專利名稱：Sip基因及其編碼的蛋白和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及SIP基因，該基因編碼的SIP蛋白，以及所述基因和蛋白在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。所述蛋白能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)和增殖，對(duì)cyclinD1啟動(dòng)子啟動(dòng)熒光素酶表達(dá)起抑制作用。
背景技術(shù)：
某些蛋白可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，發(fā)現(xiàn)新的抑制腫瘤生長(zhǎng)和增殖的蛋白和編碼它們的基因可為腫瘤的治療提供新的方法和手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種可抑制乳腺癌等的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖的蛋白，克隆了編碼該蛋白的基因，構(gòu)建了含有該基因的表達(dá)載體和含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，并且發(fā)現(xiàn)該蛋白可抑制乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，基于以上發(fā)現(xiàn)，完成了本發(fā)明。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖的蛋白，尤其重組蛋白，該蛋白具有序列表中序列2所示的氨基酸序列，或者通過所述氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失，取代或增加而得到的氨基酸序列。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼上述蛋白的基因，它是具有序列1所示的堿基序列的DNA或者與所述DNA在嚴(yán)格條件下雜交的DNA。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有上述基因或者編碼上述蛋白的基因的表達(dá)載體。
在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了由上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)本發(fā)明的重組蛋白的方法，該方法包括下列步驟培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生本發(fā)明的重組蛋白；和從培養(yǎng)物中分離出重組蛋白。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了針對(duì)上述蛋白的抗體，它是使用所述重組蛋白作為免疫原而產(chǎn)生的特異性抗體。它可以是單克隆或多克隆抗體。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)所述蛋白的試劑盒，它含有上述特異性抗體，可以進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)，用于檢測(cè)具有序列2所示的蛋白。
此外，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)序列1所示的核苷酸序列的探針診斷試劑盒，它含有與核苷酸序列1中的部分核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。它可以是一個(gè)具有15-300個(gè)堿基的DNA片段。通過探針雜交的方法，用于檢測(cè)含有所述核苷酸序列的mRNA的表達(dá)，該mRNA被翻譯為含有序列2所示的氨基酸序列的蛋白。
此外，本發(fā)明提供了一個(gè)引物對(duì)，用于對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物如下所示Primer15’-tgc tct aga gcc acc atg gac tac aaggac gac gat gac aag gaa ttc atg gcc cag gtc ctg cac-3’Primer25’-cgc gga tcc cta ctc ttc tgc cga gga-3’。
本發(fā)明還提供了上述基因、蛋白或抗體在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是Northern Blot結(jié)果表明基因轉(zhuǎn)錄本與其全長(zhǎng)大小相符。且在人類的8種組織中均有表達(dá)。與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)相符。
圖2為GST-SIP融合蛋白在大腸桿菌BL21中表達(dá)純化的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)。90kDa為蛋白質(zhì)的分子量。箭頭所指為分離出的蛋白條帶。
圖3為SIP蛋白在真核細(xì)胞MCF-7中的表達(dá)圖(Western blot)。一抗為小鼠抗人Flag單克隆抗體，二抗為本實(shí)驗(yàn)室保存的兔抗鼠辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗。1為陰性對(duì)照，2為細(xì)胞裂解液。MCF-7細(xì)胞用flag標(biāo)簽的pcDNA3.1(-)-SIP轉(zhuǎn)染。蛋白水平用抗flag抗體測(cè)試。1-2道分別表示陰性對(duì)照和MCF-7的細(xì)胞溶解產(chǎn)物。
圖4為SIP蛋白的亞細(xì)胞定位。綠色為GFP，藍(lán)色為DAPI染的胞核。SIP的亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)。
圖5為MTT法檢測(cè)不同濃度的SIP對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。橫坐標(biāo)為轉(zhuǎn)染時(shí)間，縱坐標(biāo)為570nm吸光度值。在每組方柱中，從左至右依次是v-25ng，SIP-25ng，v-50ng，SIP-50ng，v-100ng，SIP-100ng。
圖6為SIP對(duì)cyclinD1啟動(dòng)子啟動(dòng)熒光素酶表達(dá)的作用。橫坐標(biāo)為cyclinDl啟動(dòng)子不同的缺失體。縱坐標(biāo)為Firefly/Renilla比值。
圖7是SIP的結(jié)構(gòu)示意圖，其中的兩個(gè)灰色方框?yàn)橛蒀oils2<http:∥smart.embl-heidelberg.de/help/smart glossary.shtml>程序測(cè)定的卷曲螺旋區(qū)域和6個(gè)黑色方框是由SEG<http:∥smart.embl-heidelberg.de/help/smart glossary.shtml>測(cè)定的組成復(fù)雜性低的鏈段。
SIP(SRC-l interacting protein)是由p160家族成員之一的SRC-1通過酵母雙雜交的方法篩選出來的新基因。我們從人乳腺cDNA文庫中通過PCR的方法獲取該基因的ORF。克隆到pcDNA3.1(-)真核表達(dá)載體中。為便于檢測(cè)，在其N端接上Flag標(biāo)簽。SIP又叫KIAA1518，F(xiàn)LJ20004，DKFZp434N161。定位于染色體19p13.2。全長(zhǎng)5358bp。表達(dá)蛋白～90kD。ORF2580bp。編碼859個(gè)氨基酸。
對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其廣譜表達(dá)。包含Ankyrin repeat結(jié)構(gòu)域。
(1)SIP表達(dá)信息cDNA來源正常前列腺；睪丸；結(jié)腸；結(jié)腸腫瘤，RER+；Pooled-Skin；成神經(jīng)細(xì)胞瘤COT 10 NORMALIZED；原發(fā)性肺囊性纖維化上皮細(xì)胞；脂肪；惡性黑色素瘤，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；白質(zhì)；耳蝸；骨髓基質(zhì)；惡性膠質(zhì)瘤(pooled)；五種合并肉瘤，包括粘液樣脂肉瘤，單發(fā)纖維瘤，惡性纖維組織細(xì)胞瘤，胃腸的基質(zhì)腫瘤腫瘤，和間皮瘤；小細(xì)胞癌；胎盤；淋巴；三種合并腦膜瘤；全腦；中度分化子宮內(nèi)膜腺癌，3種合并腫瘤；正常結(jié)腸；軟骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞系；成神經(jīng)管細(xì)胞瘤；腫瘤；卵巢；B細(xì)胞，慢性淋巴細(xì)胞白血??；上皮癌；黑素瘤；乳房；漿液乳頭狀癌，高級(jí)，2種合并腫瘤；正常睪丸；整個(gè)胚胎，主要是軀體；卵巢腫瘤組織；前列腺；交感神經(jīng)干；肝臟與脾；腦膜瘤；正常前列腺；腎腫瘤；虹膜；晶狀體；嗅上皮；胎盤；頸；正常胎盤；正常子宮內(nèi)膜，中分泌期，第23個(gè)周期日；黑素細(xì)胞；合并人黑素細(xì)胞，胎心，和妊娠子宮；腎；腺癌；具有印戒細(xì)胞特征的分化不良腺癌；合并；正常著色的視上皮；黑素瘤，高M(jìn)DR(細(xì)胞系)；上皮癌細(xì)胞系；成神經(jīng)細(xì)胞瘤；宮頸癌細(xì)胞系；海馬；合并的腦，肺，睪丸；視神經(jīng)；子宮腫瘤；胎兒胰腺(4 Pooled Donors，18-20星期，stratagene)；胎兒眼睛；衰老成纖維細(xì)胞；腹水；肺；初級(jí)肺上皮細(xì)胞；肺病灶纖維化；轉(zhuǎn)移性軟骨肉瘤；軟骨肉瘤；不良分化子宮內(nèi)膜腺癌，2種合并腫瘤；子宮；鱗狀細(xì)胞癌；多發(fā)性硬化病變；胰島瘤；脾；鱗狀細(xì)胞癌，細(xì)胞系；成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤；混合(pool of 40 RNAs)；內(nèi)生軟骨瘤細(xì)胞系；軟骨下骨；心臟；肺；良性腫瘤；十二指腸腺癌，細(xì)胞系；子宮內(nèi)膜，腺癌細(xì)胞系；血；人肺上皮細(xì)胞；眼睛前段；脊神經(jīng)后根神經(jīng)節(jié)；畸胎癌，細(xì)胞系；RPE/脈絡(luò)膜；細(xì)胞系；純化郎格罕氏島；平滑肌肉瘤；生發(fā)中心B細(xì)胞；中度分化腺癌；胰腺；滑膜；胸肌(在乳房切除術(shù)以后)；甲狀腺；神經(jīng)鞘瘤腫瘤；前列腺腫瘤。
(2)在氨基酸序列基礎(chǔ)上通過ExPASy及interPro對(duì)其主要功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域Ankyrin。具體細(xì)節(jié)見下圖及表圖1是SIP的結(jié)構(gòu)示意圖，其中的兩個(gè)灰色方框?yàn)橛蒀oils2<http:∥smart.embl-heidelberg.de/help/smart glossary.shtml>程序測(cè)定的卷曲螺旋區(qū)域和6個(gè)黑色方框是由SEG<http:∥smart.embl-heidelberg.de/help/smart glossary.shtml>測(cè)定的組成復(fù)雜性低的鏈段。

通過使用本發(fā)明的蛋白或者免疫學(xué)上等效的多肽，可以獲得其抗體，抗體用于所述蛋白的檢測(cè)和純化。可以利用本發(fā)明的蛋白或其部分氨基酸序列作為免疫原來產(chǎn)生抗體?？梢酝ㄟ^將抗體接種給宿主動(dòng)物并回收血清的常規(guī)方法產(chǎn)生多克隆抗體。還可以通過常規(guī)雜交瘤方法產(chǎn)生單克隆抗體。
利用MTT法檢測(cè)不同濃度的SIP對(duì)MCF-7腫瘤細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GIBC有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。
因此，本發(fā)明的蛋白可用于治療腫瘤，尤其乳腺癌。
實(shí)施例實(shí)施例1用PCR方法從人乳腺癌cDNA文庫克隆編碼SIP蛋白的基因用乳腺癌cDNA文庫為模板，在SIP基因N端接上Flag標(biāo)簽，用下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增Primer15’-tgc tct aga gcc acc atg gac tac aag gacgac gat gac aag gaa ttc atg gcc cag gtcctg cac-3’Primer25’-cgc gga tcc cta ctc ttc tgc cga gga-3’擴(kuò)增反應(yīng)的條件在50μL的反應(yīng)體積中含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl，(PH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，0.25U的pfu DNA聚合酶(Takara公司產(chǎn)品)。按下列條件反應(yīng)30個(gè)周期94℃ 30sec；59℃ 30sec；72℃ 2min 30sec。擴(kuò)增產(chǎn)物用QIAGEN公司的試劑盒純化，用XbaI及BamHI雙酶切后，克隆到相同酶切的pcDNA3.1(-)真核表達(dá)載體中。DNA序列分析結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的DNA序列與預(yù)期相符。
實(shí)施例2Northern Blot探針的標(biāo)記和雜交操作參照Clontech公司的SpotlightTMRandomPrimer Labeling Kit試劑盒說明書。過程如下(1)探針標(biāo)記25ng-1μgDNA溶于20μL體積中，90-100℃ 2-3分鐘，迅速冰浴5分鐘，加5μL[α-32P]dCTP標(biāo)記的RandomPrimers and Reaction Buffer Mix，補(bǔ)水至50μL，37℃孵育5-10min。
(2)雜交68℃預(yù)熱雜交液，將吸附有核酸的尼龍膜放入含有雜交液的雜交瓶中，加入含有100μg/mL的鮭精DNA的雜交液0.1mL/cm2，68℃預(yù)雜交30min。20ng/mL探針混入雜交液，95℃ 2-5分鐘，冰浴5分鐘。加入雜交瓶，68℃雜交1小時(shí)。
(3)洗膜用Wash Buffer 1室溫洗膜30-40分鐘，用Wash Buffer 250℃洗膜40分鐘。
(4)顯色用鑷子取出膜，洗干Wash Buffer 2，用保鮮膜覆蓋，-70℃曝光1-3天后顯影，定影。
實(shí)施例3SIP在原核細(xì)胞中的表達(dá)及純化pGEX-4T-3-SIP可以在大腸桿菌BL21菌株中30℃誘導(dǎo)表達(dá)GST-SIP的融合蛋白，首先制備BL21的感受態(tài)細(xì)胞挑取單克隆到適量培養(yǎng)基中，37℃ 250rpm培養(yǎng)至A6000.4-0.5，2500g離心15分鐘，備用。將1-50ng pGEX-4T-3-SIP轉(zhuǎn)化到上述制備的感受態(tài)細(xì)胞中，用Glutathione Sepharose 4B進(jìn)行純化，純化的步驟如下(1)取單克隆到2-3mL 2YTA培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-5小時(shí)。轉(zhuǎn)接到100mL的錐形瓶中生長(zhǎng)過夜。
(2)轉(zhuǎn)接到500mL的錐形瓶中培養(yǎng)3-5小時(shí)。
(3)加0.5mL 1M IPTG 30℃，培養(yǎng)3-6小時(shí)。
(4)3000rpm 10分鐘離心收集細(xì)胞。
(5)用25mL PBS重懸細(xì)胞。超聲10分鐘。
(6)加1.25mL 20％Triton X-100，混勻1小時(shí)。
(7)1000rpm 10分鐘離心，加入0.5mL 50％slurry of GlutathioneSepharose 4B，室溫30分鐘。
(8)1000rpm 5分鐘離心，PBS洗三遍。
(9)用0.5mL洗脫Buffer洗脫，短暫離心后收集上清。
實(shí)施例4SIP在真核細(xì)胞中的表達(dá)Western Blot是在蛋白質(zhì)電泳和固相免疫測(cè)定的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。其基本原理為抗原抗體反應(yīng)。細(xì)胞蛋白提取物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到固相支持物上(本實(shí)驗(yàn)采用硝酸纖維素膜)。與特異的一抗反應(yīng)(本實(shí)驗(yàn)用小鼠抗人Flag單克隆抗體，Sigma)，再與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗(本實(shí)驗(yàn)室保存兔抗鼠二抗)孵育，顯色，可以得到特異蛋白分子的免疫印跡圖。該方法具有從混雜抗原中檢測(cè)出特定的抗原的優(yōu)點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)帶有Flag標(biāo)簽的SIP基因轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后的表達(dá)情況。
1)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)于轉(zhuǎn)染前一天將MCF-7細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)板中，接種密度為2×106個(gè)細(xì)胞/孔，每孔加入培養(yǎng)液10ml。24小時(shí)后，細(xì)胞長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)孔底面積約50-60％時(shí)，可準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。在EP管中配制下述溶液溶液A24μg pcDNA3.1(-)-SIP表達(dá)質(zhì)粒，溶于1.5mL無血清無雙抗DMEM培養(yǎng)液。溶液B將48μL脂質(zhì)體溶液(lipofectamine 2000reagent)加入到1.5m L無血清無雙抗DMEM培養(yǎng)液中。室溫靜置5分鐘。然后將溶液A、B混合，室溫靜置20分鐘。用無血清和不含雙抗的DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞。將上述溶液A、B的混合液中加入12mL無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)液，混勻后加至細(xì)胞表面。37℃，5％CO2條件下孵育4-6小時(shí)后，再用正常含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液取代前述培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至48小時(shí)。
2)細(xì)胞總蛋白的提取培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)0.25％胰酶消化使之分散，4℃低速離心去上清，將沉淀置于冰上30min，再用預(yù)冷的PBS洗2次，每106細(xì)胞加入裂解液100μL，使細(xì)胞充分裂解30min，再于4℃，20000×g離心15min，收集上清。
3)Bradford法測(cè)定細(xì)胞裂解液蛋白的濃度首先配制考馬斯亮藍(lán)染色液；將標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(BSA)配制成1mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，分別將10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg蛋白標(biāo)準(zhǔn)液和5μL待測(cè)蛋白質(zhì)樣品加入3mL考馬斯亮藍(lán)染液中，室溫孵育10min，在595nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值。BSA標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，在一定范圍內(nèi)OD595與蛋白濃度成正比。樣品蛋白質(zhì)的濃度經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程來計(jì)算。
4)電泳及免疫反應(yīng)流程如下A、制膠(5％濃縮膠，10％分離膠)；B、50μg蛋白樣品加入上樣緩沖液，煮沸，上樣；C、電泳，濃縮膠80V電壓，分離膠120V電壓；D、轉(zhuǎn)膜，100V，1.5h；E、封閉，1h；F、一抗反應(yīng)，4℃，過夜；G、TBST洗膜，三次，每次10min；H、二抗反應(yīng)，1.5h；I、TBST洗膜，三次，每次10min；J、顯色、曝光。
實(shí)施例5SIP在細(xì)胞內(nèi)的定位利用本實(shí)驗(yàn)室保存的pEGFP-C1 C末端蛋白融合載體構(gòu)建了pEGFP-C1-SIP載體，它可以在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GFP-SIP的融合蛋白，將該載體用LipofectinTM的方法轉(zhuǎn)染進(jìn)MCF-7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行爬片，24小時(shí)后，用PBS洗三遍，用4％多聚甲醛/PBS進(jìn)行固定，室溫15分鐘，然后用PBS洗三遍。用0.1％Triton X-100/PBS透化15分鐘，然后用PBS洗三遍，加入200μL 2.5mg/mL的DAPI，室溫作用30分鐘，然后用PBS洗三遍，在熒光顯微鏡下分別用常規(guī)熒光波長(zhǎng)和DAPI波長(zhǎng)進(jìn)行觀察，并進(jìn)行拍照。結(jié)果見圖4，定位于細(xì)胞質(zhì)。
實(shí)施例6MTT法檢測(cè)不同濃度的SIP對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響MTT(四甲基偶氮唑蘭)可被細(xì)胞攝取，并被活細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶還原成一種不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲瓚，并沉淀于細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。甲瓚可溶于二甲基亞砜(DMSO)，溶液在570nm處有最大吸收。故該波段處吸收值越大代表存活細(xì)胞量越多。MTT法廣泛應(yīng)用于細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定等。本實(shí)驗(yàn)利用MTT法觀察SIP對(duì)MCF-7生長(zhǎng)的影響。具體操作方法如下將培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)。次日按照濃度梯度加入SIP(25、50、100ng)，每濃度作用6孔細(xì)胞，37℃，5％CO2進(jìn)行培養(yǎng)。分別培養(yǎng)1d、2d、3d、4d后，在每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)加入50μlL 1mg/mL的MTT溶液，同樣培養(yǎng)條件下作用4小時(shí)后取出，小心吸出每孔內(nèi)液體，每孔加入二甲基亞砜150μL，輕微振蕩10分鐘，使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解在二甲基亞砜中。用自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)量96孔板中每孔在570nm處的吸光值。參看圖5，MTT實(shí)驗(yàn)表明SIP對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)增殖起抑制作用，并且與劑量有關(guān)。
實(shí)施例7瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及熒光素酶(Luciferase)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用熒光素酶作為報(bào)告基因，為分析基因的調(diào)控元件和測(cè)量基因轉(zhuǎn)錄活性提供了便利的方法。本實(shí)驗(yàn)就是將cyclinD1基因啟動(dòng)子與熒光素酶讀碼框共同構(gòu)建到真核表達(dá)載體中，將該融合表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過測(cè)定熒光素酶的活性，從而研究轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)節(jié)蛋白對(duì)cyclinD1基因啟動(dòng)子的作用。實(shí)驗(yàn)采用螢火蟲熒光素酶(Firefly)為報(bào)告基因，海三色堇(Renillar)熒光素酶為內(nèi)參照。用Promega公司出產(chǎn)的雙熒光報(bào)告基因分析系統(tǒng)試劑盒，在同一試管中測(cè)量?jī)煞N酶的活性。并應(yīng)用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測(cè)。
2)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)于轉(zhuǎn)染前一天將MCF-7細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，接種密度為1-2×105個(gè)細(xì)胞/孔，每孔加入培養(yǎng)液0.5mL。24小時(shí)后，細(xì)胞長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)孔底面積約50-60％時(shí)，可準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。在EP管中配制下述溶液溶液A0.8μg DNA(cyclinD1報(bào)告基因質(zhì)粒200ng；內(nèi)參Renillar質(zhì)粒10ng；SIP表達(dá)質(zhì)粒600ng或pcDNA3.1(-)空載體質(zhì)粒600ng)，溶于50μL無血清無雙抗DMEM培養(yǎng)液。溶液B將2μL脂質(zhì)體溶液(lipofectamine 2000reagent)加入到50μL無血清無雙抗DMEM培養(yǎng)液中。室溫靜置5分鐘。然后將溶液A、B混合，室溫靜置20分鐘。用無血清和不含雙抗的DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞。將上述溶液A、B的混合液中加入400μL無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)液，混勻后加至細(xì)胞表面。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3孔。37℃，5％CO2條件下孵育4-6小時(shí)后，再用正常含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液取代前述培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至48小時(shí)。裂解細(xì)胞，測(cè)量熒光素酶的活性。
2)用雙熒光報(bào)告基因試劑盒測(cè)量雙熒光素酶的活性(1)裂解細(xì)胞用冷PBS清洗細(xì)胞，將1×細(xì)胞裂解液(PLB)100μL加入每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔，室溫孵育15分鐘，使細(xì)胞充分裂解。所得到的細(xì)胞裂解液可直接用于熒光測(cè)量。
(2)熒光素酶底物的配制將螢火蟲熒光素酶底物冷凍干粉溶于10mL熒光素酶分析緩沖液中，所得溶液為L(zhǎng)ARII，分裝，-70℃保存。
用Stop & Glo緩沖液將50×海三色堇熒光素酶底物稀釋到1×，所得溶液為Stop & Glo，現(xiàn)用現(xiàn)配。
(3)測(cè)量過程將20μL細(xì)胞裂解液放入96孔熒光測(cè)量板，加入100μLLARII，測(cè)量螢火蟲熒光素酶，測(cè)量條件為延遲2秒，測(cè)量10秒。再加入100μLStop & Glo，測(cè)量海三色堇熒光素酶，測(cè)量條件同上。
參看圖6，SIP對(duì)cyclinD1啟動(dòng)子啟動(dòng)熒光素酶表達(dá)起抑制作用。
SIP序~1SEQUENCE LISTING<110>北京大學(xué)<120>SIP基因及其編碼的蛋白和應(yīng)用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2580<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)..(2577)<223>
<400>1atg gcc cag gtc ctg cac gtg cct gct ccc ttc cca ggg acc cct ggc 48Met Ala Gln Val Leu His Val Pro Ala Pro Phe Pro Gly Thr Pro Gly1 5 10 15cca gcc tcc cca cct gcc ttc cct gcc aag gac ccc gat cca ccc tac 96Pro Ala Ser Pro Pro Ala Phe Pro Ala Lys Asp Pro Asp Pro Pro Tyr20 25 30tcc gtg gag acc ccc tat ggc tac cgc ctg gac ctg gac ttc ctc aag 144Ser Val Glu Thr Pro Tyr Gly Tyr Arg Leu Asp Leu Asp Phe Leu Lys35 40 45tac gtg gat gac atc gag aag ggc cac acg ctg cga cgc gtg gca gtg 192Tyr Val Asp Asp Ile Glu Lys Gly His Thr Leu Arg Arg Val Ala Val50 55 60cag cgc cgc ccc cgc ctg agc tcg ctg ccc cgt ggc cct ggc tcc tgg 240Gln Arg Arg Pro Arg Leu Ser Ser Leu Pro Arg Gly Pro Gly Ser Trp65 70 75 80tgg acg tcc act gag tcg ctg tgc tcc aat gcc agt ggg gac agc cgc 288Trp Thr Ser Thr Glu Ser Leu Cys Ser Asn Ala Ser Gly Asp Ser Arg85 90 95cac tca gcc tat tcc tac tgc ggc cgt ggc ttc tac cct cag tat ggt 336His Ser Ala Tyr Ser Tyr Cys Gly Arg Gly Phe Tyr Pro Gln Tyr Gly100 105 110gct ctg gag acc cgc ggt ggc ttc aat ccg cgg gtg gag cgc acg ctg 384Ala Leu Glu Thr Arg Gly Gly Phe Asn Pro Arg Val Glu Arg Thr Leu115 120 125ctg gat gcc cgt cgc cgt ctc gag gac cag gcg gcc aca ccc acc ggc 432
SIP序~1Leu Asp Ala Arg Arg Arg Leu Glu Asp Gln Ala Ala Thr Pro Thr Gly130 135 140ctg ggc tcc ctg acc ccc agt gcg gcc ggc tcg aca gcc tcc ctg gtg 480Leu Gly Ser Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gly Ser Thr Ala Ser Leu Val145 150 155 160ggc gtg ggg ttg cca ccc ccg aca cca cgg agt tca gga ctg tcc aca 528Gly Val Gly Leu Pro Pro Pro Thr Pro Arg Ser Ser Gly Leu Ser Thr165 170 175ccg gtg cct ccc agt gcc ggg cac ctg gcc cac gtg cgg gag cag atg 576Pro Val Pro Pro Ser Ala Gly His Leu Ala His Val Arg Glu Gln Met180 185 190gcg ggt gcc ctg cgg aag ctg cgg cag ctg gag gag cag gtg aag ctg 624Ala Gly Ala Leu Arg Lys Leu Arg Gln Leu Glu Glu Gln Val Lys Leu195 200 205atc cct gtg ctc cag gtg aag ctc tcg gtg ctc cag gag gaa aag cgg 672Ile Pro Val Leu Gln Val Lys Leu Ser Val Leu Gln Glu Glu Lys Arg210 215 220cag ctc aca gta caa ctt aag agc cag aag ttc ctg ggc cac ccc aca 720Gln Leu Thr Val Gln Leu Lys Ser Gln Lys Phe Leu Gly His Pro Thr225 230 235 240gcg ggc cgg ggt cgc agc gag ctc tgc ctg gac ctc ccc gat ccc cca 768Ala Gly Arg Gly Arg Ser Glu Leu Cys Leu Asp Leu Pro Asp Pro Pro245 250 255gag gac cca gtg gca ctg gag acc cgg agt gtg ggc acc tgg gtc cga 816Glu Asp Pro Val Ala Leu Glu Thr Arg Ser Val Gly Thr Trp Val Arg260 265 270gaa cgg gac ttg ggc atg cct gat ggg gag gct gcc ctc gcc gcc aag 864Glu Arg Asp Leu Gly Met Pro Asp Gly Glu Ala Ala Leu Ala Ala Lys275 280 285gtc gct gtg ctg gag acc cag ctc aag aag gcg ctt cag gag ctg cag 912Val Ala Val Leu Glu Thr Gln Leu Lys Lys Ala Leu Gln Glu Leu Gln290 295 300gca gct cag gcc cgg cag gct gac ccc cag ccc cag gcc tgg cca ccg 960Ala Ala Gln Ala Arg Gln Ala Asp Pro Gln Pro Gln Ala Trp Pro Pro305 310 315 320ccg gac agc ccg gtc cgc gtg gat aca gtc cgg gtg gta gaa ggg cca 1008Pro Asp Ser Pro Val Arg Val Asp Thr Val Arg Val Val Glu Gly Pro325 330 335cgg gag gtg gag gtg gtg gcc agc aca gcc gct ggc gcc ccc gca cag 1056Arg Glu Val Glu Val Val Ala Ser Thr Ala Ala Gly Ala Pro Ala Gln340 345 350cgg gcc cag agc ctg gag cct tac ggc aca ggg ctg agg gcc ctg gca 1104
SIP序~1Arg Ala Gln Ser Leu Glu Pro Tyr Gly Thr Gly Leu Arg Ala Leu Ala355 360 365atg cct ggt agg cct gag agc cca cct gtg ttc cgc agc cag gag gtg1152Met Pro Gly Arg Pro Glu Ser Pro Pro Val Phe Arg Ser Gln Glu Val370 375 380gtg gag aca atg tgc cca gtg ccc gct gca gct acc agc aac gtc cat1200Val Glu Thr Met Cys Pro Val Pro Ala Ala Ala Thr Ser Asn Val His385 390 395 400atg gtg aag aag att agc atc aca gag cga agc tgc gat gga gca gca1248Met Val Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Arg Ser Cys Asp Gly Ala Ala405 410 415ggc ctc cca gaa gtt cct gcc gaa tcg tct tcg tca ccc ccg ggg tcc1296Gly Leu Pro Glu Val Pro Ala Glu Ser Ser Ser Ser Pro Pro Gly Ser420 425 430gag gta gcc tcc ctt aca cag cct gag aag agc aca ggc cga gtg ccc1344Glu Val Ala Ser Leu Thr Gln Pro Glu Lys Ser Thr Gly Arg Val Pro435 440 445acc cag gag ccc acc cac agg gag ccc acc agg caa gca gcc tcc caa1392Thr Gln Glu Pro Thr His Arg Glu Pro Thr Arg Gln Ala Ala Ser Gln450 455 460gag tcc gag gag gcc ggg ggc acc gca cct ccg ctg tcc tcc cct cca1440Glu Ser Glu Glu Ala Gly Gly Thr Ala Pro Pro Leu Ser Ser Pro Pro465 470 475 480ggc ggg ccc ccg gca ggc gtg cga tct atc atg aaa cgg aaa gag gag1488Gly Gly Pro Pro Ala Gly Val Arg Ser Ile Met Lys Arg Lys Glu Glu485 490 495gtt gca gac ccc acg gcc cac cgg agg agc ctc cag ttc gtg ggg gtc1536Val Ala Asp Pro Thr Ala His Arg Arg Ser Leu Gln Phe Val Gly Val500 505 510aac ggc ggg tat gag tcg tca tcc gag gac tcc agc aca gca gag aac1584Asn Gly Gly Tyr Glu Ser Ser Ser Glu Asp Ser Ser Thr Ala Glu Asn515 520 525atc tca gac aac gac agc aca gag aac gag gcc cca gag ccg agg gag1632Ile Ser Asp Asn Asp Ser Thr Glu Asn Glu Ala Pro Glu Pro Arg Glu530 535 540agg gtt ccg agt gtg gcc gaa gcc ccc cag ctc agg cct gca ggg acg1680Arg Val Pro Ser Val Ala Glu Ala Pro Gln Leu Arg Pro Ala Gly Thr545 550 555 560gca gcg gcc aag acc agc cgg cag gag tgt cag ctg tct cga gaa tct1728Ala Ala Ala Lys Thr Ser Arg Gln Glu Cys Gln Leu Ser Arg Glu Ser565 570 575cag cac ata ccc act gct gag ggg gca tca gga tca aac acg gag gag1776
SIP序~1Gln His Ile Pro Thr Ala Glu Gly Ala Ser Gly Ser Asn Thr Glu Glu580 585 590gag atc agg atg gag cta agc cct gac ctc atc tca gcc tgc ttg gcc 1824Glu Ile Arg Met Glu Leu Ser Pro Asp Leu Ile Ser Ala Cys Leu Ala595 600 605ctg gaa aag tac ctg gac aat ccc aac gcc ctc aca gag cgg gag ctg 1872Leu Glu Lys Tyr Leu Asp Asn Pro Asn Ala Leu Thr Glu Arg Glu Leu610 615 620aaa gtg gcc tac acc aca gtg ctg cag gag tgg ctg cgc ctg gcc tgc 1920Lys Val Ala Tyr Thr Thr Val Leu Gln Glu Trp Leu Arg Leu Ala Cys625 630 635 640cgc agc gac gca cac ccc gag ctg gtg cgg cgg cac ctg gtc acg ttc 1968Arg Ser Asp Ala His Pro Glu Leu Val Arg Arg His Leu Val Thr Phe645 650 655cgg gcc atg tct gcg cgg ctg ctg gac tac gtg gtc aac atc gcc gac 2016Arg Ala Met Ser Ala Arg Leu Leu Asp Tyr Val Val Asn Ile Ala Asp660 665 670agc aac ggc aac aca gcc ctg cac tac tcc gtg tct cat gcc aac ttc 2064Ser Asn Gly Asn Thr Ala Leu His Tyr Ser Val Ser His Ala Asn Phe675 680 685ccc gtg gtg cag cag ctg ctc gac agc ggt gtc tgc aag gtg gac aaa 2112Pro Val Val Gln Gln Leu Leu Asp Ser Gly Val Cys Lys Val Asp Lys690 695 700cag aac cgt gct ggc tac agc cct att atg ctc acc gcc ctg gcc acc 2160Gln Asn Arg Ala Gly Tyr Ser Pro Ile Met Leu Thr Ala Leu Ala Thr705 710 715 720ctg aag acc cag gac gac atc gag act gtc ctt cag ctc ttc cgg ctt 2208Leu Lys Thr Gln Asp Asp Ile Glu Thr Val Leu Gln Leu Phe Arg Leu725 730 735ggc aac atc aat gcc aaa gcc agc cag gca gga cag acg gcc ctg atg 2256Gly Asn Ile Asn Ala Lys Ala Ser Gln Ala Gly Gln Thr Ala Leu Met740 745 750ctg gcc gtc agc cac ggg cgg gtg gac gtt gtc aaa gcc ctg ctg gcc 2304Leu Ala Val Ser His Gly Arg Val Asp Val Val Lys Ala Leu Leu Ala755 760 765tgt gag gca gat gtc aac gtg caa gat gat gac ggc tcc acg gcc ctc 2352Cys Glu Ala Asp Val Asn Val Gln Asp Asp Asp Gly Ser Thr Ala Leu770 775 780atg tgc gcc tgt gag cac ggc cac aag gag atc gcg ggg ctg ctg ctg 2400Met Cys Ala Cys Glu His Gly His Lys Glu Ile Ala Gly Leu Leu Leu785 790 795 800gcc gtg ccc agc tgt gac atc tca ctc aca gat cgc gat ggg agc aca 2448
SIP序~1Ala Val Pro Ser Cys Asp Ile Ser Leu Thr Asp Arg Asp Gly Ser Thr805 810 815gct ctg atg gtg gcc ttg gac gca ggg cag agt gag att gcg tcc atg 2496Ala Leu Met Val Ala Leu Asp Ala Gly Gln Ser Glu Ile Ala Ser Met820 825 830ctg tat tcc cgc atg aac atc aag tgc tcg ttt gcc cca atg tca gat 2544Leu Tyr Ser Arg Met Asn Ile Lys Cys Ser Phe Ala Pro Met Ser Asp835 840 845gac gag agc cct aca tca tcc tcg gca gaa gag tag 2580Asp Glu Ser Pro Thr Ser Ser Ser Ala Glu Glu850 855<210>2<211>859<212>PRT<213>人<400>2Met Ala Gln Val Leu His Val Pro Ala Pro Phe Pro Gly Thr Pro Gly1 5 10 15Pro Ala Ser Pro Pro Ala Phe Pro Ala Lys Asp Pro Asp Pro Pro Tyr20 25 30Ser Val Glu Thr Pro Tyr Gly Tyr Arg Leu Asp Leu Asp Phe Leu Lys35 40 45Tyr Val Asp Asp Ile Glu Lys Gly His Thr Leu Arg Arg Val Ala Val50 55 60Gln Arg Arg Pro Arg Leu Ser Ser Leu Pro Arg Gly Pro Gly Ser Trp65 70 75 80Trp Thr Ser Thr Glu Ser Leu Cys Ser Asn Ala Ser Gly Asp Ser Arg85 90 95His Ser Ala Tyr Ser Tyr Cys Gly Arg Gly Phe Tyr Pro Gln Tyr Gly100 105 110Ala Leu Glu Thr Arg Gly Gly Phe Asn Pro Arg Val Glu Arg Thr Leu115 120 125Leu Asp Ala Arg Arg Arg Leu Glu Asp Gln Ala Ala Thr Pro Thr Gly
SIP序~1130 135 140Leu Gly Ser Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gly Ser Thr Ala Ser Leu Val145 150 155 160Gly Val Gly Leu Pro Pro Pro Thr Pro Arg Ser Ser Gly Leu Ser Thr165 170 175Pro Val Pro Pro Ser Ala Gly His Leu Ala His Val Arg Glu Gln Met180 185 190Ala Gly Ala Leu Arg Lys Leu Arg Gln Leu Glu Glu Gln Val Lys Leu195 200 205Ile Pro Val Leu Gln Val Lys Leu Ser Val Leu Gln Glu Glu Lys Arg210 215 220Gln Leu Thr Val Gln Leu Lys Ser Gln Lys Phe Leu Gly His Pro Thr225 230 235 240Ala Gly Arg Gly Arg Ser Glu Leu Cys Leu Asp Leu Pro Asp Pro Pro245 250 255Glu Asp Pro Val Ala Leu Glu Thr Arg Ser Val Gly Thr Trp Val Arg260 265 270Glu Arg Asp Leu Gly Met Pro Asp Gly Glu Ala Ala Leu Ala Ala Lys275 280 285Val Ala Val Leu Glu Thr Gln Leu Lys Lys Ala Leu Gln Glu Leu Gln290 295 300Ala Ala Gln Ala Arg Gln Ala Asp Pro Gln Pro Gln Ala Trp Pro Pro305 310 315 320Pro Asp Ser Pro Val Arg Val Asp Thr Val Arg Val Val Glu Gly Pro325 330 335Arg Glu Val Glu Val Val Ala Ser Thr Ala Ala Gly Ala Pro Ala Gln340 345 350Arg Ala Gln Ser Leu Glu Pro Tyr Gly Thr Gly Leu Arg Ala Leu Ala
SIP序~1355 360 365Met Pro Gly Arg Pro Glu Ser Pro Pro Val Phe Arg Ser Gln Glu Val370 375 380Val Glu Thr Met Cys Pro Val Pro Ala Ala Ala Thr Ser Asn Val His385 390 395 400Met Val Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Arg Ser Cys Asp Gly Ala Ala405 410 415Gly Leu Pro Glu Val Pro Ala Glu Ser Ser Ser Ser Pro Pro Gly Ser420 425 430Glu Val Ala Ser Leu Thr Gln Pro Glu Lys Ser Thr Gly Arg Val Pro435 440 445Thr Gln Glu Pro Thr His Arg Glu Pro Thr Arg Gln Ala Ala Ser Gln450 455 460Glu Ser Glu Glu Ala Gly Gly Thr Ala Pro Pro Leu Ser Ser Pro Pro465 470 475 480Gly Gly Pro Pro Ala Gly Val Arg Ser Ile Met Lys Arg Lys Glu Glu485 490 495Val Ala Asp Pro Thr Ala His Arg Arg Ser Leu Gln Phe Val Gly Val500 505 510Asn Gly Gly Tyr Glu Ser Ser Ser Glu Asp Ser Ser Thr Ala Glu Asn515 520 525Ile Ser Asp Asn Asp Ser Thr Glu Asn Glu Ala Pro Glu Pro Arg Glu530 535 540Arg Val Pro Ser Val Ala Glu Ala Pro Gln Leu Arg Pro Ala Gly Thr545 550 555 560Ala Ala Ala Lys Thr Ser Arg Gln Glu Cys Gln Leu Ser Arg Glu Ser565 570 575Gln His Ile Pro Thr Ala Glu Gly Ala Ser Gly Ser Asn Thr Glu Glu
SIP序~1580 585 590Glu Ile Arg Met Glu Leu Ser Pro Asp Leu Ile Ser Ala Cys Leu Ala595 600 605Leu Glu Lys Tyr Leu Asp Asn Pro Asn Ala Leu Thr Glu Arg Glu Leu610 615 620Lys Val Ala Tyr Thr Thr Val Leu Gln Glu Trp Leu Arg Leu Ala Cys625 630 635 640Arg Ser Asp Ala His Pro Glu Leu Val Arg Arg His Leu Val Thr Phe645 650 655Arg Ala Met Ser Ala Arg Leu Leu Asp Tyr Val Val Asn Ile Ala Asp660 665 670Ser Asn Gly Asn Thr Ala Leu His Tyr Ser Val Ser His Ala Asn Phe675 680 685Pro Val Val Gln Gln Leu Leu Asp Ser Gly Val Cys Lys Val Asp Lys690 695 700Gln Asn Arg Ala Gly Tyr Ser Pro Ile Met Leu Thr Ala Leu Ala Thr705 710 715 720Leu Lys Thr Gln Asp Asp Ile Glu Thr Val Leu Gln Leu Phe Arg Leu725 730 735Gly Asn Ile Asn Ala Lys Ala Ser Gln Ala Gly Gln Thr Ala Leu Met740 745 750Leu Ala Val Ser His Gly Arg Val Asp Val Val Lys Ala Leu Leu Ala755 760 765Cys Glu Ala Asp Val Asn Val Gln Asp Asp Asp Gly Ser Thr Ala Leu770 775 780Met Cys Ala Cys Glu His Gly His Lys Glu Ile Ala Gly Leu Leu Leu785 790 795 800Ala Val Pro Ser Cys Asp Ile Ser Leu Thr Asp Arg Asp Gly Ser Thr
SIP序~1805 810 815Ala Leu Met Val Ala Leu Asp Ala Gly Gln Ser Glu Ile Ala Ser Met820 825 830Leu Tyr Ser Arg Met Asn Ile Lys Cys Ser Phe Ala Pro Met Ser Asp835 840 845Asp Glu Ser Pro Thr Ser Ser Ser Ala Glu Glu850 85權(quán)利要求
1.可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖的蛋白，該蛋白具有序列表中序列2所示的氨基酸序列，或者通過所述氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失，取代或增加而得到的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1的蛋白的基因，它是具有序列1所示的堿基序列的DNA或者與所述DNA在嚴(yán)格條件下雜交的DNA。
3.含有權(quán)利要求2的基因或者編碼權(quán)利要求1的蛋白的基因的表達(dá)載體。
4.由權(quán)利要求3的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
5.生產(chǎn)權(quán)利要求1的蛋白的方法，該方法包括下列步驟培養(yǎng)權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生本發(fā)明的重組蛋白；和從培養(yǎng)物中分離出重組蛋白。
6.針對(duì)權(quán)利要求1的蛋白的抗體，它是使用所述重組蛋白作為免疫原而產(chǎn)生的特異性抗體。
7.檢測(cè)所述蛋白的試劑盒，它含有權(quán)利要求6的特異性抗體，可以進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)，用于檢測(cè)具有序列2所示的蛋白。
8.用于檢測(cè)序列1所示的核苷酸序列的探針診斷試劑盒，它含有與核苷酸序列1中的部分核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求1的蛋白或權(quán)利要求2的基因在制備治療腫瘤，尤其乳腺癌的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及SIP基因，該基因編碼的SIP蛋白，以及所述基因和蛋白在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。所述蛋白能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)和增殖，對(duì)cyclinD1啟動(dòng)子啟動(dòng)熒光素酶表達(dá)起抑制作用。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1807450SQ20051001119
公開日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2005年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月18日
發(fā)明者尚永豐, 張映, 張華 申請(qǐng)人:北京大學(xué)