarray)技術(shù)，是順應(yīng)人類(lèi)基因組計(jì)劃(HGP)的進(jìn)行而產(chǎn)生的一種高通量、大規(guī)模研究基因功能的新技術(shù)，在基因芯片的表面，以微陣列(array)的方式固定有成千上萬(wàn)的寡核苷酸(oligo)或cDNA。使用DNA芯片可以大規(guī)模的對(duì)研究者感興趣的基因表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。人類(lèi)基因組計(jì)劃(HGP)獲得了大量基因信息，包括關(guān)鍵疾病基因的確定，為藥物作用提供了大量的新靶點(diǎn)。隨著分子腫瘤學(xué)、分子藥理學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的證據(jù)表明，抗腫瘤藥物發(fā)揮作用的機(jī)理均通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)而進(jìn)一步引起細(xì)胞和瘤體表型的改變。藥物作用后細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)變化特征與細(xì)胞和瘤體表型改變呈現(xiàn)內(nèi)在規(guī)律，根據(jù)這種規(guī)律，可以在未觀察到細(xì)胞表型變化之前就推測(cè)藥物的作用機(jī)理。藥物引發(fā)的基因表達(dá)變化非常復(fù)雜，呈現(xiàn)基因相互作用和調(diào)控后的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，根據(jù)個(gè)別基因的變化來(lái)推測(cè)藥物最終引起的表型變化往往有失偏頗。而通過(guò)觀察基因群的變化，雖復(fù)雜但能反映藥物作用的內(nèi)在規(guī)律。傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)均無(wú)法在同一時(shí)間內(nèi)分析大量的基因表達(dá)變化，而基因表達(dá)譜芯片集成了成千上萬(wàn)種基因，因此使在同一時(shí)間內(nèi)分析大量的基因表達(dá)變化成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)均無(wú)法在同一時(shí)間內(nèi)分析大量的基因表達(dá)變化的缺陷，本發(fā)明提供一種快速分析抗腫瘤中藥作用機(jī)理的DNA芯片及其方法，它可以縮短藥物研究開(kāi)發(fā)周期及減少藥物研究開(kāi)發(fā)費(fèi)用，加快中藥進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的快速分析抗腫瘤中藥作用機(jī)理的DNA芯片由下述具有轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞周期，癌基因和腫瘤抑制基因，應(yīng)激反應(yīng)蛋白，DNA合成、重組和修復(fù)，凋亡相關(guān)蛋白，細(xì)胞黏附受體蛋白，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞外通訊蛋白，細(xì)胞受體，細(xì)胞骨架/遷移蛋白，免疫系統(tǒng)蛋白，膜通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，代謝，翻譯后修飾/蛋白折疊，細(xì)胞交通定位，DNA結(jié)合及染色質(zhì)蛋白，細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)/效應(yīng)/調(diào)節(jié)子，細(xì)胞表面抗原，RNA處理、周轉(zhuǎn)和轉(zhuǎn)運(yùn)，翻譯，蛋白周轉(zhuǎn)，其他功能，和細(xì)胞外基質(zhì)生物學(xué)功能的基因片段組成?？焖俜治隹鼓[瘤中藥作用機(jī)理的方法按照下述步驟進(jìn)行分析一、選擇上述DNA芯片作為分析抗腫瘤中藥作用機(jī)理的芯片；二、選擇臨床常規(guī)使用的以及民間流行的抗腫瘤中藥作為工具藥物；三、選擇常用的腫瘤細(xì)胞株作為細(xì)胞模型；四、用上述抗腫瘤中藥分別作用于細(xì)胞模型后，利用CCK8方法篩選出各工具藥物相應(yīng)的敏感細(xì)胞系，提取mRNA，與DNA芯片雜交檢測(cè)藥物作用的基因；五、應(yīng)用生物信息學(xué)對(duì)藥物反應(yīng)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分類(lèi)；六、依據(jù)藥物標(biāo)志基因和特異性中瘤基因的變化規(guī)律，進(jìn)行分子細(xì)胞水平的機(jī)理驗(yàn)證。本發(fā)明的快速分析抗腫瘤中藥作用機(jī)理的DNA芯片及其方法具有許多商用價(jià)值和科研價(jià)值，具體表現(xiàn)為(1)能夠快速分析已知臨床使用的中藥以及民間秘方的抑制癌細(xì)胞的分子機(jī)理，改變中藥的出口困難的窘境。(2)該系統(tǒng)能夠作為一種商品，廣泛應(yīng)用于臨床、醫(yī)藥行業(yè)以及實(shí)際生產(chǎn)中。(3)探明分子作用機(jī)理，尋找到新的藥物靶點(diǎn)，為下一步開(kāi)發(fā)小分子藥物設(shè)計(jì)提供候選靶點(diǎn)。


圖1為CCK-8法檢測(cè)藥物對(duì)Hela癌細(xì)胞的半抑制率結(jié)果圖；圖2為CCK-8法檢測(cè)藥物對(duì)AGZY癌細(xì)胞的半抑制率結(jié)果圖；圖3為CCK-8法檢測(cè)藥物對(duì)PC3癌細(xì)胞的半抑制率結(jié)果圖；圖4為DNA片斷化實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，其中C對(duì)照，T藥物處理，M標(biāo)記；圖5為癌細(xì)胞經(jīng)5，7，4-三羥異黃酮處理前的形態(tài)圖；圖6為癌細(xì)胞經(jīng)5，7，4-三羥異黃酮處理后的形態(tài)圖；圖7為染料木素對(duì)PC3細(xì)胞6小時(shí)處理表達(dá)譜芯片熒光圖；圖8為RT-PCR驗(yàn)證TGF-β基因的表達(dá)變化結(jié)果圖，其中M分子量標(biāo)記，C對(duì)照，S樣品；圖9為RT-PCR驗(yàn)證VEGF165和VEGF121基因的表達(dá)變化結(jié)果圖，其中M分子量標(biāo)記，C對(duì)照，S樣品；圖10為RT-PCR驗(yàn)證Cyclin B和Cyclin A基因的表達(dá)變化結(jié)果圖，其中M分子量標(biāo)記，C對(duì)照，S樣品；圖11為5，7，4-三羥異黃酮藥物抑制PC3癌細(xì)胞的基因通路圖。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式的快速分析抗腫瘤中藥作用機(jī)理的DNA芯片的基因類(lèi)型、參數(shù)詳見(jiàn)表1～2。
具體實(shí)施方式
二.本實(shí)施方式按照下述步驟快速分析抗腫瘤中藥作用機(jī)理一、選擇抗腫瘤中藥作為工具藥物，它們可以是亞砷酸注射液、紫杉醇注射液、寄生多肽、土槿皮酸、5，7，4-三羥異黃酮、大豆皂甙、大豆甾醇等中的一種或幾種。二、本發(fā)明采用的篩選抗腫瘤藥物的細(xì)胞株是目前常用的腫瘤細(xì)胞株，它們是早幼細(xì)胞白血病HL-60、慢性髓細(xì)胞性白血病K-562、肝癌HepG2、胃腺癌BGC823、乳腺癌Bcap-37、卵巢癌HO8910、前列腺癌PC3、宮頸癌Hela等中的一種或幾種。三、用上述抗腫瘤中藥分別作用于細(xì)胞模型后，利用CCK8方法篩選出各工具藥物相應(yīng)的敏感細(xì)胞系，依據(jù)其半抑制濃度值IC50。
公式抑制率(％)＝(對(duì)照組OD值-用藥組OD值)/對(duì)照組OD值×100四、用上述實(shí)驗(yàn)獲得的藥物IC50濃度處理相應(yīng)腫瘤細(xì)胞系，提取mRNA，與DNA芯片雜交，檢測(cè)藥物作用下基因表達(dá)水平變化。具體步驟腫瘤細(xì)胞用中藥相應(yīng)的IC50濃度處理5分鐘，30分鐘，1小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)，8小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)后，利用RNeasy RNA試劑盒提取各時(shí)間段總RNA，通過(guò)紫外分光度計(jì)檢測(cè)RNA的Ratio值。進(jìn)一步利用Oligotex mRNA Midi試劑盒純化分離mRNA，選取Cy3和Cy5為熒光物，進(jìn)行后標(biāo)記，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)標(biāo)記效率。探針與雜交液(含50％甲酰胺)均勻混合，平鋪于芯片表面，蓋上Takara的芯片專(zhuān)用蓋玻片，置于42℃避光水浴20小時(shí)進(jìn)行雜交。取出雜交后的芯片，利用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)南雌椒ㄟM(jìn)行后處理，自動(dòng)化的洗片機(jī)保證芯片之間的差異程度降到最低。經(jīng)過(guò)洗滌后的芯片立刻用Axon4000A型掃描儀進(jìn)行掃描，采集數(shù)據(jù)，獲得藥物對(duì)特定細(xì)胞株的基因表達(dá)譜。根據(jù)生物信息學(xué)聚類(lèi)分析，獲得藥物作用細(xì)胞株后，具有表達(dá)規(guī)律的靶基因。利用Western blot(免疫印記)以及RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng))驗(yàn)證這些基因的表達(dá)規(guī)律，推測(cè)中藥抑制癌細(xì)胞的分子機(jī)理。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式以5，7，4-三羥異黃酮藥物為例，對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明一、制備DNA芯片1、本實(shí)施方式使用17000個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為點(diǎn)樣DNA(基因類(lèi)型、參數(shù)詳見(jiàn)表1～2)，用50％DMSO(二甲基亞砜)將PCR產(chǎn)物溶解至濃度為0.2μg/μl～0.5μg/μl，成為點(diǎn)樣工作液(注PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣前應(yīng)變性99.9℃5min，迅速放于冰上)。2、將點(diǎn)樣工作液按所需要的點(diǎn)陣模式進(jìn)行排列，轉(zhuǎn)移到384孔的微孔板中，即可開(kāi)始點(diǎn)樣(溫度20～23℃，相對(duì)濕度40～50％)，采用Telechem公司的醛基化玻片進(jìn)行點(diǎn)樣。3、點(diǎn)樣完畢后，玻片在室溫防塵條件下放置過(guò)夜，放置一周更好。4、取出過(guò)夜放置的玻片，以60mJ/cm2的能量進(jìn)行紫外交聯(lián)兩次。5、芯片的后處理(在做芯片的后處理前應(yīng)在玻片上標(biāo)記好DNA點(diǎn)陣的位置，因?yàn)楹筇幚砗簏c(diǎn)陣將看不到)①紫外交聯(lián)固定后，將玻片在0.2％SDS(十二烷基磺酸鈉)溶液中潤(rùn)洗2次，每次2min，以去掉未結(jié)合上的DNA；②將玻片在滅菌去離子水中室溫洗2次，每次2min；③將玻片放入95～100℃(剛停止沸騰)的水中，水浴2min，使DNA變性；④取出玻片，室溫放置5min，使之冷卻；⑤將玻片置于新鮮配制的NaBH4溶液(1.5克NaBH4溶于450ml PBS(磷酸鹽緩沖液)溶液中，然后加入133ml 100％乙醇)中，處理5分鐘以封閉自由醛基；⑥將玻片置于0.2％SDS中潤(rùn)洗3次，每次1min；⑦將玻片置于滅菌去離子水中潤(rùn)洗2次，每次1min；⑧700rpm/min離心干燥3min，得到可供使用芯片，芯片在室溫下防塵保存。
二、CCK-8法分析5，7，4-三羥異黃酮對(duì)不同的癌細(xì)胞的殺傷抑制率1、經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)檢索以及實(shí)驗(yàn)分析，5，7，4-三羥異黃酮微溶于水，而易溶于Na2CO3，將其配成母液10mM，然后經(jīng)過(guò)濾膜過(guò)濾除菌；2、CCK-8法分析5，7，4-三羥異黃酮對(duì)不同的癌細(xì)胞的殺傷抑制率，IC50(50％抑制率)檢測(cè)；CCK-8實(shí)驗(yàn)步驟①細(xì)胞計(jì)數(shù)；②播種5.6×104細(xì)胞/ml，每孔90ul，放置于培養(yǎng)箱(37度，5％的CO2)培養(yǎng)24h；③加藥每孔10ul混勻，放置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h；④加CCK-8溶液每孔10ul混勻，注意不要產(chǎn)生氣泡，放置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h(CCK用之前要37度水浴5min)；⑤于酶標(biāo)儀450nm進(jìn)行讀數(shù)，從而得出細(xì)胞存活率。藥物濃度(五個(gè)不同梯度)見(jiàn)圖1～3。3、5，7，4-三羥異黃酮藥物導(dǎo)致AGZY癌細(xì)胞凋亡的確認(rèn)通過(guò)DNA ladder(DNA片斷化)以及AGZY細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)來(lái)檢測(cè)凋亡(見(jiàn)圖4～6)。4、處理時(shí)間選取通過(guò)對(duì)PC3細(xì)胞進(jìn)行5分鐘，30分鐘，1小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)，8小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)藥物處理，利用RNeasy RNA試劑盒提取各時(shí)間段總RNA，通過(guò)紫外分光度計(jì)檢測(cè)RNA的Ratio(比值)值，進(jìn)一步利用Oligotex mRNA Midi試劑盒純化分離mRNA。
三、探針標(biāo)記及芯片雜交實(shí)驗(yàn)將各時(shí)間點(diǎn)樣本mRNA(信使核糖核酸)和原始細(xì)胞reference RNA(參考RNA)進(jìn)行雜交分析。步驟如下(1)用amino allyl-dUTP(氨基酰脫氧尿苷酸，AA dUTP)修飾cDNA引物退火①在冰上于1.5ml離心管中加入以下成分mRNA(500ng，小于9μl) Xμl隨機(jī)引物 1μloligo(dt)(寡聚脫氧胸腺嘧啶) 1μl水(試劑盒提供)Yμl總體積11μl注意如使用總RNA，則略去隨機(jī)引物，oligo(dT)的使用量為3μl；②用吸頭上下輕輕混勻；③反應(yīng)體系于70℃溫育5min；④室溫冷卻10min，使引物與mRNA模板退火；⑤離心15s。
延伸①在以上的反應(yīng)體系中加入以下成分(最后加酶)5Xbuffer(緩沖液) 4μl0.1M DTT(二硫蘇糖醇) 2μlNucleotide mix(核苷酸混合物) 1μlAA-dUTP(氨基酰脫氧尿苷酸) 1μl反轉(zhuǎn)錄酶 1μl總體積20μl②用吸頭輕混，離心15s，過(guò)激混將使酶降；③42℃溫育1.5小時(shí)；④將cDNA(互補(bǔ)DNA)放于冰上立即純化或-20℃儲(chǔ)存。
(2)純化amino allyl修飾的cDNA
降解mRNA①水浴調(diào)整至37℃；②在每個(gè)反應(yīng)管中加2μl 2.5M NaOH；③用漩渦混合器混勻，離心15s；④37℃溫育15min；⑤在每個(gè)反應(yīng)管中加入10μl 2M HEPES；⑥用漩渦混合器混勻，離心15s；⑦cDNA現(xiàn)在可以用來(lái)純化或者貯存于-20℃。
用GFX純化試劑盒純化cDNA(在用GFX純化之前，需準(zhǔn)備新配置的0.1M，pH＝9.0的NaHCO3)①在每個(gè)柱上加500μl capture buffer(捕捉緩沖液)；②將未純化的cDNA轉(zhuǎn)移至柱上，上下吸5次混勻；③13 800g離心30s；④棄去管底部的液體，將柱重新放入收集管；⑤加600ul 80％的乙醇，13 800g離心30s；⑥棄去液體，重復(fù)步驟5，共洗3次，最后一次洗后，棄去液體，將管重新放入同一收集管；⑦13 800g離心15s，除去殘留乙醇，棄掉管；⑧將GFX柱轉(zhuǎn)移至新管，加60μl 0.1M NaHCO3，使液體覆蓋整個(gè)膜；⑨室溫1～5min，13 800g離心1min收集純化的aminoallyllabelled cDNA(氨基酰標(biāo)記的cDNA)；⑩立刻進(jìn)行以下的反應(yīng)。
(3)用Cy3、Cy5標(biāo)記amino allyl修飾的cDNA后標(biāo)的偶聯(lián)反應(yīng)(避光操作)①將cDNA直接放入CyDye NHS ester(Cy染料NHS酯)的1.5ml管中，用吸頭反復(fù)重懸數(shù)次，13 800g離心1分以使所有液體收集于底部；②室溫避光作用60～90min；③加15μl 4M的羥胺于每個(gè)反應(yīng)管；④上下吸數(shù)次混勻，室溫暗處作用15min；⑤繼續(xù)以下的純化反應(yīng)。
純化熒光標(biāo)記的cDNA(用CyScribe GFX純化試劑盒，wash buffer在使用前加入40ml的無(wú)水乙醇，加后密封以防揮發(fā))①將GFX柱放入干凈的收集管，加500ul capture buffer(捕捉緩沖液)；②將未純化的cDNA(20-100μl)轉(zhuǎn)移至每個(gè)柱，用吸頭輕柔混五次；③立即于13 800g離心30s，cDNA探針在capture buffer中超過(guò)10min將會(huì)使產(chǎn)量降低；④棄去底部液體，將柱重新放入收集管；⑤加600μul的wash buffer(沖洗緩沖液)，13 800g離心30s；⑥重復(fù)步驟⑤，共需洗三次，不要縮減洗的次數(shù)；⑦最后一次洗后，另需離心10s以充分除去wash buffer；⑧將柱轉(zhuǎn)移至新的收集管，加60μl的elution buffer(洗脫緩沖液)，使其覆蓋整個(gè)膜，將elution buffer預(yù)熱至65度將會(huì)使收率提高5％；⑨室溫作用1～5min，13800g離心1min收集標(biāo)記的cDNA；⑩重復(fù)步驟⑨，在260nm下檢測(cè)cDNA濃度，649nm和550nm分別檢測(cè)Cy5和Cy3的摻入率。
(4)雜交及洗片雜交①將標(biāo)記的兩管cDNA合并成一管，避光將cDNA蒸干；②將cDNA溶解于6μl無(wú)核酸酶的水中；③95℃變性2min；④冰上冷卻30s；⑤加1.5μl的polyA(多聚腺苷酸)(1mg/ml)以封閉polyT(多聚胸腺嘧啶)尾巴，混勻，75℃作用45min；⑥加7.5μl的雜交緩沖液(提供好的)和15μl 100％的甲酰胺，混合均勻，離心15s；⑦鋪片，不要有氣泡(將Takara的蓋玻片蓋于雜交區(qū)域，然后用移液器從蓋玻片兩側(cè)分別注入一半體積的雜交液)；⑧42℃濕盒中雜交16～18h，注意避光。
洗片盡量采用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)南雌绦?。①先?50ml預(yù)熱至55℃的1×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉緩沖液)+0.2％SDS(十二烷基磺酸鈉)中洗10分鐘；②然后在預(yù)熱至55℃的0.1×SSC+0.2％SDS中洗兩次，每次洗10分鐘；③室溫在0.1×SSC中洗兩次，每次1分鐘；④最后在ddH2O(雙蒸水)中浸一下(小于10s)；⑤短暫離心干燥。
四、用Axon4000A型掃描儀進(jìn)行掃描，采集數(shù)據(jù)見(jiàn)圖7，經(jīng)過(guò)雙通道激光掃描儀在波長(zhǎng)為650nm與550nm分別掃描后，得到組圖中代表性的一張表達(dá)譜芯片熒光圖。
五、生物信息學(xué)分析經(jīng)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析，顯示5，7，4-三羥異黃酮藥物抑制PC3癌細(xì)胞，一些與血管生成密切相關(guān)的基因表達(dá)明顯下調(diào)，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)和骨衍生生長(zhǎng)因子(BDGF)等等。而與細(xì)胞生長(zhǎng)周期相關(guān)的基因也有明顯變化，如細(xì)胞周期素A(cyclin A)、細(xì)胞周期素B(cyclin B)以及細(xì)胞分裂周期基因25(CDC25)的表達(dá)下調(diào)，然而細(xì)胞周期素G2(cyclin G2)的表達(dá)則上調(diào)了。
六、RT-PCR驗(yàn)證RT-PCR驗(yàn)證分析芯片得到的表達(dá)差異基因，TGF-β，VEGF，Cyclin B，Cyclin A的變化，見(jiàn)圖8～10。
七、分析5，7，4-三羥異黃酮藥物抑制PC3癌細(xì)胞的基因通路，由圖11可以看出，紅色表示基因表達(dá)上調(diào)，綠色表示基因表達(dá)下調(diào)，Genistein染料木素降低CDC25及cyclin B的表達(dá)，上調(diào)cyclin G2的表達(dá)，從而抑制PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)；而且還能通過(guò)降低VEGF，BPGF和TGF-β來(lái)抑制腫瘤血管的生成達(dá)到抗腫瘤的目的。
表1. 17000個(gè)基因芯片的基因類(lèi)別


權(quán)利要求
1.一種快速分析抗腫瘤中藥作用機(jī)理的DNA芯片，其特征在于所述DNA芯片由下述具有轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞周期，癌基因和腫瘤抑制基因，應(yīng)激反應(yīng)蛋白，DNA合成、重組和修復(fù)，凋亡相關(guān)蛋白，細(xì)胞黏附受體蛋白，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞外通訊蛋白，細(xì)胞受體，細(xì)胞骨架/遷移蛋白，免疫系統(tǒng)蛋白，膜通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，代謝，翻譯后修飾/蛋白折疊，細(xì)胞交通定位，DNA結(jié)合及染色質(zhì)蛋白，細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)/效應(yīng)/調(diào)節(jié)子，細(xì)胞表面抗原，RNA處理、周轉(zhuǎn)和轉(zhuǎn)運(yùn)，翻譯，蛋白周轉(zhuǎn)，其他功能，和細(xì)胞外基質(zhì)生物學(xué)功能的基因片段組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速分析抗腫瘤中藥作用機(jī)理的DNA芯片，其特征在于所述DNA芯片的參數(shù)為探針基因類(lèi)型雙鏈cDNA；cDNA片段長(zhǎng)度≥500bp，平均1.4kb；基質(zhì)玻片；點(diǎn)數(shù)17000；包含基因數(shù)17000；陽(yáng)性對(duì)照50；陰性對(duì)照50；管家基因30；比值變化標(biāo)準(zhǔn)4；質(zhì)控基因重復(fù)次數(shù)12；檢測(cè)方法雙色熒光競(jìng)爭(zhēng)雜交法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速分析抗腫瘤中藥作用機(jī)理的DNA芯片，其特征在于所述具有轉(zhuǎn)錄生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為1547；具有細(xì)胞周期生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為412；具有癌基因和腫瘤抑制基因生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為423；具有應(yīng)激反應(yīng)蛋白生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為510；具有DNA合成、重組和修復(fù)生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為345；具有凋亡相關(guān)蛋白生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為417；具有細(xì)胞黏附受體蛋白生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為506；具有細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞外通訊蛋白生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為678，具有細(xì)胞受體生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為1697；具有細(xì)胞骨架/遷移蛋白生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為524；具有免疫系統(tǒng)蛋白生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為346；具有膜通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為667；具有代謝生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為1482；具有翻譯后修飾/蛋白折疊生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為534；具有細(xì)胞交通定位生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為742；具有DNA結(jié)合及染色質(zhì)蛋白生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為379；具有細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為411；具有細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)/效應(yīng)/調(diào)節(jié)子生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為1669；具有細(xì)胞表面抗原生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為422；具有RNA處理、周轉(zhuǎn)和轉(zhuǎn)運(yùn)生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為473；具有翻譯生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為413；具有蛋白周轉(zhuǎn)生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為633；具有其他功能生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為1112；具有細(xì)胞外基質(zhì)生物學(xué)功能的基因片段的數(shù)目為326。
4.利用權(quán)利要求1所述DNA芯片快速分析抗腫瘤中藥作用機(jī)理的方法，其特征在于所述分析抗腫瘤中藥作用機(jī)理的方法按照下述步驟進(jìn)行分析一、選擇權(quán)利要求1所述的DNA芯片作為分析抗腫瘤中藥作用機(jī)理的芯片；二、選擇臨床常規(guī)使用的以及民間流行的抗腫瘤中藥作為工具藥物；三、選擇常用的腫瘤細(xì)胞株作為細(xì)胞模型；四、用上述抗腫瘤中藥分別作用于細(xì)胞模型后，利用CCK8方法篩選出各工具藥物相應(yīng)的敏感細(xì)胞系，提取mRNA，與DNA芯片雜交檢測(cè)藥物作用的基因；五、應(yīng)用生物信息學(xué)對(duì)藥物反應(yīng)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分類(lèi)；六、依據(jù)藥物標(biāo)志基因和特異性腫瘤基因的變化規(guī)律，進(jìn)行分子細(xì)胞水平的機(jī)理驗(yàn)證。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用DNA芯片快速分析抗腫瘤中藥作用機(jī)理的方法，其特征在于所述抗腫瘤中藥為亞砷酸注射液、紫杉醇注射液、寄生多肽、土槿皮酸、5，7，4-三羥異黃酮、大豆皂甙、大豆甾醇中的一種或幾種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用DNA芯片快速分析抗腫瘤中藥作用機(jī)理的方法，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞株為早幼細(xì)胞白血病HL-60、慢性髓細(xì)胞性白血病K-562、肝癌HepG2、胃腺癌BGC823、乳腺癌Bcap-37、卵巢癌HO8910、前列腺癌PC3、宮頸癌Hela中的一種或幾種。
全文摘要
快速分析抗腫瘤中藥作用機(jī)理的DNA芯片及其方法，它屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。為解決傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)均無(wú)法在同一時(shí)間內(nèi)分析大量的基因表達(dá)變化的缺陷，本發(fā)明的DNA芯片所涉及到的基因包括凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、藥物轉(zhuǎn)化代謝等，分析抗腫瘤中藥作用機(jī)理的方法為選擇抗腫瘤中藥作為工具藥物，腫瘤細(xì)胞株作為細(xì)胞模型；用上述抗腫瘤中藥分別作用于細(xì)胞模型后，篩選出各工具藥物相應(yīng)的敏感細(xì)胞系，然后用基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)藥物作用的基因；應(yīng)用生物信息學(xué)對(duì)藥物反應(yīng)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分類(lèi)；依據(jù)藥物標(biāo)志基因和特異性腫瘤基因的變化規(guī)律，進(jìn)行分子細(xì)胞水平的機(jī)理驗(yàn)證。本發(fā)明可縮短藥物研究開(kāi)發(fā)周期及減少藥物研究開(kāi)發(fā)費(fèi)用，加快中藥進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1766121SQ20051001042
公開(kāi)日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2005年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月12日
發(fā)明者韓俊, 李昌利, 顧雪鋒, 李克深, 閆作梅, 于小麗, 楊光 申請(qǐng)人:哈爾濱基太生物芯片開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司