專利名稱：一種反硝化細菌直接倍比稀釋pcr快速定量檢測方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種反硝化細菌的檢測方法。
背景技術(shù)：
以往檢測反硝化細菌(DNB)主要依據(jù)杜氏小管中是否有N2生成，利用格利斯試劑I、格利斯試劑II、二苯胺試劑、濃硫酸是否檢測到有NO-2生成和NH3的存在，或是采用氣相色譜檢測法檢測。但以往檢測反硝化細菌的方法煩瑣，不能定量檢測，整個檢測過程需要25-29天，對生產(chǎn)和科學研究無法提供有效和即時的數(shù)據(jù)，而且檢測費用高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決以往檢測反硝化細菌的方法煩瑣，不能定量檢測，檢測時間長，無法為生產(chǎn)和科學研究提供有效和即時的數(shù)據(jù)，檢測費用高的問題，而提供的一種反硝化細菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法。本發(fā)明通過以下步驟實現(xiàn)(一)菌體的制備；(二)將制備的菌體在冰上進行倍比稀釋；(三)倍比稀釋液在冰上進行PCR操作；(四)采用三管或五管平行法；(五)PCR擴增；(六)1.0％的瓊脂糖電泳檢測；(七)觀察結(jié)果，記數(shù)、查表計算得出結(jié)論；所述的步驟(三)中PCR的反應體系為20μL由2μL Buffer(10×)，2μL dNTP，1μL 0.1μmol/L的特意引物I DNBF5’-GC[T/C][C/T]ACCAAG[G/C]CGACGATC-3’共19bp、1μL 0.1μmol/L的特意引物IIDNBR5’-ACCAGG GTATCTAATCCTG-3’共19bp、0.3U rTaq酶、11.7μL去離子水和2μL經(jīng)梯度稀釋的樣品組成。本發(fā)明用已倍比稀釋的反硝化細菌菌體作為模板直接進行PCR擴增檢測，方法簡單，可定量檢測，檢測時間短，檢測費用低，并且可以即時、準確的提供數(shù)據(jù)用于生產(chǎn)和科學研究。
本發(fā)明中使用的器材、藥品、試劑和酶均可通過生物制品公司購買得到，藥品、試劑和酶按產(chǎn)品說明保存。特意引物I和特意引物II的基因序列由發(fā)明人自己設計，生物制品公司合成，-20℃低溫保存。


圖1是本發(fā)明用含有高純氮氣的厭氧管取回的油田污水作檢測樣，經(jīng)1.0％的瓊脂糖電泳后第1至第4稀釋梯度的結(jié)果，圖2是本發(fā)明用含有高純氮氣的厭氧管取回的反應器污水作檢測樣，經(jīng)1.0％的瓊脂糖電泳后第5至第6稀釋梯度的結(jié)果，附圖上端數(shù)字表示稀釋梯度。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式通過以下述步驟進行(一)菌體的制備取1mL檢測樣注入到已滅菌的1.5mL的離心管中，在震蕩器上充分震蕩3-5min，之后在13000r/min下離心1min，離心后棄上清液0.9mL，再向剩余的0.1mL檢測樣中加入菌體前處理緩沖液0.9mL，然后將離心管置于震蕩器上充分震蕩5min，再在13000r/min下離心2min，離心后棄上清液0.98mL，再次充分震蕩2min即制備完成，短時間保存采用4℃，長時間保存采用-20℃；(二)將制備的菌體在冰上進行倍比稀釋吸取2μL菌體加入到PCR管中，再加入18μL的去離子水，用移液槍將其吸打混勻；然后依次從上一稀釋梯度的PCR管中吸取菌體2μL加入到下一稀釋梯度的PCR管中，加入18μL的去離子水吸打混勻，直到稀釋的倍數(shù)為103-1012，保留3-7個稀釋梯度；(三)在冰上進行PCR操作，PCR反應體系為20μL由2μL Buffer(10×)、2μLdNTP、1μL 0.1μmol/L的特意引物I DNBF5’-GC[T/C][C/T]ACCAAG[G/C]CGACGATC-3’共19bp、1μL 0.1μmol/L的特意引物II DNBR5’-ACCAGGGTATCTAATCCTG-3’共19bp、0.3U rTaq酶、11.7μL去離子水和2μL經(jīng)梯度稀釋的樣品組成；(四)采用三管或五管平行法，保留的3-7個稀釋梯度，每個稀釋梯度作3或5平行樣；(五)PCR擴增，擴增程序為94℃預熱5min，94℃變性30s，55.9℃復性45s，72℃延伸90s，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min；(六)1.0％的瓊脂糖電泳檢測；(七)觀察結(jié)果，記數(shù)、查表計算得出結(jié)論。
本實施方式操作在超凈工作臺下完成，操作前超凈工作臺需紫外線滅菌20-40min。本實施方式中菌體前處理緩沖母液由70g NaCi、2g KCi、12g Na2HPO4、2g KH2PO4、1‰SDS和1L去離子水組成，將菌體前處理緩沖母液稀釋10倍制成工作液，工作液用NaOH調(diào)pH值為7.5，在121℃條件下滅菌15-30min后使用。
本實施方式整個過程需要3.5-4h，檢測菌落數(shù)量級比以往的方法高102，真實的反應了檢測樣中實際DNB菌的數(shù)量，對生產(chǎn)和科學研究有指導性意義，而且費用低廉。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(四)采用三管平行法，保留的3-7個稀釋梯度，每個稀釋梯度作3平行樣。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一、二的不同點是步驟(四)采用五管平行法，保留的3-7個稀釋梯度，每個稀釋梯度作5平行樣。
本實施方式步驟(七)反硝化細菌的查表計算方法是選擇后三個連續(xù)稀釋梯度(10x、10x+1、10x+2)，將有菌體DNA條帶出現(xiàn)的管數(shù)按稀釋梯度由小到大的順序排列成一個三位數(shù)稱之為條帶近似值(abc)。其中，第一個稀釋梯度(10x)是最后一個5個試管中都有菌體DNA條帶出現(xiàn)的稀釋梯度，如果第三個稀釋梯度(10x+2)再往下的梯度稀釋管仍有菌體DNA條帶出現(xiàn)，可將此管數(shù)加到第三個稀釋梯度(10x+2)上。然后查閱哈爾濱工業(yè)大學出版社2002年出版的《污染控制微生物學實驗》32-38頁“每毫升稀釋液的細菌近似值表”得出對應數(shù)值，計算出1mL檢測樣中反硝化細菌的總數(shù)。計算公式如下1mL檢測樣中反硝化細菌的總數(shù)(個)＝條帶近似值(abc)表中對應數(shù)值×三個稀釋梯度中第一個稀釋梯度的稀釋倍數(shù)(10x)×10×102％；本實施方式結(jié)果表明，三管平行法記錄的結(jié)果無論在檢測樣濃度低或高的情況下，數(shù)量級上與五管平行法無差別。本實施方式采用五管平行法在于五管平行法可以精確到一個菌體，更加準確，置信度大于99％。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
三的不同點是用含有高純氮氣的厭氧管取回的油田污水作檢測樣，1.0％的瓊脂糖電泳檢測結(jié)果如圖1、圖2所示。
本實施方式選擇104、105、106三個稀釋梯度，條帶近似值(540)，查閱哈爾濱工業(yè)大學出版社2002年出版的《污染控制微生物學實驗》32-38頁“每毫升稀釋液的細菌近似值表”得出其對應數(shù)值13。
從而得出本實施方式中1mL檢測樣中反硝化細菌的總數(shù)(個)＝條帶近似值(540)×104×10×102％＝13×104×10×102％＝1.326×106(個)
序列表(1)特意引物I的信息(a)序列特征長度19bp類型核酸鏈性單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型rDNA(c)序列描述特意引物I DNBFGC[T/C][C/T]ACCAAG[G/C]CGACGATC(2)特意引物II的信息(a)序列特征長度19bp類型核酸鏈性單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型rDNA(c)序列描述特意引物II DNBRACCAGGGTATCTAATCCTG
權(quán)利要求
1.一種反硝化細菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，其特征是它通過以下步驟實現(xiàn)(一)菌體的制備；(二)將制備的菌體在冰上進行倍比稀釋；(三)倍比稀釋液在冰上進行PCR操作；(四)采用三管或五管平行法；(五)PCR擴增；(六)1.0％的瓊脂糖電泳檢測；(七)觀察結(jié)果，記數(shù)、查表計算得出結(jié)論；所述的步驟(三)中PCR的反應體系為20μL由2μL Buffer(10×)，2μL dNTP，1μL 0.1μmol/L的特意引物I DNBF5’-GC[T/C][C/T]ACCAAG[G/C]CGACGATC-3’共19bp、1μL 0.1μmol/L的特意引物II DNBR5’-ACCAGGGTATCTAATCCTG-3’共19bp、0.3U rTaq酶、11.7μL去離子水和2μL經(jīng)梯度稀釋的樣品組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反硝化細菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，其特征在于整個操作在超凈工作臺下完成，操作前超凈工作臺紫外線滅菌20-40min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反硝化細菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，其特征在于步驟(一)菌體的制備方法如下取1mL檢測樣注入到已滅菌的1.5mL的離心管中，在震蕩器上充分震蕩3-5min，之后在13000r/min下離心1min，離心后棄上清液0.9mL，再向剩余的0.1mL檢測樣中加入菌體前處理緩沖液0.9mL，然后將離心管置于震蕩器上充分震蕩5min，再在13000r/min下離心2min，離心后棄上清液0.98mL，再次充分震蕩2min即制備完成，短時間保存采用4℃，長時間保存采用-20℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的反硝化細菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，其特征在于菌體前處理緩沖母液由70g NaCi、2g KCi、12g Na2HPO4、2gKH2PO4、1‰SDS和11去離子水組成，將菌體前處理緩沖母液稀釋10倍制成工作液，工作液用NaOH調(diào)pH值為7.5，在121℃條件下滅菌15-30min后使用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反硝化細菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，其特征是步驟(二)中菌體在冰上進行倍比稀釋的方法如下吸取2μL菌體加入到PCR管中，再加入18μL的去離子水，用移液槍將其吸打混勻；然后依次從上一稀釋梯度的PCR管中吸取菌體2μL加入到下一稀釋梯度的PCR管中，加入18μL的去離子水吸打混勻，直到稀釋的倍數(shù)為103-1012，保留3-7個稀釋梯度。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反硝化細菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，其特征在于步驟(四)采用三管或五管平行法，保留的3-7個稀釋梯度，每個稀釋梯度作3或5個平行樣。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反硝化細菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，其特征在于步驟(五)PCR擴增的擴增程序為94℃預熱5min，94℃變性30s，55.9℃復性45s，72℃延伸90s，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min。
全文摘要
一種反硝化細菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，它涉及一種反硝化細菌的檢測方法。它解決了以往檢測反硝化細菌的方法繁瑣，不能定量檢測，檢測時間長，無法為生產(chǎn)和科學研究提供有效和即時的數(shù)據(jù)，檢測費用高的問題。它通過以下步驟實現(xiàn)(一)菌體的制備；(二)將制備的菌體在冰上進行倍比稀釋；(三)倍比稀釋液在冰上進行PCR操作；(四)采用三管或五管平行法；(五)PCR擴增；(六)1.0％的瓊脂糖電泳檢測；(七)觀察結(jié)果，記數(shù)、查表計算得出結(jié)論。本發(fā)明中經(jīng)倍比稀釋的反硝化細菌直接進行PCR檢測，方法簡單，可定量檢測，檢測時間短，檢測費用低，并且可以即時、準確的提供數(shù)據(jù)用于生產(chǎn)和科學研究。
文檔編號C12Q1/04GK1769471SQ20051001045
公開日2006年5月10日 申請日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月21日
發(fā)明者馬放, 魏利 申請人:哈爾濱工業(yè)大學