專利名稱：一種快速擴增食線蟲真菌胞外絲氨酸蛋白酶基因的方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種快速擴增食線蟲真菌胞外絲氨酸蛋白酶基因的方法和應用，屬于分子生物學和應用微生物學領域。
背景技術：
植物寄生線蟲是一大類重要的植物病害，每年造成損失巨大。在線蟲生物防治中，食線蟲真菌是一類非常重要的線蟲生防資源，目前已有包括線蟲必克等商品化的線蟲生防制劑上市。
在線蟲侵染過程中，無論是對于線蟲蟲體或者蟲卵來說，其覆蓋于表面的體壁或卵殼都是防止侵染的重要保護結構。線蟲的體壁主要由包括角蛋白、膠原蛋白在內(nèi)的蛋白質和纖維質所構成，卵殼則主要是由幾丁質層構成。體壁和卵殼共同形成了防止侵染的主要屏障。研究表明，在食線蟲菌物侵染線蟲的過程中，主要是機械與酶共同作用的結果，其中顯微結構和組織化學的研究表明，至少在線蟲體壁的刺入、線蟲被侵入、線蟲的消化等過程中均有蛋白酶和水解酶的參與。蛋白酶能有效地降解線蟲體壁，協(xié)助完成侵染過/程，是線蟲侵染的重要毒力因子。因此，從食線蟲菌物中獲取蛋白酶基因是提高線蟲生防制劑毒力，對現(xiàn)有菌株進行基因工程改造的重要手段之一。
目前克隆食線蟲真菌胞外絲氨酸蛋白酶基因的方法主要是通過分離純化目的蛋白酶，測定蛋白酶的N-端氨基酸序列，根據(jù)N-端氨基酸設計簡并引物，然后通過以下兩種方法克隆得到目的蛋白酶的編碼基因。一是通過RACE技術擴增得到全長基因序列；二是建立cDNA文庫，通過雜交篩選得到全長編碼基因，以上兩種方法共同的特點是難度大，時間長，而且費用極高。
經(jīng)文獻檢索，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明內(nèi)容相同文獻的公開報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術不足，通過發(fā)明一種快速擴增食線蟲真菌胞外絲氨酸蛋白酶基因的方法，迅速獲得需要的胞外絲氨酸蛋白酶編碼基因，促進線蟲生防菌株的基因工程菌研究開發(fā)。
本發(fā)明根據(jù)GenBank上發(fā)表的絲氨酸蛋白酶編碼序列設計了5對共6條簡并引物用于擴增捕食線蟲真菌的胞外絲氨酸蛋白酶基因，對PCR擴增片段進行測序，測序結果在NCBI(美國國立生物技術信息中心，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行檢索，根據(jù)檢索結果就可以判斷用專利引物擴增得到的基因序列是不是捕食線蟲真菌絲氨酸蛋白酶基因，并初步判斷蛋白酶殺線蟲能力大小。
本發(fā)明用于引物設計的產(chǎn)胞外絲氨酸蛋白酶的真菌和相關的基因序號(GenBank索引號)如下(表1)，利用生物分析軟件DNAman對這些真菌的胞外蛋白酶基因進行比對，并根據(jù)它們的保守序列設計了5對共6條簡并引物(表2)。
表1用于簡并引物設計的真菌和胞外絲氨酸蛋白酶編碼基因

表2用于捕食線蟲真菌胞外絲氨酸蛋白酶基因的簡并引物


表中的簡并堿基代碼M＝A/C，R＝A/G，W＝A/T，S＝G/C，Y＝C/T，K＝G/T，V＝A/G/C，H＝A/C/T，D＝A/G/T，B＝G/C/T，N＝A/G/C/T。
表2中所設計的引物用途說明如下引物1能夠擴增包括捕食線蟲真菌在內(nèi)的絲狀真菌的胞外絲氨酸蛋白酶編碼基因的中間序列，尤其適合于擴增等電點較高(pI＞8.0)的堿性絲氨酸蛋白酶基因，擴增片段900-1200bp(由于不同真菌的內(nèi)含子序列大小不同，所以擴增片段大小也不完全相同)，一般的擴增片段為1000bp.
引物2能夠擴增包括捕食線蟲真菌在內(nèi)的絲狀真菌的胞外絲氨酸蛋白酶編碼基因的中間序列，尤其適合于擴增等電點較低(pI＜7.0)的中性絲氨酸蛋白酶基因，擴增片段900-1200bp(由于不同真菌的內(nèi)含子序列大小不同，所以擴增片段大小也不完全相同)，一般的擴增片段為1000bp.
引物3能夠擴增捕食線蟲真菌的胞外絲氨酸蛋白酶編碼基因的3’端序列，擴增片段1100-1300bp，由于不同捕食線蟲真菌的內(nèi)含子序列大小不同，所以擴增片段大小也不完全相同。
引物4能夠擴增捕食線蟲真菌的胞外絲氨酸蛋白酶編碼基因的5’端序列，尤其適合于擴增等電點較低(pI＜7.0)的中性絲氨酸蛋白酶基因，擴增片段一般為450-500bp.
引物5能夠擴增捕食線蟲真菌的胞外絲氨酸蛋白酶編碼基因的全長序列，尤其適合于擴增等電點較低(pI＜7.0)的中性絲氨酸蛋白酶基因，擴增片段一般為1200-1400bp，由于不同捕食線蟲真菌的內(nèi)含子序列大小不同，所以擴增片段大小也不完全相同。
采用本發(fā)明設計的引物可以實現(xiàn)對包括捕食線蟲真菌在內(nèi)的絲狀真菌的胞外絲氨酸蛋白酶基因的快速擴增，引物1和引物2適合于包括捕食線蟲真菌在內(nèi)的絲狀真菌的胞外絲氨酸蛋白酶基因的快速擴增，引物3和4能夠用于分別擴增捕食線蟲真菌胞外絲氨酸蛋白酶基因的3’端和5’端序列的擴增，引物5適合于擴增捕食線蟲真菌胞外絲氨酸蛋白酶基因全序列。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的真菌培養(yǎng)，從菌絲中提取基因組DNA作為模板，利用以上設計的引物進行PCR擴增，擴增片段測序，測序結果在NCBI中利用BLAST N(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行檢索，根據(jù)檢索結果判斷擴增序列的性質。
1.真菌培養(yǎng)捕食線蟲真菌一般用PDA培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，不同真菌的營養(yǎng)要求可能有所差異，本發(fā)明不做特殊要求。等菌絲長好以后，用常規(guī)的封口塑料袋收集，并用液體氮氣進行速凍，速凍的菌絲可以放在-70℃進行長期保存。
2.真菌基因組DNA的提取以常用的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法進行提取，常規(guī)的提取步驟如下1)收集在平板或者液體培養(yǎng)基中新鮮菌絲；2)用液氮研磨或者用石英砂研磨(100mg石英砂，100mg菌體，300ml CTAB溶液)，菌體磨好后再加300ml CTAB溶液，混合均勻；3)65℃水浴1小時，20分鐘翻轉一次；如果要除去RNA，可以在水浴40分鐘的時候加入1μl的RNA酶(10mg/ml)4)加入300μl苯酚和300μl三氯甲烷，混合均勻；5)6500rpm離心30分鐘；6)把上清溶液轉移到新的EP管中，注意不要吸到中間的沉淀物質，在上清液中加入300μl苯酚和300μl三氯甲烷，混合均勻；7)6500rpm離心20分鐘；8)把上清溶液轉移到新的EP管中，加入0.5倍體積的異丙醇或2倍體積的乙醇，混合均勻；9)12000rpm離心5分鐘，棄上清10)沉淀用70％的乙醇清洗兩遍11)把殘余的乙醇真空抽干，加入20-30μl的水溶解沉淀；12)取2-3μl樣品電泳檢測(1％agarose)，DNA樣品-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.PCR擴增把基因組DNA稀釋5-20倍(根據(jù)提取質量)，利用以上所設計的引物配制PCR反應體系，PCR擴增程序采用降落(Touch-down)PCR程序。
1)PCR擴增體系

a使用簡并引物，所以引物的濃度較高2)降落(Touch-down)PCR程序


由于以上PCR擴增采用的是簡并引物，通過降落PCR能夠有效的提高擴增產(chǎn)物的特異性，如果PCR產(chǎn)物比較弱的話也可以進行二次PCR來提高PCR反應的特異性。同時由于引物和模板濃度或者擴增程序不匹配等原因而導致沒有預期擴增產(chǎn)物出現(xiàn)的話，可以對以上因素進行修正，然后再次進行擴增。
4.PCR擴增片段測序可以把PCR擴增片段純化出來并和商業(yè)化的測序載體連接，也可以直接把PCR擴增液體送給專業(yè)的公司進行測序。
5.測序結果分析測序結果出來后，可以利用NCBI上的核苷酸序列同源性分析工具BLAST N(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行分析，根據(jù)檢索結果判斷擴增序列的是否是捕食線蟲真菌的胞外絲氨酸蛋白酶的編碼基因，也可以用DNAman進行同源序列分析。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有快捷、簡便、經(jīng)濟等優(yōu)點。
具體實施例方式以下是本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實施例一刀孢輪枝菌的胞外絲氨酸蛋白酶基因保守序列擴增將刀孢輪枝菌(L.psalliotae，syn.V.psalliotae)菌體接種到PDA平板上，26℃培養(yǎng)6-8天，收集菌絲并提取基因組DNA，以刀孢輪枝菌的基因組DNA作為模板，用引物1進行擴增得到胞外絲氨酸蛋白酶編碼基因的保守序列。
實施例二囊孢單頂孢的胞外絲氨酸蛋白酶基因保守序列擴增將囊孢單頂孢(M.cystosporium)菌體接種到PDA平板上，26℃培養(yǎng)6-8天，收集菌絲并提取基因組DNA，并用引物2進行擴增得到胞外絲氨酸蛋白酶編碼基因的保守序列。
實施例三隔子孢YMF1.00118的胞外絲氨酸蛋白酶基因擴增基本同實施例二，以隔子孢YMF1.00118(Dactylella spp.YMF1.00118)的基因組DNA作為模板，用引物3進行擴增得到胞外絲氨酸蛋白酶成熟肽全序列和部分前肽序列。
實施例四秀麗單頂孢的胞外絲氨酸蛋白酶基因5′端序列擴增基本同實施例二，以秀麗單頂孢(M.elegans)的基因組DNA作為模板，并用引物4進行擴增得到胞外絲氨酸蛋白酶編碼基因的5′端序列。
實施例五圓錐節(jié)叢孢胞外絲氨酸蛋白酶基因擴增基本同實施例二，以圓錐節(jié)叢孢(A.conoides)的基因組DNA作為模板，并用引物5進行擴增得到胞外絲氨酸蛋白酶全長編碼基因序列，圓錐節(jié)叢孢胞外絲氨酸蛋白酶編碼基因已經(jīng)整理完成，并已經(jīng)遞交到GenBank上，基因的序列索引號為AY859782。
Untitled1.ST25SEQUENCE LISTING<110>云南大學<120>一種快速擴增食線蟲真菌胞外絲氨酸蛋白酶基因的方法及應用<130>01<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1090<212>DNA<213>Lecanicillium psalliotae(syn.Verticillium psalliotae)<220>
<221>gene<222>(1)..(1090)<223>
<400>1aagtacattg tcaagctcaa ggatgaggcc aagtttggca tcatgaacgc caagtccaag 60atccccggta ttgagcgcgt gtacgagaac gtcctcaacg gcttctctgc caccctcagc 120aacgaggagc ttgagcgcct tcgccgcgat cccgatgtaa gttgaaagat tcaaattgcg 180gagtgaccat aggaatggtt gtggctgaga cggggtcatc aacccaccaa caggtcgagt 240cgattgagca ggatgccatt ttcagcatca acgccattac ccagcagcag ggcgcaacct 300ggggacttac tcgcatctcc caccgcgcgc gtggcagcac cgcgtacgcc tacgacacca 360gcgccggagc tggtgcctgt gtctatgtga ttgacactgg tgtcgaggac acccaccccg 420tgagtgcctc ctgtccctac ttggcatgcc agatgactag gaccgttcta acctgcttca 480ccataggatt ttgagggccg tgccaagcag atcaagagct acgccagcac cgcccgcgat 540ggccacggcc acggcactca ctgcgccggc accatcggct ccaagacttg gggtgtcgcc 600aagaaggtca gcatctttgg cgtcaaggtg ctcgacgaca gcggctccgg ctccctgagc 660aacattgtcg ccggcatgga ctttgtcgcc tccgaccgcc agagccgcaa ctgccccaga 720cgcaccgtcg ccagcatgtc cctcggcggt ggctactcgg ccgccctcaa ccaggccgcc 780gcccgcctcc agagctccgg tgtctttgtc gccgtcgcgg caggcaacga caaccgcgac 840gccgccaaca cctcgccggc ctctgagccc accgtctgca ctgtcggagc caccgactcc 900
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Untitled2.ST25SEQUENCE LISTING<110>云南大學<120>一種快速擴增食線蟲真菌胞外絲氨酸蛋白酶基因的方法及應用<130>1<160>l<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1014<212>DNA<213>Monacrosporium cystosporium<220>
<221>gene<222>(1)..(1014)<223>
<400>1aaatacattg tcgtcctcaa gaatggtctc tccgagactg ctgttgcgaa gcataccaac 60cgcatttctt ccttccactc cgtcgttgct cgggacctta ctggagctag ggcccatggc 120gttggcaaga agttcaggtt cacatccact ggattcaatg gatacgttgg tggcttcgat 180aaggcaaccc ttcaggagat tctcaactcc ccagaggtcg actacgtcga gcaggatgcc 240gtagtcaaga tcaatgctga acagctcggt tccacttggg gtcttgatcg catctcccac 300gaggattacg ccgagccgta cacatatgaa tacgacgaga ctgccgctgg cgctggaact 360accgtctacg tcatcgatac tggcgttcaa attactcacg atgtaagtct tgatgtctaa 420tataaatacg gatcggtttc taactatatc gtaggaattc aaaactgcta acggcacaag 480ccgagcttcc tggggattca atgccgttga ctcgactaac accgatggca atggccacgg 540cactcactgc gctggtacca tcggtggaaa gacctatggt gtctcaaaga aggcaaagat 600tgtcgctgtc aaggttctta gcgctggtgg ctctggttcc acttctggtg tcgttaatgg 660aatgaactgg gttgctcaga atgctgttcc aaacttttct gtcgccagca tgtctcttgg 720aggcgggaag tctacagcta tcaacagtgc cgttgacgcc atcttcaacg ctggtaccac 780catcgttgtt gctgccggca atgagagcca agatgctaaa aatgtttcgc ctgcttctgc 840tcccaacgcc atcaccgtcg gtgccatcga tagcaagaat acgattgcat ccttctctaa 900
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Untitled3.ST25SEQUENCE LISTING<110>云南大學<120>一種快速擴增食線蟲真菌胞外絲氨酸蛋白酶基因的方法及應用<130>1<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1110<212>DNA<213>Dactylella spp.YMFl.00118<220>
<221>gene<222>(1)..(1110)<223>
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Untitled4.ST25SEQUENCE LISTING<110>云南大學<120>一種快速擴增食線蟲真菌胞外絲氨酸蛋白酶基因的方法及應用<130>1<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>486<212>DNA<213>Monacrosporium elegans<220>
<221>gene<222>(1)..(486)<223>
<400>1aatgatttcg aacggcctca tctctctctt agccattgct ggattggcat ttgcaggtcc60catccgcaaa gtttctaacg ctggcgcttc tggaactatt gccgacaaat acattgtcgt120cctcaagaat ggcctctccg agagtgctgt tgcgaagcat accaaccgca tttcttcctt180tcactccgtc gttgctcgag accttaccgg agctcgggcc catggcgttg gcaggaagtt240caggttcgca gccactggat tcaatggata cgttggcggc ttcgataagg caacccttca300ggagattctc aactccccag aggtcgacta cgtcgagcag gatgctgtag tcaagatcaa360tgctgaacag ctcgattcca cctggggcct tgatcgtatc tcccacgaga atttcgcagc420gccgtacaca tatgaatacg acgagactgc cgctggcgct ggaactaccg tctacgtcat480cgacac 486
Untitled5.ST25SEQUENCE LISTING<110>云南大學<120>一種快速擴增食線蟲真菌胞外絲氨酸蛋白酶基因的方法及應用<130>1<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1297<212>DNA<213>Arthrobotrys conoides<220>
<221>gene<222>(1)..(1297)<223>
<300>
<308>AY859782<309>2004-12-16<313>(1)..(1297)<400>1aatgctgacg aacggcctca tctccctcct agcaatcgct ggattggcta ccaatgcctt60tgccggccca atccgcaagg tctccaatgc cggcgcagct ggagccatcg ccgacaaata120cattgtcgtc ttgaagaaag gcctctctga gagcgccgtt tcaaagcaca ccaaccgcat180ctcctctttc cacaccaatg ttgctagaga ccttactgga gctagagctc acggtgttgg240aaagaagttt agattctcat ccactggctt caatggatac actggtggtt tcgacaaggc300aactcttcag gagatcttga actcccctga ggtcgactac gtcgaacaag acactgtagt360tactaccaac gctgaacaga cagactccac ttggggcctt gaccgcatct cccacgagga420attcgatact ccgtatacct atgaatacga tgaaacgttc gctggttctg gaaccacagt480ctacgtcatc gacaccggta ttcgcattac ccacaatgta ggttttgata taatttatga540ccaaacacaa tccaccagtc tgctaattat attttaggaa ttccaaaccg agaacggcac600
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1.一種快速擴增食線蟲真菌胞外絲氨酸蛋白酶基因的方法，包括真菌培養(yǎng)、真菌基因組DNA的提取、用引物進行PCR擴增、擴增片段測序及測序結果分析步驟，其特征在于本方法中所用引物由下列方法設計得到(1)選擇GenBank上發(fā)表的下列真菌和胞外絲氨酸蛋白酶的編碼基因用于簡并引物設計；真菌名稱蛋白酶性質GenBank索引號Arthrobotrys表皮降解絲氨酸蛋 X94121oligospora 白酶(PII)Arthrobotrys中性絲氨酸蛋白酶 AF516146oligospora (Aozl)Paecilomyces絲氨酸蛋白酶(Pr) L29262lilacinusVerticillium堿性絲氨酸蛋白酶 AJ427460chlamydosporium (VCP1)Beauveria 表皮降解絲氨酸蛋 AF154118bassiana白酶(Pr)Metarhizium 絲氨酸蛋白酶 AJ251925anisopliae (PrA)Cordyceps 表皮降解蛋白酶AY520815brongniartii(Pr1)Fusarium sp.堿性蛋白酶S71812S-19-5 (Alp)Tritirachium絲氨酸蛋白酶 X56116album(2)利用生物分析軟件DNAman對上述真菌和胞外絲氨酸蛋白酶的編碼基因進行比對，并根據(jù)它們的保守序列設計出下列5對共6條簡并引物上游引物序列 下游引物序列引(5’--3’) (5’--3’)物1AARTAYATYGTCAAGYWSAAGAYRTGDGGRSWRGCCATSGA2AARTAYATYGTCGTCYWSAAGAYRTGDGGRSWRGCCATSGA3AARTAYATYGTCGTCYWSAAGTTAAGYRKHKCCRTTGWAG4MAWGMTKWYGAACSKYCT GTRTCRATGACGTAGACKG5MAWGMTKWYGAACSKYCT TTAAGYRKHKCCRTTGWAG表中的簡并堿基代碼M＝A/C，R＝A/G，W＝A/T，S＝G/C，Y＝C/T，K＝G/T，V＝A/G/C，H＝A/C/T，D＝A/G/T，B＝G/C/T，N＝A/G/C/T。
2.權利要求1所述的方法，其特征在于本方法作為快速擴增捕食線蟲真菌胞外絲氨酸蛋白酶基因的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速擴增食線蟲真菌胞外絲氨酸蛋白酶基因的方法和應用，屬于分子生物學和應用微生物學領域。本發(fā)明設計了5對簡并引物(共6條)用于快速擴增捕食線蟲真菌的胞外絲氨酸蛋白酶基因。本發(fā)明設計的5對簡并引物序列為引物1，AARTAYATYGTCAAGYWSAAG/ AYRTGDGGRSWRGCCATSGA；引物2，AARTAYATYGTC GTCYWSAAG/AYRTGDGGRSWRGCCATSGA；引物3，AAR TAYATYGTCGTCYWSAAG/TTAAGYRKHKCCRTTGWAG；引物4，MAWGMTKWYGAACSKYCT/GTRTCRATGACGTA GACKG；引物5，MAWGMTKWYGAACSKYCT/TTAAGYRK HKCCRTTGWAG。本發(fā)明以捕食線蟲真菌基因組DNA作為模板，通過以上引物快速擴增胞外蛋白酶的編碼基因。本發(fā)明能夠快速擴增捕食線蟲真菌胞外絲氨酸蛋白酶基因，具有良好的應用前景。
文檔編號C12N15/57GK1710077SQ20051001080
公開日2005年12月21日 申請日期2005年5月11日 優(yōu)先權日2005年5月11日
發(fā)明者張克勤, 楊金奎 申請人:云南大學