專(zhuān)利名稱(chēng)：柯薩奇病毒b組2型基因疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)防柯薩奇病毒感染的疫苗。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)用于預(yù)防CVB(柯薩奇病毒)感染的疫苗有滅活疫苗和減毒活疫苗。滅活疫苗在其滅活過(guò)程中出現(xiàn)抗原性減弱及重要表位丟失，使機(jī)體不能產(chǎn)生足夠的保護(hù)性免疫。減毒活疫苗接種后常常引起免疫抑制，減毒不充分可致臨床病毒感染，且活病毒疫苗有回復(fù)突變產(chǎn)生致病表型的可能，而過(guò)分減毒又造成疫苗效價(jià)的降低，削弱其激發(fā)機(jī)體免疫的能力。新型CVB疫苗有亞單位疫苗和合成肽疫苗。亞單位疫苗安全、無(wú)毒、副作用小，但免疫原性差。近年來(lái)把病毒的亞單位成分通過(guò)DNA重組技術(shù)加以表達(dá)的疫苗，稱(chēng)為基因工程重組亞單位疫苗?；蚬こ桃呙缂罕粦?yīng)用于臨床。該疫苗的制備包括基因的分子克隆、表達(dá)和蛋白純化過(guò)程，其研制費(fèi)用較高，技術(shù)難度較大且成功率低。常因誘發(fā)對(duì)載體自身的免疫反應(yīng)而不能重復(fù)使用；活重組疫苗亦有回復(fù)突變、造成免疫低下、宿主患病甚至死亡的潛在危險(xiǎn)。合成肽疫苗是根據(jù)需要有目的地方設(shè)計(jì)具有中和或保護(hù)性抗原的短肽作為疫苗。但由于合成肽是一種直鏈結(jié)構(gòu)，缺乏天然的三維空間結(jié)構(gòu)，功能不同于天然蛋白。另外合成的短肽分子很小，免疫原性較差。因此人們迫切希望找到新的安全有效的疫苗。90年代人們開(kāi)展了針對(duì)CVB特異性免疫防治的研究工作，包括滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗及合成肽疫苗，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)接種，顯示了一定的免疫保護(hù)作用。但由于CVB有6個(gè)血清型，核酸具有感染性，因此研制滅活疫苗、減毒活疫苗及亞單位疫苗十分困難。上述疫苗本身又有一定的缺陷，故一直未有CVB的疫苗上市，人們迫切希望找到一種安全有效的新疫苗。近幾年發(fā)展起來(lái)的基因免疫(genetic immunization)技術(shù)為CVB疫苗的研制開(kāi)辟了一條新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有疫苗存在免疫原性差、安全性差的不足，提供一種柯薩奇病毒B組2型基因疫苗，即防治柯薩奇病毒B組2型心肌炎的基因疫苗，它是一種由真核表達(dá)系統(tǒng)pcDNA3和CVB2VP1基因組成的pcDNA3-CVB2VP1真核表達(dá)質(zhì)粒，其主要優(yōu)點(diǎn)為免疫應(yīng)答完整；免疫應(yīng)答持久；同種異株交叉保護(hù)；聯(lián)合免疫；制備簡(jiǎn)便；安全穩(wěn)定；重復(fù)使用。
基因免疫通過(guò)直接給動(dòng)物接種抗原蛋白編碼基因使動(dòng)物獲得對(duì)該抗原的免疫力，這種編碼抗原蛋白的外源基因既是載體又是抗原的來(lái)源，并具有疫苗的功能，因此被稱(chēng)為基因疫苗或核酸疫苗(nucleic acid vaccine)?；蛞呙绲某霈F(xiàn)為CVB感染的防治開(kāi)辟了新的途徑?；蛞呙缬址Q(chēng)核酸疫苗或DNA疫苗，由病原體抗原編碼基因和作為真核表達(dá)載體的質(zhì)粒組成?？乖幋a基因的表達(dá)產(chǎn)物必須是病原體的有效成分，才可引發(fā)保護(hù)性免疫。與傳統(tǒng)疫苗相比，本發(fā)明的基因疫苗有下列優(yōu)點(diǎn)(1)直接DNA接種，避免了傳統(tǒng)疫苗抗原制備純化等繁瑣過(guò)程；(2)免疫應(yīng)答完整持久，基因免疫時(shí)抗原多肽的遞呈和自然感染時(shí)相似，以天然構(gòu)象被免疫系統(tǒng)識(shí)別，克服了其它疫苗抗原表位改變的缺點(diǎn)；(3)基因疫苗具有共同的理化特征，可在同一質(zhì)粒嵌合多種目的基因，形成聯(lián)合免疫；(4)基因疫苗制備簡(jiǎn)便，成本低，安全穩(wěn)定，便于貯存和運(yùn)輸。


圖1為PMD18-T質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖譜；圖2為pcDNA3質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖譜；圖3為CVB2云南分離株VP1基因RT-PCR結(jié)果圖，其中1為T(mén)he products of RT-PCR，2為MarkerDL2000；圖4為pMD18-T CVB2 VP1 PCR鑒定結(jié)果圖，其中1.ThePCR product of CVB2 VP1，2為DL2000Marker；圖5為pMD18-T CVB2 VP1酶切鑒定結(jié)果圖，其中1為pMD18-T CVB2 VP1/EcoRI，2為pMD18-T/EcoRI，3為DL2000Marker；圖6為柯薩奇病毒B2VP1氨基酸(165位-263位)的進(jìn)化樹(shù)分析圖；圖7為pMD18-T-CVB2 VP1 PCR及酶切鑒定結(jié)果圖；圖8為pcDNA3-CVB2 VP1 PCR及酶切鑒定結(jié)果圖；圖9為pcDNA3-CVB2 VP1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后RT-PCR檢測(cè)CVB2VP1mRNA的表達(dá)結(jié)果圖；圖10為pcDNA3-CVB2 VP1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞間接免疫熒光檢測(cè)圖，圖11為pcDNA3-CVB2 VP1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞間接免疫熒光檢測(cè)圖；圖12為pcDNA3-CVB2 VP1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞間接免疫熒光檢測(cè)圖；圖13為小鼠基因免疫后CVB2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果圖；圖14為基因免疫后小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果圖；圖15為免疫后小鼠CD4+T細(xì)胞的變化結(jié)果圖；圖16為免疫后小鼠CD8+T細(xì)胞的比較結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式的柯薩奇病毒B組2型基因疫苗是一種由真核表達(dá)系統(tǒng)pcDNA3和CVB2VP1基因組成的pcDNA3-CVB2VP1真核表達(dá)質(zhì)粒，CVB2VP1和pcDNA3-CVB2VP1的基因序列參見(jiàn)基因序列表。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式對(duì)CVB2基因疫苗進(jìn)行詳細(xì)介紹。
一、材料(一)病毒、細(xì)胞系、載體與菌株CVB2云南分離株、HeLa細(xì)胞由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)提供。克隆載體pMD18-T購(gòu)自TaKaRa公司(如圖1所示)，真核表達(dá)載體pcDNA3購(gòu)自Invitrogen公司(如由圖2所示)，宿主菌株為E.coliJM83，P-815小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞(H-2d基因型)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。參考毒株及GenBank登錄號(hào)如表1所示。
表1 CVB2參考毒株及GenBank登錄號(hào)

(二)主要試劑和工具酶rTaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、RNase A、限制性?xún)?nèi)切酶XbaI、BgLII、EcoRI、Marker(DL2000，DL15000)為PROMEGA、Invitrogen、GIBCO/BRL及大連寶生物公司產(chǎn)品。QIAgen Mini Extraction Kit為Qiagen公司產(chǎn)品，DNA片段凝膠回收試劑盒購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司，總RNA提取試劑TRIzol、Eagle′sMEM，RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液等為GIBCO/BRL產(chǎn)品。FITC的標(biāo)記羊抗鼠IgG、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。CVB2IgG ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自萬(wàn)太公司，CVB2 IgG購(gòu)自美國(guó)USB公司。FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD4抗體，R-PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD8抗體購(gòu)自晶美生物技術(shù)公司，小牛血清、淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于天津血液研究所，其它試劑均為分析純。
(三)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為3周齡BALB/c小鼠(H-2d基因型)，體重15±3g。
二、方法(一)pcDNA3-CVB2 VP1真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其體外真核表達(dá)1、CVB2 RNA的提取將TCID50為10-9的CVB2病毒接種HeLa細(xì)胞，37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞病變?yōu)?++～++++時(shí)收獲。將細(xì)胞反復(fù)凍融三次，取0.4ml置于1.5ml微量離心管中，加入0.4ml TRIzol，劇烈振搖，15～30℃放置5min。加入0.4ml氯仿，劇烈振搖15s，室溫放置10min。4℃12000g離心15min。取上層水相，加入1.0ml異丙醇，15～30℃放置10min。4℃12000g離心15min，去上清，干燥沉淀，加33μl DEPC處理的ddH2O重懸沉淀，-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 2、CVB2 VP1的反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增(1)CVB2 VP1反轉(zhuǎn)錄取0.5ml微量離心管加入23μl RNA模板，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，5×1st strand buffer 8μl、10mM dNTP2μl、RNase out 1μl、20pM下游引物5μl。37℃水浴作用150min，煮沸5～7min，冰浴，所得溶液即為cDNA溶液，-20℃保存待用。
(2)CVB2 VP1的PCR擴(kuò)增擴(kuò)增CVB1 VP1基因的引物是用Oligo5.0軟件設(shè)計(jì)，上游引物(P1)序列5’-AGCCCAGTGGAGGAATCCATTGAG-3’，下游引物(P2)序列5’-CGTGGTCGTGAGACTATCTCTCTTT-3’。取0.2ml微量離心管加入CVB2 RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.0μg、10×rTaq DNA聚合酶反應(yīng)buffer5μl、dNTP終濃度20μM、上游引物20pM、下游引物20pM、rTaq DNA聚合酶2U、ddH2O 28.5μl。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；94℃30s、55℃45s、72℃1min，共30個(gè)循環(huán)；最后一次延伸為72℃10min。取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，其余-20℃保存。
3、pMD18-T-CVB2 VP1的克隆與核苷酸序列分析(1)CVB2 VP1基因的PCR產(chǎn)物回收與純化將25μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加至1％瓊脂糖凝膠中，5V/cm電泳40min。回收純化方法按照上海生物工程有限公司DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行在UV照射下將0.85kb片段用清潔刀片切下，放入1.5ml離心管，加入500μl的Binding buffer，置55℃溫育10min至凝膠完全融化，將溶化后的瓊脂糖液移入吸附柱，室溫2分鐘，10000g離心1min，倒掉收集管中的液體，在吸附柱內(nèi)加入500μl Binding buffer，10000g離心1min，倒掉收集管中的液體，在吸附柱內(nèi)加Washing solution500μl，10000g離心1min，將柱放在同一收集管上，讓蓋開(kāi)著，再12000g離心1min，將柱放于無(wú)菌的1.5ml離心管上，在吸附膜中央加入30μl Elusion buffer，55℃靜置2min，12000g離心1min，管內(nèi)即為回收的PCR產(chǎn)物。
(2)CVB2 VP1和pMD18-T的連接在1.5ml離心管中加入純化的CVB2VP1 PCR產(chǎn)物11μl、pMD18-T 1μl、Ligation solusion I 8μl，于16℃反應(yīng)過(guò)夜。
(3)感受態(tài)細(xì)菌的制備和轉(zhuǎn)化用滅菌的接種針刮拭甘油凍存的E.coliJM83細(xì)菌，快速劃于加有氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑單菌落接種于100ml新鮮的含Amp LB培養(yǎng)基，37℃振搖至OD600值為0.5時(shí)將培養(yǎng)液置于冰上預(yù)冷10min，于4℃1600g離心10min。細(xì)胞沉淀用10ml冰預(yù)冷時(shí)CaCl2溶液重懸，于4℃1100g離心5min。細(xì)胞沉淀用10ml冰預(yù)冷的CaCl2溶液重懸，冰上放置30min，于4℃1100g離心5min。用2ml冰預(yù)冷的CaCl2溶液重懸細(xì)胞，分裝-70℃凍存。
(4)CVB2 VP1和pMD18-T的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM83取20μl連接產(chǎn)物加至100μl感受態(tài)E.coli JM 83，冰浴30min，42℃60s，冰浴2min，加入800μl SOC培養(yǎng)基，37℃振搖60min。將200μl培養(yǎng)物涂布于含Amp(氨芐)(100μg/ml)的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)8小時(shí)。
(5)質(zhì)粒DNA的粗提隨機(jī)挑取生長(zhǎng)在LB瓊脂平板上的17個(gè)菌落分別接種于含Amp LB液體培養(yǎng)基37℃振搖過(guò)夜培養(yǎng)。取1.5ml含重組質(zhì)粒的細(xì)菌菌液，12000g離心1min棄上清，加入100μl預(yù)冷的溶液I(25mM Tris-HCl，pH8.0、10mM EDTA，pH8.0、50mM葡萄糖)重懸細(xì)胞，然后加入200μl新配制的溶液II(0.2M NaOH、1％SDS)，顛倒數(shù)次，再加150μl冰預(yù)冷的溶液III(5M KAc60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)，顛倒混勻，冰浴5min。12000g離心10min，將上清移至另一個(gè)微量離心管，加入2倍體積無(wú)水乙醇，混勻，-20℃放置10min。4℃12000g離心10min，去上清，干燥后加30μl ddH2O。取4μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，挑選分子量大的質(zhì)粒，待進(jìn)一步鑒定。
(6)PCR鑒定取1μl可疑陽(yáng)性重組質(zhì)粒加99μl滅菌ddH2O，取其中的1μl作為模板，加10×buffer 2.5μl，dNTP終濃度為20μM，上游引物50pM，下游引物50pM，rTaq DNA聚合酶2U，滅菌純水加至終體積為25μl，95℃5min；94℃30s、55℃30s、72℃1min；共25個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取4μl PCR產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/ml溴化乙錠，1×TAE)中電泳，以DL2000為DNA分子量Marker，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并照像。
(7)質(zhì)粒DNA的精提將PCR陽(yáng)性的質(zhì)粒菌液中加Amp LB液體培養(yǎng)液2ml，37℃振搖過(guò)夜培養(yǎng)。取1.5ml含重組質(zhì)粒的細(xì)菌菌液，12000g離心1min棄上清，加入100μl預(yù)冷的溶液I(25mM Tris-HCl，pH8.0；10mM EDTA，pH8.0；50mM葡萄糖)重懸細(xì)胞，然后加入200μl新配制的溶液II(0.2M NaOH；1％SDS)，顛倒數(shù)次，再加150μl冰預(yù)冷的溶液III(5M KAc 60ml；冰乙酸11.5ml；水28.5ml)，顛倒混勻，冰浴5min。12000g離心10min，將上清移至另一個(gè)微量離心管，加飽和酚和氯仿各200μl，12000g離心5min，將上清移入另一1.5ml微量離心管中，加入2倍體積無(wú)水乙醇，混勻，-20℃放置10min。4℃12000g離心10min，去上清，干燥后加30μl含20μg/μl RNase A的TE溶解沉淀。取4μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，待進(jìn)一步鑒定。
(8)酶切鑒定在2個(gè)0.5ml離心管中各加入4μl提取的質(zhì)粒，用EcoR I 1μl相應(yīng)10×buffer H 1μl，ddH2O 4μl，共10μl體積，37℃酶切1小時(shí)，判斷目的基因的插入。
(9)CVB2 VP1的生物信息學(xué)分析應(yīng)用ExPASy Molecular Biology Server(http://www.expasy.org)在線分析CVB2 VP1云南分離株氨基酸的特點(diǎn)，應(yīng)用Blastn在線分析CVB2 VP1云南分離株核苷酸的同源序列，應(yīng)用BioEdit軟件分析CVB2 VP1的酶切位點(diǎn)，采用Clustal X1.83軟件進(jìn)行多序列聯(lián)配比對(duì)，鄰位相連法(Neighbor-joining method)構(gòu)建CVB2氨基酸種系進(jìn)化樹(shù)，為保證進(jìn)化樹(shù)的準(zhǔn)確性，采用10000次bootstrap trial，隨機(jī)數(shù)字generator seed是1000，應(yīng)用ANTHEPROT5.0預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。
4、pcDNA3-CVB2 VP1的構(gòu)建與鑒定(1)pMD18-T-CVB2 VP1重新構(gòu)建根據(jù)已測(cè)定的CVB2云南株VP1基因序列和Kozak原則重新設(shè)計(jì)引物，上游引物(P3)中設(shè)計(jì)了VP1基因的起始密碼子及EcoR I酶切位點(diǎn)，引物序列為P35’-GAATTCGTCATGAGCCCAGCGGAGGAATC-3’。下游引物(P2)序列5’-CGTGGTCGTGAGACTATCTCTCTFT-3’。
(2)同前進(jìn)行PCR鑒定。
(3)酶切鑒定篩選目的質(zhì)粒同前用EcoR I進(jìn)行酶切，判定目的質(zhì)粒。
(4)pcDNA3-CVB2 VP1連接取10μl正向pMD18-T-VP1和5μl pcDNA3-分別同時(shí)用XbaI+HindIII酶切消化，體系如下pMD18-T-VP1 10μl，pcDNA3-5μl，內(nèi)切酶buffer M 2μl，XbaI 2μl，HindIII 2μl，加ddH2O至20μl，37℃消化4h。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，用上海生物工程公司回收試劑盒回收酶切后0.85kb的CVB2 VP1酶切產(chǎn)物和5.4kb的線形化的pcDNA3。取CVB2 VP1 20μl和線形化的pcDNA3 5μl加至1.5ml微量離心管中，加入10×T4連接酶反應(yīng)buffer 3μl、T4 DNA連接酶1μl、補(bǔ)加ddH2O至30μl。16℃反應(yīng)過(guò)夜。
(5)pcDNA3-CVB2 VP1轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物取30μl加至100μl感受態(tài)E.coliJM83，冰浴60s，冰浴2min，加入800μlSOC培養(yǎng)基，37℃振搖60min，接種至含Amp的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)8小時(shí)。
(6)鑒定用前述方法小量提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行初步瓊脂糖凝膠電泳分析，選擇出較大的可疑陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)一步精提，進(jìn)行PCR和酶切鑒定。取5μl該質(zhì)粒分別用BgL II、XbaI+Hind III酶切，判斷其大小及目的基因插入的正確性。
5、pcDNA3-CVB2 VP1的體外真核表達(dá)(1)純化重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒純化采用聚乙二醇沉淀法，具體操作如下挑含有目的質(zhì)粒的單菌落接種于5ml含Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，提質(zhì)粒鑒定正確后將上述培養(yǎng)液1/10稀釋?zhuān)臃N于45ml含Amp(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基中，37℃搖振4小時(shí)培養(yǎng)。收獲菌液于4℃7000g離心10min，棄上清，加入3.6ml預(yù)冷的溶液I(同前)重懸細(xì)胞，然后加入8ml新配制的溶液II(同前)，顛倒數(shù)次，靜置7分鐘至沉淀消失，再加4ml冰預(yù)冷的溶液III(同前)，顛倒混勻，冰浴10min。5000g 4℃離心15min，將溶液過(guò)濾于4層滅菌紗布，上清加入另一25ml離心管中，加0.6倍體積的異丙醇，-20℃靜置10min，9500g4℃離心10min棄上清，倒置吹干，在室溫下用70％的乙醇刷洗管底及管壁，倒掉乙醇，并使剩余的乙醇揮發(fā)掉，用TE(pH8.0)300μl溶解濕潤(rùn)的核酸沉淀。加入300μl預(yù)冷的5M LiCl,混勻，4℃12000g離心10min，將上清移入1.5ml微量離心管中，在室溫下用70％的乙醇刷洗管底及管壁，倒掉乙醇，并使剩余的乙醇揮發(fā)掉，用50μl含RNase A的TE(pH8.0)溶解濕潤(rùn)的核酸沉淀。室溫放置30min。加入50μl含13％(W/V)聚乙二醇(PEG-8000)的1.6M NaCl溶液充分混合，12000g 4℃離心5min，以回收沉淀的質(zhì)粒，用酚∶氯仿抽提一次，然后用氯仿抽提一次。用標(biāo)準(zhǔn)的乙醇沉淀發(fā)法回收DNA，濕潤(rùn)的質(zhì)粒沉淀用35μl滅菌的TE(pH 8.0)溶解。以1∶100用TE(pH 8.0)稀釋后測(cè)OD260，并計(jì)算質(zhì)粒DNA的濃度。按1OD260＝50μg質(zhì)粒DNA/ml計(jì)算，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
(2)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞按Lipofect AMINETM產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)空載體和病毒感染細(xì)胞對(duì)照。具體操作如下取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞移種到滅菌6孔板中，輕輕晃動(dòng)以分散細(xì)胞，使之均勻分布到平皿的底部，放入37℃含5％CO2的溫箱中孵育，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞覆蓋平皿面積達(dá)60％～70％時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將20μg重組質(zhì)粒加入不含抗生素和小牛血清的92μl MEM中混勻，將6μl脂質(zhì)體加入不含抗生素和小牛血清的94μl MEM中混勻，再將上述兩種液體混勻室溫靜置20min。此時(shí)將6孔板中接種的HeLa細(xì)胞在不沖散其單層的情況下，吸棄細(xì)胞上的培養(yǎng)液，并將轉(zhuǎn)染混合物加入800μl不含抗生素和小牛血清的MEM，沿孔壁緩慢地加入，在37℃含5％CO2的孵箱中孵育5h。孵育后再向平皿中加入2.0ml含10％的胎牛血清和青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml的MEM，用封口膜密封6孔板，在37℃含5％CO2的細(xì)胞孵箱中繼續(xù)孵育，分別于48h、72h、96h取出作RT-PCR及間接免疫熒光檢測(cè)。
(3)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的RT-PCR檢測(cè)分別將48h、72h、96h的HeLa細(xì)胞棄上清，用TRIzol提取試劑盒提取總RNA，在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，用于PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)CVB2 VP1 mRNA的轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)條件同CVB2 VP1的RT-PCR。擴(kuò)增CVB2的特異性引物為P1、P2。
(4)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫熒光檢測(cè)將轉(zhuǎn)染后48h、72h、96h的細(xì)胞用冷丙酮固定干燥在載玻片上，用0.05M PBS(pH7.2)1∶250稀釋CVB2 VP1 IgG作為陽(yáng)性血清、將其與陰性血清及羊抗鼠IgG熒光抗體(用1∶10000的Evan’s藍(lán)1∶50稀釋)感作后，50％甘油PBS封片，置于熒光顯微鏡下觀察。
(二)pcDNA3-CVB2 VP1的動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)1、真核表達(dá)質(zhì)粒的大量制備及純化免疫動(dòng)物所用的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-CVB2 VP1、pcDNA3、按如下的步驟制備(1)取菌液劃線于含Amp的LB瓊脂平板上37℃培養(yǎng)過(guò)夜。(2)挑取單個(gè)菌落于10mlLB培養(yǎng)液中37℃振蕩培養(yǎng)、鑒定。(3)取1ml上述菌液加入到100ml LB培養(yǎng)液中37℃3h后加0.3ml氯霉素(0.34mg/ml)過(guò)夜培養(yǎng)。(4)8000g離心20min，棄上清加3.2ml的溶液I及0.9ml新配制的溶菌酶(5mg/ml)混勻，冰浴30min；加溶液II6.4ml，冰浴5min；加入溶液III4.8ml，冰浴60min。然后以15000g離心15min，取上清加入2倍體積乙醇，-20℃過(guò)夜。(5)12000g離心20min，沉淀以1ml TE懸浮，加入0.129g醋酸銨(終濃度為0.25M)混勻，冰浴20min。(6)12000g離心20min，取上清加2倍體積無(wú)水乙醇-20℃過(guò)夜。(7)12000g離心20min，棄上清，沉淀吹干，以0.4ml含RNA酶(20μg/ml)的TE懸浮，37℃作用30min。(8)以等體積飽和酚、等體積飽和酚/氯仿、氯仿/異戊醇(24∶1)各抽提取一次。(9)收集水相，加2倍體積的冷乙醇和1/10體積的NaAc(3M，pH4.8)，混勻，于-70℃沉淀1h后，4℃12000g離心15min，棄上清。(10)沉淀用70％乙醇洗滌，真空抽干，TE溶解。(11)取適量樣品進(jìn)行酶切分析、驗(yàn)證，取該質(zhì)粒溶液作適量稀釋后用紫外分光光度測(cè)其含量。(12)應(yīng)用0.01M PBS溶液稀釋重組質(zhì)粒和空載體，終濃度為1μg/μl，-20℃保存待用。
2、動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)(1)動(dòng)物分組和免疫將66只BALB/c小鼠隨機(jī)分成3組，即空載體對(duì)照組、pcDNA3-CVB2 VP1基因免疫組及PBS組，每組22只。每只鼠腹腔注射鹽酸氯胺酮1mg，數(shù)分鐘后小鼠四肢松弛，接種3次，每次間隔一周，分別于免疫后2周、4周、6周、8周斷尾采血，分離血清，-20℃保存用于特異性抗體測(cè)定(10只/次)，于免疫后2周、4周、6周每組隨機(jī)取小鼠雌雄各半4只，摘眼球采血約500μl/只，加入含有EDTA抗凝劑的試管中于4小時(shí)以?xún)?nèi)測(cè)定CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，即刻取脾分離淋巴細(xì)胞用于淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，第8周每組隨機(jī)取小鼠雌雄各半4只，摘眼球采血用于中和抗體效價(jià)測(cè)定并分離這些及剩余的空載體組和疫苗組小鼠脾淋巴細(xì)胞用于CTL活性測(cè)定。
(2)接種后體液免疫應(yīng)答檢測(cè)①CVB2特異性抗體IgG的ELISA檢測(cè)參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，取標(biāo)本稀釋液100μl加入反應(yīng)板內(nèi)，將待檢血清用生理鹽水按1∶10稀釋后取10μl加入反應(yīng)孔內(nèi)，置37℃反應(yīng)20min，用洗滌液洗板5次，每孔加100μl酶結(jié)合物(羊抗鼠IgG酶標(biāo)抗體1∶1000稀釋)，置37℃反應(yīng)20min，洗板5次，將底物A、B液各取50μl加到反應(yīng)孔內(nèi)避光顯色10min，每孔加終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450nm處測(cè)定OD值，用空白對(duì)照孔調(diào)零，計(jì)算P/N值，P/N≥2.1時(shí)判為陽(yáng)性，P/N＜2.1判為陰性。
②中和抗體效價(jià)測(cè)定
病毒液制備將CVB2病毒接種于HeLa。每瓶加病毒液1ml，生長(zhǎng)液9ml(含10％滅活胎牛血清的MEM)，37℃培養(yǎng)1～3天，病變達(dá)++++時(shí)收獲。2000r/min，15min離心沉淀，去除細(xì)胞碎屑。將混勻的病毒分裝于小管，供病毒滴定用。
TCID50滴定將CVB2病毒懸液分別用維持液作連續(xù)10倍稀釋?zhuān)?0-3～10-10。首先在96孔微量滴定板每孔內(nèi)加入細(xì)胞懸液200μl(5000/μl)，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，吸棄上清，每孔加病毒液100μl，每個(gè)稀釋度病毒加4孔，37℃5％CO2溫箱孵育吸附2小時(shí)，吸棄上清，每孔加維持液(含2％滅活胎牛血清的MEM)200μl，37℃5％CO2溫箱孵育，逐日在普通顯微鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)情況至第7天，細(xì)胞病變50％或以上作為病變陽(yáng)性孔，無(wú)細(xì)胞病變或細(xì)胞病變50％以下作為陰性孔。按Reed和Muench法計(jì)算距離比例∶距離比例＝大于50％的百分?jǐn)?shù)-50％/大于50％的百分?jǐn)?shù)-小于50％的百分?jǐn)?shù)；1g TCID50＝大于50％的病毒稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù)。
固定病毒稀釋血清法測(cè)定中和抗體效價(jià)于滅菌96孔板上接種100μl HeLa細(xì)胞，將待檢血清用MEM作1∶5，1∶10，1∶20，1∶40連續(xù)2倍稀釋?zhuān)?6℃水浴滅活30分鐘，1.5ml微量離心管中每管100μl稀釋血清，病毒液按每100μl含100TCID50病毒量(即10-7/100μl)，將其分別加入上述每個(gè)Ep管中，37℃水浴中和2小時(shí)，將各稀釋度的血清-病毒混合液，按100μl/孔接種于HeLa細(xì)胞，每個(gè)稀釋度做3個(gè)孔，另設(shè)病毒對(duì)照(100TCID50/100μl)、血清對(duì)照(1∶5)、正常細(xì)胞對(duì)照各兩孔，37℃5％CO2溫箱孵育，逐日在普通顯微鏡下觀察細(xì)胞情況，觀察7天，以第7天的結(jié)果作為最后結(jié)果，待檢血清的各稀釋度能抑制50％細(xì)胞病變出現(xiàn)者即為50％保護(hù)，表明該稀釋度血清中有中和抗體存在。按Reed和Muench法計(jì)算距離比例∶距離比例＝50％-低于50％的病變率/大于50％的病變率-小于50％的病變率；效價(jià)＝(低于50％病變率血清稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例×血清稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù))的反對(duì)數(shù)。
(3)接種后的細(xì)胞免疫應(yīng)答①淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)斷頸處死小鼠，無(wú)菌取出脾臟，洗去血液，將脾組織研磨碎，紗網(wǎng)過(guò)濾，離心后加入0.83％NH4Cl放置15min，破壞紅細(xì)胞，1000r/min離心收集淋巴細(xì)胞，用10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液懸浮脾淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml，加入96孔板，每孔約200μl，每只動(dòng)物脾細(xì)胞重復(fù)10孔，其中5孔為對(duì)照組，不加刀豆蛋白A(ConA)，另5孔加ConA(100μg/μl)，終濃度為10μg/μl，混勻后置37℃，5％CO2培養(yǎng)66小時(shí)，取出培養(yǎng)板，顯微鏡下觀察淋巴細(xì)胞增殖情況，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率于終止培養(yǎng)前4小時(shí)每孔加入10％SDS的0.01M HCl 100μl，震蕩溶解15min后，540nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度值(A)，根據(jù)各組細(xì)胞A值計(jì)算其平均值。增殖指數(shù)(proliferation index，PI)PI＝實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值。
②CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞測(cè)定將采集的肝素(250U/ml)抗凝血用PBS稀釋后，小心的加到淋巴細(xì)胞分離液的上層，室溫2000rpm離心25分鐘，抽取中間白細(xì)胞層，用PBS洗一次，離心重懸后加入FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠的CD4抗體(200倍稀釋?zhuān)深A(yù)實(shí)驗(yàn)確定)與R-PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠的CD8抗體(200倍稀釋?zhuān)深A(yù)實(shí)驗(yàn)確定)暗盒冰浴30min，用含有4％胎牛血清的PBS洗3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞中CD4+、CD8+細(xì)胞的百分含量，用CellQuest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的獲取與分析。
③CTL活性測(cè)定效應(yīng)細(xì)胞的制備參照Vignuzzi方法，無(wú)菌取小鼠脾制備單細(xì)胞懸液。0.83％NH4Cl放置15min低滲裂解紅細(xì)胞，10％FCS的RPMI 1640洗兩次，用含10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)，37℃孵育1.5小時(shí)，去除貼壁細(xì)胞，收集脾細(xì)胞懸液，2000r/min，離心5min，以2％FCS的RPMI 1640調(diào)整細(xì)胞濃度為4×107/ml。
靶細(xì)胞的制備P-815細(xì)胞培養(yǎng)于10％FCS的RPMI 1640液，感染CVB2云南株，37℃吸附1.5小時(shí)，繼續(xù)培養(yǎng)兩天收集細(xì)胞，用PBS洗兩次，然后以2％FCS的RPMI 1640調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml。
特異性T細(xì)胞殺傷試驗(yàn)將不同比例的效/靶細(xì)胞(E/T)混合孵育，51Cr釋放法測(cè)定CTL殺傷效應(yīng)。效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞分別為12.5∶1，25∶1及50∶1，結(jié)果以γ液體閃爍計(jì)數(shù)器每分鐘記錄的脈沖數(shù)cpm表示。CTL殺傷率＝[(實(shí)驗(yàn)組cpm值-自然釋放cpm值)/最大釋放cpm值-自然釋放cpm值]。
3、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以x±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，并以LSD法進(jìn)行組間，組內(nèi)兩兩比較，以P＜0.05作為結(jié)果存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)，以P＜0.01作為結(jié)果存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果
一、CVB2云南分離株VP1基因的擴(kuò)增CVB2 VP1的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)0.85kb處有一條明亮的核酸區(qū)帶，與預(yù)期值一致(圖3)。
二、pMD18-T-CVB2VP1重組質(zhì)粒的鑒定重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)0.85kb處有一條明亮的核酸區(qū)帶，與預(yù)期值一致，經(jīng)EcoR I單酶切較空載體pMD18-T大，被切成3.6kb的單一片段，初步說(shuō)明VP1基因插入pMD18-T(見(jiàn)圖4、圖5)三、CVB2云南分離株的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列分析、BC環(huán)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)被克隆的CVB2云南分離株VP1全基因序列含846個(gè)堿基，編碼282個(gè)氨基酸，如序列表CVB2云南分離株全長(zhǎng)VP1基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列所示(框內(nèi)為CVB共同抗原表位；下劃線為βB-βC環(huán))，與PCR擴(kuò)增片段核苷酸數(shù)目相符，無(wú)起始密碼子與終止密碼子。相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為31558.74。本株CVB2 VP1含有的氨基酸中蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸、纈氨酸所占的比例較高，分別占10.28％，9.22％，7.45％，7.45％。等電點(diǎn)的理論值為8.43。72～96位氨基酸構(gòu)成BC環(huán)，240～252位氨基酸RIYFKPKHVKAWI為CVB可能的共同抗原表位(如序列表中CVB2VP1基因核苷酸推導(dǎo)的氨基酸序列與參考毒株的對(duì)應(yīng)區(qū)域的聯(lián)配比對(duì)所示，其中陰影部分表示變異的氨基酸，氨基酸序列的方框內(nèi)表示可能存在抗原表位的區(qū)域，-表示未測(cè)部分；預(yù)測(cè)的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中H為螺旋結(jié)構(gòu)，E為伸展結(jié)構(gòu)，T為轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，C為無(wú)規(guī)卷曲))。BC環(huán)預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中螺旋結(jié)構(gòu)(H)占35％，轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)(T)占9％，無(wú)規(guī)卷曲(C)占17％和伸展結(jié)構(gòu)(E)占39％。
四、CVB2云南分離株與Ohio-1株等VP1核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列同源性及其變異分析GenBank中參考毒株序列聯(lián)配比對(duì)(推導(dǎo)的氨基酸序列聯(lián)配比對(duì)見(jiàn)序列表)，CVB2VP1云南株與登錄號(hào)為AF081312的CVB2Ohio-1株VP1基因核苷酸序列同源性最高為98％，與之比較，云南分離株存在5處錯(cuò)義突變，即第30、82、140、159、270位氨基酸分別由A→V，G→S，V→A，T→A，E→K；2處缺失突變，即因核苷酸序列252位-257位缺失6個(gè)A造成的推導(dǎo)的氨基酸序列中84位和85位各缺少1個(gè)賴(lài)氨酸，正處于βB、βC區(qū)之間，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明該處為無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。CVB2云南分離株VP1基因與Ohio-1，jo/Roma98，fr/Roma98，sp/Roma88，816/84，China-2，China-1，MD84-5914，HON84-6016，NC95-2135，F(xiàn)L92-1512等11株國(guó)內(nèi)外參考毒株VP1基因相應(yīng)核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為49％-98％，52-98％(見(jiàn)表2)。預(yù)測(cè)的環(huán)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中除sp/Roma88株變化較大，其余四株βB、βC區(qū)內(nèi)結(jié)構(gòu)完全相同。比對(duì)CVB的共同抗原表位RIYFKPKHVKAYV，RIYFKPKHVKA高度保守，為云南株及其它參考毒株的共同序列，氨基酸的變異主要在CVB2的251-252位，W→Y，V→I。
五、CVB2的進(jìn)化樹(shù)分析除sp/Roma88，816/84株(因這兩株165位-263位氨基酸序列無(wú)報(bào)道)，建立其余10株CVB2VP1對(duì)應(yīng)氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)，CVB2云南分離株與Ohio-1株同在一組，親緣關(guān)系最近，與China-1較近，與MD84-5914、NC95-2135親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(見(jiàn)圖6)。
表2 CVB2云南分離株VP1基因與參考毒株對(duì)應(yīng)區(qū)核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸同源性比較

六、依據(jù)已測(cè)定的CVB2云南株VP1設(shè)計(jì)引物構(gòu)建的pMD18-T CVB2 VP1的初步鑒定CVB2 VP1與pMD18-T連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM83后平板有菌落生長(zhǎng)，粗提質(zhì)粒進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳初步篩選，獲得大小約為0.85kb的PCR片段，且經(jīng)EcoRI酶切獲得0.85kb和2.7kb兩個(gè)片段質(zhì)粒初步認(rèn)定為VP1基因是正向插入到pMD18-T，為目的克隆(如圖7所示)。
七、pcDNA3-CVB2 VP1的PCR及酶切鑒定CVB2 VP1與pcDNA3-連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM83后平板有菌落生長(zhǎng)，粗提質(zhì)粒進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳初步篩選，PCR后獲得一大小約為0.85kb的產(chǎn)物，且經(jīng)HindIII+XbaI酶切獲得0.85kb和5.6kb兩個(gè)片段的質(zhì)粒初步認(rèn)定為VP1基因是正向插入到pcDNA3，為重組陽(yáng)性質(zhì)粒(如圖8所示)。
八、pcDNA3-CVB2 VP1測(cè)序結(jié)果插入的CVB2 VP1采用T7和SP6通用引物測(cè)序，CVB2 VP1基因序列與pMD18-T CVB2 VP1的測(cè)序結(jié)果無(wú)差異，CVB2 VP1正確插入到pcDNA3/HindIII+XbaI酶切位點(diǎn)。
九、pcDNA3-CVB2VP1的體外瞬時(shí)表達(dá)(一)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的RT-PCR檢測(cè)取擴(kuò)增產(chǎn)物4μl經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)0.85kb處有一條明亮的核酸區(qū)帶，與預(yù)期值一致(見(jiàn)圖9)。
(二)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的間接免疫熒光檢測(cè)如圖10～12所示，pcDNA3-CVB2VP1轉(zhuǎn)染的50～60％HeLa細(xì)胞于48h胞內(nèi)可見(jiàn)亮綠色的熒光，而對(duì)照細(xì)胞內(nèi)無(wú)熒光。病毒感染的細(xì)胞圓縮，胞內(nèi)可見(jiàn)顆粒樣亮綠色的熒光。
十、pcDNA3 CVB2 VP1真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠后CVB2特異性抗體的測(cè)定如表2示，單純pcDNA3質(zhì)粒接種未見(jiàn)CVB2特異性抗體產(chǎn)生。pcDNA3-CVB2 VP1真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠后2周時(shí)，P/N＜2.1，未檢測(cè)到免疫小鼠的CVB2特異性抗體(數(shù)據(jù)未列出)；免疫后4周A450吸光度值高于空載體組和PBS組(P＜0.001)且P/N＞2.1，即此時(shí)產(chǎn)生了CVB2特異性抗體，免疫后6周CVB2IgG水平高于免疫后4周(P＜0.01)，于第8周觀察時(shí)CVB2特異性抗體仍存在，且與第6周無(wú)差別(P＞0.05)。從圖13可以看出隨著應(yīng)用pcDNA3 CVB2VP1真核表達(dá)質(zhì)粒的加強(qiáng)免疫，小鼠的CVB2 IgG有增高的趨勢(shì)。
表3 小鼠基因免疫后CVB2IgG水平(x±s)ELISA檢測(cè)(血清1∶100倍稀釋)

*與pcDNA3和PBS對(duì)照組進(jìn)行比較P＜0.001；與pcDNA3-VP1免疫4周比較P＜0.01，與其免疫8周比較P＞0.05；與pcDNA3-VP1免疫后4周比較P＜0.05。
十一、TCID50測(cè)定結(jié)果依據(jù)公式及表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算CVB2的TCID50∶距離比例＝(80-50)/(80-20)＝0.5，lgTCID50＝lg(10-8)+0.5×lg(10-1)＝8.50，TCID50＝10-8.50，100μl，即10-8.50的CVB2病毒懸液100μl表示1個(gè)TCD50。這一稀釋度可以使50％接種病毒的細(xì)胞發(fā)生病變。
表4 CVB2的TCID50測(cè)定

十二、pcDNA3CVB2 VP1真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠CVB2中和抗體效價(jià)測(cè)定經(jīng)計(jì)算，第8周CVB2病毒中和抗體效價(jià)在1∶22，即1∶22稀釋的血清可保護(hù)50％的細(xì)胞不產(chǎn)生病變(如表5所示)。
表5 小鼠CVB2DNA免疫8周50％血清中和終點(diǎn)

十三、pcDNA3 CVB2 VP1真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠淋巴細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)變化從圖14可以觀察到小鼠免疫后4周、6周T淋巴細(xì)胞較免疫后2周有所增殖(P＜0.01)，免疫后6周較4周略有增高(P＜0.05)。
十四、pcDNA3 CVB2 VP1真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化小鼠經(jīng)pcDNA3 CVB2 VP1真核表達(dá)質(zhì)粒免疫后第4周，CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)已較免疫后第2周增高(P＜0.05)，且高于空載體和PBS組(P＜0.05)，免疫后6周CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)略高于重組質(zhì)粒免疫后第4周(P＜0.05)，但顯著高于免疫后第2周(P＜0.01)，CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈增高趨勢(shì)(表6，圖15)。小鼠經(jīng)pcDNA3 CVB2 VP1真核表達(dá)質(zhì)粒免疫后第4周，第6周CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)較免疫后第2周明顯增高(P＜0.01)，且高于第二次免疫后的空載體和PBS組(P＜0.01)，免疫后第6周CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)與免疫后第4周無(wú)差別(P＞0.05)(表7，圖16)。
表6 pcDNA3-CVB2 VP1免疫后小鼠CD4+T細(xì)胞的變化

*與pcDNA3-VP1免疫2周比較P＜0.01，與pcDNA3-VP1免疫4周比較P＜0.05；與pcDNA3-VP1免疫2周比較P＜0.05。
表7 pcDNA3 CVB2 VP1免疫后小鼠CD8+T細(xì)胞的變化

*與pcDNA3-VP1免疫2周比較P＜0.01，與pcDNA3-VP1免疫6周比較P＞0.05；與pcDNA3-VP1免疫2周比較P＜0.01。
十五、CTL活性測(cè)定小鼠pcDNA3-CVB2 VP1免疫后CVB2 VP1特異性CTL活性如表8所示，以100μg/鼠重組質(zhì)粒免疫小鼠，第8周時(shí)不同E/T比例，pcDNA3-VP1接種組CTL特異殺傷百分率均高于pcDNA3組(P＜0.01)，隨著E/T比例升高，CTL特異性殺傷百分率也逐漸上升，當(dāng)E/T為50∶1時(shí)pcDNA3-VP1免疫后特異性CTL殺傷百分率最高，為(31.2±6.8)％(P＜0.05)(見(jiàn)表8)。
表8 小鼠pcDNA3-VP1免疫后CVB2 VP1特異性CTL活性

1)與pcDNA3組比較P＜0.01，；2)與組內(nèi)E/T比為25∶1，12.5∶1時(shí)比較P＜0.0。
序列表一、CVB2VP1的DNA序列CCAAGCTGGC TAGCGTTTAA ACTTAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACGA TTGAATTCGT 60CATGAGCCCA GTGGAGGAAT CCATTGAGAG AAGCATTGGC AGAGTTGCTG ACACCATTGG120TAGTGGACCA TCCAATTCGG AGGCAATACC GGTACTCACA GCAGTAGAAA CAGGACACAC180ATCACAGGTT ACACCTAGTG ACACGATGCA AACAAGACAT GTGCACAACT ACCATTCAAG240GTCCGAATCC AGCGTAGAGA ACTTCCTGGC ACGCTCGGCT TGTGTGTTTT ATACAACATA300CACCAACAGT AAAAATGCCG CCAAAGAGAA GAAGTTTGCA ACGTGGAAGG TGAGTGTTAG360ACAAGCCGCC CAACTAAGAA GAAAGCTAGA GCTATTCACA TACTTACGCT GTGACATCGA420ACTAACATTC GTCATCACCA GTGCACAAGA TCCATCGACC GCTACCAACT TGGATGCGCC480AGTGTTGACC CATCAAATAA TGTACGTCCC ACCTGGTGGT CCAGTCCCTG AAGCCGTGGA540CGATTACAAC TGGCAAACAT CTACAAATCC CAGCCTTTTT TGGACTGAAG GGAATGCACC600TCCACGCATG TCAATTCCAT TCATGAGCAT AGGCAATGCC TATAGTATGT TCTATGATGG660TTGGTCCGAG TTTAGGCATG ACGGTGTGTA CGGCCTGAAT ACCCTTAACA ATATGGGCAC720AATATATGCT AGGCACGTCA ACGCTGACAA CCCAGGTAGC ATCACCAGCA CAGTGAGAAT780ATACTTCAAA CCCAAACATG TCAAGGCATG GATTCCTCGC CCGCCTCGTT TGGCACAGTA840TCTTAAAGCC AATAATGTGA ATTTTAAGAT CACCGATGTG ACAGAAAAGA GAGATAGTCT900CACGACCACG AATCTCTAGA GGGCCCGTTT AAACCCGCTG 940二、質(zhì)粒pcDNA3-CVB2VP1 DNA序列GACGGATCGG GAGATCTCCC GATCCCCTAT GGTCGACTCT CAGTACAATC TGCTCTGATG 60CCGCATAGTT AAGCCAGTAT CTGCTCCCTG CTTGTGTGTT GGAGGTCGCT GAGTAGTGCG120CGAGCAAAAT TTAAGCTACA ACAAGGCAAG GCTTGACCGA CAATTGCATG AAGAATCTGC180TTAGGGTTAG GCGTTTTGCG CTGCTTCGCG ATGTACGGGC CAGATATACG CGTTGACATT240GATTATTGAC TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA300TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC360CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC420ATTGACGTCA ATGGGTGGAC TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT480ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT540ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA600TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG660ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC720AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG780GTAGGCGTGT ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTCT CTGGCTAACT AGAGAACCCA840CTGCTTACTG GCTTATCGAA ATTAATACGA CTCACTATAG GGAGACCCAA GCTTGCATGC900CTGCAGGTCG ACGATTGAAT TCGTCATGAG CCCAGTGGAG GAATCCATTG AGAGAAGCAT960TGGCAGAGTT GCTGACACCA TTGGTAGTGG ACCATCCAAT TCGGAGGCAA TACCGGTACT 1020CACAGCAGTA GAAACAGGAC ACACATCACA GGTTACACCT AGTGACACGA TGCAAACAAG 1080ACATGTGCAC AACTACCATT CAAGGTCCGA ATCCAGCGTA GAGAACTTCC TGGCACGCTC 1140GGCTTGTGTG TTTTATACAA CATACACCAA CAGTAAAAAT GCCGCCAAAG AGAAGAAGTT 1200TGCAACGTGG AAGGTGAGTG TTAGACAAGC CGCCCAACTA AGAAGAAAGC TAGAGCTATT 1260CACATACTTA CGCTGTGACA TCGAACTAAC ATTCGTCATC ACCAGTGCAC AAGATCCATC 1320GACCGCTACC AACTTGGATG CGCCAGTGTT GACCCATCAA ATAATGTACG TCCCACCTGG 1380TGGTCCAGTC CCTGAAGCCG TGGACGATTA CAACTGGCAA ACATCTACAA ATCCCAGCCT 1440
TTTTTGGACT GAAGGGAATG CACCTCCACG CATGTCAATT CCATTCATGA GCATAGGCAA1500TGCCTATAGT ATGTTCTATG ATGGTTGGTC CGAGTTTAGG CATGACGGTG TGTACGGCCT1560GAATACCCTT AACAATATGG GCACAATATA TGCTAGGCAC GTCAACGCTG ACAACCCAGG1620TAGCATCACC AGCACAGTGA GAATATACTT CAAACCCAAA CATGTCAAGG CATGGATTCC1680TCGCCCGCCT CGTTTGGCAC AGTATCTTAA AGCCAATAAT GTGAATTTTA AGATCACCGA1740TGTGACAGAA AAGAGAGATA GTCTCACGAC CACGAATCTC TAGAGGGCCC TATTCTATAG1800TGTCACCTAA ATGCTAGAGC TCGCTGATCA GCCTCGACTG TGCCTTCTAG TTGCCAGCCA1860TCTGTTGTTT GCCCCTCCCC CGTGCCTTCC TTGACCCTGG AAGGTGCCAC TCCCACTGTC1920CTTTCCTAAT AAAATGAGGA AATTGCATCG CATTGTCTGA GTAGGTGTCA TTCTATTCTG1980GGGGGTGGGG TGGGGCAGGA CAGCAAGGGG GAGGATTGGG AAGACAATAG CAGGCATGCT2040GGGGATGCGC TGGGCTCTAT GGCTTCTGAG GCGGAAAGAA CCAGCTGGGG CTCTAGGGGG2100TATCCCCACG CGCCCTGTAG CGGCGCATTA AGCGCGGCGG GTGTGGTGGT TACGCGCAGC2160GTGACCGCTA CACTTGCCAG CGCCCTAGCG CCCGCTCCTT TCGCTTTCTT CCCTTCCTTT2220CTCGCCACGT TCGCCGGCTT TCCCCGTCAA GCTCTAAATC GGGGCATCCC TTTAGGGTTC2280CGATTTAGTG CTTTACGGCA CCTCGACCCC AAAAAACTTG ATTAGGGTGA TGGTTCACGT2340AGTGGGCCAT CGCCCTGATA GACGGTTTTT CGCCCTTTGA CGTTGGAGTC CACGTTCTTT2400AATAGTGGAC TCTTGTTCCA AACTGGAACA ACACTCAACC CTATCTCGGT CTATTCTTTT2460GATTTATAAG GGATTTTGGG GATTTCGGCC TATTGGTTAA AAAATGAGCT GATTTAACAA2520AAATTTAACG CGAATTAATT CTGTGGAATG TGTGTCAGTT AGGGTGTGGA AAGTCCCCAG2580GCTCCCCAGG CAGGCAGAAG TATGCAAAGC ATGCATCTCA ATTAGTCAGC AACCAGGTGT2640GGAAAGTCCC CAGGCTCCCC AGCAGGCAGA AGTATGCAAA GCATGCATCT CAATTAGTCA2700GCAACCATAG TCCCGCCCCT AACTCCGCCC ATCCCGCCCC TAACTCCGCC CAGTTCCGCC2760CATTCTCCGC CCCATGGCTG ACTAATTTTT TTTATTTATG CAGAGGCCGA GGCCGCCTCT2820GCCTCTGAGC TATTCCAGAA GTAGTGAGGA GGCTTTTTTG GAGGCCTAGG CTTTTGCAAA2880AAGCTCCCGG GAGCTTGTAT ATCCATTTTC GGATCTGATC AAGAGACAGG ATGAGGATCG2940TTTCGCATGA TTGAACAAGA TGGATTGCAC GCAGGTTCTC CGGCCGCTTG GGTGGAGAGG3000CTATTCGGCT ATGACTGGGC ACAACAGACA ATCGGCTGCT CTGATGCCGC CGTGTTCCGG3060CTGTCAGCGC AGGGGCGCCC GGTTCTTTTT GTCAAGACCG ACCTGTCCGG TGCCCTGAAT3120GAACTGCAGG ACGAGGCAGC GCGGCTATCG TGGCTGGCCA CGACGGGCGT TCCTTGCGCA3180GCTGTGCTCG ACGTTGTCAC TGAAGCGGGA AGGGACTGGC TGCTATTGGG CGAAGTGCCG3240GGGCAGGATC TCCTGTCATC TCACCTTGCT CCTGCCGAGA AAGTATCCAT CATGGCTGAT3300GCAATGCGGC GGCTGCATAC GCTTGATCCG GCTACCTGCC CATTCGACCA CCAAGCGAAA3360CATCGCATCG AGCGAGCACG TACTCGGATG GAAGCCGGTC TTGTCGATCA GGATGATCTG3420GACGAAGAGC ATCAGGGGCT CGCGCCAGCC GAACTGTTCG CCAGGCTCAA GGCGCGCATG3480CCCGACGGCG AGGATCTCGT CGTGACCCAT GGCGATGCCT GCTTGCCGAA TATCATGGTG3540GAAAATGGCC GCTTTTCTGG ATTCATCGAC TGTGGCCGGC TGGGTGTGGC GGACCGCTAT3600CAGGACATAG CGTTGGCTAC CCGTGATATT GCTGAAGAGC TTGGCGGCGA ATGGGCTGAC3660CGCTTCCTCG TGCTTTACGG TATCGCCGCT CCCGATTCGC AGCGCATCGC CTTCTATCGC3720CTTCTTGACG AGTTCTTCTG AGCGGGACTC TGGGGTTCGA AATGACCGAC CAAGCGACGC3780CCAACCTGCC ATCACGAGAT TTCGATTCCA CCGCCGCCTT CTATGAAAGG TTGGGCTTCG3840GAATCGTTTT CCGGGACGCC GGCTGGATGA TCCTCCAGCG CGGGGATCTC ATGCTGGAGT3900TCTTCGCCCA CCCCAACTTG TTTATTGCAG CTTATAATGG TTACAAATAA AGCAATAGCA3960TCACAAATTT CACAAATAAA GCATTTTTTT CACTGCATTC TAGTTGTGGT TTGTCCAAAC4020TCATCAATGT ATCTTATCAT GTCTGTATAC CGTCGACCTC TAGCTAGAGC TTGGCGTAAT4080
CATGGTCATA GCTGTTTCCT GTGTGAAATT GTTATCCGCT CACAATTCCA CACAACATAC4140GAGCCGGAAG CATAAAGTGT AAAGCCTGGG GTGCCTAATG AGTGAGCTAA CTCACATTAA4200TTGCGTTGCG CTCACTGCCC GCTTTCCAGT CGGGAAACCT GTCGTGCCAG CTGCATTAAT4260GAATCGGCCA ACGCGCGGGG AGAGGCGGTT TGCGTATTGG GCGCTCTTCC GCTTCCTCGC4320TCACTGACTC GCTGCGCTCG GTCGTTCGGC TGCGGCGAGC GGTATCAGCT CACTCAAAGG4380CGGTAATACG GTTATCCACA GAATCAGGGG ATAACGCAGG AAAGAACATG TGAGCAAAAG4440GCCAGCAAAA GGCCAGGAAC CGTAAAAAGG CCGCGTTGCT GGCGTTTTTC CATAGGCTCC4500GCCCCCCTGA CGAGCATCAC AAAAATCGAC GCTCAAGTCA GAGGTGGCGA AACCCGACAG4560GACTATAAAG ATACCAGGCG TTTCCCCCTG GAAGCTCCCT CGTGCGCTCT CCTGTTCCGA4620CCCTGCCGCT TACCGGATAC CTGTCCGCCT TTCTCCCTTC GGGAAGCGTG GCGCTTTCTC4680AATGCTCACG CTGTAGGTAT CTCAGTTCGG TGTAGGTCGT TCGCTCCAAG CTGGGCTGTG4740TGCACGAACC CCCCGTTCAG CCCGACCGCT GCGCCTTATC CGGTAACTAT CGTCTTGAGT4800CCAACCCGGT AAGACACGAC TTATCGCCAC TGGCAGCAGC CACTGGTAAC AGGATTAGCA4860GAGCGAGGTA TGTAGGCGGT GCTACAGAGT TCTTGAAGTG GTGGCCTAAC TACGGCTACA4920CTAGAAGGAC AGTATTTGGT ATCTGCGCTC TGCTGAAGCC AGTTACCTTC GGAAAAAGAG4980TTGGTAGCTC TTGATCCGGC AAACAAACCA CCGCTGGTAG CGGTGGTTTT TTTGTTTGCA5040AGCAGCAGAT TACGCGCAGA AAAAAAGGAT CTCAAGAAGA TCCTTTGATC TTTTCTACGG5100GGTCTGACGC TCAGTGGAAC GAAAACTCAC GTTAAGGGAT TTTGGTCATG AGATTATCAA5160AAAGGATCTT CACCTAGATC CTTTTAAATT AAAAATGAAG TTTTAAATCA ATCTAAAGTA5220TATATGAGTA AACTTGGTCT GACAGTTACC AATGCTTAAT CAGTGAGGCA CCTATCTCAG5280CGATCTGTCT ATTTCGTTCA TCCATAGTTG CCTGACTCCC CGTCGTGTAG ATAACTACGA5340TACGGGAGGG CTTACCATCT GGCCCCAGTG CTGCAATGAT ACCGCGAGAC CCACGCTCAC5400CGGCTCCAGA TTTATCAGCA ATAAACCAGC CAGCCGGAAG GGCCGAGCGC AGAAGTGGTC5460CTGCAACTTT ATCCGCCTCC ATCCAGTCTA TTAATTGTTG CCGGGAAGCT AGAGTAAGTA5520GTTCGCCAGT TAATAGTTTG CGCAACGTTG TTGCCATTGC TACAGGCATC GTGGTGTCAC5580GCTCGTCGTT TGGTATGGCT TCATTCAGCT CCGGTTCCCA ACGATCAAGG CGAGTTACAT5640GATCCCCCAT GTTGTGCAAA AAAGCGGTTA GCTCCTTCGG TCCTCCGATC GTTGTCAGAA5700GTAAGTTGGC CGCAGTGTTA TCACTCATGG TTATGGCAGC ACTGCATAAT TCTCTTACTG5760TCATGCCATC CGTAAGATGC TTTTCTGTGA CTGGTGAGTA CTCAACCAAG TCATTCTGAG5820AATAGTGTAT GCGGCGACCG AGTTGCTCTT GCCCGGCGTC AATACGGGAT AATACCGCGC5880CACATAGCAG AACTTTAAAA GTGCTCATCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGAAAACTCT5940CAAGGATCTT ACCGCTGTTG AGATCCAGTT CGATGTAACC CACTCGTGCA CCCAACTGAT6000CTTCAGCATC TTTTACTTTC ACCAGCGTTT CTGGGTGAGC AAAAACAGGA AGGCAAAATG6060CCGCAAAAAA GGGAATAAGG GCGACACGGA AATGTTGAAT ACTCATACTC TTCCTTTTTC6120AATATTATTG AAGCATTTAT CAGGGTTATT GTCTCATGAG CGGATACATA TTTGAATGTA6180TTTAGAAAAA TAAACAAATA GGGGTTCCGC GCACATTTCC CCGAAAAGTG CCACCTGACG6240三、CVB2云南分離株全長(zhǎng)VP1基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列1AGC CCA GTG GAG GAA TCC ATT GAG AGA AGC ATT GGC AGA GTT GCT GAC ACC ATT GGT AGT GGA CCA TCC AAT TCG GAG1 S P V E E S I E R S I G R V A D T I G S G P S N S E79 GCA ATA CCG GTA CTC ACA GCA GTA GAA ACA GGA CAC ACA TCA CAG GTT ACA CCT AGT GAC ACG ATG CAA ACA AGA CAT27A I P V L T A V E T G H T S Q V T P S D T M Q T R H157 GTG CAC AAC TAC CAT TCA AGG TCC GAA TCC AGC GTA GAG AAC TTC CTG GCA CGC TCG GCT TGT GTG TTT TAT ACA ACA53V H N Y H S R S E S S V E N F L A R SA C V F Y TT
-——————βB—————235TAC ACC AAC AGT AAA AA— —— —T GCC GCC AAA GAG AAG AAG TTT GCA ACG TGG AAG GTG AGT GTT AGA CAA GCC GCC79 Y T N S K (K K)NA A K E K K F A T W K V S V R Q A A——————||—————βC—————313CAA CTA AGA AGA AAG CTA GAG CTA TTC ACA TAC TTA CGC TGT GAC ATC GAA CTA ACA TTC GTC ATC ACC AGT GCA CAA105 Q L R R K L E L F T Y L R C D I E L T F V IT S A Q391GAT CCA TCG ACC GCT ACC AAC TTG GAT SCS CCA GTG TTG ACC CAT CAA ATA ATG TAC GTC CCA CCT GGT SST CCA GTC131 D P S T A T N L D A P V L T H Q I M Y V P P G G P V469CCT GAA GCC GTG GAC GAT TAC AAC TGG CAA ACA TCT ACA AAT CCC AGC CTT TTT TGG ACT GAA GGG AAT GCA CCT CCA157 P E A V D D Y N W Q T S T N P S L F W T E G N A P P547CGC ATG TCA ATT CCA TTC ATG AGC ATA GGC AAT GCC TAT AGT ATG TTC TAT GAT GGT TGG TCC GAG TTT AGG CAT GAC183 R M S I P F M S I G N A Y S M F Y D G W S E F R H D627GGT GTG TAC GGC CTS AAT ACC CTT AAC AAT ATG GGC ACA ATA TAT GCT AGG CAC GTC AAC GCT GAC AAC CCA GGT AGC209 G V Y G L N T L N N M G T I Y A R H V N A D N P G S705ATC ACC AGC ACA GTG AGA ATA TAC TTC AAA CCC AAA CAT GTC AAG GCA TGG ATT CCT CGC CCG CCT CGT TTG GCA CAG235 I S T V P R P P R L A Q783TAT CTT AAA GCC AAT AAT GTG AAT TTT AAG ATC ACC GAT GTG ACA GAA AAG AGA GAT AGT CTC ACG ACC ACG261 Y L K A N N V N F K I T D V T E K R D S L T T T四、CVB2VP1基因核苷酸推導(dǎo)的氨基酸序列與參考毒株的對(duì)應(yīng)區(qū)域的聯(lián)配比對(duì)1 100YunnanSPVEESIERSIGRVADTISSSPSNSEAIPVLTAVETGHTSQVTPSDTMQTRHVHNYHSRSESSVENFLARS KVSVSecondary structure HEEEEEECCTTC—CHHHHHHHEEEOhi-1SPVEESIERSIGRVADTIGSGPSNSEAIPALTAVETGHTSQVTPSDTMQTRHVHNYHSRSESSVENFLARS KVSVSecondary structure HEEEEEECCTTCCCCHHHHHHHHEEjo/RoMA98 ————————————————————————————————————————————————fr/Rona98 ————————————————————————————————————————————————sp/Roma ———————————————————————————KHVRSESTIENFLARS VITTSecondary structure HEEEEEECCCCCC—CCCCCCCCE816/84 SPVEESIERSIGRVADTIGSGPSNSEAIPALTAVETGHTSQVTPSDTMQTRHVRNYHSRSESSVENFLARS KVSVSecondary structure HEEEEEECCTTC—CHHHHHHHHEEChina-2 SPVEESIERSIGRVADTIGSGPSNSEAIPALTAVETGHTSQVTPSDTMQTRHVHNYHSRSESSVENFLARS KVSVSecondary structure HEEEEEECCTTC—CHHHHHHHHEEChina-1 —————————————————————————————————————————————————MD84 —————————————————————————————————————————————————HON84—————————————————————————————————————————————————NC95 —————————————————————————————————————————————————FL92 —————————————————————————————————————————————————101 200Yunnan RQAAQLRRKLELFTYLRCDIELTFVITSAQDPSTATNLDAPVLTHQIMYVPPGGPVPEAVDDYNWQTSTNPSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIGNAYSMFYDOhi-1 RQAAQLRRKLELFTYLRCDIELTFVITSAQDPSTATNLDVPVLTHQIMYVPPGGPVPETVDDYNWQTSTNPSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIGNAYSMFYDjo/Roma98———————————————————————MYVPXGGPVPESVDDYNWQTSTNPSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIGNAYSMFYDfr/Roma98———————————————————————————VPESVDDYNWQTSTNPSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIGNAYSMFYDsp/Roma RKVAQLRRKLEMFTYLRFDMEITVVITSSQDQSTSQNQNAPVLTHQIM——————————————————————————
816/84 RQAAQLRRKLELFTYLRCDIELTFVITSAQDPSTATNLDVPVLTHQIMYVPPGGPVPETVDDYNWQTSTNQSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIG————China-2 RQAAQLRRKLELFTYLRCDIELTFVITSAQDPSTAKNLDVPVLTHQIMYVPPGGPVPETVDDYNWQTSTNPSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIGNAYSMEYDChina-1 ————————————————————————————————WQTSTNPSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIGNAYSMFYDMD84———————————————————————————PVPETVDDYNWQTSTNPSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIGNAYSMFYDHON84 ———————————————————————————PVPETVDDYNWQTSTNPSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIGNAYSMFYDNC95———————————————————————————PVPETVDDYNWQTSTNPSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIGNAYSMFYDFL92———————————————————————————PVPETVDDYNWQTSTNPSLFWTEGNAPPRMSIPFMSIGNAYSMFYD201 —————————————————————————————————————————————————300Yunnan GWSEFRHDGVYGLNTLNNMGTIYARHVNADNPGSITSTV PRPPRLAQYLKANNVNFKITDVTEKRDSLTTT—.............................................................................
OhiO-1 GWSEFRHDGVYGLNTLNNMGTIYARHVNADNPGSITSTV PRPPRLAQYLKANNVNFEITDVTEKRDSLTTT—....
jo/Roma98GwSEFRHDGVYGLNTLNNMGTIYARHVNADNPGSITSTV PRPPRLAQYLKANNFEITDVTEKRESL——...........
fr/Roma98GwSEFRHDGVYGLNTLNNMGTIYARHVNADNPGSITSTV PRPPRLAQYLKANNVNFEITDVTEKRESLVTT—........
sp/Roma88———————————————————————————————————————————............
816/84 ———————————————————————————————————————————............
China-2 GWSEFRHDGVYGLNTLNNMGTIYARHVNADNPGSITSTV PRPPRLAQYLKANNVNFEITDVTEKRESLTTT—........
China-1 GWSEFRHDGVYGLNTLNNMGTIYARHVNADNPGSITSTV PRPPRLAQYLKANNVNFEITDVTEKRESLTTT—........
MD84 GWSEFRHDGVYGLNTLNNMGTIYARHVNADNPGSITSTV PRPPRLAQYLKANNVNFEITDVTEKRDSLVTTGA.........
HON84GWSEFRHDGVYGLNTLNNMGTIYARHVNADNPGSITSTV PRPPRLAQYLKANNVNFEITDVTEKRDSLTTTGA.........
NC95 GWSEFRHDGVYGLNTLNNMGTIYARHVNADNPGSITSTV PRPPRLAQYLKANNVNFEITDVTEKRDSLTTT—.........
FL92GWSEFRHDGVYGLNTLNNMGTIYARHVNADNPGSITSTV PRPPRLAQYLKANNVNFEITDVTEKRDSLVTT—.........
五、pcDNA3-CVB2VP1測(cè)序結(jié)果HindIII1CCAAGCTGGC TAGCGTTTAAA CTTAAGCTTG CATGCCTGCA GGTCGACGAEcoRI51 TTGAATTCGT CATGAGCCCAG TGGAGGAATC CATTGAGAGA AGCATTGGC101 AGAGTTGCTG ACACCATTGGT AGTGGACCAT CCAATTCGGA GGCAATACC151 GGTACTCACA GCAGTAGAAAC AGGACACACA TCACAGGTTA CACCTAGTG201 ACACGATGCA AACAAGACATG TGCACAACTA CCATTCAAGG TCCGAATCC251 AGCGTAGAGA ACTTCCTGGCA CGCTCGGCTT GTGTGTTTTA TACAACATA301 CACCAACAGT AAAAATGCCGC CAAAGAGAAG AAGTTTGCAA CGTGGAAGG351 TGAGTGTTAG ACAAGCCGCCC AACTAAGAAG AAAGCTAGAG CTATTCACA401 TACTTACGCT GTGACATCGAA CTAACATTCG TCATCACCAG TGCACAAGA451 TCCATCGACC GCTACCAACTT GGATGCGCCA GTGTTGACCC ATCAAATAA501 TGTACGTCCC ACCTGGTGGTC CAGTCCCTGA AGCCGTGGAC GATTACAAC551 TGGCAAACAT CTACAAATCCC AGCCTTTTTT GGACTGAAGG GAATGCACC601 TCCACGCATG TCAATTCCATT CATGAGCATA GGCAATGCCT ATAGTATGT651 TCTATGATGG TTGGTCCGAGT TTAGGCATGA CGGTGTGTAC GGCCTGAAT701 ACCCTTAACA ATATGGGCACA ATATATGCTA GGCACGTCAA CGCTGACAA751 CCCAGGTAGC ATCACCAGCAC AGTGAGAATA TACTTCAAAC CCAAACATG801 TCAAGGCATG GATTCCTCGCC CGCCTCGTTT GGCACAGTAT CTTAAAGCC851 AATAATGTGA ATTTTAAGATC ACCGATGTGA CAGAAAAGAG AGATAGTCT901 CACGACCACG AATCTCTAGAG GGCCCGTTTA AACCCGCTGXba I Apa I
權(quán)利要求
1.柯薩奇病毒B組2型基因疫苗，其特征在于所述柯薩奇病毒B組2型基因疫苗是一種由真核表達(dá)系統(tǒng)pcDNA3和CVB2VP1基因組成的pcDNA3-CVB2VP1真核表達(dá)質(zhì)粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柯薩奇病毒B組2型基因疫苗，其特征在于CVB2VP1基因的基因序列為CCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGAATTCGTCATGAGCCCAGTGGAGGAATCCATTGAGAGAAGCATTGGCAGAGTTGCTGACACCATTGGTAGTGGACCATCCAATTCGGAGGCAATACCGGTACTCACAGCAGTAGAAACAGGACACACATCACAGGTTACACCTAGTGACACGATGCAAACAAGACATGTGCACAACTACCATTCAAGGTCCGAATCCAGCGTAGAGAACTTCCTGGCACGCTCGGCTTGTGTGTTTTATACAACATACACCAACAGTAAAAATGCCGCCAAAGAGAAGAAGTTTGCAACGTGGAAGGTGAGTGTTAGACAAGCCGCCCAACTAAGAAGAAAGCTAGAGCTATTCACATACTTACGCTGTGACATCGAACTAACATTCGTCATCACCAGTGCACAAGATCCATCGACCGCTACCAACTTGGATGCGCCAGTGTTGACCCATCAAATAATGTACGTCCCACCTGGTGGTCCAGTCCCTGAAGCCGTGGACGATTACAACTGGCAAACATCTACAAATCCCAGCCTTTTTTGGACTGAAGGGAATGCACCTCCACGCATGTCAATTCCATTCATGAGCATAGGCAATGCCTATAGTATGTTCTATGATGGTTGGTCCGAGTTTAGGCATGACGGTGTGTACGGCCTGAATACCCTTAACAATATGGGCACAATATATGCTAGGCACGTCAACGCTGACAACCCAGGTAGCATCACCAGCACAGTGAGAATATACTTCAAACCCAAACATGTCAAGGCATGGATTCCTCGCCCGCCTCGTTTGGCACAGTATCTTAAAGCCAATAATGTGAATTTTAAGATCACCGATGTGACAGAAAAGAGAGATAGTCTCACGACCACGAATCTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTG。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柯薩奇病毒B組2型基因疫苗，其特征在于質(zhì)粒pcDNA3-CVB2VP1的DNA序列為GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGAATTCGTCATGAGCCCAGTGGAGGAATCCATTGAGAGAAGCATTGGCAGAGTTGCTGACACCATTGGTAGTGGACCATCCAATTCGGAGGCAATACCGGTACTCACAGCAGTAGAAACAGGACACACATCACAGGTTACACCTAGTGACACGATGCAAACAAGACATGTGCACAACTACCATTCAAGGTCCGAATCCAGCGTAGAGAACTTCCTGGCACGCTCGGCTTGTGTGTTTTATACAACATACACCAACAGTAAAAATGCCGCCAAAGAGAAGAAGTTTGCAACGTGGAAGGTGAGTGTTAGACAAGCCGCCCAACTAAGAAGAAAGCTAGAGCTATTCACATACTTACGCTGTGACATCGAACTAACATTCGTCATCACCAGTGCACAAGATCCATCGACCGCTACCAACTTGGATGCGCCAGTGTTGACCCATCAAATAATGTACGTCCCACCTGGTGGTCCAGTCCCTGAAGCCGTGGACGATTACAACTGGCAAACATCTACAAATCCCAGCCTTTTTTGGACTGAAGGGAATGCACCTCCACGCATGTCAATTCCATTCATGAGCATAGGCAATGCCTATAGTATGTTCTATGATGGTTGGTCCGAGTTTAGGCATGACGGTGTGTACGGCCTGAATACCCTTAACAATATGGGCACAATATATGCTAGGCACGTCAACGCTGACAACCCAGGTAGCATCACCAGCACAGTGAGAATATACTTCAAACCCAAACATGTCAAGGCATGGATTCCTCGCCCGCCTCGTTTGGCACAGTATCTTAAAGCCAATAATGTGAATTTTAAGATCACCGATGTGACAGAAAAGAGAGATAGTCTCACGACCACGAATCTCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAG6TTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCGTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGVCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC。
全文摘要
柯薩奇病毒B組2型基因疫苗，它涉及一種預(yù)防柯薩奇病毒感染的疫苗。本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有疫苗存在免疫原性差、安全性差的不足，提供一種柯薩奇病毒B組2型基因疫苗，它是一種由真核表達(dá)系統(tǒng)pcDNA3和CVB2VP1基因組成的pcDNA3－CVB2VP1真核表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明的基因疫苗有下列優(yōu)點(diǎn)直接DNA接種，避免了傳統(tǒng)疫苗抗原制備純化等繁瑣過(guò)程；免疫應(yīng)答完整持久，基因免疫時(shí)抗原多肽的遞呈和自然感染時(shí)相似，以天然構(gòu)象被免疫系統(tǒng)識(shí)別，克服了其它疫苗抗原表位改變的缺點(diǎn)；基因疫苗具有共同的理化特征，可在同一質(zhì)粒嵌合多種目的基因，形成聯(lián)合免疫；基因疫苗制備簡(jiǎn)便，成本低，安全穩(wěn)定，便于貯存和運(yùn)輸。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1772304SQ20051001047
公開(kāi)日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2005年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月25日
發(fā)明者田野, 鐘照華, 郭宏, 王言, 肖建敏, 孟繁超 申請(qǐng)人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)