專利名稱：一種多重pcr反應試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地說，涉及一種檢測奶牛腐蹄病的多重PCR反應試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
腐蹄病是危害奶牛業(yè)的主要疾病之一，他主要是由多種病原菌相互并發(fā)感染而引起的具有傳染性的疾病，其發(fā)病率較高，約占肢蹄病的30％，在全世界各地的奶牛場均有腐蹄病的發(fā)生，本病重者可使奶牛臥地不起，產奶量下降，淘汰率升高，給奶牛業(yè)帶來了很大的經濟損失。
在國內對腐蹄病的檢查是通過臨床癥狀和病理變化來初步確診，但對鑒別蹄炎、趾間皮炎、蹄底潰瘍有一定困難。在國外對腐蹄病的檢測已運用了ELISA方法和PCR檢測法，ELISA試驗有很高特異性，但它的敏感性很低，不易推廣。PCR法有快速、準確、特異等優(yōu)點，但只是針對節(jié)瘤擬桿菌單一致病菌設計應用的，在沒有完全分離出是哪種血清型的節(jié)瘤擬桿菌情況下，還不適宜應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測奶牛腐蹄病的快速、敏感性高、特異性強，可實現(xiàn)工業(yè)化生產，成本低的PCR診斷試劑盒及其檢測方法和應用。
本發(fā)明提供了一種多重PCR反應試劑盒，其特征在于它含有如下引物(1)檢測壞死桿菌的引物上游引物5’TGA CAT TAC AGC TGA AGC AAA 3’
下游引物5’TCC AAC AGA AAC AGA AGC ATC 3’(2)檢測產氣莢膜桿菌的引物上游引物5’TGT TAA GTT TGA GAC TTT TGC 3’下游引物5’ATC TGG GAA TGC TGT ATA TTT 3’(3)檢測金色葡萄菌的引物上游引物5’CCG AAT TCG TTA TGA CAG AAT ACT 3’下游引物5’CAA GTC GAC CAG CGT TGT CTT CGC 3’(4)檢測化膿棒狀桿菌的引物上游引物5’ACAATT TGC GTT CGGACATCT 3’下游引物5’CCA CTT GAG CCT GAA CTT TGC 3’本發(fā)明所述的試劑盒，其中各組分體積配比為滅菌超純水26體積份、10×PCR反應緩沖液5體積份、25mmol/L MgCl24體積份、10mmol/L dNTP 2體積份、25pmol/L檢測壞死桿菌的引物1體積份、25pmol/L檢測產氣莢膜桿菌的引物1體積份、25pmol/L檢測金色葡萄菌的引物1體積份、25pmol/L檢測化膿棒狀桿菌的引物1體積份。
優(yōu)選地，試劑盒組成45μL反應體系，其中滅菌超純水26μL、10×PCR反應緩沖液5μL、25mmol/L MgCl24μL、10mmol/L dNTP2μL、25pmol/L檢測壞死桿菌的引物1μL、25pmol/L檢測產氣莢膜桿菌的引物1μL、25pmol/L檢測金色葡萄菌的引物1μL、25pmol/L檢測化膿棒狀桿菌的引物1μL。
本發(fā)明還提供了用所述試劑盒的檢測方法，它包括如下步驟(1)將模板DNA加入試劑盒中，迅速加入Taq DNA聚合酶，離心；(2)在PCR擴增儀上孵育，PCR循環(huán)參數(shù)為94℃預變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃再延伸10min；
(3)將擴增產物進行電泳檢測。
其中電泳檢測后，出現(xiàn)404bp、560bp、668bp、968bp的特異性條帶。
本發(fā)明還公開了所述試劑盒在檢測牛或豬壞死桿菌、產氣莢膜桿菌、金色葡萄菌、化膿棒狀桿菌中的應用。
通過檢測壞死桿菌、產氣莢膜桿菌、金色葡萄菌、化膿棒狀桿菌的結果，來診斷奶牛腐蹄病或診斷牛、豬壞死桿菌病。
本發(fā)明是利用基因工程技術，PCR反應具有特異性強、敏感性高等優(yōu)點，針對腐蹄病中分離到的壞死桿菌(Fusobacteriumnecrophorum)、產氣莢膜梭菌(Cl.Perfringense)、金色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及化膿棒狀桿菌(Corynebacteriumpyogenes)，這四種菌可產不同的毒素，根據(jù)四種菌毒素基因序列的特異性，分別設計引物，優(yōu)化后組合成多重PCR反應試劑盒。用該試劑盒對病料或病料培養(yǎng)增菌后提取的病菌DNA進行PCR反應，反應產物經瓊脂糖凝膠電泳，如出現(xiàn)三條以上特異性條帶，即可確診腐蹄病的存在。
本發(fā)明的產品制備過程如下(1)設計引物根據(jù)壞死桿菌白細胞毒素基因lktA基因是最主要的毒力相關基因，用Oligo軟件對該基因404bp片段進行引物設計；根據(jù)魏氏梭菌各種毒素和酶中，以α毒素最為重要，是主要致死毒素，用Oligo軟件對α毒素的Cpa基因的560bp片段進行引物設計；根據(jù)nuC基因為金色葡萄菌DNA片段高保守序列，該基因編碼金葡萄菌TNase酶是金葡萄菌所特有的，用Oligo軟件對nuC基因的668bp片段進行引物設計；根據(jù)化膿桿菌溶血素pyolysin(PLO)與毒力非常相關，用Oligo軟件對編碼該毒素的基因967bp片段進行引物設計。
引物由哈爾濱寶泰克生物技術公司合成。
(2)通過PCR反應對每一對引物進行敏感性和特異性試驗；(3)對所設計的各種菌的特異引物進行優(yōu)化組合；(4)用四種標準菌株提取DNA后，進行PCR反應來驗證組合的引物，即試劑盒。
(5)用條件菌大腸桿菌等提取DNA后進行PCR反應，驗證試劑盒具有特異性。
(6)采集病料(或用病料增菌后)，提取DNA，驗證試劑盒的實用性。
診斷試劑盒的保存，一般保存在-20℃的冰箱中，短時間內應用時，可存放于4℃冰箱中。
本發(fā)明的產品優(yōu)點體現(xiàn)在①本試劑盒在檢測奶牛腐蹄病時具有敏感性高，特異性強，診斷快速等優(yōu)點。
②本試劑盒生產工藝先進，生產成本低，產品附加值高，市場應用前景廣。
具體實施例方式
(1)采集病料采集病料用剪刀修剪患病蹄部，從蹄壁或分開的蹄底下濕潤、開放部位采集部分壞組織，用2.5mm×152mm木制消毒棉簽或解剖刀扯刮取病變部位病料，應細心避免血液污染樣本。病料插入到運送培養(yǎng)基中。
運送培養(yǎng)基瓊脂0.4g 半胱氨酸0.05g 美藍0.02g 磷酸氫二鈉0.4g 牛肉膏1g加水到100ml，調節(jié)pH值7.2，加熱1210℃15min，裝入試管中備用。
(2)對病料進行接種，增加細菌的數(shù)量培養(yǎng)基的制備蹄粉4g、牛肉膏0.5g、蛋白胨1g、NaCl0.5g、酵母膏0.1g瓊脂2g，加水到100ml，調節(jié)pH值為7.2-7.4，加熱121℃15min。
采集的樣本接種于培養(yǎng)基上，用厭氧罐或厭氧培養(yǎng)箱在37℃下厭氧培養(yǎng)3～5d。
(3)病料病原菌DNA的提取，DNA提取法依據(jù)革蘭氏陰性桿菌DNA快速提取方法。在厭氧培養(yǎng)基中培養(yǎng)的病料在37℃培養(yǎng)3～5d天后，挑取菌落，用800ulSTE懸浮重新離心收集菌體，用400ulTE懸浮，加10ul溶菌酶(0.1mg/ml)，60℃下孵育15分鐘，加入10ul蛋白酶K(1％溶液)和5ulSDS(25％)，60℃下孵育15分鐘。冰塊上冷卻后加入等體積苯酚，搖動，10000rpm/min離心10分鐘。將上清液移到另一新EPPendorf管中，加入等體積苯酚/氯仿?lián)u動，離心10分鐘。將上清移到另一新的EPPendorf管中，加等體積氯仿/異戊醇，搖動，離心10分鐘。將上清移到另一新EPPendorf管中，加入等體積4M醋酸按和2倍體積的異丙醇，充分震蕩后，室溫放置10分鐘，離心10分鐘。仔細去上清液，得到沉淀團，加入500ul70％乙醇，離心10分鐘清洗。更加仔細去上清液，室溫干燥沉淀團，在50ulTE中或滅菌水中溶解沉淀團。
DNA的保存一般保存在-20℃的冰箱中。
(4)用提取病料的DNA，加入診斷試劑盒中，在加入Taq酶，在PCR反應儀中進行PCR。
試劑盒組成45μL反應體系在標準PCR管中，滅菌超純水26μL，10×PCR反應緩沖液5μL，25mmol/L MgCl24μL，10mmol/L dNTP2μL，四種引物各1μL(25pmol/L)。
PCR循環(huán)參數(shù)首先94℃預變性5min；然后94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；最后72℃再延伸10min。
試劑盒應用將模板DNA4.5μL加入試劑盒中的標準PCR管中后，迅速加入TaqDNA聚合酶0.5μL，短暫離心后按以下循環(huán)參數(shù)，在PCR擴增儀上孵育。(Taq DNA聚合酶為常規(guī)生物試驗所用酶)。反應結束后，取出PCR管，擴增產物用于電泳檢測。
(5)用PCR反應產物，在瓊脂糖凝膠電泳，對比Marker 2000，即可鑒別腐蹄病的存在或不存在(圖1)。
判定標準出現(xiàn)三條帶或三條帶以上；出現(xiàn)壞死桿菌特異性條帶在內的所有狀況。


圖1本發(fā)明試劑盒檢測結果圖。
泳道1為PCR反應產物電泳后的電泳圖，由上至下為化膿棒狀桿菌、金色葡萄菌、產氣莢膜桿菌、壞死桿菌四種菌的電泳帶。
泳道2為對比電泳帶的標準物Marker 2000。
權利要求
1.一種多重PCR反應試劑盒，其特征在于它含有如下引物(1)檢測壞死桿菌的引物上游引物5’TGA CAT TAC AGC TGA AGC AAA3’下游引物5’TCC AAC AGA AAC AGA AGC ATC3’(2)檢測產氣莢膜桿菌的引物上游引物5’TGT TAA GTT TGA GAC TTT TGC3’下游引物5’ATC TGG GAA TGC TGT ATA TTT3’(3)檢測金色葡萄菌的引物上游引物5’CCG AAT TCG TTA TGA CAG AAT ACT3’下游引物5’CAA GTC GAC CAG CGT TGT CTT CGC3’(4)檢測化膿棒狀桿菌的引物上游引物5’ACAATT TGC GTT CGG ACA TCT3’下游引物5’CCA CTT GAG CCT GAA CTT TGC3’
2.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，其中各組分體積配比為滅菌超純水26體積份、10×PCR反應緩沖液5體積份、25mmol/L MgCl24體積份、10mmol/L dNTP 2體積份、25pmol/L檢測壞死桿菌的引物1體積份、25pmol/L檢測產氣莢膜桿菌的引物1體積份、25pmol/L檢測金色葡萄菌的引物1體積份、25pmol/L檢測化膿棒狀桿菌的引物1體積份。
3.根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，試劑盒組成45μL反應體系，其中滅菌超純水26μL、10×PCR反應緩沖液5μL、25mmol/L MgCl24μL、10mmol/L dNTP 2μL、25pmol/L檢測壞死桿菌的引物1μL、25pm ol/L檢測產氣莢膜桿菌的引物1μL、25pmol/L檢測金色葡萄菌的引物1μL、25pmol/L檢測化膿棒狀桿菌的引物1μL。
4.一種檢測方法，它包括如下步驟(1)將模板DNA加入任一權利要求1-3所述的試劑盒中，迅速加入Taq DNA聚合酶，離心；(2)在PCR擴增儀上孵育，PCR循環(huán)參數(shù)為94℃預變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃再延伸10min；(3)將擴增產物進行電泳檢測。
5.根據(jù)權利要求4的檢測方法，其中電泳檢測后，出現(xiàn)404bp、560bp、668bp、968bp的特異性條帶。
6.權利要求1-3所述試劑盒在檢測?；蜇i壞死桿菌、產氣莢膜桿菌、金色葡萄菌、化膿棒狀桿菌中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術領域，公開了一種用于檢測奶牛腐蹄病的PCR診斷試劑盒及其檢測方法和應用。該PCR診斷試劑盒檢測奶牛腐蹄病具有快速、敏感性高、特異性強，成本低等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK1861802SQ20051001169
公開日2006年11月15日 申請日期2005年5月9日 優(yōu)先權日2005年5月9日
發(fā)明者呂占軍, 李林 申請人:呂占軍, 李林